PANNON EGYETEM, GEORGIKON KAR KESZTHELY
NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
A PARLAGFŰ GYOMBIOLÓGIAI VALAMINT EGÉSZSÉGÜGYI SZEMPONTBÓL LEGLÉNYEGESEBB TULAJDONSÁGAINAK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA
KÉSZÍTETTE: CSEH ANDRÁS ATTILA Agrárkémikus-agrármérnök
TÉMAVEZETŐ: DR. TALLER JÁNOS Tudományos főmunkatárs, Ph.D.
Keszthely 2010
1. A kutatómunka előzményei és célkitűzései
A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) invazív gyom Európában és hatalmas humán egészségügyi és gazdasági károkat okoz. Magyarországon az elsőszámú gyomnövény és a pollene a legveszélyesebb allergének közé tartozik. Az A. artemisiifolia Észak-Amerika déli területeiről származó egyéves növény. Az Egyesült Államokból, ahol 1838-ban fedezték fel mint gyomnövényt (Wagner és Beals 1958), többször is behurcolták Európába heremag, gabona és burgonya szállítmányokkal. Németországban már az 1800-as évek közepe táján regisztrálták, azonban nem honosodott meg (Hegi 1960). A gyors terjedés a második világháború után kezdődött el. Az európai inváziójának két központja volt: a kisebbik Délnyugat-Franciaországban, Lyon körzetében, a nagyobbik Délnyugat-Magyarország és Horvátország határos részein (Szigetvári és Benkő 2004). Az országos gyomfelvételezések adatai szerint a parlagfű 1947–53 között a borítottságot tekintve 0,39 %-kal még csak a 21. volt, de az 1996–1997. évi felvételezésen 4,7 %-kal a fontossági sorrendben már az első helyen végzett (Novák és mtsai 2009). Az elmúlt pár évtizedben szemtanúi lehettünk a molekuláris genetikai vizsgálati módszerek látványos fejlődésének. Ugyanakkor jelentősége ellenére, nemcsak hazai szinten, de világviszonylatban is kevés szakirodalom található a parlagfű molekuláris genetikai vizsgálatáról. Genton és munkatársai (2005) mikroszatellit markerekkel hasonlítottak össze észak-amerikai és franciaországi parlagfű populációkat. A franciaországi populációkban nagyobb genetikai változatosságot találtak mint az amerikaiakban, mely eredményből arra következtetnek, hogy több forrásból történhetett a parlagfű inváziója. Amerikában Patzoldt és mtsai (2001) és Tranel és mtsai (2004) vizsgálták az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia molekuláris genetikai okait az Ambrosia artemisiifolia, Xanthium strumarium, Amaranthus hybridus és az Amaranthus tuberculatus gyomfajokban. Ez a kevés eredmény meglehetősen érthetetlen, hiszen orvos-biológiai vonatkozású kutatások tömege jelzi a pollenallergia okozta probléma súlyosságát, de az allergiát kiváltó növény molekuláris genetikai természetének megismerésével mégsem foglalkoznak mélyebben. Ugyanakkor a gyomnövények herbicid rezisztenciájának megállapítása is gyorsabbá válna a DNS vizsgálatával és a genetikai információkra alapozott gyomirtási tanácsadás a jövőben új, ígéretes iránya lehet a növényvédelemnek.
