A PANCREAS SZIGETSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ KORAI EREDMÉNYEIT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK: AZ IZOLÁCIÓS ENZIMEK ÉS A REVASCULARISATIO VIZSGÁLATA Doktori tézisek Dr. Máthé Zoltán Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola
Programvezető:
Dr. Monos Emil c. egyetemi tanár, az MTA doktora
Témavezető:
Dr. Gerő László egyetemi tanár, az MTA doktora
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Tihanyi Tibor egyetemi tanár
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Somogyi Anikó egyetemi docens, Ph.D. Dr. Vörös Péter osztályvezető főorvos, Ph.D.
Opponensek:
Dr. Horányi János egyetemi docens, Ph.D. Dr. Vörös Péter osztályvezető főorvos, Ph.D.
Budapest 2007.
1
1. BEVEZETÉS
A diabetes mellitus mintegy 170 millió embert érint a világon és népbetegségnek számít a fejlett ipari országokban. Az I-es típusú
formájában szenvedő betegek között
huszonötször gyakoribb a vakság, tizenhétszer az idült veseelégtelenség, kétszer a cardiovascularis megbetegedés mint az átlagos népességben. A betegek mintegy 34%-a 15 éven belül végstádiumú veseelégtelenség állapotába kerül, 10%-uknál a súlyos angiopathia miatt végtagamputáció válik szükségessé. A diabeteses retinopathia a vakság fő oka a 20 és 60 év közötti korcsoportban. Az előrehaladt atherosclerosis következtében létrejött cardiovascularis
betegség
vezető
halálokként
szerepel
a
diabeteses
populációban.
Életkilátásuk, megfelelő kezelés nélkül, mintegy kétharmada az átlagos népességnek. A diabeteses betegek számának további jelentős növekedése várható az elkövetkező években, számuk 2030-ra megközelítheti a 366 milliót a WHO előrejelzése szerint.
A betegek
számának rohamos emelkedése miatt új terápiás lehetőségek kutatása időszerű.
A világszerte folyó intenzív kutatások ellenére a diabetes kezelése napjainkban sem megoldott. Az újabb klinikai tanulmányok megerősítik azt a feltevést, hogy a szénhidrát anyagcsere fiziológiás szabályozásának visszaállítása csak az inzulintermelő Langerhansszigetek transzplantációjával lehetséges. Ennek egyik formája a pancreasból izolált szigetek önálló transzplantációja, ami ígéretes fejlődésnek indult az ezredfordulón. Az Edmontonprotokoll kidolgozásával és bevezetésével ugyanis megváltoztak a betegszelekció szempontjai,
új
immunszuppressziós
szerek
kerültek
bevezetésre,
nemzetközi
együttműködések indultak. A módszer tömeges alkalmazását jelentős mértékben nehezíti azonban, hogy az izolációk mindössze 50-60%-ban lehetséges beültethető minőségű szigetet szeparálni, továbbá, hogy a transzplantációk korai szakában nagyfokú, gyakran a szigetek 4050%-át érintő, veszteség észlelhető. Ezért egy diabeteses beteg számára a fiziológiás szükségletnél nagyobb mennyiségű, általában két-három agyhalott donorból összegyűjthető sziget szekvenciális transzplantációja szükséges. A világszerte jellemző szervdonor hiány a fenti két probléma további elemzését és új, alternatív megoldások kidolgozását sürgeti.
A humán sziget izolációk egyik központi kérdése a pancreas szövet emésztéséhez nélkülözhetetlen
enzimek
változékonysága 2
és
sokszor
kiszámíthatatlansága.
Egy
szabályozható összetételű és pontosabban adagolható enzim bevezetése növelheti az izolációk eredményességét és javíthatja a szeparált szigetek életképességét. A jelen értekezés első részében egy ilyen új enzimkészítmény vizsgálatával foglalkozom. Az elmúlt évek kutatásai felhívták a figyelmet arra, hogy a Langerhans-szigetek komplex érrendszere az enzimatikus
izolációs folyamat során sérül és az elégtelen
vascularisatio egyik fő tényezője lehet a transzplantáció után észlelt korai szigetsejt veszteségnek. A szigetek ugyanis fejlett mikrovascularis hálózattal rendelkeznek és a megfelelő
működéshez
a
komplex
érrendszer
regenerációja
szükséges.
Ezért
a
revascularisatiot segítő tényezők kutatása hozzájárulhat a transzplantálandó szigetek számának csökkentéséhez és működésük javításához. A közelmúlt irodalmi adatai arra utalnak, hogy a tumor angiogenesisben fontosnak tartott vascularis endothelialis növekedési faktor, a VEGF-A a transzplantált szigetsejtek revascularisatiojában is kulcsszerepet játszik. Felmerült, hogy a lokális VEGF-A termelés fokozásával javítani lehetne a szigetek körüli angiogenesist és csökkenteni a transzplantációt követő szigetsejt veszteséget. Az értekezés második részében arra kerestem választ, hogy a fokozott VEGF expresszió hogyan befolyásolja a transzplantált szigetsejtek revascularisatioját és működését és szabályozható-e ez a folyamat gyógyszeresen?
