Poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a bőr ultribolya (UV) fény indukálta károsodásában

1

Doktori (Ph.D.) értekezés

Poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a bőr ultribolya (UV) fény indukálta károsodásában

Dr. Csete Béla

Interdiszciplinális doktori iskola vezető: Dr. Sümegi Balázs, egyetemi tanár Alprogramvezető: Dr. Farkas Beatrix, egyetemi tanár Dr. Battyáni Zita, egyetemi docens

Pécsi Tudományegyetem 2009.

2

Tartalomjegyzék

Bevezetés

2.

Célkitűzések

10.

I. Anyag és módszer

12.

I/1. Állatkísérletek

12.

I/2. Klinikai tünetek értékelése

24.

II. Eredmények

30.

III. Összefoglalás

45.

III/1. Témában elért új eredmények

46.

Irodalomjegyzék

56.

Rövidítések jegyzéke

66.

Köszönetnyilvánítás

67.

A szerző közleményeinek jegyzéke

68.

A szerző kongresszusi előadásainak jegyzéke

70.

Táblázatok és Ábrák

72.

3

Bevezetés

A bőr multifunkcionális „interface” a külvilág és a szervezet között. A környezeti tényezők (légköri szennyeződés, inszoláció fokozódása, az ózonlyuk növekedése, stb.), valamint az életmódbeli szokások (nyári, téli üdülés, hétvégi szabadtéri tevékenység, mesterséges ultraibolya (UV) besugárzás rendszeres igénybevétele, stb.) radikális változása az UV-fény okozta bőrkárosodás pontos patomechanizmusának megismerését, valamint ezáltal

a

folyamat

megelőzésére

és

kezelésére

szolgáló

eljárások

kidolgozását világszerte a bőrgyógyászat egyik vezető kutatási területévé tette. Az UV fény három különböző tartományra osztható. Így az UVA 320-400 nm (ezen belűl UVAI: 340-400 nm, UVAII: 320-340 nm), az UVB: 290-320 nm és az UVC: 200-290 nm formájában lett meghatározva (Diffey 2002). Ismert, hogy az UV-sugarak hullámhossz-dependens módon penetrálnak a bőrbe, vagyis a hullámhossz növekedésével a behatolás mélysége nő. A rövidebb hullámhosszú UVB-sugárzás főleg az epidermiszben abszorbeálódik, és ott dominálóan a keratinocitákkal lép interakcióba. A hosszabb hullámhosszú UVA-tartomány a mélybe penetrál, és az epidermisz mellett érinti a dermális sejtek funkcióját is (Höningsmann 2002). Az UVA- és UVB-tartomány káros hatása additív jellegű és kumulálódik (Lim és mtsai. 2001, Kurtmann 2001) (1.ábra). Annak ellenére, hogy a Földet érő elektromágneses hullámból az UVAtartomány aránya lényegesen magasabb (95%), mint az UVB-é, a biológiailag káros hatások kiváltását dominálóan az UV-fény UVB-

4

tartományával hozzák összefüggésbe (Elmets és mtsai. 2001, Cole 2001, Lim és mtsai. 2001). Az UV-fény legtöbb, bőrben jelentkező kóros biológiai hatásának fő molekuláris

„targetje”

a

DNS.

Az

epidermisz

számos

kromoforral

(nukleinsavak, urokainsav, aromás aminosavak, melanin prekurzorok, stb.) rendelkezik, melyek a fény UV-tartományát elnyelik, és fotokémiai reakción keresztül a bőr biológiai károsodását idézhetik elő (Hönigsmann 2002). Az UV-fény direkt DNS-károsító hatása során dominálóan ciklobután-pirimidindimerek

(CPD),

valamint

pirimidin

(6-4)

pirimidon

fotoproduktumok

képződnek (Freeman és mtsai. 1989, Hemminki és mtsai. 2001). A direkt DNS-károsodás

kiváltásában

az

UVB-

és

a

rövid

UVA-

(UVA-II)

tartománynak van szerepe (Young és mtsai. 1998) A fény UVA-I tartománya főleg indirekt módon, ROS indukció által fejti ki hatását, mely a DNS oxidációja mellett, a lipid-peroxidációban, a fehérjék oxidációjában, a transzkripciós faktorok aktivációjában, DNS-törések előidézésében nyilvánul meg (Krutmann és mtsai. 1997). A fény UVB-tartománya szintén képes ROS képződést indukálni, direkt hatása mégis a DNS-fototermékek (timindimerek), egyesláncú DNS-törések képződésén, a DNS-repair enzimek aktivációján keresztül jelentősebb (Katiyar és mtsai. 2000, Berton és mtsai. 1997, Krutmann 2001, Mitchell és mtsai. 2001). Az epidermisz sejtjeiben bekövetkező DNS-károsodás mértéke jól követhető az akut UV-fény stressz hatására létre jött apoptótikus keratinocyták („sunburn sejtek”) kvantitatív meghatározásával (Ziegler és mtsai. 1994). Az UV-sugárzás direkt és indirekt DNS-t károsító hatása a bőrben gyulladás, fototoxikus reakció, immunszupresszió, „photoaging”, fotokarcinogenezis és

5

számos egyéb elváltozás formájában nyilvánul meg (Krutmann 2001, Kulms és mtsa. 2000, Yarosh és mtsai. 2001, Maccarrone és mtsai. 1997, Steenvoorden és mtsai. 1997) (2. Ábra). Általában az UV-sugárzás akut tüneteinek kiváltásáért, amely dominálóan az epidermális keratinocitákra kifejtett különböző mértékű citotoxikus károsodás következménye, a fény UVB-tartományát teszik felelőssé (Elmets és mtsai. 2001, Lim és mtsai. 2001). A napégés, számos jelátviteli útvonalon keresztül, önmaga elégséges lehet az évekkel, évtizedekkel később manifesztálódó melanoma és nemmelanoma bőrtumorok (carcinoma spinocellulare, carcinoma basocellulare) indukciójához. A krónikus fénykárosodás, vagy „photoaging” kiváltásában az UV-fény mindkét tartományának szerepe van, hiszen hatásuk additív, mégis az UVA jelentőségét emelik ki. Az UV-fény okozta öregedés („photoaging”) és fotokarcinogenezis (melanoma malignum, carcinoma basocellulare illetve spinocellulare) legkifejezettebben az I-II bőrtípusú (fehér, érzékeny bőr) kaukázusiaknál jelentkezik (Young és mtsai. 1996, Katiyar és mtsai. 2000, Kraemer 1997, Farkas és mtsai. 2002). Az életkor meghosszabbodása, valamint a természetes (napfény) és a mesterséges (pl. szolárium) UV-expozíció növekedése által kiváltott fénykárosodás világszerte a jó- és rosszindulatú bőrtumorok előfordulási gyakoriságának progresszív emelkedéséhez vezetett A malignus bőrtumorok incidenciája az utóbbi 30 évben hazánkban is drámaian emelkedett, s ez a tendencia jelenleg is folytatódik. Míg az epidermális eredetű laphám carcinoma és a basocelluláris carcinoma patogenézisében a krónikus (élet során összeadódó) napfény expozíciónak, addig malignus melanoma

6

esetében inkább az ismétlődő, rövid expozíciós idejű, intenzív napégéseknek lehet szerepe. Fenti tényezők miatt a fényvédő készítmények iránti követelmények megnőttek. A teljes spektrumú védelem (UVA, UVB) alkalmazása feltétlenül indokolttá vált (Lim és mtsai. 2001). A jelenleg meglévő, és a fényvédők használatát sok esetben akadályozó mellékhatások (fototoxikus, fotoallergiás reakció, színező hatás, nem megfelelő konzisztencia, stabilitási problémák) kiküszöbölése fontos feladat (Lim és mtsai. 2001). A kutatás az eddigiektől merőben eltérő, új típusú fényvédő készítmények (pl.: a DNS-repair kapacitást támogató T4V (T4N5) liposzómális endonukleáz, az IL-12, PARPgátlók) előállítása irányába folyik (Yarosh és mtsai. 2001, Schwartz és mtsai 2002, Farkas és mtsai. 2002). A cél a megelőzés és a hatékony védelem által a bőrtumor-incidencia növekedésének megállítása (Lim és mtsai 2001). A rendelkezésünkre álló új molekulákkal munkánk célja elsősorban az akut és krónikus UV-fény okozta károsodás kialakulásának megelőzésében szerepet játszó szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr védelmét

elősegítő

illetve

károsító

folyamatok

farmakológiai

befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A bonyolult védelmi funkció érvényesüléséhez az alapvető celluláris folyamatokat (proliferáció, differenciálódás, túlélés, apoptózis) szabályozó, számos jelátviteli rendszer korrekt működése szükséges. Jelen munkában a nagyszámú

jelátviteli

folyamatból,

melyek

az

UV-fény

indukálta

bőrelváltozások kialakulásában részt vesznek a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP)

enzim

aktivitás

és

annak

mechanizmusokat kívántam vizsgálni.

szabályozásával

összefüggő

7

A

poli(ADP-ribóz)

polimeráz

az

eukarióta

sejtekben

(kivéve

az

élesztősejteket) nagy mennyiségben (körülbelül 106 molekula/sejt) jelenlevő nukleáris, 116 kD molekulasúlyú enzim, amely meglehetősen hosszú féléletidejű fehérje. A PARP három fő doménból áll: az N-terminális DNSkötő domén (DBD), az automodifikációs domén (AMD) és a C-terminális katalitikus domén. A DBD-n belül két cink-ujj felelős a DNS kötésért és néhány fehérje-fehérje kölcsönhatásért. A DBD ezen kívül tartalmaz egy nukleáris lokalizációs szignál (NLS) régiót, amelyen belül a kaszpáz hasító hely (DEVD) is található. Az automodifikációs domén tartalmaz egy BRCT (breast cancer susceptibility protein C terminus) szakaszt, amely számos DNS repair és sejtciklus fehérjében közös. A PARP a különböző fehérjefehérje kölcsönhatásokban a BRCT szakaszon keresztül vesz részt. Az enzim C-terminális részén található aktív hely, az eukariótákban rendkívül konzervált, 50 aminosavból álló szekvencia úgy is ismert, mint „PARP névjegy” (Virág és mtsa. 2002). Amennyiben a sejtet különböző behatások (pl.: alkiláló szerek, ionizáló sugárzás, UV-sugárzás vagy szabadgyökök, stb) károsítják, a PARP gyorsan odakötődik a DNS lánctörések helyére, automodifikáción megy keresztül, amely a célfehérjén (leggyakrabban magán az enzimen) hosszú, elágazó láncú poli(ADP-ribóz) polimerek képződéséhez vezet. A folyamathoz NAD+ használódik fel szubsztrátként, amely végeredményben az intracelluláris NAD+ deplécióját okozza (Lindahl és mtsai. 1995, Burkle 2001, Virág és mtsa. 2002). A képződő negatív töltésű PARP azután leválik a DNSvégekről, elősegítve a DNS-repair folyamatát (Lindahl és mtsai. 1995). A poli(ADP-ribóz) in vivo rövid életű, mert a poli(ADP-ribóz) glükohidroláz

8

(PARG) gyorsan (2-5 perccel a polimer képződése után) lebontja (Bernardi és mtsai. 1997). A PARP-nak ez az oda-vissza kötődése a DNS lánctörés helyén annak a hipotézisnek a megszületéséhez vezetett, hogy a PARP és a poli-ADP-riboziláció

különböző,

kromatinhoz

kötött

működésekben

is

szerepet játszik (de Murcia és mtsai. 1997, Kanai és mtsai. 2000). A PARP automodifikációja megváltoztatja az enzim affinitását a DNS lánctörésekhez, valamint azt a képességét, hogy más, a DNS-repair-ben részt vevő fehérjékkel versenyezzen (Lindahl és mtsai. 1995, D’Amours és mtsai. 1999). A PARP különböző biológiai folyamatokban játszott lehetséges funkciójába azok az in vitro kísérletek nyújtottak sokoldalú betekintést, amelyekben NAD+ analógokat

alkalmaztak

a

poli-ADP-riboziláció

gátlására

(például:

nikotinamid, benzamid és származékai). A tanulmányok szerint a kémiai gátlószerek hatékonyan képesek megakadályozni a NAD+ deplécióját, és túlérzékennyé tenni a sejteket a DNS-károsító szerekre, valószínűleg a károsodott DNS kijavítását késleltetve (D’Amours és mtsai. 1999, Shall 1995). Ezek az anyagok valóban gátolják a PARP aktivitást, ugyanakkor a normális

sejtmetabolizmust

is

befolyásolják

más

NAD+-dependens

folyamatokat érintve (Milam és mtsai. 1984). Annak ellenére, hogy az elmúlt évtizedben számos szervvel és szövettel (szív, vázizom, központi idegrendszer, vese, bél, izület, szem, stb.) kapcsolatos vizsgálatok történtek a PARP szerepére vonatkozóan(Zhang 2002, Virág és mtsa. 2002, Szabados és mtsai. 2000.). A bőr az ilyen irányú kutatásokból gyakorlatilag kimaradt. A PARP aktivációnak a bőrelváltozások patomechanizmusában betöltött jelentőségével kapcsolatban csak nagyon szórványos adatok találhatók az irodalomban, a PARP aktiváció bőrben

9

történő szabályozásával (PARP-gátlók hatása) kapcsolatos vizsgálatokra vonatkozó keresésünk pedig eredménytelenül zárult. A PARP bőrben betöltött szerepére vonatkozó eddigi ismereteinket a következőkben tudjuk összefoglalni. Keratinocitákon végzett vizsgálatokkal mutatták ki, hogy a peroxinitrit és a hidrogén-peroxid a HaCaT sejtekben PARP aktivációt idéz elő, amely hozzájárul a peroxinitrit által okozott citotoxicitáshoz (Szabó C. és mtsai. 1998), ill. Hinshaw és mtsai. a kén-mustárral (DNS károsító szer) kiváltott fokozott PARP-szintézisről számoltak be (Hinshaw és mtsai. 1999). Később, in vivo oxazolonnal előidézett kontakt dermatitisz kapcsán (Szabó E. és mtsai. 2001), ill. egérbőr mustárolajjal történő kezelése során (Virág és mtsai. 2002) észleltek PARP aktivációt. Virág és mtsai. az epidermisz bazális rétegében, immunhisztokémiai vizsgálattal, monoklonális poli-ADP-ribóz ellenes antitestet használva észleltek kifejezett keratinocita festődést. Ugyanezen kísérlet során, a mustárolajjal kezelt bőrben, poliklonális antinitrotirozin antitestet használva, az epidermális és dermális sejtekben jelentős nitrotirozin képződést figyeltek meg, mely alapján feltételezték a peroxinitrit jelenlétét Vizsgálataik alapján arra következtettek, hogy a PARP aktiváció egyik mechanizmusa a PARP direkt aktivációja lehet az alkilált DNS által, valamint az intracutan peroxinitrit képződés is hozzájárulhat az enzim aktivációjához (Virág és mtsai. 2002). Annak ellenére, hogy az UV-fény DNS-károsító hatása (Hemminki és mtsai. 2001, Freeman és mtsai. 1989), valamint a PARP DNS-lánctörésre történő aktivációja (Benjamin és mtsai. 1980, Satoh és mtsa. 1992, Lindahl és mtsai. 1995) jól ismert, az UV-besugárzást követően a PARP bőrben betöltött szerepére vonatkozóan ismereteink hiányosak. Ezért érdemesnek látszott,

10

hogy kutatásom egyik legfontosabb céljává tenni az UV-expozíciót követő PARP-aktiválás kimutatását, valamint azt, hogy direkt bizonyítékokat szolgáltassak a PARP-gátlás vagy reguláció protektív hatására.

11

Célkitűzések

Munkánk célja a bőr különböző környezeti stresszhatásokkal szembeni, illetve a már kialakult kóros állapotok helyreállításában részt vevő poli(ADPribóz)

polimeráz

(PARP)

enzim

szerepének

és

farmakológiai

befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A környezeti stresszhatások közül érdeklődésünk középpontjába a fény ultraibolya (UV) tartománya került. Ismert, hogy az élet során elszenvedett fénykárosodás

kumulálódik.

A

civilizált

világban

az

életkor

meghosszabbodásával a természetes (napfény) és mesterséges (pl. szolárium) UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás mértéke jelentősen nő. A fentiek következtében, az UV-fény okozta jó- és rosszindulatú (melanoma, és

nem-melanoma

típusú)

bőrtumorok

előfordulási

gyakoriságának

progresszív növekedése már jelenleg is világszerte megoldandó problémát jelent. Az új molekulák (immunstimulánsok, DNS-protektív anyagok, stb.) előállításával

és

alkalmazásával

várható

a

hatékonyabb

prevenciós

lehetőségek számának növekedése illetve a kóros állapotok jelenleginél korszerűbb diagnosztikus és terápiás megoldása. A rendelkezésünkre álló új molekulákkal célunk elsősorban az akut és krónikus UV-fény károsodás kialakulásának megelőzésében szerepet játszó szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr védelmét elősegítő, protektív, illetve károsító folyamatok farmakológiai befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A megvalósításhoz egyszerű, ugyanakkor jól reprodukálható modelleket próbáltunk használni, amelyek mind sejtszinten, mind pedig a bőr, mint szerv

12

szintjén biztosítják a fiziológiás és patológiás történések vizsgálhatóságát, és magukban foglalják a gyakorló klinikus számára az alkalmazás potenciális lehetőségét. A fentiek alapján tanulmányozni kívántuk:

1.

PARP-regulátor/inhibitor általi szabályzás vizsgálata a bőr akut és Krónikus UV-irradiáció elleni védelmében • A poli-ADP-riboziláció károsodásában

jelentősége

a

bőr

UV-fény

indukálta

• PARP aktivitás in vitro és in vivo vizsgálata • PARP-regulátor/inhibítor antieritematogén, immunoprotektív hatásának vizsgálata 2.

DNS-protektív,

PARP-regulátor/inhibítor szerepe az UVA- és UVB-fény indukálta karcinogenezis elleni védelemben

13

I. Anyag és módszer

A

vizsgálatok

végzéséhez

PTE

ÁOK

Régionális

Etikai

Bizottsága

engedélyével, valamint beteg információs és beleegyező nyilatkozattal rendelkeztünk.

I./1.

Állatkísérletek

A kísérleteket az „European Community guiding principles for the care and use of laboratory animals” szabályai szerint, állatetikai engedély birtokában végeztük. Egy-egy kísérleti sorozatban az állatok életkor és súly szerint lényeges eltérést nem mutattak. I./1.1.

Akut és krónikus fénykárosodás vizsgálata „hairless” egérmodellen

A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor (különböző koncentrációban BGP15M hatóanyagot tartalmazó krém) dermatológiai hatásának vizsgálatához (akut és krónikus UV-fény expozíciós kísérletek) hairless CRL:hr/hr BR Hr1, (Charles River Ltd., Németország) szőrtelen egereket használtunk (3. Ábra). Az

általunk

használt

egerek

lényeges

tulajdonsága,

hogy

immunkompetensek, spontán malignus tumor képződésre nem hajlamosak, és jóindulatú papillómák is csak nagyon idős korban jelentkeznek az állatokon (Sundberg 1994). Az egerek hátán az epidermisz vastagsága megközelítőleg 30 µm (két sejtsoros), az epidermális sejtek „turnover” ideje 1-2 hét. A szőrtelensége miatt kifejezett UV-abszorpciót mutató epidermisz alkalmassá teszi ezt az egértípust az UV-fény hatásának (pl. az akut, vagy a krónikus fénykárosodás, fotokarcinogenezis, stb.) modellezésére (De Gruijl

14

és mtsa. 1995). Kísérleteinkhez 5-8 hetes, 18-26 g súlyú, nőstény egereket használtunk. Az állatokat kórokozó mentes környezetben, 12 órás periódikus (sötét/világos)

megvilágítás

alkalmazásával,

22-25°C-on,

50-70%

páratartalom mellett, általánosan használt egértápon és csapvíz itatással tartottuk. Az állatok egyéni identifikálása a fülön történő jelöléssel, a ketreceké pedig kártyával történt.

