A BIOTECHNOLÓGIA MÛSZAKI HÁTTERE A rekombináns proteinek gyors kimutatására szolgáló módszerek Tárgyszavak: rekombináns protein; kimutatás; ELISA; optikai bioszenzor; elektro-kemilumineszcencia; nefelometria; folyadékkromatográfia.
A rekombináns proteinek kimutatásának jelentősége Az idegen szervezetekben géntechnológiai módosítás után termelt „fajtaidegen”, rekombináns proteinek nagy mennyiségű előállításakor igen fontos a megtermelt proteinek mennyiségének folyamatos követése. Ezzel elkerülhető a túl korai begyűjtés vagy a termék fokozatos lebomlása a túl hosszú idejű tárolás miatt. A hagyományos ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay = enzimmel kapcsolt immun-adszorpciós vizsgálat) módszer 3–5 órát igényel, ezért ennél gyorsabb módszerek kifejlesztésére törekedtek. A módszernek célszerűen legalább olyan gyorsnak kell lennie, mint magának a gyártási eljárásnak, a legelőnyösebb a valós idejű koncentrációkövetés lenne a bioreaktorban. Az ilyen in situ próbamolekulákkal (amelyek egy indikátorfestékhez hasonlóan működnének) az a baj, hogy a felismeréshez használható protein ligandumok denaturálódnának a sterilezés során vagy elszenynyeznék magát az előállítandó terméket. A koncentrációmérés lehetőségeit a használt expressziós rendszer is behatárolja. Állati eredetű expressziós rendszerekben (pl. aranyhörcsög ovárium sejttenyészetek) a termelt protein kiválasztódik a sejten kívüli (extracelluláris) közegbe, baktériumokban vagy élesztőkben azonban gyakran sejten belül marad. Itt csak az extracelluláris térbe kijutó termékek koncentrációkövetéséről lesz szó. Olyan gyors és egyszerűen használható tesztekre lenne szükség, mint amilyen pl. az otthon is elvégezhető terhességi teszt, amely a terhességi hormont mutatja ki vizeletben. Itt egy 5 perc alatt elvégezhető vizsgálatról van szó, amely azonban csak fél-kvantitatív, „igen/nem” választ ad a feltett kérdésre. Ebben a vizsgálatban sterilezett és fagyasztva szárított antitesteket használnak, amelyet egy különleges polimer réteggel tartanak steril állapotban mindaddig, amíg a bevonat fel nem oldódik a vizeletben. Amíg azonban nem sikerül sterilezhető próbamolekulákat előállítani a fermentorokban gyártott
rekombináns proteinek számára, immun-affinitásra épülő gyors analitikai módszereket fejlesztenek. Bakteriális és élesztőalapú rendszerekben eddig is rutinszerűen használtak on-line módszereket metabolitok azonosítására és kvantitatív meghatározására, de ehhez sterilezhető próbamolekulákra lenne szükség a rekombináns proteinek esetében. Bioszenzoros off-line technológiákat fejlesztettek ki számos tápanyag, metabolit és ozmózisszabályozó ion számára (pl. pH-, pO2-, pCO2-, Na+-, K+-, Ca2+-, glükóz-, laktát-, NH4+-, glutamát- és glutaminmérő szenzorok). A proteinanalízisben az ELISA módszerek mellett optikai bioszenzorokat, elektro-kemilumineszcenciás detektorokat, gyors kromatográfiás eljárásokat és nefelomteriát használnak, és ezek rekombináns proteinekre való alkalmazhatóságát vizsgálják.
