A poli (ADP-ribóz) polimeráz 1 szerepe a krónikus kardiovaszkuláris betegségek patogenezisében

A poli (ADP-ribóz) polimeráz 1 szerepe a krónikus kardiovaszkuláris betegségek patogenezisében Doktori értekezés

Benkő Rita Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Szabó Csaba Hivatalos bírálók: Dr. Radák Zsolt Dr. Antus Balázs Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Ligeti László Dr. Ivanics Tamás Dr. Dézsi László

Budapest 2008.

TARTALOM

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................................4 TU

UT

IRODALMI HÁTTÉR ....................................................................................................7 TU

UT

A poli (ADP-ribóz) polimerázok (PARP) ............................................................................................7 TU

UT

A poli (ADP-ribóz) polimeráz-1 fiziológiás működése ............................................... 8 TU

UT

A poli (ADP-ribóz) polimeráz-1 működése kóros állapotokban .................................. 9 TU

UT

A poli (ADP-ribóz) polimeráz aktivitásának szabályozása ........................................ 12 TU

UT

Az oxidatív stressz szerepe a korral járó krónikus betegségek kialakulásában..............................14 TU

UT

Az öregedés genetikai és hibafelhalmozódáson alapuló elmélete .............................. 14 TU

UT

Diabétesz mellitusz ..................................................................................................... 17 TU

UT

Ateroszklerózis ........................................................................................................... 23 TU

UT

Esszenciális hipertónia ............................................................................................... 25 TU

UT

A kor és az oxidatív stressz szerepe a metabolikus X szindróma kialakulásában...... 26 TU

UT

CÉLKITŰZÉSEK .........................................................................................................29 TU

UT

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................32 TU

UT

Millar rendszer: az intrakardiális nyomás- és térfogatváltozás regisztrációja in vivo...................32 TU

UT

A mellkasi aorta kontraktilitásának és relaxációs készségének vizsgálata ......................................33 TU

UT

Állatmodellek alkalmazása az általunk vizsgált kórfolyamatokban ................................................34 TU

UT

Az INO-1001 javítja a szívfunkciókat és az aorta relaxációs készségét idős patkányban ..............35 TU

UT

Fisher patkánytörzs, az emberi korosodás modellje ................................................... 37 TU

UT

Poli (ADP-ribóz) polimeráz aktiváció szerepe a diabéteszes szív működésében bekövetkező TU

változásokban .......................................................................................................................................38 UT

Diabéteszes állatmodellek .......................................................................................... 38 TU

UT

Az INO-1001 helyreállítja az aorta relaxációs készségét Apolipoprotein E deficiens TU

érelmeszesedésben ................................................................................................................................39 UT

1

A ballonkatéteres sértést követő resztenózissal szemben protektív hatású a metalloporfirin TU

szerkezetű, a peroxinitrit bontását katalizáló WW85 .......................................................................40 UT

Ateroszklerotikus állatmodellek ................................................................................. 40 TU

UT

A poli (ADP-ribóz) polimeráz gátlása javítja az angiotenzin-rendszer túlműködéséből eredő TU

endotéldiszfunkciót ...............................................................................................................................41 UT

A hipertónia modellezése ........................................................................................... 42 TU

UT

Statisztikai analízis ...............................................................................................................................42 TU

UT

EREDMÉNYEK ............................................................................................................43 TU

UT


UT









MEGBESZÉLÉS ...........................................................................................................61 TU

UT


UT









2

KÖVETKEZTETÉS .....................................................................................................76 TU

UT

ÖSSZEFOGLALÁS ......................................................................................................78 TU

UT

SUMMARY ....................................................................................................................79 TU

UT

IRODALOMJEGYZÉK ...............................................................................................80 TU

UT

FELHASZNÁLT IRODALOM: ..................................................................................80 TU

UT

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK...............................................................................................98 TU

UT

AZ ÉRTEKEZÉSBEN FELHASZNÁLT CIKKEK ......................................................98 TU

UT

EGYÉB NEMZETKÖZI PUBLIKÁCIÓK ....................................................................99 TU

UT

MAGYAR NYELVŰ PUBLIKÁCIÓK ...........................................................................99 TU

UT

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .....................................................................................100 TU

UT

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACE

angiotenzin konvertáló enzim

ADPr

ADP-ribóz

AGE

késői glikációs termékek (advanced glycation endproducts)

maxAICAR B

5-amino-4-imidazolkarboxamid ribozid

B

AIF

apoptózis indukáló faktor

AMP

adenozin-monofoszfát

AMPK

AMP-aktivált protein kináz

Ang II

angiotenzin II

Apo E

apolipoprotein E

Artériás Pközép B

B

artériás középnyomás

ATP

adenozin-trifoszfát

BK Pdia

bal kamrai végdiasztolés nyomás

B

B

DAG

diacilglicerol

DHAP

dihidroxiaceton-foszfát

dP/dt

nyomásgörbe első deriváltja

+dP/dtmax B

-dP/dtmax B

B

B

a szisztolés nyomásnövekedés maximális meredeksége a diasztolés nyomásesés legnagyobb meredeksége

EDRF

endotélium eredetű relaxációs faktor

Emax

végszisztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggése

B

B

eNOS

endoteliális nitrogén-monoxid szintáz

GAPDH

glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GFAT

glutamin:fruktóz-6-foszfát amidotranszferáz

Glu

glukóz

Glut

glukóz transzporter

HDL

high density lipoprotein

HMG-CoA

3-hidroxi-3-metil glutaril koenzim A

ICAM-1

intercelluláris adhéziós molekula-1

IL-

interleukin-

IgG

immunglobulin γ

iNOS

indukálható nitrogén-monoxid szintáz

INO-1001

izoindolinon szerkezetű allosztérikus PARP-gátló anyag

4

LDL

low density lipoprotein, alacsony fehérjetartalmú, sok lipidet felvett lipoprotein

LPS

lipopoliszacharid

NA

nikotinamid +

NAD

nikotinamid-adenin-dinukleotid

P

P

NADPH

nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát redukált formája

NF-κB

sejtmagi faktor kappa B

NOS

nitrogén-monoxid szintáz -

ONOO

peroxinitrit

P

P

oxLDL

oxidált low density lipoprotein

Oxo8dG

8-oxo-2-deoxiguanozinszint

PAR

poli(ADP-ribóz)

PARG

poli (ADP-ribóz) glikohidroláz

PAR-áció

poli (ADP-ribozil)áció

PARP

poli (ADP-ribóz) polimeráz

PARP

-/P

P

poli (ADP-ribóz) polimeráz 1 deficiens (knock-out) állatok/sejtek

+/+

PARP P

vad típusú poli (ADP-ribóz) polimeráz 1 génekkel rendelkező P

állatok/sejtek Pdia VR

végszisztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggése

PFVW

előterhelés-függő térfogati munka

PJ34

PARP-gátló, N-(-oxo-5,6-dihidro-fenantridi-nin-2-yl)-N,N-

B

B

dimetilacetamid) PKC

protein kináz C

RAGE

késői glikációs termékek receptora

RNI

reaktív nitrogén köztitermékek

ROI

reaktív oxigén köztitermékek

SOD

szuperoxid diszmutáz

SHR

spontán hipertenzív patkánytörzs

TNF

tumor nekrózis faktor

TPR

teljes perifériás rezisztencia

UDP-GlcNAc

UDP-N-acetilglukózamin

5

Vdia

végdiasztolés térfogat

VCAM

vaszkuláris sejtadhéziós molekula

VW

térfogati munka (volumen work)

WW85

egy, a peroxinitrit bomlását katalizáló metalloporfirin szerkezetű

B

B

anyag

6

IRODALMI HÁTTÉR A poli (ADP-ribóz) polimerázok (PARP) A ’60-as évek végén írták le először, hogy sejtmagpreparátumok képesek NAD+ P

P

felhasználásával poli (ADP-ribóz) molekulákat (PAR) szintetizálni (Sugimura and Shimizu, 1968; Haines et al., 1969a; Haines et al., 1969b). 1972-ből származik az a felismerés, hogy a polimert szintén a nukleuszban található glikohidroláz bontja le, amelyet így poli (ADP-ribóz) glikohidroláznak (PARG) neveztek el (Ueda et al., 1972). Hamarosan az is kiderült, hogy a PAR hisztonokhoz kapcsolódik, kovalens kötéssel (Miyakawa et al., 1972; Smith and Stocken, 1973), és nincs közvetlen kapcsolat a DNSszintézis és a PAR-iláció között (Hilz and Kittler, 1971; Lehmann and Shall, 1972). A PARP 1-ről megállapították, hogy az élesztősejtek és a neutrofil granulociták kivételével minden sejt magjában megtalálható, méghozzá igen nagy mennyiségben. 113 kDa méretű fehérje, amely szerkezete az 1. ábra felső részén látható. N-terminális végén a DNS-hez kapcsolódó két cink-ujj motívumot találunk, a C-terminális vég irányában az automodifikációs domén helyezkedik el, majd a katalitikus domént találjuk (Nishikimi et al., 1982; Kameshita et al., 1984; Shizuta et al., 1986; Mazen et al., 1989). Magnus Johansson 1999-ben számol be arról, hogy talált két további PARP aktivitású enzimet, amelyeket PARP 2 és PARP 3 néven említ. Ezek 60 kDa méretűek, Cterminális végük 40% illetve 31% azonosságot mutat a PARP 1 szerkezetével, de nincs automodifikációs doménjük, illetve a PARP-3 DNS-kötő szekvenciái is hiányoznak. Ebből Johansson arra következtetett, hogy egy teljes PARP géncsaládot találunk emberi szövetekben, amelynek legalább három tagja van (Johansson, 1999). Johansson nem tévedett. Mára a PARP-család 16 tagot számlál, de a sejtekben képződő PAR legalább 90%-át a PARP 1 állítja elő. Mint a következőkben látni fogjuk, elsősorban ez az enzim felelős a vizsgált kórfolyamatokban megjelenő PAR-ációért, ezért a továbbiakban csak a PARP 1 működését és annak szabályozását mutatom be.

7

Automodifikációs domén

Cink-ujjak

Katalitikus domén PARP 1

Katalitikus hely

NSL Cink-ujjak

PARP 2

1.ábra. A PARP 1 és PARP 2 szerkezete vázlatosan. A közös elemek a cink-ujjak, amelyek a DNS-kapcsolódást teszik lehetővé, illetve a katalitikus domén. A PARP 1 tartalmaz még egy automodifikációs domént, így aktivitását a PARG szabályozza, illetve a kaszpázok számára van rajta egy hasítási hely. Az apoptózis során aktiválódó kaszpáz 3 és 7 ezért inaktiválja a PARP-t, lehasítva a DNS-felismerő domént. Így nemcsak a hasított enzim válik inaktívvá, hanem a cink-ujj domén verseng a DNS-kötődésért a még ép, hasítatlan PARP 1-gyel is, ezzel is csökkentve a PAR-ációt és energiafelhasználást. A poli (ADP-ribóz) polimeráz-1 fiziológiás működése A PARP 1 legfőbb funkciója a DNS-sérülések érzékelése és a nukleinsav töréseinek helyén a környező fehérjéknek, hisztonoknak és magának a PARP automodifikációs doménjeinek PAR-ációja. A hosszú, elágazó ADP-ribóz polimerek nagy negatív töltést visznek a sérült DNS-szakasz környezetére, ezzel megváltoztatják annak szerkezetét, hozzáférhetővé téve a törött szakaszokat a javító enzimek számára, illetve elősegítik a kromatinszerkezet átalakítását és a transzkripció regulációját is. Nagyszámú transzkripciós faktorról, DNS replikációban részt vevő fehérjéről és szignálmolekuláról bizonyosodott be, hogy a PARP 1 PAR-álja ezeket. A PARP 1 szabályozó működése ezeken a fehérjéken nemkovalens protein-protein interakciók szintjén vagy kovalens PAR-ációval valósul meg.

Maga a PAR-áció egy igen gyors dinamikájú folyamat, a

8

polimer féléletideje rövid (<1 perc), két enzim végzi a bontását (PARG és ADP-ribozil protein liáz). A legutóbbi időkig úgy tartották, hogy a PARP szabályozása elsősorban a DNS-törések szintjén történik, azok lennének az elsődleges aktivátorai a PAR-ációnak (Virág és Szabó, 2002; Jagtap és Szabó, 2005; Virág, 2005; Schreiber et al., 2006; Szabó et al., 2006). A legújabb tanulmányok azonban érdekes eredményekhez vezettek: bizonyítást nyert, hogy a PARP 1 aktivitása több további, endogén és exogén tényező befolyása alatt áll, beleértve több kinázt, az ösztrogént, pajzsmirigyhormonokat, a D-vitamin aktív formáit, poliaminokat, purinokat és koffein metabolitokat is (Mabley et al., 2005; Szabó et al., 2006; Mabley et al., 2007). A PAR-áció részt vesz a sejt igen sok élettani és kóros folyamatának szabályozásában, mint a DNS hibajavítása, génátírás, sejtciklus fázisainak beállítása, sejthalál, kromatin funkció és genetikai stabilitás.

A poli (ADP-ribóz) polimeráz-1 működése kóros állapotokban Ahhoz, hogy az enzim működését megérthessük, tisztáznunk kell az oxidatív és a nitrózatív stressz fogalmát. A szervezetben mind oxigén- mind pedig nitrogéntartalmú szabadgyökök képződnek, amelyek elsősorban mint szignálok, redox szabályzásban részt vevő ágensek szükségesek; másrészt a szervezet védekező reakcióiban is részt vesznek. Azonban reaktív oxigén köztitermékek (ROI) sztochasztikus termelődése is megfigyelhető. A mitokondriális légzési láncról lecsorgó egy-egy elektron képezi ezeket, molekuláris oxigénhez kapcsolódva szuperoxidot hoz létre (O2 + e- → O2-) A B

B

P

P

B

P

PB

szervezet antioxidáns rendszerei hidrogén-peroxidon keresztül vízzé redukálják a szuperoxidot szuperoxid-diszmutáz, illetve kataláz segítségével. A vízből és a H2O2-ból B

B

B

B

is képződhet hidroxilgyök (OH.). Ezek az agresszív oxidálószerek, ha kikerülik az P

P

antioxidáns rendszereket, képesek a szerves molekulákat támadni, ekkor károsítva a membránokat (lipidperoxidáció), enzimeket és ioncsatornákat (ha fehérjéket támadnak), illetve a DNS-t is károsíthatják. A szervezetben fontos szabályozó molekula a szintén szabadgyök természetű nitrogénmonoxid (NO.). Jelen munkámban kiemelem, hogy az endotélium eredetű relaxációs P

P

faktor (EDRF) azonos a NO.-dal (Ignarro et al., 1987), de szerepe van más szabályozási P

P

folyamatokban is, például mint neurotranszmitter. A NO. reakcióba léphet a O2-- dal, P

P

B

PB

P

ezzel létrehozza a reaktív nitrogén intermediereket (RNI), köztük a rendkívül reaktív

9

peroxinitritet (ONOO-). A ONOO-, akárcsak a ROI, támadja a membránokat és a P

P

P

P

fehérjéket, főleg az aminosavak fenolos oldalláncait. A tirozin ilyen jellegű módosítása annak foszforilációját gátolja, (ez a reakció hozza létre a nitrotirozint, ami arra ad lehetőséget, hogy immunhisztokémiai módszerekkel megbecsülhessük a nitrozatív stressz mértékét,) a szerkezet megváltozása funkciókiesést vonhat maga után. Ugyanakkor még a ROI-nél is agresszívebben támadja a DNS-t, egy- és kétszálú töréseket hagyva maga után. A PARP ezeket a DNS-töréseket ismeri fel, és a DNS-hez kapcsolódva a H1 hisztonokat glutamát oldalláncaikon PAR-álja. A nukleon B

B

konformációja a PAR oldalláncok alatt megváltozik, szerkezete fellazul, ezzel helyet készít a DNS-javítás enzimeinek. De mit is jelent a PAR-áció? Az aktivált PARP NAD+-t hasít nikotinamid (NA) és ADP-ribóz (ADPr) egységekre. A P

P

NA szabadon távozik, az ADPr elemeket pedig hozzákapcsolja a fehérjéhez, majd innen kiindulva hosszú, akár 200-400 monomerből álló, gyakran elágazó láncokat fűz adapter fehérjéihez (Sugimura and Shimizu, 1968; Burkle, 2001b) (2. ábra). (Mivel a legkisebb, immunhisztokémiai módszerekkel kimutatható PAR 25-30 monomerből épül fel, nem tudjuk megmondani, mekkora a legalacsonyabb monomerszámú hatékony PAR.) Maga az aktív PARP dimer, és a dimer tagjai egymásra is hasonló PAR-láncokat kapcsolnak, az automodifikációs doménen. Az autoPAR-áció gátolja az enzimet. (Ogata et al., 1981; Adamietz, 1987) A PARP fontos szerepet tölt be a genom integritásának megőrzésében, és a DNSjavításnak is segítségére van (Burkle, 2001b). Nemcsak a stressz indukálja a PAR-ációt, alapállapotban a PARP-család több szabályozási folyamatban is részt vesz, egyes géntermékek átírására nagy hatással van, és jelenléte a magzat fejlődéséhez esszenciális (PARP 1 és PARP 2 kettős deficiens mutáció letális). Mivel aktív állapotában a PARP sok NAD+-t bont el, működése a mitokondriális légzési P

P

lánctól elvonja a NAD+-t, ezzel energetikailag hátrányos helyzetbe hozva a sejtet. Ha P

P

ezt megnövekedett oxidatív és nitrozatív stressz állapotában teszi, a sejtek károsodása irreverzibilissé válik. Az apoptózis energiaigényesebb folyamat, mint a nekrózis, ATPdepléció esetén ezért az utóbbi felé tolódik el a sejthalál mechanizmusa. A nekrotikus folyamatok gyulladáshoz vezetnek, tovább fokozva a szabadgyökök károsító hatását. A PARP kifejezett aktivációja a mitokondrium felé szignált küld, aminek hatására apoptózis indukáló faktor (AIF) lép ki a plazmába, és aktiválódnak a kaszpázok. A

10

génátírási mintázatot is megváltoztatja, indukálja a gyulladási citokinek szintézisét. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a PARP aktivációja oxidatív stresszben a védekezési folyamatok egyik lényeges láncszeme, de, akárcsak az immunrendszer reakciói, ha „túlpörög a rendszer”, a hatás további károsodásokhoz vezet.

NAD+ P

P

Hiszton

NA

2. ábra. A PARP 1 vázlatos működése. Az oxidatív és nitrózatív stressz a DNS egyszálú törését okozza. A cink-ujj domén felismeri a nukleinsav sérülését, és a katalitikus domén 15-200 ADP-ribóz alegységből álló PAR-t szintetizál a közeli hisztonokon. Ez negatív töltést visz a fehérjére, ami elektrosztatikusan taszítja a DNS-t, minek következtében annak szerkezete fellazul, és a javító enzimek számára hozzáférhetővé válik. Eközben a PARP NAD+ -t használ, és nikotinamidot szabadít fel. Ez a magyarázata, hogy P

P

miért lehetett az egyik legkorábbi PARP-gátlóként használt szer a nikotinamid: nagy mennyiségben a PAR-képződést leállítja, hiszen minden enzimatikus reakció egyensúlyra vezet, amit a végtermék felhalmozódása gátol.

11

A poli (ADP-ribóz) polimeráz aktivitásának szabályozása A PARP legfontosabb aktivátora az egyszálú DNS-törés, de a kettős szálú DNS-törések is működésbe hozzák az enzimet. Az enzim gátlásánál viszont jelentős számú tényezőt említhetünk meg. A folyamatosan képződő PAR-t két enzim távolítja el a fehérjékről, és bontja ADPr egységekre: a poli (ADP-ribóz) glikohidroláz (PARG) és az ADP-ribozil protein liáz. A polimer lebontásának kulcsenzime a PARG. A PARG exoglikozidáz aktivitása révén képes a PAR terminális ADPr egységeinek hidrolizálására, valamint endoglikozidázként működve nagyobb oligo(ADPr) fragmentek eltávolítására (Brochu et al., 1994; Davidovic et al., 2001). Mivel a PARG affinitása sokkal nagyobb a hosszabb ADPr polimerekhez, mint a rövidebbekhez (Hatakeyama et al., 1986), ezért valószínű, hogy az enzim először a nagyobb molekulákat bontja le. A PARG ezután exoglikozidázként egyenként távolítja el az ADPr egységeket. A fehérjéhez közvetlenül kapcsolódó ún. proximális ADP-ribóz egységet egy alig jellemzett enzim, az ADP-ribozil protein liáz távolítja el (Oka et al., 1984). A PARG magas specifikus aktivitása kompenzálja az enzim kis mennyiségét. Közel 90%-os PARG aktivitás gátlás szükséges a PAR intracelluláris felhalmozódásához (Jonsson et al., 1988a; Jonsson et al., 1988b). A poli (ADP-ribóz) mennyiségét két enzim aktivitásának egyensúlya határozza meg: a PARP és a PARG antagonisztikus tevékenysége. Mivel a PARP 1 automodifikációs doménjának PAR-ációja inaktiválja az enzimet, így ezen keresztül is szabályozza a PARG a PARP aktivitását (Kawaichi et al., 1981). Az ATP viszont gátolja az automodifikációt, ezért valószínűleg jó energiaellátottságú sejtekben az autoreguláció nem működik (Kun et al., 2004). Mivel az ADP-riboziláció folyamata NAD+-t emészt P

P

fel, ami a sejt energiaraktárainak kimerüléséhez vezethet, ezért érthető, hogy a rendszer védekezik a NAD+-készletek kimerülése ellen, ha nem elegendő az ATP. P

P

Ha az apoptotikus útvonal aktiválódik, kaszpázok (kaszpáz 3 és 7) hasítják a PARP-t, a DNS-kötő és a katalitikus domén között. Ekkor az enzim elveszti aktivitását, de a DNSkötő doménok affinitása megmarad, kompetitíven gátolva az aktiválható formák kapcsolódását a DNS-hez. A szervezetben lejátszódó, enzimekkel katalizált kémiai folyamatok jelentős része egyensúlyi állapotra vezet, így a PAR képződése is. A reakció végtermékeként felszabaduló, és lokálisan felhalmozódó nikotinamid szintén gátolja a PARP aktivitását,

12

ami negatív visszacsatolással védhet a PARP túlzott aktivációja ellen (Sims et al., 1981). Bizonyos hatásokra (például ionizáló sugárzásnak kitett szövetekben) nemcsak a PARP aktivitása növekszik, hanem a fehérje mennyisége is. Ez a jelenség transzkripciós szabályozásra utal (Bergeron et al., 1997; Tramontano et al., 2000; Doucet-Chabeaud et al., 2001). Ezzel elérkeztünk a hosszabb láncú szabályozási folyamatokhoz, amelyek az enzim aktivitását a teljes szövet, vagy akár szervezet állapotához igazítják. Talán a legrégebben ismert ilyen szabályozási mechanizmus, hogy a PARP foszforilációja (protein kináz C-vel, rövidítése PKC) az enzim gátlásához vezet (Tanaka et al., 1987; Bauer et al., 1992). Újabb, munkacsoportunk által megfigyelt szabályozási utat jelent az, hogy az ösztrogén receptor α és a PARP összekapcsolódik, ha a receptorhoz ösztrogén kapcsolódik, ekkor a PARP affinitása a DNS-hez nagymértékben csökken (Mabley et al., 2005). Részben erre a jelenségre vezethető vissza az ösztrogén protektív hatása a kardiovaszkuláris rendszerben. Még újabb adat, hogy a D-vitamin szintén gátolja a PARP aktivációját, amely tulajdonság valószínűleg szerepet játszik a Dvitamin gyulladásgátló hatásában (Mabley et al., 2007). A PARP aktivációinak káros következményeit figyelembe véve érdemes volt kísérletesen kipróbálni, milyen hatásai lehetnek az enzim gátlásának különböző, magas ROI-RNI szinttel járó állapotokban, úgymint gyulladásos reakció, ischémiás-reperfúziós modellekben és a kardiovaszkuláris rendszer egyes kóros állapotaiban. Az ilyen vizsgálatokhoz kezdetben a nikotinamidot használták, amiből kellő enzimgátlás eléréséhez nagyon magas dózisokat kellett adni a kísérleti szervezeteknek. Később az Inotek Pharmaceuticals Corporation kifejlesztett egy kompetitív PARP-gátló molekulát, amelyet PJ34 néven ismernek (a vegyész Prakash Jagtap nevéből ered a rövidítés). Sajnos ez a molekula farmakológiai tulajdonságai miatt nem ideális arra, hogy humán alanyokat kezeljenek vele, ezért megmaradt a laboratóriumokban. Nem így a következő, allosztérikus PARP-gátló, amely szintén Jagtap Prakash fejlesztése, és INO-1001 néven találkozunk vele, már klinikai kipróbálás alatt áll. A genom integritását és a DNS-javítást támogató enzimként a PARP a daganatterápiának is célpontjává vált. PARP-gátló kezelésekkel kombinálva a kemoterápiát a tumorsejtek regenerációja romlik, ezáltal hatékonyabbá válik a kezelés.