I./1.2. Lokális kezeléshez alkalmazott készítmények

BGP-15M (PARP-regulátor) az O-(2-hidroxi-3-piperidino-propil) piridin-3karboxil sav amidoxim monohidroklorid sója. A molekula, amelyet lokális alkalmazásra állítottak elő, az orális, szisztémás alkalmazásra szánt dihidroklorid sóval szemben a BGP-15M jelölést kapta (előállító: N-GENE Res. Lab., New York). A lokális készítményre vonatkozó adatokat az előállító bocsátotta rendelkezésünkre. Vizes oldata enyhén savas kémhatású (pH 5,6). Por formában fehér, nem higroszkópos kristályos anyag. Vízben oldódik. A BGP-15M két enantiomert (+ és -) tartalmaz, a molekula chilaris centruma mentén. A BGP-15M jelölés egyben a racem keverékre utal. A kísérletekhez előállított krém 5-20% koncentrációban tartalmazott BGP-15Mt. Az elvégzett stabilitási (fotostabilitási) vizsgálatok alapján a BGP-15M a krémben stabilnak bizonyult. A preklinikai biztonsági vizsgálatok (toxikológia, mutagenitás,

farmakológia,

farmakokinetika)

dominálóan

orális

adást

követően, bizonyos esetekben dermális kezeléshez társulva (pl. akut dermális toxicitás egérben, szőrtelen egérben, akut dermális irritáció nyúlban, szubakut (28 napos) dermális toxicitás két hetes követéssel patkányban)

15

történt. Az ismertetett adatok alapján a krém formula a biztonsági vizsgálatok során

lokális

(eritéma,

ödéma),

és

szisztémás

(letalitás,

belszervi

makroszkópos és mikroszkópos eltérések, testsúly csökkenés) kóros elváltozásokat nem okozott. BGP-15M lokális készítmény vivőanyaga olaj a vízben (O/V) típusú, kis zsírtartalmú kenőcs (desztillált víz, glicerin, sztearin, cetil-sztearil-alkohol, fehér vazelin, folyékony paraffin, lecitin, polietilénglikol-cetilsztearil éter (etoxiszáma 6) polietilénglikol-cetilsztearil éter (etoxiszáma 25) (Ph.Hg.VII. szerinti magyar névvel feltüntetve). Az „AS” jelzésű készítményt kísérleteinkben kontrollként használtuk. A kereskedelmi forgalomban kapható, Mexoryl® SX komponense által az UVA tartományban is hatékony, fotostabil fényszűrőt tartalmazó, SPF (Sun Protection Factor) 30 és anti UVA/UVB jelzésű (széles spektrumú, a fény UVB és UVA tartományát lefedő), korszerű fényvédőt választottuk ki referencia készítményként, és jelöltük ”AS”-sel. A kontroll készítmény összetétele a következő: desztillált víz, octocrilen, ciclopentasiloxan, titándioxid,

glicerin,

metoxidibenzoilmetán, kopolimer,

propilénglikol, oktil-palmitát,

nátrium-cetil-foszfát,

propilénglikol sztearinsav trietanolamin,

éter, észtere

izohexadekán,

sztearin,

sztearil-heptanoát,

jojoba,

tokoferol-acetát,

fenoxietilalkohol,

sztearil-kaprilát,

(100

csop.),

dimethikonol,

etilénoxid szilikon

olaj,

butil-

PVP/eikozén metilcellulóz polietilénglikol

etil-p-hidroxi

benzoát,

propil-p-hidroxi

benzoát,

tereftalidén-dikámfor-szulfon sav, akrilátok/C10-30 alkil-akrilát krosszpolimer, dinátrium-EDTA, butirospermum parkii, cetil-alkohol, metil-p-hidroxi benzoát,

16

butil-p-hidroxi benzoát, alumínium-hidroxid, glicerilmonosztearát, parfüm (C9794/1). (Ph.Hg.VII. szerinti magyar névvel feltüntetve). A szőrtelen egerek törzsén kialakított egy, vagy több tesztterületet BGP-15M tartalmú krémmel (hatóanyag tartalom: 5%, 10%, 15%, 20% BGP-15M), illetve hatóanyagmentes vivőanyagával (vehikulum), vagy az ”AS”-sel jelölt készítménnyel, 2 mg/ testfelszín cm2 krém egyenletes felvitelével kezeltük. Az UV-fény akut károsító hatásának vizsgálata során az állatokat az UV-fény expozíció előtt 15 perccel, egyszeri kezelésben részesítettük. Az UVbesugárzás krónikus hatásának tanulmányozására végzett kísérletekben az egerek tesztterületeit heti 5 alkalommal, egymást követő napokon, az UVirradiáció előtt 15 perccel, azonos időben és módon kezeltük.

I./1.3. Szőrtelen egerek UV-fény kezelése

Az UV-irradiáció kivitelezéséhez mesterséges (UVB- és UVA-tartományban sugárzó)

és

természetes

fényforrást

(Nap)

használtunk.

Az

UVB-

expozícióhoz a széles spektrumú UV21 Philips lámpát (13 cső, csőtípus: F 85/100 W, emissziós spektrum: 285-350 nm, peak: 310-315 nm, Waldmann Medizintechnik, Villingen-Schwenningen) alkalmaztunk UVB-sugárzóként. Az UVA-irradiációt Waldmann UV 8001K széles spektrumú UVA-készülékkel (csőtípus: WF 85/100 W, emissziós spektrum: 320-400 nm, peak: 365 nm, Waldmann Medizintechnik, Németország) végeztük. A sugárzás méréséhez IL 700 spektroradiométert (koszinusz korrekciós SEE detektorral) használtunk.

17

A természetes fénnyel, a napfénnyel végzett UV-expozíció paramétereinek meghatározása a beeső teljes fotonszám mérése alapján Brewer MK3 Spektrofotometerrel és Brewer szoftverrel (Sci-Tec, USA) történt. (A mérések végzéséért

ezúttal

szeretnénk

köszönetet

mondani

Tóth

Zoltánnak,

Országos Meterológiai Szolgálat Légkörfizikai Intézet, Budapest.) Az aktuális maximális irradianciát és a biológiailag effektív intenzitásokat a fény UVBtartományának 287-320 nm hullámhosszúságú, valamint az UVA-tartomány 321-363 nm hullámhosszúságú részére adtuk meg. Hazánkban, a fény UVBtartományában az irradiancia maximális értéke: 1,2-1,3 J/cm2/h, az UVAtartományában pedig: 8,5-8,6 J/cm2/h. A vizsgálat időpontjában a fény UVB-tartományában (287-320 nm-re integrálva) az irradiancia maximális értéke: 1,08 J/cm2/h volt. A vizsgálat időpontjában a fény UVA-tartományában (321-363 nm-re integrálva) az irradiancia maximális értéke: 8,3 J/cm2/h-nak bizonyult. Ez az érték 321-380 nm tartományban 13 J/cm2/h. A biológiailag effektív intenzitások: UVB (287-320 nm): 0,07 J/cm2, UVA (321-363 nm): 0,015 J/cm2. A számítások végzéséért szeretnénk köszönetet mondani Erostyák Jánosnak (PTE Kísérleti Fizikai Tanszék, Pécs). Az állatokat a besugárzáshoz a mesterséges UV-fényforrástól 30 cm-re helyeztük el. A bőrfelszínen mért sugárzás intenzitás alapján határoztuk meg az egyes kísérlet során a sugárzó által leadandó dózist. (A sugárzó és a spektroradiométer kalibrálása, az előírás szerinti rendszeres időszakonként, a szakszerviz által történt.) Minden egyes kísérlet előtt meghatároztuk a minimális eritéma dózist (MED), amelyet mJ/cm2, illetve J/cm2-ben adtunk meg.

18

A szoláris UV-fény kezeléshez az állatokat speciális egérlapon rögzítettük, amely biztosította a tesztterület standard kezelését és a környező bőr biztonságos takarásának megoldását. Az UVA-besugárzás, valamint a szoláris expozíció esetén az állatokat a hőhatástól alulról, átfolyásos vízhűtéssel működő rendszerrel védtük. Az

UVA-fénnyel,

fotokarcinogenezis

a

krónikus

fénykárosodás

tanulmányozásához)

végzett

megítélésére kísérletek

során,

(pl.: a

besugárzási idő csökkentése céljából „forszírozott UVA”-kezelést, vagyis pszorálen (8-metoxi-psoralen (8-MOP), Geroxalen® oldattal fényérzékenyített tesztterületeket sugaraztunk be (Lowe és mtsai. 1987). A 8-MOP oldattal történt ecsetelés és az UVA-irradiáció között 30 perc telt el. A napfény expozíciót felhőmentes nyári napon 12-13 óra között végeztük. Az előkísérletek során határoztuk meg mindazon feltételeket, amelyek az állatok számára az általunk megítélt legkíméletesebb eljárást biztosították.

I./1.4.

A minimális eritéma dózis (MED) meghatározása szőrtelen egereken

A minimális eritéma dózis (MED) alatt azt az UVB-fény által közvetített energiamennyiséget értjük, amely a bőr minimális eritémás reakciójának előidézéséhez szükséges (Lowe 1990). A MED meghatározásához az egerek fedetlen bőrén kialakított 6 db, egyenként 0,25 cm2 területű tesztterületet

emelkedő

dózisú

(0,12

J/cm2-től

induló)

UVB-fénnyel

sugaraztuk be. A MED leolvasása 24 órával az UVB-besugárzást követően,

19

ugyanazon személy által történt (az interperszonális eltérések elkerülése céljából).

I./1.5.

UVB-expozíció akut hatásának vizsgálata PARP-regulátorral kezelt egérbőrön

Az egerek hátán (thoracalis régió), a reakciómentes, ép bőrön, 2 x 1,44 cm2es nagyságú, egymás alatt elhelyezkedő (egymástól legalább 0,8 cm távolságra levő), tesztterületet alakítottunk ki, és használtunk a kísérletekben (antieritematogén

koncentráció

meghatározásra,

fényvédő

hatás

összehasonlító vizsgálatára UVB-tartományban, stb.) - az állatok számát az egyes kísérleteknél tüntettük fel. Az egerek kezeléséhez a PARP-regulátor BGP-15M tartalmú krémet (hatóanyagtartalom: 5%, 10%, 15% és 20%) alkalmaztuk, illetve vivőanyagát használtuk. Az egerek krémmel történő előkezelését 1.2. pontban leírtak szerint végeztük. Ezt követően az állatokat egyszeri, eritémát okozó UVB-irradiációban részesítettük. Az alkalmazott MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet előtt 3 állaton történt. A környező bőrfelszíneket az UV-behatástól takarással védtük. A negatív kontroll csoportot a krémmel nem kezelt, UV-expozícióban nem részesült állatok képezték. Az irritatív hatás vizsgálatára 20% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt, UV-expozícióban nem részesült állatok csoportja szolgált. Az UVB-irradiáció után közvetlenül, a BGP-15M krémet, illetve vivőanyagát az állatok bőréről eltávolítottuk. A vizsgálatokat az egerek I.-VI. csoportjával (jelölés: /1= felső, /2= alsó tesztterület) végeztük, melyek a következő kezelésben részesültek: I.: I./1.:

20

vivőanyag + UVB, I./2: 5% BGP-15M + UVB; II.: II./1.: vivőanyag + UVB, II./2: 10% BGP-15M + UVB; III.: III./1.: vivőanyag + UVB, III./2: 15% BGP-15M + UVB; IV.: IV./1.: vivőanyag + UVB, IV./2: 20% BGP-15M + UVB; V.: 20% BGP-15M; VI.: kezeletlen, negatív kontroll. A tesztterületek elrendezésével biztosítani kívántuk az esetleges individuális különbségekből adódó eltérések minimálisra csökkentését. A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatásának vizsgálatához a bőrmintákat az UVB-besugárzás után közvetlenül, vagy 24 óra elteltével excízióval nyertük. Az állatokat cervicalis dislocatioval pusztítottuk el.

I./1.6.

Egérbőr kezelése a PARP-regulátor és ismert fényvédő faktorú készítmény

antieritematogén

hatásának

összehasonlító

vizsgálatához A BGP-15M antieritematogén hatását a forgalomban kapható, széles spektrumú (UVA és UVB tartományban ható), általunk ”AS”-sel jelölt, fényvédő készítménnyel hasonlítottuk össze. Az egerek háti felszínén kialakított 1,44 cm2-es tesztterületek közül a proximálisat „AS” jelzésű krémmel, a disztálisat pedig 10%, 15%, vagy 20% BGP-15M

tartalmú

krémmel

kezeltük

az

egymáshoz

viszonyított

antieritematogén hatás megítéléséhez. Az egyes készítmények, kísérleti körülményeink között, az eritéma kialakulására kifejtett gátló hatásának meghatározásához

a

proximális

tesztterületet

UVB-irradiációban

részesítettük (pozitív kontroll), a disztális tesztterületet pedig „AS” jelzésű, vagy 15% BGP-15M krémmel kezeltük. A tesztterületeket egyszeri, 2 MED dózissal UVB-irradiációban részesítettük, a környező bőr takarással biztosított védelme mellett. A MED meghatározása (I./1.4. pont) a kísérlet

21

előtt 24 órával, 3 állaton történt. Negatív kontrollként kezeletlen, UVBexpozícióban nem részesült egerek csoportja szolgált. A krémet az állatok bőréről az UVB-irradiáció után közvetlenül eltávolítottuk. A kezelés alapján a vizsgálatokhoz az állatok következő csoportjait használtuk: I.: I/1.:AS + UVB, I./2.:10% BGP-15M+UVB; II.: II./1.:AS + UVB, II./2.: 15% BGP-15M+UVB; III.: III/1.: AS+UVB, III./2.: 20% BGP-15M+UVB; IV.: IV./1.: UVB, IV./2.: AS+UVB; V.: V./1.: UVB, V./2.: 15% BGP-15M+UVB; VI.: kezeletlen, negatív kontroll csoport. A tesztterületek elrendezésével biztosítani kívántuk az esetleges individuális reakciókülönbségből adódó eltérések minimálisra csökkentését. Az antieritematogén hatást az UVBbesugárzás után 24 és 48 órával vizsgáltuk.

I./1.7.

Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral szoláris-expozíció akut hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor, a napfény akut károsító hatásával szembeni fotoprotektív tulajdonságának vizsgálatához a szőrtelen egerek csoportjait 10%, 15%, vagy 20% BGP-15M tartalmú krémmel, valamint vivőanyagával és az ismertettek alapján kezeltük. Az állatok felhőtlen nyári napon, délben (12-13 óra), speciálisan erre a célra kialakított (hőhatást csökkentő rendszer) körülmények között (I./1.3. pont) részesültek a tesztterületeken 1 órán keresztül természetes napfény expozícióban. Az egerek a napoztatási idő alatt mért irradiancia alapján összesen 8,3 J/cm2/h UVA és 1,08 J/cm2/h UVB dózisú sugárzást kaptak. Az állatokat a tesztterületek kivételével az UVfénytől védtük. Negatív kontrollként kezeletlen, az UV-fénytől a teljestest

22

takarásával védett (sham-irradiált) egerek szolgáltak. A BGP-15M krémet, illetve vivőanyagát az állatok bőréről az UV-irradiáció után közvetlenül eltávolítottuk. A kezelés alapján az egerek következő csoportjait használtuk: I.: I./1: 10% BGP-15M + UV, I./2.: vivőanyag + UV; II.:II/1.: 15% BGP-15M + UV, II./2.: vivőanyag + UV; III.: III./1: 20% BGP-15M + UV, III./2.: vivőanyag + UV; IV.: 15% BGP-15M; V.: kezeletlen, negatív kontroll. Az állatok egy részét közvetlenül az UV-expozíció után cervicalis dislocatioval elpusztítottuk, a tesztterületekből nyert bőrmintákat további feldolgozásig fagyasztva (-70°C) tároltuk. A fennmaradó egerek bőrén az UV-irradiáció után 24 órával végeztünk vizsgálatokat.

I./1.8.

Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVB-expozíció krónikus hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor, BGP-15M protektív hatását a krónikus UVB-irradiáció bőrelváltozásokat előidéző tulajdonságával szemben, azonos életkorú (6 hetes), 18-21g súlyú, nőstény szőrtelen egereken vizsgáltuk. Az egerek hátán (n=20 állat/csoport), a középvonalban 12 x 18 mm-es tesztterületet alakítottunk ki, melyet 15% BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (n=20 állat) előkezeltünk. Az állatok az előkezelés után napi egyszeri, 1 MED UVB-besugárzást kaptak, heti öt egymást követő napon keresztül. A MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet elkezdése előtt 5 egéren történt. Az állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással védtük az UV-sugárzással szemben. Tíz egér nem részesült kezelésben. Ez

23

a csoport volt a negatív kontroll. A kontroll csoportba tartozó egerek bőrállapota (makroszkópos és mikroszkópos) szolgált a „photoaging” (fény általi öregedés) mentes kronológiai öregedés („aging”) követésére. Öt állatot a tesztterületnek megfelelően 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezeltünk (UVB-fénytől védve) az irritatív vagy allergiás reakciók vizsgálata céljából. Az UVB-irradiáció után közvetlenül a BGP-15M krémet, ill. vivőanyagát az állatok bőréről eltávolítottuk. A kialakított vizsgálati csoportok a következők: I.: 15% BGP-15M + UVB; II.: vivőanyag + UVB; III.: 15% BGP-15M; IV.: kezeletlen, negatív kontroll. Az állatokat 32 héten át kezeltük és követtük. A 6. héttől kezdve az egyes csoportokból hisztológiai,

cervicalis

dislocatioval

immunhisztokémiai

és

elpusztított

egerek

elektronmikroszkópos

bőrmintáin vizsgálatokat

végeztünk.

I./1.9.

Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVA-expozíció krónikus hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a krónikus UVA-irradiáció által a szőrtelen egerek bőrében előidézett változásokra

(„photoaging”

és

fotokarcinogenezis)

„forszírozott-UVA”

kezelésben részesített (1.3. pont), azonos korú (7 hetes), nőstény egereken vizsgáltuk. Az egerek hátán 2,25 cm2 (1,5x1,5 cm) tesztterületek (n=2) kerültek kialakításra. Az állatokat 8-metoxipsoralen (8-MOP, Geroxalen®, Gerot

Pharmazeutika,

fényérzékenyítettük.

