A PANCREAS SZIGETSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ KORAI EREDMÉNYEIT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK: AZ IZOLÁCIÓS ENZIMEK ÉS A REVASCULARISATIO VIZSGÁLATA Doktori értekezés Dr. Máthé Zoltán Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola
Programvezető:
Dr. Monos Emil c. egyetemi tanár, az MTA doktora
Témavezető:
Dr. Gerő László egyetemi tanár, az MTA doktora
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Tihanyi Tibor egyetemi tanár
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Somogyi Anikó egyetemi docens, Ph.D. Dr. Vörös Péter osztályvezető főorvos, Ph.D.
Opponensek:
Dr. Horányi János egyetemi docens, Ph.D. Dr. Vörös Péter osztályvezető főorvos, Ph.D.
Budapest 2007.
1
TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések jegyzéke
4
1. BEVEZETÉS
5
2. IRODALMI HÁTTÉR
8
2.1. Történelmi visszatekintés, időszerű kérdések
8
2.2. A sziget transzplantációk eredményeit befolyásoló tényezők
11
2.2.1. Szervkivétel
11
2.2.2. A szigetek izolációja és az izolációs enzimek jellemzői
13
2.2.3. A humán szigetek transzplantációja
16
2.2.4. A szigetek mikrocirkulációja
17
2.2.5. A transzplantált szigetek revascularisatioja
19
2.2.6. A revascularisatiot befolyásoló tényezők
20
2.2.7. A VEGF-A szerepe a szigetek angiogenesisében
24
3. CÉLKITŰZÉS
30
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
33
4.1. A Collagenase NB1 enzimmel végzett vizsgálatok
33
4.1.1. Az enzimek jellemzői, összetétele
33
4.1.2. A humán szigetek izolációja
34
4.1.3. Az enzimek gyártási vonalainak vizsgálata
37
4.1.4. Az izolált humán szigetek morfológiai vizsgálatai
37
4.1.5. A szigetek apoptosisának és inzulinszekréciójának vizsgálata
37
4.1.6. In vivo vizsgálatok: állatkísérletes és humán transzplantációk
37
4.2. A fokozott VEGF-A expresszió vizsgálata
39
4.2.1. A RIP-VEGF szigetekkel végzett kutatások
39
4.2.1.1. A RIP-VEGF szigetek izolációja és in vitro glukóz stimulációja
39
4.2.1.2. A RIP-VEGF szigetek transzplantációja
40
4.2.2. A TET-VEGF béta-sejtekkel végzett kutatások
41
4.2.2.1. In vitro kísérletek: angiogenesis és tetracyclines gátlás
41
4.2.2.2.A revascularisatio és a tetracyclines gátlás vizsgálata a TET-VEGF szigetek transzplantációja után
46
2
5. EREDMÉNYEK
48
5.1. Az enzim vizsgálatok eredményei
48
5.1.1. A gyártási vonalak vizsgálatának eredményei
48
5.1.2. Az izolált humán szigetek morfológiai vizsgálatainak eredményei
48
5.1.3. Az állatkísérletes és humán sziget transzplantációk eredményei
53
5.2. A fokozott VEGF-A expresszió vizsgálatának eredményei
55
5.2.1. A Rip-VEGF szigetek transzplantációjának eredményei
55
5.2.2. A TET-VEGF béta-sejtekkel végzett kutatások eredményei
59
5.2.2.1. Az in vitro angiogenesis és tetracyclines gátlás vizsgálatának eredményei 59 5.2.2.2. A transzplantált TET-VEGF szigetek működésének, revascularisatiojának és a tetracyclines szabályozás vizsgálatának eredményei
62
5.3. Az új eredmények összefoglalása
68
6. MEGBESZÉLÉS
70
6.1. Az enzimvizsgálatok eredményeinek értékelése
70
6.2. A fokozott VEGF-A expresszió hatásainak értékelése
72
7. KÖVETKEZTETÉSEK
75
8. ÖSSZEFOGLALÁS
77
9. IRODALOMJEGYZÉK
79
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
102
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
110
3
Rövidítések jegyzéke
VEGF-vascularis endothelialis növekedési factor IEQ-islet equivalent, szigetsejt equivalens, a különbőző méretű szigetek azonos méretre (150 um) történő konverziója TET-tetracyclin Rip-VEGF-Tg- a pancreas béta-sejtekben humán VEGF-t expresszáló transzgenikus egerek, amelyekben a VEGF expressziót a patkány-inzulin promoter (RIP-rat insulin promoter) kontrollálja TET-VEGF- a VEGF-t fokozottan expresszáló génmódosított inzulinoma sejtvonal, amelyben a VEGF expresszió tetracyclinnel leállítható STZ-streptozotocin IPGTT-intraperitonealis glukóz tolerancia teszt BS-1 –Bandeirea simplicifolia, az endothelsejteket speciálisan festő lektin HE- haematoxylin-eosin PP sejtek- pancreas polypeptidet termelő sejtek a Langerhans-szigetekben
4
1. BEVEZETÉS A diabetes mellitus mintegy 170 millió embert érint a világon és népbetegségnek számít a fejlett ipari országokban (1). A harmadik leggyakoribb megbetegedés és a negyedik vezető halálok az Egyesült Államokban, ahol a lakosság több mint 6%-a érintett (2). Magyarországon ma megközelítőleg fél millió személy tud diabeteséről, sokan nincsenek tudatában betegségüknek, így a kórkép előfordulása megközelíti a 10%-ot. A betegség I-es típusú formája a leggyakoribb krónikus megbetegedés gyermek- és serdülőkorban. Előfordulása háromszorosára nőtt az elmúlt húsz évben Magyarországon, így százezer 15 év alatti gyerek között ma 10-12 beteg van (3). A diabeteses betegek számának további jelentős növekedése várható az elkövetkező években, számuk 2030-ra megközelítheti a 366 milliót a WHO előrejelzése szerint (1). A betegek számának rohamos emelkedése miatt új terápiás lehetőségek kutatása időszerű. A világszerte folyó intenzív kutatások ellenére a diabetes kezelése napjainkban sem megoldott. A Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) nemzetközi multicentrikus tanulmány a közelmúltban igazolta, hogy az I-es típusú diabetes szövődményei késleltethetők a vércukorszint gyakori ellenőrzésével és korrekciójával, az ún. intenzív inzulin kezeléssel (4). A vércukorszint azonban így is jelentős napi ingadozást mutathat és a kezeléshez háromszor gyakrabban társult, akár életveszélyes, hypoglykaemiás epizód (5). Hasonló eredményre jutott az United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) is (6). Ezek az eredmények megerősítik azt a feltevést, hogy a szénhidrát anyagcsere fiziológiás szabályozásának visszaállítása csak az inzulintermelő Langerhans-szigetek transzplantációjával lehetséges (7). Ennek egyik formája a pancreasból izolált szigetek önálló transzplantációja, ami ígéretes fejlődésnek indult az ezredfordulón. Az Edmonton-protokoll kidolgozásával és bevezetésével ugyanis megváltoztak a betegszelekció szempontjai, új immunszuppressziós szerek kerültek bevezetésre nemzetközi együttműködések indultak (8-10). A módszer tömeges alkalmazását jelentős mértékben nehezíti azonban, a transzplantációt követő órákban-napokban észlelt nagyfokú szigetsejt veszteség, ami a beültetett szigetek 40-50%-át is érintheti (11). Ezért egy diabeteses