13

Az oxidatív stressz szerepe a korral járó krónikus betegségek kialakulásában A következő fejezetekben a keringési rendszer korosodással együttjáró élettani és patológiás változásairól készítek összefoglalást. A továbbiakban a metabolikus X szindróma három lényeges komponensét, a hipertóniát, diabétesz mellituszt és érelmeszesedést mutatom be, egymással összefüggésben. Szükséges, hogy az öregedés feltételezett mechanizmusaira és modellezésére is kitérjek, mivel ismereteink szerint az ateroszklerózis, a cukorbaj és a magas vérnyomás betegség nemcsak gyakran társul a korosodáshoz, de feltételezhető, hogy e három krónikus betegség kiváltó tényezői között szerepel. Az öregedés genetikai és hibafelhalmozódáson alapuló elmélete Az emberi öregedés egy igen különleges folyamat, mivel a legtöbb állatfajnál nem figyelhető meg. Természetes körülmények között ugyanis azok korábban elhullanak, még fiatalon vagy középkorúan. A korosodás folyamatát vissszavezethetjük proximális és disztális okokra, illetve külső és belső tényezők hatására. A disztális ok az, hogy a szelekció 1. nem hatott az öregedés ellen, mivel az a szaporodási koron túl válik csak kifejezetté; 2. támogatta azokat a stratégiákat, ahol az egyed az utódok nevelésére viszonylag nagyobb részét fordította a rendelkezésre álló forrásainak, mint önmaga fenntartásának, és inkább idővel leépült; így nagyobb számú utód, több „öregedő” replikon jelent meg a következő generációkban; 3. az öregedésért felelős gének egy jelentős része olyan tulajdonságokat kódolhat, amelyek az élet korai szakaszában adaptívak lehetnek. 4. egy nem öregedő populációban a domináns hímeket nehezebben szorítanák ki a következő nemzedék tagjai, így azok saját nőstény utódaikkal is bepárzanának, ezzel a belterjes szaporodással növekedne a homozigóták aránya, csökkenne a diverzitás és emelkedne a káros (recesszív) gének kódolta tulajdonságok megjelenési gyakorisága. A proximális okok maguk az öregedést előidéző illetve azzal járó folyamatok összessége. Ezeket a következőképpen csoportosíthatjuk: I. Programozott öregedés elmélete, amely szerint a sejt öregedése és halála a DNSben kódolt folyamat; ennek megfelelően a teljes szervezet korosodási folyamatai

14

is részben genetikailag determináltak. (Martin, 1980; Smith and Pereira-Smith, 1989a; Smith and Pereira-Smith, 1989b; Leung and Pereira-Smith, 2001) II. Hibafelhalmozódáson alapuló elméletek (Blumenthal and Berns, 1964; Welch, 1967; Srivastava et al., 1999; Terman, 2001; Jolly, 2004; Kujoth et al., 2006). Ezeket a további alcsoportokra oszthatjuk: 1. Klónelmélet: az osztódóképesség determinált. 2. Mutációs elmélet: a DNS-javító enzimek aktivitása hosszú életű állatokban

(ember,

elefánt)

ötszöröse

a

rágcsálókban

mérhető

aktivitásnál. 3. Szabadgyök-elmélet: részben a DNS szomatikus mutációjához vezet, részben a lipid- és fehérjekárosító hatás révén gátolja a sejtek normális működését. A membránkárosodás miatt megemelkedik az intracelluláris K+-szintje, ami a kromatin kondenzációját fokozza és ezzel a P

P

transzkripciós aktivitást csökkenti. Szintén kimutatható, hogy hosszú életű állatok kataláz, SOD és peroxidáz-aktivitása magasabb, illetve antioxidánsok hozzáadása a táptalajhoz a fibroblasztok osztódási képességét megnöveli. 4. Autoimmun elmélet: a szomatikus sejtekben bekövetkező mutációk megváltoztathatják a sejt antigén-szerkezetét, ezzel az autoantigénként viselkedhet. A T-sejt populáció időskorban a fiatalkorinak a tizedére csökkenhet, amíg a B-limfociták mennyisége alig változik. Ebből következően a magzati korban kialakult immuntolerancia csökken, az eddig sajátként felismert sejtek immunreakciót válthatnak ki. 5. Hibakatasztrófa-elmélet: a fehérjeszintézis zavarára vezeti vissza az öregedési folyamatokat. 6. Bomlástermék-teória:ez a legrégibb elmélet az öregedés folyamatára. Ezen feltevés szerint a korosodás legfőbb oka a lipofuszcinfelhalmozódás, amely gátolja az mRNS-szintézist. A korosodást általában különböző hibák felhalmozódásával magyarázzák. A sejtosztódások során hibák jelennek meg. A DNS hibás másolatait komplex enzimrendszerek javítják, ám ezek is hagynak egy-egy elírást. (Kb. 1 000 000 bázispáronként találunk egy másolási hibát.) Evolúciósan ez az arány bizonyult az

15

eukariótáknál „elegendően hatékonynak”, kicsivel nagyobb pontosság is már jelentősen növelné a ráfordítást, nagyobb pontatlanság veszélyeztetné az információ továbbjutását. Ez az egymilliomod hiba az evolúció nyersanyaga. A hibák gyakorisága növekszik, ha a genetikai anyagot több károsító hatás éri. Ez, főleg az ember esetén annyiból állhat, hogy olyan területre vándorol át, ahol az ionizáló sugárzás (pl. az alapkőzet radioaktív izotóptartalma) magasabb, mint amilyen környezethez az ősei adaptálódtak az elmúlt néhány tíz generációban. De ugyanilyen kihívást jelentenek egyes xenobiotikumok, vagy a gyakori gyulladásos folyamatok is. Ezen öregedési folyamatok mögött is részben az áll, hogy a javító mechanizmusok hatékonysága az életkorral csökken, ami részben ezek sérüléseire vezethető vissza, részben arra, hogy a szervezet leépíti ezeket. Ismert példa az utóbbira a telomeráz enzim működése, illetve az antioxidáns rendszerek életkorfüggő aktivitás-csökkenése. Ugyanígy figyelemre méltó, hogy egyes gének transzkripciója az életkorral változik. A téma szempontjából kiemelendő, hogy a poli (ADP-ribóz) glikohidroláz átírása idős korban körülbelül a harmadára csökken (Kayo et al., 2001), illetve a vazorelaxáns adenozin A2A receptor expressziója 5,5-ödére esik (Jenner et al., 2004). B

B

Tekoppele munkacsoportja azt találta, hogy a Maillard reakció következtében kialakuló termékek (főként AGE) felhalmozódik az idős emberek ízületi porcaiban (Verzijl et al., 2000). (A Maillard reakciók a fehérjék nem-enzimatikus módosulásait, redukált cukrokkal történő glikációját jelentik.) Az ebben a tanulmányban közreműködő John W. Baynes az öregedési folyamatokat elsőorban az oxidatív stresszre és a Maillard reakciókra vezeti vissza. Elmélete szerint a kémia és a biológia örökös versenyben áll az élő szervezetekben, ahol a degradáció felé törő kémia nyeri meg a csatát (az organizmus elpusztul), de a háborút a biológia (a fajok túlélnek) (Baynes, 2000). Arlan Richardson laborja (Hamilton et al., 2001) azt a kérdést vizsgálta, hogy a korosodással együtt jár-e a DNS gyakoribb oxidatív sérülésével. (Bár általánosan elfogadott, hogy igen, de ebben részben szerepet játszhat a DNS oxidációja az izolálás során; egy erre kifejlesztett, kíméletesebb technikát használtak a kérdés körüljárására.) Ez a munkacsoport is azt találta, hogy rágcsálóknál a DNS oxidatív sérülése (a 8-oxo-2deoxiguanozinszint, oxo8dG) az életkorral valamennyi vizsgált szervben: az agyban, májban, szívben, vesében és izomszövetben gyakoribbá vált. A máj mitokondriumait vizsgálva ez a növekedés csak a középkorú, vagy idősödő állatok esetén volt

16

megfigyelhető. A tanulmány érdekessége az, hogy szubletális dózisú ionizáló sugárzásnak (2 Gy) tették ki az alanyokat az egyik vizsgálatban, majd 0, 7,5, 15 illetve 30 perc után feláldozták az állatokat, hogy a DNS oxidatív sérüléseit vizsgálják rajtuk. Minden életkorban az oxo8dG kezdetben a kezeletlen csoporthoz képest tízszeres növekedést mutatott, ami 15 (fiatal) illetve 30 (öreg) perc után visszaállt a besugárzás előtti szintre. Amikor az öreg és a fiatal egerek γ-sugárzás okozta DNS-károsodását összevetették, azt találták, hogy az idős egereknél 60%-kal magasabb volt az oxo8dG a májszövetben, 85%-kal a szívben és 170%-kal az agyban. Az eliminálásához pedig kétszer annyi időre volt szükség. Ugyanakkor ezekben a szövetekben lényegileg nem különbözött az antioxidáns enzimek (Mn-SOD, CuZn-SOD, gluthátion-peroxidáz és kataláz) aktivitása a különböző korú állatoknál. Ebből a megfigyelésből arra következtettek, hogy idősebb korban megnő a szervezet érzékenysége az oxidatív stresszel szemben.

Diabétesz mellitusz Mivel a cukorbetegségre jellemző az oxidatív és nitrózatív stressz, amelyek már inzulinrezisztens illetve glukóz-intoleráns állapotokban megjelennek, ezért indokoltnak látom, hogy hosszabban tárgyaljam ezt a kórfolyamatot. A diabétesz minden formájára jellemző a krónikus hiperglikémia. Ennek fellépését a vércukorszint minél hatékonyabb és pontosabb beállításával csökkenteni lehet, de teljesen

nem

lehet

kiküszöbölni.

A

hiperglikémia

következményeképpen

a

cukorbetegekben jellegzetes mikrovaszkuláris elváltozások jelennek meg, pl. a retinában, a veseglomerulusokban és a perifériás idegekben. Ezen mikrovaszkuláris elváltozások következtében a cukorbetegség szövődménye lehet többek között vakság, krónikus vesebetegség, és a diabetikus neuropátia. A cukorbetegség gyorsan progrediáló érelmeszesedéshez is vezet azokban a nagyobb artériákban, amelyek érintik a szív, az agy és az alsó végtagok vérellátását. (Candido et al., 2003)Következésképpen a cukorbetegeknek

jóval

nagyobb

az

esélyük

infarktusra,

agyvérzésre

és

végtagamputációra. Számos klinikai vizsgálat mutatja, hogy szoros összefüggés van a vércukorszint és a diabéteszes mikrovaszkuláris szövődmények között, mind az egyes, mind pedig a kettes típusú diabéteszben. Az emelkedett vércukorszint és az

17

inzulinrezisztancia egyaránt fontos szerepet játszik a makrovaszkuláris szövődmények kialakulásaban. Mind az inzulinrezisztancia, mind a hiperglikémia érintett a diabéteszes diszlipidémia patogenezisében. A hiperglikémia többek között az apolipoprotein B-tartalmú maradványrészecskék felszaporodásához vezet, mivel csökkenti bizonyos heparánszulfát proteoglikánok expresszióját a hepatocitákban. Az érelmeszesedés és az aterogenetikus rizikófaktorok szoros kapcsolata a vércukorszinttel a glukóztolerancia széles skáláján kimutatásra került, a normális cukortoleranciától a diabéteszesig. A posztprandiális hiperglikémiából jobban lehet következtetni az ateroszklerózis veszélyére, mint az éhgyomri glükózszintből vagy a vérplazma hemoglobin A1ctartalmából. (Basta G etal., 2004) Négy fő elmélet van azzal kapcsolatosan, hogy az emelkedett vércukorszint hogyan vezet az endotél diszfunkciójához, illetve a diabéteszes szövödmények kialakulásához. Ez a négy hipotézis a következő. 1. A poliol útvonal megnövekedett szerepe; 2. A megnövekedett késői glikációs termékek (advanced glycation endproducts, AGE) termelődése; 3. A PKC egyes formáinak aktiválódása; és 4. Megnövekedett hexózaminútra áramlás (3. ábra).

3. ábra. A diabétesz mellitusz szövődményei kialakulásának biokémiai háttere.

18

Fentről lefele haladva, a poliol útvonal megnövekedett szerepe (amelyet a glukóz koncentrációjának növekedése okoz); a megnövekedett hexózamin-útra áramlás (amelyet a megnövekedett fruktóz-6-foszfátszint okoz), a protein kináz C (PKC) aktiválódása és a megnövekedett a késői glikációs termékek (advanced glycation endproducts, AGE) termelődése (mindkét utóbbi folyamat a gliceraldehid-3-foszfát megemelkedésének következménye). A GAPDH enzim gátlása a fő oka annak, hogy a glukóz metabolizmusa a fenti négy reakcióútra terelődik. A poliol reakcióúton keresztül a glukóz szorbitollá majd fruktózzá alakul, amely NAD+- és NADPH felhasználásával jár. Mindez csökkenti a P

P

glutathion (GSH) regenerációját, ami megnöveli a sejtek érzékenységét oxidatív stresszre. Ugyanezek a mechanizmusok megnövekedett ozmotikus stresszt is okozhatnak, amely károsíthatja a vaszkuláris endotélt. A hexózamin-úton a glutamin:fruktóz-6-foszfát amidotranszferáz (GFAT) segítségével a glukózamin6-foszfát és UDP-N-acetilglukózamin (UDP-GlcNAc) termelődése fokozódik. Ez az SP1-PA I mechanizmuson, és más reakcióutakon keresztül okoz különféle géntranszkripciós

és

poszttranszkripcionális

módosításokat,

amelyek

hozzájárulnak a diabetikus vaszkuláris gyulladás és az endotéldiszfunkió kialakulásához. A protein kináz C (PKC) reakcióút aktivációja során a dihidroxiaceton-foszfátból (DHAP) diacilglicerol (DAG) képződik, amely aktiválja a PKC β-és δ-izoformáit. A PKC aktivációja az endotél diszfunkcióját, és a nátrium-kálium pumpa inaktivációját okozza, valamint különféle gyulladásos reakcióutakat is aktivál. Végül, az AGE termelődése, elsősorban intracelluláris metilglioxálból, módosításokat okoz számos vaszkuláris és mátrixfehérjében, valamint az AGE receptorát (RAGE) aktiválva oxidative stresszt indukál és gyulladásos mechanizmusokat aktivál. A B1 vitamin, valamint módosított B1 vitamin-származékok (pl. benfotiamin) a transzketoláz enzimet aktiválják, amelynek hatására glicerinaldehid foszfát és a fruktóz-6foszfát átalakul pentóz-5-foszfáttá, eritróz-4-foszfáttá és más cukrokká, ezáltal elterelve a cukor metabolizmusát az AGE és a PKC utak aktivációját okozó utaktól. Állatmodellekben és sejtszintű vizsgálatokban is bizonyított, hogy a diabétesz számos oxidánsokat és szabadgyököket termelő enzim működését fokozza. Ezen enzimek és

19

enzimrendszerek között van a citokróm P450, a lipoxigenáz, a xantin-oxidáz és az NAD(P)H-oxidáz. Ennek ellenére, az utóbbi évek kutatásainak eredményei alapján megállapítható, hogy az emelkedett vércukorszint hatására történő szuperoxidtermelődés legnagyobb mértékben az endotélsejtek mitokondriumaiból származik (2. ábra). Az intracelluláris glukózkoncentráció emelkedése az endotélsejtekben fokozza a glikolízist, amely másodlagosan fokozza a mitokondriumok aktivitását, és a mitokondriumok belső membránján a protonok elektrokémiai potenciálkülönbségét (amely végeredményben a mitokondriális elektrontranszport motorja, és így a mitokondrium oxidatív foszforilációs munkájának fenntartója). Amikor a mitokondrium belső membránján létrejött protongrádiens az elektrokémiai potenciálkülönbség emelkedése

miatt

megnő,

bizonyos

szuperoxid-termelő

elektrontranszport-

intermedierek, pl. az ubikinon, életideje meghosszabbodik. Létezik egy küszöbérték, ami fölött ezen szuperoxid-termelés jelentősen megemelkedik. A hiperglikémia a protongrádienst e fölé a küszöb fölé emeli, amely az elektrondonorok Szent-GyörgyiKrebs-ciklusbeli túltermelődésével jár együtt. Ez viszont a szuperoxid-termelés jelentős emelkedését okozza az endotélsejtekben. Végeredményben tehát, a hiperglikémia a mitokondriumok túlműködését okozza, amelynek eredményeképpen a III. számú mitokondriális elektrontranszport alrendszerből fölös elektronok csorognak le, amelyek szuperoxid szabadgyökök termelődéséhez vezetnek (4. ábra). A mitokondriális szuperoxid, amenyiben túlzott mértékben termelődik az endotélsejtekben és a sejt nem képes semlegesíteni, vagy hidrogén peroxiddá és hidroxil gyökké alakulhat, vagy pedig reagálhat az endotélsejtben bazálisan termelődő nitrogen monoxid szabadgyökkel, amely a peroxinitrit (ONOO-) képződéséhez vezet. A peroxinitrit több úton is károsítja a P

P

sejteket, pl. fehérjék nitrálását és oxidálását okozza, megváltoztatva vagy megszüntetve azok funkcióját. Oxidálhatja a tetrahidrobiopterint (amely az eNOS enzim egyik esszenciális kofaktora). Csökkent tetrahidrobiopterin-szint mellett az eNOS nem tudja feladatát megfelelően ellátni. Egy másik mechanizmussal, diabéteszes endotélsejtekben a peroxinitrit inaktiválja a prosztaciklin szintetáz enzimet, amely által csökken a prosztaciklin endogén sejtvédő hatása, és eltolódik a vaszkuláris egyensúly a vazokonstriktor,

protrombotikus

hatású

prosztanoidok

(pl.

prosztaglandin H2) irányába. (Nishikawa et al., 2000; Brownlee, 2001) B

B

20

tromboxán

A2, B

B

A diabéteszes komplikációkkal kapcsolatosan azonban talán a peroxinitrit egyik legjelentősebb hatása, hogy a DNS károsodását (az egyik DNS szál törését) előidézve aktiválja a sejtmagban elhelyezkedő PARP-t, amely különböző sejtmagbeli molekulák ribozilálása során a sejt energiaraktárait (NAD+, ATP) csökkenti (2. ábra). A PARP P

P

aktivációja nemcsak a citoszol NAD+ szintjét, hanem a NADPH szintjét is csökkenti. P

P

Mivel a NADPH (a tetrahidrobiopterin mellett) az endoteliális NO szintáz enzim másik nélkülözhetetlen kofaktora, a NADPH csökkenése miatt is csökken a NO. szintáz P

P

aktivitása. (Megjegyzendő, hogy megfelelő kofaktorok hiányában az eNOS nemcsak nem termel nitrogén monoxidot, de ehelyett más káros reaktív gyököket, mint pl. szuperoxidot generálhat, ezáltal tovább fokozva az oxidatív stresszt a sejtben.) További nagyon fontos mechanizmus, hogy a PARP aktivációja az endotélsejtek gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) enzimének módosításához (poli (ADPribozil)áció) vezet, amely az enzim aktivitását csökkenti (4. ábra). A GAPDH enzim aktivitásának csökkenése alapvető fontosságú tényező a diabétesz szövődményeinek molekuláris patogenezisében, mivel direkt módon befolyásolja mind a négy, fentebb ismertetett kórélettani utat (aldóz-reduktáz, AGE-formáció, PKC aktiváció és a hexózamin útvonal) (Du et al., 2003). Mitokondrium

ROI

Sejtmag

PARP

4. ábra. A gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) enzim gátlásának sejtes mechanizmusa és szerepe a diabetikus szövődmények kialakulásában.

21

Emelkedett

extracelluláris

glukózkoncentrációt

okoz

glukózkoncetráció az

emelkedett

endotélsejtekben.

Az

intracelluláris intracelluláris

glukózkoncentráció emelkedése fokozza a glikolízist, amely másodlagosan fokozza a mitokondriumok aktivitását, és a mitokondriumok belső membránján a protonok elektrokémiai potenciálkülönbségét. A hiperglikémia ilymódon a mitkondriumok túlműködését okozza, amelynek eredményeképpen a III. számú mitokondriális elektrontranszport alrendszerből fölös elektronok csorognak le, amely szuperoxid szabadgyök termelődéséhez vezet. A mitokondriális szuperoxid vagy hidrogén peroxiddá és hidroxil gyökké alakulhat - együttesen az előbb említett gyököket és oxidánst reaktív oxygen specieseknek nevezzük (ROS) -, vagy pedig reagálhat az endotélsejtben bazálisan termelődő nitrogén-monoxid szabadgyökkel, amely a -

peroxinitrit (ONOO ) nevű reaktív oxidáns képződéséhez vezet. Mindezek a gyökök P

P

és oxidánsok a DNS károsodását (az egyik DNS szál törését) előidézve aktiválják a sejtmagban elhelyezkedő PARP 1-t, amely, más hatások mellett (sejt energetikai raktárainak csökkentése, gyulladásos gének transzkripciójának fokozása, stb.), az endotélsejtek

gliceraldehid-3-foszfát

dehidrogenáz

(GAPDH)

enzimének

módosításához (poli (ADP-ribozil)áció) vezet, amely az enzim gátlását okozza. Mindez négy, az 3. ábrán részletesebben is feltüntetett reakcióúton (poliol, AGE, PKC, hexózamin utak) keresztül vezet a diabétesz mellitusz szövődményeinek kialakulásához. A fenti folyamatok egyes tényezői nemcsak kísérletes modellekben, hanem humán mintákon is kimutathatóak. Például a diabétesz során kialakuló DNS károsodás kimutatást nyert diabéteszben szenvedő betegek fehérvérsejtjeiben, és a PARP aktivációja kimutatásra került diabéteszes betegek bőrbiopsziáiban található kiserek endotélsejtjeiben (Szabó et al., 2002b). A peroxinitrit termelődését humán diabéteszben többek között a nitrotirozin (amely egy, a peroxinitrit hatására létrejövő módosított aminosav) immunohisztokémiai kimutatása bizonyítja. Tirozin-nitrációt diabéteszes szövetekben, valamint diabéteszes betegek perifériás vérében is ki lehet mutatni, ez utóbbit a postprandiális hiperglikémia mértékével arányosan. A PARP aktivációja és a diabéteszes betegek endotélfüggő relaxációs készségének csökkenése között direkt korrelációt lehet megállapítani. Állatmodellekben a PARP gátlószereivel kezelt állatok,

22

vagy olyan genetikailag módosított állatok, amelyekben a PARP domináns, 1. típusú izoformája hiányzik, védettséget mutatnak a diabétesz különféle szövődményeivel szemben (vaszkuláris diszfunkció, kardiomiopátia, neuropátia, retinopátia). Ateroszklerózis Az ateroszklerózis az artériák intimájának jellegzetes elváltozása, amelynek során a lipidek érfalba történő lerakódása, kötőszöveti elemek

és véralkotó részek felhal-

mozódása következik be. A plakképződés érszűkületet von maga után, ennek következtében a mögöttes érszakasz vérellátása zavart szenved, az ischémiás területek megjelenése pedig számos súlyos, akár végzetes problémát szülhet. Az ateroszklerózis és az infarktus nőkben a menopauza előtt hozzávetőlegesen háromszor ritkábban fordul elő, mint férfiakban. Ennek oka a nők magasabb ösztrogénszintje,

alacsonyabb

intenzitású

anyagcseréje,

fokozott

fibrinolitikus

aktivitása, illetve az is megfigyelhető, hogy a szaporodóképes korú nőkben alacsonyabb a triglicerid- és magasabb a HDL-koleszterin szint, mint a férfiakban. A menopauza megjelenésével ez a relatív védettség csökken, majd megszűnik, és a nők körében is gyakoribbá válnak a különböző szív és érrendszeri megbetegedések. Az ateroszklerózis kialakulására vonatkozóan számos elmélet született (lipidelmélet, trombogén elmélet, kötőszövetes elmélet, sérüléssel, áramlással, retencióval kapcsolatos elméletek, valamint immunelmélet). Ezen elméletek közül a „lipidelmélet“ tekinthető a leginkább elfogadottnak. E szerint alapvető jelentőségű, hogy a vérplazmában megemelkedik a koleszterin- és/vagy a trigliceridszint. A hiperkoleszterinémiára utaló magas LDL (low density lipoprotein) szint a vérplazmában igen jelentős rizikófaktor az ateroszklerózis kialakulásában, hiszen ilyenkor az érfal sejtjei nemcsak “szokványos” hanem úgynevezett “scavenger” receptoraikkal is elkezdik felvenni (receptor mediált endocitózissal) az LDL által szállított koleszterint. A koleszterin

szteroidvázas

vegyület, a sejtek nem képesek lebontani. Az érfalban megjelenő túlzott mértékű lipidtartalom hatására a jelenlévő endotél- és simaizomsejtekben, valamint az odaérkező makrofágokban, monocitákban aktiválódó enzimek oxigén szabadgyököket termelnek, amelyek az LDL-ből

oxidált LDL-t hoznak létre. Az oxidált LDL következtében

endotél-károsodás, vérlemezke- aktiváció jön létre beindítva a véralvadási rendszert és a simaizomsejtek proliferációs folyamatait. A lipidlerakódás egy bizonyos ideig reverzibilis folyamat lehet, az ateroszklerózis azonban visszafordíthatatlanná válik,

23

amikor a koleszterint felvevő sejtek “habos sejtekké” alakulnak. Az ilyen módosult sejtek kollagént és más kötőszöveti mukopoliszacharidokat termelve hozzák létre az ér lumenébe bedomborodó plakkot. A plakkra kalcium rakódik le, megkeményedik, majd ez felrepedve helyet és alkalmat biztosít a trombociták megtapadásához. A sérült endotélen való megtapadás után, a trombociták

aktiválódása és aggregálódása

következik be, majd különböző vazoaktív anyagok szabadulnak fel (szerotonin, prosztaglandinok, leukotriének), amelyek nem csak további vérlemezkéket aktiválnak, hanem fokozzák az érfal permeabilitását is. Az utóbbi pedig tovább könnyíti az LDL érfalba kerülését. Így a vérplazma magas koleszterinszintje mellett a sérült endotélhez érkező vérlemezkék közvetlenül is hatnak az érfal sejtjeinek fokozott LDL felvételére (Stocker and Keaney, 2004). A másik elmélet, amellyel foglalkoznunk kell, a „válasz a sérülésre“ mechanizmuson alapszik. E szerint az érfalat ért traumák (tipikus modellje az angioplasztika, de sérülést okoz a vérnyomás emelkedése, a dohányfüst szén-monoxid tartalma, a koleszterin vagy a szabadgyökök megjelenése nagyobb mennyiségben – olyannyira, hogy beszélhetünk ma már önálló szabadgyök-elméletről) indítják be azokat a folyamatokat, amelyek miatt végeredményben az LDL nagyobb affinitást mutat a lerakódásra az érfalban. A szabadgyök-elmélet magyarázatára igen alkalmas Ullrich munkacsoportjának tanulmánya. Ők arról számolnak be, hogy a szervezetben előforduló mennyiségű ONOO- az eNOS cink-tiolát centrumát megtámadja, mivel a cink részleges pozitív P

P

töltése hozzáférhető. Ez az oxidációs folyamat a cink-tiolát centrumot károsítja, felszabadul a cinkion és a tiol oxidálódik. Az eNOS ennek következtében aktív dimerből inaktív monomerekre esik szét, minek következtében csökken a NO felszabadulás és növekedik az endotélium O2- -termelése. Az így keletkező O2B

P

PB

B

PB

P

reakcióba lép a NO-val, tovább csökkentve annak biológiailag aktív mennyiségét és növeli a ROI és RNI-szintet (eNOS szétkapcsolás). A szerzők azt is leírják, hogy már kis mennyiségű ONOO- is szelektíven nitrálja, ezáltal inaktiválja a prosztaciklin P

P

szintázt, ami nemcsak megszünteti a prosztaciklin vazodilátor, antitrombotikus, antiadhezív és a simaizom proliferációját gátló hatását, de az ezeket a folyamatokat segítő és vazokonstriktor hatású prosztaglandin H2 és tromboxán A2 felszabadulását is B

B

B

B

facilitálja. (Ezeket a folyamatokat a szerzőknek cukorbeteg állatmodellekben sikerült

24

kimutatniuk.) Kimondható tehát, hogy a fokozott ONOO- -jelenlét két vazorelaxáns P