2
1.1 Célkitűzések A fent említettek miatt, a jelen kutatási program célja a parlagfűről molekuláris genetikai információk gyűjtése, melyek felhasználhatóak további kutatásokhoz ill. közvetlenül
alkalmazhatóak
gyombiológiai
vizsgálatokhoz,
így
populáció-genetikai
összehasonlításokhoz, a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia gyors DNS szintű meghatározásához és az amb a I géncsalád pontosabb megismeréséhez. 2. Anyag és módszer 2. 1. Növényi anyag A populációgenetikai vizsgálatokhoz Kelet-Magyarországról Hódmezővásárhely közeléből, Nyugat-Magyarországról Keszthely térségéből, Kanadában Montreal környékén és az USA-ban Madison közelében gyűjtött parlagfű magokat használtunk. Referenciaként két napraforgó fajtát, az ’Iregi Szürke’ szabadelvirágzású fajtát és a ’Nova’ hibridet is bevontuk a vizsgálatokba. A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatánál 36 fogékony és 12 rezisztens növényt használtunk. A kezelést az atrazin 2,0 kg/ha-os dózisával közvetlenül a vetés után, preemergensen végeztük. A rezisztensnek tűnő mintákat minden esetben ugyanezzel a dózissal posztemergens kezelésben is részesítettük. Az ALS-A és ALS-B fragmentum szekvenciáját Keszthelyről, Hódmezővásárhelyről és Montreálból véletlenszerűen begyűjtött parlagfűvekben és egy napraforgóban (Nova hibrid) határoztuk meg. Az Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 cDNS-ekre tervezett primerek tesztelése Keszthelyről, Hódmezővásárhelyről, Montreal és Madison környékéről gyüjtött parlagfűvek DNS-én történt. 2. 2. Molekuláris vizsgálatok 2. 2. 1. DNS izolálás A DNS-t minden növényből Walbot és Warren (1988) eljárását követve izoláltuk, de kisebb módosításokat hajtottunk végre.
3
2. 2. 2. DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR) A PCR reakciót minden esetben Robocycler (Stratagene, USA) készülékben hajtottuk végre. A reakciókat Cseh és mtsai (2009) által leírtak alapján végeztük. A PCR profilt az alkalmazott primerek kapcsolódási hőmérsékletének és a felszaporítani kívánt termékek méretének megfelelően választottuk meg. 2. 2. 3. A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata Az organellum genomok vizsgálatánál Al-Janabi és mtsai (1994), Demesure és mtsai (1995), Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai (1989), Petit és mtsai (1998) és Wu és mtsai (1998) által kifejlesztett 12 db kloroplasztisz és a 12 db mitokondrium specifikus primer párt teszteltük. A restrikciós emésztésekhez 10 µl PCR terméket használtunk fel. A Taq I restrikciós enzimnél 65oC-os, a BstU I-nél 60 oC-os az Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I és az Rsa I-es restrikciós endonukleáznál 37 oC-os hőmérsékletet alkalmaztunk a gyártó (New England Biolabs, US) leírása szerint. 2. 2. 4. A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz A psbA gént tartalmazó 1800 bp nagyságú fragmentum amplifikációját a trnH és a trnK (Demesure és mtsai 1995) primerekkel végeztük. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát az f277 és az r277 (Cheung és mtsai 1993) primerek segítségével szaporítottuk fel. A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek közül a BstXI-es endonukleázból 8 unitot a MaeI-esből 3 unitot adtunk 10 µl PCR termékhez. A psbA gén szekvenálásához a trnK+r277 és a f277+trnH primer párokkal is felszaporítottuk a gén két felét. A PCR profilok megegyeztek a Cseh és mtsai (2009) által leírt profilokkal. A szekvenálás a 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA) történt. 2. 2. 5. A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR amplification of specific alleles) primerekkel A psbA gén 278 bp méretű mutációt tartalmazó darabját és a fogékony egyedekre jellemző 208 bp ill. a rezisztensekben felszaporodó 109 bp nagyságú fragmentumokat a PsbaF, PsbaR, BPMMF és BPMMR primereket egy reakcióban használva amplifikáltuk. A 4