5
beteg számára a fiziológiás szükségletnél nagyobb mennyiségű, általában két-három agyhalott donorból összegyűjthető sziget transzplantációja szükséges (12; 13). A világszerte jellemző szervdonor hiány a helyzet további elemzését és új, alternatív megoldások kidolgozását sürgeti. A sziget izolációk egyik központi kérdése napjainkban is a pancreas szövet emésztéséhez
nélkülözhetetlen
enzimek
változékonysága
és
sokszor
kiszámíthatatlansága. Ez az egyik oka annak, hogy az izolációk mindössze 50-60%ban lehetséges beültethető minőségű és mennyiségű szigetet szeparálni még a nagy tapasztalattal rendelkező centrumokban is (14; 15). Egy szabályozható összetételű és pontosabban adagolható enzim bevezetése növelheti az izolációk eredményességét és javíthatja a szeparált szigetek életképességét. A jelen értekezés első részében egy ilyen új enzimkészítmény vizsgálatával foglalkozom. Az elmúlt évek kutatásai felhívták a figyelmet arra is, hogy a Langerhansszigetek komplex érrendszere az enzimatikus izolációs folyamat során sérül, és egyik fő tényezője lehet a transzplantáció után észlelt korai szigetsejt veszteségnek (11). Számos vizsgálat igazolta, hogy a szigetek fejlett mikrovascularis hálózattal rendelkeznek és a megfelelő implantációhoz és működéshez a komplex érrendszer regenerációja szükséges (16; 17). Mattson eredményei tanusítják, hogy a transzplantációt követő revascularisatio nem éri el a pancreasban levő natív szigetek fiziológiás vascularisatiojának mértékét egy évvel a transzplantáció után sem (18). Így a beültetést követő spontán revascularisatio elégtelen és túlságosan lassan megy végbe ahhoz,
hogy
az
érhálózat
megakadályozza (11; 19).
károsodásából
származó
szigetsejt
veszteséget
Ezért a revascularisatiót segítő tényezők kutatása
hozzájárulhat a transzplantálandó szigetek számának csökkentéséhez és működésük javításához. A közelmúlt irodalmi adatai arra utalnak, hogy a tumor angiogenesisben fontosnak tartott vascularis endothelialis növekedési faktor, a VEGF-A, a transzplantált szigetsejtek revascularisatiojában is kulcsszerepet játszik (20-22). Felmerül, hogy a lokális VEGF-A termelés fokozásával javítható-e a szigetsejtek körüli angiogenesis és csökkenthető-e a transzplantációt követő szigetsejt veszteség? Az értekezés következő részében arra kerestem választ, hogy a 6
fokozott VEGF expresszió hogyan befolyásolja a transzplantált szigetsejtek revascularisatioját és működését. Kísérletes adatok alapján ismert, hogy a mértéktelen VEGF szekréció értumorok kialakulásához vezethet (23; 24). Ezért célom volt a VEGF expressziót gyógyszeresen szabályozható modell kidolgozása is a transzplantált szigetsejtek életképességének javítása érdekében.
7
2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. Történelmi visszatekintés, időszerű kérdések A Langerhans-sziget transzplantáció első próbálkozását 1894-re tehetjük, amikor az angliai Bristol Royal Infirmary kórházban, Williams egy 15 éves, súlyosan diabeteses
fiút próbált juhból frissen eltávolított és a subcutan régióba ültetett,
pancreas darabokkal kezelni (235). A glucosuria átmeneti javulást mutatott ugyan, de a beteg három nappal a kezelést követően elhunyt. Jelentős áttörést jelentett az inzulin felfedezése a húszas évek elején Torontóban. Banting és Best közleménye, amelyben egy 14 éves diabeteses fiú sikeres kezeléséről számoltak be szarvasmarha pancreas kivonattal, 1922-ben látott napvilágot és alapjaiban megváltoztatta az addig halálos kimenetelű cukorbetegség kezelését (25). A pancreas szövet átültetése a 30-as évek végén került ismételten a figyelem középpontjába, hiszen addigra kiderült, hogy a külsőleg adott inzulin életmentő ugyan a diabeteses ketoacidosis súlyos formáiban és elfogadható szénhidrát anyagcserét tart fenn, de nem képes megakadályozni a szövődmények (retinopathia, vakság, nephropathia,
akcelerált, atherosclerosis)
kialakulását és progresszióját. A szigetsejt transzplantáció, önálló szakterületként, a múlt század 60-as éveinek végén kezdett kialakulni, amikor a pancreas
collagenase-al történő
enzimatikus emésztését és a szigetek sűrűségrádiens alapján történő szétválasztását kidolgozták (26; 27). Ezt hamarosan követte az izolált szigetek első sikeres transzplantációja kisállat modellen. Ballinger és Lacy 1972-ben bizonyította, hogy a diabeteses állapot korrigálható a szigetek transzplantációjával állatkísérletes modellen (28). Működőképes humán szigetek izolálása volt a következő jelentős lépés, amely elvezetett az első humán transzplantációhoz a Minnesota-i egyetemen 1974-ben (29). Az első próbálkozások során csak átmeneti C-peptid emelkedést tudtak elérni, tartós szigetsejt funkciót illetve exogén inzulinmentességet azonban gyakorlatilag nem észleltek. A szigetsejt transzplantáció modern történetét 1988-tól számíthatjuk, amikor Ricordi és mtsai kidolgozták az izolálás automata módszerét (30). Ennek lényeges eleme a Ricordi-kamra, amelyben 37°C-on történt az előzőleg 4°C-os collagenase
8
oldattal feltöltött, majd feldarabolt pancreas emésztése. Ez a technikai módosítás tette lehetővé a humán szigetsejt szeparáció lépéseinek egységesítését és a korábbinál több több működőképes sziget előállítását. centrumból
bíztató
eredményeket
Az új technika elterjedésével számos közöltek
(31);
(32).