Az

Wien) egerek

0,15%-os

oldatának

előkészítése

a

használatával kísérlethez

a

24

következőképpen történt: 5 µl/cm2 8-MOP oldattal a tesztterületeket bekentük, az egereket sötétbe helyeztük, majd 30 perc múlva, a 15% BGP15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával kezeltük és 15 perc elteltével UVA-irradiációban részesítettük. Az állatok UVA- és a „forszírozottUVA” kezeléssel (8-MOP + UVA) szembeni érzékenységének vizsgálatára külön állatcsoportot állítottunk be (krémkezelést nem kaptak). További, 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt (UVA-expozíciótól védett) egerek szolgáltak az esetlegesen fellépő irritatív, vagy allergiás reakció vizsgálatára. A fentiek mellett kezeletlen kontroll csoportot használtunk. Az egerek heti 5 alkalommal, napi 0,5 J/cm2 UVA-besugárzást kaptak 26 héten keresztül. Az állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással védtük. Az UVA-irradiáció után közvetlenül a kezelésre használt krémeket (BGP-15M tartalmú, illetve vivőanyag) az állatok bőréről eltávolítottuk. A kezelés szerint az állatokat a következő csoportokba osztottuk: I.:I./1.: 8MOP + UVA, I./2.: UVA; II.: II./1.: 8-MOP + vivőanyag + UVA; II./2.: 8-MOP + 15% BGP-15M krém + UVA ; III.: III./1.: 8-MOP + vivőanyag, III./2.: 15% BGP-15M krém; IV.: kezeletlen kontoll (n=6 egér/csoport). A kontroll csoportba tartozó egerek bőrállapota szolgált a kronológiai öregedés követésére. A rendszer összeállítása lehetővé tette az egerek UVA- és „forszírozott-UVA”

érzékenységének

(makro-

és

mikromorfólógiai)

megítélését, valamint az önkontrollos elhelyezés az esetleges individuális különbségekből adódó eltérések minimálisra csökkentését. Az egereket 26 héten át kezeltük és követtük. A 26. hét végén cervicalis dislocatioval elpusztított egerekből vett bőrmintákat használtuk a hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálatokhoz.

25

I./2.

Klinikai tünetek értékelése

I./2.1.

Klinikai vizsgálatok akut és krónikus UV-expozícióban

A különböző kezelésben részesült egerek tesztterületeinek bőrállapotát vizuálisan és dermatoszkóppal vizsgálva összehasonlítottuk a kezeletlen kontroll állatokéval. Az akut UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás klinikai tüneteit (eritéma, ödema, vezikula, bulla, erózió) az UV-besugárzás után közvetlenül és 24 órával azt követően, öt fokozatú skála (0-4 pont) szerint értékeltük (I/2.2. pont) és tüntettük fel az egérkövetési lapokon. A krónikus UVB- és UVA-besugárzás során a szőrtelen egerek tesztterületeit hasonló módon, a kezelések előtt, hetente 5 alkalommal, valamint a kísérletek befejezésekor vizsgáltuk. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, erózió, exulceráció) intenzitását (I/2.2. pont) értékeltük. Az átmérő ≥1 mm nagyságú tumorokat vettük figyelembe és tüntettük fel. Az észlelteket az egérkövetési lapon regisztráltuk. Az egyes csoportok bőrstátuszában bekövetkezett változásokat átlagosan 4 hetente, valamint a kísérlet végén fotódokumentációval rögzítettük.

I./2.2.

Klinikai tünetek értékelése pontszámmal

A klinikai tünetek meglétének és intenzitásának értékeléséhez öt fokozatú skálarendszert használtunk. A tünetek súlyosságát 0-4 ponttal: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe, 2 = enyhe, 3 = közepesen súlyos, 4 = súlyos fejeztük ki.

26

Eritémára vonatkoztatva: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig észlelhető), 2 = enyhe (jól látható), 3 = közepesen súlyos (vörös), 4 = súlyos (mélyvörös); ödémára: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig megítélhető), 2 = enyhe (érintett terület előemelkedő széllel bír), 3 = közepesen súlyos (a bőr szintje fölé emelkedik <1mm-rel), 4 = súlyos (>1mm-rel emelkedik a bőr szintje fölé). A

krónikus

UVB-

és

UVA-besugárzás

során

a

szőrtelen

egerek

tesztterületein a klinikai tüneteket (eritéma, pigmentáció, erózió, exulceráció) hasonló módon értékeltük. A krónikus UVA-besugárzás során hat fokozatú skálát alkalmaztunk (0 = nincs - 5 = nagyon súlyos).

I./3.

PARP enzim auto-ADP-ribozilációjának vizsgálata Western-blot analízissel

A PARP auto-ADP-ribozilációját különböző bőrmintákban (kezeletlen, nem besugárzott; 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt; 15% BGP-15M tartalmú krémmel, vagy vivőanyaggal előkezelt és UV-fénnyel besugárzott) határoztuk meg (Szabados és mtsai. 2000). A bőrmintákat (20-22 mg/minta) 250 µl 50 mM Tris pufferben (pH 7,8) Ultra-Turrax készülékben homogenizáltuk, majd 8 M karbamid tartalmú 2x Laemmli puffer 250 µl-ének hozzáadását

követően

Potter-Elvehjem

teflonos

homogenizátorban

(Wheaton) tovább homogenizáltuk, majd centrifugáltuk (5 perc, 10.000 rpm). A mintákban levő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (8%-os gél) szeparáltuk és nitrocellulóz membránra blottoltuk (Western-blot analízis) (Szabados és mtsai. 2000). Az ADP-ribozilált fehérjék kimutatására antiADP-ribóz monoklonális antitestet (Dr. Alexander Berkley, Heidelberg és Dr. Masanao Miva, Tsukuba bocsátotta rendelkezésünkre) és anti-egér IgG

27

peroxidáz komplexet (Sigma, München) használtunk. Az antitest-antigén komplex megjelenítését ECL (Enhanced Chemiluminescence) módszerrel végeztük. A Western-bloton kapott jelek kvantitatív meghatározása „Image Tool (Version 1.27) image processing” programmal (University of Texas, Health Science Center, San Antonio) történt.

I./4.

„Sunburn” sejtek kvantítatív meghatározása

A „sunburn” sejtek UV-fény expozicíó hatására a bőrben megfigyelhető apoptótikus keratinociták. A „sunburn” keratinociták a környező sejtektől különálló,

lekerekedett

alakú,

zsugorodott,

eozinofil

citoplazmával,

vakuolumokkal rendelkező, kondenzált, piknotikus sejtmaggal bíró sejtek (Ziegler és mtsai. 1994). A jellegzetes morfológiai elváltozásokkal rendelkező „sunburn”

sejteket

felhasználják

a

fénykárosodás

mértékének

megítélésében. Az eozinofilen festődő, nukleusz nélküli, vagy piknotikus maggal rendelkező „sunburn” sejtek számát a szövetminták 10%-os pufferolt formalinban fixált, paraffinba ágyazott, He-festett, 4 µm-es metszetein, a bazálmembrán 250 µm-es szakasza (kalibrált ocular, Periplan GF 10x/20 Leitz, Nürnberg) feletti interfollikuláris

epidermiszben,

400x

nagyítás

mellett

(Diaplan

fénymikroszkóp, Leitz, Nürnberg) határoztuk meg. Az állatonként 16 látótérben (80 látótér/csoport) vizsgált „sunburn” sejtek számának átlagát 1 mm hosszúságú epidermiszre vonatkoztatva (átlag ± SEM/mm epidermis) adtuk meg.

28

I./5.

Hisztológiai vizsgálatok

A vizsgálatokhoz a szövetmintákat narkózisban, vagy az állatok cervicalis dislocatioval történő elpusztítása után nyertük. Az így kapott anyagot, vagy azonnal feldolgoztuk, vagy a további feldolgozásig -70°C-on tároltuk. Kimetszés után közvetlenül a bőrminták egy részét Tissue Freezing Mediumot (Cambridge Instruments, Heidelberg) használva beágyazóként, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A blokkokat feldolgozásig -70°C-on tároltuk. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz 6 µm-es metszeteket készítettünk (-24°C, Reichert-Jung Cryocut 1800 kriosztát, Leica, Nusslock). Másrészt,

a

szövetmintákból

formalinos

fixálás

(fedeles

beágyazó

kazettában, (Bio-Optica, Milánó), 4,5% pufferolt formalin, pH 7,0, 9-24 h), paraffinba való beágyazás (Citadel 1000 víztelenítő automata (Shandon, Runcorn), 22 h, felszálló alkohol sor: 50% etilalkohol, 70% etilalkohol, 80% etilalkohol, 96% etilalkohol, aceton, amilacetát + paraffinolaj (1:1), xylol (Reanal, Budapest), paraffin (tissuewax, olvadáspont: 52-54°C, (Medite, Burgdorf)) történt. Rotációs mikrotómmal (Leica RM 2135 rotációs mikrotóm, Nusslock) 4 µm-es (felvétel és tárgylemezre olvasztás, 56°C, 30 min.) metszeteket készítettünk. A festések előtt deparaffinálást és rehidrálást (xilol 2x10 min., abszolut alkohol, 96% alkohol 2x, 80% alkohol, 70% alkohol, 50% alkohol), majd 3x csapvizes öblítést végeztünk (Mikkel 1994, Luna 1968).

29

I./5.1. Hematoxilin-eozin (He) festés

A metszeteket hematoxilin oldattal (Merck, Darmstadt) 8 percig festettük, majd kékítést (2 min., csapvíz) követően a további festést eozin oldattal (Merck, Darmstadt) szintén 8 percig végeztük. A víztelenítéshez felszálló alkoholsort (70% etilalkohol 2x, 90% etilalkohol, 96% etilalkohol 2x, abszolut alkohol 2x, abszolút alkohol+xilol 1:1 arányú keveréke, xilol 2x) használtunk. A készítményt Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) fedtük (Mikkel 1994, Luna 1968).

I./5.2. Fontana-Masson festés

A

melanin

kimutatására

paraffinos

metszeteken

argentaffin

reakciót

végeztünk Fontana-Masson módszere szerint (Krobock és mtsai. 1978). Deparaffinálást és rehidrálást követően a metszeteket 2%-os AgNO3 oldattal (Reanal, Budapest) inkubáltuk (szobahő, 2h), majd mosás után hidegen telített (5%) nátriumtioszulfát oldattal (Reanal, Budapest) kezeltük (szobahő, 2 min.), folyó csapvizes mosás (30 min.) után háttérfestésként Mayer-féle kármint (Merck, Darmstadt) alkalmaztunk (3 min.). Dehidrálást követően a fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt.

I./5.3. Orcein-Giemsa festés

A rugalmas rostok vizsgálatára paraffinos metszeteken Orcein-Giemsa festést végeztünk (Krobock és mtsai. 1978). Deparaffinálást és rehidrálást

30

követően a metszeteket orcein (Merck, Darmstadt) savanyított alkoholos oldatával festettük (20 min.). Abszolut alkohollal való differenciálás, Giemsa oldattal (Reanal, Budapest) történő háttérfestés (5 min.) és dehidrálás után, a fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt.

I./6.

Immunhisztológiai vizsgálatok

Az egérbőrből nyert, 6 µm-es kriosztátos metszeteket üveg tárgylemezen, hideg acetonban (4°C, 10 min.) fixáltuk. A szövetminták minőségének ellenőrzésére a metszeteken hematoxilin-eozin festést végeztünk. Az immunhisztokémiai reakcióhoz anti-poli-ADP-ribóz poliklonális antitestet (hígítás: 1:1000 TBS-ben, Biomol, Hamburg) használtunk, az inkubációt szobahőmérsékleten, 60 percig végeztük, és a streptavidin-biotin-peroxidáz módszert alkalmaztuk (H2O2/aminoetilkarbazol (AEC) előhívás, Immunotech Universal kit (Immunotech, Marseilles)). Negatív kontrollként nem immunizált egér hasűri folyadéka szolgált (Mikel 1994).

I./7.

Elektronmikroszkópos vizsgálatok

Elektronmikroszkópos vizsgálathoz a frissen eltávolított bőrmintákat 12-24 órán át, 4°C-on Karnovszky fixálóban (1% paraformaldehid és 2,5% glutáraldehid keveréke, Reanal R, SERVA) inkubáltuk, majd 1%-os ozmiumtetroxidban utófixáltuk (90 min.). Dehidratáció után az anyagot Araldit-be (Fluka) ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket uranil acetáttal és ólom citráttal (MERCK) kontrasztosítottuk, és JEOL 1200 EX II transzmissziós elektromikroszkópon vizsgáltuk (Pease 1964).

31

II. Eredmények

1.

PARP-regulátor szerepe a bőr UV-fény károsodása elleni védelemben

2.

PARP-regulátor hatásának vizsgálata UV-fény indukálta karcinogenezisben

Napjainkban a bőr vonatkozásában a legjelentősebb környezeti DNS károsító faktor a napfény UV tartománya. Egyszeri, magas dózisú napfényexpozíció alkalmazásával vizsgáltuk a PARP-regulátor (5-20% BGP-15M hatóanyag

tartalmú

krém)

potenciális

DNS-protektív

hatását

immunkompetens hairless (szőrtelen) egérmodellen. Az UV-sugárzás által az egérbőrben indukált akut DNS-károsodás mértékét a bőrben képződött egyes láncú DNS-törések mennyiségének meghatározásával, továbbá az UV-irradiáció

által

okozott

DNS-károsodás

markereként

nyilvántartott

epidermális „sunburn” sejtek (apoptótikus keratinociták) képződésének kvantitatív, valamint ultrastruktúrális vizsgálatával jellemeztük.

II./1.1.

PARP-regulátor hatása az UV-sugárzás indukálta egyes láncú DNS törések képződésére a bőrben

Az egyes láncú DNS törések meghatározását DNS-lánc szétcsavarodásán alapuló fluoreszcenciás módszerrel végeztük. Mint ismert, a DNS a törések környezetében szétcsavarodik és csak a sérülés mentes régiókban marad meg kettős láncú formában. Ugyanakkor a kettős láncú DNS-hez kötődő

32

ethidium-bromid

fluoreszcenciája

sokkal

magasabb,

mint

hasonló

körülmények között az egyes láncúé. Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció (napfény) akut bőr DNS-károsító hatását szőrtelen egérmodellen vizsgáltuk. Rendszerünkben a napfény expozícióban nem részesült, kezeletlen egerek, valamint a 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt csoport bőrmintáiban a DNS nagy része (átlagosan 80%) károsodást nem szenvedett, kettős láncú DNS-nek bizonyult. Ugyanakkor az intenzív napfény expozíciónak (egy óra alatt 8,3 J/cm2 UVA és 1,08 J/cm2 UVB) kitett egérbőrben a vivőanyaggal kezelt mintákban

az egyes láncú DNS törések mennyiségének jelentős

megnövekedése következtében, a nem károsodott DNS aránya 30% alá csökkent (1. Táblázat). A napfény behatás előtt PARP-regulátorral (15% BGP-15M tartalmú krém) végzett lokális előkezelés az intenzív UV-sugárzás által indukált nagyfokú DNS-károsodás mértékét szignifikánsan (p<0,01) csökkentette, a mintákban (n=5) az ép DNS aránya meghaladta az 50%-ot (4. Ábra).

II./1.2.

PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta „sunburn” sejtek képződésére

Az apoptótikus sejthalál egyik prototípusának tartott „sunburn” sejtképződés kvantitatív meghatározásával vizsgáltuk egérbőrben, az elszenvedett UVfény károsodás mértékét. Rendszerünkben (I./1.5. pont) a PARP-regulátorral vagy a hatóanyagot nem tartalmazó vivőanyaggal előkezelt egércsopotok tesztterületeiben egyszeri, eritémát okozó (2 MED) UV-irradiáció hatására

33

jelentkezett „sunburn” sejtek (apoptótikus keratinociták) számát hasonlítottuk össze az UV-sugárzástól védett (kezeletlen) kontroll állatok bőrében észleltekkel. A „sunburn” sejtek kvantitatív meghatározását 24 órával az UVB-expozíció után vett bőrmintákból készült, hematoxilin-eozinnal festett hisztológiai készítményekben vizsgáltuk. Az UVB-besugárzástól védett, kontroll állatok bőrmintáiban az epidermisz 1 milliméteres bazálmembrán feletti szakaszán a „sunburn” sejtek átlagos száma 0,5 ± 0,2 volt (2. Táblázat). Az UV-expozíció hatására a vivőanyaggal kezelt bőrben, az ugyanekkora epidermisz szakaszon megfigyelhető „sunburn” sejtek száma hetvenötszörösére (37,4 ± 1,4 sejt/mm) nőtt, ami kifejezett DNS-károsodásra utalt (5. Ábra). A PARP-regulátorral történt előkezelés már az 5% BGP-15M hatóanyag tartalom mellett szignifikánsan (p<0,01) csökkentette az UVB-besugárzás által indukált apoptótikus keratinociták képződését (8,8 ± 0,4 sejt/mm epidermisz), ami a szer magasabb koncentrációinál (10% és 15%) még kifejezettebben érvényesült (1,6 ± 0,3 és 1,1 ± 0,4 sejt/mm epidermisz) (6. Ábra). A 15% BGP-15M tartalmú krém előkezelés 34-szeres védelmet mutatott az egyszeri, eritémát okozó (2 MED) UVB-sugárzás apoptótikus sejthalált kiváltó hatásával szemben. Amennyiben az UVB védelmi képesség megítélésének elterjedt módját, a protektív faktort használjuk, úgy a PARP-regulátor (15% BGP-15M tartalmú krém) protektív faktora a „sunburn” sejt képződésre: 34

(2.

Táblázat). Az apoptótikus keratinociták számával meghatározott, UVB-expozíció indukálta DNS-károsodásra vonatkozó eredmények összhangban vannak a napfény által okozott, a bőrben képződött egyes láncú DNS törések

34

kvantitatív vizsgálatával kapott adatokkal, és a PARP-regulátor feltételezett fotoprotektív tulajdonságát véli alátámasztani.

II./1.3.

PARP-regulátor hatásának ultrastruktúrális vizsgálata az akut UVB-sugárzás indukálta DNS-károsodásra a bőrben

A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatását az akut UVB-irradiáció által okozott fénykárosodás ultrastruktúrális eltéréseit frissen eltávolított bőrminták ultravékony metszeteiben transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A kezeletlen, UV-fénytől védett szőrtelen egerek bőrmintáiban

kóros

ultrastruktúrális eltérést nem észleltünk. Ugyanakkor az eritémát okozó (2 MED) UVB-besugárzásban részesült (vivőanyaggal előkezelt) egérbőrben a felszíni hámréteg bazális és szuprabazális sejtrétegében az apoptózis ultrastruktúrális jeleit mutató sejteket detektáltunk (7. Ábra). A kromatin marginális kondenzációját, részleges nukleáris fragmentációt, a mag zsugorodását, perinukleáris ödémát és az intercelluláris kapcsolat részleges felbomlását lehetett megfigyelni. Az elváltozás megfelelt a „sunburn” sejtekre jellemzőknek (7. Ábra). A lokálisan alkalmazott PARP-regulátorral (BGP-15M tartalmú

krémmel)

előkezelt,

UVB-irradiációban

részesített

állatok

bőrmintáiban apoptózisra jellemző sejtkárosodást az elektronmikroszkópos feldolgozás során nem észleltünk (8. Ábra). Az akut UV-expozícióval végzett ultrastruktúrális vizsgálatok eredményei további adatot szolgáltattak a PARP-regulátor DNS-protektív szerepére.

35

II./1.4.