3
2. CÉLKITŰZÉSEK
A jelen Doktori értekezés alapjául szolgáló munkák közös célja volt a humán sziget izolációk eredményességének javítása illetve a transzplantációt követő revascularisatio optimalizálása a korai szigetsejt veszteség csökkentése érdekében. Az értekezés első részében egy új humán izolációs enzimkészítményt vizsgáltam, második részében a fokozott VEGF expresszió hatásait elemeztem a szigetsejt transzplantációt követő revascularisatiora illetve endokrin működésre állatkísérletes modellben. Szem előtt tartva a kontrollálatlan VEGF szekréció potenciálisan káros hatásait, célom volt a VEGF expressziót és ezáltal a szigetsejt revascularisatiot gyógyszeresen szabályozható in vitro és in vivo modell kidolgozása is. Az enzimvizsgálatok során a következő kérdésekre kerestem választ:
1. Milyen a Collagenase NB1/Neutral Protease NB1 enzimkészítmények emésztő aktivitásának stabilitása a humán sziget transzplantációban általánosan elterjedt Liberase HI enzimmekkel összehasonlítva? 2. Különbözik-e a két enzimmel izolált humán szigetek mennyisége, morfológiája és apoptosisa? 3. Milyen az új enzimmel izolált szigetek in vitro inzulin elválasztása? 4. Milyen a két enzimmel izolált
szigetek in vivo endokrin funkciója állatkísérletes
modellben és melyek a kezdeti eredmények humán transzplantációk esetében?
A VEGF-expressziós kutatásokban a következő kérdéseket vizsgáltam:
5.
Milyen hatást gyakorol a fokozott VEGF-A
génexpresszió az izolált RIP-VEGF-A
transzgenikus egér szigetek in vitro inzulin elválasztására? 6. Javítják-e a RIP-VEGF-A homozigóta transzgenikus egerekből izolált szigetek diabeteses recipiensek szénhidrát anyagcseréjét a transzplantáció után?
4
a
7. Képes-e az általunk kialakított, genetikailag módosított CDM3D-TET-VEGF bétasejtvonal stabil in vitro VEGF-A szekrécióra ? 8. Hogyan befolyásolja a CDM3D-TET-VEGF béta-sejtek fokozott VEGF-A expressziója az in vitro angiogenesist endothel sejtekkel történő együttes sejtkultúra esetén? 9. Szabályozható-e ez a folyamat tetracyclin hozzáadásával in vitro? 10. Hatással van-e a genetikai módosítás a CDM3D-TET-VEGF béta-sejt szigetek glukózzal stimulált in vitro inzulin elválasztására? 11. Milyen a transzplantált CDM3D-TET-VEGF béta-sejt szigetek in vivo endokrin működése? 12. Hogyan befolyásolja a fokozott VEGF-A szekréció a transzplantációt követő szigetsejt revascularisatiot és ez milyen összefüggésben van az endokrin funkcióval? 13. Szabályozható-e tetracyclin hozzáadásával a CDM3D-TET-VEGF béta-sejtek lokális VEGF expressziója és következésképpen a szigetsejtek revascularisatioja a transzplantáció után?
5
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
3.1. A Collagenase NB1 enzimmel végzett összehasonlító vizsgálatok Kilenc humán szigetsejt izolációt végeztünk a Collagenase NB1/Neutral Protease NB1 (Serva Electrophoresis Gmbh, Heidelberg, Németország) enzimkombinációval (I. csoport). Adatainkat az általános gyakorlatban elterjedt Liberase HI (Roche-Boehringer-Mannheim, IN, US) enzimmekkel végzett kilenc humán izoláció eredményeivel hasonlítottuk össze (II. csoport). A pancreasokat különböző centrumokban távolították el agyhalott donorokból. A szállítás 4°C-os University of Wisconsin oldatban történt asepticus körülmények között. A szigetek izolációja a Genfi Szigetsejt Izolációs és Transzplantációs Központban történt minden esetben, módosított collagenase emésztéses félautomata Ricordi-módszerrel. Röviden: a fő pancreas vezetéket asepticus műtői körülmények között feltártuk, két irányban kanüláltuk, majd a szervet hideg (4ºC-os) enzimoldattal feltöltöttük kontrollált nyomást biztosító folyadék-adagoló pumpa segítségével. Az enzimatikus emésztés 37ºC-on történt, majd a folyamatot 4°C-os humán albumin oldattal állítottuk le. A szigetek szeparációját az emésztett exocrin szövettől hűtött COBE 2991-es sejtszeparátorral (COBE, Lakewood, US) végeztük folyamatas sűrűség grádiensű Ficoll cukoroldat alkalmazásával. Az izolációkat ugyanazon team végezte. Megvizsgáltuk, hogy egy pancreasból milyen mennyiségű sziget nyerhető ki. Elemeztük és összehasonlítottuk az izolált sziget equivalensek (IEQ) számát, tisztaságát, morfológiáját, vitalitását, in vitro funkcióját valamint a szigeteket alkotó sejtek apoptosisát. A szigetek számának és morfológiájának vizsgálatát fénymikroszkóppal végeztük. Az életképességet (vitalitását) fluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiphot, Felbach, Svájc) vizsgáltuk, fluorescein-diacetát és propidium-jodid (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) festéssel, az irodalomban elfogadott módszerek alapján. Az apoptosis vizsgálatokat 100-100 szigetsejt equivalensből 12 órás sejtkultúra után végeztük TUNEL módszerrel. Erre a célra Cell
Death
Detection
ELISA
kittet
(Roche-Boehringer-Mannheim,
Németország)
használtunk, amely az apoptosis miatt létrejövő és a cytoplasmában található microsomalis particulumokat (sejt lysatumok) detektálja. Az in vitro inzulin elválasztást 2,8 mmol/l-es, 25 mmol/l-es majd ismételten 2,8 mmol/l-es
glukóz stimuláció után vizsgáltuk 100 izolált
szigeten. A felülúszóban levő inzulin mennyiségét Ultrasensitive Human Insulin ELISA-val (Marcomedia AB, Uppsala, Svédország) mértük. A stimulációs indexet (SI) a basalis és a stimulációt követő inzulin elválasztás arányából kaptuk. Az akut inzulin választ (AIR) a stimulált és a basalis inzulin válasz különbségéből számítottuk. 6
Az izolált szigetek in vivo funkcióját állatkísérletes modellben és humán transzplantációk
során
vizsgáltuk.