Tartós
exogén
inzulinmentességet csak 8-10 %-ban észleltek ugyan, de mérhető béta-sejt működés (serum C-peptid > 0.5 ng/ml) a betegek jelentős részében igazolható volt és a szénhidrát anyagcsere egyértelműen javult (33). Magyarországon a szegedi munkacsoport számolt be foetalis szigetsejtek átültetéséről 1995-ben (34). Továbbra is központi probléma maradt azonban az izoláláshoz szükséges megfelelő emésztőenzim kiválasztása. A szigetsejt transzplantáció új lendületet kapott az ezredfordulón, világszerte új centrumok nyíltak, és új klinikai vizsgálatok indultak. A változások
egyik
sarokköve az edmontoni munkacsoport közleménye, amelyben 100%-os exogén inzulinmentességről számoltak be egy év után, hét egymást követő transzplantált beteg esetében (8). Megfigyeléseik képezték az alapját az Edmonton-protokoll kidolgozásának, amelyet az alábbi fejezetben részletesen ismertetek.
2005-ös
közleményükben, nagyobb betegszám esetében, exogén inzulinmentességet 82%-ban regisztráltak egy év után (9). Az ezredforduló másik jelentős eredményének számít a szigetsejt allograftok hosszútávú túlélése T-sejt ellenes antitestekkel kezelt majmok esetében (35). Ezek a megfigyelések felvetették, hogy a szigetek korai átültetésével a diabetes
súlyos
szövődményeinek
kialakulása
megelőzhető
lenne,
illetve
progressziójuk lassítható. Az új eredményeken alapuló tudományos lelkesedés az amerikai Immune Tolerance Network által alapított és számos szervezet által finanszírorott kollaboratív nemzetközi vizsgálatban csúcsosodott, azzal a jól meghatározott céllal, hogy a transzplantációs toleranciát lehetővé tevő protokollok további kidolgozását és klinikai bevezetését elősegítse (36). Az új eredményekkel a megoldatlan kérdések is felszínre kerültek.
A
szigetsejt transzplantáció egyik alapvető problémáját jelentette továbbra is, hogy a sziget izolációknak csak 50-60%-a sikeres (14). Tehát, az izoláló központokba került pancreasoknak mintegy feléből lehet megfelelő mennyiségű működőképes szigetet szeparálni. Ez a tény elsősorban az izolációkban alkalmazott enzimkészítmények eltérő hatásfokára vezethető vissza. A másik fontos tényező a beültetést követő 9
nagyfokú szigetsejt veszteség. Ez utóbbi szoros összefüggésben van a szigetek elégtelen revascularisatiojával az irodalmi adatok szerint. Mindkét témakör intenzív kutatások tárgyát képezi napjainkban is. A 90-es években számos fontos megfigyelés
született, amelyek a
későbbiekben hozzájárultak az Edmonton-protokoll megvalósulásához. Ide tartoznak a giesseni munkacsoport eredményei, amelyek az optimális szigetsejt implantációt célozták. Antioxidáns szerek (nicotinamid, pentoxyphillin, E vitamin) adását, intravénás inzulinkezelést és glukóz pótlást javasoltak a transzplantáció előtt és az azt követő első héten, a beültetett szigetekre háruló metabolikus terhelés csökkentése érdekében. A szigetsejt izoláció során endotoxinmentes reagenseket alkalmaztak. 30%-os exogén inzulinmentességet értek el a fenti módosításokkal az 1992 és 1997 között transzplantált 50 beteg esetében (33). Shapiro és mtsai-nak 2000-ben megjelent közleménye áttörést jelentett a klinikai sziget transzplantáció addig közölt szerény eredményeihez képest (8). Gyakori hypoglykaemiával járó, ún. instabil I-es típusú diabetesben szenvedő, jó vesefunkcióval rendelkező betegeket vontak be a tanulmányba. Több lényeges változtatást eszközöltek a szigetsejt izoláció és a transzplantáció folyamatában, amelyek összesítve hozzájárultak a sikerhez, illetve az Edmonton–protokoll kidolgozásához. Fokozott figyelmet szenteltek a gyors és kíméletes szervkivételnek. Hangsúlyt fektettek a nagy tisztasági fokú, jó minőségű szigetsejt preparátum előállítására. Kiküszöbölték az állati eredetű fehérjék alkalmazását az izoláció során. Megemelték a beültetendő szigetsejtek számát és legalább 10.000 szigetsejt equivalens/tskg transzplantációját javasolták. Új immunszupresszív protokollt alkalmaztak az addig használt szerek diabetogén hatásának csökkentése érdekében. Az immunszuppressziós indukciót IL-2 receptor gátló monoklonális antitesttel (daclizumab) végezték, a fenntartó kezelés bázisát egy nemrégiben bevezetett gyógyszer, a sirolimus és a csökkentett dózisú calcineurin-gátló (tacrolimus) kombinációja képezte. A számos mellékhatással rendelkező szteroidokat mellőzték. A betegek mintegy 80%-a nem szorult tartósan külső inzulin adására a munkacsoport újabb közleménye szerint (9). A hypoglycaemiás epizódok teljesen megszűntek és a szénhidrát anyagcsere jelentősen javult (12).