A vizsgálati módszerek hatékonyságának összehasonlítása A gyors monitorozási technológiák összehasonlításához két reprezentatív fehérjét használtak: egy viszonylag nagy rekombinás proteint (rekombináns humanizált immunglobulin-1 [rhIgG1], móltömeg kb. 160 kDa) és egy viszonylag kis rekombináns glikoproteint (rekombináns metalloproteináz-1 inhibitor [TIMP-1], móltömeg kb. 24 kDa). Az analízis körülményeit illetően igyekeztek olyan viszonyokat teremteni, mint amilyeneket a hagyományos ELISA-teszteknél használnak, az összehasonlíthatóság érdekében. Minden módszernél három mérést végeztek, három különböző napon, tíz koncentrációban, és minden koncentrációnál hat párhuzamost használtak a szórás megállapítására. Ez módszerenként 180 mérést jelent. A standard mintákat egy tipikus minimál sejttenyésztési tápközeggel hígították fel (DMEM-F12 + 5 %(V/V) borjúembriószérum). A 180 pont (adat) statisztikai analízisét gyógyászati termékekre vonatkozó európai szabványok szerint végezték. A mérés reprodukálhatóságát (Relative Assay Variability, RAV%) a három különböző napon, több koncentrációnál felvett adatpontokból számították, míg a mérési pontokhoz tartozó szórást, a mérés pontosságát (Coefficient of Variation, CV%) az egy-egy koncentrációhoz tartozó 6–6 adatpont szórásából számították.
Rekombináns proteinek analízise ELISA módszerrel Mióta felfedezték és ipari léptékben kifejlesztették a monoklonális antitest készítési technológiáját, amellyel egy célantigénre nézve specifikus antitestek klónjait lehet nagy mennyiségben előállítani, az ELISA módszer a 80-as és 90-es években egyre népszerűbbé vált. Ezzel a módszerrel nagy érzékenység és specificitás érhető el anélkül, hogy sugárzó atomokkal kellene megjelölni a
ligandumokat. A módszert, amelyet vázlatosan az 1. ábra mutat, ma is szívesen használják különféle antigének kimutatására. Az ELISA vizsgálatokat a 0– 200 ng/ml koncentrációtartományban végezték el.
színes termék szubsztrátum
detektálás
blokkolószer üreg alja
Először egy szilárd fázishoz nem kovalens módon tisztított primer ligandumot kötnek, majd hozzáadnak egy blokkolószert, hogy megakadályozzák a nem-specifikus kötődést. Az antigént (Ag) tartalmazó oldatot hozzáadva megtörténik a specifikus kötődés a primer ligandumhoz. A nem kötött fehérjemolekulákat lemossák és egy másodlagos antitestet adnak hozzá, amely egy reaktív enzimmel van konjugálva (pl. tormaperoxidázzal). Egy újabb mosási lépéssel eltávolítják a nem kötött szekunder ligandumokat, majd spektrofotometriás módszerrel (egy mikrolemezes abszorbancia leolvasó segítségével) meghatározzák azt az időt, amely alatt a konjugált enzim egy kromogén anyagot oldható, színes termékké alakít.
1. ábra Az egyszerű „ szendvics” ELISA módszer alapelve Az ELISA módszerek elterjedésével egyre több antigénhez lehet kapni olyan, szinte változatlan formában alkalmazható ELISA-készletet, amely alig kíván bármilyen optimalizálást. Az ELISA módszer (1. táblázat) viszonylag érzékeny, egyszerű és nincs szüksége karbantartásra. A gyors, félautomata lemezmosó és leolvasó rendszerek csökkentik az elkövethető kezelői hibákat. Mivel egy lemezen 96-nál több minta mérhető egyszerre, az egy mintára jutó mérési idő meglehetősen gazdaságos. Egyetlen minta vizsgálatára viszont ez a módszer nem kimondottan alkalmas. Az ELISA módszer problémái között említhető a viszonylag hosszú „előhívási” idő és kis molekulák esetében a kis dinamikus lineáris tartomány (a kisebbik, TIMP-1 protein esetében pl. csak 0,2–25 ng/ml). Hátrányként említhető még a nagy hígítási igény, ami folyadékadagolási hibákat okozhat. Az ELISA tesztekhez viszonylag nagy mennyiségű szubsztrátumra és egyéb, vissza nem nyerhető vegyszerekre van szükség. A rekombináns proteinekre vonatkozó próbák száma egyelőre meglehetősen korlátozott és áruk magas.