PCR reakció az alábbiak szerint történt: 94oC 2 perc; 45 ciklus: 94oC 15 másodperc, 53oC 15 másodperc, 72oC 30 másodperc, végül 72oC 3 percig. 2. 2. 6. Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása és szekvenálása Az ALS-A és ALS-B régiók felszaporítása Patzoldt és mtsai (2001) által közölt primerekkel és PCR profil szerint történt. Az ALS-A fragmentumokat direkt szekvenáltuk 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA). Az ALS-B fragmentumokat a pGEMT Easy Vector System (Promega, USA) segítségével klónoztuk a gyártó leírása szerint, majd szekvenáltuk. 2. 2. 7. Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel Első lépésként Rafnar és mtsai (1991) által publikált primereket (RW38, RW45, RW32.1, RW32.2, RW32.3) teszteltük le. A három génváltozat elkülönítésére irányuló vizsgálatokat a PrimerSelect (DNAStar Inc., Madison, USA) (Amba 1-2E, Amba 1K, Amba 1-2E, Amba 2K, Amba 3E, Amba 3K) és Primer3 (Rozen és mtsai 2000) (Amba 1P530, Amba 1P1172, Amba 1P298, Amba 1P968, Amba 1-2P224, Amba 1-2P891, Amba 3P232, Amba 3P899) programokkal tervezett specifikus primerekkel végeztük. 2. 2. 8. DNS elválasztás gélelektroforézissel A különböző méretű DNS fragmentumok elválasztására agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk. A PCR és a restrikciós termékeket 1,5%-os agaróz (Promega, USA) gélen, a heteroplazmásság vizsgálatakor 2,5%-os Metaphor (Cambrex, USA) gélen választottuk szét. A kapott mintázatot, a Syngene GeneGenius géldokumentációs rendszerével detektáltuk és értékeltük. A fragmentumok méretét 50 bp-os és 100 bp-os súlymarkerhez (Fermentas, Litvánia) viszonyítottuk. 2. 2. 9. A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP viszgálatánál kapott restrikciós fragmentumok jelenlétét 1-esel a hiányát 0-ával jelöltük. Az így kapott binomiális mátrixot a Treecon 1.3b softver (Van de Peer és De Wachter 1994) segítségével elemeztük. 5
Kiszámoltuk a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrixot, majd ez alapján UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) dendogrammot készítettünk. A szekvenálásból kapott ABI fájlok szekvencia adatait a SeqMan (DNAStar Inc., Madison, USA) program segítségével illesztettük egymáshoz és határoztuk meg a pontmutációkat ill. a kódoló szekvenciák által meghatározott aminosavsorrendet. A nukleotid és aminosav szintű homológia kereséseket a BLAST program (Altschul és mtsai 1990) segítségével a http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html internetes oldalon végeztük el. 3. Új tudományos eredmények I.
Meghatároztunk négy kloroplasztisz és öt mitokondrium nem kódoló DNS régiót,
amelyek az univerzálisnak mondott primerekkel a parlagfűben is csak egyetlen PCR terméket amplifikálnak így alkalmazhatóak PCR-RFLP módszerrel végzett populáció genetikai vizsgálatokban. II.
A megbízhatóan amplifikálható kloropasztisz és mitokondrium szekvenciákat kilenc
restrikciós enzimmel emésztettük, így anyai öröklésű markereket fejlesztettünk. A markerek segítségével az Egyesült Államokból, Kanadából és Magyarországról származó parlagfűvek között meghatároztuk a genetikai távolságot. III.
Szekvenáltuk a parlagfű psbA kloroplasztisz génjét az atrazin rezisztens és szenzitív
egyedekből és bizonyítottuk, hogy a rezisztenciát a gén 790. bázispárjánál bekövetkezö pontmutáció (adenin/guanin) okozza. IV.
Restrikciós emésztésekkel bizonyítottuk, hogy a psbA gén rezisztens és szenzitív
változata is megtalálható a rezisztens parlagfüvekben, tehát a két kloroplasztisz genotípus heteroplazmásan van jelen. V.
Bi-PASA allél specifikus primereket terveztünk a psbA gén rezisztens és szenzitív
változatára, így az atrazin rezisztencia tesztek egyetlen PCR reakcióval elvégezhetőek. VI.
Magyarországi parlagfüvekben és a Nova napraforgó hibridben szekvenáltuk és
elemeztük az ALS-gátló herbicidek célgénjének A és B régióját. A parlagfű teljes ALS-B régió szekvenciáját ez a dolgozat közli először. 6
VII.