Állatkísérleteinkben
streptozotocin-diabeteses
thymushiányos (nude) egereket használtunk recipiensként. Négy-négy humán szigetsejt preparátumból 1000 szigetsejt-equivalensnyi szigetet transzplantáltunk a kísérleti állatok bal vesekapszulája alá. A graftokat akkor tekintettük működőképesnek, ha a diabeteses recipiensek vércukorértéke 11 mmol/l alá csökkent a transzplantáció után és ez az érték legalább két napig fennállt. Kilenc (5+4) humán transzplantációt is végeztünk a két enzimmel izolált szigetekkel. A szigetek beültethetőségének kritériumai a következők voltak: 70%-ot meghaladó vitalitás, 30%-ot meghaladó tisztaság, minimum 5000 IEQ/recipiens testsúly kilogramm, kevesebb mint 10 ml-es végső térfogat és a végső preparátumból negatív Gram festés. A transzplantációk megoszlása és a recipiensek kiválasztása független volt a jelen vizsgálattól. A beültetés minden esetben percutan transhepaticus módszerrel történt a vena portae rendszerébe. A szigetsejt graftok funkcióját a beültetés előtti és a transzplantáció után egy hónap múlva szükséges napi külső inzulin mennyiség összehasonlításával vizsgáltuk.
3.2. A RIP-VEGF szigetekkel végzett vizsgálatok A RIP-VEGF transzgenikus egerek jellemzője, hogy a pancreas béta-sejtjeiben, a RIP (Rat-Insulin-Promoter) által szabályozott módon, szelektív humán VEGF-A termelésre képesek. Vizsgálatainkban homozigóta transzgenikus egerekkel dolgoztunk. A pancreas Langerhans-szigeteket kollagenáz módszerrel izoláltuk az irodalomban elfogadott módszerek alapján. Röviden összefoglalva: a szigetsejt donorokat intraperitonealis pentobarbital injekcióval elaltattunk, majd cervicalis dislocatiot végeztünk. A hasüreget megnyitottuk, a pancreast látótérbe hoztuk. A choledochust a máj felé egy fém klippel lefogtuk és distal felől kanülálva, 4°C-os, V-ös típusú collagenase-t tartalmazó (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) oldattal ((Hank’s balanced salt solution (HBSS), 2mg/7ml-es koncentrációban)) a pancreast feltöltöttük. Ezután eltávolítottuk és a jégen tárolt hideg enzim oldatba tettük. Ezt követően, 37°C-os melegvizes fürdőbe helyeztük 18 percre, ahol az enzim aktiválódott és megtörtént az emésztés. A szövetek szétválasztását erőteljes rázással tettük teljessé a folyamat végén. A túlemésztés megakadályozására a preparátumhoz hideg HBSS-t adtunk és ezáltal az emésztést leállítottuk. A készítményt 450 μm-es fémszűrőn átszűrtük, majd Euro-Ficoll cukoroldatban 800 g-al 16 percig centrifugáltuk a szigetek és az exocrin elemek szétválasztására. A szigetek tisztaságát és méretét dithizone (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) festés után ítéltük meg. 7
Ezt követően a szigeteket megszámoltuk. A különböző méretű szigeteket, egy erre a célra kifejlesztett képlettel, 150 µm-es szigetsejt-equivalensre (IEQ) konvertáltuk az irodalomban leírt módszer alapján. Az izolált szigetekkel in vitro glukóz stimulációs inzulin szekréciós vizsgálatot végeztünk a szigetek működésének megítélésére. RIP-VEGF-Tg egerekből és a kontroll csoportból izolált 50-50 szigetet, éjszakai inkubálást követően, 2,8mmol/l glukózt tartalmazó Krebs-Ringer bikarbonát (kontroll KRB) oldatban, 37ºC-on előinkubáltuk. Ezt követően, háromszor egy órás inkubációt végeztünk, egy órát friss kontroll KRB-vel, egy órát 16,7 mmol/l glukózt tartalmazó KRB-vel, majd ismételten egy órát kontroll KRB-vel. A felülúszó inzulin tartalmát ELISA-val (Mercodia, Svédország) mértük. A kísérleteket három-három mintán, háromszor ismételtük. Az izolált RIP-VEGF és a kontroll szigeteket streptozotocinnal (STZ, Sigma, Buchs, Svájc) (200 mg/kg i.p.)