Rekombináns proteinek analízise optikai bioszenzorral A bioszenzorok fejlesztése a 70-es és 80-as években vált intenzívvé, mert a fermentációs rendszerek folyamatos fejlődése szükségessé tette a fermentációs paraméterek (pH, hőmérséklet, oldott oxigén stb.) minél pontosabb, folyamatos követését. Megjelentek a glükóz, laktát, glutamin, ammónia stb. on-line követésére alkalmas szenzorok. A jelzőmolekula csatolását nem igénylő módszerek között említhetők a felületi plazmonrezonancia technológia (BIAcore Ab, Svédország) vagy a rezonáns tükrözési technológia (IAsys, Affinity Biosensors, Egyesült Királyság), amelyek jelenleg piacvezető helyzetben vannak. Ezek a bioszenzorok, amelyek valós idejű mérést tesznek lehetővé, közvetlenül a ligandum–antigén kölcsönhatást mérik oly módon, hogy a biológiai érzékelő elemet hozzákötik egy fizikai jeladóhoz. Az itt ismertetett mérésben BIAcore szenzorokat alkalmaztak, de ugyanígy alkalmazhatták volna a versenytárs technológiáját is. A mérés elvét a 2. ábra mutatja. Ezzel a módszerrel tíz különböző koncentrációnál végeztek mérést a 0– 200 µg/ml tartományban. A rekombináns protein standardot sorozatban hígították és 2 µl/min sebességgel áramoltatták egy karboximetilezett dextránnal borított szenzor felületéhez kötött specifikus ligandum felett. A következő mérés előtt a szenzort először gyenge savval regenerálták, majd sós, pH = 7,4 HEPES pufferrel öblítették. A bioszenzorok előnye, hogy nincs szükség sem a ligandum, sem a kimutatandó molekula jelölésére, és az átfolyásos cellák 10 percnél rövidebb idő alatt lehetővé teszik a hígítatlan mintában a proteinek és főbb szennyezőik kvantitatív kimutatását. Rendelkezésre állnak kézi és teljesen automatizált mérőeszközök is. Sokféle felületi kémiai módosítás létezik: karboxi-metil-dextrán, aminezett, hidrofil és hidrofób felületek, biotin (IAsys) és sztreptavidin, lipofil és keláttal kezelt felületek (BIAcore). A szenzorok ára közepes, de többször is felhasználhatók és több hónapig eltarthatók. A berendezéseket többféle célra is lehet használni (kinetikai vizsgálatok, epitoptérképezés, kötőhelyjellemzés, többszörös komplexképződés funkcionális vizsgálata). A bioszenzorokat gyakran tömegspektrometriával kapcsolva használják bioaktív proteinek gyors jellemzésére. A megnőtt analitikai lehetőségek tehát kompenzálják a nagyobb kezdeti tőkeigényt. A fejlett szoftver kezelése azonban némi betanulást igényel. Az elvégzett vizsgálatok alapján azt lehet mondani, hogy a kis koncentrációktól eltekintve (<1 µg/ml) a módszer reprodukálható, és széles dinamikus tartományt biztosít. Az automatikus analízist, ha egyszer beállították, könnyű végrehajtani, de az adatok teljes kiértékelése órákat vesz igénybe. A szenzoron kívül egyéb fogyóeszközökre nincs is szükség.
(a) A technológia sematikus ábrázolása. A befogó ligandumot kovalens kötéssel rögzítik a szenzor áramkör felületéhez. A vizsgálandó oldat folyamatosan áramlik a kötött ligandum fölött. Ha kialakul a kötés, a polarizált fehér fény teljes visszaverődést szenved és evaneszcens hullám képződik (a fény egy része elnyelődik a határfelületen). Ennek hatására megváltozik a törésmutató, amit jól lehet detektálni (egy adott visszaverődési szögnél a viszszavert fény intenzitásában hirtelen csökkenés áll be). (b) Az optikai bioszenzor valós idejű válaszgörbéje. A bioszenzor kimenő jele (a rezonanciajel) közvetlen kapcsolatban áll a megkötött, mérendő molekulák mennyiségével. Az automatikus adatfeldolgozás lehetővé teszi a koncentráció folyamatos követését akár az induló jel meredeksége alapján, akár az egyensúlyi jel nagysága alapján (ez utóbbi esetben néhány percre van szükség az egyensúly beállásához).