PARP auto-ADP-ribozilációja és regulációja UV-besugárzott bőrben

A poli(ADP-ribóz) polimeráz, egy olyan evoluciónárisan konzervatív nukleáris enzim, mely az eukarióta sejtekben a környezeti (pl. UV-sugárzás) és endogén

genotoxikus

hatásokkal

szembeni

DNS-károsodást

elhárító

rendszer ismert szabályzó faktora (D’Amours és mtsai. 1999). A nagyfokú DNS-károsodás, amely direkt módon, túlméretezett PARP-aktivációhoz vezet, a nukleáris fehérjék fokozott poli-ADP-ribozilációja, valamint a PARP auto-ADP-ribozilációja által előidézi a NAD+ és az ATP deplécióját, a sejt energia metabolizmusának károsodását, és ezáltal a sejtfunkciók különböző mértékű zavarát eredményezheti. Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció akut DNS-károsító hatása által a szőrtelen egérbőrben indukált PARP-aktiváció mértékét az enzim auto-ADP-ribozilációjának mérésével határoztuk meg. Kísérleti körülményeink között (I./1.7. pont) az egér csoportok tesztterületeinek az UVexpozíció előtt különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel történő kezelésével a PARP-regulátor enzimaktivitásra kifejtett hatását vizsgáltuk. A PARP auto-ADP-ribozilációjának meghatározását az UV-irradiáció (napfény expozíció) után közvetlenül eltávolított bőrmintákban végeztük. Western-blot technikát alkalmaztunk, az ADP-ribozilált fehérjéket anti-poli(ADP-ribóz) monoklonális antitesttel (peroxidáz komplex) detektáltuk, „ECL”-módszerrel láthatóvá tettük, valamint „Image-Tool (verzió 1.27) image processing” programmal a jelintenzitás erősségének

mértékét kvantitatív módon

36

meghatároztuk (3. Táblázat). A továbbiakban immunhisztokémiai technikával vizsgáltuk a bőrminták epidermális sejtjeiben a PARP ADP-ribozilációját.

II./1.5.

PARP

auto-ADP-ribozilációjának

vizsgálata

Western-blot

analízissel akut UV-fény expozícióban részesült egérbőrben

Kísérleti körülményeink között (I./1.7. pont) a kezeletlen szőrtelen egerek bőrmintáiban az ADP-riboziláció mértéke (Western-blot jel) a nehezen detektálható tartományba esett, ami arra utalt, hogy az UV-irradiációtól védett állatok bőrében a PARP aktivációs szignál intenzitása (DNS törések mennyisége) gyakorlatilag elenyésző volt (9. Ábra és 3. Táblázat). Az egy órás napfény expozícióban részesült, vivőanyaggal előkezelt állatokból származó bőrmintákban a PARP enzim auto-ADP-ribozilációja az UVsugárzástól védett kontroll bőrben meghatározott érték 25x-re nőtt. Ugyanakkor a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés hatására az UV-expozíció által kiváltott fokozott ADP-riboziláció mértéke, a Western-blot

analízissel

kapott

jelek

intenzitásának

kvantitatív

meghatározása alapján, több mint 50%-kal csökkent. A BGP-15M lokális alkalmazásával, UV-besugárzás hatására a bőrben létrejött extrém magas PARP-aktivitás (a PARP-enzim auto-ADP-ribozilációjával mérve) szignifikáns mértékben (p<0,01) csökkent.

37

II./2.

PARP-regulátor a bőr akut fénykárosodására kifejtett hatásának klinikai vizsgálata

II./2.1.

PARP-regulátor hatásának vizsgálata egyszeri UVB-expozíció indukálta akut klinikai tünetekre

A lokális BGP-15M-kezelés potenciális fotoprotektív hatását szőrtelen egerek bőrén, az egyszeri, eritematogén (2 MED) UVB-irradiáció által kiváltott, akut fénykárosodás (dermatitis solaris) klinikai tüneteinek öt fokozatú skálán történő értékelésével vizsgáltuk. A különböző koncentrációjú (5%, 10%, 15% és 20%) BGP-15M tartalmú krémmel, illetve vivőanyaggal előkezelt tesztterületeken az UVB-irradiáció után 24 órával jelentkezett klinikai tünetek (eritéma, ödéma, vezikula, bulla, erózió) súlyosságát vizuálisan és dermatoszkóppal határoztuk meg (10. Ábra). Az egyszeri, 2 MED UVBbesugárzás hatására a vivőanyaggal kezelt csoportban 5 állatnál a tesztterületen intenzív bőrpír (eritéma pont: 3), valamint enyhe ödéma (pontérték: 2), egy állatnál pedig jól definiálható eritéma (pontérték: 2) jelentkezett. Az alkalmazott kísérleti feltételek mellett > 5% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés teljes mértékű védelmet mutatott az UVB-irradiáció indukálta akut klinikai tünetek kialakulásával szemben. Az egerek 5% BGP-15M lokális kezelésben részesült tesztterületén egy állatban jól definiálható eritéma és nagyon enyhe ödéma (pontérték: 2, illetve 1), valamint két további esetben bizonytalan eritéma (pontérték: 1) jelentkezett. A vizsgálat során a tesztterületeken (BGP-15M-krémmel kezelt UVBbesugárzott és nem besugárzott) irritációra utaló elváltozást nem észleltünk.

38

Az

alkalmazott

kísérleti

körülmények

között

a

BGP-15M

≥

10%

koncentrációban fotoprotektívnek bizonyult (10. Ábra). A továbbiakban ezt tekintettük a BGP-15M antieritematogén koncentrációjának.

II./2.2.

PARP-regulátor hatásának vizsgálata UVB-expozíció indukálta akut hisztológiai elváltozásokra bőrben

A különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel, illetve vivőanyaggal előkezelt (I/1.5. pont) egerek tesztterületének bőréből 24 órával az UVbesugárzás után vett, valamint a negatív kontrollként szolgáló kezeletlen állatok

bőréből

nyert

szövetmintákat

formalinos

fixálást,

paraffinos

beágyazást, He-festést követően vizsgáltuk. A vivőanyaggal előkezelt UVBexpozícióban részesített bőrminták hisztológiai feldolgozása során a kezeletlen kontrollhoz képest különböző mértékű, fénykárosodásra utaló eltéréseket lehetett megfigyelni, melyek a következők voltak: számos, eozinofil citoplazmával, piknótikus sejtmaggal rendelkező, vagy mag nélküli apoptótikus

keratinocita.

A

dermisz

felső

rétegében

részben

perivaszkulárisan, részben a dermo-epidermális határ mentén ödémásan fellazult alapállományban neutrofil granulociták láthatók, a papilláris réteg erei dilatáltak, vér alakos elemeivel kitöltöttek, endotéljük duzzadt (11. Ábra). A ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt állatok csoportjaiban a kezeletlen kontroll bőrben észleltekhez képest lényeges kóros hisztológiai eltérést nem találtunk. A ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt, 2 MED UVB-besugárzott bőrben a „sunburn” sejtek száma a bazális membrán 1 mm-es szakasza

39

feletti epidermiszben átlagosan egy-egy volt (2. Táblázat). Ugyanakkor a vivőanyaggal

kezelt,

UVB-besugárzott

állatok

azonos

hosszúságú

epidermisz szakaszában átlagosan 37 „sunburn” sejtet lehetett detektálni. Amennyiben az UV-károsodás mértékét az egységnyi epidermiszben jelen levő „sunburn” sejtek számával fejezzük ki, úgy a BGP-15M ≥ 10% koncentrációban alkalmazva több mint harmincszoros védelmet jelent, az egyszeri, eritematogén UVB-irradiáció károsító hatásával szemben (11. Ábra).

II./2.3.

PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálata ismert fényvédő faktorú (SPF) készítménnyel

A BGP-15M tartalmú krémet ≥ 10% koncentrációban alkalmazva, egy forgalomban levő, jól ismert, SPF (sun protection factor) 30 jelzésű, az UVB és

UVA

tartományban

védelmet

biztosító

(általunk

”AS”-sel

jelölt)

készítménnyel hasonlítottuk össze antieritematogén hatás vonatkozásában. A kísérletben egyszeri, eritematogén (2MED) UVB-besugárzást alkalmaztunk (1.5. pont). Az egerek pozitív kontrollként használt, UVB-vel irradiált tesztterületein (n=6) dermatitis szoláris klinikai tüneteit (eritéma pont: 3-2, ödéma pont: 2-1) lehetett megfigyelni (12. Ábra). Az „AS”, illetve BGP-15M előkezelésben részesült tesztterületeken az UVB-expozíció klinikai tünetet nem okozott, a környező (UV-fénytől takarással védett) bőrrel, illetve a negatív kontrollként használt állatok bőréhez hasonlítva makromorfológiai eltérést nem észleltünk. Hisztológiai vizsgálattal „AS”, ill. BGP-15M kezelésben részesített bőrmintákban lényeges kóros eltérést nem találtunk.

40

Az alkalmazott kísérleti körülmények között a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krém fotoprotektív hatása megegyezett az „AS” jelzésű, 30-as fényvédő faktorú (SPF 30) készítményével.

II./2.4.

PARP-regulátor fotoprotektív hatásának vizsgálata a bőr akut szoláris károsodására

Szőrtelen egerek tesztterületeit magas dózisú szoláris UV-irradiációban részesítettük. A maximális irradiancia a kísérlet időpontjában a fény UVBtartományában (287-320 nm-re integrálva): 1,08 J/cm2/h volt (hazánkban az irradiancia maximális értéke: 1,2-1,3 J/cm2). Az UVA-tartományában (321363 nm-re integrálva): 8,3 J/cm2/h volt (hazánkban az irradiancia maximális értéke: 8,5-8,6 J/cm2). A biológiailag effektív intenzitások: UVB (287-320 nm): 0,07 J/cm2, UVA (321-363 nm): 0,015 J/cm2. (A mérések az Országos Meterológiai Szolgálat Légkörfizikai Intézetben, Budapest, a számítások a PTE Kísérleti Fizikai Tanszékén történtek, Pécs). Az állatok tesztterületei a napfény expozíció előtt 10%, 15%, illetve 20% BGP-15M tartalmú krém, illetve vivőanyaggal előkezelésben részesültek (1.5. pont) UV-besugárzástól védett, kezeletlen állatok csoportja szolgált kontrollként. A tesztelt bőrterületek állapotát 24 órával az UV-irradiációt követően vizsgáltuk. A vivőanyaggal előkezelt, intenzív UV-sugárzásnak kitett tesztterületeken a bőr a napégés klinikai tüneteit (lividvörös eritéma, súlyos ödéma, két esetben bullaképződés mutatta (13. Ábra). Hisztológiailag a klinikai tüneteknek megfelelően erodált, illetve ödémásan fellazult, csökkent magfestésű,

41

nekrotikus hámfelszínen nagy mennyiségű fibrincsapadék volt megfigyelhető. A dermisz legfelső részében elhelyezkedő neutrofil granulociták és magtörmelékeik denz, széles sávot képeztek (14. Ábra). Másrészről a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés az intenzív UV-sugárzás által indukált súlyos klinikai tüneteket kivédte (13. Ábra). A BGP-15M tartalmú krémmel kezelt tesztterületeken a bőr sem a környező, UV-besugárzástól takarással védett, sem az UV-expozícióban nem részesült állatok bőréhez képest szabadszemmel megfigyelhető, vagy dermatoszkóppal detektálható eltérést nem mutatott. A bőrminták hisztológiai feldolgozása során normális anatómiai struktúrának megfelelő szövettani képet láttunk: két rétegből álló hám, szerkezetében megtartott dermisz, az akut UV-károsodásra utaló lobosodás jelei nélkül. Az UV-besugárzásban nem részesült kontroll bőrmintákban kóros hisztológiai eltérést nem észleltünk.

II./3.

PARP-regulátor

hatása

a

bőr

UVB-sugárzás

indukálta

karcinogenezisére (hairless egérmodell)

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a krónikus UVB-sugárzás hatására, a szőrtelen egerek bőrében kialakuló, „photoaging”-hez, fotokarcinogenezishez vezető változások követésével határoztuk meg. Klinikai, hisztológiai, immunhisztokémiai és ultrastruktúrális vizsgálatokat végeztünk a következő egércsoportokban: I.: 15% BGP-15M + UVB; II.: vivőanyag + UVB; III.: 15% BGP-15M; IV.: kezeletlen kontroll. Az egereket 32 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém, vagy vivőanyag

előkezelés

után

0,25

J/cm2/nap

UVB-besugárzásban

42

részesítettük. A klinikai tüneteket a kezelések előtt vizsgáltuk, és átlagosan 2-4 hetente fotodokumentációval rögzítettük. A kezelés második hetétől a vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott tesztterületen az eritémás, ödémás tüneteket, az egyre mélyülő színű pigmentáció és infiltráció váltotta fel (15. Ábra). A ≥ 1 mm tumorok időbeni jelentkezését, valamint a tumoros állatok prevalenciáját a 16. Ábrán tüntettük fel. Az első tumort (átmérő: 1,1 mm) vivőanyaggal kezelt, UVB-besugárzott szőrtelen egerek csoportjában (II. csoport) a kezelés 18. hetében észleltük. A tumoros állat az észlelés időpontjáig 22,5 J/cm2 összdózisú UVB-besugárzást kapott. A 15% BGP15M krémmel előkezelt egerek bőre elváltozást nem mutatott (17. Ábra). A 19. héten már 3 egéren lehetett 1-2 mm nagyságú, vörösesbarna színű, félgömbszerűen

kiemelkedő

tumor

jelentkezését

megfigyelni,

és

a

feldolgozás során hisztológiailag igazolni. A 19. héttől kezdve a vivőanyaggal kezelt, krónikus UVB-besugárzásban részesített egerekben progresszív tumorképződést észleltünk. A vivőanyaggal kezelt, UVB-irradiált csoport minden tagja a 23. hétre egy vagy több, klinikailag és hisztológiailag verifikálható, spinocellularis carcinomá-val, illetve keratosis solaris-nak megfelelő bőrelváltozással rendelkezett, ugyanakkor a PARP-regulátor, 15% BGP-15M krémmel előkezelt egerek bőre enyhe fokú pigmentáción kívül más eltérést nem mutatott. A 32. héten a vivőanyaggal előkezelt, krónikus UVBbesugárzásban megvastagodott,

részesült

állatok

sötétbarna-szürkés

bőre

a

tesztterületen

pigmentációt

jelentősen

mutatott,

felszíni

egyenetlenség jeleivel, különösen a multiplex tumorok környezetében (18. Ábra). A tumorok fejlődése során az adott területen hiperpigmentáció és depigmentáció egyaránt megfigyelhető volt. A 32. héten, a kísérlet

43

lezárásával, a 15 % BGP-15M krémmel előkezelt, és krónikus UVBexpozícióban (összdózis: 39 J/cm2) részesített egércsoportban, a tesztterület bőrét összehasonlítva a kezeletlen kontroll állatokéval, illetve a környező, takarással védett bőrfelszínnel, barnás-vörös színű pigmentáción kívül egyéb klinikailag értékelhető eltérést nem találtunk (18. Ábra). 8 hónap elteltével tumorképződésre utaló klinikai tünetet az UVB-expozíciótól védett, BGP-15M krémmel kezelt (III. csoport), illetve kezeletlen kontroll állatokon (IV. csoport), valamint a krónikus UVB-expozícióban részesített, PARP-regulátorral (BGP15M krémmel) előkezelt szőrtelen egereken (I. csoport) nem lehetett megfigyelni. Kísérleteink eredményei alapján megállapíthatjuk, hogy a PARP-regulátor a krónikus UVB-expozíció fotokarcinogén hatását kivédte. Az UV-expozíciótól védett, 15% BGP-15M krémmel kezelt állatokon (III. csoport) a 32 hetes kezelés alatt irritatív vagy allergiás reakcióra utaló eltérést nem észleltünk (18. Ábra). A klinikai vizsgálattal megfigyelt tumorképződés hisztológiailag igazolást nyert. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVB-expozícióban részesített egerek szövetmintáinak vizsgálati eredménye alapján, a PARP-regulátor gátolta az UVB-fény által, a vivőanyaggal előkezelt mintákban megfigyelt, súlyos fénykárosodásra (epidermisz kiszélesedése, akantózis, sejtes infiltráció, rugalmas rostok fragmentációja, melaninakkumuláció) (19-22. Ábra) és tumorképződésre (23. Ábra) utaló hisztológiai, immunhisztológiai (IL-10, TNFα, és p53) (24-26. Ábra) és szubmikroszkópos (27. Ábra) elváltozások kialakulását.

44

II./4.

PARP-regulátor

hatása

a

bőr

UVA-sugárzás

indukálta

karcinogenezisére („forszírozott UVA”-kezelés)

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a krónikus „forszírozott UVA”-kezelés hatására a szőrtelen egerek bőrében kialakuló,

„photoaging”-hez,

fotokarcinogenezishez

vezető

változások

követésével vizsgáltuk. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, hámlás, erózió, kifekélyesedés) súlyosságát 0-5 pontos skálán (nincs elváltozás - igen súlyos), a tumorok (átmérő ≥ 1mm) jelentkezését naponta, a kezelések előtt szabad szemmel és dermatoszkóppal végzett vizsgálat alapján regisztráltuk (4. Táblázat). Az állatok I-IV. csoportjában (I.:I./1.: 8-MOP + UVA, I./2.: UVA; II.: II./1.: 8-MOP + vivőanyag + UVA; II./2.: 8-MOP + 15% BGP-15M krém + UVA; III.: III./1.: 8MOP + vivőanyag, III./2.: 15% BGP-15M krém; IV.: kezeletlen kontroll) huszonhat héten keresztül értékelve a makromorfológiai elváltozásokat a következő eredményt kaptuk: az első hónap végén, amikor az állatok 10 J/cm2 összdózisú UVA-besugárzást kaptak, a 8-MOP-pal fényérzékenyített tesztterületeken intenzív (8-MOP + UVA: 4,0 ± 0,8) és (8-MOP + vivőanyag + UVA:3,8 ± 0,7) eritéma, valamint egy-egy állaton erózió jelentkezett. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott állatok bőrén kóros elváltozást nem észleltünk (28. Ábra és 4. Táblázat). Irritatív, vagy allergiás reakciót nem tudtunk megfigyelni. Az idő előrehaladtával, a 3. hónap végére, az UV-besugárzott állatokon a 15% BGP-15M krémmel előkezeltek kivételével, a gyulladás mértéke egyre kifejezettebbé vált (pontszám: 3 - 5) és egyre több állaton lehetett

45

exulcerációt (pontszám: 2 – 3) megfigyelni (29. Ábra és 4. Táblázat). Az első tumor a 8-MOP + UVA-kezelt állaton a 14. héten jelentkezett (30. Ábra és 5. Táblázat). A 4. hónap végére a 8-MOP + UVA-kezelésben részesült csoportban mind a 6 állaton, a fényérzékenyítést nem kapott, UVAbesugárzott

csoportban

4/6

állaton

és

a

vivőanyaggal

előkezelt,

fényérzékenyített, és UVA-besugárzott csoportban pedig 5/6 állaton egy, vagy több tumor jelentkezett (31. Ábra és 5. Táblázat). Az UVA-val kezelt csoportban (I./2) a tumorok átmérőjének nagysága alig haladta meg az 1 mm-t és ebben a csoportban egy állat még az 5. hónap végén is tumor mentes volt. Ugyanekkor végzett klinikai vizsgálattal a 15% BGP-15M krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott egerek bőre továbbra is tünet mentesnek bizonyult (32. Ábra). Több mint fél év elteltével (26. hét) az UVA-kezelésben részesült csoportokban kifejezett pigmentációt találtunk (pontérték: 3,7± 0,5 ; 3,2 ± 1,1; 3,7± 0,4). A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVA-besugárzott csoportban enyhe fokú pigmentációt észleltünk (pontérték: 1,8 ± 0,4) (31. Ábra, 4. Táblázat). mértékű

A

fényérzékenyített,

hegképződést

lehetett

UVA-besugárzott megfigyelni

a

állatokon

különböző

korábban

exulcerált

területeken. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVAbesugárzott állatok kivételével az UVA-expozícióban részesült csoportokban különböző nagyságú tumorokat észleltünk. Önmagában, besugárzás nélkül a 8-MOP, a vivőanyag, vagy a PARPregulátor bőrelváltozást nem okozott (irritatív, vagy allergiás reakció nem jelentkezett) (31. Ábra). A hisztológiai, immunhisztológiai és elektronmikroszkópos eredmények a klinikai képpel korreláltak (33-37. Ábra).