diabetesessé tett syngenicus recipiensek bal vesekapszulája alá
transzplantáltuk 3500 IEQ/tskg mennyiségben. A vércukorszintet naponta mértük. Kísérletünk végpontja a diabeteses egerek vércukorszintjének
normalizálásáig eltelt idő
mérése és a kontrollcsoporttal történő összehasonlítása volt.
3.3. A CDM3D-TET-VEGF béta-sejtekkel végzett vizsgálatok A kísérletes munkánknak ebben a részében gyógyszeresen szabályozható VEGF-A szekréciót mutató béta-sejtvonalat hoztunk létre. Ehhez Dupraz és mtsai által módosított immortalizált egér inzulinoma sejtvonal (CDM3D) további genetikai átalakítását végeztük. A CDM3D sejtek Efrat és mtsai (Albert Einstein college, NY, US) által izolált és leírt βTC-tet sejtvonalból származó, immortalizált egér béta-sejtek, amelyek a genetikai módosítás révén, human bcl-2-t is expresszálnak. A stabil inzulin szekréciót mutató, adenovírus vektor felhasználásával tovább alakítottuk
CDM3D sejtvonalat
és ezáltal a VEGF-t fokozottan,
tetracyclinnel szabályozható módon expresszáló új, CDM3D-TET-VEGF béta sejteknek elnevezett sejtvonalat hoztunk létre. Vizsgáltuk és összehasonlítottuk az in vitro VEGF szekréciót, a glukóz stimulációra adott inzulinválaszt a fent leírt módon, valamint az in vitro angiogenesist az endothelsejtekkel történő együttes tenyésztés esetén.
A béta-
sejt/endothelialis sejtkultúrában, a sejteket (CDM3D, CDM3D-TET-VEGF), 10.000 ill. 35.000 sejt/üreg koncentrációban, 350μl kollagén gélre helyeztük. Ezt követte második rétegként, egy sejtmentes kollagénréteg illetve harmadikként a BME sejtek (100.000 sejt/üreg koncentrációban 500μl α-MEM/DMEM médiumban, 1:1 5%-os DCS hozzáadásával). A 8
kontrollhoz hasonlóan, a médiumot cseréltük és 5 nap múlva fixáltuk. Egyes esetekben egér rekombináns VEGF164-t semlegesítő ellenanyagot adtunk a rendszerhez 2ug/ml-es koncentrációban. (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Az endothelsejtekből kialakult új erek penetrációját a gélben véletlenszerűen kiválasztott mezőkben mértük az irodalomban leírt metodika szerint. Az eredmények kísérletenként legalább három adatsor átlagát és legalább két kísérlet adatait tükrözik. A béta-sejt szigeteket egy szintén syngenicus modell keretében streptozotocin diabeteses egerek vesekapszulája alá transzplantáltuk. Az átültetett sejtek működését, a, a vércukorszint rendszeres meghatározásával és intraperitonealis glukóz tolerancia teszttel (IPGTT) követtük az irodalomban elfogadott módszerek szerint. Röviden, 16 órás éhhomi állapot és vércukor mérés után intraperitonealis (i.p.) glukóz (2g/kg) injekciót adtunk, majd 15, 30, 60, 90 és 120 perc múlva ismételten megmértük a szérum glukóz szinteket. A szigetsejt graftokat tartalmazó veséket hat héttel a transzplantációt követően eltávolítottuk és szövettani vizsgálatokat végeztünk. Az in vivo tetracylines gátlás vizsgálatára két különálló kísérletsorozatot végeztünk. Az elsőben tetracyclinnel előkezelt (1ug/ml 48 órán át) kontroll béta-sejteket és TETVEGF sejteket transzplantáltunk diabeteses egerekbe. Ezt követően, a recipiensek folyamatos tetracyclin kezelésben részesültek (1mg/ml
az ivóvízben). A második
csoportban, a fenti két sejttípus átültetése mellett, a recipienseket csak akkor kezeltük tetracyclinnel (1mg/ml), ha a vércukorszint már normalizálódott a transzplantáció után. Mindkét csoportban IPGTT vizsgálatot is végeztünk. Hat kísérleti állatot vizsgáltunk minden csoportban. A statisztikai számításokhoz az SPSS 10.0 (SPSS Institute, Chicago, IL, USA) számítógépes programot használtuk. Az összehasonlító számítások Student-t próbával illetve ANOVA teszttel készültek. A különbséget p<0.05 esetén tartottuk szignifikánsnak. Kísérletes munkánkat Svájcban, a Genfi Egyetemi Központban végeztük, a helyi egyetemi tanács etikai engedélyével és az érvényben levő helyi és általános állatvédelmi előírások maradéktalan betartásával.