P

folyamatot is károsít, egymástól függetlenül (Zou et al., 2004). Esszenciális hipertónia Az artériás középnyomást a perctérfogat és a teljes perifériás ellenállás együttesen határozzák meg. Bármelyik is növekedik, hipertónia alakul ki, ami tartós terhelést ró a szívre és az érfal sérüléseit okozza. A perctérfogat emelkedése az elsődleges változás primer hipertóniában. Ez kialakulhat sóterhelés-vízretenció következtében, amikor ennek következménye hipervolémia. Azok a hatások, amelyek az artériák tónusát növelik, a perifériás vénákat is összehúzódásra serkentik, minek következtében a centrális vénákban növekedő vérmennyiség az előterhelést fokozza, így növelve a perctérfogatot. Azok a transzmitterek, amelyek a perctérfogatot növelik, magas vérnyomás betegség kialakulásához vezethetnek, ha szekréciójuk tartósan emelkedik. Magas vérnyomás betegségben általában megfigyelhető a renin-angiotenzin rendszer túlműködése. Az aktív angiotenzin II (Ang II) egyes típusú receptorához kapcsolódva aktiválja a foszfolipáz C-t, ami a következő lépésben foszfatidil-inozitol-3,4,5triszfoszfátot és Ca2+-t szabadít fel, az érfal simaizomzatában kontrakciót, az P

P

endotéliumban NO-felszabadulást indukálva. Továbbá működésbe lép a protein kináz C (PKC), ami végső soron a mitogén aktiválta kinázok aktiválódásához vezet (Berk and Corson, 1997). Ennek következtében növekszik a fibroblaszt növekedési faktor és transzformáló növekedési faktor-β átírása (Weigert et al., 2002), különböző sejtmagi fehérjék, extracelluláris mátrixproteinek és szekrécióra kerülő fehérjék, mint például az antiproteázok termelése fokozódik. Ezek a folyamatok jelentős részben felelősek az Ang II hipertrofizáló és sejtosztódást facilitáló hatásaiért (Brilla et al., 1994; Brown et al., 2002). Az erek falának átépülését az Ang II az aldoszteron-szekréció fokozásával is elősegíti. A renin-angiotenzin rendszer harmadik támadáspontja a foszfolipáz A2-n keresztül B

B

eikozanoidok felszabadításához vezet, illetve aktiválja a NADPH oxidáz enzimeket, ami végső soron az oxidatív stresszt fokozza (Choi et al., 2008). A teljes perifériás ellenállás növekedése másodlagos a magas vérnyomás betegség lefolyásában, megjelenése csak krónikus hipertónia esetén várható. (Hasonló tapasztalatainkról számolok be diabéteszes egerek keringési paramétereit vizsgáló

25

tanulmányunkban, ahol a perifériás ellenállás csak a nyolcadik héten emelkedett meg, de a többi keringési paraméter már a negyedik héten beállt a jellemző, kóros értékre.) A vérnyomás emelkedéséhez vezet, ha az érfal simaizomsejtjeinek jelátviteli mechanizmusai sérülnek. Szignifikáns korreláció áll fenn ezen sejtek szabad Ca2+P

P

tartalma és a vérnyomás emelkedése között. A szabad Ca2+-tartalom növekedésének P

P

pontos mechanizmusa nem ismert, de feltételezhető, hogy a genetikai hajlamnak jelentős szerepe van kialakulásában. Erre abból következtethetünk, hogy hipertóniára hajlamos személyeknél a foszfolipáz C és protein kináz C aktivitása emelkedett már a betegség megjelenése előtt. A magas Ca2+-szint miatt a Na+- Ca2+-antiport működése P

P

P

P

P

P

fokozódik (szintén genetikai hajlam határozza meg, mennyire), az intracelluláris Na+P

P

koncentráció emelkedését alkalózis követi. Az intracelluláris alkalózis következtében pedig a Ca2+ kötődése a szarkoplazmatikus retikulumhoz gátolt, ezzel tartóssá téve a P

P

simaizom-kontrakciót (Aviv, 1988; Aviv and Livne, 1988). Megfigyelések alapján az inzulinrezisztencia kialakulása, illetve a hiperinzulinémia fennállása elősegíti a magas vérnyomás betegség kialakulását. Ugyanakkor nem egyértelmű, hogy a nem inzulindependens diabétesz mellitusz és a hipertónia milyen genetikai kapcsolatban áll egymással: amíg több őshonos amerikai népcsoportnál (Pimák) és az afrikai-amerikai népességnél szoros korrelációt találtak a két tünetcsoport között, addig a mexikói (vagy általánosabban latin-amerikai) népességnél a magas vérnyomás betegség gyakorisága elválik az inzulinrezisztenciától (Ferrannini et al., 1991). Feltételezhető, hogy a különböző népek eltérő sótűrésére vezethető vissza ez a jelenség. Az inzulinrezisztencia következtében emelkedik a keringő inzulin mennyisége, ami szimpatikus izgalmat okoz. Ennek következében emelkedik az alapanyagcsere intenzitása és a vérnyomás is. A tartós szimpatikus izgalom pedig magas vérnyomás betegség kialakulásához vezet (Goldstein et al., 1983). A kor és az oxidatív stressz szerepe a metabolikus X szindróma kialakulásában Ahogy azt „Az öregedés genetikai és hibafelhalmozódáson alapuló elmélete” alfejezetben már kifejtésre került, az eddigi megfigyelések arra mutatnak, hogy a korral megnő a szervezet érzékenysége az oxidatív stresszel szemben. Részben ez az oka az idős korban kialakuló, a metabolikus X szindrómára is jellemző krónikus szív- és érrendszeri elváltozásoknak. De vajon csak az antioxidáns rendszerek gyengült

26

működése az ok, vagy az idő előrehaladtával a szervezetben termelődő ROS mennyisége is növekszik? Mint

azt

a

"Diabétesz

elektrontranszport-lánc hiperglikémia

káros

mellitusz"

fokozott hatásai.

fejezetben

olvastuk,

szuperoxid-termelésére

Idős

korban

csökken

a

a

mitokondriális

vezethető

vissza

glukóztolerancia,

a ami

visszavezethető - Az inzulinrezisztencia növekedésére - Az inzulinszekréció glukózstimulusra idős egyéneknél kezdetben felülmúlja a fiatalokét, ám ha az emelkedett glukózszint hosszasan fennmarad, vagy túlnő egy adott értéken, akkor az inzulinszekréció a fiatalokhoz képest elmarad. Barzilai munkacsoportja (Muzumdar et al., 2004; Muzumdar R., 2004) 3, 9 és 20 hónapos hím CD patkányokon vizsgálta a glukózterhelés inzulintermelésre gyakorolt hatását. Ez a törzs idős korra nem válik diabéteszessé, de a β-sejtek relatív diszfunkciója megfigyelhető volt. Az ún. hiperglikémiás clamp technikát alkalmazzák krónikusan kanülált állatoknál, amelyeknél a kísérlet kezdetén a vércukorszint azonos volt, de idősebb állatoknál a bazális inzulinszint mérhetően magasabb. A vércukorszintet két órán keresztül 11mmol/l-es értéken tartották, ekkor az idősebb állatok inzulinszintje jobban növekedett, mint a fiatalabbaké. Amikor további két órán keresztül alkalmazták ezt a stimulust, vagy a vércukorszintet megemelték 18mmol/l-re, a fiatal állatok inzulinszintje növekedett a legintenzívebben, a 20 hónapos állatok ettől jelentősen elmaradtak. Ugyanezeket a méréseket kalóriarestrikciós diétán tartott 20 hónapos CD patkányokon is elvégezték, illetve olyan, szintén 20 hónapos patkányokon, amelyek viszcerális zsírszövetének 2/3-át műtétileg eltávolították fiatal korban. Az utóbbi két csoportban az állatok inzulintermelése az első két órában alatta maradt a 20 hónapos kontrollokénak, de a növekvő kihívást is követni tudta. Azt már korábban is megfigyelték, pl. a Pima indiánoknál, hogy a normálisan hiperbolikus inzulinszenzitivitás-inzulinszint relációtól évek alatt elmozdulnak azok az egyének, akik a kettes típusú diabéteszre hajlamosak. Ez a tanulmány arra is felhívja a figyelmünket, hogy ezek a változások néhány óra alatt is lezajlanak egyes esetekben. A szabad zsírsavakra az inzulin-elválasztás idős korban éppoly érzékenyen reagált, mint fiatal egyedeknél.

27

Ezen megfigyeléseknek részben ellentmond Rizza munkacsoportjának tanulmánya (Basu et al., 2003). Ők 23 és 70 éves embereket kértek fel egy olyan vizsgálatra, ahol a glukóztolerancia mindhárom elemét tanulmányozták. Az idős emberek testtömege, zsírmentes testtömege és szérum kreatininszintje nem különbözött a fiatalokétól, de a testtömegindexük magasabb volt (27.5±0.5 versus 25.0±0.6 kg/m2) Mind vegyes P

P

táplálékfelvételt követően (45% szénhidrát, 40% zsír és 15% fehérje), mind pedig intravénás glukózinjekció után megfigyelhető volt, hogy az idős embereknél az inzulinszekréció- és érzékenység egyaránt csökkent. Az inzulinclearance ugyan alacsonyabb volt náluk, de a máj nagyobb mennyiségű inzulint extrahált. Amikor viszont az eredmények kiértékelésénél azt is számításba vették, hogy az idős csoport testtömegindexe, viszcerális zsírszövete magasabb, míg erőnléte aerobic és izomerő tekintetében is elmarad a fiatalok csoportjához képest, az életkorral megjelenő különbségek elhanyagolhatóan kicsikké váltak. - A glukózclearance idős embereknél csökkenhet. Régóta ismert az is, hogy idősebb korban az érfal veszít a rugalmasságából. Ez általában a pulzusnyomás növekedésével jár, ami egészséges embernél a szisztolés érték emelkedését és ugyanakkor a diasztolés nyomás csökkenését is jelenti. Oka a kollagén átépülése idős korban. Ugyanakkor az érfal kollagén összetételének változása önmagában nem indokolja az LDL gyakoribb lehorgonyzását az artériák falában. Ám jellemző, hogy az idős korúaknál a diasztolés vérnyomás is emelkedik, ami fokozott terhelést jelent a szervezet számára, és az oxidatív stresszt is növelheti. A vérnyomás emelkedése és az antioxidáns rendszerek kimerülése és a nem-enzimatikus módosulások (Maillard reakciók) termékeinek felhalmozódása együttesen hajlamosít idősebb korban ateroszklerotikus plakkok kialakulására a válasz a sérülésre elmélet szerint.

28

CÉLKITŰZÉSEK •

Az életkor előrehaladtával az érfal veszít rugalmasságából. Egyre több bizonyíték támasztja alá azt az elméletet, amely szerint a korosodással megjelenő szív- és érrendszeri károsodás a lokálisan keletkező ROI és RNI hatására alakul ki a szívizom sejtjeiben és az erekben is (Inoue and Inoue, 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1998; Bejma et al., 2000; van der Loo et al., 2000; Hamilton et al., 2001; Suh et al., 2001; Csiszár et al., 2002; Lakatta, 2003; Navarro et al., 2004). Egy korábbi tanulmányában Pacher Pál munkatársaival együtt azt találta, hogy az öreg Wistar patkányoknál kialakuló endoteliális funkcióromlást PJ34-kezeléssel csökkenteni lehet, ami szintén arra utal, hogy a ROI/RNI hatására aktiválódó PARP-nak lényeges szerepe van az öregedéssel együtt járó endoteliális funkcióromlás kialakulásában (Pacher et al., 2002d). Első tanulmányunkban egy újabb PARP-gátló gyógyszerjelölt, az INO-1001 hatását vizsgáltuk az emberi öregedés modellezésére gyakran használt Fisher344 patkánytörzs öreg hím egyedein. A két év körüli állatok szívműködésének alapértékeit mértük Millar mikrohegyű intrakardiális katéter segítségével, illetve a mellkasi aorta NO-függő relaxációs készségét határoztuk meg. Diabéteszzes betegek között vezető halálok a kardiovaszkuláris szövődmények kialakulása.

A

miokardiális

koronáriabetegségektől

diszfunkció

függetlenül

jelenik

ezen meg,

betegeknél amit

a

diabéteszes

kardiomiopátiának neveznek, és jól ismert kórkép a diabétesz mellituszban szenvedő betegek között. Azonban a betegségben megjelenő hemodinamikai változásokat kisállat-modelleken még nem követték végig részletesen. Munkacsoportunk vizsgálta, hogy a diabéteszes szív működésében milyen korai, illetve késői változások állnak be a betegség előrehaladása során. A teljes perifériás ellenállás meghatározásával következtetni lehet, hogy a keringési rendszer hogyan reagál hosszú távon a szív munkájának változására. További kísérleteket végeztünk arra vonatkozóan, hogy a PARP gátlása diabéteszes illetve egészséges állatokban okoz-e változást a szívfunkcióban akár önmagában, akár endotoxin-terhelésre.

29

•

A következő részben leírt tanulmány elsődleges célkitűzése a diabéteszes glomerulopátia és a kettes típusú diabéteszben megjelenő PARP-aktiváció kapcsolatának vizsgálata volt. Michael Brownlee ismerte fel, hogy a cukorbetegek érkárosodásában szerepet játszó folyamatok a mitokondriális ROI-termelés emelkedésénél futnak össze (Brownlee, 2001). Az ő vezetésével dolgozó munkacsoport igazolta ezt a teóriát, mégpedig éppen a GAPDH PAR általi inaktivációját találták kapcsolódási pontnak (Du et al., 2003). Az a feltételezés is széles körben elfogadott, hogy a cukorbaj szövődményeiben nagy szerepet játszanak az angiopátiák: az érfunkció romlása következtében az egyes szövetek vérellátása nem megfelelő, ezért azok károsodnak. Így levezethető az angiopátiából a glomerulopátia és a nefropátia is. Újabb megfigyelések viszont arra utalnak, hogy a diabéteszes nefropátia kialakulásában a podocitáknak is fontos szerepe lehet (Kriz et al., 1998; Pavenstadt et al., 2003; Wolf et al., 2005; Susztak et al., 2006). Ezek száma csökken diabéteszes nefropátiában, és a podociták számának csökkenése az egyik legjobb markere a betegség előrehaladásának (Meyer et al., 1999). A podociták magas glukóztartalmú közegbe helyezése megnöveli az apoptózisra való hajlamukat (Asaba et al., 2005; Susztak et al., 2006), és a podociták elvesztése számottevő mértékben járulhat hozzá a diabéteszes nefropátia kialakulásához. Vizsgálataink során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a PARP farmakológiai gátlása kettes típusú diabétesz modellben a vesekárosodás csökkentésére jótékony hatással van-e. Ennek követésére az albuminuria és a mezangiális expanzió mérését használtuk. Tanulmányunkban mértük a mellkasi aorta funkcionális állapotát is, de a PARP-gátlás érbelhártyára és podocitákra kifejtett protektív hatását nem választottuk szét.

•

Az emelkedett ROI és RNI termelés szerepét az ateroszklerotikus endotél diszfunkció kialakulásában már több tanulmány is vizsgálta (Laursen et al., 2001; Daugherty, 2002; Jiang et al., 2003a; Jiang et al., 2003b). A magasabb szabadgyök-koncentráció hatására a PARP aktiválódik, ami következményeként a szívműködés és az érbelhártya funkciózavara is kialakul különböző, vizsgált kórállapotokban, úgymint a diabéteszes szövődmények és a korosodás eseteiben

30

is (Szabó and Dawson, 1998; Hassa and Hottiger, 2002; Virág and Szabó, 2002). Az ateroszklerózisban megjelenő PARP-aktiváció követésére az ApoE deficiens egértörzset választottuk, vizsgálataink során arra a kérdésre is kerestük a választ, hogy a PARP farmakológiai gátlása INO-1001-gyel (Khan et al., 2003; Shimoda et al., 2003; Murthy et al., 2004) az ateroszklerózis korai szakaszában az endotélium funkcionális állapotromlására hatással van-e. •

A következő tanulmányunkban egy metalloporfirin szerkezetű, ONOO--bomlást P

P

katalizáló vegyülettel (WW85) (Pieper et al., 2005) vizsgáltuk, hogy a peroxinitrit farmakológiai semlegesítése befolyásolja-e az erek érzékenységét angioplasztikával szemben, patkány modellt használva. A neointima formáció és az endotél funkcionális állapota mellett figyeltük, hogy a WW85 hatása a ONOO--szint P

P

csökkentésével

csökkenti-e

a

nitrózatív

stresszre

következményesen megjelenő nitrotirozin és PAR mennyiségét, illetve az adhéziós molekula VCAM-1 expresszióját. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy lehet-e a ONOO- a ballonkatéteres sértést követő resztenózis egy P

P

lényeges kóroki tényezője. •

Az angiotenzin II jelenléte kardiovaszkuláris elváltozások kialakulásához vezet. Ennek egyik mechanizmusa feltételezhetően a szabadgyök-koncentráció emelkedése az érintett szövetekben (Drexler and Hornig, 1999; Wolf, 2000; Gilbert et al., 2003; Singh and Mehta, 2003). Az Ang II –tartalmú médiumban inkubált endotélsejtekben megfigyelhető, hogy a O2- -termelésük emelkedik. E B

PB

P

mellett az is bemutatásra került, hogy ez az oxidatív stressz az érbelhártya károsodásához vezet, és azt is bizonyított, hogy antioxidánsokkal ez ellen védelmet tudunk nyújtani (Laursen et al., 1997; Wang et al., 2003). Minthogy az oxidatív stressz a PARP egyik legfontosabb aktivátora (Hassa and Hottiger, 2002; Virág and Szabó, 2002), vizsgálatunk legfontosabb kérdése az volt, hogy a PARP aktivációja hogyan játszik közre az Ang II kiváltotta endotéldiszfunkció kialakulásában.

31

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A vizsgálatokat a “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” U.S. National Institutes of Health 1996-os kiadásának megfelelően (NIH Publication 85-23 revised 1996), a Helyi Állatvédelmi Bizottság engedélyével végeztük.

Millar rendszer: az intrakardiális nyomás- és térfogatváltozás regisztrációja in vivo Kísérleteinkhez felhasználtuk a bal kamrai nyomás követését in vivo altatott patkányban. (Anesztéziát 60mg/ttkg pentobarbitál oldat intraperitoneális adagolásával értünk el.) A méréshez az ún. Millar rendszert használtuk, amelynek lényege egy mikrokatéter, végében piezoelektromos kristállyal. Ezt a jobb oldali a. carotis communison keresztül vezettük be a bal kamrába, ahol a nyomásváltozások a kristályt deformálták, és az az alakváltozással arányos elektromos jelet adott. Az így generált jelet a Millar rendszer saját jelátalakító-erősítő rendszerére vezette a katéter, amit végül Macintosh számítógépre vittünk és értékeltünk ki. Az így nyert adatokat további feldolgozásra Excel táblázatba vittük át. Kalibráció a Millar átalakító belső 100 Hgmmes jelével történt. (Pacher et al., 2002a; Pacher et al., 2002b; Pacher et al., 2003) A Millar katéter újabb, továbbfejlesztett változata már nem csak a nyomásváltozások regisztrálására alkalmas, hanem a vezetőképességet is méri, ennek változása a környezetében található elektrolit-oldat mennyiségének és összetételének függvénye. A bal kamra telődésekor a konduktancia megnő, ürülésekor csökken. A nyomás és a vezetőképesség együttes mérésével felrajzolható a nyomás-térfogat függvény minden egyes szívciklusban. A mérőrendszer térfogati kalibrálását in vitro kilenc ismert térfogatú hengeres edény segítségével végeztük, melyek átmérője különbözött, mélysége 1cm volt, és friss, heparinizált teljes egérvérrel töltöttük fel őket. Ezzel a kalibrációval a katéter lineáris térfogat-konduktancia regresszióját felvettük, és a kísérletekben mért vezetőképességeket ehhez viszonyítottuk. Minden kísérlet végén 10μl 15%-os sóoldatot injektáltunk intravénásan, és a PV-hurok eltolódásából számított konduktancia-térfogattal korrigáltuk a szív töltőtérfogatát.

32

A nyomás-térfogat függvény önmagában is informatív, de a bal kamrai telődés csökkentésével további adatok nyerhetők a szív állapotáról. A v. cava caudalis gradiális okluziójával, majd felengedésével elérhető a vénás visszaáramlás változtatása. Az oklúziót legegyszerűbben a hátulsó üresvénára helyezett majd lassan leszorított vattahegyű pálcával érhetjük el egérben. (Altatás ketamin-xylazin keverék i.p. adásával.)

5. ábra.

Millar rendszerrel rögzített nyomás-térfogat hurok (balra), illetve

intraventrikuláris nyomáshullám az első deriváltjával (jobbra).

A mellkasi aorta kontraktilitásának és relaxációs készségének vizsgálata Anesztézia alatt felkerestem a hasüreg hátsó felében a hasi aortát, átvágtam, és kivéreztettem az állatot. A mellkast megnyitottam, a szívet és a tüdőt előre, a fej felé húztam, majd a nyelőcső átvágása után kiemeltem a mellkasból. A thoracalis aortát a rekesz fölött átvágtam, az azt befogadó kötőszövetet mikrocsipesszel megfogtam és felfelé emelve kivágtam az aortaívig, úgy, hogy magát az aortát nem érintettem semmilyen fémeszközzel. A kiemelt főütőeret szervkádba, 37°C-ra előmelegített 5% CO2 és 95% O2 keverékével (carbogen) buborékoltatott Krebs oldatba helyeztem, B

B

B

B

aminek az összetétele NaCl 130mM, NaHCO3 14.9mM, KCl 4.7mM, CaCl2 1.6mM, B

B

B

B

MgSO4 1.17mM, KH2PO4 1.18mM, EDTA 0.026mM, glukóz 11mM volt. (Sigma) Itt B

B

B

B

B

B

megtisztítottam a kötőszövettől és a véralvadéktól, majd 3 mm-es gyűrűket vágtam

33

belőle és ezeket izometriás erőmérőre helyeztem (Kent Scientific), szintén carbogennel buborékoltatott 37°C-os Krebs oldatban. Az erőmérőn az ereket előfeszítettem, a patkányból származó mintákat 1,5 g-nak megfelelő erővel, az egér aortagyűrűket pedig 1 g-nak megfelelő erővel. Egy órás ekvilibráció után (amely idő alatt 15 percenként cseréltem a szervkádakban a Krebs oldatot, és folyamatosan utánaállítottam az előfeszítést,) adrenalinnal kimértem az érgyűrűk kontraktilitását. (10-10 mol/l-től 3*10-6 mol/l-es koncentrációtartományban.) P

P

P

P

Ezután a gyűrűk környezetéből kimostam az adrenalint kétszeri oldatcserével, majd újabb egy óra ekvilibráció következett. Ha az aortagyűrűk a kezdeti előfeszítésnél jobban relaxáltak, akkor a feszítést utánaállítottam. Ezután az érgyűrűket összehúztam, az egerekből származókat 10-7 mol/l-es, a patkányokból származókat 3*10-7 mol/l-es P

P

P

P

koncentrációjú adrenalinnal. Amikor a kontrakció maximális volt, a relaxációt acetilkolin

adagolásával

határoztam

meg

(10-9 P

P

mol/l – 3 *10-4 P

P

mol/l

koncentrációtartományban). A kontraktilitást abszolút értékben, grammokban megadva számoltam, az általam beállított alapvonalhoz képest; a relaxációt %-ban fejeztem ki, az (adott acetilkolin koncentrációnál mért kontrakció/adrenalin prekontrakció az alapvonal fölött)*100 képlettel. (Pacher et al., 2002b; Pacher et al., 2002c; Pacher et al., 2002d)

Állatmodellek alkalmazása az általunk vizsgált kórfolyamatokban Ahogy a születéskor várható élettartam kitolódik a fejlett világban, egyre nagyobb jelentőségre tesz szert a kor előrehaladtával megjelenő krónikus betgségek megismerése, kialakulásukra és lefolyásukra jóslatokat szeretnénk adni, illetve ezek megelőzésére és karbantartására nagy erőfeszítéseket teszünk. Ez a befektetés szükséges, mivel a lakosság jelentős részét érintik ezek a kórfolyamatok, komoly terhet róva a társadalomra anyagilag és erkölcsi értelemben is. Természetesen az az optimális, ha megfigyeléseinket humán mintákon végzett tanulmányokból szerezzük, és következtetéseinket is ezekből vonhatjuk le. A vizsgálati módszerek kiterjedése az invazív és nem invazív, diagnosztikai célokra is használt eljárásoktól, az alanyok hosszabb távú követésétől, orvosi eredetű (terápiás és

34

diagnosztikai) megfigyeléseken át az emberi szöveteken végzett élettani, illetve molekuláris biológiai vizsgálatokig terjed. Emberi anyagon a vizsgálat lehetősége korlátozott, főképpen etikai megfontolásokból, de részben azért is, mivel a beteganyag mindig heterogén, gyakran polimorbid, ezért csak nagy elemszámú minták vizsgálatából, gyakran hosszú utánkövetéssel lehet következtetéseket levonni, ezért ezek a tanulmányok igen lassúak és költségesek. Ezért használunk szívesen állatmodelleket ezen kórképek megismerésére is. A kísérleti állatfajok viszonylag rövid élettartama és kis testmérete miatt alkalmasak a kutató céljaira. Tartásuk is általában könnyen megoldható. (Kivételt képeznek a főemlősökön végzett kutatások, amelyeket egyre több kritika ér, elsősorban etikai okokból.) Természetesen ezeknek a modelleknek is megvannak a korlátai: az alacsonyabb rokonsági fok miatt az állatkísérletek alanyai eltérő anatómiáját, biokémiai tulajdonságait és anyagcseréjét mindig számításba kell vennünk, mielőtt az így nyert adatokat emberre vetítenénk ki. Az általam végzett kutatásokban rágcsálókon: patkányokon és egereken dolgoztam. Mindkét fajnál kétféle típusú modellt találhatunk: a kísérletes sértéssel előidézett betegséget (ide értve a műtéti beavatkozásokat, a betegség kialakulását elősegítő diétákat, drogokkal végzett kezeléseket és a különböző deprivációs modelleket is); illetve a genetikai módosításokkal előidézett kórképeket. Az alábbiakban az általam használt állatmodellek leírása következik.