2. ábra A felületi plazmon-rezonanciát alkalmazó optikai bioszenzor működési elve
Rekombináns protein analízise elektro-kemilumineszcenciás módszerrel Ezt a technikát az IGEN(R) International Inc. fejlesztette ki, és lényegében egy igen nagy érzékenységű „folyékony ELISA” módszerről van szó, amelyben egy fémmel jelzett ligandum–termék komplexet kis feszültség hatásának tesznek ki, és az így keletkező lumineszcens sugárzást detektálják (3. ábra). Vannak 96 és 384 férőhelyes lemezeket olvasó berendezések. Az elektrolumiszcencia módszerével sikerült nukleinsavakat, rekombináns proteineket,
(a) mágneses sztreptavidin gyöngy
ruténiummal jelölt antitest
gyöngykomplex
mérendő molekula biotinilezett antitest
(b)
1. lépés: beömlés a cellába
fénydetektor 2. lépés: elektro-kemilumineszcencia gyöngykomplex
áramlás
3. lépés: regenerálás
elektród mágnes
áramlás
A komplexképződést az (a) ábra mutatja. Egy primer antitestet kovalensen megjelölnek ruténiumvörössel, majd egy oldatban kezelik a mérendő molekulával és mágneses sztreptavidin gyöngyökre rögzített biotinilezett szekunder antitestekkel. A mikron átmérőjű gyöngyök játsszák a szilárd fázis szerepét, amelyhez a komplex a szekunder ligandum biotincsoportján keresztül hozzákapcsolódik. Az elektrolumineszcens detektálást a (b) ábra mutatja. A keverékhez egy szabadalommal védett, tripropil-amint tartalmazó puffert adnak, majd a megkötött komplex részt vesz az elektrolumineszcens reakcióban, a keletkezett fényt mérik, végül regenerálják a felületet.
3. ábra Az elektro-kemilumineszcenciás mérés elve
receptor–ligandum komplexeket, baktériumokat és vírusokat pikogrammnál kisebb mennyiségben detektálni. A primer ligandumot ruténiumvörössel, a szekunder ligandumot biotinnel jelezve a standardokat 0–2000 ng/ml koncentrációtartományban mérték. A ligandumot, a standard oldatot és a szteptavidinnel konjugált paramágneses gyöngyöket egyforma térfogatban keverték 60 percig, majd automatikusan hozzáadták az ORIGEN(R) puffert és mérték a lumineszcens fényintenzitást. A módszer előnye az ELISA-val szemben a rövidebb mérési idő és a kisebb munkaigény. Nincs szükség mosásokra, ami növeli a mérés pontosságát. A próba formátuma (szendvics, közvetlen és kompetitív próbák) tetszés szerint megválasztható, és mind dinamikus tartománya, mind pontossága jobb az ELISA-nál. A mérőrendszer félautomatikus, a kiértékelés gyors és egyszerű, nem kíván hosszú betanulást. Sokféle (több mint 300) célmolekulához készült már próba, amely nem igényel további optimalizálást. A nagy érzékenység hátránya, hogy a vizsgálandó oldatot gyakran hígítani kell ahhoz, hogy mérni lehessen. Olyan molekulák esetében, amelyeket addig még nem mértek, az optimalizálás folyamata eléggé hasonlít a szilárd fázisú ELISA-éhoz. A reprodukálhatóság összemérhető az ELISA-éval, de sokkal kisebb mintatérfogatot igényel. A próba nagyon érzékeny, és mind a kisebb (TIMP-1), mind a nagyobb (rhIgG1) rekombináns protein esetében hasonló dinamikus tartományt lehetett elérni (kb. 0–2000 ng/ml). Az ismételt mérések között jelentős változások voltak, ami talán részben a szobahőmérséklet változásával, részben a hígítással kapcsolatos műveletekkel magyarázható (ezt az érzékeny módszer felerősíti). Az egy mérésen belüli szórás 10% alatt maradt. A mérési folyamat egyszerű és egy órán belül elvégezhető. A mérések közti gyenge reprodukálhatóság miatt azonban (az ELISA-hoz hasonlóan) célszerű minden mérésbe belső standardot is használni.