9
4. EREDMÉNYEK 1. Adataink alapján megállapíthatjuk, hogy a CollagenaseNB1/Neutral Protease NB1 enzimkészítmény gyártási vonalai stabilabbak és aktivitásuk kiszámíthatóbb a Liberase HI készítményeknél. A Collagenase NB1 enzimkombinációval végzett izolálások során minden esetben (9/9,100%) több mint 250x103 sziget equivalenst (IEQ) nyertünk ki. Ezzel szemben a Liberase HI csoportban ez csak 56%-ban (5/9) sikerült (p<0,05). Az egy gram pancreasra számított izolált szigetek száma szignifikánsan magasabb volt az első csoportban (4020+1240) mint a másodikban (2360+1350, p<0,05). A sziget equivalens és a szigetek számának aránya is, amely a szigetek valódi méretét tükrözi szignifikánsan magasabb volt az első csoportban (p<0,05).
2. A Collagenase NB1/Neutral Protease NB1 enzimkombinációkkal végzett izolációk során a szigetek morfológiai jellemzői jobban megmaradtak. Magasabb arányban tudtunk intakt és szabad szigeteket izolálni az I. csoportban (71+9% ill. 52+14%, p<0,01). Kevesebb fragmentált szigetet találtunk az első csoportban (14+11%) mint a Liberase HI csoportban (38+14%). A végső preparátum tisztasága is magasabb volt az első csoportban (62+6%) ill. 53+8%, p<0,05).
Az apoptoticus sejtek aránya szignifikánsan alacsonyabb volt az I.
csoportban (1,25±0,03% ill. 7,25±1,23%, p<0,05). A donorok tekintetében nem volt lényeges különbség a két csoport között, jóllehet a meleg ischaemiás idő átlaga kissé hosszabb volt az első csoportban.
3. Az izolált humán szigetek in vitro glukóz stimulációs inzulin elválasztása lényegében hasonló volt a két csoportban. Ugyanakkor, az akut inzulin válasz (AIR) lényegesen jobb volt az első csoportban (p<0,001).
4. Az izolált humán szigetek in vivo működését állatkísérletes transzplantáció során vizsgáltuk. Az izolált szigeteket (1000 IEQ) streptozotocinnal diabetesessé tett nude egerek bal vesekapszulája alá transzplantáltuk. Mindkét enzimmel izolált szigetek a transzplantációt követő 48 órán belül korrigálták a hyperglikemiát az összes recipiensnél és a különbség nem volt szignifikáns (1,2 nap+0,4 az első ill. 1,1+0,3 nap a második csoportban). Miután meggyőződtünk a Collagenase NB1-el izolált szigetek kiváló in vitro és in vivo működéséről előzetes humán transzplantációkat is végeztünk. Kilenc sziget izoláció után öt esetben végeztünk transzplantációt az első csoportban (56%), míg négy esetben a második 10
csoportban (44%). A transzplantált betegek napi exogén inzulin szükséglete több mint felére csökkent az első csoportban, míg ugyanezt mindössze két esetben észleltük a II. csoportban. Az átlagos napi inzulin szükséglet a transzplantáció előtt 38+10U/nap illetve 50+11U/nap volt a két csoportban. Egy hónappal a transzplantáció után ez 8+3U/napra illetve 32+13U/napra csökkent az első és a második csoportban. A különbség nem volt szignifikáns. Két beteg az első, míg egy beteg a második csoportból teljesen elhagyhatta a külső inzulint egy hónappal a transzplantáció után. Ezen kezdeti eredmények mindössze arra utalnak, hogy az új enzimmel izolált szigetek a humán transzplantációk vonatkozásában is működőképesek. A további következtetésekhez azonban nagyobb esetszám és részletesebb adatelemzés szükséges.
5. A homozigóta RIP-VEGF transzgenikus egerekből izolált szigetekkel végzett kísérletek során kapott eredményeink arra utalnak, hogy a VEGF-A fokozott szekréciója a betasejtekben nem befolyásolta lényegesen az izolált szigetek glukózzal stimulált in vitro inzulin elválasztását a kontrollcsoporthoz képest. 6. Adataink azt mutatják, hogy a RIP-VEGF-Tg szigetek in vivo funkciója a transzplantációt követően szignifikánsan jobb volt a kontrollcsoporténál. A transzplantált diabeteses állatok felének szérum glukóz szintje 26 nap után, a teljes csoporté átlagosan 39 nap után normalizálódott, ha a kontroll állatokból izolált szigeteket transzplantáltuk. Ezzel szemben, a Rip-VEGF egerekből izolált és transzplantált szigetek szignifikánsan (p=0,008) gyorsabban korrigálták a diabeteses egerek vércukorszintjét, így a recipiensek fele 16 nap után, a teljes csoport pedig 21 nap után vált normoglikaemiássá. Eredményeink arra utalnak, hogy a fokozott VEGF-A expresszió javítja a transzplantált szigetek implantációját, ami összefügghet a transzplantációt követő hatékonyabb revascularisatioval. 7. A genetikailag átalakított CDM3D-TET-VEGF béta-sejtekkel végzett méréseinkből megállapíthatjuk, hogy az új sejtvonal stabil VEGF-A szekréciót mutatott in vitro és a VEGF expresszió gátolható volt tetracyclin hozzáadásával. 8-9. Az új sejtvonal jól mérhető in vitro angiogenesist indukált a három dimenziós kollagén gél modellen. A CDM3D-TET-VEGF-sejtek illetve a kontroll béta-sejtek endothelium sejtekkel történő in vitro együttes tenyésztése esetén az ötször nagyobb érinváziót észleltünk az első csoportban.