A parlagfű pollen allergén fehérjéjét kódoló amb a I gén első felét valószínűleg
amplifikáltuk szekvencia specifikus primerekkel magyarországi parlagfüvekből. Szekvencia specifikus primerekkel nem sikerült kimutatnunk a teljes gént, így közvetve bizonyítottuk a gén változékonyságát és azt, hogy a parlagfű genomban több helyen kódolt az Amb a I fehérje. 4. Irodalomjegyzék Al-Janabi S.M., McClelland M., Petersen C., Sobral B.W.S. (1994) Phylogenetic analysis of organellar DNA sequences in the Andropogoneae: Saccharinea. Theor. Appl. Genet. 88: 933-944. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410. Cheung W., Cote J., Benoit D., Landry B. (1993) A rapid assay for chloroplast-encoded triazine resistance in higher plants. Plant. Mol. Biol. Rep. 11: 142-155. Cseh A., Cernák I., Taller J. (2009) Molecular characterization of atrazine resistance in common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) Journal of Applied Genetics 50(4): 321–327. Demesure B. N., Sodzi R. J., Petit R. (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology 4: 129-131. Dumolin-Lapegue S., Bodenes C., Petit R. J. (1996) Detection of rare polymorphisms in mitochondrial DNA of oaks with PCRRFLP combined with SSCP analysis. For. Genet. 3: 227-230. Genton B. J., Shykoff J . A., Giraud T. (2005): High genetic diversity in French invasive populations of common ragweed, Ambrosia artemisiifolia, as a result of multiple sources of introduction. Molecular Ecology 14: 4275-4285. Hegi G. (1960) Illustrierte Flora von Mittel-Europa. 6., Lehmanns Verlag, München. 496-498. Hiratsuka J., Shimada H., Whittier R., Ishibashi T., Sakamoto M., Mori M., Kondo C., Honji Y., Sun C-R., Meng B-Y., Li Y-Q., Kanno A., Nishizawa Y., Hirai A., Shinozaki K., Sugiura M. (1989) The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: Intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals. Molecular and General Genetics 217: 185-194.
7
Nei M. és Li W. H. (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Acadademy of Science USA 76: 5269-5273. Novák R., Dancza I., Szentey L., Karamán J. (2009) Magyarország szántóföldjeinek gyomnövényzete. Ötödik Országos Szántóföldi Gyomfelvételezés. Témadokumentáció, Budapest Patzoldt W. L., Tranel P. J., Alexander A. L., Schmitzer P. R. (2001) A common ragweed population resistant to cloransulam-methyl Weed Science 49: 485-490. Petit R.J., Demesure B., Dumolin S. (1998) cpDNA and mtDNA primers in plants. In Molecular tools for screening biodiversity. Edited by A. Karp, P.G Isaac, and D.S. Ingram. Chapman and Hall, London. 256–261. Rafnar T., Griffiths I. J., Kuos M-c., Bonds J. F., Rogers B. L., Klapper D. G. (1991) Cloning of Amb a I (Antigen E), the major allergen family of short ragweed pollen. The Journal of Biological Chemistry 2: 1229-1236. Szigetvári Cs. és Benkő Zs. R. (2004) Ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.). In: Mihály B. és Botta-Dukát Z. Biológiai inváziók Magyarországon Özönnövények. Természetbúvár Alapítvány Kiadó, Budapest 337-370. Tranel P. J., Weilu J., Patzoldt W. L., Wright T. R. (2004) Intraspecific variability of the acetolactate synthase gene. Weed Science 52: 236-241. Van de Peer Y. és De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment Comput. Applic. Biosci. 10: 569-570. Wagner W. H. és Beals T. F. (1958): Perennial ragweeds (Ambrosia) in Michigan, with the description of a new intermediate taxon. Rhodora 60: 178-204. Walbot V. és Warren C. (1988) Regulation of Mu element copy number in maize lines with an active or inactive Mutator transposable element system. Mol. Gen. Genet. 211(1): 27-34. Wu J., Krutovskii K. V., Strauss S. H. (1998) Abundant mitochondrial genome diversity, population differentiation and convergent evolution in pines. Genetics 150: 1605–1614.