Rekombináns proteinek vizsgálata nefelometriával A nefelométereket már évtizedek óta alkalmazzák számos anyag immunológiai detektálására mind klinikai, mind ipari környezetben. A maximumnefelometria a mérendő molekula koncentrációjának változását méri, amely a turbiditással arányos, a turbiditást pedig az immunkomplex képződése okozza az oldatban. A működési elvet a 4. ábra mutatja. A nefelometriás mérést két okból nem végezték el a kisebb, TIMP-1 proteinre. Egyrészt nem állt rendelkezésre kereskedelemben kapható poliklonális IgG ligandum, másrészt a nefelometria nagyobb molekuláknál ideális eszköz, hiszen azok viszonylag hígabb oldatban is nagymértékű fényszórást produkálnak. A TIMP-1 esetében ahhoz, hogy mérhető jelet kapjunk, próbánként kb. 150 µg poliklonális antitestet kellene felhasználni, ami nagyon drágává tenné a módszert. Az rhIgG1 proteinre a mérés minden további nélkül elvégezhető.
Ismert koncentrációjú, specifikus, poliklonális, a mérendő molekulára érzékeny antitestet adnak két független áramlási cellához, amelyekben ismert koncentrációjú mérendő molekula van, aminek hatására nagy immunkomplexek képződnek. Ennek hatására megnő a fényszórás, amelyet a beeső fényre merőleges irányban mérnek (a fényforrás egy monokromatikus lézer). Ahogy a mérendő molekula koncentrációja nő, nő a fényszórás is, amíg el nem ér egy maximumot. Az immunkomplexek fényszórását a átáramló cellákban megmérik a 400–620 nm tartományban, és ezt a szoftver egy standard görbévé konvertálja. Ha a standard koncentrációja túl nagy, automatikus hígítás következik, hogy a jel beleférjen a mérési tartományba.
4. ábra A maximum-nefelometria működési elve A módszer előnye az, hogy nem igényel molekuláris jelzést, és teljesen automatizált nefelométerek állnak rendelkezésre, amelyek addig hígítják az oldatot, amíg az bele nem fér a kívánt tartományba. A tápoldat esetleges szennyezései által okozott fényszórást meg lehet mérni egy vakmintán, és háttérként kivonni a valós mért jelből. A Beckman cég nefelométere gyors mérést, automatikus mintavételt és jól felhasználható szoftvert kínál, amelyen a mérés is, feldolgozás is kevés előképzettséget igényel. A nefelometria hátránya, hogy a méréshez elég nagy koncentrációban kell hozzáadni az immunkicsapódást eredményező ligandumot. Ezt a problémát enyhíti a BMG Laboratories műszere, amely 24-384 mérőhelyes mikroüreges lemezekben végzi a mérést. A Beckman cég műszeréhez jelenleg kb. 50 molekulához áll rendelkezésre specifikus proteinvizsgáló készlet. A módszer reprodukálhatósága igen jó, dinamikus tartománya viszonylag jól megfelel az állatisejtes fermentációban képződő rekombináns protein koncentrációknak (8–200 µg/ml). A próba gyorsan elvégezhető (kb. 1 perc), kevés mintát igényel (42 µl), és a fermentlé hígítás nélkül használható. A mérési sorozaton belüli és sorozatok közötti szórás is nagyon kicsi, az adatkiértékelés egyszerű.