A CDM3D-TET-VEGF-sejtek által kiváltott in vitro angiogenesis
leállítható és ezáltal szabályozható volt tetracyclinnel.
11
10. A genetikai átalakítás lényegesen nem befolyásolta a CDM3D-TET-VEGF béta-sejt szigetek glukózzal stimulált
in vitro inzulin elválasztását a kontroll CDM3D sejtekhez
képest. 11. Adataink alapján elmondhatjuk, hogy a CDM3D-TET-VEGF béta-sejt szigetek diabeteses syngenicus egerekbe történő transzplantációja után mért in vivo funkciója szignifikánsan jobb volt a kontrollcsoporténál. A kontroll CDM3D béta-sejtvonalból képzett szigetszerű sejtcsoportok transzplantációjakor, a diabeteses recipiensek felének vércukorszintje átlagosan harminc nap után, a teljes csoporté 38 nap után normalizálódott. A CDM3D-TET-VEGF csoportban viszont, mindez szignifikánsan (p<0,05) gyorsabban következett be, a csoport 50%-a átlagosan húsz nap után, a teljes csoport pedig 24 nap után vált normoglikaemiássá. Hasonló eredményt mutatott, a 28. posztoperatív napon végzett intraperitonealis glukóztolerancia teszt (IPGTT) is. Eszerint, a glukózterhelésre adott válasz szignifikánsan jobb volt a VEGF-t expresszáló sejtek transzplantációjakor (p<0,001). 12. A szigetsejt graftokat tartalmazó veséket hat héttel a transzplantáció után eltávolítottuk és szövettani vizsgálatokat végeztünk a graft körüli angiogenesisre vonatkozóan. Az endothelsejtekhez speciálisan kötődő BS-1 festéssel vizsgáltuk a graftok revascularisatioját. Szignifikánsan (p<0,005) több kapillárist illetve endothelsejtet találtunk a VEGF-t expreszáló CDM3D béta-sejteket tartalmazó graftokban. Ez arra utal, hogy a fokozott VEGF expresszió elősegítette a transzplantációt követő revascularisatiot. 13.
A transzplantációt követő VEGF szekréció és revascularisatio is szabályozható volt
tetracyclinnel. A tetracyclinnel előkezelt sejtekkel (kontroll sejtek illetve CDM3D-TETVEGF sejtek) transzplantált állatok a transzplantáció ellenére diabetesesek maradtak. A tetracyclin tehát hatásosan gátolta a VEGF expressziót.
A másik csoportban, ahol a
vércukorszint normalizálódása után adtunk tetracyclint a transzplantációt követően, a szérum glukóz tartósan a normál tartományban maradt, azt igazolva, hogy a VEGF expresszió és a sejtproliferáció a tetracyclin hozzáadásával hatásosan szabályozható. A VEGF expressziót tehát hatékonyan le tudtuk állítani a revascularisatio kiteljesedése után, így a VEGF túlprodukciót csak a szigetek implantációjához szükséges optimális ideig tarthattuk fent.
12
5. KÖVETKEZETETÉSEK, AZ ÚJ ISMERETEK ÖSSZEFOGLALÁSA Az enzimvizsgálatok eredményeiből megállapíthatjuk, hogy adataink új ismeretekkel szolgálnak egy új enzim bevezetéséhez a humán szigetsejt izolációkban. A Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 kombinációjának emésztő aktivitása kiszámíthatóbbnak bizonyult az általános gyakorlatban elterjedt Liberase HI készítménynél. Külön előnyt jelenthet a collagenase és neutral protease szétválasztása, mert így a két komponens aránya változtatható. Ez lehetővé teszi az enzimkészítmény összetételének a mindenkori pancreasszövethez történő igazítását, tehát ha a pancreas fiatalabb donorból származik és kevesebb kötőszövetet tartalmaz, akkor kevesebb, míg a tömöttebb, fibroticusabb pancreas esetén több neutral protease hozzáadása lehetséges. Ennek a pancreas sziget autotranszplantáció vonatkozásában is jelentősége lehet, mivel ott az eltávolított chronicus pancreatitises állomány általában sok kötőszövetet tartalmaz. A két komponens szétválasztása a készítmény tárolhatóságát is javíthatja, mert a kombinált enzimek aktivitása csökkenhet a tárolás során. Az új enzim bevezetésének legfontosabb előnye és gyakorlati haszna, hogy szélesíti a humán izolációk fegyvertárát és lehetővé teszi az egyes pancreas sajátosságaihoz igazított, „egyénre szabott” sziget izolációk kivitelezését. Ezáltal javulhat az izolációk eredményessége és bővülhet a szigetsejt transzplantációra alkalmas donorok skálája. A VEGF-t expresszáló szigetsejt transzplantációs kísérleteinkből megállapíthatjuk, hogy a szigetsejtek közvetlen környezetében fokozott VEGF elválasztás elősegíti a beültetést követő revascularisatiot és javítja a szigetek endokrin funkcióját. Az értekezésben ismertetett módszer újdonsága, hogy átmeneti lokális VEGF expressziót tesz lehetővé a transzplantált szigetsejtek környezetében és a VEGF-A expresszió a megfelelő revascularisatio kialakulása után leállítható. Továbbá, a dolgozatban bemutatott in vitro angiogenesis modell alkalmas lehet a béta-sejtek és az endothelsejtek kölcsönhatásainak további vizsgálatára is. Az angiogenesis serkentését, VEGF génterápiával, sikeresen alkalmazták coronariailletve perifériás érbetegségekkel kapcsolatos klinikai vizsgálatokban.