Az INO-1001 javítja a szívfunkciókat és az aorta relaxációs készségét idős patkányban Korábban már bizonyították, hogy az öregedéssel együtt járó kardiovaszkuláris diszfunkció a miokardiumban és az erekben lokálisan képződő reaktív oxigén és nitrogén speciesekhez kapcsolható (Inoue and Inoue, 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1998; Bejma et al., 2000; van der Loo et al., 2000; Hamilton et al., 2001; Suh et al., 2001; Csiszár et al., 2002; Lakatta, 2003; Navarro et al., 2004). A fenantridinonszármazék PJ34 jótékony hatását már korábban bemutatták öregedő Wistar patkányokon, (Pacher et al., 2002d) ami azt sugallta, hogy a ROS és RNS indukálta PARP-aktiváció jelentős szerepet játszik a korosodással megjelenő endotél-diszfunkció

35

kialakulásában. Az alábbi vizsgálatban azt vizsgáltuk, hogy a specifikus PARP 1 gátló INO-1001 adagolása hogyan befolyásolja a szív teljesítőképességét, szisztolés és diasztolés funkcióját különböző előterhelés mellett, illetve a vaszkuláris reaktivitást idős Fisher-344 törzsbe tartozó hím patkányoknál. Fiatal felnőtt (3 hónapos) és öreg (24 hónapos) hím Fisher patkányokat használtunk a korosodás modellezésére. Mindkét korosztályból az állatok felét izoindolinon szerkezetű PARP-gátlóval, INO-1001-gyel kezeltük, napi 30 mg/kg-t kaptak orálisan, két hónapig, míg a többi patkány vehikulumot kapott. A patkányokat kettesével vagy hármasával tartottuk, standard laboratóriumi táppal etettük és itattuk ad libitum, 12 órás sötét/világos ciklust állítottunk be. (Du et al., 2003; Khan et al., 2003; Shimoda et al., 2003; Murakami et al., 2004; Szabó et al., 2004) Kísérleteinkhez felhasználtuk a bal kamrai nyomás követését in vivo altatott patkányban. (Anesztéziát 60mg/ttkg pentobarbitál oldat intraperitoneális adagolásával értünk el.) A méréshez a Millar rendszert használtuk, amelynek lényege egy mikrokatéter, végében piezoelektromos kristállyal, és a vezetőképességet is méri Ezt a jobb oldali a. carotis communison keresztül vezettük be a bal kamrába, ahol a nyomásváltozások a kristályt deformálták, és az az alakváltozással arányos elektromos jelet adott. A bal kamra telődésekor a konduktancia megnő, ürülésekor csökken. Az így generált jelet a Millar rendszer saját jelátalakító-erősítő rendszerére vezette a katéter, amit végül Macintosh számítógépre vittünk és értékeltünk ki. Az így nyert adatokat további feldolgozásra Excel táblázatba vittük át. Kalibráció: nyomásra a Millar átalakító belső

100

Hgmm-es

jelével

történt,

vezetőképeségre

1,5%-os

NaCl-oldatot

használtunk. A nyomás-térfogat függvény önmagában is informatív, de a bal kamrai telődés csökkentésével további adatok nyerhetők a szív állapotáról. A v. cava caudalis gradiális okklúziójával, majd felengedésével értük el a vénás visszaáramlás változtatását. A mérés befejeztével kiemeltük a tüdőt és a szívet, és a súlyukat lemértük. A kiemelt mellkasi aortát szervkádba, 37°C-ra előmelegített 5% CO2 és 95% O2 B

B

B

B

keverékével (carbogen) buborékoltatott Krebs oldatba helyeztem. A kontraktilitást abszolút értékben, grammokban megadva (1g=9,81mN) számoltam, az általam beállított alapvonalhoz képest; a relaxációt %-ban fejeztem ki, az (adott acetil-cholin

36

koncentrációnál mért kontrakció/adrenalin prekontrakció az alapvonal fölött)*100 képlettel.

Fisher patkánytörzs, az emberi korosodás modellje

A Fisher 344 patkánytörzs lipidanyagcseréje genetikusan eltér a többi patkányétól. Kritchevsky munkacsoportja 1976-ban közölte le azt a tanulmányt, amelyben jellemzi a Fisher 344 patkánytörzs zsíranyagcseréjének jellemzőit, az állatok 2-24 hónapos kora között. Azt találták, hogy más törzsektől eltérően, a Fisher patkányoknál a szérum és a máj koleszterintartalma életkortól független, nem mutatja a más törzsekre jellemző graduális növekedést az életkor előrehaladtával. Helyette 2 hónapos koruktól 6 hónapos korukig volt csak megfigyelhető a szérum és máj koleszterinszint emelkedés, majd ezen az értéken maradt 18 hónapos korukig, ezután ismét emelkedett 24 hónapos korukig. A trigliceridszint viszont csak az első hat hónapban emelkedett, azután két éves korukig állandó maradt. Acetátból kiinduló koleszterinszintetizáló kapacitásuk 2-9 hónapos koruk között felére esett, majd csak kevéssé csökkent a 24. hónapig. 3-hidroxi-3-metil glutaril koenzim A (HMG-CoA) reduktáz aktivitásuk hasonlóan változott 9 hónapos korukig, de azután további csökkenést nem írtak le. A patkányok életkora nem befolyásolta a koleszterin 7α hidroxiláz aktivitást (Story et al., 1976). Négy évvel később ugyanez a munkacsoport megjelentetett egy újabb tanulmányt, amelyben fiatal (45 napos) és idős (18 hónapos) Fisher 344 patkányok szöveti koleszterinszintézisét vetette össze azonos korú Sprague-Dawley patkányokéval. Azt találták, hogy fiatal korban a Fisher patkányok veséje és vastagbele aktívabban állítja elő a koleszterint, mint a Sprague-Dawley patkányok azonos szövetei. Idős állatoknál, illetve más szervek vizsgálatával (máj és lép) nem találtak hasonló különbséget a két törzs között (Kritchevsky et al., 1980). A Fisher 344 törzsbe tartozó patkányokra jellemző, és ennél a csoportnál jellemzően korfüggő lipid-anyagcsere változások teszik különösen alkalmassá ezt a törzset a kor előrehaladtával

megjelenő,

metabolikus

tanulmányozására.

37

eltéréseket

követő

betegségek

Poli (ADP-ribóz) polimeráz aktiváció szerepe a diabéteszes szív működésében bekövetkező változásokban A következő munkánkban hím db/db egereket 5 hetes koruktól INO-1001 kezelésnek vetettünk alá. Aszpartámmal (NutraSweet) édesített steril vízben 4,8 g/l INO-1001-t oldottunk fel, és ezt adtuk ivóvízként. Vehikulum kontrollunk a NutraSweet-tel ízesített steril ivóvíz volt. Negatív kontrollként db/m heterozigóta egereket használtunk, amelyeket ugyanezen oldatokkal itattunk. Átlagosan az állatok 60 mg/kg PARP-gátlót fogyasztottak. Az egereket 17-21 hetes koruk között áldoztuk fel. A mellkasi aortát kimetszettem, és vizsgáltam az érgyűrűk funkcionális állapotát.

Diabéteszes állatmodellek Genetikai hajlamot mutatnak a kettes típusú cukorbetegségre a nagyfokú elhízással küszködő, leptinhiányos rágcsálók: a Zucker patkányok és a db/db egerek. Habár a Zucker patkánytörzset már a ’70-es évek elejétől használjuk az inzulinrezisztencia és a kettes típusú cukorbetegség modellezésében (Johnson et al., 1971; Stern et al., 1972), csak 2001 óta kezd kirajzolódni előttünk az, hogy hogyan is kapcsolódik össze a törzsre jellemző leptinhiány és a metabolikus szindróma kialakulása (Pedersen et al., 2001; Minokoshi et al., 2002). A felszabaduló leptin aktiválja az AMP-aktivált protein kinázt (AMPK), amely a vázizomban 15 perc, a hipotalamuszban 6 óra elteltével indukál változásokat. A Zucker patkánytörzs leptin receptor deficiens, ezért az AMPK természetes aktivációja hiányzik. Ennek következtében ezek az állatok hamar elhíznak, ektópiás lipiddepozíció is megfigyelhető.

Az AMPK aktivátor 5-amino-4-imidazolkarboxamid ribozid

(AICAR) adagolása következtében ez az ektópiás lipiddepozíció csökkent (vázizom, szívizom, máj, hasnyálmirigy) és a diabétesz mellitusz kialakulása gátolt a kezelt Zucker patkányokban. Hasonló leptindeficienciát mutat az elhízásra és cukorbetegségre hajlamos db/db egértörzs is.

38

Szintén régóta és elterjedten használt modell a streptozotocinnal (egér, patkány) vagy alloxannal (nyúl) kezelt állatok vizsgálata. Streptozotocin egyszeri 70 mg/kg dózis intravénás adása (felületes Nembutal narkózisban, a Fluka forgalmazta pH 4,5 citrátpufferben oldva) a pancreas β-sejtjeinek pusztulását okozza. A kezelést követően már néhány nap után megfigyelhető poliuria és polidipszia, a vércukorszint gyakran 25 mM fölé emelkedik. Ezt az egyes típusú diabétesz mellitusz modelljének tekintjük. A streptozotocint 40 mg/kg dózisban intraperitoneálisan adagolva öt egymást követő napon szintén cukorbetegséget vált ki.

Az INO-1001 helyreállítja az aorta relaxációs készségét Apolipoprotein E deficiens érelmeszesedésben

Az alább leírt vizsgálatainkban az INO-1001 (Khan et al., 2003; Shimoda et al., 2003; Murthy et al., 2004) hatását figyeltük meg az endotéldiszfunkció kialakulására Apolipoprotein E-hiányos (ApoE deficiens) egereknél. Továbbá vizsgáltuk, hogy a már kialakult endotéldiszfunkciót képes-e befolyásolni a PARP 1 specifikus gátlása. 10 hetes apolipoprotein E deficiens egereket és azonos korú kontrollokat (C57Bl6 törzs) aterogenetikus diétán tartottunk, és 12 héten keresztül kezeltük őket 30mg/kg/nap INO1001-gyel, amit az ivóvízben oldottunk fel. Az érfunkciós vizsgálatok során in vitro az érgyűrűk felét 3μM INO-1001-t tartalmazó szervfürdőben inkubáltuk. A magas zsírtartalmú aterogenetikus diétán tartott ApoE deficiens egerekben 5 hónapos korukra súlyos endotéliális diszfunkció alakult ki, szabad szemmel is jól látható, kiterjedt plakkokal, amelyre az acetilkolin érzékenység jelentős csökkenése jellemző volt (13. ábra). Az endotélium-dependens relaxáció képességével ellentétben az adrenalinra adott kontrakció és a nátrium-nitroprussziddal kiváltott endotéliumfüggetlen relaxáció nem változott az aterogenetikus diétán tartott ApoE deficiens állatokban, jelezve, hogy csak az érbelhártya NO-szintetizáló képessége volt érintett, az aorta simaizom-réteg NO-érzékenysége nem változott.

39

A ballonkatéteres sértést követő resztenózissal szemben protektív hatású a metalloporfirin szerkezetű, a peroxinitrit bontását katalizáló WW85 Pentobarbitál anesztéziában 400-500 g közötti hím Sprague-Dawley patkányok jobb oldali közös fejartériáját felkerestük, annak külső és belső fejverőérre szétágazásánál. A külső fejverőér oldalról permanens ligatúrát helyeztünk fel (7-0 selyemvarratot használtunk ehhez), a belső fejverőeret csak a műtét idejére zártuk le. A külső fejverőéren 2F Fogarty katétert (Baxter) vezettünk be, a mellkas bejáratáig. A katéter ballonját fiziológiás sóoldattal töltöttük fel annyira, hogy mozgatásakor ellenállást érezzünk, majd a katétert hat alkalommal kihúztuk a külső fejverőér felé, és visszatoltuk a mellkas bejáratáig. Ezt követően a külső fejverőeret újra ligáltuk, hogy az arteriotómia mindkét oldalról ki legyen zárva a keringésből, és a belső fejverőeret megnyitottuk a véráramlásnak. A nyak középvonalában ejtett sebet ezután zártuk, a bőrt 4-0 selyemfonállal varrtuk össze. Az állatokat két csoportra osztottuk: egy részük a műtét után, illetve az azt követő 14 napon kétszer 1 mg/kg WW85 kezelést kapott s.c. A másik csoport ugyanezen időpontokban azonos mennyiségű fiziológiás sóoldatott kapott s.c. (Ez a csoport szolgált pozitív kontrollként.) Negatív kontrollnak áloperált patkányokat használtunk. A műtétet követő 28.-31. napon a patkányokat túlaltattuk 200 mg/kg pentobarbitállal. Egy részüknél ezután a bal kamrába vezetett 20G injekcióstűn keresztül in situ 4 %-os paraformaldehid oldat perfúziójával fixáltuk a szöveteket, és a sértett ereket paraffinba ágyaztuk, a további vizsgálatok (morfometriás analízis, immunhisztokémiai jelölés) elvégzéséhez. A patkányok másik csoportjában fixálás nélkül izoláltuk a sértett artériát, és a mellkasi aortával azonos módon vizsgáltuk azok funkcionális állapotát.

Ateroszklerotikus állatmodellek A rágcsálók az embernél jóval kisebb hajlamot mutatnak az érelmeszesedésre, csupán magas zsírtartalmú diétával egyedül a nyulakban váltható ki ateroszklerózis. Azért, hogy megfelelő patkány vagy egér modellhez jussunk, egyéb módszerekkel kell

40

dolgozni. Két típusú állatmodellel dolgozhattam az ateroszklerózis modellezésekor is: genetikailag módosított ApoE deficiens egértörzsön és kísérletes sértéssel is. A bevezetőben említett apolipoproteinek alapvető szerepet játszanak az LDLkoleszterin felvételében a máj sejtjeiben. Ezek hiánya, vagy szerkezeti változása megakadályozza, hogy az LDL saját receptorain keresztül jusson be a hepatocitákba, így

utcaseprő

(azaz

scavenger)

receptorokhoz

kapcsolódva

nem

gátolja

a

koleszterinszintézist, hiperkoleszterinémiához vezetve. Ezek a módosult LDL-formák kifejezett hajlamot mutatnak arra is, hogy az erek falába rakódjanak le, kialakítva az ateroszklerotikus plakkokat (Meir and Leitersdorf, 2004). A másik megközelítés az angioplasztika utáni resztenózis modellezése, ahol a humán beavatkozásnál is használatos ballonkatéterrel okozunk sérülést. Az intimát szinte letörli az eszköz, és az oxidatív stressz is jelentős mértékűvé válik. Az érbelhártya sejtjei pusztulni kezdenek, ezzel egy időben megindul az utánpótlást képező sejtek proliferációja is. Jellemző, hogy az újonnan képződő sejtek kisebb hajlamot mutatnak apoptózisra, ha oxidatív károsodás éri őket. E mellett az is ismert, hogy az intima jelentős mértékű megvastagodása alakul ki, amivel az érfal rugalmatlanabbá válik, ürege beszűkül, és az endotéliális NO-szintézis lecsökken, ezért a relaxációs készsége is romlik az érintett érszakasznak. A ballonkatéteres sértés a ROI termelést beindítja, és gyulladásos reakciókat is kivált, amely folyamatok az ér luminális sejtjeit károsítják. Ezt a jelenséget részben az intima simaizom-rétege, részben a gyulladásos sejtek és a fibroblasztok mediálják. Ezzel egybehangzó annak a tanulmánynak az eredménye, amelyben a SOD mimetikus M40401 adásával csökkenteni tudták a neointima képződést a ballonkatéteres sértés patkány modelljét használva (Muscoli et al., 2004). Hasonló védettséget találtak az antioxidáns tempol adagolásával (Jagadeesha et al., 2005), vagy a SOD, illetve kataláz gének bevitelével (Laukkanen et al., 2002; Durand et al., 2005).

A poli (ADP-ribóz) polimeráz gátlása javítja az angiotenzin-rendszer túlműködéséből eredő endotéldiszfunkciót 8 hetes hím spontán hipertenzív patkányokat (SHR) 8 héten keresztül 20 mg/kg/nap enalapril-maleáttal kezeltünk, amit az ivóvízben oldottunk fel. Pozitív kontrollként

41

vehikulummal kezelt SHR állatokat használtunk, negatív kontrolljaink pedig azonos korú Wistar-Kyoto (WKY) patkányok voltak. A kezelés végén mértük a szív hemodinamikai teljesítményét (Anne Vaslin végezte a mérést), érfunkciós vizsgálatokat végeztünk in vitro, majd a szívből, veséből és a mellkasi aortából mintát vettünk immunhisztokémiai

vizsgálatokhoz.

(Dr.

Zsengellér

Zsuzsanna

végezte

az

immunhisztokémiai jelölést.) Korábbi kísérleteimben meggyőződtem arról, hogy a PARP-gátlók és az angiotenzin-rendszer között nincs közvetlen kapcsolat, sem in vivo, sem in vitro (nem közölt adat.).

A hipertónia modellezése

A magas vérnyomás betegség vizsgálatára kitűnő modell az SHR, azaz spontán hipertenzív patkánytörzs. A Wistar-Kyoto törzsben alakult ki, spontán mutációval 1963ban. Okamoto 1969-ben számol be az új patkánymodellről, amelynél a nőstények vérnyomása is emelkedett, de nem olyan mértékben, mint a hímeké (Okamoto, 1969). A hipertónia mellett jellemzi az inzulin rezisztencia, következményes hiperinzulinémia, hipertrigliceridémia és hiperkoleszterinémia is (Swislocki and Tsuzuki, 1993), de a kortikoszteron szekréciójuk nem különbözik a vad típustól. A kortikoszteron és a deoxikortikoszteron szintjüket kevésbé csökkenti a dexametazon kezelés, mint a normotenzív Wistar-kyoto patkányokét (Freeman et al., 1975). Mivel a metaboikus X szindrómára is jellemző ez a tünetegyüttes, ezért szívesen alkalmazzák az emberi primer magas vérnyomás betegség modelljeként.

Statisztikai analízis Az eredményeket átlag ± az átlag szórása formában adom meg. Szignifikánsan különbözőnek akkor tekintettünk két csoportot, ha p<0,05. A p értékét két vizsgált csoport összehasonlításakor kétoldali párosítatlan Student-féle t-próbával határoztuk meg, kettőnél több vizsgálati csoport esetén pedig varianciaanalízissel, Bonferroni (érgyűrűk és keringő leukocita), illetve Dunnett-féle (Millar) post hoc teszt korrekcióval.

42

EREDMÉNYEK

Az INO-1001 javítja a szívfunkciókat és az aorta relaxációs készségét idős patkányban Korábban már bizonyították, hogy az öregedéssel együtt járó kardiovaszkuláris diszfunkció a miokardiumban és az erekben lokálisan képződő reaktív oxigén és nitrogén speciesekhez kapcsolható (Inoue and Inoue, 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1998; Bejma et al., 2000; van der Loo et al., 2000; Hamilton et al., 2001; Suh et al., 2001; Csiszár et al., 2002; Lakatta, 2003; Navarro et al., 2004). A fenantridinonszármazék PJ34 jótékony hatását már korábban bemutatták öregedő Wistar patkányokon, (Pacher et al., 2002d) ami azt sugallta, hogy a ROS és RNS indukálta PARP-aktiváció jelentős szerepet játszik a korosodással megjelenő endotél-diszfunkció kialakulásában. Az alábbi vizsgálatban azt vizsgáltuk, hogy a specifikus PARP 1 gátló INO-1001 adagolása hogyan befolyásolja a szív teljesítőképességét, szisztolés és diasztolés funkcióját különböző előterhelés mellett, illetve a vaszkuláris reaktivitást idős Fisher-344 törzsbe tartozó hím patkányoknál. A szív átépülése: a korosodással együtt járt a bal pitvar és kamra szignifikáns tömegnövekedése, de a jobb szívfél tömege nem változott. A tüdő tömege is jelentősen megnőtt. Az INO-1001 kezelés a bal szívfél és a tüdő tömegének változását nem befolyásolta (6. ábra).

43

6. ábra. PARP1 gyógyszeres gátlása (2 hónapon keresztül) nem befolyásolja szignifikánsan a szív korral járó átépülését és a tüdőödémát. A bal kamra (Bkt), a jobb kamra (Jkt), pitvar és tüdő tömege (tüdőt) fiatal felnőtt (F), INO-1001-gyel kezelt fiatal felnőtt (F+INO), öreg (Ö) és INO-1001-gyel kezelt öreg (Ö+INO) hím Fisher patkányokban. A szervek tömegét a testtömeggel (tt) arányosan ábrázoltuk. Az értékeket átlag+standard error formában ábrázoltuk, minden csoport 6-10 mérést foglal magába. * : P<0,05 a fiatal, kezeletlen patkányokhoz képest. Szívfunkció: Ahogy

azt a 7. és 8. ábra mutatja, az öregedés (A) az artériás

középnyomás (artériás Pközép), bal kamrai végdiasztolés nyomás, a szisztolés B

B

nyomásnövekedés maximális meredeksége (+dP/dtmax), a diasztolés nyomásesés B

B

legnagyobb meredeksége (-dP/dtmax), ejekciós frakció (EF), verőtérfogat, szívindex, B

B

térfogati munka index (VW index), és pulzusszám csökkenésével volt jellemezhető. Ezzel ellentétben a bal kamrai végdiasztolés nyomás (PK Pdia) és a bal kamrai B

B

nyomásesés időkonstansa a diasztolés diszfunkció indikátoraként emelkedett az öreg állatokban. A teljes perifériás ellenállás index (TPR index) szintén növekedett az idős patkányokban (8. ábra). Az INO-1001 kezelés hatására szignifikánsan növekedett a verőtérfogat, szívindex és a térfogati munka indexe, és csökkent a bal kamrai végdiasztolés nyomás, és a bal kamrai

44

nyomásesés időkonstansa is. A teljes perifériás ellenállás is csökkent, és a bal kamrai szisztolés nyomás és a középartériás nyomás is kis mértékben emelkedett a PARP-gátló hatására öreg állatokban. Ezzel együtt a dP/dtmax illetve a –dP/dtmax is javulási B

B

B

B

tendenciát mutatott (8. ábra), de ezek a változások nem bizonyultak szignifikánsnak kétfaktoros variancaanalízissel vizsgálva, amit Dunnett-féle post hoc teszt követett. Ezzel szemben fiatal felnőtt patkányoknál az INO-1001 kezelés nem volt hatással egyik hemodinamikai paraméterre sem (8. ábra). A 7. ábra bemutat egy-egy reprezentatív nyomás-térfogat hurkot a fiatal, öreg és PARP-gátlóval kezelt öreg állatok csoportjából. A hurok jobbra tolódása, ami megfigyelhető az öreg állatokban, a szisztolés nyomás maximumának és a meredekségének csökkenése jelzi a szívizom kontraktilitásának csökkenését és a szívelégtelenséget. Az INO-1001 kezelés hatására a kontraktilitást kis mértékben növekedett (7. és 8. ábra).

7. ábra. Reprezentatív nyomás-térfogat hurkok (fent) és bal kamrai nyomáshullám (lent) a fiatal, öreg és PARP-gátlóval kezelt öreg állatok csoportjából. A hurok jobbra tolódása, ami megfigyelhető az öreg állatokban, a szisztolés nyomás maximumának és a meredekségének csökkenése jelzi a szívizom

45

kontraktilitásának csökkenését és a szívelégtelenséget. Az INO-1001 kezelés hatására a kontraktilitást kis mértékben növekedett.

8. ábra. A PARP gyógyszeres gátlása (2 hónapos kezelés) javítja az öregedéssel együttjáró szívműködési zavarokat.

46

Artériás középnyomás (Artériás Pközép), bal kamrai szisztolés nyomás (BK Pszisztole), B

B

B

B

bal kamrai végdiasztolés nyomás (BK Pdia), pulzusszám, dP/dmaxt és –dP/dtmax, B

B

B

B

B

B

ejekciós frakció (EF), bal kamrai nyomásesés időkonstansa, verőtérfogat, térfogati munka index (VW index), szívindex és teljes perifériás ellenállás indexe (TPR index) fiatal felnőtt (F), INO-1001-gyel kezelt fiatal felnőtt (F+INO), öreg (Ö) és INO-1001-gyel kezelt öreg (Ö+INO) hím Fisher patkányokban. Az értékeket átlag+standard error formában ábrázoltuk, minden csoportban 6-10 állat adatai vannak. * : P<0,05 a fiatal kezeletlen állatokhoz képest; #: P<0,05 a kezeletlen öreg állatokhoz képest. A 9. ábrán jellegzetes nyomás-térfogat hurok látható a v. cava caudalis leszorítása után, tehát

a

előterhelés

lecsökkenésekor.

A

végszisztolés

nyomás-térfogatváltozás

összefüggése (Pdia VR illetve Emax), előterhelés-függő térfogati munka (PFVW), B

B

B

B

+dP/dtmax, -dP/dtmax, végdiasztolés térfogat (Vdia), teljesítmény és végdiasztolés nyomásB

B

B

B

B

B

térfogatváltozás összefüggése a 10. ábrán kerül bemutatásra. Ahogy az a 9. és 10. ábrán látható, a végdiasztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggés meredekebb volt a fiatal állatok esetében, ami a koros patkányok szisztolés teljesítményromlására enged következtetni. Ezzel ellentétben a végdiasztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggés értéke emelkedett az öreg patkányoknál, ami a diasztolé végén jelentős merevségre utal. A PARP-gátló adása feltűnően javította a végszisztolés és végdiasztolés nyomástérfogatváltozás összefüggést is. Ezekhez a paraméterekhez hozzátehetjük, hogy a különböző előterhelés mellett rögzített nyomás-térfogat hurkok alapján számíthatóak egyéb, a szisztolés funkciót jellemző indexek, amelyek kevésbé függenek az előterhelés adta körülményektől illetve a szív tömegétől, így például a előterhelés-függő térfogati munka (PFVW) és a dP/dtmax-végdiasztolés térfogat arány (dP/dtmax- Vdia)((Little, 1985; B

B

B

B

B

B

Kass et al., 1987)) (10. ábra). Ahogyan az a 10. ábráról leolvasható, ezek a kontraktilitást jellemző, a terheléstől független arányszámok a korosodással gyengülnek, és a PARP gátlása jelentősen emelte értéküket. A bal kamra munkájának hatékonysága szintén romlott az öreg állatokban, és PARP-gátlással a hatásfok esetén is szignifikáns javulást értünk el.

47

9. ábra. A PARP gyógyszeres gátlása (2 hónapos kezelés) javítja a végszisztolés és végdiasztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggést (ESPVR, EDPVR) korosodással megjelenő szívelégtelenségben. Reprezentatív nyomás-térfogat hurkok különböző előterhelés mellett, amelyek bemutatják, milyen különbségek alakulnak ki a végszisztolés és végdiasztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggés esetén fiatal és öreg patkányok között, illetve az INO-1001 milyen hatással van ezekre a paraméterekre.

A végszisztolés

nyomás-térfogatváltozás összefüggés öreg állatokban kisebb meredekségű egyenes mentén változik, ami súlyosan károsodott kontraktilis funkcióra utal. A kontraktilitás a PARP-gátlás hatására jelentősen javul. A végdiasztolés nyomástérfogatváltozás összefüggés meredeksége pedig növekszik a diasztolé végén jelentősen merevebben viselkedő szívizom miatt, amit szintén javít az INO-1001.

48

10. ábra. A PARP gyógyszeres gátlása (2 hónapos kezelés) javítja a végszisztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggést (PdiaVR, Emax), előterhelés-függő térfogati B

B

B

B

munkát (PFVW), dP/dtmax-végdiasztolés térfogat arányt (dP/dtmax-PdiaV), végdiasztolés B

B

B

B

B

B

nyomás-térfogat arányt és hatásfokot a korosodással megjelenő szívelégtelenségben. A fenti paraméterek átlagos értéke átlag + standard error formában, minden csoport 6-10 állatból mért értéket tartalmaz. * :P < 0.05 a fiatal felnőttekhez viszonyítva; #: P < 0.05 a kezeletlen öreg állatokhoz képest. Érfunkciós vizsgálatok. Több, korábbi vizsgálathoz hasonlóan, a mi ex vivo méréseink is alátámasztották azt a megállapítást, hogy az életkor előrehaladtával patkányokban az endotélfunkció károsodik, amelyet jól mutat a mellkasi aortából kimetszett gyűrűk acetilkolinra adott maximális relaxációs válaszának csökkenése , és a dózis-hatás görbe jobbra tolódása a fiatal kontrollokhoz képest (11. ábra). A PARP farmakológiai gátlása INO-1001-gyel szignifikánsan javította az acetilkolinra adott választ az öreg állatokban, ugyanakkor

nem

volt

hatással

az

egészséges,

endotélfunkciójára.