Rekombináns proteinek analízise gyors folyadékkromatográfiával Az FPLC (gyors folyadékkromatográfia) és HPLC (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia) módszereit korábban is alkalmazták mikrobiális és állati szövettenyészetek analízisére, de ezeknek a módszereknek szelektivitása korlátozott, és túl lassúak ahhoz, hogy valós idejű analízishez használhassák őket. Az immunkromatográfia bioszelektív és ma már elég gyors ahhoz, hogy rekombináns proteinek esetében valós idejű analízishez használható legyen (10 percnél rövidebb). Az új oszlop-mátrixok viszonylag nagy áramlási sebességeket, jó adszorpciót és szelektivitást biztosítanak (5. ábra). A gyors kromatográfiához használt oszlopok töltete rendszerint kis, monodiszperz, hidrofil gyöngyökből vagy mikroporózus szemcsékből áll, amelyek különböző kémiai összetételűek lehetnek. Az ilyen közegek egyszerre biztosítják a nagy áramlási sebességet és a nagy kötési affinitást, valamint a nagy felbontást. A mérésekhez használt POROS(R) oszlopok mikroporózus részecske-agglomerátumokat tartalmaznak, amelyek gyors, konvektív áramlást és rövid diffúziós utakat biztosítanak. Az Amersham Pharmacia Minibeads(R) oszlopai hidrofil poliéter-alapú, nem porózus gyöngyöket tartalmaznak, amelyek ugyancsak nagy felbontást, sebességet biztosítanak és elég tartósak. A jobb anyagtranszport azt jelenti, hogy a kromatográfiás közegbe a diffúzió nincs korlátozva, és viszonylag nagy lineáris sebességeket lehet alkalmazni, ami javítja a dinamikus megkötési jellemzőket. injektor bejárata
felülúszó
affinitásmátrix
abszorbancia
B
detektor
Először egy specifikus ligandumot rögzítenek egy kromatográfiás mátrixhoz, majd az így kapott affinitásoszlopot arra használják, hogy megkössenek adott mennyiségű mérendő molekulát az adott térfogatú oldatból automatikus kromatográf segítségével. A 280 nm-s elnyelést mérve (A) először az oszlopot tisztára mossák a meg nem kötött szennyezőktől, majd (B) a megtisztított mérendő molekulát oldják le az oldószer megfelelő változtatásával (pl. pH). A vizsgálandó anyag mennyiségét az elúciókor kapott integrált jel és a kalibrációs görbe összehasonlításával kapják.
5. ábra A proteinmeghatározás elve gyors affinitáskromatográfiával
Tíz különböző koncentrációjú mintát vizsgáltak a 0–200 µg/ml tartományban. A POROS(R) típusú oszlopon először immobilizáltak egy specifikus ligandumot, majd az oszlopot 7,0 pH-jú foszfátpufferrel hozták egyensúlyba, majd egy standard hígítássorozattal megállapították a kalibrációs görbét. Az áramlási sebesség 1 ml/min volt. A mérés menete a következő volt: az oszlopot először megtisztították a meg nem kötött szennyezőktől, ráinjektálták a megfelelően hígított standardot, majd a tiszta standardot enyhe savas mosással eltávolították. Az elúciós csúcsot detektálva és integrálva a jelet megkapható a kalibrációs görbe szerkesztéséhez használt jel. A mérés ideje kb. 6 perc. A módszer előnye az oszlophoz kötött ligandum viszonylag nagy stabilitása (több mint 6 hónap) és a rendszer rugalmassága, hiszen tetszőleges, kereskedelmileg elérhető HPLC készülék használható, nem kell új, drága berendezést vásárolni. Mivel a mérési idő is rövid (kevesebb, mint 10 perc), a módszer ideális a gyors kiértékelésre és a tisztított termék egyidejű kinyerésére. A módszer hátránya, hogy a tápoldatban levő egyéb komponensek zavaró hátteret okozhatnak, megnő az oszlop elszennyeződésének veszélye, és az oszlophoz kötődő ligandum lassú