10
Az edmontoni eredmények jelentős előrelépésnek tekinthetők, annak ellenére, hogy a protokoll keretében két vagy három donorból származó szigetsejt preparátumra volt szükség recipiensenként és a transzplantációt az esetek többségében ismételni kellett. 2.2. A sziget transzplantációk eredményeit befolyásoló tényezők 2.2.1. Szervkivétel A pancreas eltávolítása sziget transzplantáció céljából agyhalott donorokból történik, általában multiorgan szervkivétel keretében. A megfelelő donor kiválasztása, a donorkezelés és a szervkivételi technika hatással van a sziget izolációk kimenetelére az irodalmi adatok szerint (37). A szigetsejt specifikus donor kritériumok megegyeznek a multiorgan donáció általános feltételeivel, az elfogadott korhatár 20-65 év között van (38). A hasi szervek közül a pancreas a legérzékenyebb a hypoxiára. Ezért tartós, 30 percet meghaladó hypotensio, illetve pozitív inotrop gyógyszerek adása nagy dózisban a donorkezelés során megkérdőjelezi a pancreas alkalmasságát a sziget izolációra. Fontos kiemelnem néhány tényezőt, amelyek az irodalmi adatok alapján befolyásolhatják a működőképes szigetek szeparálását (39). Ide tartozik a 18 év alatti életkor, ilyenkor ugyanis a szigetek még
fejletlenek és emiatt
izolációjuk gyakran sikertelen; az alacsony
testtömeg index (BMI<25) és a szívmegállás időtartama sikeres újraélesztés esetén (39; 40). Toso és Ricordi vizsgálatai azt igazolták, hogy a nagyobb testömeg indexű (BMI>25) donorokból nagyobb számú funkcióképes sziget izolálható (38). Ennek a megfigyelésnek az oka nem teljesen tisztázott, valószínű, hogy az elhízott donorokban a szigetek nagyobbak és fejlettebbek a megnövekedett metabolikus terhelés miatt (41). Célszerű hangsúlyozni, hogy a teljes pancreas- és a sziget transzplantáció általában jól kiegészíti egymást és nem jelent kompetíciót ugyanazért a szervért. A túlsúlyos donorok pancreasa ugyanis általában nem alkalmas a teljes szerv transzplantációjára. A magas interstitialis zsírtartalom jelentősen megnöveli a graftpancreatitis kockázatát a transzplantáció után (42). A pancreas eltávolítás sebészi technikája szigetsejt transzplantáció céljából megegyezik a teljes pancreas transzplantációra eltávolított szerv kivételével. A pancreas lezárt duodenum segmentummal és léppel együtt kerül eltávolításra (1.ábra).
11
1. ábra A duodenum segmentummal és léppel együtt eltávolított pancreas (43)
Két dolog jelentőségét szeretném kiemelni a szigetek integritásának és életképességének megőrzése szempontjából a szervkivétel során. Az egyik, a pancreasra vonatkozó szervkímélő, ún. „no-touch” sebészi technika. A pancreas ugyanis rendkívül érzékeny a manipulációra (44). Szintén ide tartozik a kötőszövetes pseudo-kapszula épségének megőrzése, amely a későbbi nyomáskontrollált enzimes feltöltés miatt fontos. A másik az aorta lefogásától számított ún. meleg ischaemiás idő (WIT) minimalizálása, amely max. 45 percig elfogadható (45). Emiatt, a szigetsejt transzplantáció céljából történő multiorgan donáció esetében a pancreasnak a máj előtt történő eltávolítása célszerű és ajánlatos. A Genf-Budapest szigetsejt kollaboráció
keretében ezt az
időt 30 perc alatt tartottuk (46). A pancreas
prezervációja a többi hasi szervvel együtt 4°C-os University of Wisconsin (UW) konzerváló oldattal történik. A közelmúlt egyik újdonsága az oxigént kötő
12
perfluorocarbon (PFC) és UW kettős oldattal történő prezerváció. A PFC sűrűsége nagyobb az UW-nál, emiatt a két oldat nem keveredik, a pancreas pedig, speciális konténerben, a két oldat határán lebeg (47). A maximális hideg ischaemiás idő ezzel a módszerrel is 12 óra, de a sziget izolálást célszerű 8 órán belül elkezdeni. Nemzetközi kollaborációk esetében ez igen jó szervezést igényel (48). Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy az agyhalott donorok kiválasztása, intenzív osztályos kezelése (donor management) és a szervkivételi sebésztechnika hatással van a sziget izolációk eredményességére, fontos szerepet játszik a szigetek életképességének megőrzésében és befolyásolhatja a transzplantáció sikerét.
2.2.2. A szigetek izolációja és az izolációs enzimek jellemzői A pancreas megközelítőleg egymillió Langerhans-szigetet tartalmaz, amelyek a teljes szerv mindössze 1%-át alkotják (49). Ebből egy 50-90%-os tisztaságú sziget preparátum előállítása egy komplex, többlépcsős folyamat. Működőképes szigetek kivonása a pancreasból a hatvanas évek végén sikerült először állatkísérletek során. Moskalewski volt az első, aki collagenase-os emésztést alkalmazott tengerimalac modellen (26). Lacy és Kostianowsky ezt kiegészítette a pancreasvezeték enzimes feltöltésével, ami folyamatot (27).
hatékonyabbá tette az emésztési
Ricordi a humán izolációk egyes lépéseit automatizálta és
mechanikus mozgatással segítette az enzimatikus emésztést (2. ábra).
13
2. ábra A humán sziget izoláció sematicus ábrája Ricordi nyomán (236)
Az izolációs folyamat első lépése a szervkivételt követően a pancreas sebészi preparálása asepticus műtői körülmények között, amelyet a fő pancreasvezeték kétirányú kanülálása és a pancreas feltöltése követ hideg enzim oldattal. Az utóbbi lépés részleteit Lakey és mtsai dolgozták ki a 90-es évek közepén (50). Ezt követi a pancreas feldarabolása és behelyezése a Ricordi- kamrába, ahol a rendszert 37°C-ra melegítjük, hogy az enzim aktiválódjék. Az emésztést, a megfelelő pillanatban hideg albuminos oldattal állíthatjuk le.