46

III. Összefoglalás

III/1.

A PARP-regulátor BGP-15M DNS-protektív hatása a bőrben

Az UV-sugárzás által az egérbőrben indukált akut DNS-károsodás mértékét

a

képződött

egyes

láncú

DNS-törések

mennyiségének

vizsgálatával azt találtuk, hogy az intenzív napfény expozíció a szövetmintákban

az

ép,

nem

károsodott

DNS-arányát

30%

alá

csökkentette. Ugyanakkor a PARP-regulátor lokális alkalmazása kifejezett védelmet biztosított a napfény UV-tartományának DNS-károsító hatásával szemben. Az UV-irradiáció által okozott DNS károsodás hisztológiai markereként nyilvántartott epidermális „sunburn” sejtek (apoptótikus keratinociták) kvantitatív meghatározása során, az UV-besugárzott, vivőanyaggal kezelt bőrben a kontrollhoz

képest hetvenötszörösére

emelkedett „sunburn” sejtek száma. A „sunburn” sejt képződéssel szemben a PARP-regulátor használata DNS-protektívnek bizonyult. A PARP-regulátorral előkezelt bőrmintákban az apoptótikus keratinociták száma közel azonos volt a kontroll bőrben észleltekkel. Az ultrastrukturális vizsgálatok további adatokat szolgáltattak a PARP-regulátor DNSprotektív szerepére.

III/2.

A PARP-regulátor (BGP-15M) hatása az UV-besugárzás által bőrben indukált immunszupresszióra

Az UV-fény ismert, negatív tulajdonságai között kiemelt jelentőségű a fotokarcinogenezis „előszobája”-ként nyilvántartott fotoimmunszupresszív hatás. A korszerű UV-tartományban fényvédő anyagokkal szemben elvárás, hogy a bőr, mint immunszerv funkciójának fiziológiás működését biztosítsák, vagyis megakadályozzák a fotoimmunszupresszió/moduláció kialakulását (Lim és mtsai. 2001). Az UVB-besugárzás után észlelhető immunszupresszió

47

és gyulladás az epidermális sejtek által termelt citokinek (pl. IL-10, TNFα, IL6, IL-1, IL-12,stb) és biológiailag aktív anyagok modulációja (up-,downregulációja) révén manifesztálódik. Egérbőrben az IL-10 és TNFα citokineket az UVB-fény indukálta immunszupresszió markereként tartják számon (Kripke és mtsai. 1992). A PARP-regulátor (BGP-15M) fotoimmunprotektív hatásának meghatározását az IL-10 és TNFα citokinek immunhisztokémiai vizsgálatával

végeztük.

A

vivőanyaggal

előkezelt,

UVB-besugárzott

mintákban az epidermális sejtek anti-IL-10 poliklonális antitesttel kifejezett citoplazmatikus festődést mutattak az epidermisz teljes vastagságában. Ugyanakkor a PARP-regulátorral kezelt mintákban szórványosan csak egyegy sejt festődött. A vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott bőrből készült metszeteken anti-TNFα poliklonális antitesttel intenzív citoplazmatikus és membránfestődést észleltünk. Az ödémásan kiszélesedett hámban részben a bazális rétegben perinukleárisan intenzív, a felső sejtsorokban pedig kevésbé kifejezett, diffúz, intracitoplazmális reakciót figyeltünk meg. A papilláris dermisz legfelső rétegében közvetlenül a hám alatt elhelyezkedő makrofágok is kifejezett festődést mutattak. A PARP-regulátorral előkezelt, UVB-expozícióban részesült bőr epidermiszében, hasonlóan az UVBbesugárzástól védett kontrollhoz, immunhisztokémiailag detektálható TNFα szintézist nem észleltünk. Ezek a adataink azt mutatják, hogy a PARPreguláror (BGP-15M) lokális alkalmazása fotoimmunprotektív hatásúnak bizonyult az UVB-irradiáció indukálta bőr-immunszupresszióval szemben.

48

III/3.

A PARP-regulátor szerepe a bőr akut UVB-fény károsodás elleni védelmében (klinikai és hisztológiai vizsgálatok)

A szőrtelen egerek bőrén különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt tesztterületeken, 2 MED UVB-irradiáció után 24 órával jelentkezett klinikai tünetek (eritéma, ödéma, vezikula, bulla, erózió) alapján határoztuk meg a PARP-regulátor antieritematogén koncentrációját. A bőrminták hisztológiai feldolgozása során a vivőanyaggal előkezelt, UVBexpozícióban részesített bőrben különböző mértékű, akut fénykárosodásra utaló eltérést észleltünk. Számos, eozinofil citoplazmával, piknótikus sejtmaggal rendelkező, vagy mag nélküli apoptótikus keratinocitát („sunburn” sejtet), a dermisz felső rétegében, részben perivaszkulárisan, részben a dermo-epidermális határ mentén ödémásan fellazult alapállományban neutrofil granulocitákat, a papilláris rétegben dilatált, duzzadt endotélű, vér alakos elemeivel kitöltött ereket lehetett látni. A ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt állatok csoportjaiban lényeges kóros hisztológiai eltérést nem találtunk. Amennyiben az UVB- károsodás mértékét az egységnyi epidermiszben jelen levő „sunburn” sejtek számával fejezzük ki, úgy a BGP15M ≥ 10% koncentrációban alkalmazva több mint harmincszoros védelmet jelent, az egyszeri, eritematogén UVB-irradiáció (vivőanyaggal kezelt bőrben kifejtett) károsító hatásával szemben. Így az itt bemutatott eredmények a lokálisan alkalmazott PARP-regulátor fotoprotektív hatását igazolták a bőr akut UVB-fénykárosodása esetén.

III/4.

PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálata ismert fényvédő faktorú (SPF) készítménnyel

A

BGP-15M

tartalmú

krém

(≥

10%

koncentrációban

alkalmazva)

antieritematogén hatását hasonlítottuk össze egy, a forgalomban levő, SPF (Sun Protection Factor) 30 jelzésű, az UVB és UVA tartományban védelmet biztosító (általunk ”AS”-sel jelölt) készítménnyel. Az „AS”, illetve BGP-15M

49

krém előkezelésben részesült tesztterületeken az UVB-expozíció klinikai tüneteket nem okozott. Hisztológiai vizsgálattal az ”AS”-sel jelölt, ill. BGP15M krém kezelésben részesített bőrmintákban lényeges kóros eltérést nem találtunk Ezen adatok jelzik, hogy az alkalmazott kísérleti körülmények között a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krém fotoprotektív hatása megegyezett az „AS” jelzésű, 30-as fényvédő faktorú (SPF 30) készítményével.

III/5.

PARP-regulátor

hatása

a

szoláris

UV-expozíció

klinikai

tüneteire és a hisztológiai elváltozásokra

A

vivőanyaggal

előkezelt,

intenzív

napfény

sugárzásnak

kitett

tesztterületeken a bőr a napégés klinikai tüneteit (lividvörös eritéma, súlyos ödéma, két esetben bullaképződés) mutatta. Hisztológiailag a klinikai tüneteknek megfelelően erodált, illetve ödémásan fellazult, csökkent magfestésű, nekrotikus hám felszínen nagy mennyiségű fibrincsapadék volt megfigyelhető.

A

dermisz

legfelső

részében

elhelyezkedő

neutrofil

granulociták és magtörmelékeik sötét, széles sávot képeztek. Ugyanakkor a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés az intenzív szoláris UV-sugárzás által indukált súlyos klinikai tüneteket kivédte. A PARPregulátor (BGP-15M krém ≥ 10%) fotoprotektívnek bizonyult, meggátolta az intenzív UV-expozíció által indukált dermatitis solaris (napégés) klinikai és hisztológiai tüneteinek megjelenését.

50

III/6.

A BGP-15M krém protektív a krónikus UV-besugárzás indukálta

fotokarcinogenezis klinikai, hisztológai, immunhisztológiai és ultrastuktúrális tüneteivel szemben A 32 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém (vagy vivőanyag) előkezelés után 0,25 J/cm2/nap UVB-besugárzásban részesített szőrtelen egerek tesztterületein vizsgáltuk a PARP-regulátor hatását a krónikus fénykárosodás elleni védelemben. Kísérleteink eredményei alapján a PARPregulátor lokális alkalmazása a krónikus UVB-expozíció (32 hét, UVB összdózis: 39 J/cm2) fotokarcinogén hatását kivédte. A vivőanyaggal előkezelt tesztterületeken a 18. héttől kezdve (UVB-dózis: 22,5 J/cm2 ) klinikailag 1-2 mm nagyságú, vörösbarna színű, félgömbszerűen kiemelkedő tumorok

jelentkeztek,

amelyek

hisztológiai

vizsgálattal

carcinoma

spinocellulare-nak bizonyultak. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt egerek bőrmintáinak hisztológiai feldolgozása során a kontroll bőrhöz képest az epidermisz másfél-kétszeresére történő kiszélesedését lehetett megfigyelni, a dermiszben lényeges kóros eltérést nem észleltünk. A vivőanyaggal kezelt, UVB-irradiált csoport minden tagja a 23. hétre egy vagy több, klinikailag és hisztológiailag verifikálható, spinocellularis carcinomával, illetve keratosis solarisnak megfelelő bőrelváltozással rendelkezett, ugyanakkor a PARPregulátor, 15% BGP-15M krémmel előkezelt egerek bőre enyhe fokú pigmentáción kívül más eltérést nem mutatott. A kísérlet befejezésekor a 32. héten a vivőanyaggal előkezelt, krónikus UVB-besugárzásban részesült állatok bőre a tesztterületen jelentősen megvastagodott, sötétbarna-szürkés hiperpigmentációt és depigmentációt mutatott, felszíni egyenetlenség jeleivel, különösen a multiplex tumorok környezetében. A 15% BGP-15M krémmel

51

előkezelt, és krónikus UVB-expozícióban (összdózis: 39 J/cm2) részesített egércsoportban, a tesztterület bőrét összehasonlítva a kezeletlen kontroll állatokéval, illetve a környező, takarással védett bőrfelszínnel, barnás-vörös színű pigmentáción kívül egyéb klinikailag értékelhető eltérést nem találtunk. Nyolc hónap elteltével tumor képződésre utaló klinikai, vagy hisztológiai eltérést a BGP-15M krémmel előkezelt csoportban nem észleltünk. Az UVBexpozíciótól védett (BGP-15M, ill kontroll csoport) állatokon spontán tumor képződést nem lehetett megfigyelni. Irritatív, vagy allergiás reakciót a kísérlet során nem észleltünk. A krónikus fénykárosodás a vivőanyaggal előkezelt mintákban a 26. héten a rugalmas rostok Orcein-Giemsa festéssel kimutatható károsodásában (nagy gócokban fragmentáció és összecsapzódás), a 32. héten a tumorok körül az elasztikus

rostok

megfogyatkozásában,

és

a

kollagén

rostok

felszaporodásában nyilvánult meg. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, és UVB-irradiációban részesült egerek bőrmintáiban ugyanakkor megtartott, ill. enyhén megfogyatkozott rugalmas rosthálózatot figyelhettünk meg, amit a kronológiai öregedés hisztológiai jeleként értékeltünk. Amíg a vivőanyaggal előkezelt mintákban a krónikus UV-expozíció hatására a dermiszben a melanin a makrofágokban durva szemcsés formában, esetenként szabadon a kötőszöveti alapállományban is megtalálható volt, addig a PARPregulátorral előkezelt egerek bőrében a melanin pigment a bazális réteg egyes sejtjeiben gócosan jelent meg. Immunhisztokémiai vizsgálattal a PARP-regulátorral előkezelt, krónikus UVBbesugárzásban részesített bőrmintákban a bazális keratinociták p53 antitesttel csak elvétve adtak immunhisztológiai reakciót. A vivőanyaggal

52

előkezelt állatok bőrében a keratosis solarisnak megfelelő területeken foltos p53 festődést kaptunk. Az invazív tumorokban a sejtek nagy része intenzív p53 magpozitivitást adott. A precancerosus elváltozásokban megfigyelhető „patch”-jelleg a klonális expanzióra utalt. Elektronmikroszkópos vizsgálattal a vivőanyaggal előkezelt, 39 J/cm2 UVBexpozícióban részesült egérbőrben a normál keratinocita struktúra részbeni felbomlását, tonofibrillum fragmentumokhoz kötődve dezmoszóma struktúrát, a perinukleáris régióban számfeletti centroszómákat, a sejtmagok nagy részében

durva,

szabálytalanul

összecsapzódott

kromatin

állományt

észleltünk. A szubmikroszkópos elváltozások jelentős része megfelelt a carcinoma spinocellulare-ban látottaknak. A BGP-15M krémmel előkezelt, UV-besugárzott bőrminták elektronmikroszkópos vizsgálata során egy esetben sem észleltünk in situ, vagy invazív karcinomát. A fenti eredmények némileg nem várható eredményt okoztak azaz a PARP feltehetően nem komplett részleges gátlása A 32. héten az UVB expozicíót megelőzően lokálisan alkalmazott PARP-regurátorral a krónikus UVBexpozíció fotokarcinogén hatásának kivédését eredményezte. A hatás feltehetően az UV expozicíóra bekövetkező, mások által is megfigyelt extra PARP-aktiváció a BGP-15M-nek közel a normális szintre történő downregulációjával magyarázható.

53

III/7. PARP-regulátor

hatásának

vizsgálata

UVA-sugárzás

indukálta

fotokarcinogenezis klinikai tüneteire szőrtelen egérmodellen

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a krónikus UVA- besugárzott, ill. 8-MOP (Geroxalen®) fényérzékenyített és UVA- besugárzott szőrtelen egerek bőrében kialakuló, „photoaging”-hez, fotokarcinogenezishez vezető változások követésével vizsgáltuk. A szőrtelen egerek tesztterületei 26 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém (vagy vivőanyag) előkezelés után 0,5 J/cm2/nap UVA-besugárzásban részesültek. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, hámlás, erózió, kifekélyződés) súlyosságát 0-5 pontos skálán, valamint a tumorok (átmérő ≥ 1mm) jelentkezését vizsgáltuk a kezelések előtt. Az első tumort a 14. héten, a fényérzékenyített és UVA-besugárzott a vivőanyaggal kezelt állaton figyeltük meg. A 4. hónap végére a vivőanyaggal előkezelt, 8-MOP+UVAirradiációban részesült állatokon különböző nagyságú szoliter tumorokat észleltünk. A PARP-regulátor lokális előkezelés fotoprotektívnek bizonyult mind a 8-MOP-pal fényérzékenyített, mind pedig a „csak” UVA-besugárzott (26 hét, összdózis: 65 J/cm2) állatok bőrében. A PARP-regulátor kivédte a vivőanyaggal előkezelt, hasonló módon UV-expozíciónak kitett állatokban klinikailag megfigyelt, és hisztológiailag igazolt tumorképződést. A PARP-regulátorral előkezelt, UVA-besugárzott bőrmintákban hisztológiai vizsgálattal a hám enyhe kiszélesedését (5-8 sejtréteg) és megtartott hám struktúrát találtunk. Ugyanakkor a vivőanyaggal előkezelt, UVA-besugárzott mintákban

az

hiperkeratótikusnak,

epidermisz

egyenetlenül

szegmentálisan

akantótikusnak

parakeratótikusnak

bizonyult

és a

hematoxilin-eozinnal festett metszetekben. Az epidermisz alsó részein a szerkezet felbomlott, a magok polaritása megszűnt. Ezeken a területeken a

54

sejtmagok általában anapláziát, hiperkrom kromatin szerkezetet mutattak, és nagyobb számban sejtoszlások is észlelhetők voltak. A bazális rétegben kifejezett sejtproliferációt láttunk. A dermo-epidermális határ mentén főként limfocitákból és hisztiocitákból álló lobosodást észleltünk. A vivőanyaggal kezelt, UVA-besugárzott bőrmintákból készült hisztológiai metszeteken Orcein-Giemsa festéssel a rugalmas rostok fragmentálódását és összecsapzódását figyeltük meg a dermisz középső részében. A PARPregulátorral előkezelt UVA besugárzott bőrben (8-MOP+BGP-15M+UVA) az elasztikus rostok száma minimális mértékben csökkent, a kollagén rostok száma változatlan volt a kezeletlen, azonos korú kontroll bőrhöz viszonyítva. Fontana-Masson festéssel kisebb mennyiségű melanin pigmentet tudtunk fokálisan

kimutatni

a

bazális

és

szuprabazális

keratinocitákban.

A

vivőanyaggal előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott egérbőrben Fontana-Masson festéssel fokálisan nagy mennyiségű melanint lehetett kimutatni a bazális és szuprabazális keratinocitákban, az epidermisz alsóbb sejtsoraiban, és a dermális makrofágokban tömeges melanin pigmentet észleltünk.

Ugyanakkor

az

UVA-fénnyel

besugárzott

bőrben

kisebb

mennyiségben lehetett melanin pigmentet a hámban és az irhában megfigyelni. Immunhisztológiai vizsgálattal a 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVAbesugárzott (8-MOP+BGP-15M+UVA), valamint az UV-expozícióban nem részesült (8-MOP; 15% BGP-15M és kezeletlen kontroll) bőrmintákban p53 festődést nem észleltünk A vivőanyaggal előkezelt, UVA-besugárzott (8MOP+vivőanyag+UVA) részesített állatok bőrében a bazális sejtréteg magjainak és a megbomlott szerkezetű hámrészletek tumorosan átalakult sejtjeinek p53 akkumulációját igazoltuk. Eletronmikroszkópos

vizsgálattal

a

PARP-regulátorral

(8-MOP+BGP-

15M+UVA) előkezelt és UVA expozicíóban részesült bőrben megtartott szerkezetet láttunk, kóros ultrastruktúrális eltérés nélkül. A vivőanyaggal

55

előkezelt,

UVA-besugárzott

(8-MOP+vivőanyag+UVA)

bőrminták

feldolgozása során már 4 hetes UVA-expozíciót (UVA-összdózis: 10J/cm2) követően az intercelluláris rések kiszélesedését lehetett megfigyelni. Az UVA-expozícióban nem részesült (8-MOP; 15% BGP-15M) bőrmintákban, valamint a kezeletlen azonos korú kontroll állatok bőrében a mikroszkópos és ultramikroszkópos vizsgálatok során kóros eltérést nem észleltünk.Ezek az adatok jelzik, hogy PARP-regulátorral végzett kezelés protektívnek bizonyult a több mint féléves UVA-besugárzás fotokarcinogén hatásával szemben. A fenti adatok azt mutatják, hogy a PARP részleges gátlása jelentős védelmet nyújthat akut és krónikus UV károsodás tüneteinek kialakulásával, valamint fotokalcinogenésissel szemben, jelezve egy rendkívül fontos területet PARP-inhibitorok klinikai alkalmazására. A BGP-15M krém jelenleg NG-SUN néven fázis kettő vizsgálatokban vesz rész melynek kezdeti része bíztató, így remélhetőleg belátható időn belül megjelenhet a klinikai felhasználásban. Azaz az értekezésben bemutatott vizsgálatok ténylegesen hozzájárulhatnak egy új típusú UV protektív anyag kifejlesztéséhez és a gyógyászatba történő megjelenéséhez.