Az általunk
kidolgozott, gyógyszeresen szabályozható VEGF-expressziós modell hozzájárulhat a transzplantáció után észlelt szigetsejt veszteség mérsékléséhez és a génterápia mai lendületes fejlődése mellett, alapját képezheti hasonló klinikai módszer kidolgozásának a szigetsejt transzplantációban is.
13
6. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 1. Zoltan Mathe, Philippe Dupraz, Chris Rinsch, Bernard Thorens, Domenico Bosco, Marie Zbinden, Philippe Morel, Thierry Berney, Michael S. Pepper: Tetracycline-Regulated Expression of VEGF-A in Beta Cells Induces Angiogenesis: Improvement of Engraftment Following Transplantation Cell Transplantation, 2006, 15(7), 621-36 IF: 3.481 2. Máthé Zoltán; Zbinden, Marie; Bosco, Domenico; Berney,Thierry; Pepper, Michael: A
fokozott
VEGF-A
génexpresszió
javítja
a
transzplantált
szigetsejtek
revascularisatióját és működését Diabetologia Hungarica, 2006, 14 (3), 217-225 3. Má́thé́, Z., Langer, R., Bucher, P., Thierry, B., Morel, P., Járay, J., Perner, F.: A pancreas szigetsejt-allotranszplantá́ció új eredmé́nyei. Orvosi Hetilap 2004; 145 (20), 1053-9 4. Máthé Zoltán, Langer Róbert, Pascal Bucher, Thierry Berney: A hasnyálmirigy és szigetsejtátültetés helyzete, új lehetőségek Focus Medicinae, 2004, 6, (2):10-15 5. Bucher, P., Mathe, Z., Morel, P., Bosco, D., Andres, A., Kurfuest, M., Friedrich, O., Buchler, L.H., Wendrey, C., Berney, T.: Assessment of a novel two-component enzyme preparation for human islet isolation and transplantation Transplantation 2005; 79 (1), 91-7 IF: 3,879 6. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Andres, A., Kurfuerst, M., Ramsch-Gunther, N., Buhler, L., Morel, Ph., Berney, T.: Serva collagenase NB1: A new enzyme preparation for human islet isolation Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1143-4 IF:0,511
14
7. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Andres, A., Buhler, L.H., Morel, P., Berney, T.: Islet of Langerhans transplantation for the treatment of type 1 diabetes Swiss Surgery 2003; 9 (5), 242-6 8. Bucher, P., Bosco, D., Mathe, Z., Matthey-Doret, D., Andres, A., Kurfuerst, M., RamschGunther, N., Buhler, L., Morel, P., Berney, T.: Optimization of neutral protease to collagenase activity ratio for islet of langerhans isolation Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1145-6 IF:0, 511
9. Bucher, P., Mathe, Z., Buhler, L.H., Andres, A., Bosco, D., Berney, T., Morel, P.: Diabetes Type I therapy through transplantation Annales de Chirurgie 2005; 130 (6-7), 374-83 IF: 0,455 10. Berney, T., Bucher, P., Mathe, Z., Andres, A., Bosco, D., Mage, R., Toso, C., Oberholzer, J., Becker, C., Philippe, J., Buhler, L., Morel, P.: Islet of Langerhans allogeneic transplantation at the University of Geneva in the steroid free era in islet after kidney and simultaneous islet-kidney transplantations Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1121-2 IF:0,511 11. Berney, T., Mathe, Z., Bucher, P., Andres, A., Bosco, D., Toso, C., Buhler, L., Morel, P.: Islet of Langerhans autotransplantation for the prevention of surgical diabetes after extensive pancreatic resection | [Autotransplantation d'ilots de Langerhans pour la prévention du diabète après résection pancréatique étendue] Medecine et Hygiene 2003; 61 (2442), 1313-8
Össz IF: 9,348
15
7. AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ ABSZTRAKTOK, PREZENTÁCIÓK 1. Mathe, Z; Langer, R M.; Jaray, J ; Filo, A ; Doros, A ; Weszelits, V; Remport, A; Varga, M; Mathe, Zs; Perner, F; Andres, A; Bosco, D; Morel, Ph ; Berney, T: Human Pancreatic Islet Transplantation in International Collaboration with a Distant Islet Isolation Center: Preliminary Results from the Budapest-Geneva Experience. Transplantation. 78(2) Supplement 1:353, July 27, 2004. 2. Z. Mathe, Ph. Dupraz, D. Bosco, P. Bucher, M. Zbinden, C. Rinsch, B. Thorens, Th. Berney and M. S. Pepper: Retroviral Transduction of Pancreatic Beta-cells by VEGF-164 Improves Glycemic Control in a Syngeneic Model of Islet Cell Transplantation. IPITA 2003, 8-11 July, Dublin, Ireland 3. Z. Mathe1,2, Ph. Dupraz3, M. Zbinden4, D. Bosco1, A. Filo², P. Bucher1, C. Rinsch3, B. Thorens5, T. Berney1 and M.S. Pepper4 Regulated Gene Expression of VEGF-164 by Pancreatic
Beta-cells
Improves
Revascularization
and
Engraftment
after
Transplantation. EASD, 5-9 Sept, 2004, Munich, Germany 4. Bucher, Pascal; Bosco, Domenico; Morel, Philippe; Mathe, Zoltan; Kurfuest, Manfred; Buhler, Leo; Berney, Thierry: The Role of Neutral Protease During Islet Isolation Evaluated with a New Enzyme Preparation. American Journal of Transplantation Supplement. 4 Supplement 8:470-471, March 2004. 5. Z. Mathe, P. Bucher, D. Bosco, J. Oberholzer, C. Wandrey, L.Buhler, Th. Berney, Ph. Morel:
Short Term Immunosuppression Reduces Pericapsular Fibrotic Infiltration
Around Barium-M-Alginate Microbeads. 22th Workshop of the AIDPIT and EASD; Igls, Austria, January 27-29, 2003 6. Z. Mathe, D. Bosco, P. Bucher, C. Wandrey, D. Sainz, Th. Berney, L. Bühler and Ph. Morel: Microencapsulation for Immunoprotection of Islets of Langerhans NRP 46-International Workshop on Implants and Transplants, 20-21 February, 2003, Bern, Switzerland
16
7. Z. Mathe, P. Bucher, D. Bosco, C. Toso, J. Oberholzer, C. Wandrey, D. Sainz, L. Bühler, Ph. Morel and Th. Berney: Fibrotic Infiltration Around Barium-alginate Microbeads Can be Reduced by a Short Course of Immunosuppression IPITA 2003, 8-11 July, Dublin, Ireland 8. Baertschiger, Reto M.; Bosco, Domenico; Morel, Philippe; Andres, Axel; Armanet, Mathieu; Wojtusciszyn, Anne; Mathe, Zoltan; Bucher, Pascal; Pernin, Nadine; Charvier, Solange; Toso, Christian; Berney, Thierry: How to select good donors of pancreatic islets? A difficult task Abstract# 1296 Poster Board #-Session: P226-III. American Journal of Transplantation Supplement. 5 Supplement 11:486, May 2005. 9. Berney, Thierry; Bucher, Pascal; Mathe, Zoltan; Kempf, Marie-Claude; Bosco, Domenico; Andres, Axel; Oberholzer, Jose; Becker, Christoph ; Philippe, Jacques; Mage, Raymond; Majno, Pietro; Buhler, Leo H.; Morel, Philippe: Islet of Langerhans Allogeneic Transplantation at the University of Geneva in the steroid-free era. American Journal of Transplantation Supplement. 3 Supplement 5:254, May 2003. 10. Mai, G 1; Bucher, P 1; Mathe, Z 1; Bosco, D 1; Pernin, D 1; Berney, T 1; Morel, Ph 1; Buhler, L 1 Retransplantation of Discordant Xenogeneic Islets using Costimulatory Blockade. Xenotransplantation. 10(5):493, September 2003. 11. Mai, G 1; Bucher, P 1; Mathe, Z 1; Bosco, D 1; Berney, T 1; Morel, Ph 1; Buhler, L 1 Inhibition of Signals 2 and 3 Allows Long-term Graft Survival of Concordant and Discordant Islet Grafts. Xenotransplantation. 10(5):492, September 2003. 12. Z. Mathe, F. Triponez, C. Toso, P. Bucher, Ph. Morel: Pancreatic Islet Autotransplantation in a Patient with Severe Pancreatic Injury: Systemic, Pre- and Posthepatic C-peptide and Insulin Levels during Intravenous Glucose Tolerance Test. 7th Congress of the United Surgical Societies of Switzerland, 19-22 June 2002, Lausanne, Switzerland 13. Bucher, P.; Mai, G.; Mathe, Z.; Bosco, D.; Berney, T. H.; Buhler, L. H.; Morel, P. H. Retransplantation of discordant xenogeneic islets using costimulatory blockade. British Journal of Surgery. 91(7):905, July 2004
17
18