A humán sziget izolációk alapja tehát a pancreas három dimenziós kollagénvázának enzimatikus emésztése. A kereskedelemben kapható collagenase-ok olyan enzimkeverékek, amelyek képesek a kollagén hármas helix hidrolízisére. A 14
nyers collagenase (clostridiopeptidase) preparátumokat
Clostridium histolyticum
tenyészetből állítják elő. Endotoxin kontaminációjuk általában magas és kollagén emésztő képességük gyakran változékony (51-53). A kísérletes vizsgálatokból kiderült, hogy az endotoxin tartalom fontos szerepet játszik a szigetsejt graftok elégtelen működésében (primary non-function) a transzplantációt követően (51; 54); (55). Ezért intenzív kutatások indultak az endotoxin tartalom csökkentésére és az exocrin pancreas szövetre szelektíven ható komponensek azonosítására (56), amelyek elvezettek
a
Liberase
HI
(Roche-Boehringer-Mannheim,
Indianapolis,
IN)
kifejlesztéséhez (52); (57). Ez egy tisztított enzimkombináció, amely a Clostridium histyolyticum- ból előállított collagenase I-es és II-es formáját, valamint a Bacillus thermoproteolyticus-ból kinyert thermolysint tartalmazza. A készítmény endotoxin tartalma minimális, az összetevők aktivitását a humán pancreas izolációk speciális követelményeihez igazították. Az enzimkombináció megnövelte az egy pancreasból izolálható szigetek számát. (51). A
készítményre továbbra is jellemző maradt
azonban az egyes enzim sorozatok emésztő hatásának változékonysága és az összetevők pontosan meg nem határozható arányának következtében, a készítmény kiszámíthatatlansága (58).
Ezért, minden újonnan előállított Liberase HI enzim
gyártási vonalát humán pancreasokon, ún. próbaizolálások során kell tesztelni az aktivitás megállapítása céljából (59). Az egyes gyártási sorozatok a „jó” illetve „rossz” vonal („good lots vs. bad lots”) minősítést kapták a szakirodalomban és a kereskedelmi forgalomban is (15). Egy új, komponensenként külön adagolható és kiszámíthatóbb aktivitású enzimkészítmény kidolgozása jelentős előrelépést jelentene a nagyobb számú, életképesebb szigetek sikeres izolációjához. Számos kutatócsoport dolgozik ezen a kérdésen. A Giessen-i csoport a közelmúltban fejlesztett ki egy új rekombináns enzim készítményt, amely a bíztató kezdeti eredmények ellenére sem került forgalomba (60). A fenti problémák vezettek el a Collagenase-NB1 és a Neutral Protease NB enzim preparátum előállításához. Az új készítmény jellemzője,
hogy az egyes
összetevők nagyfokban tisztítottak és endotoxin tartalmuk minimális. Fontos hangsúlyozni, hogy a preparátum két fő komponense, a collagenase I-II enzimkeverék illetve a neutral protease külön csomagolt. Ennek az a fő előnye, hogy az egyes komponensek tetszőleges koncentrációban adagolhatóak. A collagenase és a neutral 15
protease megfelelő aránya az enzimkészítményben
kulcsfontosságú, hiszen az
alacsony neutral protease aktivitás inkomplett emésztéshez, míg a túl magas aktivitás a szigetek töredezettségéhez vezet (61; 62). Az alacsony trypsin-szerű aktivitás szintén külön előnyt jelent, hiszen a korábbi kutatások azt is tanusították, hogy a magas trypsin tartalom is hozzájárul az izolált szigetek fragmentálódásához (63); (64). Az új készítmény bevizsgálása humán sziget izolációk során még nem történt meg, és munkacsoportunk számára nyílt lehetőség ennek a kutatómunkának az elvégzésére. A szigetek és az exocrin pancreas szövet közötti sűrűség grádiens különbség lehetővé teszi a szigetsejtek elválasztását az exocrin szövettől. A folyamat hasonlít a vér alakos elemeinek szétválasztásához, számítógép által vezérelt, hűtött (COBE 2991) sejtszeparáló centrifugában történik, folyamatos sűrűség grádienst tartalmazó cukoroldat (Ficoll) felhasználásával (65). Ezzel a módszerrel a pancreasban lévő szigeteknek kevesebb mint fele (350-400.000 szigetsejt) nyerhető ki a nagy tapasztalattal rendelkező centrumokban is (14) (66; 67). 2.2.3. A humán szigetek transzplantációja A szigetek beültetése a máj vena portae rendszerébe történik a leggyakrabban (8). A vena portae-ba elválasztott inzulin ugyanis -hasonlóan a fiziológiás élettani viszonyokhoz -közvetlen kapcsolatban van a májsejtekkel. A vena portae ultrahang vezérelt
percutan
punctioját
invazív
radiológiai
osztályon
végzik
helyi
érzéstelenítésben (68). Ezt egy kanül behelyezése követi a porta fő ágába, majd angiographiás kontroll után történhet a sziget preparátum lassú infúziója. A szigetek a vena portae kis ágainak rendszerébe implantálódnak. A beavatkozás a betegek által általában jól tolerált, kockázata gyakorlatilag a percutan transhepaticus portographia rizikójával (vérzés, thrombosis) azonos (69). A szigetsejt preparátum heparint is tartalmaz, a porta thrombosis kockázatának csökkentése érdekében. A porta nyomás átmeneti emelkedésével számolhatunk a beültetés során (70).
16
2.2.4. A szigetek mikrocirkulációja A pancreasban található szigetek önálló, kis endokrin szervként működnek és sajátos vérellátással rendelkeznek. Érrendszerük fenesztrált kapillárisokat tartalmazó finom hálózatból áll.
Ezek körül helyezkednek el, meghatározott elrendezésben
funkcionális egységet képezve a hormontermelő sejtcsoportok. A
hasnyálmirigy
keringésének
vizsgálatával
foglalkozó
kísérletes
tanulmányokból kiderült, hogy a szigetek vérellátása egyedi sajátosságokat mutat a pancreason belül és a szigetek keringésének szabályozása részben független az exocrin szövetétől (71). A Langerhans-szigetek
a
teljes pancreason átáramló
vérmennyiség kb. 10%-ból részesülnek, jóllehet tömegük csak a pancreas 1%-át teszi ki (72).