49

fiatal

felnőtt

patkányok

11. ábra. Az előrehaladott, korosodás okozta endotéldiszfunkciót a PARP farmakológiai gátlása javítja patkányokban. Acetilkolin-indukált endotélium-dependens relaxáció. A görbe minden pontja átlag ± standard error 7-10 kísérlet alapján.

* : P<0,05 a fiatal felnőtt

csoporthoz képest; # : P<0,05 az öreg patkányok csoportjához viszonyítva.

Poli (ADP-ribóz) polimeráz aktiváció szerepe a diabéteszes szív működésében bekövetkező változásokban

A következőkben leírt három kísérlet eredményeit nemzetközi konferenciákon (FASEB, FEBS Advanced Course: Biology and pathophysiology of poly (ADP-ribosylation)) mutattuk be, egyéb helyen nem jelentek meg. Ezért ábrák nélkül, rövid összefoglalásként mutatom be ezeket a munkákat.

50

Kísérleteinkben a bal kamrai nyomás-töltőtérfogat összefüggését vizsgáltuk diabéteszes szívelégtelenség modellben: Diabéteszt 100mg/kg i.p. streptozotocinnal indukáltunk hím BALBc egereknél. A szívfunkciót a diabétesz indukcióját követően 1, 4 illetve 8 héttel vizsgáltuk. Hemodinamikai mérések: Az egereket általános anesztéziában Millar rendszerrel monitoroztuk, vizsgáltuk a bal kamra funkciót. A jobb oldali combartériában pedig az artériás középnyomást mértük. Vizsgált paramétereink a szívfrekvencia, a bal kamrai szisztolés nyomás maximuma, az artériás középnyomás (artériás Pközép), a szisztolés nyomásemelkedés meredekségének B

B

maximuma (+dP/dtmax) és a diasztolés nyomásesés meredekségi minimuma (-dP/dtmax), B

B

B

B

a nyomásesés időkonstansa, az ejekciós frakció (EF), a verőrérfogat, a perctérfogat és a szív munkája. A teljes perifériás ellenállást (TPR) a TPR= artériás Pközép/ perctérfogat B

B

összefüggésből számoltuk. Eredményeink szerint a szisztolés funkció változásáról a következőt állapítottuk meg: a kontrollhoz képest az egy hetes diabéteszes állatokban az artériás Pközép, a bal kamrai B

B

szisztolés nyomás és a szívfrekvencia szignifikánsan megemelkedett (ami nem utal diabéteszes funkciózavarra, ezért valószínű, hogy ekkor még az általános gyulladásos reakció következményeit láttuk), de a +dP/dtmax nem változott. A diabétesz 4. hetében B

B

szignifikáns csökkenést mutatott mind a négy paraméter. A 8. hétre a +dP/dtmax további B

B

esése volt megfigyelhető. A diasztolés funkció romlása az első héten még nem volt megfigyelhető. A negyedik hétre a bal kamrai végdiasztolés nyomás, a –dP/dtmax és a nyomásesés időkonstansa is B

B

szignifikánsan emelkedett volt a kontrollhoz képest; a nyolcadik hétre csak a végdiasztolés nyomás emelkedett tovább, a másik két paraméter nem változott. A perctérfogat a bal kamrai szisztolés nyomással, az ejekciós frakció a szisztolés nyomásemelkedés meredekségének maximumával párhuzamosan változott, a teljes perifériás ellenállás viszont csak a 8 hetes diabéteszes egereknél mutatott szignifikáns emelkedést. Korábban kimutattuk izolált, perfundált patkányszíveken, hogy ischémiás-reperfúziós modellben a PJ34-nek nem volt semmilyen hatása sem a hemodinamikai paraméterekre sem pedig a Ca2+i-háztartásra. A másik oldalon viszont azt találtuk, hogy a PJ34-gyel P

PB

B

kezelt szívek nagyobb hányada kezdett ismét verni a reperfúzió alatt (77% versus a

51

kontrollok 67%-a). Az iszkémia utáni visszatérés is gyorsabb volt: míg a reperfúzió 5. percében a PJ34-kezelt szívek 70%-a vert, a kontrolloknak ekkor csak 37,5%-a működött. Összefoglalásként megállapítottuk, hogy a PARP szelektív gátlásával a szívizomsejtek ATP- és NAD+-készleteit megmenthetjük a gyors depléciótól, ezzel elősegítve a P

P

hemodinamikai működőképesség visszanyerését iszkémiás inzultus után, anélkül, hogy a miokardium kálcium-homeosztázisába beleavatkoznánk. Ezen adatok, és a szakirodalom alapján terveztük meg a következő kísérletet: hím Sprague-Dawley patkányokat diabéteszessé tettünk egyszeri streptozotocin-kezeléssel. Az állatokat hat hét után vontuk be a mérésekbe. Kezeletlen kontrollokkal szemben, Nembutál altatásban Millar rendszerrel mértük a szívfrekvenciát és a bal kamrai nyomást, és ebből számoltuk a szisztolés és diasztolés nyomásváltozás maximális meredekségét. Harminc perces ekvilibráció után mind a diabéteszes, mind az egészséges állatok fele 30 mg/ttkg PJ34-t kapott i.v., a többi alany pedig ugyanekkor vehikulumot. További 60 percig monitoroztuk a szívműködést. Azt tapasztaltuk, hogy a mérés kezdetén nem volt különbség a csoportok bal kamrai nyomásában, de az összesen 90 perces mérés végén a diabéteszes állatok nyomása szignifikánsan csökkent, amit a PARP-gátló adásával teljesen ki lehetett védeni. A szívfrekvencia végig szignifikánsan alacsonyabb maradt, mint a kontroll állatokban. A PJ34 a kontroll állatokban nem fejtett ki semmilyen hatást. A kísérlet második felében az állatok mindegyikének 15 mg/ttkg lipopoliszaharidot adtunk i.v. Ennek hatására az első két percben a kezeletlen diabéteszes állatok nyomása, dP/dtmax-je és szívfrekvenciája is leesett. Ennél kisebb nyomásesést figyelhettünk meg a B

B

másik három csoportnál, az LPS adását követő 4.-6. percben, de a szívfrekvencia ezeknél nem csökkent. Az endotoxémiát 90 percig követtük, de további hemodinamikai eltéréseket nem találtunk a csoportok között. A túlélést viszont, úgy tűnt, hogy a PARPgátlás nem, de a cukorbaj befolyásolja: az endotoxémia 90. percéig mind a PJ34-kezelt, mind a kezeletlen kontrollok 72 %-a maradt életben, a cukorbetegek közül 100 % (kezeletlen), illetve 87,5 % (PJ34) élte túl a mérés végpontját. Eredményeink arra mutatnak, hogy a korábbi megfigyeléseknek megfelelően a diabéteszes relaxációs zavar a db/db egerekben kialakult. A db/m állatoknál a relaxációs készség szignifikánsan jobb volt, mint a cukorbeteg állatokban (47±5% versus 25±2%).

52

PARP-gátló kezelés hatására a db/m állatokból izolált mellkasi aorta relaxációs készsége nem változott (25±2% versus 28±4%), de a db/db egerekben szignifikáns

Kontrakció (%)

javulást találtunk (47±5% versus 36±4,2%) (12. ábra).

#

12. ábra. Leptindeficiens egerekben az endotéldiszfunkció romlását a PARP farmakológiai gátlása megállítja az általunk használt egér modellben. Acetilkolinnal

indukált

endotélfüggő

relaxációt

vizsgáltunk

adrenalin

prekontrakciót követően. A kontroll és a db/db. állatok felét INO-1001-gyel kezeltük 12-16 héten keresztül, az egerek másik fele ugyanakkor vehikulumot kapott. A görbe minden pontja átlag±S.E.M. értéket ábrázol, 6-8 kísérlet alapján.


A 3 hónapos INO-1001 kezelés szignifikánsan javította az endotéliumfüggő relaxációs képességet ezekben az állatokban (13. ábra). Az izolált aortagyűrűk PARP inhibítoros kezelése in vitro 1 órán át a szervfürdőben részben visszaállította az endotélfunkciót

53

(14. ábra). A PARP farmakológiai gátlása nem befolyásolta az egészséges kontroll állatokban mérhető relaxációt (14. ábra).

13. ábra. ApoE deficiens egerekben az endotéldiszfunkció romlását a PARP farmakológiai gátlása megállítja az általunk használt egér modellben. Acetilkolinnal

indukált

endotélfüggő

relaxációt

vizsgáltunk

adrenalin

prekontrakciót követően. A kontroll és az ApoE deficiens állatok felét 30 mg/ttkg/nap INO-1001-gyel kezeltük 12 héten keresztül, az egerek másik fele ugyanakkor vehikulumot kapott. A görbe minden pontja átlag±S.E.M. értéket ábrázol, 6-8 kísérlet alapján. *: P<0,05 az ApoE deficiens és kontroll csoport között (INO-1001 kezeléssel vagy kezeletlenül); #: P<0,05 INO-1001 kezelt ApoE deficiens egerek adatait a vehikulummal kezelt ApoE deficiens egerekével szemben.

54

14. ábra. A PARP in vitro farmakológiai gátlása részlegesen helyreállítja az endotélfüggő relaxációs készséget ApoE deficiens egér modellben. Acetilkolinnal

indukált

endotélfüggő

relaxációt

vizsgáltunk

adrenalin

prekontrakciót követően. A kontroll és az ApoE deficiens állatokból származó érgyűrűk felét 3µM INO-1001-t tartalmazó Krebs oldatban inkubáltuk 1 órán keresztül, az érgyűrűk másik fele ugyanakkor vehikulumot kapott. A görbe minden pontja átlag±S.E.M. értéket ábrázol, 6-8 kísérlet alapján. *: P<0,05 az ApoE deficiens és kontroll csoport között (INO-1001 kezeléssel vagy kezeletlenül); #: P<0,05 INO-1001 kezelt ApoE deficiens érgyűrűk adatait a vehikulummal kezelt ApoE deficiens gyűrűkével szemben.

A ballonkatéteres sértést követő resztenózissal szemben protektív hatású a metalloporfirin szerkezetű, a peroxinitrit bontását katalizáló WW85 A ballonkatéteres sértés súlyos vaszkuláris sérülést okozott, amelyet a nagymértékű neointima formációval karakterizálhattunk. A ONOO--lebontást katalizáló WW85 a P

55

P

neointima formációt csökkentette. A morfometrikus analízist számítógépre kapcsolt mikroszkópos planimetria eljárással végeztük, így határoztuk meg az intima/média arányt. Az intima/média arány a WW85 kezelés hatására mintegy 40%-kal csökkent a kezeletlen kontrollokhoz képest. Az izolált érgyűrűkön végzett méréseink is azt igazolták, hogy a sértést követően az erek relaxációs készsége jelentősen romlott az endotélium-dependens vazodilatátor acetilkolinnal szemben. A peroxinitrit farmakológiai semlegesítése WW85-tel

Kontrakció (%)

szignifikánsan javította az érgyűrűk funkcionális állapotát (15. ábra).

15. ábra. A ONOO- lebontását segítő WW85 részlegesen helyreállítja az endotélfüggő P

P

relaxációs készséget ballonkatéteres sértés modellben. Acetilkolinnal

indukált

endotélfüggő

relaxációt

vizsgáltunk

adrenalin

prekontrakciót követően. A kontroll és az angioplasztikán átesett állatokból származó érgyűrűk relaxációs készségét vizsgáltuk WW85 kezelés mellett. A görbe minden pontja átlag±S.E.M. értéket ábrázol, 6-8 kísérlet alapján. **: P<0,01 a ballonkatéterrel sértett és kontroll csoport között; #: P<0,05 WW85-tel kezelt angioplasztikán átesett patkányokból izolált érgyűrűk adatait a vehikulummal kezelt angioplasztikán átesett patkányokból izolált gyűrűkével szemben.

56

Immunhisztokémiai vizsgálatokkal az is igazolást nyert, hogy a sértett erek intima rétegében nagyobb mennyiségben volt jelen a nitrotirozin (nitrózatív stressz), PAR és VCAM-1 (adhéziós molekula), mint a kontroll erekben. A WW85 kezelés hatására mindhárom vizsgált molekula festődése (tehát expressziója) csökkent.

A poli (ADP-ribóz) polimeráz gátlása javítja az angiotenzin-rendszer túlműködéséből eredő endotéldiszfunkciót

A három csoport (negatív kontroll Wistar Kyoto, SHR és enalapril-kezelt SHR patkányok) testtömegében nem volt szignifikáns különbség. Az SHR patkányok artériás vérnyomása közel kétszerese volt a negatív kontrollokénak (209 ± 5 Hgmm, illetve 109 ± 6 Hgmm). Az enalapril-kezelés a vérnyomást szignifikánsan csökkentette 138 ± 23 Hgmm-re (p < 0,01). A bal kamrai szisztolés nyomás szintén erősen emelkedett a spontán hipertenzív állatoknál, amelyet az ACE-gátló alkalmazása normalizált (16. ábra). Ezzel együtt a +dP/dtmax érték is emelkedett a magas vérnyomású csoportban, és B

B

enalapril kezelésre visszatért a kontroll értékre. A mellkasi aorta endotélfüggő relaxációs készségét vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a hipertóniás csoportban szignifikánsan rosszabb volt az acetilkolin érzékenység, mind a kontrollokhoz, mind pedig az ACE-gátlóval kezelt csoprthoz mérten. Utóbbiak endotélfüggő relaxációs készsége nem különbözött a kontroll Wistar-Kyoto patkányokétól (17. ábra). Korábbi tanulmányok arra mutatnak, hogy a PARP farmakológiai gátlása szintén normalizálja a magas vérnyomás következtében kialakuló endotéldiszfunkciót (Pacher et al., 2002e) . A poli (ADP-ribóz) szintézisre utaló bizonyítékokat immunhisztokémiai módszerekkel kerestük a szívizomban, a mellkasi aorta rétegeiben és a veseglomerulusokban. Az immunhisztokémiai módszerrel jelölt PAR mennyiségét csökkenti az általunk használt enalapril-kezelés. A kontroll metszetekben nem volt detektálható mennyiségű PAR. A PAR felhalmozódás az SHR állatok szöveteiben sötét intranukleáris jelölésként látszott a szív izomsejtjeiben, az érbelhártya sejtjeiben és az ér simaizom-rétegeiben és a vese tubulusaiban, illetve a glomerulusokban. Enalapril-kezelés hatására a PARP aktiváció észrevehetően csökkent ezekben a szövetekben (ábra nélkül.).

57

16. ábra. A magas vérnyomás következtében megnövekedett artériás középnyomást (Partéria), bal kamrai nyomást (Pbal B

B

B

kamra) B

és a szisztolés funkciógörbe (+dP/dtmax)

meredekségének növekedését az enalapril-terápia visszafordítja SHR patkányokban.

58

B

B

Az adatok átlag ±S.E.M. értéke van ábrázolva, Wistar-Kyoto kontrollokkal szemben. *P<0,05 a kontrollhoz képest, #P<0,05 kezeletlen SHR patkányokhoz viszonyítva.

17. ábra A magas vérnyomás következtében kialakuló endotéliális funkcióromlást visszafordítja az enalapril-kezelés spontán hipertenzív patkányok esetén. Az adatokat átlag ±S.E.M. formában ábrázoltuk. * P<0,05 az egészséges WistarKyoto kontrollokhoz képest; # P<0,05 a kezeletlen SHR állatokhoz viszonyítva.

Munkacsoportunk ezekkel a mérésekkel párhuzamosan vizsgálta az angiotenzin szubpresszor dózisú krónikus adagolásának hatását in vivo önmagában és PARPgátlóval együtt adva is, illetve egér endotélsejtekre gyakorolt hatását in vitro. Ezen mérésekből, illetve a hipertónia betegség, PARP-aktiváció és endotél diszfunkció kapcsolatára vonatkozó kísérletekből a következő mechanizmus rajzolódott ki:

59

Az angiotenzin receptor aktiválása a NADPH oxidáz fokozott szuperoxid-termelését indukálja. A nagyobb mennyiségben megjelenő szuperoxid a nitrogén-monoxiddal RNIket képez (ami elsősorban az eNOS terméke), ezért emelkedett koncentrációban peroxinitrit jelenik meg. A peroxinitrit a DNS egyszálú töréseit okozza, ezen keresztül aktiválja a PARP 1-t, ami a bevezetőben említett mechanizmusokon keresztül vezet endotéldiszfunkcióhoz (18. ábra). AI

Beavatkozási lehetőség: enalapril., egyéb inhibítorok

ACE AII

AII receptor

NADPH oxidáz Beavatkozási lehetőség: antioxidánsok

NOS

O2B

PB

NO. P

P

P

ONOOP

P

Egyszálú DNStörések Beavatkozási lehetőség: PARP-gátlók ?

PARP1 aktiváció

NAD+ ↓ P

P

NADPH+ ↓ P

ATP ↓

P

Endotél diszfunkció

18. ábra.

A PARP aktiváció szerepe az angiotenzin II. okozta endotéliális

funkciókárosodás kialakulásában. Az angiotenzin II A1-receptorához kötődve az érbelhártya sejtjeiben a NADPH oxidázt aktiválja, ami fokozza a szuperoxid-termelést (O2-). A képződő szuperoxid B

PB

P

reakcióba lép a nitrogén-monoxiddal, amelyet főleg az eNOS termel. A reakcióban peroxinitrit képződik (ONOO-), amely a DNS-t károsítja, így a PARP 1 P

P

aktivációjához vezet. A fentebb leírt, haszontalan metabolikus ciklus az endotélsejtek reverzibilis károsodásához vezet.

60

MEGBESZÉLÉS

Az INO-1001 javítja a szívfunkciókat és az aorta relaxációs készségét idős patkányban Az első kísérletsorozatunkban a PARP farmakológiai gátlásának hatását a keringési rendszerre egy öregedés-modellben jellemeztük. Itt nyomás-térfogati konduktancia katétert használtunk a szív állapotának meghatározására, illetve a mellkasi aortán in vitro vizsgáltuk az endotélfunkciót Fisher patkányokban. A nyomás-térfogati görbe analízise igen sok előnnyel jár: intakt kamrafunkció mellett közvetlenül mérhetünk, és az előterheléstől független paramétereket igen jól el tudjuk különíteni (Little, 1985; Kass et al., 1987; Nakano et al., 1990). Ezt a megközelítést használva sikerült kimutatnunk, hogy a PARP gátlása INO-1001-gyel feltűnően javítja az időskorban gyengült szív teljesítményét. Egyre több adat mutat arra, hogy idős korban a kardiovaszkuláris rendszer funkciója romlik (Anversa et al., 1989; Capasso et al., 1990; Hatake et al., 1990; Taddei et al., 1995; Higashi et al., 1997; van der Loo et al., 2000; Hamilton et al., 2001; Boluyt et al., 2004) De az a mechanizmus, amely felelős ezen diszfunkció kialakulásáért, még nem teljesen feltárt. Ez a károsodás mindenképpen, legalább részben visszavezethető a reaktív oxigén és nitrogén speciesek lokális formációjára a miokardiumban és az érfalban egyaránt (Inoue and Inoue, 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1998; van der Loo et al., 2000). A megnövekedett nitrotirozin képződésről már valóban beszámoltak korábbi tanulmányok (van der Loo et al., 2000; Csiszár et al., 2002) A

Fisher

patkányok

már

régóta

szolgálnak

a

kardiovaszkuláris

öregedés

mechanizmusainak tanulmányozására (Anversa et al., 1989; Capasso et al., 1990; Boluyt et al., 2004). Az ő esetükben a szív csökkenő teljesítménye és a progresszív kardiomiopátia kialakulása a 20 hónapos kor körül már kimutatható (Anversa et al., 1989). Ezzel összhangban a mi vizsgálatainkban is a Fisher patkányok öregedése együtt járt a dP/dtmax és az ejekciós frakció csökkenésével és tüdőödéma kialakulásával. Habár B

B

a +dP/dtmax széles körben használt paraméter a szív kontraktilitásának meghatározására, B

B

61

jól ismert, hogy értéke nagyban függ a szív telődésétől (Little, 1985; Kass et al., 1987). Az ejekciós frakcióról is ismert, hogy az elő- és utóterhelés is befolyásolja, ezért nem megbízható jelzője a szívizom kontraktilis állapotának azokban a modellekben, ahol mindkettő módosul. Ezért mi a nyomás-térfogat összefüggés alapján a kamra kontraktilitásának más jellemzőit is meghatároztuk, amelyek kevésbé függenek az előés utóterheléstől: végszisztolés nyomás-térfogatváltozás összefüggését (Pdia VR illetve B

B

Emax), előterhelés-függő térfogati munkát (PFVW), és a dP/dtmax-végdiasztolés térfogat B

B

B

B

arányát (dP/dtmax-Vdia). Az előbb említett, a bal kamra funkcionális állapotát jellemző B

B

B

B

telődéstől független indexek értéke nagymértékben csökkent öreg állatoknál, ami jelezte, hogy a szisztolés kontraktilitás diszfunkciós ebben a csoportban. A PARP gyógyszeres gátlása INO-1001-gyel a telődéstől függő paramétereket csak mérsékelten javította (+dP/dtmax, bal kamrai szisztolés nyomás és ejekciós frakció) (7. és 8. ábra). B

B

Ezzel szemben a kezelés szignifikánsan javította a bal kamrai funkció terheléstől független jellemzőit (Emax, előterhelés-függő térfogati munka és a dP/dtmaxB

B

B

B

végdiasztolés térfogat aránya), ami a kontraktilitás javulását jelzi. A szív relaxációs készségének zavarai és a végdiasztolés állapotban megfigyelhető szívizom-merevség növekedése az öreg állatokban megjelenik, amint azt a bal kamrai nyomásesés időkonstansának megnyúlása és a végdiasztolés nyomás-térfogat arányszám növekedése mutatja. Ezeket a relaxációs zavarokat az INO-1001 kezelés enyhítette (10. ábra). Ezen túlmenően az INO-1001 terápia az acetilkolin indukálta, NO-mediált érrelaxációt is javította izolált mellkasi aortákon. Ezek az adatok igen jó egyezést mutatnak azokkal a korábbi vizsgálatokkal, amelyekben a PJ34 PARP-inhibítort használták, és szintén jó eredményeket értek el vele: az öregedő patkányok endotélfüggő relaxációját növelte a szer adása (Pacher et al., 2002d). Összefoglalva: adataink alátámasztják, hogy a PARP farmakológiai gátlása INO-1001gyel figyelemre méltóan javítja mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés diszfunkciót, amelyek az öreg Fisher patkányokban megjelennek. Ehhez még hozzáadódik az az előny, amely szerint az INO-1001 kezelés hatására ugyanebben a csoportban az acetilkolin aktivált NO-függő relaxációs készség is szignifikánsan javul az elasztikus típusú nagyerekben. Megfontolandó, hogy az öregedéssel együtt járó szívelégtelenség kialakulása és az endotéliális PARP-aktivációs útvonal egymással kapcsolt; az endotélfunkció valamely hibája globális vagy regionális miokardiális ischémiához

62

vezethet, és ez másodlagosan vezethet a szív teljesítményének csökkenéséhez. Adataink alátámasztják, hogy a PARP gyógyszeres gátlása egy új terápiás lehetőséget jelenthet az időskori kardiovaszkuláris problémák kezelésében. Ki kell térnünk egy ellentmondásra is: ugyan vizsgálatainkból és korábbi tanulmányokból is egyértelműen azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a PARP aktivációja

összefüggést

mutat

az

időskori

kardiovaszkuláris

betegségek

előrehaladásával, más kutatók azt írták le, hogy a hosszabb élettartamú állatfajok PARP-aktivitása magasabb, mint a rövid élettartamú fajoké (Burkle et al., 1992). Sőt, az időskorú lakosság átlagos PARP-aktivitása magasabb, mint a 20-30 évvel fiatalabb korosztályé, tehát az alacsony PARP-aktivitású személyek korábban halnak (Cottet et al., 2000). Sajnos ismereteim nem elégségesek ahhoz, hogy ezt a paradoxont feloldhassam valamiféle egyesített elmélettel. A PARP-kutatás éppen az elmúlt néhány évben új szakaszba lépett, amikor kezdtük felismerni, hogy egy sokkal bonyolultabb rendszer egyik láncszemét alkotja ez az enzim, mint gondoltuk. Nemcsak az ROI-RNI → egyszálú DNS-törések → PARP aktiváció → javítás vagy halál útvonalon működik közre, hanem az ép DNS hozzáférhetővé tételében, több géntermék transzkripciójának szabályozásában is (Rouleau et al., 2004), és fontos szerepe van például a hosszú távú memória kialakulásában (Edwards and Rickard, 2002; Cohen-Armon et al., 2004; Yang et al., 2004); több egyéb faktor (D-vitamin (Mabley et al., 2007), ösztrogén (Mabley et al., 2005) is!) részt vesz a PARP aktivitás szabályozásában. Nagyon lényeges felismerés a paradoxon feloldására, hogy a PAR-iláció a DNS karbantartását segíti ezekben az esetekben, illetve a karcinogénekre adott DNS-amplifikáció választ gátolja (Burkle, 2001a). Még két feltételezhető mechanizmust emelek csak ki, amelyek számomra támpontot nyújtanak a megoldás kereséséhez: egyrészt a bevezetés öregedéssel foglalkozó alfejezetében hivatkoztam arra, hogy a poli (ADP-ribóz) lebontásáért felelős enzim, a PARG átírása idős korra közel a harmadára csökken (Kayo et al., 2001), másrészt a túléléshez szükséges a megfelelő hosszú távú memória.

63

Poli (ADP-ribóz) polimeráz aktiváció szerepe a diabéteszes szív működésében bekövetkező változásokban

Diabéteszes betegek között vezető halálok a kardiovaszkuláris szövődmények kialakulása. A miokardiális diszfunkció ezeknél a betegeknél a koronáriabetegségektől függetlenül jelenik meg, amit diabéteszes kardiomiopátiának neveznek, és jól ismert kórkép a diabétesz mellituszban szenvedő betegek között. Azonban a betegségben megjelenő hemodinamikai változásokat kisállat-modelleken korábban még nem követték végig részletesen. Az általunk használt streptozotocin-indukált diabéteszes egereknél a hemodinamikai változásokat karakterizáltuk, a betegség legkorábbi szakaszától a krónikus keringési adaptációig. Megállapítottuk, hogy a PARP farmakológiai

gátlásának

nincsen

hatása

egészséges

állatok

szívműködésére.