8
5. A doktori disszertációhoz kapcsolódó publikációk Idegen nyelvű cikkek: Cseh A., Cernák I. and Taller J. (2009) Molecular characterization of atrazine resistance in common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) Journal of Applied Genetics 50(4): 321–327. Impact factor: 1.351 Cseh A. and Taller J. (2008) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. Journal of Plant Diseases and Protection, Special Issue XXI, 389-394. Impact Factor: 0.566 Idegen nyelvű előadások: Cseh A. and Taller J. (2007) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. XIV. European Weed Research Society Symposium, Hamar, Norway, 173. Cseh A., Cernak I. and Taller J., (2006) Molecular genetic analysis of the most dangerous invasive weed of Middle- Europe, Ambrosia artemisiifolia L. International Symposium Intractable Weeds and Plant Invaders, Ponta Delgada, Portugal, 19. Magyar nyelvű cikkek: Cseh András és Taller János (2008) Herbicid célgének molekuláris genetikai vizsgálata az ürömlevelű parlagfűben (Ambrosia artemisiifolia L.) Magyar Gyomkutatás és Technológia 9(2): 57-69. Cseh András és Taller János (2008) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) genetikai diverzitásának vizsgálata az anyai öröklésű kloroplaszt és mitokondrium DNS-ének elemzésével. Magyar Gyomkutatás és Technológia 9(1): 56-57.
9
Magyar nyelvű előadások: Cseh A. és Taller J. (2008) Molekuláris genetikai vizsgálatok a parlagfűben. A Magyar Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság Növényorvosi Munkabizottsága konferenciája, Keszhely Taller J. és Cseh A. (2006) Hogyan járulhat hozzá a molekuláris genetika a parlagfű elleni védekezéshez? A Magyar Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság Növényorvosi Munkabizottsága konferenciája "A hazai gyomnövénykutatás legújabb eredményei", Keszthely Más témákban megjelent publikációk, előadások Idegen nyelvű cikkek: Molnár-Láng M., Cseh A., Szakács É., Molnár I. (2010) Development of a wheat genotype combining the recessive crossability alleles kr1kr1kr2kr2 and the 1BL.1RS translocation, for the rapid enrichment of 1RS with new allelic variation Theor. Appl. Genet. (accepted) Impact Factor: 3.49 Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome segment into cultivated wheat and its characterization with GISH, FISH and SSR markers. Cereal Research Communications 37: 321-324. Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to Macrophomina phaseolina in field trials. Cereal Research Communications 35: 333-336. Impact Factor: 1.190 Cseh A., Taller, J., Podmaniczky P., Kocsis L. (2006) Comparative analysis of the most wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite markers. Cereal Research Communications 34: 773-776. Impakt Faktor: 1.030
10
Idegen nyelvű előadások: Molnár-Láng M., Szakács É., Molnár I., Kruppa K., Sepsi A., Cseh A., Dulai S., Aranyi N., Hoffmann B. (2009) Molecular cytogenetic identification, physical mapping and phenotyping of wheat-barley introgression lines. 8th International Symposium in the Series, Recent advances in plant biotechnology, Szeged, Hungary Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome segment into cultivated wheat and its Characterization with GISH, FISH and SSR markers. VIII. AlpsAdria Scientific Workshop Neum, Bosnia-Herzegovina Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to Macrophomina phaseolina in field trials.VI. Alps-Adria Scientific Workshop, Obervellach, Austria Podmaniczky P., Győrffyné J. G., Cseh A., Taller J., Kocsis L. (2006) Genetic differences among roottstokcks derived from the Teleki’s seedlings. 9 International Conference on Grape Genetics and Breeding, Udine, Italy Cseh A., Taller J., Podmaniczky P., Kocsis L.(2006) Comparative analysis of the most wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite markers. V. Alps-Adria Scientific Workshop, Opatija, Croatia Magyar nyelvű cikkek: Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J. G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 252-256. Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza × árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és ssr-markerek segítségével. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 277-281.
11
Molnár I., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 337-341. Magyar nyelvű előadások: Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J. G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza × árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és SSR-markerek segítségével. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest
Molnár I., Cseh A. Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Cseh A., Csöndes I., Varga Zs., Taller J. és Fischl G. (2008) Genetikai vizsgálatok a Keszthely térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) és a Botryosphaerostroma visci populációiban. XIV. Növényvédelmi Tudományos Napok 2008, Budapest Cseh A., Varga Zs, Taller J, Cernák I, Fischl G (2006) Előzetes eredmények keszthely térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) populációk genetikai vizsgálatairól. XVI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely
12