Korróziós technikákkal készült anatómiai tanulmányok és
elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták, hogy a szigetek vérellátása kapuér- rendszeréhez hasonlít (11). A rendszer alapját egy
pásztázó a máj
glomerulus-szerű
érhálózat alkotja, amelyet a szigetek méretétől függően, 1-5 kis arteriola táplál. Ezek egy efferens plexusba szedődnek össze, majd az elvezető venulákba ömlenek (73). Számuk ugyancsak a sziget méretétől
függ és egytől hatig változhat. Ezzel
párhuzamosan található egy másik elvezető rendszer, amely kapilláris nagyságú ereket tartalmaz és közvetlen összeköttetést képez a szigetek körül levő exocrin parenchyma ereivel. Ez a hálózat alkotja az ún. inzulo-acinaris porta rendszert (73). A kisebb(<100) szigetek erei elsősorban a környező exocrin szövet kapilláris hálózatába integrálódnak, míg a nagyobb (>150 µm) szigetek érrendszere a fent leírt elrendeződést mutatja (19). A véráram iránya a szigetek érhálózatán belül alapvető fontosságú a hormontermelő sejtek meghatározott elhelyezkedése miatt. Az inzulintermelő B (béta) sejtek elsősorban centrálisan találhatók, míg az A (alfa), D (delta) és PP (pancreas polypeptid) sejtek inkább a szigetek perifériáján helyezkednek el (74). A véráramlás iránya tehát szerepet játszik a komplex hormonális szabályozásban és befolyásolhatja a sejtek közötti kölcsönhatásokat (75). A véráramlás iránya és jellege azonban nem teljesen tisztázott a szigeteken belül. Az irodalmi adatok három fő modellt ismertetnek. Az első modell szerint a vér a periféria felől a B (béta) sejtek felé áramlik, ezáltal a non-B-sejtek által termelt 17
hormonoknak, a glucagonnak, a somatostatinnak és a pancreas polypeptidnek lehet közvetlen szabályozó hatása az inzulin elválasztására (11). A második modell szerint az áramlás fordított, tehát az inzulin szabályozza a non-B-sejtek hormontermelését. A harmadik modell a két első közötti átmeneteként, belső és külső ércsatornák létezését vélelmezi, amelyek nyitásával és zárásával a pillanatnyi szükségletnek megfelelően szabályozható a hormontermelés (76). Kísérletes vizsgálatok azt is igazolták, hogy a szigetekre háruló metabolikus terhelés növekedése, például tartós glukóz infúzió (77) vagy részleges pancreas reszekció (78), jelentősen megnöveli az egyes szigetek véráramlását. A véráramlás fokozódásában, a mesterséges hyperglykaemia (glukóz infúzió) esetén főleg idegi tényezők, elsősorban a nervus vagus rostjai játszanak szerepet (79). A vagushoz kapcsolódó glukóz-receptorokat írtak le a pancreas mellett az agyban, a szájüregben és a duodenumban is, míg a májban ezek a receptorok elsősorban a szimpatikus idegvégződésekhez kötődnek. Tekintettel arra, hogy a szigetek elveszítik az idegi összeköttetéseiket az izoláció során, ez kihatással lehet a szabályozásra is (80). Azt is megfigyelték, hogy teljes pancreas átültetésekor a denervált szövet elveszíti a glukóz adására történő korai véráramlás fokozó képességét (81). Tartósan magas vércukorszint esetén azonban a szigetekre háruló fokozott metabolikus terhelés önmagában is képes a véráramlás fokozására, elsősorban a termelődő adenosin révén (82). Ezek a mechanizmusok különösen fontosak lehetnek a transzplantációt követően, de figyelembe kell venni azt is, hogy túlzott igénybevételük a szigetek kimerüléséhez vezethet. Egy autoimmun eredetű diabetes állatkísérletes modellben például,
a szigetek véráramlásának
csökkenését írták le a magas vércukorszint
ellenére, mert a szabályozó mechanizmusok nem érvényesülhettek az endothel sejtek és a fenesztrált kapillárisok közvetlen károsodása miatt (83). A szigetek véráramlásának szabályozásában az endothel sejtek által termelt mediátoroknak,
elsősorban a nitrikus-oxidnak (NO), az angiotenzin II-nek, az
endothelinek és a natriureticus-peptidnek is fontos szerepet tulajdonítanak. A megfelelő NO termelés fontosnak tűnik a szigetsejtek fokozott véráramlásának fenntartásában is metabolikus terhelés esetén (82).
18
A fenti kísérletes adatok jól érzékeltetik, hogy a Langerhans-szigetek keringése összetett hormonális, idegi és metabolikus szabályozás alatt áll és egyben felhívják a figyelmet a revascularisatio fontosságára a transzplantáció után. 2.2.5. A transzplantált szigetek revascularisatioja A transzplantációra kerülő egyéb szervekkel (máj, vese, szív, tüdő, teljes hasnyálmirigy) szemben, amelyek vérrellátását az éranastomosisok elkészítése után helyreállítjuk, a szigetek gyakorlatilag avascularisnak tekinthetők. Az enzimatikus emésztés és az ezt követő szeparálás során ugyanis az érösszeköttetések megszakadnak. A transzplantáció után, egy új érhálózat gyors kiépítésére van szükség a megfelelő
oxigén- és tápanyagellátás, valamint a szabályozó mechanizmusok
mielőbbi helyreállítása érdekében. A szabadon átültetett szigetek in vivo revascularisatioját elemző intravitalis mikroszkópos vizsgálatok azt mutatták, hogy az angiogenesis első lépései, tehát a kapillárisok még vakon végződő kezdeményei már a transzplantációt követő második napon megjelennek. A 4.-6. naptól látható valódi keringés az újonnan formálódott erekben (11). A teljes érhálózat kialakulása a beültetés utáni 10-14 nap körüli időszakra tehető és ez a hálózat már olyan glomerulus-szerű érszerkezetet mutat, amilyent a hasnyálmirigyben in situ elhelyezkedő szigetek tartalmaznak. Ezek a megfigyelések alátámasztják a korábbi szövettani vizsgálatokat is, amelyek szerint a szigetsejtek revascularisatioja a transzplantációt követő két hét után nyeri el végleges formáját (84). A sziget-graft érszerkezetének további elemzéseiből kiderült, hogy az újonnan kialakult endothelium az eredeti, in situ szerkezethez hasonlóan fenesztrált és a főleg a recipiens szervezet sejtjeiből képződik (85). Brissova és mtsai transzplantált humán szigeteket vizsgálva a közelmúltban viszont azt találták, hogy a szigetek belsejében, az izolálás után
túlélő, saját endothel-sejtek is aktívan részt vesznek a
transzplantációt követő revascularisatioban (86). Az újonnan képződött kapillárisok sejtjeinek eredete fontos, mert a rejekciós folyamatok első támadáspontját éppen az endotheliumsejtek képezik.