Diabéteszes állapotban a PARP aktivációja nemcsak megfigyelhető a kardiovaszkuláris rendszer szöveteiben, de részt is vesz a cukorbaj keringési szövődményeinek kialakulásában. A diabéteszre jellemző bal kamrai nyomáscsökkenést, illetve az endotéldiszfunkciót a PARP gyógyszeres gátlása mérsékli. Már 1980-ban leírták, hogy a PARP gátlásával a Langerhans-szigetek β-sejtjeiben a proinzulin szintézisét meg lehet védeni a streptozotocin hatásával szemben (Yamamoto and Okamoto, 1980). Egy évtizeden belül olyan felismerések is napvilágra kerültek, amelyek szerint a PARP gátlása segíti a sérült endokrin hasnyálmirigy regenerálódását (Sandler and Andersson, 1988; Yonemura et al., 1988). A PARP

-/P

P

egereken végzett

vizsgálatok azt is kimutatták, hogy ezek az állatok ellenállnak a streptozotocin βsejteket károsító hatásának (Burkart et al., 1999). De vajon hogyan járul hozzá a diabéteszes szövődmények kialakulásához a PARP aktivációja? A

bevezetőben

glukózkoncetráció

már

említésre

emelkedett

került,

hogy

intracelluláris

az

emelkedett

extracelluláris

glukózkoncentrációt

okoz

az

endotélsejtekben. Az intracelluláris glukózkoncentráció emelkedése fokozza a glikolízist, amely másodlagosan fokozza a mitokondriumok aktivitását, és a mitokondriumok belső membránján a protonok elektrokémiai potenciálkülönbségét. A hiperglikémia

ilymódon

a

mitkondriumok

túlműködését

okozza,

amelynek

eredményeképpen a III. számú mitokondriális elektrontranszport alrendszerből fölös elektronok csorognak le, amely szuperoxid szabadgyök termelődéséhez vezet. A

64

mitokondriális

szuperoxid mint ROI vagy az NO-val reagálva mint RNI a DNS

károsodását előidézve aktiválja a sejtmagban elhelyezkedő PARP-t, amely, más hatások mellett (sejt energetikai raktárainak csökkentése, gyulladásos gének transzkripciójának fokozása, stb.), az endotélsejtek gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) enzimének módosításához (PAR-ációjához) vezet, amely az enzim gátlását okozza (Du et al., 2003). Mindez négy, az 1. ábrán részletesebben is feltüntetett reakcióúton (poliol, AGE, PKC, hexózamin utak) keresztül vezet a diabétesz mellitusz érkárosító szövődményeinek

kialakulásához.

Márpedig

a

cukorbetegség

valamennyi

szövődményét visszavezethetjük a makro-és mikroangiopátiák kialakulására.


A reaktív oxigén és nitrogén gyökök termelése nagy szerepet játszik a korai ateroszklerotikus endotélkárosodások kialakulásában (Laursen et al., 2001; Jiang et al., 2003a; Jiang et al., 2003b). Ezek a gyökök a DNS-t károsítják, amely folyamat szerepet játszik az ateroszklerotikus károsodások kialakulásában (Martinet et al., 2001; Martinet et al., 2002). A kísérletünkben használt ApoE deficiens egérmodellben specifikusan kimutatható, hogy az erekben az oxidánsok és nitrozatív szabadgyökök mennyisége emelkedett, és antioxidáns terápiával ebben a modellben megelőzhető az érbelhártya relaxációs képességének csökkenése (d'Uscio et al., 2001; Laursen et al., 2001; Chen et al., 2003; Jiang et al., 2003a; Jiang et al., 2003b; Matsumoto et al., 2003). Ezért feltételeztük, hogy a DNS-törések aktiválják a PARP-ot, amely az endotélfunkció romlásához vezethet az érelmeszesedés korai stádiumában az ApoE deficiens modellben. Valóban több közlemény leírja, hogy a PARP-aktivációnak komoly szerepe van az endotélfunkció elvesztésében más patofiziológiás folyamatokban, mint például endotoxin-sokkban

(Szabó et al., 1997), ischémiás-reperfúziós sérülések esetén

(Cuzzocrea et al., 1997; Szabó et al., 2003), krónikus szívelégtelenség mellett (Pacher et al., 2002b), cukorbajban (Garcia Soriano et al., 2001), és az öregedést kísérő relaxációs zavarok kialakulásában (Pacher et al., 2002d). Ez az endotéliális diszfunkció nem feltétlenül jár együtt az endothélsejtek denudációjával vagy pusztulásával, és reverzibilis lehet. Ahogy azt diabétesz mellituszban szenvedő patkányok mellkasi

65

aortáján kimutatták, a kialakuló endotéliális diszfunkció gyorsan visszafordítható a PARP farmakológiai gátlásával, és a diszfunkció elsődleges oka a NADPH depléció az érbelhártya sejtjeiben, ugyanis a NADPH esszenciális kofaktora az endotéliális nitrogén-monoxid szintáznak (Garcia Soriano et al., 2001; Soriano et al., 2001). Az ApoE deficiens modellben ex vivo kimutatott, hogy az érfalban folyamatosan emelkedett az oxigén szabadgyökök termelése (Godecke et al., 2002), és az is bizonyított, hogy az ApoE deficiens egerek carotisát in vivo SOD-mimetikus oldatban inkubálva javul azok acetilkolinnal kiváltott, endotélium-dependens relaxációs képessége (d'Uscio et al., 2001). Hasonló javulás észlelhető, ha az artériát in vitro inkubálják a feltételezhetően peroxinitrit-semlegesítő húgysavval (Laursen et al., 2001). A fentebb leírt eredményeink bizonyítják, hogy a PARP farmakológiai gátlása megelőzheti az endotélium funkcionális romlását, de akutan is javíthatja a relaxációs képességet az ApoE deficiens modellben. Ezek az adatok együttesen azt is jelzik, hogy az emelkedett szabadgyök-termelés és a PARP-aktiváció együtt jár az ApoE deficiens egerek ereinek falában, még azután is, hogy ezeket az ereket már eltávolítottuk az állatokból. Ezen adataink alátámasztják, hogy a PARP-aktivációs útvonalnak jelentős szerepe van az endotéldiszfunkció kialakulásában az általunk használt ApoE deficiens modellben. Ez az eredmény konzisztens azzal a publikációval, ami szinte egyszerre jelent meg a miénkkel, és leírja, hogy a PARP gátlása javítja az endotélfunkciót és csökkenti az ér intimarétegének vastagodását ballonkatéteres sértéssel előidézett érsérülések esetén patkány modellben (Zhang et al., 2004). A PARP-aktivációnak feltételezhetően több kiváltóoka van. Azok a gyökök, amelyek termelése már az ateroszklerózis korai fázisában elkezdődik, kiválthatnak egyszálú DNS-töréseket, ezáltal aktiválva a PARPot. Ezen gyökök közé sorolhatjuk a peroxinitritet és a hidrogén-peroxidot. Meg kell jegyeznünk, hogy eddig minden olyan tanulmány, amely az ateroszklerózis és a PARP összefüggéseit vizsgálta (Zhang et al., 2004) és a jelen munka), a PARP farmakológiai gátlószereit használta. Ezek az anyagok gátolhatnak más PARP-izoformákat is, nemcsak a leggyakoribbat (PARP 1), és lehet ezeknek más, aspecifikus hatásuk is, amelyet nem a PARP-ok befolyásolásán keresztül fejtenek ki. További tanulmányok szükségesek annak eldöntésére, hogy tisztán csak a PARP 1 mekkora szerepet játszik az endotéliális diszfunkció kialakulásában. Ilyen kísérletek lehetnek például a PARP

66

1/ApoE kettős knock-out állatokon mérni az érbelhártya funkcionális állapotának változását, vagy ballonkatéteres sértés modellben vizsgálni a PARP 1 deficiens állatok érzékenységét. Továbbá szükséges olyan vizsgálatok elvégzése, amelyek során a folyamatra jellemző intracelluláris eseményeket követhetjük nyomon. A PARP-aktivitás befolyásol több celluláris anyagcsere-útvonalat (NAD, NADPH és ATP-felhasználó enzimként ezek mennyiségét, elérhetőségét jelentősen csökkenti), a mitokondriumok funkcióit és kapcsolatot mutat a sejthalálhoz vezető folyamatokkal, illetve szignáltranszdukciós útvonalakkal is (Virág and Szabó, 2002). Hogy a fentebb leírt modellben mekkora szerepet játszanak egyenként az itt felsorolt folyamatok, illetve mi a PARP lehetséges befolyása ezekre a folyamatokra, annak kiderítése további vizsgálatokat igényel. Az

ApoE

deficiens

egér

esetén

kimutatható,

hogy

az

endotélium

kóros

funkcióváltozásában az angiotenzin II szintén szerepet játszik (Knowles et al., 2000; Wolf, 2000; Tham et al., 2002a). Ebből a szemszögből érdemes megjegyezni, hogy az angiotenzin II-ről tudjuk, fokozza a szabadgyökök termelését az érbelhártyában (Wattanapitayakul et al., 2000), és ezzel elindíthatja a PARP aktivációját kísérő endotéliális diszfunkció kialakulását (Szabó, 2003). Ezen adatok alapján, illetve egy másik laborból származó, a mi méréseinkkel egyszerre zajló kísérletek szerint (Zhang et al., 2004) azt a feltételezést tekinthetjük megerősítettnek, amely szerint az ateroszklerózis korai stádiumában a kórosan emelkedett ROI és RNI termelés az endothélium sejtjeiben aktiválja a PARP-ot, és ez a folyamat indítja el az endotéliális diszfunkció kialakulását. Ez a korai megjelenésű endotéliális funkciózavar önmagukat erősítő kóros körfolyamatokat kapcsol be (mint például fokális szubintimális lipid és lipoprotein lerakódások az úgynevezett habos sejtekben, ami ezeken a területeken krónikus gyulladásos folyamatokhoz és fibrózishoz vezet, az artériák lumenében sztenózis alakul ki, aminek szövődménye az érintett szervek károsodása.) Ugyanakkor irodalmi adatok alapján azt látjuk, hogy nincs mindig egyenes ok-okozati összefüggés az érbelhártya funkcionális állapotának javulása és az ateroszklerotikus plakkok méretének redukciója között az ApoE deficiens modellben (például antioxidáns-terápiát követően, vagy koleszterinszint-csökkentő ágensek adagolása mellett) (Gervais et al., 2003; Jiang et al., 2003a; Jiang et al., 2003b). További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy vajon ha a PARP

67

farmakológiai gátlásával kivédjük a korai endotélium-károsodást, akkor ezzel az ateroszklerózis további patofiziológiai következményeit is kivédjük, vagy legalábbis késleltethetjük-e.

A ballonkatéteres sértést követő resztenózissal szemben protektív hatású a metalloporfirin szerkezetű, a peroxinitrit bontását katalizáló WW85

Az angioplasztikát követő resztenózis egy igen összetett patofiziológiai folyamat, amely jól jellemezhető az artériafal átépülésével és a neointima hiperpláziájával a ballon okozta sérülés helyén. Annak ellenére, hogy egyre több ismeretet szerzünk különböző angioplasztika modellek követésével, az elváltozások kialakulásának mechanizmusa és a terápiás lehetőségek mégis megfoghatatlanok maradtak ezidáig. (a kérdésről bővebb áttekintést ad Laurindo (Azevedo et al., 2000)). Klinikai tapasztalatok és kísérleti megközelítések egyaránt arra mutatnak, hogy a fellépő oxidatív stressz (a ROI széles skálája) az egyik lényeges vonása a resztenózisnak. Korábbi tanulmányok már bemutatták, hogy a különböző eredetű érsérülések helyén peroxinitrit képződik (Nakazawa et al., 2000; Touyz and Schiffrin, 2004; Csiszár et al., 2005). Ezen belül készültek tanulmányok a ballonkatéteres sérülést követő nitrotirozin megjelenéséről is (Takagi et al., 1998; Kennedy et al., 2004; Muscoli et al., 2004). Eredményeink a már közölt adatoknak megfelelnek, és sikerült azt is bemutatnunk, hogy a peroxinitrit keletkezése még a sértést követő 28. napon is folytatódott patkány modellünkben. A regenerálódó endotéliumban az immunhisztokémiai jel erőteljes volt, kifejezettebb, mint az intima mélyebb rétegeiben, vagy a mediában. A nitrotirozin felszaporodása az érintett érszakaszban arra utal, hogy a nitrózatív stressz és a betegség kialakulása között ok-okozati összefüggés áll fenn. A nitrotirozin akkumulációja az endotél rétegben konzisztenciát mutat a jelenleg elfogadott „válasz a sérülésre” resztenózis modellel. A bizonyítékok több sorban alátámasztják, hogy a peroxinitrit

szelektív

semlegesítése

enyhíti

több

vaszkuláris

és

gyulladásos

megbetegedés lefolyását. A porfirinvázas peroxinitrit-bontást katalizáló anyagunk több ilyen betegség modellben hatásosnak mutatkozott, az ischémiás-reperfúziós sérülésektől a kolitiszig, az artritisztől a diabéteszes komplikációkig és transzplantátum-kilökődések

68

ellen is védelmet nyújtott (Salvemini et al., 1998; Szabó et al., 2002a; Szőcs et al., 2002; Pieper et al., 2005). A ballonkatéter okozta sérülés modellen végzett vizsgálataink arra mutatnak, hogy a peroxinitritnek jelentős szerepe van a resztenózis patogenezisében, és egy új terápiás célpont lehet a betegség megelőzésére. A ONOO- képződéséhez szükséges O2- több forrásból származhat, ezek között lehet a P

P

B

PB

P

NADPH oxidáz, a mitokondrium, a beszűrődő mononukleáris sejtek, de a NOS is. Ugyanígy a ONOO- képződéséhez szükséges NO forrásai lehetnek ugyanúgy a P

P

konstitutív mint az indukálható NO-szintáz (Szőcs et al., 2002; Kennedy et al., 2004; Dourron et al., 2005). A DNS-sérülések gyakorisága növekszik, és ennek következtében a PARP aktiválódik, ahogy azt már nyulakon végzett ballonkatéteres sértés kísérletek bizonyították, ugyanebben a modellben azt is leírták, hogy a PARP gátlása lassítja a neointima formációt (Zhang et al., 2004). Munkánk során mi is megfigyeltük, hogy a ballonkatéteres sértés hatására felhalmozódik a PAR az érbelhártyában. Amikor WW85 kezelést alkalmaztunk, ez a PAR-áció is csökkent, ami alátámasztja azt a korábbi megfigyelést, hogy a peroxinitrit farmakológiai eszközökkel történő lebontása a DNS védelmén keresztül csökkenti a PARP aktivációt. Megfigyeléseink további bizonyítékot szolgáltatnak a „ROI/RNI képződés → DNS sérülések → PARP aktiváció” útvonal szerepéről a resztenózis kialakulása során. Még a WW85 kezelés után is található néhány olyan endotélium sejtmag, amely PAR-pozitív festődést mutat. Ezt a megfigyelést a DNS-törések valamilyen alternatív mechanizmusára vezethetjük vissza, amelyeket a peroxinitrittől eltérő intermedierek mediálnak, például hidrogén-peroxid, hidroxilgyök vagy nitroxil anion. (A PARP aktivációt előidéző molekulákról szóló, részletes áttekintést ad (Virág and Szabó, 2002).) A peroxinitrit-bontó katalizátor erekre gyakorolt védő hatása nemcsak a neointima formáció csökkentésén és a PARP aktiváció mérséklésén keresztül vált nyilvánvalóvá, hanem az endotélium funkcionális állapotát is szignifikánsan javította. A WW85 ezen hatása feltételezhetően nem közvetlen, mivel a sértetlen erekre szinte semmilyen hatást nem gyakorolt, hanem az érbelhártya azon sérüléseit védi ki, amelyeket egyébként a peroxinitrit-képződés és ennek következményeként a PARP-aktiváció okozna. Egy másik metalloporfirin szerkezetű peroxinitrit-bontó katalizátor, az FP15 alkalmazásával már bemutatták, hogy a nitrotirozin képződés és a peroxinitrit-indukálta citotoxicitás

69

gátlása az erek funkcionális állapotromlásával szemben védelmet nyújt egy diabéteszes egérmodellben (Szabó et al., 2002a). Egyre több bizonyíték támasztja alá az adhéziós molekulák szerepét a resztenózisos artériafal átépülésében. Az E-szelektin, P-szelektin és VCAM-1 expresszió növekedik angioplasztikát követően (Tanaka et al., 1993; Yoshimura et al., 2001), és ezeknek a molekuláknak a felszaporodása növeli meg a leukociták adhéziós készségét és behatolását az érfalba. Ha a leukociták megtapadását gátolják egy leukocita integrin receptor elleni antitesttel, a neointima vastagságát szignifikánsan csökkenteni lehet nyulakban (Golino et al., 1997). Megfigyeléseink szerint a VCAM-1 kifejeződése csökkent WW85 hatására az általunk használt modellben, ami egybevág azzal a nézettel, amely szerint a ONOO- részt vesz az adhéziós receptorok számának P

P

növelésében ballonkatéteres sértés után. Ez a megállapítás indirekt módon bizonyítást nyer : 1. a transzkripciós faktorok aktivációja (pl. NF-κB) fontos szerepet játszik az adhéziós

receptorok

expressziójának

növelésében

angioplasztika

után

(Yoshimura et al., 2001); 2. a ONOO- -ról ismert, hogy az egyes szignáltranszdukciós útvonalakat, köztük az P

P

NF-κB átírását aktiválja (Cooke and Davidge, 2002; Sohn et al., 2003; Hattori et al., 2004); 3. és a ONOO- az adhéziós molekulák kifejeződését serkenti in vitro (Zouki et al., P

P

2001; Zhao et al., 2004) Azt a következtetést vonhattuk le ebből a kísérletsorozatból, hogy a ONOO- korábban P

P

leírt patogenetikus tulajdonságai megfigyelhetőek ballonkatéteres sértést követően. A peroxinitrit semlegesítése protektív hatású a sértett érszakaszra, aminek oka lehet a fehérjék nitrációjának kivédése és a kevesebb kromatinsérülés miatt a PARP aktiváció csökkenése az endotéliumban. A peroxinitrit farmakológiai semlegesítése ezért az angioplasztika terápiás megközelítésében is egy új lehetőséget jelenthet.

70

A poli (ADP-ribóz) polimeráz gátlása javítja az angiotenzin-rendszer túlműködéséből eredő endotéldiszfunkciót

A krónikus hipertónia modellel végzett kísérleteink tapasztalatait következőképpen foglalhatjuk össze. Az általunk felállított hipotézissel az SHR állatokon kapott eredményeink konzisztensek Enalapril adásával nemcsak a magas vérnyomást tudtuk rendezni, hanem gátoltuk a PARP aktivációját is. Ez a megfigyelés azt támasztja alá, hogy az angiotenzin nemcsak kísérletesen adagolva, hanem endogén forrásból származva is képes aktiválni a PARP-t az érrendszerben. Az általunk használt enalapril mennyiségről már korábban leírták, hogy teljes egészében gátolja az ACE-t (Goto et al., 2000; Raasch et al., 2002; Ji et al., 2003). Feltehetjük azt a kérdést, hogy vajon a PARP aktivációja a spontán hipertenzív patkányok esetében közvetlen következménye-e az Ang II oxidatív és nitrózatív folyamatokat indukáló hatásának, vagy közvetve, a megnövekedett terhelés miatt alakul-e ki. A magas vérnyomás elméletileg fokozhatja az érbelhártya oxidáns- és szabadgyök-termelését a megnövekedett nyíróerő miatt (Go et al., 1999; Silacci et al., 2001; Fleming and Busse, 2003). Az a felismerés, amely szerint az Ang II már szubpresszor dózisban is képes a PARP működését fokozni in vitro és in vivo egyaránt, közvetlen hatásra enged következtetni. A citokinek és kemokinek termelésének szabályozásában a PARP szintén szerepet játszik. Ezt részben a nukleáris faktor-κB (NF-κB) szintézisének növelésével teszi (Landmesser et al., 2002; Rueckschloss et al., 2003). Ismert, hogy az Ang II a gyulladásos szignáltranszdukciós útvonalakat aktiválja, szintén a NF-κB leadás növelésén keresztül (Drexler and Hornig, 1999; Wolf, 2000; Hassa and Hottiger, 2002; Tham et al., 2002b; Virág and Szabó, 2002; Costanzo et al., 2003; Singh and Mehta, 2003). További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy vajon az Ang II (részben) a PARP aktivációján kersztül emeli-e a gyulladási citokinek szintjét. Összefoglalva, eredményeink elsőként mutattak arra, hogy az Ang II aktiválja a PARPot teljes szervezetben éppúgy, mint sejtkultúrában. Azt is megállapítottuk a farmakológiai gátlószerekkel végzett kísérletekben, hogy ez a PARP aktiváció a NOS és NADPH oxidáz termelte reaktív speciesekre vezethető vissza. Az Ang II kiváltotta ROI termelés egyik kulcslépése a NADPH oxidáz aktiválása (Rueckschloss et al., 2003). A p47(phox-/-) (NADPH-oxidáz komplex deficiens) egértörzsből izolált endoteliális sejtek P

P

71

az Ang II jelenlétére kisebb O2- - termeléssel válaszolnak, mint a vad típusú társaik (Landmesser et al., 2002). Azt is megállapítottuk, hogy az Ang II okozta endotéldiszfunkció, legalábbis részben, a PARP aktivációra vezethető vissza. Hozzátéve, hogy elsőként írtuk le, hogy a magas vérnyomás betegségben aktiválódik a PARP, illetve hogy az ACE-gátlók protektív hatása kapcsolatban áll a PARP-aktiváció gátlásával SHR modellben. A 17. ábrán összefoglaltuk, hogy a keringő Ang II milyen mechanizmusokon keresztül vezet endotél diszfunkcióhoz vizsgálataink szerint: Az angiotenzin II A1-receptorához kötődve az érbelhártya sejtjeiben a NADPH oxidázt aktiválja, ami fokozza a szuperoxid-termelést (O2-). A képződő szuperoxid reakcióba lép a nitrogén-monoxiddal, amelyet főleg az B

PB

P

eNOS termel. A reakcióban peroxinitrit képződik (ONOO-), amely a DNS-t károsítja, P

P

így a PARP 1 aktivációjához vezet. A fentebb leírt, haszontalan metabolikus ciklus az endotélsejtek reverzibilis károsodásához vezet. Megjegyzem, hogy az Ang II endotéldiszfunkció (és egyéb kardiovaszkuláris elváltozások) kialakulását serkentő hatása nemcsak hipertóniában jelenik meg. Az Ang II kiváltotta oxidatív stressz és a kapcsolódó kóros folyamatok érintettek a diabéteszes szövődmények, krónikus szívelégtelenség és érelmeszesedés kialakulásában is Ezeket a betegségeket már korábban összekapcsolták a PARP aktivációval. Valószínű, hogy az Ang II endogén aktivátora lehet a PARP-nak ezekben a patofiziológiai folyamatokban. A 19. ábrán összefoglalóan azt mutatom be, hogy a PARP 1 hogyan járul hozzá a metabolikus X szindróma következtében kialakuló endotéldiszfunkcióhoz. A korábban tárgyalt folyamatok közül feltüntettem az Ang II mellett a magas vércukorszint és az ateroszklerózisban megjelenő oxidánsok hatásainak lehetséges útvonalait is.

72

oxLDL, TNFα, Hipoxia, plakkok

AII ↑

iNOS ↑

AII receptor

Glu ↑

eNOS ↓

NADPH oxidáz ↑

Glut

O2 . B

PB

NO. P

P

P

ONOOP

P

PARP1 ↑

NAD+ P

NADPH+ ↓ ATP ↓ AIF ↑ P

Poliol ↑

19. ábra.

GAPDH ↓

P

AGE ↑

PKC ↑ hexózamin ↑

Összefoglalás: a PARP1 aktiváció helye a metabolikus X szindróma

következtében kialakuló endotéliális funkciókárosodás kialakulásában: a metabolikus X szindróma „egyesített elmélete PARP-szemszögből” Az emelkedett vércukorszint (Glu) az endotéliális transzporterén (Glut) keresztül akadálytalanul és inzulintól függetlenül áramlik az érbelhártya sejtjeibe. Ennek hatására a mitokondriumban az oxidatív szabadgyökök képződése emelkedik. Az angiotenzin II (Ang II) A1-receptorához kötődve az érbelhártya sejtjeiben a NADPH oxidázt aktiválja, ami fokozza a szuperoxid-termelést (O2-). Az oxidált B

PB

P

LDL (oxLDL), az emelkedett TNFα-szint, a szöveti hipoxia, illetve az ateroszklerotikus plakkok megjelenése szintén a NADPH oxidáz ROI-termelését fokozzák, ugyanakkor az eNOS-t is gátolják az NO, de serkentik az O2B

PB

P

termelésére. A képződő szuperoxid reakcióba lép a nitrogén-monoxiddal. A NO két forrásból származhat: vagy még az eNOS termeli, vagy inkább a gyulladásos reakciókat kísérő iNOS aktiváció az eredete. A reakcióban peroxinitrit képződik (ONOO-), amely a DNS-t károsítja, így a PARP 1 aktivációjához vezet. A PARP P

P

73

fokozott működése részben a NAD+ depléciójához (ezzel ATP és NADPH+szintek P

P

P

P

csökkenéséhez) vezet, részben előidézi a mitokondrium apoptózis indukáló faktor (AIF) leadását. A PARP túlműködése a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) gátlásával a diabéteszes szövődmények felé vezető anyagcsereútvonalakat is aktiválja. Az ábrán feltüntettem, hogy ezek a reakciók hogyan vezetnek önerősítő körök kialakulásához: az Ang II a gyulladási citokinek átírását, és ezzel az iNOS aktiválását segíti, az AGE-k az oxidatív stresszt növelik, míg maga a PARP aktivitása szintén a gyulladási citokinek termelését és a nitrózatív stresszt fokozza. A korosodással gyakran együtt járó endotéldiszfunkciót az antioxidáns rendszerek beszűkülésére illetve a glukóztolerancia csökkenésére vezethetjük vissza. A fenti ábrán egyszerre és kapcsolódási pontjuk feltüntetésével mutattam be a metabolikus X szindróma következtében kialakuló endotéliális funkciókárosodáshoz vezető folyamatokat – PARP-szemszögből. A glukóz az endotéliális transzporterén keresztül akadálytalanul és a keringő inzulin mennyiségétől függetlenül áramlik az endotélium sejtjeibe. Ennek hatására a mitokondriumban az oxidatív szabadgyökök képződése emelkedik. Az Ang II A1-receptorához kötődve az érbelhártya sejtjeiben a NADPH oxidázt aktiválja, ami fokozza a szuperoxid-termelést (O2-). Így mindkét P

P

folyamat a ROI termelést növeli, egymást erősítő folyamatokban. (Hiszen gyakran van jelen emelkedett Ang II-szint cukorbetegségben.) A másik oldalon az LDL, főként pedig az oxidált LDL (oxLDL), az ateroszklerózissal együtt járó emelkedett TNFα-szint és a szöveti hipoxia, illetve maguk az ateroszklerotikus plakkok megjelenése szintén a NADPH oxidáz ROI-termelését fokozzák, ugyanakkor az eNOS-t is gátolják a NO, de serkentik az O2- termelésére. A több forrásból származó szuperoxid reakcióba lép a P

P

nitrogén-monoxiddal. A NO két forrásból származhat: vagy még az eNOS termeli, vagy már inkább a gyulladásos reakciókat kísérő iNOS aktiváció az eredete. A reakcióban peroxinitrit képződik (ONOO-), amely a DNS-t károsítja, így a PARP 1 aktivációjához P

P

vezet. A PARP fokozott működése részben a NAD+ depléciójához (ezzel ATP és P

P

NADPH+szintek csökkenéséhez) vezet, részben előidézi a mitokondrium apoptózis P

P

indukáló faktor (AIF) leadását. A PARP túlműködése a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázt is poli (ADP-riboz)ilálja, ezzel gátolva a GAPDH működését. A GAPDH

74

inhibíciója a diabéteszes szövődmények felé vezető anyagcsere-útvonalakat is aktiválja. Az ábrán továbbá azt is feltüntettem, hogy ezek a reakciók hogyan vezetnek önerősítő körök kialakulásához: az Ang II a gyulladási citokinek átírását, és ezzel az iNOS aktiválását segíti, az AGE-k az oxidatív stresszt növelik, míg maga a PARP aktivitása szintén a gyulladási citokinek termelését és a nitrózatív stresszt fokozza. Ennek következtében mitokondriális károsodások és anyagcsere-útvonalak működési zavarai jelennek meg, energiahiánnyal küszködnek a károsult sejtek. Ezek a folyamatok együttesen funkcióromláshoz vezetnek, növekszik a pusztuló sejtek aránya, a kialakuló új

sejtrétegek

abnormális

rezisztenciát

mutatnak

a

redox

szabályozási

mechanizmusokkal szemben. A korosodással gyakran együtt járó endotéldiszfunkciót az antioxidáns rendszerek beszűkülésére, a glukóztolerancia csökkenésére, a Maillardreakciók termékeinek felgyülemlésére, az emelkedett szisztolés nyomásra, a baroreflex ezt követő szenzitivitás-csökkenésére és genetikailag programozott folyamatokra (például a kötőszöveti kollagén összetételének megváltozására) vezethetjük vissza.