56

A témában elér új eredmények összefoglalása:

Igazolást nyert a BGP-15M PARP-regulátor

a,

DNS-protektív hatása

b,

fotoimmunoprotektív hatása UVB tartományban

c,

fotoprotektív

hatása

megegyezik

30-as

SPF

faktorú

készítménnyel d,

fotoprotektív hatása szoláris UV expozicióval szemben

e,

protektív krónikus UVA-besugárzás indukálta carcinogenezisben

gyári

57

Irodalomjegyzék [1]

Affar E. B., Germain M., Winstall E., Vodenicharov M., Shah R. G., Salvesen G. S., Poirer G. G.: Caspase-3- mediated processing poly(ADP-ribose) glycohydrolase during apoptosis. J. Biol. Chem. (2001) 276:2935-2942.

[2]

Benjamin R. C., Gill D. M.: ADP-ribosylation in mammalian cell ghosts. Dependence of poly(ADP-ribose) synthesis on strand breakage in DNA. J. Biol. Chem. (1980) 255:10493-10501.

[3]

Bernardi R., Rossi L., Poirier G. G., Scovassi A. I.: Analysis of poly(ADP-ribose) glycohydrolase activity in nuclear extracts from mammalian cells, Biochem. Biophys. Acta. (1997) 1338:60-68.

[4]

Bernstein E. F., Chen Y. Q., Kopp J. B., Fisher L., Brown D. B., Hahn P. J., Robey F. A., Lakkakorpi J., Uitto J.: Long-term sun exposure alters the collagen of the papillary dermis. Comparison of sunprotected

and

photoaged

immunohistochemical

staining,

skin and

by

northern

confocal

laser

analysis, scanning

microscopy. J. Am. Acad. Dermatol. (1996) 34:209-218. [5]

Bernstein E. F., Chen Y. Q., Tamai K., Shepley K. J., Resnik K. S., Zhang H., Tuan R., Mauviel A., Uitto J.: Enhanced elastin and fibrillin gene expression in chronically photodamaged skin. J. Invest. Dermatol. (1994) 103:182-186.

[6]

Berton T. R., Mitchell D. L., Fischer S. M., Locniskar M. F.: Epidermal proliferation but not the quantity of DNA photodamage is correlated with UV-induced mouse skin carcinogenesis, J. Invest. Dermatol. (1997) 109:340-347.

[7]

Brash D. E., Ziegler A., Jonason A. S., Simon J. A., Kunala S., Leffell D. J.: Sunlight and Sunburn in Human Skin Cancer: p53, Apoptosis, and Tumor Promotion. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings (1996) 1:136-142.

[8]

Burkle A.: Physiology and pathophysiology of poly(ADP-ribosyl)ation. Bioessays. (2001) 23:795-806.

58

[9]

Cole C.: Sunscreen protection in the ultraviolet A region: how to measure

the

effectinevess.

Photodermatol.

Photoimmunol.

Photomed. (2001) 17:2. [10] Cruz P. D. Jr., Leverkus M., Dougherty I., Gleason M. J., Eller M., Yaar M., Gilchrest B. A.: Thymidine dinucleotides inhibit contact hypersensitivity and activate the gene for tumor necrosis factor α, J. Invest. Dermatol., (2000) 114:253-258. [11] D’Amours D., Desnoyers S., D’Silva I., Poirier G. G.: Poly(ADPribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochem. J. (1999) 342:249-268. [12] D’Amours D., Sallmann F. R., Dixit V. M., Poirer G. G.: Gain-of-fuction of poly(ADP-ribose) polymerase-1 upon cleavage by apoptotic proteases: implications for apoptosis. J. Cell. Sci. (2001) 114:37713778. [13] Dantzer F., Schreiber V., Niedergang C., Trucco C., Flatter E., De La Rubia G., Oliver J., Rolli V., Menissier-de Murcia J., de Murcia G.: Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair. Biochemie. (1999) 81:69–75. [14] Daya-Grosjean L., Dumaz N., Sarasin A.:The specificity of p53 mutation spectra

in

sunlight

induced

human

cancers.

Journal

of

Photochemistry and Photobiology (1995) 28:115-124. [15] de Gruijl F. R., Forbes P. D.: UV-induced skin cancer in hairless mouse model. Bio. Essays. (1995) 17:651-660. [16] de Murcia G., Huletsky A., Lamarre D., Gaudreau A., Pouyet J., Daune M., Poirier G. G.: Modulation of chromatin superstructure induced by poly(ADP-ribose) synthesis and degradation. J. Biol. Chem. (1986) 261:7011–7017 . [17] de Murcia G., Menissier de Murcia J.: Poly(ADP-ribose) polymerase: a molecular nick-sensor. Trends. Biochem. Sci. (1994) 19:172-176. [18] de Murcia J. M., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux B., Mark M., Oliver F. J., Masson M., Dierich A., LeMeur M.: Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA

59

damage in mice and in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997) 94: 73037307. [19] Diffey B. L.: What is light? Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. (2002) 18:68-74. [20] Drazen D. L., Bilu D., Edwards N., Nelson R. J.: Disruption of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) protects against stress-evoked immunocompromise. Mol. Med. (2001) 7:761-766. [21] Durkacz B. W., Lunec J., Grindley H., Griffin S., Horner O., Simm A.: Murine melanoma cell differentiation and melanogenesis induced by poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors. Exp. Cell. Res. (1992) 202:287-291. [22] Durkacz B. W., Omidiji O., Gray D. A., Shall S.: (ADP-ribose)n participates in DNA excision repair. Nature (1980) 283:593-596. [23] Elmets C. A., Singh D., Tubesing K., Matsui M., Katiyar S., Mukhtar H.: Cutaneous photoprotection from ultraviolet injury by green tea polyphenols. J. Am. Acad. Dermatol. (2001) 44:425-432. [24] Farkas B., Magyarlaki M., Csete B., Németh J., Rablóczky Gy., Bernáth S., Literáti Nagy P., Sümegi B.: Reduction of acute photodamage in skin by topical application of a novel PARP inhibitor Biochem. Pharmacol. (2002) 63:921-932. [25] Farkas B., Sümegi B., Rablóczky Gy., Csete B., Hodosi B., Magyarlaki M., Bernáth S., Literáti Nagy P.: Protecting effect of PARP inhibition on UV light-induced skin damage. In: Zhang J. (ed), PARP as a therapeutic target. Pharmacology & Toxicology Series, Boca Raton, London, New York, Washington, CRC Press, (2002) pp:257-276. [26] Faro R., Toyoda Y., McCully J., Jagtap P., Szabo E., Virág L., Bianchi C., Levitsky S., Szabo C.: Protective effect on regional myocardial function and infarct size induced by PJ34: a novel poly(ADP-ribose) synthetase inhibitor. Ann. Thorac. Surg. (2002) 73: 575-581. [27] Fisher G. J., Datta S. C., Talwar H. S., Wang Z. Q., Varani J., Kang S., Voorhees J. J.: Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature (1996) 379:335-339.

60

[28] Freeman S. E., Hacham H., Gange R. W., Maytum D. J., Sutherland J. C., Sutherland B. M.: Wavelength dependence of pyrimidine dimer formation in DNA of human skin irradiated in situ with ultraviolet light, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5605-5609. [29] Germain M., Affar E. B., D’Amours D., Dixit V. M., Salvesen G. S., Poirier

G.

G.:

Cleavage

of

automodified

poly(ADP-ribose)

polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase7. J. Biol. Chem. (1999) 274:28379-28384. [30] Gilchrest B. A.: A review of skin ageing and its medical therapy. Brit. J. Dermatol. (1996) 135:867-875. [31] Gilchrest B. A.: Skin aging and photoaging : an overview. J. Am. Acad. Dermatol. (1989) 21:610-613. [32] Hemminki K., Xu G., Le Curieux F.: Ultraviolet radiation-induced photoproducts in human skin DNA as biomarkers of damage and its repair, IARC Sci. Publ. (2001) 154:69-79. [33] Hinshaw D. B., Lodhi I. J., Hurly L. L., Atkins K. B., Dabrowska M. I.: Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in endothelial cells and keratinocytes: role in an in vitro model of sulfur mustard-mediated vesication. Toxicol. Appl. Pharmacol. (1999) 156:17-29. [34] Horkay I., Varga L., Tamasi P., Gundy S.: Repair of DNA damage in light sensitive human skin diseases. Arch. Dermatol. Res. (1978) 263:307-15. [35] Horkay I.: Sun protection, sunscreens. Bőr. Vener. Szle. (1998) 74:8385. [36] Hönigsmann

H.:

Erythema

and

pigmentation.

Photodermatol.

Photoimmunol. Photomed. (2002) 18:75-81. [37] Kanai M., Uchida M., Hanai S., Uematsu N., Uchida K., Miwa M.: Poly(ADP-ribose) polymerase localizes to the centrosomes and chromosomes. Biochem. Biophys. Res. (2000) 278:385-389. [38] Katiyar S. K., Matsui M. S., Mukhtar H.: Kinetics of UV light-induced cyclobutane

pyrimidine

dimers

in

human

skin

in

vivo:

an

immunohistochemical analysis of both epidermis and dermis. Photochem. Photobiol. (2000) 72:788.

61

[39] Kim J. W., Kim K., Kang K., Joe C. O.: Inhibition of homodimerization of poly(ADP-ribose) polymerase by its C-terminal cleavage products produced during apoptosis. J. Biol. Chem. (2000) 275:8121-8125. [40] Kim J. W., Won J., Sohn S., Joe C. O.: DNA-binding activity of the Nterminal cleavage product of poly(ADP-ribose) polymerase is required for UV mediated apoptosis. J. Cell. Sci. (2000) 113:955-961. [41] Kraemer K. H.: Sunlight and skin cancer: another link revealed. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1997) 94:11-14. [42] Kripke M. L., Cox P. A., Alas L. G., Yarosh D. B.: Pyrimidine dimers in DNA initiate systemic immunosuppression in UV-irradiated mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:7516-7520. [43] Kripke M. L.: Latency, histology, and antigenicity of tumors induced by ultraviolet light in three inbred mouse strains. Cancer Res. (1977) 37:1395-1400. [44] Krobock E., Rahbari H., Mehregan A. H.: Acid orcein and Giemsa stain. Modification of a valuable stain for dermatological specimens. J. Cutan. Pathol. (1978) 5: 37-38. [45] Krutmann J., Croteau D. L., Bohr V. A.: Repair of oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells, J. Biol. Chem. (1997) 272:25409. [46] Krutmann J.: The role of UVA rays in skin aging, Eur. J. Dermatol. (2001) 11:170-171. [47] Kulms D., Schwarz T.: Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. (2000) 16: 195-201. [48] Lim H. W., Naylor M., Honigsmann H., Gilchrest B. A, Cooper K., Morison W., Deleo V. A., Scherschun L.: American Academy of Dermatology sunscreens:

Consensus summary

Conference

and

on

UVA

recommendations,

protection J.

Am.

of

Acad.

Dermatol. (2001) 44:505-508. [49] Lindahl T., Satoh M. S., Poirier G. G., Klungland A.: Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks. Trends. Biochem. Sci. (1995) 20:405-411.

62

[50] Lowe N. J., Dromgoole S. H., Sefton J.: Indoor and outdoor efficacy testing of a broad spektrum sunscreen against ultraviolet A radiation in psoralen-sensitized subjects. J. Am. Acad. Dermatol. (1987) 17:224-230. [51] Lowe N. J.: Sun protection factor: Comparative techniques and selection of UV sources. In: Sunscreens,development, evaluation and regulatory aspects. eds. by Lowe N. J., Shaath N., Marcel D., New York, (1990) pp. 379-394. [52] Luna L. G: Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition, McGraw-Hill New York, (1968). [53] Maccarrone M., Catani M. V., Iraci S., Melino G., Agro A. F.: A survey of reactive oxygen species and their role in dermatology, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. (1997) 8:185-202. [54] Menisser-de Murcia J. M., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux B., Mark M., Oliver F. J., Masson M., Dierich A., LeMeur M., Walztinger C., Chambon P., de Murcia G.: Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery form DNA damage in mice and in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997) 94:7303-7307. [55] Mikel U. V.: Advanced laboratory methods in histology and pathology Washington DC: Armed Forces Institute of Pathology and Armed Registry of Pathology, (1994). [56] Milam K. M., Cleaver I. E.: Inhibitors of poly(adenosine diphosphateribose) synthesis: effect on other metabolic processes, Science. (1984) 223:589-591. [57] Mitchell D. L., Byrom M., Chiarello S., Lowery M. G.: Effects of chronic exposure to ultraviolet B radiation on DNA repair in the dermis and epidermis of the hairless mouse, J. Invest. Dermatol. (2001) 116:209215. [58] Molinete M., Vermeulen W., Burkle A., Menissier de Murcia J., Kupper J. H., Hoeijmakers J. H., de Murcia G.: Overproduction of the poly(ADP-ribose) polymerase DNA-binding demain blocks alkylationinduced DNA repair synthesis in mammalian cells. EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J. (1993) 12:2109-2117.

63

[59] Oliver J. F., Menissier-de Murcia J., de Murcia G.: DNA Repair ’99 Poly(ADP-Ribose) Polymerase in the Cellular Response to DNA Damage, Apoptosis, and Disease. Am. J. Hum. Genet. (1999) 64:1282-1288. [60] Pacher P., Liaudet L., Soriano F. G., Mabley J., Szabo E., Szabo C.: The Role of poly(ADP-ribose) polymerase in the development of myocardial

and

endothelial

dysfunction

in

diabetes

mellitus.

Diabetes. (2002) 51: 514-521. [61] Pacher P., Mabley J. G., Soriano F. G., Liaudet L., Komjati K., Szabo C.: Endothelial dysfunction in aging animals: the role of poly(ADPribose) polymerase activation. Br. J. Pharmacol. (2002) 135:13471350. [62] Pacher P., Mabley J. G., Soriano F. G., Liaudet L., Szabo C.: Activation of poly(ADP-ribose) polymerase contributes to the endothelial dysfunction associated with hypertension and aging. Int. J. Mol. Med. (2002) 9:659-664. [63] Pease, D. C.: Histological techniques for electron microscopy, 2nd Ed., Academic Press Inc, New York. (1964). [64] Rigel D. S., Friedman R. J., Kopf A. W.: Lifetime risk for development of skin cancer in the U.S. population: current estimate is now 1 in 5. J. Am. Acad. Dermatol. (1996) 35:1012-1013. [65] Rougier A.: Are UVA rays dangerous? In.:Protection of the skin ultraviolet radiations. ed. by Rougier A. and Schaefer H.John Libbey Eurotext, Montrouge, London, Rome, Paris, (1998) 1-9. [66] Rünger T. M.: Role of UVA in the pathogenesis of melanoma and nonmelanoma skin cancer. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. (1999) 15:212-216. [67] Satoh M. S., Lindahl T.: Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. (1992) 356:356-358. [68] Satoh M. S., Poirier G. G., Lindahl T.: Dual function for poly(ADPribose) synthesis in response to DNA strand breakage. Biochemistry. (1994) 33:7099-7106.

64

[69] Satoh M. S., Poirier G. G., Lindahl T.: NAD(+)-dependent repair of damaged DNA by human cell extracts. J. Biol. Chem. (1993) 268:5480-5487. [70] Schwartz A., Stander S., Berneburg M., Bohm M., Kulms D., van Steeg H., Grosse-Heitmeyer K., Krutmann J., Schwarz T.: Interleukin-12 suppresses ultraviolet radiation-induced apoptosis by inducing DNA repair. Nat. Cell. Biol. (2002) 4:26-31. [71] Shah G. M., Poirier D., Duchaine C., Brochu G., Desnoyers S., Lagueux J., Verreault A., Hoflack J. C., Kirkland J. B., Poirier G. G.: Methods for biochemical study of poly (ADP-ribose) metabolism in vitro and in vivo. Anal. Biochem. (1995) 227:1-13. [72] Shall S.: ADP-ribosylation reactions, Biochimie. (1995) 77:313-318. [73] Sims J. L., Berger S. J., Berger N. A.: Poly-(ADP-ribose) polymerase inhibitors preserve nicotinamide adenine dinucleotide and adenosine 5’-triphosphate

pools

in

DNA-damaged

cells:

mechanism

of

stimulation of unscheduled DNA synthesis. Biochemistry. (1983) 22:5188-5194. [74] Smulson M., Istock N., Ding R., Cherney B.: Deletion mutants of poly(ADP-ribose) polymerase support a model of cyclic association and dissociation of enzyme from DNA ends during DNA repair. Biochemistry. (1994) 33:6186-6196. [75] Soriano F. G., Virag L., Jagtap P., Szabo E., Mabley J. G., Liaudet L., Marton A., Hoyt D. G., Murthy K. G., Salzman A. L.: Diabetic endothelial dysfunction: the role of poly (ADP-ribose) polymerase activation. Nat. Med. (2001) 7:108-113. [76] Steenvoorden D. P. T., Beijersbergen G. M. J.: The use of endogenous antioxidants to improve photoprotection, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. (1997) 41:1-10. [77] Sundberg J. P.: Handbook of mouse mutations with skin and hair abnormalities. CRC Press. Boca Raton, Ann Arbor, London Tokyo. (1994) pp.:291-310. [78] Szabados E., Literati-Nagy P., Farkas B., Sümegi B.: BGP-15, a Nicotinic Amidoxime Derivate Protecting Heart from Ischaemia

65

Reperfusion

Injury

through

Modulation

of

Poly

(ADP-ribose)

Polymerase. Biochemical Pharmacology (2000) 59:937-945. [79] Szabo C., Dawson V. L.: Role of poly(ADP-ribose) synthetase in inflammation and ischeamia-reperfusion. Trends Pharmacol. Sci. (1998) 19:287-298. [80] Szabo C., Virag L., Cuzzocrea S., Scott G. S., Hake P., O’Connor M. P., Zingarelli B., Salzman A., Kun E.: Protection against peroxynitriteinduced fibroblast injury and arthritis development by inhibition of poly(ADP-ribose) synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95:3867-3872. [81] Szabo C.: Potential role of the peroxynitrite-poly (ADP-ribose) synthetase pathway in a rat model of severe hemorrhagic shock. Shock (1998) 9:341-344. [82] Szabo E., Virag L., Bakondi E., Gyure L., Hasko G., Bai P., Hunyadi J., Gergely P., Szabo C.: Peroxynitrite production, DNA breakage and poly(ADP-ribose)polymerase activation in a mause model of oxazolone-induced contact hypersensitivity. J. Invest. Dermatol. (2001) 117:74-80. [83] Vigh L., N. Literati P., Horvath I., Torok Zs., Balogh G., Glatz A., Kovacs E., Boros I., Ferdinandy P., Farkas B., Jaszlits L., Jednakovits A., Koranyi L., Maresca B.: Bimoclomol: A nontoxic, hydroxylamine derivative with stress protein-inducing activity and cytoprotective effects. Nat. Med. (1997) 3:1150-1154. [84] Virag L., Bai P., Bak I., Bakondi E., Szabo E., Liaudet L., Gergely P., Szabo C.: Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase attenuates leukocyte migration in an ovalbumin-induced asthma model in mice.(Abstract). FASEB J. (2002) 16: A674. [85] Virag L., Salzman A. L., Szabo C.: Poly(ADP-ribose) synthetase activation mediates mitochondrial injury during oxidant-induced cell death. J. Immunol. (1998) 161:3753-3759. [86] Virag L., Scott G. S., Cuzzocera S., Marmer D., Salzman A. L., Szabo C.:

Peroxynitrite-Induced

Thymocyte

Apoptosis:

the

Role

of

66

Caspases and Poly (ADP-Ribose) Synthetase (PARS) Activation. Immunology (1998) 94:345-355. [87] Virag L., Szabo C.: The therapeutic potential of poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol. Rev. (2002) 4:375-429. [88] Virag L., Szabo É., Bai P., Gergely P., Hunyadi J., Szabo C.: Nitric oxide peroxynitrite-poly(ADP-ribose) polymerase pathway in the skin. Exp. Dermatol. (2002) 11:189-202. [89] Yarosh D., Klein J., O'Connor A., Hawk J., Rafal E., Wolf P.: Effect of topically applied T4 endonuclease V in liposomes on skin cancer in xeroderma pigmentosum: a randomised study. Lancet (2001) 357:926-929. [90] Young A. R., Chadwick C. A., Harrison G. I., Nikaido O., Ramsden J., Potten C. S.: The similarity of action spectra for thymine dimers in human epidermis and erythema uggest that DNA is the chromophore for erythema. J. Invest. Dermatol. (1998) 111:982-988. [91] Young A. R., Walker S. L.: Sunscreens: Photoprotection of nonerythema endpoints relevant to skin cancer. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. (1999) 15:221-225. [92] Zdenko H., Wang Z. Q.: Functions of poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death. Mut. Res. (2001) 477:97-110. [93] Zhang J., Li J. H.: Poly(ADP-ribose)polymerase inhibition by genetic and pharmacological means. In: Szabó C (ed), Cell Death: the Role of PARP. Pharmacology & Toxicology Series, Boca Raton, London, New York, Washington, CRC Press, (2000) pp:209-230. [94] Ziegler A., Jonason A. S., Leffell D. J., Simon J. A., Sharma H. W., Kimmelman J., Remington L., Jacks T., Brash D. E.: Sunburn and p53 in the onset of skin cancer. Nature (1994) 372:773-776. [95] Zingarelli B., Cuzzocrea S., Zsengeller Z., Salzman A. L., Szabo C.: Protection against myocardial ischemia and reperfusion injury by 3aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase. Cardiovasc. Res. (1997) 36:205-215.

67

RÖVIDÍTÉSEK 8-MOP: ABC: ADP: ATP: AMD: BRCT: CPD: CTL: DBD: DEVD: DNS: ECL: He: IL-10: MED: NAD+: NK sejtek: NLS: PARG: PARP: RNS: ROS: SIS: SPF 30: TNFα: UV:

8-metoxipsoralen avidin-biotin complex adenozin monofoszfát adenozin trifoszfát automodifikációs domén breast cancer susceptibility protein C terminus ciklobután-pirimidin-dimerek citotoxikus T limfocita DNS kötő domén kaszpáz hasító hely dezoxiribonukleinsav enhanced chemiluminescence system hematoxillin-eozin interleukin-10 minimális eritéma dózis nikotinsavamid természetes ölősejtek nukleáris lokalizációs szignál poli(ADP-ribóz) glükohidroláz poli(ADP-ribóz) polimeráz ribonukleinsav reaktív oxigén gyök skin immune system sun protection factor tumor nekrózis faktor-α ultraibolya

68

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném köszönetemet és hálámat kifejezni mindazoknak, akik e munka elvégzésében, Ph.D. értekezésem megírásában szakmai és baráti tanácsaikkal segítettek. Prof. Dr. Sümegi Balázsnak és a PTE ÁOK Biokémiai Intézet összes dolgozójának, akik kutatói pályámon elindítottak és munkámat mindvégig segítették. Prof. Dr. Farkas Beatrixnak, a PTE Bőr-, Nemikórtani és Onkodermatológiai Klinika tanszékvezető egyetemi tanárának, aki Ph.D. munkám megírására ösztönzött és akinek vezetése alatt végeztem tudományos munkámat. Dr. Magyarlaki Márta és Dr Zombai Erzsébet adjunktusnőknek a szövettani, immunhisztológiai és elektronmikroszkópos felvételek elkészítéséért és értékeléséért. Stein Anikónak és Kavas Máriának a szőrtelen egerekkel végzett kísérleteimben nyújtott segítségükért. Hálámat szeretném kifejezni családomnak támogatásukért, megértésükért és szeretetükért. A kísérletekhez megvalósításához támogatást nyújtottak: az OTKA, az ETT, a DAAD-MÖB, valamint az N-Gene Research Laboratórium.

69

A szerző tudományos közleményei: Petykó Z., Lénárd L., Sümegi B., Hajnal A., Csete B., Faludi B., Jandó G.: Learning disturbances in offspring of Zidovudine (AZT) treated rats. Neurobiology 5:83, 1997. Szabados E., Fischer G.,Toth K., Csete B., Nemeti B., Trombitás K., Habon T., Endrei D., Sumegi B.: Role of reactive oxygen species and poly-ADP-ribose polymerase in the development of AZT-induced cardiomyopathy in rat. Free Radical Biology and Medicine 26:309, 1999. Farkas B., Sümegi B., Csete B., Szekeres Gy.: Novel poly(ADP)-ribose polymerase inhibitor with photoprotective activity. J Invest Dermatol 113:438, 1999. Farkas B., Sümegi B., Rablóczky Gy., Csete B., Hodosi B., Magyarlaki M., Bernáth S., Literáti Nagy P.: Protecting utilities of PARP inhibitors. Chapter 13, CRC Press, Boca Raton, 2001. Farkas B., Magyarlaki M., Csete B., Németh J., Rabloczky Gy., Bernáth S., Literáti Nagy P., Sümegi B.: Reduction of acute photodamage in skin by topical application of a novel PARP inhibitor. Biochem. Pharmacology, 63: 1-12, 2002. B. Farkas, B. Sümegi, Gy. Rabloczky, B. Csete, B. Hodosi, M. Magyarlaki, S. Bernáth, P. Literáti Nagy: Protecting Effect of PARP Inhibition on Ultraviolet Light-Induced Skin Damage. Pp.: 257-271, In: Edit.: Jie Zhang: PARP as a therapeutic Target. CRC Press, London, New York, Washington, 2002

70

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Human papilloma virus infection

leading

to

social

exclusion.

Ann.

Dermatol.

Vénéréol. 129: 681, 2002. Hodosi B., Csete B., Zombai E., Farkas B.: Chronic actinic dermatosis combined with allergy against occupational factors. Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 1724, 2002. Csete B., Németh J., Farkas B.: Giant multiplex condiloma acuminata, acanthosis nigricans, and insulin resistant diabetes mellitus Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 842, 2002. Farkas B., Csete B., Magyarlaki M., Bernáth S., Sümegi B.: Topical Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) regulator and its prospects for use. Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 91, 2002. Csete B., Magyarlaki M., Rablóczky Gy., Sümegi B., Farkas B.,: Novel Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) regulator in sun protection J. Eur Acad Derm. Vener. 17 (Suppl. 1.) :64, 2003. Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator in chronic UVA-damage JDDG Supplement 1: 16, 2003.

71

A szerző kongresszusi előadásainak jegyzéke: Csete B., Skuta G., Fischer G., Sümegi B.,: AZT induced cardiomyopathy

in

rats.

XIII.

International

Student

Conference, Istanbul, 1997. Csete B., Farkas B., Sümegi B.: AZT induced mitochondrial DNA fragmentation. Congress of Hungarian Dermatologycal Society, Budapest, 1997. Csete B., Péter I., Farkas B. : PCR-Chlamydia diagnosis by psoriatic and autoimmun patients. Annual meeting of Hungarian Dermatologycal Society, Lillafüred, 1998. Csete B., Fábos B., Nagy Gy., Farkas B.: Therapyresistent pyoderma gangrenosum treated with Sandimmun NeoralR. Congress of Young Dermatologist, Kecskemét, 2000. Csete Béla, Szabados Eszter, Farkas Betarix, Sümegi Balázs: Role of PARP in the development of AZT induced tissue

damage.

Annual

meeting

of

Hungarian

Dermatologycal Society, Lillafüred, 2001. Csete B., Zombai E., Farkas B.: Human papilloma virus infection leading social exclusion. Annual meeting of Hungarian Dermatologycal Society, Debrecen, 2002. Csete B., Zombai E., Farkas B.: Humán papilloma virus infection leading to social exclusion. XX. World Congress of dermatology, 2002. Paris

72

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Florid cutaneous and mucosal papillomatosis. DUDG 2002. Düsseldorf Csete Béla, Zombai Erzsébet, Kádár Zsolt, Farkas Beatrix: Calcinosis cutis Congress of Hungarian Dermatologycal Society, 2002. Budapest Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator in chronic UVA-damage 42. Tagung der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft 2003. Berlin Csete

B.,

Zombai

E.,

Farkas

B.

Társadalmi

kirekesztettséghez vezető florid cutan papillomatosis Annual Meeting of Hungarian Dermatologycal Society, 2003. Szeged Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator on UV light induced photodamage. Tagung der DeutschenUngarischen Dermatologischen Gesellschaft 2004. Pécs Csete B., Lengyel Zs., Kádár Zs., Battyáni Z.: Poly(Adenosine Diphosphate-Ribose) Polymerase-1 expression in cutaneous malignant melanomas as a new molekular marker of agressive tumors. Pathol Ocol Res 2008. Aug. 28. ( Epub ahead of print)

73

1. Táblázat

PARP-regulátor (BGP-15M) hatása a bőr sejtjeinek napfény expozíció indukálta DNS károsodására

Kezelés típusa (n = 5 állat / csoport)

Nem károsodott DNS %-os aránya a bőrben

Kezeletlen (kontroll)

80,7 ± 6

15% BGP-15M krém

78,1 ± 7

Vivőanyag + UV

26,5 ± 4**

15% BGP-15M + UV

52,4 ± 5*

Intenzív napfény expozíciónak kitett egérbőrben az egyes láncú DNS töréseket alkalikus pH-n történő, DNS lánc szétcsavarodásán alapuló, fluoreszcenciás módszerrel határoztuk meg. A kapott értékek (átlag ± SEM) a kettős láncú (nem károsodott) DNS %-os arányát fejezik ki. Az eltérés a vivőanyaggal (2 mg/cm2) előkezelt, napfény besugárzott mintákhoz képest szignifikáns, *p < 0,01, a kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

74

2. Táblázat

BGP-15M protektív hatása az UVB-indukálta, eritéma, ödéma és „sunburn” sejt képződésre egérbőrben

Eritéma

Ödéma

átlag ± SEM

átlag ± SEM

„Sunburn”-sejt/ mm epidermisz átlag ± SD

Kezeletlen kontroll

0

0

0,5 ± 0,2

Vivőanyag + UVB

2,8 ± 0,2

1,2 ± 0,3

37,4 ± 1,4

0,7 ± 0,3**

0,3 ± 0,2 *

8,8 ± 0,4*

Kezelés

5% BGP-15M + UVB 10% BGP-15M + UVB

0

0

1,6 ± 0,3**

15% BGP-15M + UVB

0

0

1,1 ± 0,4**

Különböző koncentrációjú BGP-15M krémmel, ill. vivőanyagával előkezelt, egyszeri UVB-irradiációban (2 MED) részesített egérbőrben észlelt klinikai tüneteket 5 pontos skála szerint értékeltük. A „sunburn” sejt képződés kvantitatív meghatározása He-festéssel, csoportonként 80 látótér vizsgálatával történt. A kapott értékek (átlag ± SD) 6 állatra vonatkoznak. A vivőanyaggal előkezelt UVB-irradiált bőrben észleltekhez képest az eltérés szignifikáns, *p < 0,01, ill. **p < 0,001.

75

3. Táblázat BGP-15M krém kezelés hatása a bőr PARP-enzim poli ADP-ribozilációjára a bőrben

Kezelés formája

Kezeletlen kontroll

Jelintenzitás mértéke (átlag ± SEM)

2±1

Vivőanyag + UV

51 ± 6**

10% BGP-15M krém + UV

23 ± 2*

Vivőanyag + UV

48 ± 4**

20% BGP-15M krém + UV

21 ± 3*

Vivőanyag + UV

47 ± 5**

PARP (pozitív kontroll)

52 ± 4

Különböző koncentrációjú BGP-15M krémmel, ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2), UV-besugárzott egérbőrben (n=5 állat/csoport) az ADP-riboziláció mértékét a Western-bloton kapott jelek intenzitásának kvantitatív meghatározásával („Image Tool image processing” program) végeztük. Az értékeket átlag ± SEM formájában fejeztük ki. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt, UV-besugárzott mintákhoz képest szignifikiáns, *p < 0,01. A kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

76 4. Táblázat A BGP-15M kezelés hatása a bőr krónikus UVA-besugárzás indukálta klinikai tüneteire A PARP-regulátor hatását „forszírozott UVA”-kezelésben (8-MOP+UVA), ill. UVA-irradiációban részesített, vivőanyaggal, ill. 15% Kezelés

Eritéma Pigmentáció Erózió Exulceráció Tumor Idő - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP (hét) + VEH. BGP + VEH. BGP + VEH. BGP + VEH. BGP + VEH. BGP UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA 4 2.80 4.00 3.80 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.20 0.40 0.40 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.30 0.36 0.30 - 0.16 0.20 0.32 8 3.67 4.67 4.67 0.00 0.00 0.33 0.33 0.00 1.00 1.67 1.67 0.00 0.00 0.33 0.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.30 0.19 - 0.19 0.30 - 0.25 0.19 0.19 - 0.19 0.15 12 4.50 4.67 4.50 0.00 0.50 1.83 1.80 0.00 1.60 2.83 3.00 0.17 0.17 2.67 2.33 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.30 0.19 0.20 - 0.30 0.43 0.16 - 0.20 0.15 0.23 0.15 0.15 0.19 0.30 16 3.67 2.67 2.83 0.17 1.83 2.50 2.33 0.83 1.80 1.83 1.83 0.00 1.67 3.33 3.33 0.00 0.67 2.00 1.50 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.19 0.15 0.15 0.15 0.30 0.19 0.15 0.16 0.15 0.15 - 0.19 0.30 0.30 - 0.19 0.33 0.30 20 2.33 1.67 1.83 0.00 2.33 3.00 2.83 1.17 0.40 0.83 0.67 0.00 1.67 2.50 2.50 0.00 1.50 3.67 3.17 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.19 0.15 - 0.30 0.33 0.15 0.15 0.20 0.15 0.15 - 0.19 0.20 0.20 - 0.30 0.56 0.28 26 1.00 0.83 0.67 0.00 3.17 3.67 3.67 1.83 0.40 0.33 0.50 0.00 2.17 0.50 0.33 0.00 3.17 4.50 4.33 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.23 0.15 0.19 - 0.43 0.19 0.19 0.15 0.20 0.19 0.20 - 0.15 0.20 0.19 - 0.36 0.30 0.30 BGP-15M krémmel előkezelt tesztterületeken vizsgáltuk (n=6 állat/csoport). A krónikus fénykárosodás klinikai tüneteit 6 fokozatú skálán (nincs-nagyon súlyos) értékeltük. A kapott értékeket átlag ± SEM formájában fejeztük ki.

77

5. Táblázat Tumorok előfordulása krónikus UVA-besugárzott szőrtelen egereken

Kezelési formák

Idő MOP (hét)

-

UVA UVA -

-

MOP

MOP

MOP

-

-

UVA

UVA

-

-

-

Vivőa.

BGP-15M

Vivöa.

BGP-15M Kontroll

1. hét 0 0 0 0 0 0 2. hét 0 0 0 0 0 0 3. hét 0 0 0 0 0 0 4. hét 0 0 0 0 0 0 5. hét 0 0 0 0 0 0 6. hét 0 0 0 0 0 0 7. hét 0 0 0 0 0 0 8. hét 0 0 0 0 0 0 9. hét 0 0 0 0 0 0 10. hét 0 0 0 0 0 0 11. hét 0 0 0 0 0 0 12. hét 0 0 0 0 0 0 13. hét 0 0 0 0 0 0 14. hét 1 0 0 0 0 0 15. hét 4 2 3 0 0 0 16. hét 6 4 5 0 0 0 17. hét 6 4 5 0 0 0 18. hét 6 4 6 0 0 0 19. hét 6 5 6 0 0 0 20. hét 6 5 6 0 0 0 21. hét 6 5 6 0 0 0 22. hét 6 5 6 0 0 0 23. hét 6 5 6 0 0 0 24. hét 6 6 6 0 0 0 25. hét 6 6 6 0 0 0 26. hét 6 6 6 0 0 0 n=6/csoport, UVA-kezelés formája: 5x0,5J/cm2/hét; időtartam: 26 élő, tumoros állatok számát tüntettük fel

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 hét; az

78

1. Ábra

Napfény penetrációja a bőrbe (hullámhossz növekedésével a penetráció mélysége nő)

Ultraibolya Ultraviolet C B A C B A400 200

Subcutis

Dermis

Epidermis

200

Visible

Látható

Infrared

Infravörös

500 600 700 800 900

1200

400 500 600 700 800 900 1200

nm

79

2. Ábra

A fény negatív hatásainak molekuláris mechanizmusa

UV fény

direkt (UVB)

bőrsejt DNS

DNS-károsodás

timin dimerek

indirekt (UVA) DNS-repair (NER)

DNS-károsodás akkumulációja fotokarcinogenezis

ROS

80

3. Ábra

Hairless egér

81

4. Ábra

PARP-regulátor (BGP-15M) hatása a napfény (UV-tartomány) indukálta DNS károsodásra a bőrben

% 100 90

Nem károsodott DNS

80 70 60

*

50 40

**

30 20 10 0 Kontroll

15% BGP-15M Vivőanyag 15% BGP-15M + + UV UV

kezelés módja

A 15% BGP-15M tartalmú krémmel vagy annak vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, intenzív UV-expozíciónak kitett egérbőrben az egyes láncú DNS töréseket alkalikus pH-n történő, DNS-lánc szétcsavarodásán alapuló, fluoreszcenciás módszerrel határoztuk meg. A kapott értékek (átlag ± SEM) 5 állatból vett bőrmintára vonatkoznak, és a kettős láncú (nem károsodott) DNS %-os arányát fejezik ki. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt UV-besugárzott mintákhoz képest szignifikáns, *p < 0,01. A kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

82

5. Ábra

PARP-regulátor hatása az UVB-sugárzás indukálta „sunburn” sejtek képződésére

"Sunburn" sejtek száma / mm epidermisz

%

40

30

20

10

* **

0

Kontroll

Vivőanyag 5% BGP + UV

**

10% BGP 15% BGP + + UV UV

kezelés

Különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (2 mg/cm2) előkezelt, UVB-besugárzott (2 MED) bőrben a „sunburn” sejtek kvantitatív meghatározását 24 órával az UVB-expozíció után vett bőrmintákból készült hematoxilin-eozinnal festett metszetben, a bazálmembrán 250 µm-es szakasza feletti epidermiszben, 16 látótér/állat végeztük. A kapott értékek (átlag ± SD) öt állatból vett bőrmintára (80 látótér/csoport) vonatkoznak. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt, UVBbesugárzott mintákhoz képest * p < 0,01, ill. ** p < 0,001 szinten szignifikáns.