19
A transzplantált szigetek új érhálózata általában hasonló a pancreasban in situ található szigetek érszerkezetéhez, tehát a kapillárisokat 1-4 tápláló arteriola látja el és a vénás elvezetés 1-6 kis venulán át történik. Emellett Menger és mtsai leírtak egy másik kapillárishálózatot is a transzplantált szigetek és a befogadó szervezet erei között, amelynek szerkezete hasonlít a pancreasban található, a szigetek és az exocrin szövet határán levő, inzulo-acinaris portarendszerhez (11). A véráramlás irányát elemezve a transzplantált szigeteken belül, kimutatták, hogy a vér a szigetek belseje felől a periféria felé áramlik (11). Ez az inzulinnak a többi szigetsejt-hormon (glucagon és somatostatin) elválasztására gyakorolt szabályozó szerepét valószínűsíti. A svéd munkacsoport, Carlsson és mtsainak újabb vizsgálatai is rávilágítanak arra, hogy
a transzplantáció után kialakult új érhálózat nem teljesen azonos a
pancreasban levő eredeti érszerkezettel. Az endothelium és a kiserek mennyisége, valamint az erek sűrűsége ugyanis lényegesen kisebb a transzplantáció után. Nagyobb metabolikus terhelés esetén ennek közvetlen hatása lehet a beültetett szigetek funkciójára (16; 87). Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy szigetek sérülékenyek a transzplantációt követő korai angiogenesis időszakában, ugyanis a megfelelő érellátás hiányában fokozottan ki vannak téve a befogadó szervezet gyulladásos és immunológiai reakcióinak.
2.2.6. A transzplantált szigetek revascularisatioját befolyásoló tényezők Számos kísérletes tanulmány foglalkozott a sziget izoláció egyes lépéseinek és a
transzplantációt
követő
revascularisatio
folyamatának
kapcsolatával.
Megállapították, hogy az izoláció végén nyert preparátum minősége befolyásolhatja az optimális szigetsejt működést és a revascularisatiot (88). Ide tartozik az ép és fragmentált szigetek aránya az emésztés után, a szigetek viabilitása az izolálás végén és az exocrin elemek jelenléte. Ez utóbbi kérdés azért érdekes, mert a szigetek autotranszplantációjakor,
amelyet
kiterjesztett
pancreas
reszekciót
követően
alkalmaznak a sebészi diabetes megelőzésére, szeparáció nem történik, tehát a szigetek és az exocrin szövetelemek együttes beültetését végzik jó eredménnyel (8991). Gray és mtsai viszont, állatkísérletes modellben azt találták, hogy az exocrin 20
elemek jelenléte gátolja a szigetek implantációját allotranszplantáció esetén (92). Hasonlóan, Heuser és mtsai intravitális fluoreszecens mikroszkópos vizsgálatokkal is kimutatták, hogy az exocrin szövet mennyisége hátrányosan befolyásolja az új erek képződését (93). A szigetek optimális szeparációja tehát alapvető fontosságú a transzplantációt követő hatékony angiogenesis és revascularisatio szempontjából. A szigetek mérete is hatással van az implantációra és az új erek képződésére. A Langerhans-szigetek átmérője 50 és 400 µm-között változik. Ideális lenne csak a nagy szigeteket transzplantálni, de általában a végső sziget preparátum inkább kisebb, 50 és 100 µm körüli szigeteket tartalmaz. Ennek egyik oka a nagyobb szigetek fragmentálódása az enzimatikus emésztés során. Wolf és mtsai a szigetek mérete és a revascularisatio összefüggéseit vizsgálták (94). Eredményeik szerint a graftok implantációja és revascularisatioja lényeges jobb a nagyobb szigetek transzplantációja esetén. Valószínűnek tartják, hogy a nagyobb szigetek erőteljesebb angiogén stimulusokat kiváltására képesek. Menger és mtsai a szigetek sejtkultúrája és az angiogenesis összefüggéseit elemezték. Megfigyeléseik szerint az egy hetes sejtkultúra, 24 illetve 37°C-on, alapvetően nem befolyásolja a transzplantációt követő angiogenesist (11). Mások, konfokális mikroszkópos és immunhisztokémiai módszerekkel megállapították, hogy a 24 órás szigetsejt kultúra nincs káros hatással a beültetést követő angiogenesisre (17). Ezek az adatok teljes összhangban vannak az újabb eredményekkel, amelyek szerint a szigetek 24-72 órás sejtkultúrában tartása a transzplantáció előtt kifejezetten előnyös (95). A sejtkultúrában ugyanis az erőteljes gyulladásos reakciót kiváltó exocrin elemek életképessége csökkent, a sérült szigetek elpusztulnak, majd a sejttenyésztő folyadék cseréjével eltávolításra kerülnek a belőlük felszabaduló citokinekkel együtt. Ezáltal egy tisztább és működőképesebb preparátum kerülhet beültetésre. Ezen kívül, a szigetek inkubátoros tárolása lehetővé teszi a transzplantáció
optimális
időzítését,
a
szükséges
immunológiai
vizsgálatok
elvégzését, és a nagy (>1000 km) távolságra történő szállítást (96). A 80’-as években végzett kísérletes vizsgálatok azt sugallták, hogy a recipiensek hyperglycaemiája is hátrányosan érintené a szabadon transzplantált szigetek vérellátását (97). Ezt
a revascularisatio közvetlen gátlásával, illetve a 21
szigeteken
belüli
véráramlást
irányító
belső
szabályozó
mechanizmusok