75

KÖVETKEZTETÉS 1. A korosodó népességnél kimutatható az oxidatív/nitrózatív stressz fokozott hatása. Ezek a változások, részben legalábbis, visszavezethetőek az antioxidáns rendszerek csökkent aktivitására. A glukóztolerancia csökkenése is okozhatja a mitokondriumok ROS-termelésének fokozódását. Ezek a változások felelősek lehetnek a korosodással együtt megjelenő krónikus szív-érrendszeri betegségek és anyagcsere-zavarok kialakulásáért. A PARP gyógyszeres gátlása a kardiovaszkuláris rendszer öregedésének több szimptómáját kivédi. Ez részben a NAD+ és ATP készletek fenntartására vezethető vissza, részben az oxidatív és P

P

főleg nitrózatív stresszt csökkenti a PARP gátlása. 2. Diabéteszes állapotban a PARP aktivációja nemcsak megfigyelhető a kardiovaszkuláris rendszer szöveteiben, de részt is vesz a cukorbaj keringési szövődményeinek

kialakulásában.

A

diabéteszre

jellemző

bal

kamrai

nyomáscsökkenést, illetve az endotéldiszfunkciót a PARP gyógyszeres gátlása mérsékli. 3. A hiperlipidémiás, ateroszklerotikus vagy hipertenzív állatoknál megfigyeltük a reaktív szabadgyök-termelés növekedését, és a PARP-aktivitás fokozódását is. 4. A magas vérnyomás kezelése csökkentette a PARP aktivitását a kísérleti állatokban. 5. A PARP aktiváció farmakológiai gátlása javította a kardiovaszkuláris rendszer állapotát diabéteszes, hipertenzív és ateroszklerotikus modelljeinkben. Ez, akárcsak az öregedéssel együtt járó kórállapotokban, részben a NAD+ és ATP P

P

készletek fenntartására vezethető vissza, részben az oxidatív és főleg nitrózatív stresszt csökkenti a PARP gátlása. 6. Megfigyeléseink alapján, az irodalmi adatokkal egybevetve felállítható a metabolikus X szindróma egy „egyesített elmélete PARP-szemszögből”: a metabolikus X szindróma minden elemére jellemző fokozódó oxidatív stressz a jelenlevő NO. mellett nitrózatív stressz kialakulásához vezet. A nitrózatív stressz P

P

a PARP 1 aktivitását akár tízszeresére fokozhatja, ami önerősítő körök kialakulásához vezet. A gyulladási citokinek átírása felgyorsul, a ROI és RNI termelés fokozódik, a nem-enzimatikus redox folyamatok aránya növekedik.

76

Ennek következtében mitokondriális károsodások és anyagcsere-útvonalak működési zavarai jelennek meg, energiahiánnyal küszködnek a károsult sejtek. Ezek a folyamatok együttesen funkcióromláshoz vezetnek, növekszik a pusztuló sejtek aránya, a kialakuló új sejtrétegek abnormális rezisztenciát mutatnak a redox szabályozási mechanizmusokkal szemben.

77

ÖSSZEFOGLALÁS A reaktív oxigén- és nitrogéngyökök túltermelése összefüggést mutat a diabéteszes, ateroszklerotikus és hipertenzív kórképekben, illetve az öregedés során a szív és az érendotél károsodásával. Az oxidánsok kiváltotta sejtkárosodás működésbe hozza a sejtmagi poli (ADP-ribóz) polimerázt (PARP), amely enzim túlzott aktivációja hozzájárul

az

érendotél

károsodásához

és

különböző

szívműködési

zavarok

kialakulásához a fent felsorolt patológiás folyamatokban. Korábbi tanulmányokban bizonyítást nyert, hogy a cukorbeteg állatok és emberek szívizomszövetében és érfalában a poli (ADP-ribozil)ált (PAR-ált) fehérjék mennyisége emelkedett, és hasonló eredményt mutatott a Leprdb/db egerek veséjéből nyert szövettani minta is. Ebből az emelkedett szöveti PAR-áltságból a kutatók megnövekedett PAPR aktivitásra következtettek. A bemutatásra kerülő vizsgálatok célja annak felderítése volt, hogy -

Milyen hatással van egy új PARP-gátló farmakon, az INO-1001 előrehaladott öregedés során a szívre és az érbelhártya funkcionális állapotára;

-

Leprdb/db egereken meghatározzuk az INO-1001 hatását a kettes típusú diabétesz mellituszban kialakuló endoteliális diszfunkcióra;

-

Milyen mértékben járul hozzá a PARP aktivációja a korai ateroszklerózisban megjelenő endoteliális diszfunkció kialakulásához apolipoprotein E deficiens egér modellben;

-

Miután a citotoxikus peroxinitrit, mint erősen reaktív nitrogén species, a PARP aktivációját kiváltja, ezért a következő tanulmányunk célja annak meghatározása volt, hogy a peroxinitrit farmakológiai semlegesítése befolyásolja-e angioplasztikát követően a neointima képződést és az érbelhártya funkcionális sérülését patkány modellben;

-

A PARP aktivációja része-e az angiotenzin II kiváltotta azon reakcióknak, amelyek az endotél diszfunkciójához vezetnek.

Vizsgáltuk a korosodás, a diabéteszes komplikációk, az ateroszklerózis és a hipertenzió közötti kapcsolatokat a reaktív specieszek termelődésének és a PARP aktivációnak a szintjén, különböző állat modellek felhasználásával. Azt tapasztaltuk, hogy a PARP farmakológiai gátlása protektívnek bizonyult ezekben a kórképekben a szív és az érrendszer általunk vizsgált károsodásaival szemben.

78

SUMMARY Increased production of reactive oxygen and nitrogen species has recently been implicated in the pathogenesis of cardiac and endothelial dysfunction associated with atherosclerosis, hypertension, and aging. Oxidant-induced cell injury triggers the activation of nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). Oxidant-mediated activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) plays a role in the development of endothelial dysfunction and the pathogenesis of various cardiovascular diseases, including diabetes, reperfusion injury, circulatory shock, and aging. Earlier studies found increased amounts of poly(ADP) ribosylated proteins in diabetic heart, vessels in both human and animal samples, and also in kidneys of Leprdb/db(BKsJ) mice, suggesting increased PARP activity. The aim of the present studies were to investigate -

the effect of a new PARP inhibitor, INO-1001, on cardiac and endothelial dysfunction associated with advanced aging using Millar’s new Aria pressurevolume conductance system and isolated aortic rings;

-

the effects of INO1001 on the development of diabetic endothelial dysfunction of Leprdb/db(BKsJ) mice, an experimental model of type 2 diabetes;

-

whether the activation of PARP contributes to the development of endothelial dysfunction in the apolipoprotein E (ApoE) deficient mice;

-

as peroxynitrite is a potent cytotoxic oxidant produced from nitric oxide (NO) and superoxide anion during conditions of oxidative stress, and it leads to PARP activation, the purpose of our next study was to determine the effects of a peroxynitrite decomposition catalyst (WW85) on the endothelial dysfunction and neointima formation in a rat model of carotid artery injury;

-

whether activation of the nuclear enzyme PARP contributes to the development of angiotensin II-induced endothelial dysfunction.

In these studies, certain links were investigated between ageing, diabetic complications, atherosclerosis, hypertension on the level of reactive species formation and PARP activation using animal models. We observed that pharmacological inhibition of PARP protected the cardiovascular system in these pathological states.

79

IRODALOMJEGYZÉK FELHASZNÁLT IRODALOM: Kézikönyvek: Gergely János – Erdei Anna: Immunbiológia Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 1998. Folyóiratok: Adamietz P (1987) Poly(ADP-ribose) synthase is the major endogenous nonhistone acceptor for poly(ADP-ribose) in alkylated rat hepatoma cells. Eur J Biochem 169:365-372. Anversa P, Puntillo E, Nikitin P, Olivetti G, Capasso JM and Sonnenblick EH (1989) Effects of age on mechanical and structural properties of myocardium of Fischer 344 rats. Am J Physiol 256:H1440-1449. Asaba K, Tojo A, Onozato ML, Goto A, Quinn MT, Fujita T and Wilcox CS (2005) Effects of NADPH oxidase inhibitor in diabetic nephropathy. Kidney Int 67:1890-1898. Aviv A (1988) The link between cytosolic Ca2+ and the Na+-H+ antiport: a unifying factor for essential hypertension. J Hypertens 6:685-691. Aviv A and Livne A (1988) The Na+/H+ antiport, cytosolic free Ca2+, and essential hypertension: a hypothesis. Am J Hypertens 1:410-413. Azevedo LC, Pedro MA, Souza LC, de Souza HP, Janiszewski M, da Luz PL and Laurindo FR (2000) Oxidative stress as a signaling mechanism of the vascular response to injury: the redox hypothesis of restenosis. Cardiovasc Res 47:436445. Basta G, Schmidt AM, De Caterina R. (2004) Advanced glycation end products and vascular inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes. Cardiovasc Res. 63: 582-92. Basu R, Breda E, Oberg AL, Powell CC, Dalla Man C, Basu A, Vittone JL, Klee GG, Arora P, Jensen MD, Toffolo G, Cobelli C and Rizza RA (2003) Mechanisms of the age-associated deterioration in glucose tolerance: contribution of alterations in insulin secretion, action, and clearance. Diabetes 52:1738-1748. Bauer PI, Farkas G, Buday L, Mikala G, Meszaros G, Kun E and Farago A (1992) Inhibition of DNA binding by the phosphorylation of poly ADP-ribose

80

polymerase protein catalysed by protein kinase C. Biochem Biophys Res Commun 187:730-736. Baynes JW (2000) From life to death--the struggle between chemistry and biology during aging: the Maillard reaction as an amplifier of genomic damage. Biogerontology 1:235-246. Bejma J, Ramires P and Ji LL (2000) Free radical generation and oxidative stress with ageing and exercise: differential effects in the myocardium and liver. Acta Physiol Scand 169:343-351. Bergeron MJ, Leclerc S, Laniel MA, Poirier GG and Guerin SL (1997) Transcriptional regulation of the rat poly(ADP-ribose) polymerase gene by Sp1. Eur J Biochem 250:342-353. Berk BC and Corson MA (1997) Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res 80:607-616. Blumenthal HT and Berns AW (1964) Autoimmunity And Aging. Adv Gerontol Res 18:289-342. Boluyt MO, Converso K, Hwang HS, Mikkor A and Russell MW (2004) Echocardiographic assessment of age-associated changes in systolic and diastolic function of the female F344 rat heart. J Appl Physiol 96:822-828. Brilla CG, Zhou G, Matsubara L and Weber KT (1994) Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol 26:809-820. Brochu G, Duchaine C, Thibeault L, Lagueux J, Shah GM and Poirier GG (1994) Mode of action of poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Biochim Biophys Acta 1219:342350. Brown NJ, Kumar S, Painter CA and Vaughan DE (2002) ACE inhibition versus angiotensin type 1 receptor antagonism: differential effects on PAI-1 over time. Hypertension 40:859-865. Brownlee M (2001) Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820. Burkart V, Wang ZQ, Radons J, Heller B, Herceg Z, Stingl L, Wagner EF and Kolb H (1999) Mice lacking the poly(ADP-ribose) polymerase gene are resistant to

81

pancreatic beta-cell destruction and diabetes development induced by streptozocin. Nat Med 5:314-319. Burkle A (2001a) PARP 1: a regulator of genomic stability linked with mammalian longevity. Chembiochem 2:725-728. Burkle A (2001b) Physiology and pathophysiology of poly(ADP-ribosyl)ation. Bioessays 23:795-806. Burkle A, Grube K and Kupper JH (1992) Poly(ADP-ribosyl)ation: its role in inducible DNA amplification, and its correlation with the longevity of mammalian species. Exp Clin Immunogenet 9:230-240. Candido R, Srivastava P, Cooper ME, Burrell LM. (2003) Diabetes mellitus: a cardiovascular disease. Curr Opin Investig Drugs. 4: 1088-94. Capasso JM, Palackal T, Olivetti G and Anversa P (1990) Severe myocardial dysfunction induced by ventricular remodeling in aging rat hearts. Am J Physiol 259:H1086-1096. Chen J, Kuhlencordt P, Urano F, Ichinose H, Astern J and Huang PL (2003) Effects of chronic treatment with L-arginine on atherosclerosis in apoE knockout and apoE/inducible NO synthase double-knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:97-103. Choi H, Leto TL, Hunyady L, Catt KJ, Bae YS and Rhee SG (2008) Mechanism of angiotensin II-induced superoxide production in cells reconstituted with angiotensin type 1 receptor and the components of NADPH oxidase. J Biol Chem 283:255-267. Cohen-Armon M, Visochek L, Katzoff A, Levitan D, Susswein AJ, Klein R, Valbrun M and Schwartz JH (2004) Long-term memory requires polyADP-ribosylation. Science 304:1820-1822. Cooke CL and Davidge ST (2002) Peroxynitrite increases iNOS through NF-kappaB and decreases prostacyclin synthase in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 282:C395-402. Costanzo A, Moretti F, Burgio VL, Bravi C, Guido F, Levrero M and Puri PL (2003) Endothelial activation by angiotensin II through NFkappaB and p38 pathways: Involvement of NFkappaB-inducible kinase (NIK), free oxygen radicals, and selective inhibition by aspirin. J Cell Physiol 195:402-410.

82

Cottet F, Blanche H, Verasdonck P, Le Gall I, Schachter F, Burkle A and Muiras ML (2000) New polymorphisms in the human poly(ADP-ribose) polymerase-1 coding sequence: lack of association with longevity or with increased cellular poly(ADP-ribosyl)ation capacity. J Mol Med 78:431-440. Cuzzocrea S, Zingarelli B, Costantino G, Szabó A, Salzman AL, Caputi AP and Szabó C (1997) Beneficial effects of 3-aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADPribose) synthetase in a rat model of splanchnic artery occlusion and reperfusion. Br J Pharmacol 121:1065-1074. Csiszár A, Pacher P, Kaley G and Ungvári Z (2005) Role of oxidative and nitrosative stress, longevity genes and poly(ADP-ribose) polymerase in cardiovascular dysfunction associated with aging. Curr Vasc Pharmacol 3:285-291. Csiszár A, Ungvári Z, Edwards JG, Kaminski P, Wolin MS, Koller A and Kaley G (2002) Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circ Res 90:1159-1166. d'Uscio LV, Smith LA and Katusic ZS (2001) Hypercholesterolemia impairs endothelium-dependent relaxations in common carotid arteries of apolipoprotein e-deficient mice. Stroke 32:2658-2664. Daugherty A (2002) Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci 323:3-10. Davidovic L, Vodenicharov M, Affar EB and Poirier GG (2001) Importance of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the control of poly(ADP-ribose) metabolism. Exp Cell Res 268:7-13. Doucet-Chabeaud G, Godon C, Brutesco C, de Murcia G and Kazmaier M (2001) Ionising radiation induces the expression of PARP 1 and PARP 2 genes in Arabidopsis. Mol Genet Genomics 265:954-963. Dourron HM, Jacobson GM, Park JL, Liu J, Reddy DJ, Scheel ML and Pagano PJ (2005) Perivascular gene transfer of NADPH oxidase inhibitor suppresses angioplasty-induced neointimal proliferation of rat carotid artery. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288:H946-953. Drexler H and Hornig B (1999) Endothelial dysfunction in human disease. J Mol Cell Cardiol 31:51-60. Du X, Matsumura T, Edelstein D, Rossetti L, Zsengellér Z, Szabó C and Brownlee M (2003) Inhibition of GAPDH activity by poly(ADP-ribose) polymerase activates

83

three major pathways of hyperglycemic damage in endothelial cells. J Clin Invest 112:1049-1057. Durand E, Al Haj Zen A, Addad F, Brasselet C, Caligiuri G, Vinchon F, Lemarchand P, Desnos M, Bruneval P and Lafont A (2005) Adenovirus-mediated gene transfer of superoxide dismutase and catalase decreases restenosis after balloon angioplasty. J Vasc Res 42:255-265. Edwards TM and Rickard NS (2002) Inhibition of monoADP-ribosylation prevents long-term memory consolidation of a single-trial passive avoidance task in the day-old chick. Neurobiol Learn Mem 78:192-198. Ferrannini E, Haffner SM, Stern MP, Mitchell BD, Natali A, Hazuda HP and Patterson JK (1991) High blood pressure and insulin resistance: influence of ethnic background. Eur J Clin Invest 21:280-287. Fleming I and Busse R (2003) Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284:R1-12. Freeman RH, Davis JO, Aharon NV, Ulick S and Weinberger MH (1975) Control of aldosterone secretion in the spontaneously hypertensive rat. Circ Res 37:66-71. Garcia Soriano F, Virág L, Jagtap P, Szabó E, Mabley JG, Liaudet L, Márton A, Hoyt DG, Murthy KG, Salzman AL, Southan GJ and Szabó C (2001) Diabetic endothelial dysfunction: the role of poly(ADP-ribose) polymerase activation. Nat Med 7:108-113. Gervais M, Pons S, Nicoletti A, Cosson C, Giudicelli JF and Richer C (2003) Fluvastatin prevents renal dysfunction and vascular NO deficit in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:183-189. Gilbert RE, Krum H, Wilkinson-Berka J and Kelly DJ (2003) The renin-angiotensin system and the long-term complications of diabetes: pathophysiological and therapeutic considerations. Diabet Med 20:607-621. Go YM, Patel RP, Maland MC, Park H, Beckman JS, Darley-Usmar VM and Jo H (1999) Evidence for peroxynitrite as a signaling molecule in flow-dependent activation of c-Jun NH(2)-terminal kinase. Am J Physiol 277:H1647-1653.

84

Godecke A, Ziegler M, Ding Z and Schrader J (2002) Endothelial dysfunction of coronary resistance vessels in apoE-/- mice involves NO but not prostacyclindependent mechanisms. Cardiovasc Res 53:253-262. Goldstein DS, Lake CR, Chernow B, Ziegler MG, Coleman MD, Taylor AA, Mitchell JR, Kopin IJ and Keiser HR (1983) Age-dependence of hypertensivenormotensive differences in plasma norepinephrine. Hypertension 5:100-104. Golino P, Ambrosio G, Ragni M, Cirillo P, Esposito N, Willerson JT, Rothlein R, Petrucci L, Condorelli M, Chiariello M and Buja LM (1997) Inhibition of leucocyte and platelet adhesion reduces neointimal hyperplasia after arterial injury. Thromb Haemost 77:783-788. Goto K, Fujii K, Onaka U, Abe I and Fujishima M (2000) Renin-angiotensin system blockade improves endothelial dysfunction in hypertension. Hypertension 36:575-580. Haines ME, Johnston IR, Mathias AP and Ridge D (1969a) The metabolism of nicotinamide-adenine dinucleotide in various classes of rat liver nuclei. Biochem J 115:56P. Haines ME, Johnston IR, Mathias AP and Ridge D (1969b) The synthesis of nicotinamide-adenine dinucleotide and poly (adenosine diphosphate ribose) in various classes of rat liver nuclei. Biochem J 115:881-887. Hamilton ML, Van Remmen H, Drake JA, Yang H, Guo ZM, Kewitt K, Walter CA and Richardson A (2001) Does oxidative damage to DNA increase with age? Proc Natl Acad Sci U S A 98:10469-10474. Hassa PO and Hottiger MO (2002) The functional role of poly(ADP-ribose)polymerase 1 as novel coactivator of NF-kappaB in inflammatory disorders. Cell Mol Life Sci 59:1534-1553. Hatake K, Kakishita E, Wakabayashi I, Sakiyama N and Hishida S (1990) Effect of aging on endothelium-dependent vascular relaxation of isolated human basilar artery to thrombin and bradykinin. Stroke 21:1039-1043. Hatakeyama K, Nemoto Y, Ueda K and Hayaishi O (1986) Purification and characterization of poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Different modes of action on large and small poly(ADP-ribose). J Biol Chem 261:14902-14911.

85

Hattori Y, Kasai K and Gross SS (2004) NO suppresses while peroxynitrite sustains NF-kappaB: a paradigm to rationalize cytoprotective and cytotoxic actions attributed to NO. Cardiovasc Res 63:31-40. Higashi Y, Oshima T, Ozono R, Matsuura H and Kajiyama G (1997) Aging and severity of hypertension attenuate endothelium-dependent renal vascular relaxation in humans. Hypertension 30:252-258. Hilz H and Kittler M (1971) Lack of correlation between poly ADP-ribose formation and DNA synthesis. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 352:1693-1704. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE and Chaudhuri G (1987) Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A 84:9265-9269. Inoue M and Inoue K (1996) Role of free radicals in and around vascular endothelial cells in the mechanism of aging. Ann N Y Acad Sci 786:224-232. Jagadeesha DK, Lindley TE, Deleon J, Sharma RV, Miller F and Bhalla RC (2005) Tempol therapy attenuates medial smooth muscle cell apoptosis and neointima formation after balloon catheter injury in carotid artery of diabetic rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289:H1047-1053. Jagtap P and Szabó C (2005) Poly(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. Nat Rev Drug Discov 4:421-440. Jenner TL, Mellick AS, Harrison GJ, Griffiths LR and Rose'Meyer RB (2004) Agerelated changes in cardiac adenosine receptor expression. Mech Ageing Dev 125:211-217. Ji Y, Huang Y, Han Y, Xu Y and Ferro A (2003) Cardiac effects of amiloride and of enalapril in the spontaneously hypertensive rat. J Hypertens 21:1583-1589. Jiang F, Guo Y, Salvemini D and Dusting GJ (2003a) Superoxide dismutase mimetic M40403 improves endothelial function in apolipoprotein(E)-deficient mice. Br J Pharmacol 139:1127-1134. Jiang F, Jones GT, Husband AJ and Dusting GJ (2003b) Cardiovascular protective effects of synthetic isoflavone derivatives in apolipoprotein e-deficient mice. J Vasc Res 40:276-284.

86

Johansson M (1999) A human poly(ADP-ribose) polymerase gene family (ADPRTL): cDNA cloning of two novel poly(ADP-ribose) polymerase homologues. Genomics 57:442-445. Johnson PR, Zucker LM, Cruce JA and Hirsch J (1971) Cellularity of adipose depots in the genetically obese Zucker rat. J Lipid Res 12:706-714. Jolly CA (2004) Dietary restriction and immune function. J Nutr 134:1853-1856. Jonsson GG, Jacobson EL and Jacobson MK (1988a) Mechanism of alteration of poly(adenosine diphosphate-ribose) metabolism by hyperthermia. Cancer Res 48:4233-4239. Jonsson GG, Menard L, Jacobson EL, Poirier GG and Jacobson MK (1988b) Effect of hyperthermia on poly(adenosine diphosphate-ribose) glycohydrolase. Cancer Res 48:4240-4243. Kameshita I, Matsuda Z, Taniguchi T and Shizuta Y (1984) Poly (ADP-Ribose) synthetase. Separation and identification of three proteolytic fragments as the substrate-binding domain, the DNA-binding domain, and the automodification domain. J Biol Chem 259:4770-4776. Kass DA, Maughan WL, Guo ZM, Kono A, Sunagawa K and Sagawa K (1987) Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation 76:1422-1436. Kawaichi M, Ueda K and Hayaishi O (1981) Multiple autopoly(ADP-ribosyl)ation of rat liver poly(ADP-ribose) synthetase. Mode of modification and properties of automodified synthetase. J Biol Chem 256:9483-9489. Kayo T, Allison DB, Weindruch R and Prolla TA (2001) Influences of aging and caloric restriction on the transcriptional profile of skeletal muscle from rhesus monkeys. Proc Natl Acad Sci U S A 98:5093-5098. Kennedy S, Preston AA, McPhaden AR, Miller AM, Wainwright CL and Wadsworth RM (2004) Correlation of changes in nitric oxide synthase, superoxide dismutase and nitrotyrosine with endothelial regeneration and neointimal hyperplasia in the balloon-injured rabbit subclavian artery. Coron Artery Dis 15:337-346.