hidrolízise miatt az oszlop időben elhúzódó „szivárgást” mutathat. Az ún. áttörési értékeket is gondosabban kell meghatározni a kalibráció során, hogy az átfolyás során be ne következzék az antigének elvesztése, ami elrontaná a kvantitatív végeredményt. A dinamikus megkötési görbe függ a használt áramlási sebességtől és a puffertől. Ez a módszer sem tud (a többi korábban említetthez hasonlóan) különbséget tenni az antigénvariánsok között. Ez a nehézség azonban egyszerűen leküzdhető, ha az immunaffinitás oszlop után egy másik (pl. ioncserés) oszlopot kötnek további elválasztás és detektálás céljából. Bár a vizsgált affinitáskromatográfiás oszlop esetében nem olyan jó az érzékenység, mint a kemilumineszcencia vagy az ELISA módszer esetében (3–6 µg/ml), az elérhető mérhetőségi tartomány bőven megfelel az állati sejttenyészetekben tapasztalható rekombináns proteinek tipikus koncentrációjának. A reprodukálhatóság mérési sorozatokon belül és mérési sorozatok között is igen jó (~<5%, RAV <5%). A mérés gyors, olcsó, egyszerűen értelmezhető. Külön előnyt jelent, hogy egy utána kapcsolt oszloppal a vizsgált termék automatikusan tovább analizálható proteinheterogenitás szempontjából, amely döntő jelentőségű a termék minősége szempontjából.
Az analitikai módszerek összehasonlítása A vizsgált módszerek ugyan nem fogják át a rekombinás proteinek koncentrációjának mérésére szolgáló lehetőségek teljes spektrumát, hiszen léteznek itt nem említett módszerek is (pl. szcintillációs közelségi (proximitási) tesztek, diffúzióval erősített lantanidadiffúziós fluoreszcens immunpróba,
kvantitatív kapilláris elektroforézis stb.), de a tárgyalt módszerek reprezentatív képet adnak a jelenleg elérhető, kereskedelmileg bevezetett lehetőségekről. Mindegyik módszernek megvannak a maga előnyei és hátrányai. Ami a módszer párhuzamosíthatóságát illeti, az ELISA és a mikrolemezes elektrolumineszcenciás módszer 24 minta három párhuzamosának egy lapon történő vizsgálatát is lehetővé teszi a standardokkal együtt. Ez természetesen nem lehetséges az optikai bioszenzorral, a nefelométerrel vagy a gyors kromatográffal. A választás a módszerek között attól függ, hogy mire akarják használni. Ha valós időben kell követni egy biológiai folyamatot, ahol időben néhány, de gyors analízist kell végrehajtani, akkor az optikai bioszenzor, a nefelométer vagy a kromatográfia a kedvezőbb. Ha azonban sok mintát kell vizsgálni akár utólagosan, akár más okból, akkor az ELISA vagy a kemilumineszcencia a jobb választás. Egy gyártási folyamat szabályozásához nemigen használható olyan módszer, amelynek pontossága nem jobb 5%-nál. Meg kell említeni, hogy a vizsgált mérési módszerek különböztek abban a tekintetben, hogy mekkora szórást mutattak egy mérési sorozaton belül (pontosság), ill. különböző mérési sorozatok között (reprodukálhatóság). Az ELISA és az elektro-kemilumineszcencia általában nagyobb szórást mutat, mint az optikai bioszenzor, a kromatográfia vagy a nefelometria (1. táblázat). Egy másik megfontolandó szempont, hogy a kiértékeléshez használt berendezés csak egyetlen módszerhez használható-e (pl. ELISA, elektrokemilumieszcencia, nefelometria), vagy esetleg többféle vizsgálathoz (optikai bioszenzor, gyors kromatográfia). A több célra használható berendezéseket egy sokféle vizsgálatot végző, általános biokémiai laboratóriumban sokkal költséghatékonyabban lehet kihasználni, mint egy speciális célra szolgáló berendezést. Az egy célra kifejlesztett