83

6. Ábra

PARP-regulátor hatása a „sunburn” sejtek képződésére

1

2

3 A 10 % BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2), UVBbesugárzott (2MED) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: megtartott magszerkezetű keratinociták alkotják a hámot. 2: a hámban az alkotó sejtek struktúrája a kontrolléval megegyezik, „sunburn” sejt nem látható. 3: a hámban számos piknótikus, magfestés nélküli, ill. magtöredéket tartalmazó eozinofil „sunburn” sejt (nyilak) figyelhető meg. (He-festés, 400 x)

84

7. Ábra

UVB-sugárzás indukálta akut fénykárosodás ultrastruktúrális vizsgálata egérbőrben

1A

1B A BGP-15M krém vivőanyagával előkezelt, egyszeri 2 MED UVB-irradiációban részesített hairless egér bőrének EM képe: A: a bazális sejtrétegben fragmentált sejtmaggal, kondenzált kromatin állománnyal rendelkező „sunburn” sejt látható. A környező sejtek felé az intercelluláris kapcsolat nagyrészt megszakadt. (5000 x) B: a perinukleáris zónában számfeletti centroszómák figyelhetők meg. (20.000 x)

85

8. Ábra

PARP-regulátor hatásának ultrastruktúrális vizsgálata a bőr UVB-sugárzás indukálta akut fénykárosodásában

1A

1B Egyszeri, UVB-besugárzott (2 MED), 15% BGP-15M krémmel előkezelt egérbőr EM képe: A: mérsékelt intracelluláris ödéma (8000 x). B: a perinukleáris zónában számfeletti centroszóma nem látható (15.000 x)

86

9. Ábra

A PARP ADP-ribozilációjának meghatározása bőrben Western blot technikával

A PARP enzim ADP-ribozilációját a BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, napfény-expozíciónak kitett bőrből, közvetlenül a besugárzás után vett mintákban Western-blot analízissel határoztuk meg. Az ADPriboziláció mértékét a Western-bloton kapott jelek intenzitása fejezi ki: kezeletlen, nem besugárzott (natív) egérbőr (1. oszlop); pozitív kontroll: ADP-ribozilált PARP (2. oszlop); vivőanyaggal előkezelt, UV-besugárzott egérbőr (3. és 5. oszlop); 10% BGP15M krémmel előkezelt és UV-besugárzott (4. oszlop), valamint 20% BGP-15M krémmel előkezelt és UV-besugárzott bőr (6. oszlop).

87

10. Ábra

A PARP-regulátor hatása az egyszeri UVB-expozíció klinika tüneteire

A

B

1

A

B

2 BGP-15M tartalmú krémmel (5%, 10%, 15% és 20%) (A), ill. vivőanyagával (B) előkezelt (2mg/cm2), UVB-irradiált (2 MED) akut fénykárosodás klinikai tünetei az expozíció után 24 órával: 1-2 A: dermatitis solaris klinikai képe, 1B: enyhe eritéma, ödéma nélkül, 2B: tünetmentes bőr

88

11. Ábra A PARP-regulátor hatása a bőr akut fénykárosodására

1

2

3 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVBbesugárzott (2 MED) egérbőr: 1: kezeletlen kontroll: két sejtsoros hám. 2: megtartott szerkezetű hám, a dermiszben gyulladás nem látható. 3: ödémásan fellazult hámban számos, eozinofil festődésű, apoptótikus keratinocita („sunburn” sejt) látható, a papilláris dermiszben dilatált, duzzadt falú erek körül neutrofil granulociták. (He-festés, 200 x)

89

12. Ábra

A PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálata ismert fényvédő faktorú készítménnyel

U

A

B A

2 1

U

B

10% BGP-15M + UVB

3 PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálatát ismert fényvédő faktorú (SPF: 30, UVB/UVA), „AS” jelzésű készítménnyel végeztük (n=6 állat). 10% BGP-15M krémmel (B), ill. „AS” fényvédővel (A) előkezelt (2mg/cm2) és UVBbesugárzott (2 MED), valamint előkezelés nélkül UVB-irradiált (U) hairless egérbőr. 23 U: dermatitis solaris klinikai tünetei. 1-3 A,B: UVB-expozíció klinikai tünetet nem okozott. 1A-1B: 10% BGP-15M krém fotoprotektív hatása megegyezik az „AS” jelzésű, 30-as fényvédő faktorú készítményével.

90

13. Ábra

PARP-regulátor hatása a szoláris UV-expozíció akut klinikai tüneteire

A

15% BGP-15M + UV

Vehikulum

B

+ UV

Az egerek (n=5/csoport) tesztterületei az intenzív napfény expozíció előtt 10%, 15%, illetve 20% BGP-15M tartalmú krém (A), illetve vivőanyag (B) előkezelésben részesültek. Hairless egér bőre 24 órával az UV-irradiáció után: B: napégés klinikai tünetei (lividvörös eritéma, súlyos ödéma), A: 15% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés kivédte az intenzív UV-sugárzás akut bőrkárosító hatását.

91

14. Ábra

PARP-regulátor hatása a napégés hisztológiai tüneteire

1

2

3 10% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2), napfényexpozíciónak kitett egérbőr. 1: kezeletlen kontroll: megtartott szerkezetű hám, és irha. 2: kétmagsoros epidermis, a dermiszben gyulladás jelei nem észlelhetőek. 3: a hám nekrotizált, a felszínt vaskos fibrincsapadék borítja, alatta a dermisz felső részében széles sávban denz, főként neutrofil granulocitákból álló lobosodás figyelhető meg. (Hefestés, 200 x)

92

15. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr UVB-sugárzás indukálta krónikus fénykárosodására

1A

1B

2A

2B

A két (1), illetve hat héten át (2) UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2) hairless egerek (n=20 állat/csoport) tesztterületének klinikai vizsgálatával a vivőanyaggal kezelt bőrőn 1A: barnás-vörös eritéma, mérsékelt ödéma, 2A: vörösbarna, szürkésbarna pigmentáció és infiltráció figyelhető meg; a 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr 1B-2B: tünetmentes.

93

16. Ábra

PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fotokarcinogenezisre

tumoros állatok

% 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

6

12

18

19

20

21

22

23

32

hét

32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (BGP15M+UVB), ill. vivőanyaggal (vehikulum+UVB) előkezelt (2mg/cm2) hairless egerek bőrén vizsgáltuk a tumorok jelentkezését. A vízszintes tengelyen az időt, a függőleges tengelyen a tumoros állatok százalékos előfordulását tüntettük fel. A PARP-regulátorral kezelt állatokban a 32 hetes időtartam alatt tumor nem jelentkezett.

94

17. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr UVB-sugárzás indukálta krónikus fénykárosodására (18.-23. hét)

1B

1A

2A

2B

2C

A 18 (1) illetve 23 héten át (2) UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2) hairless egérek tesztterületének klinikai vizsgálata során, a vivőanyaggal előkezelt bőrön 1A: vörösbarnán pigmentált, infiltrált környezetben, 1,1 mm átmérőjű, félgömbszerűen kiemelkedő tumor, 2A: mediálisan, a felső és alsó harmadban 1,5 mm ill. 1,1 mm átmérőjű, szürkésbarnán pigmentált tumorok figyelhetők meg. 1B-2B: a 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr makromorfológiailag nem tér el a kezeletlen kontrolltól (2C).

95

18. Ábra

PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fotokarcinogenezisre a bőrben (32. hét)

1A

1B

2 1A: a 32 héten át vivőanyaggal (2mg/cm2) előkezelt, UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét) hairless egér tesztterületén számos, 0,5-3,0 mm átmérőjű, szürkéslividbarnán pigmentált tumor figyelhető meg. 1B: A 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr enyhe fokú, vörösbarna pigmentációt mutat, fénykárosodásra utaló tünet nem látható. 2: vivőanyaggal előkezelt, fénykárosodott egérbőr dermatoszkópos képe.

96

19. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

1

2

3 A 18 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, kóros eltérés nélkül. 2: a hám enyhén kiszélesedett. 3: az akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a hám szerkezete gócosan felbomlott, a felszínen hiper- és parakeratózis, a dermisz középső részében nagygócos mononukleáris sejtekből álló lobosodás észlelhető. (He-festés, 100 x)

97

20. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

1

2 A 26. héten vett szövetmintában az UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), vivőanyaggal előkezelt (2mg/cm2) egérbőrben, a dermiszben, a rugalmas rostok összecsapzódása és fragmentációja látható (1). A 32. héten vett bőrmintában a dermiszben a tumor környezetében a rugalmas rostok megkevesbedtek (2). (Orcein-Giemsa festés, 100 x)

98

21. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

1

2

3 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, az irhában megtartott rugalmas rosthálózattal. 2: a rugalmas rostok enyhe fokú megkevesbedése figyelhető meg. 3: a keratosis solarisnak megfelelő hámelváltozás alatt, a dermisz középső részében, a rostok kifejezett fragmentációt és összecsapzódást mutatnak. (Orcein-Giemsa festés, 200 x)

99

22. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta pigmentációjára

1

2

3 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, melanin pigment nélkül. 2: a bazális rétegben szakaszosan, illetve a dermisz felső részében melanofágokban figyelhető meg pigment tartalom. 3: az egyenetlenül kiszélesedett, és hiperkeratotikus hám bazális és szuprabazális részében, valamint a papilláris dermiszben nagy mennyiségű melanin tartalom mutatható ki. (Fontana-Masson festés, 100 x)

100

23. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

1

2

3 A 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, kóros eltérés nélkül. 2: a hám enyhén kiszélesedett, hipergranulózist mutat, a dermiszben kóros eltérés nem észlelhető. 3: a hám irregulárisan kiszélesedett, a szerkezet részleges, ill. teljes felbomlásával, atípusos sejtekből álló, a dermisz felső részébe infiltráló, leszakadó sejtcsoportokkal (invazív carcinoma spinocellulare), a tumor környezetében kifejezett lobosodással. (He-festés, 100 x)

101

24. Ábra

PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta IL-10 expresszióra

1

2

3 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVBbesugárzott (2 MED) egérbőr: 1: kezeletlen kontroll egér bőrében a faggyúmirigyek aspecifikus festődése figyelhető meg, IL-10 expresszió nem látható. 2: a kétmagsoros epidermisz IL-10-re specifikus immunfestődést nem mutat. 3: az epidermisz sejtjei intenzív pozitív IL-10 festődést mutatnak. (Poliklonális IL-10 ellenes antitest, ABCperoxidáz reakció, 200 x)

102

25. Ábra

PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta TNFα expresszióra

1

2

3 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVBbesugárzott (2 MED) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egér: TNFα expressziójára utaló pozitív festődés nem látható. 2: a megtartott szerkezetű hámban TNFα expresszió nem észlelhető. 3: az ödémásan kiszélesedett hám keratinocitáiban részben intracitoplazmatikus, részben sejtfelszíni, változó intenzitású TNFα expresszió látható. (Poliklonális TNFα ellenes antitest, ABC-peroxidáz reakció, 400 x)

103

26. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta p53 expressziójára

1

2

3A

3B

Kezeletlen kontroll egérbőr (1), 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 12: immunhisztokémiai vizsgálattal p53 expresszió nem látható. 3A: a keratosis solarisnak megfelelő epidermisz részletben foltos p53 nukleáris expresszió figyelhető meg. 3B: az invazív, dermiszbe infiltráló spinocellularis carcinoma sejtjei csaknem 100%-ban expresszálnak p53 antigént. (ABC-peroxidáz reakció, 200 x)

104

27. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodásának ultrastruktúrális tüneteire

A

B

C

D

A BGP-15M krém vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, 32 héten át UVBbesugárzott (5x0,25J/cm2/hét) egérbőr elektronmikroszkópos feldolgozása. A: több sejtrétegben a nukleáris kromatin eloszlás szabálytalan (3000 x). B: az intracelluláris térben mikrovillózus sejtfelszínek és kevés dezmoszóma látható (5000 x). C: számos centroszóma észlelhető a perinukleáris tág csatornák között (15000 x). D: a citoplazmában tonofibrillum fragmentumokhoz kötődve dezmoszóma struktúra figyelhető meg (6000 x).

105

28. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire

B

B

A

A

1

2

3 A hairless egerek tesztterületeit 4 héten át UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) (1A) részesítettük, melyet 8-MOP-pal történő fényérzékenyítés (1B) és 15% BGP-15M krémmel (2A) ill. vivőanyagával (2B) előkezelés (2mg/cm2) előzött meg. Egyes tesztterületek UVA-besugárzást nem kaptak (3). A „forszírozott UVA”-kezelés hatására a tesztterületeken (1B, és 2B) intenzív eritéma, ödéma jelentkezett erózióval. Az UVA-besugárzás (1A) kevésbé súlyos eritémát és ödémát idézett elő. A PARP-regulátor, 15% BGP-15M (2A) krém kivédte a Geroxalen® oldattal fényérzékenyített bőr, 10 J/cm2 UVAsugárzás indukálta károsodását, normál egérbőr képe látható, úgymint az UVAexpozícióban nem részesült (3) tesztterületeken (2A, 3).

106

29. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire (12. hét)

B B A A

1

2

3 A 12-hetes „forszírozott UVA”-besugárzás (30 J/cm2) után a PARP-regulátorral (15% BGP-15M krém) előkezelt tesztterület (2A) kivételével, ahol a normál bőr klinikai képét lehet megfigyelni, súlyos exulceráció jelentkezett (1B, 2B). Az UVA-besugárzott (1A) területen a fénykárosodás mértéke enyhébb. Az UVAexpozícióban nem részesült tesztterületeken (3) kóros eltérés nem volt.

107

30. Ábra

A PARP-regulátor hatása a „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta fotokarcinogenezisre hairless egérmodellben

Tumorok relatív gyakorisága

1.0 UVA+8-MOP

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

* * * * * *

UVA+ 8-MOP+BGP15M

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

hét hét

Logisztikus regresszió: Chi^2 = 0; A1= 0, A2 = 0, x0= 20,1, p = 27,5

A hairless egerek tesztterületeit 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően 15% BGP-15M krémmel, ill. vivőanyaggal előkezeltük, majd UVA-expozíciót (5x0,5J/cm2/hét) alkalmaztunk 26 héten át. A „forszírozott UVA”-kezelés hatására a vivőanyaggal (piros) előkezelt csoportban a 18. héttől tumorképződést észleltünk. A 26. hétre az UVA-sugárzásban részesített állatok mindegyike tumorral rendelkezett. A BGP-15M krémmel előkezelt (fekete) csoportban tumorképződést a vizsgált 26 hetes időszakban nem észleltünk.

108

31. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire (26. hét)

B

B

A

A

1

2

3 A 26 hetes „forszírozott UVA”-besugárzás (65 J/cm2) hatására a tesztterületeken (1B, 2B) húzó hegképződés, sötétbarna, különböző nagyságú tumorok jelentkezése, kifejezett pigmentáció látható. A PARP-regulátorral (15% BGP-15M krém) előkezelt tesztterület (2A) a normál bőr klinikai képét mutatja. Az UVA-besugárzott bőrön (1A) a gyulladásos komponens kifejezettebb, mint a 8-MOP+UVA-kezelteken, egyébként az elváltozások hasonlóak. Az UVAexpozícióban nem részesült tesztterületeken (3) allergiás, vagy irritatív eltérés nem jelentkezett.

109

32. Ábra

Tumorok kumulatív relatív gyakorisága

A PARP-regulátor hatása az UVA–besugárzás indukálta fotokarcinogenezisre egérbőrben

6 5 4

1. UVA

3

2. 8-MOP + UVA 3. 8-MOP + UVA + vivőanyag

2

4. 8-MOP + UVA + BGP-15M

1 0

2

20

30

40

50

60

70

UVA dózis, J/cm

Kolmogorov-Smirnov 2 mintás próba: K=n×m×Dnm =36, K>30, p=0,05

A hairless egerek tesztterületeit az ábrán feltüntetett módon kezeltük. Az egerek 5x0,5J/cm2/hét UVA-expozícióban részesültek 26 héten át. Tumorképződést legelőször 35 J/cm2 UVA összdózisnál észleltünk a 8-MOP + UVA csoportban. 60 J/cm2 UVA-besugárzás után az 1.-3. csoportban minden állatban tumorképződést észleltünk. A 2.-3. csoportban 40 J/cm2 dózisnál a relatív gyakoriság ugrásszerű emelkedését figyeltük meg. A BGP-15M krémmel kezelt csoportban a vizsgálat folyamán tumorképződést nem tapasztaltunk.

110

33. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP +UVA) indukálta krónikus fénykárosodás hisztológiai elváltozásaira

1

2

3 A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2), majd UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr. 2: a hám enyhén kiszélesedett, enyhe fokú hiperkeratózist mutat, az epidermiszben atípusos sejtek nem észlelhetők. 3: a kifejezett hiper- és parakeratotikus, akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a hám szerkezete gócosan felbomlott, in situ carcinomának megfelelő képet mutat. (He-festés, 100 x).

111

34. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus „forszírozott UVA”-kezelés indukálta rugalmas rost károsodásra egérbőrben

1

2

3 A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) előkezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: kronológiai öregedésnek megfelelően a rugalmas rostok megkevesbedése és enyhe feltöredezése, valamint a dermisz középső, alsó részében ciszták kialakulása látható. 2: a hám 5-8 sorosra kiszélesedett, a rugalmas rost hálózat enyhe fokú megkevesbedése figyelhető meg. 3: az in situ carcinoma környezetében rugalmas rost fragmentációt észleltünk. (OrceinGiemsa festés, 100 x)

112

35. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás hisztológiai elváltozásaira

1

2

3 A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: kronológiai életkornak megfelelő bőrszerkezet mellett pigmentet nem tartalmaz. 2: főként a hám bazális rétegében figyelhető meg a melanin pigment felszaporodása. 3: mind az epidermiszben, mind a dermiszben a melanofágokban jelentős a pigmentfelszaporodás. (FontanaMasson festés, 100 x)

113

36. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta p53 akkumulációjára

1

2

3 A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: p53 festődés nem figyelhető meg. 2: az enyhén kiszélesedett hámban atípusos sejtek nem észlelhetők, p53 nem mutatható ki. 3: kifejezett hiper- és parakeratotikus, akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a felbomlott szerkezetű atípusos sejteket tartalmazó részletek gócosan pozitív p53 magfestődést mutatnak. (Poliklonális p53 ellenes antitest, ABC-peroxidáz reakció, 200 x).

114

37. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta ultrastruktúrális elváltozásaira

1

3

2 A hairless egerek tesztterületeit 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVAbesugárzásban (összdózis: 10J/cm2) részesítettük. 1: kezeletlen normál egérbőr EM képe: lényeges kóros eltérés nem látható (5000 x). 2: megtartott szerkezet, kóros eltérés nélkül (3000 x). 3: az intercelluláris rések kiszélesedése figyelhető meg (3000 x).