87

Khan TA, Ruel M, Bianchi C, Voisine P, Komjáti K, Szabó C and Sellke FW (2003) Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves postischemic myocardial function after cardioplegia-cardiopulmonary bypass. J Am Coll Surg 197:270277. Knowles JW, Reddick RL, Jennette JC, Shesely EG, Smithies O and Maeda N (2000) Enhanced atherosclerosis and kidney dysfunction in eNOS(-/-)Apoe(-/-) mice are ameliorated by enalapril treatment. J Clin Invest 105:451-458. Kritchevsky D, Scott DA and Malhotra S (1980) Cholesterol synthesis in tissues of young and old Fisher 344 and Sprague-Dawley rats. Experimental Gerontology 15:369. Kriz W, Gretz N and Lemley KV (1998) Progression of glomerular diseases: is the podocyte the culprit? Kidney Int 54:687-697. Kujoth GC, Leeuwenburgh C and Prolla TA (2006) Mitochondrial DNA mutations and apoptosis in mammalian aging. Cancer Res 66:7386-7389. Kun E, Kirsten E, Mendeleyev J and Ordahl CP (2004) Regulation of the enzymatic catalysis of poly(ADP-ribose) polymerase by dsDNA, polyamines, Mg2+, Ca2+, histones H1 and H3, and ATP. Biochemistry 43:210-216. Lakatta EG (2003) Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part III: cellular and molecular clues to heart and arterial aging. Circulation 107:490-497. Landmesser U, Cai H, Dikalov S, McCann L, Hwang J, Jo H, Holland SM and Harrison DG (2002) Role of p47(phox) in vascular oxidative stress and hypertension caused by angiotensin II. Hypertension 40:511-515. Laukkanen MO, Kivela A, Rissanen T, Rutanen J, Karkkainen MK, Leppanen O, Brasen JH and Yla-Herttuala S (2002) Adenovirus-mediated extracellular superoxide dismutase gene therapy reduces neointima formation in balloondenuded rabbit aorta. Circulation 106:1999-2003. Laursen JB, Rajagopalan S, Galis Z, Tarpey M, Freeman BA and Harrison DG (1997) Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension. Circulation 95:588-593. Laursen JB, Somers M, Kurz S, McCann L, Warnholtz A, Freeman BA, Tarpey M, Fukai T and Harrison DG (2001) Endothelial regulation of vasomotion in apoE-

88

deficient mice: implications for interactions between peroxynitrite and tetrahydrobiopterin. Circulation 103:1282-1288. Lehmann AR and Shall S (1972) No inhibition of endogenous DNA polymerase by synthesis of poly (ADP-ribose) in nuclei from lymphoid cells. FEBS Lett 26:181-184. Leung JK and Pereira-Smith OM (2001) Identification of genes involved in cell senescence and immortalization: potential implications for tissue ageing. Novartis Found Symp 235:105-110; discussion 110-105; 146-109. Little WC (1985) The left ventricular dP/dtmax-end-diastolic volume relation in closedchest dogs. Circ Res 56:808-815. Mabley JG, Horváth EM, Murthy KG, Zsengellér Z, Vaslin A, Benkő R, Kollai M and Szabó C (2005) Gender differences in the endotoxin-induced inflammatory and vascular responses: potential role of poly(ADP-ribose) polymerase activation. J Pharmacol Exp Ther 315:812-820. Mabley JG, Wallace R, Pacher P, Murphy K and Szabó C (2007) Inhibition of poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase by the active form of vitamin D. Int J Mol Med 19:947-952. Martin GM (1980) Genotropic theories of aging: an overview. Adv Pathobiol 7:5-20. Martinet W, Knaapen MW, De Meyer GR, Herman AG and Kockx MM (2001) Oxidative DNA damage and repair in experimental atherosclerosis are reversed by dietary lipid lowering. Circ Res 88:733-739. Martinet W, Knaapen MW, De Meyer GR, Herman AG and Kockx MM (2002) Elevated levels of oxidative DNA damage and DNA repair enzymes in human atherosclerotic plaques. Circulation 106:927-932. Matsumoto T, D'Uscio L V, Eguchi D, Akiyama M, Smith LA and Katusic ZS (2003) Protective effect of chronic vitamin C treatment on endothelial function of apolipoprotein E-deficient mouse carotid artery. J Pharmacol Exp Ther 306:103-108. Mazen A, Menissier-de Murcia J, Molinete M, Simonin F, Gradwohl G, Poirier G and de Murcia G (1989) Poly(ADP-ribose)polymerase: a novel finger protein. Nucleic Acids Res 17:4689-4698.

89

Meir KS and Leitersdorf E (2004) Atherosclerosis in the apolipoprotein-E-deficient mouse: a decade of progress. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24:1006-1014. Meyer TW, Bennett PH and Nelson RG (1999) Podocyte number predicts long-term urinary albumin excretion in Pima Indians with Type II diabetes and microalbuminuria. Diabetologia 42:1341-1344. Minokoshi Y, Kim YB, Peroni OD, Fryer LG, Muller C, Carling D and Kahn BB (2002) Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nature 415:339-343. Miyakawa N, Ueda K and Hayaishi O (1972) Association of poly ADP-ribose glycohydrolase with liver chromatin. Biochem Biophys Res Commun 49:239245. Murakami K, Enkhbaatar P, Shimoda K, Cox RA, Burke AS, Hawkins HK, Traber LD, Schmalstieg FC, Salzman AL, Mabley JG, Komjáti K, Pacher P, Zsengellér Z, Szabó C and Traber DL (2004) Inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase attenuates acute lung injury in an ovine model of sepsis. Shock 21:126-133. Murthy KG, Xiao CY, Mabley JG, Chen M and Szabó C (2004) Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in circulating leukocytes during myocardial infarction. Shock 21:230-234. Muscoli C, Sacco I, Alecce W, Palma E, Nistico R, Costa N, Clementi F, Rotiroti D, Romeo F, Salvemini D, Mehta JL and Mollace V (2004) The protective effect of superoxide dismutase mimetic M40401 on balloon injury-related neointima formation: role of the lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1. J Pharmacol Exp Ther 311:44-50. Muzumdar R, Ma X, Atzmon G, Vuguin P, Yang X and Barzilai N (2004) Decrease in glucose-stimulated insulin secretion with aging is independent of insulin action. Diabetes 53:441-446. Muzumdar R. MX, Atzmon G., Vuguin P., Yang X., Barzilai N. (2004) Decrease in glucose-stimulated insulin secretion with aging is independent of insulin action. Diabetes:441-446. Nakano K, Sugawara M, Ishihara K, Kanazawa S, Corin WJ, Denslow S, Biederman RW and Carabello BA (1990) Myocardial stiffness derived from end-systolic

90

wall stress and logarithm of reciprocal of wall thickness. Contractility index independent of ventricular size. Circulation 82:1352-1361. Nakazawa H, Fukuyama N, Takizawa S, Tsuji C, Yoshitake M and Ishida H (2000) Nitrotyrosine formation and its role in various pathological conditions. Free Radic Res 33:771-784. Navarro A, Gomez C, Lopez-Cepero JM and Boveris A (2004) Beneficial effects of moderate exercise on mice aging: survival, behavior, oxidative stress, and mitochondrial electron transfer. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286:R505-511. Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, Yamagishi S, Matsumura T, Kaneda Y, Yorek MA, Beebe D, Oates PJ, Hammes HP, Giardino I and Brownlee M (2000) Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature 404:787-790. Nishikimi M, Ogasawara K, Kameshita I, Taniguchi T and Shizuta Y (1982) Poly(ADPribose) synthetase. The DNA binding domain and the automodification domain. J Biol Chem 257:6102-6105. Ogata N, Ueda K, Kawaichi M and Hayaishi O (1981) Poly(ADP-ribose) synthetase, a main acceptor of poly(ADP-ribose) in isolated nuclei. J Biol Chem 256:41354137. Oka J, Ueda K, Hayaishi O, Komura H and Nakanishi K (1984) ADP-ribosyl protein lyase. Purification, properties, and identification of the product. J Biol Chem 259:986-995. Okamoto K (1969) Spontaneous hypertension in rats. Int Rev Exp Pathol 7:227-270. Pacher P, Cziráki A, Mabley JG, Liaudet L, Papp L and Szabó C (2002a) Role of poly(ADP-ribose) polymerase activation in endotoxin-induced cardiac collapse in rodents. Biochem Pharmacol 64:1785-1791. Pacher P, Liaudet L, Bai P, Mabley JG, Kaminski PM, Virág L, Deb A, Szabó E, Ungvári Z, Wolin MS, Groves JT and Szabó C (2003) Potent metalloporphyrin peroxynitrite decomposition catalyst protects against the development of doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Circulation 107:896-904. Pacher P, Liaudet L, Mabley J, Komjáti K and Szabó C (2002b) Pharmacologic inhibition of poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase may represent a

91

novel therapeutic approach in chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 40:10061016. Pacher P, Liaudet L, Soriano FG, Mabley JG, Szabó E and Szabó C (2002c) The role of poly(ADP-ribose) polymerase activation in the development of myocardial and endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes 51:514-521. Pacher P, Mabley JG, Soriano FG, Liaudet L, Komjáti K and Szabó C (2002d) Endothelial dysfunction in aging animals: the role of poly(ADP-ribose) polymerase activation. Br J Pharmacol 135:1347-1350. Pacher P, Mabley JG, Soriano FG, Liaudet L and Szabó C (2002e) Activation of poly(ADP-ribose) polymerase contributes to the endothelial dysfunction associated with hypertension and aging. Int J Mol Med 9:659-664. Pavenstadt H, Kriz W and Kretzler M (2003) Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev 83:253-307. Pedersen SB, Lund S, Buhl ES and Richelsen B (2001) Insulin and contraction directly stimulate UCP2 and UCP3 mRNA expression in rat skeletal muscle in vitro. Biochem Biophys Res Commun 283:19-25. Pieper GM, Nilakantan V, Chen M, Zhou J, Khanna AK, Henderson JD, Jr., Johnson CP, Roza AM and Szabó C (2005) Protective mechanisms of a metalloporphyrinic peroxynitrite decomposition catalyst, WW85, in rat cardiac transplants. J Pharmacol Exp Ther 314:53-60. Raasch W, Bartels T, Schwartz C, Hauser W, Rutten H and Dominiak P (2002) Regression of ventricular and vascular hypertrophy: are there differences between structurally different angiotensin-converting enzyme inhibitors? J Hypertens 20:2495-2504. Rodriguez-Martinez MA, Alonso MJ, Redondo J, Salaices M and Marin J (1998) Role of lipid peroxidation and the glutathione-dependent antioxidant system in the impairment of endothelium-dependent relaxations with age. Br J Pharmacol 123:113-121. Rouleau M, Aubin RA and Poirier GG (2004) Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. J Cell Sci 117:815-825. Rueckschloss U, Duerrschmidt N and Morawietz H (2003) NADPH oxidase in endothelial cells: impact on atherosclerosis. Antioxid Redox Signal 5:171-180.

92

Salvemini D, Wang ZQ, Stern MK, Currie MG and Misko TP (1998) Peroxynitrite decomposition catalysts: therapeutics for peroxynitrite-mediated pathology. Proc Natl Acad Sci U S A 95:2659-2663. Sandler S and Andersson A (1988) Stimulation of cell replication in transplanted pancreatic islets by nicotinamide treatment. Transplantation 46:30-31. Schreiber V, Dantzer F, Ame JC and de Murcia G (2006) Poly(ADP-ribose): novel functions for an old molecule. Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528. Shimoda K, Murakami K, Enkhbaatar P, Traber LD, Cox RA, Hawkins HK, Schmalstieg FC, Komjáti K, Mabley JG, Szabó C, Salzman AL and Traber DL (2003) Effect of poly(ADP ribose) synthetase inhibition on burn and smoke inhalation injury in sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285:L240-249. Shizuta Y, Kameshita I, Ushiro H, Matsuda M, Suzuki S, Mitsuuchi Y, Yokoyama Y and Kurosaki T (1986) The domain structure and the function of poly(ADPribose) synthetase. Adv Enzyme Regul 25:377-384. Silacci P, Desgeorges A, Mazzolai L, Chambaz C and Hayoz D (2001) Flow pulsatility is a critical determinant of oxidative stress in endothelial cells. Hypertension 38:1162-1166. Sims JL, Berger SJ and Berger NA (1981) Effects of nicotinamide on NAD and poly(ADP-ribose) metabolism in DNA-damaged human lymphocytes. J Supramol Struct Cell Biochem 16:281-288. Singh BM and Mehta JL (2003) Interactions between the renin-angiotensin system and dyslipidemia: relevance in the therapy of hypertension and coronary heart disease. Arch Intern Med 163:1296-1304. Smith JA and Stocken LA (1973) Identification of poly (ADP-ribose) covalently bound to histone F1 in vivo. Biochem Biophys Res Commun 54:297-300. Smith JR and Pereira-Smith OM (1989a) Altered gene expression during cellular aging. Genome 31:386-389. Smith JR and Pereira-Smith OM (1989b) Further studies on the genetic and biochemical basis of cellular senescence. Exp Gerontol 24:377-381. Sohn HY, Krotz F, Zahler S, Gloe T, Keller M, Theisen K, Schiele TM, Klauss V and Pohl U (2003) Crucial role of local peroxynitrite formation in neutrophilinduced endothelial cell activation. Cardiovasc Res 57:804-815.

93

Soriano FG, Pacher P, Mabley J, Liaudet L and Szabó C (2001) Rapid reversal of the diabetic endothelial dysfunction by pharmacological inhibition of poly(ADPribose) polymerase. Circ Res 89:684-691. Srivastava VK, Miller SD and Busbee DL (1999) Aging and DNA polymerase alpha: modulation by dietary restriction. J Nutr Health Aging 3:111-120. Stern J, Johnson PR, Greenwood MR, Zucker LM and Hirsch J (1972) Insulin resistance and pancreatic insulin release in the genetically obese Zucker rat. Proc Soc Exp Biol Med 139:66-69. Stocker R and Keaney JF, Jr. (2004) Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev 84:1381-1478. Story JA, Tepper SA and Kritchevsky D (1976) Age-related changes in the lipid metabolism of Fisher 344 rats. Lipids 11:623-627. Sugimura T and Shimizu Y (1968) [Formation of poly ADP-ribose from NAD by nuclear enzyme preparations]. Seikagaku 40:137-153. Suh JH, Shigeno ET, Morrow JD, Cox B, Rocha AE, Frei B and Hagen TM (2001) Oxidative stress in the aging rat heart is reversed by dietary supplementation with (R)-(alpha)-lipoic acid. Faseb J 15:700-706. Susztak K, Raff AC, Schiffer M and Bottinger EP (2006) Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy. Diabetes 55:225-233. Swislocki A and Tsuzuki A (1993) Insulin resistance and hypertension: glucose intolerance, hyperinsulinemia, and elevated free fatty acids in the lean spontaneously hypertensive rat. Am J Med Sci 306:282-286. Szabó C, Cuzzocrea S, Zingarelli B, O'Connor M and Salzman AL (1997) Endothelial dysfunction in a rat model of endotoxic shock. Importance of the activation of poly (ADP-ribose) synthetase by peroxynitrite. J Clin Invest 100:723-735. Szabó C and Dawson VL (1998) Role of poly(ADP-ribose) synthetase in inflammation and ischaemia-reperfusion. Trends Pharmacol Sci 19:287-298. Szabó C, Mabley JG, Moeller SM, Shimanovich R, Pacher P, Virág L, Soriano FG, Van Duzer JH, Williams W, Salzman AL and Groves JT (2002a) Part I: pathogenetic role of peroxynitrite in the development of diabetes and diabetic vascular

94

complications: studies with FP15, a novel potent peroxynitrite decomposition catalyst. Mol Med 8:571-580. Szabó C, Pacher P and Swanson RA (2006) Novel modulators of poly(ADP-ribose) polymerase. Trends Pharmacol Sci 27:626-630. Szabó C, Pacher, P., Komjáti, K., Mabley, JG., Benkő, R., Kollai, M. (2003) Poly(ADPribose) polymerase (PARP) activation is an early event in angiotensin-induced cardiovascular disorder. FASEB Journal 17 (1). Szabó C, Zanchi A, Komjáti K, Pacher P, Krolewski AS, Quist WC, LoGerfo FW, Horton ES and Veves A (2002b) Poly(ADP-Ribose) polymerase is activated in subjects at risk of developing type 2 diabetes and is associated with impaired vascular reactivity. Circulation 106:2680-2686. Szabó G, Buhmann V, Andrasi T, Stumpf N, Bahrle S, Kékesi V, Hagl S, Szabó C and Juhász-Nagy A (2003) Poly-ADP-ribose polymerase inhibition protects against myocardial and endothelial reperfusion injury after hypothermic cardiac arrest. J Thorac Cardiovasc Surg 126:651-658. Szabó G, Soós P, Mandera S, Heger U, Flechtenmacher C, Bahrle S, Seres L, Cziráki A, Gries A, Zsengellér Z, Vahl CF, Hagl S and Szabó C (2004) INO-1001 a novel poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor improves cardiac and pulmonary function after crystalloid cardioplegia and extracorporal circulation. Shock 21:426-432. Szőcs K, Lassegue B, Sorescu D, Hilenski LL, Valppu L, Couse TL, Wilcox JN, Quinn MT, Lambeth JD and Griendling KK (2002) Upregulation of Nox-based NAD(P)H oxidases in restenosis after carotid injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22:21-27. Taddei S, Virdis A, Mattei P, Ghiadoni L, Gennari A, Fasolo CB, Sudano I and Salvetti A (1995) Aging and endothelial function in normotensive subjects and patients with essential hypertension. Circulation 91:1981-1987. Takagi Y, Gon Y, Todaka T, Nozaki K, Nishiyama A, Sono H, Hashimoto N, Kikuchi H and Yodoi J (1998) Expression of thioredoxin is enhanced in atherosclerotic plaques and during neointima formation in rat arteries. Lab Invest 78:957-966.

95

Tanaka H, Sukhova GK, Swanson SJ, Clinton SK, Ganz P, Cybulsky MI and Libby P (1993) Sustained activation of vascular cells and leukocytes in the rabbit aorta after balloon injury. Circulation 88:1788-1803. Tanaka Y, Koide SS, Yoshihara K and Kamiya T (1987) Poly (ADP-ribose) synthetase is phosphorylated by protein kinase C in vitro. Biochem Biophys Res Commun 148:709-717. Terman A (2001) Garbage catastrophe theory of aging: imperfect removal of oxidative damage? Redox Rep 6:15-26. Tham DM, Martin-McNulty B, Wang YX, Da Cunha V, Wilson DW, Athanassious CN, Powers AF, Sullivan ME and Rutledge JC (2002a) Angiotensin II injures the arterial wall causing increased aortic stiffening in apolipoprotein E-deficient mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R1442-1449. Tham DM, Martin-McNulty B, Wang YX, Wilson DW, Vergona R, Sullivan ME, Dole W and Rutledge JC (2002b) Angiotensin II is associated with activation of NFkappaB-mediated genes and downregulation of PPARs. Physiol Genomics 11:21-30. Touyz RM and Schiffrin EL (2004) Reactive oxygen species in vascular biology: implications in hypertension. Histochem Cell Biol 122:339-352. Tramontano F, Malanga M, Farina B, Jones R and Quesada P (2000) Heat stress reduces poly(ADPR)polymerase expression in rat testis. Mol Hum Reprod 6:575-581. Ueda K, Oka J, Naruniya S, Miyakawa N and Hayaishi O (1972) Poly ADP-ribose glycohydrolase from rat liver nuclei, a novel enzyme degrading the polymer. Biochem Biophys Res Commun 46:516-523. van der Loo B, Labugger R, Skepper JN, Bachschmid M, Kilo J, Powell JM, PalaciosCallender M, Erusalimsky JD, Quaschning T, Malinski T, Gygi D, Ullrich V and Luscher TF (2000) Enhanced peroxynitrite formation is associated with vascular aging. J Exp Med 192:1731-1744. Verzijl N, DeGroot J, Oldehinkel E, Bank RA, Thorpe SR, Baynes JW, Bayliss MT, Bijlsma JW, Lafeber FP and Tekoppele JM (2000) Age-related accumulation of Maillard reaction products in human articular cartilage collagen. Biochem J 350 Pt 2:381-387.

96

Virág L (2005) Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol 3:209-214. Virág L and Szabó C (2002) The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol Rev 54:375-429. Wang D, Chen Y, Chabrashvili T, Aslam S, Borrego Conde LJ, Umans JG and Wilcox CS (2003) Role of oxidative stress in endothelial dysfunction and enhanced responses to angiotensin II of afferent arterioles from rabbits infused with angiotensin II. J Am Soc Nephrol 14:2783-2789. Wattanapitayakul SK, Weinstein DM, Holycross BJ and Bauer JA (2000) Endothelial dysfunction and peroxynitrite formation are early events in angiotensin-induced cardiovascular disorders. Faseb J 14:271-278. Weigert C, Brodbeck K, Klopfer K, Haring HU and Schleicher ED (2002) Angiotensin II induces human TGF-beta 1 promoter activation: similarity to hyperglycaemia. Diabetologia 45:890-898. Welch JP (1967) Somatic mutations and the aging process. Adv Gerontol Res 2:1-36. Wolf G (2000) Free radical production and angiotensin. Curr Hypertens Rep 2:167-173. Wolf G, Chen S and Ziyadeh FN (2005) From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease: podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy. Diabetes 54:1626-1634. Yamamoto H and Okamoto H (1980) Protection by picolinamide, a novel inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase, against both streptozotocin-induced depression of proinsulin synthesis and reduction of NAD content in pancreatic islets. Biochem Biophys Res Commun 95:474-481. Yang J, He L, Wang J and Adams JD, Jr. (2004) Early administration of nicotinamide prevents learning and memory impairment in mice induced by 1-methyl-4phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine. Pharmacol Biochem Behav 78:179-183. Yonemura Y, Takashima T, Matsuda Y, Miwa K, Sugiyama K, Miyazaki I, Yamamoto H and Okamoto H (1988) Induction of islet B-cell regeneration in partially pancreatectomized rats by poly(ADP-ribose) synthetase inhibitors. Int J Pancreatol 3:73-82. Yoshimura S, Morishita R, Hayashi K, Yamamoto K, Nakagami H, Kaneda Y, Sakai N and Ogihara T (2001) Inhibition of intimal hyperplasia after balloon injury in rat

97

carotid artery model using cis-element 'decoy' of nuclear factor-kappaB binding site as a novel molecular strategy. Gene Ther 8:1635-1642. Zhang C, Yang J and Jennings LK (2004) Attenuation of neointima formation through the inhibition of DNA repair enzyme PARP 1 in balloon-injured rat carotid artery. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287:H659-666. Zhao S, Zhang Y, Gu Y, Lewis DF and Wang Y (2004) Heme oxygenase-1 mediates up-regulation of adhesion molecule expression induced by peroxynitrite in endothelial cells. J Soc Gynecol Investig 11:465-471. Zou MH, Cohen R and Ullrich V (2004) Peroxynitrite and vascular endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Endothelium 11:89-97. Zouki C, Zhang SL, Chan JS and Filep JG (2001) Peroxynitrite induces integrindependent adhesion of human neutrophils to endothelial cells via activation of the Raf-1/MEK/Erk pathway. Faseb J 15:25-27.

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK Az értekezésben felhasznált cikkek Szabó C., Pacher P., Zsengellér Zs., Vaslin A., Komjáti K., Benkő R., Chen M., Mabley JG., Kollai M. Angiotensin II-mediated endothelial dysfunction: role of poly(ADP-ribose) polimerase activation. Mol Med 2004; 10: 28-35 IF: 3,576 Benkő R., Pacher P., Vaslin A., Kollai M., Szabó C. Restoration of the endothelial function in the aortic rings of apolipoprotein E deficient mice by pharmacological inhibition of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase. Life Sci 2004; 75: 1255-1261 IF: 2,158 Pacher P., Vaslin A., Benkő R., Mabley JG., Liaudet L., Haskó G., Márton A., Bátkai S., Kollai M., Szabó C. A new, potent poly(ADP-ribose) polymerase

98

inhibitor improves cardiac and vascular dysfunction associated with advanced aging. J Pharmacol Exp Ther 2004; 311: 485-491 IF: 4,335 Szabó C, Biser A, Benkő R, Bottinger E, Suszták K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors ameliorate nephropathy of type 2 diabetic Leprdb/db mice. Diabetes 2006; 11:3004-12 IF: 8,028 Egyéb nemzetközi publikációk

Mabley JG., Horváth EM., Murthy KGK., Zsengellér Zs., Vaslin A., Benkő R., Kollai M., Szabó C. Gender differences int he endotoxin-induced inflammatory and vascular responses: potential role of poly(ADP-ribose) polimerase activation. J Pharmacol Exp Ther 2005; 315: 812-820 IF: 4,033 Csordás A, Pankotai E, Snipes JA, Cselenyák A, Sárszegi Z, Cziráki A, Gaszner B, Papp L, Benkő R, Kiss L, Kovács E, Kollai M, Szabó C, Busija DW, Lacza Z. Human heart mitochondria do not produce physiologically relevant quantities of nitric oxide. Life Sci. 2007; 80(7):633-7 IF: 2,512 Horváth EM, Benkő R, Gerő D, Kiss L, Szabó C. Treatment with insulin inhibits poly(ADP-ribose)polymerase activation in a rat model of endotoxemia. Life Sci. 2008; 82(3-4):205-9 IF: 2,512 Magyar nyelvű publikációk Benkő R., Szabó C. (2005): A diabetes mellitus kardiovaszkuláris szövődményeinek molekuláris mechanizmusa és terápiája PRAXIS 2005. február

99

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Doktori értekezésem végén szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik e munka elkészítésében segítségemre voltak. Mindenekelőtt köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Szabó Csaba professzor úrnak, hogy PhD-hallgatói sorába felvett és szakmai tudásával mindvégig felügyelte és segítette munkámat. Sok igen hasznos tapasztalatot szereztem irányítása alatt. Köszönetet mondok Kollai Márk professzor úrnak, amiért támogatta, hogy diákköri munkámat a Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézetben végezhessem, majd itt folytathattam doktoranduszként tudományos munkámat. Köszönöm közvetlen munkatársaimnak: Lacza Zsombornak, Horváth Eszternek, Pankotai Eszternek, Csordás Attilának, Kiss Leventének, Cselenyák Attilának, Murányi Mariannak, Gerő Domokosnak és Kovács Endrének, akikkel nagyon jó csapatot alkotunk, mind a munkában, mind pedig emberileg, és akiktől sokat tanultam az elmúlt hónapokban-években. Köszönöm diákkörös hallgatóinknak: Somlai Ágnesnek, Fehér Melindának, Módis Katalinnak és Kocsis Adriennek nagyszerű együttműködésüket. Köszönöm Monos Emil professzor emeritus úrnak, hogy nagy figyelemmel kísérte eddigi pályafutásomat és mindig volt hozzám egy kedves szava. Köszönöm Ligeti László professzor úrnak, Ivanics Tamásnak, Miklós Zsuzsának és Nagyné Margitnak hogy oly sokat segítettek a tudományos diákköri kezdetektől. Köszönöm Kocsisné Balogh Ibolya, Fábián Judit, Szabó Anna, Mile Mária, Krikusné Mariann és Fejérné Kamasz Judit technikai segítségét munkám során. Köszönöm a Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet valamennyi munkatársának, hogy segítették munkámat, és mindvégig szeretettel voltak irántam. Köszönettel tartozom Pacher Pálnak, Lucas Liaudet-nek, Zsengellér Zsuzsannának, Jon Mabley-nek, Anne Vaslin-nak és Chung Yang Xiao-nak, amiért gyümölcsözően dolgoztam velük. Végezetül köszönetet mondok szüleimnek, amiért eltűrték, lehetővé tették és támogatták, hogy kutatói pályára lépjek. Köszönöm mindenkinek, élőknek és holtaknak

100

egyaránt, akik lehetővé tették tudományos munkám és tézisem elkészítését, vagy inspirációt adtak ezekhez.

101

A poli (ADP-ribóz) polimeráz 1 szerepe a krónikus kardiovaszkuláris betegségek patogenezisében

Recommend Documents