berendezések előnye viszont, hogy általában kevesebb a változó paraméter, ami stabil és megbízható eljárások kifejlesztésénél fontos szempont. A technológiai lehetőségek közti választást végül is a feladat jellege, a rendelkezésre álló költségvetés, a mérések száma és a laboratóriumi környezet dönti el. Az is fontos, hogy az adott célra léteznek-e jó standardok és ligandumok. Számos speciális vagy üzleti titokként termelt bioaktív protein esetében az ilyen anyagok hiánya nagy problémát jelenthet, vagy jelentősen megdrágítja egyik vagy másik módszer használatát. Az egyik legjelentősebb korlátozás az, hogy egyik említett módszer sem ad on-line, valós idejű adatokat, de bizonyos esetekben nem állnak messze ettől. Az optikai szenzorok online alkalmazásához pl. meg kell oldani a steril mintavételt, a hőmérsékletstabilitás problémáját, a szenzor regenerálását és az elszennyeződés megakadályozását. Fluoreszcenciás szenzorokkal számos baktériumtenyészetben sikerült összefüggést találni bizonyos termékek koncentrációmaximumai és a fluoreszcenciás jelmaximumok között. Baktérium és ízeltlábú szövettenyészetekben a rekombináns proteinek kimutatásának legjobb módja az volt, hogy a proteint fuzionálták egy zöld fluoreszcens pigmentet tartalmazó prote
innel. Így a termelt proteint közvetlen fluoreszcenciás módszerrel lehet detektálni. Elképzelhető tehát, hogy az on-line, valós idejű rekombináns protein koncentráció mérése a közeljövőben egyéb rendszerekben is megvalósul. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) Baker, K. N.; Rendall, M. H. stb.: Rapid monitoring of recombinant protein products: a comparison of current technologies. = Trends in Biotechnology, 20 k. 4. sz. 2002. p. 149– 156. Willunghby, N.: The use of rapid on-line monitoring of products and contaminants from within an expanded bed to control separations exhibiting fast breakthrough characteristics and to maximize productivity. = Biotechnology and Bioengineering, 70. k. 2. sz. 2000. p. 254–261. Ohlson, S.: Continuous weak-affinity immunosensing. = Trends in Biotechnology, 18. k. 1. sz. 2000. p. 49–52.
EGYÉB IRODALOM Guntinas, N. B.; Bordin, G. stb.: Identification, characterization and determination of metalbinding proteins by liquid chromatography. A review. (Fémkötő fehérjék azonosítása, jellemzése és meghatározása folyadékkromtográfiával: áttekintés.) = Analytical and Bioanalytical Chemistry, 374. k. 3. sz. 2002. okt. p. 369–378. Fikret, K.: Enhanced biological treatment of saline wastewater by using halophilic bacteria. (Sótartalmú szennyvizek fokozott biológiai kezelése halofil baktériumok használatával.) = Biotechnology Letters, 24. k. 19. sz. okt. 1 . 2002. p. 1569–1572. Automatisierte Festphasensynthese von Oligosacchariden. (Oligoszacharidok automatizált szilárd fázisú szintézise.) = Nachrichten aus der Chemie, 50. k. 9. sz. 2002. p. 940–945. Unen, D. J.; Engbersen, J. F.; Reinhoudt, D. N.: Why do crown ethers activate enzymes in organic solvents? (Miért aktiválják a koronaéterek az enzimeket szerves oldószerben?) = Biotechnology and Bioengineering, 77. k. 3. sz. 2002. febr. 5. p. 248–255. Brivanlou, A. H.; Darnell, J. E. stb.: Signal transduction and the control of gene expression. (Jeltranszdukció és a génexpresszió szabályozása.) = Science, 295. k. 5556. sz. 2002. febr. 1. p. 813–818. Anastassian, D.: Genomic signal processing. (Genomikai jelfeldolgozás.) = IEEE Signal Processing, 18. k. 4. sz. 2001. júl. p. 8–19.