csökkenésével magyarázták. Menger és mtsai viszont a közelmúltban végzett intravitalis mikroszkópos vizsgálatokkal azt találták, hogy a hyperglycaemiának nincs közvetlen hatása a transzplantált szigetek revascularisatiojára, sőt a pancreason belül leírt in situ fiziológiás viszonyokhoz hasonlóan, a transzplantált szigetek véráramlását fokozza (11). Hasonló eredményre jutottak Moldovan és mtsai Lézer-Dopplerrel végzett áramlásvizsgálataik során. Megfigyelték, hogy a recipiens hyperglycaemia áramlásfokozó hatása a beültetett szigetekben NO által mediált mechanizmusok révén valósul meg (98). Ez utóbbi hasonló az in situ szabályozáshoz (99). Logikus kérdésfelvetés a rejekció megelőzésére adott immunoszuppresszív gyógyszerek hatásának vizsgálata a transzplantált szigetek angiogenesisére. Ezek a szerek általában erélyes antiproliferatív hatással is rendelkeznek és ezáltal csökkenthetik az angiogenesishez szükséges folyamatokat. A gyógyszerek hatásának vizsgálatához
syngenicus
szigetsejt
transzplantációs
állatkísérletes
modell
alkalmazható, hogy a gyógyszerek közvetlen hatását elkülöníthessük a rejekció okozta immunfolyamatoktól. A cyclosporin-A (Cy-A) hatását in vivo vizsgálva Vajkoczy és mtsai szerint a gyógyszernek csak minimális hátrányos befolyása van a szigetsejt graft revascularisatiojára (100). Mendola szerint, a Cy-A alkalmazása hosszas adagolás esetén sem vezet a szigetek véráramlásának csökkenéséhez, vagy a microkapillárisok sűrűségének csökkenéséhez (101). Az RS-61443 vizsgálatakor, amely aktív hatóanygként mycofenolsavat tartalmaz, kimutatták, hogy az angiogenesis folyamatát késlelteti, de nem csökkenti a szigetek perfúzióját és a nem vezet az endothelsejtek közvetlen károsodásához (102) . A Edmonton-protokollban alkalmazott sirolimusnak, a calcineurin-gátlókhoz (Cy-A és tacrolimus) hasonlóan nincs igazolt in vitro diabetogén hatása, és a szigetekre ható direkt toxicus hatását sem mutatták ki (103). Erélyes antiproliferatív hatása miatt azonban gátolhatja az angiogenesist, amint ezt tumorok esetében ki is mutatták (104; 105). Desai és mtsai megmérték az Edmontonprotokollban használt tacrolimus és sirolimus szinteket a perifériás vérben és a vena portaeban humán szigetsejt-transzplantáció közben és azt találták, hogy a gyógyszerkoncentráció lényegesen magasabb volt a portában (106). Ez hatással lehet a szigetek implantációjára illetve az ehhez szükséges angiogenesisre is.
22
Hirschberg és mtsai szigetsejt allotranszplantációt végeztek majmokon az Edmonton-protokoll gyógyszereit alkalmazva, majd a portarendszerbe transzplantált szigeteket részletes szövettani feldolgozásnak vetették alá (107). Azt találták, hogy a transzplantációt követő ötödik napon a szigetek körül nem igazolható még kapillárisképződés, de harminc illetve kilencven nappal a beültetés után a szigetek szervültek és önálló érhálózattal rendelkeznek, amely elválasztja őket a porta ágak lumenétől. Eredményeik alapján hangsúlyozták, hogy a beültetett szigetek az új erek kialakulásáig sérülékenyek, emiatt a transzplantációt követő napokban exogén inzulin adása jó hatású lehet a nagyfokú direkt metabolikus terhelés csökkentése érdekében. A
Langerhans-szigeteket
alkotó
sejteket,
egymástól
elválasztva
és
sejttenyészetbe helyezve az eredeti szigetek szerkezetéhez hasonló egységeket, ún. pseudo-szigeteket kapunk (108). Ennek a felismerésnek főleg a béta-sejtek esetén van különös jelentősége. A sejtek ugyanis sejttenyészetben szaporíthatók, ami elméletileg korlátlan sejtforrást tehet lehetővé, másrészt a szeparált sejtek in vitro módosíthatók. A
különböző
transzplantációt
faktorok követő
hozzáadása szervülést
illetve és
a
sejtek
csökkentheti
a
módosítása
javíthatja
befogadó
szervezet
immunválaszát (109). A pseudo-szigetek érellátását vizsgálva a transzplantáció után, Beger és mtsai kimutatták, hogy a revascularisatio a teljes szigetekéhez hasonlóan megy végbe, jóllehet a folyamat hosszabb időt vesz igénybe (110). In vivo vizsgálataik szerint, az új érhálózat afferens arteriolákból, glomerulus-szerű kapillárishálózatból és efferens venulákból épül fel a pszeudo-szigetek esetében is. Perfúziójuk is hasonló a teljes szigetekéhez, a vér itt is centrális irányból áramlik a periféria felé. A hormontermelő pseudo-szigetek transzplantációja vonzó alternatívája lehet a teljes Langerhans-sziget transzplantációnak. Összegzésképpen elmondhatjuk, hogy a revascularisatio rendkívül fontos a transzplantált szigetsejtek szervülése és megfelelő endocrin működése szempontjából. Emiatt, a szigetsejtek funkciójának javítását célzó új stratégiáknak magukba kell foglalniuk az angiogenesist segítő mechanizmusokat. A folyamat részletei molekuláris szinten nem tisztázottak. Több molekula szerepét vizsgálták, amelyek közül egyik legfontosabb a vascularis endothelialis növekedési faktor vagy VEGF. 23
2.2.7. A VEGF –A és szerepe a transzplantált szigetek angiogenesisben Az angiogenesis új kapillárisok kialakulását jelenti a már meglevő erek kezdeményeiből (111). Alapvető szerepe van az embrionális fejlődésben, az egyes szervek növekedésében, a sebgyógyulásban, a női nemi ciklusban és a placenta fejlődésében
(112).
Hasonlóan
pathomechanizmusában is (113).
fontos
szerepet
játszik
számos
kórkép
Az angiogenesis vizsgálata az érdeklődés
középpontjába került az elmúlt évtizedben a malignus tumorok áttétképződésének kutatása kapcsán (114-116). A daganatok növekedéséhez, lokális terjedéséhez és áttétképződéséhez ugyanis szintén új erek képződésére van szükség (117-119). Az angiogenesis részleteit vizsgáló kutatások igazolták, hogy az új erek képződése egy komplex, többlépcsős folyamat, amelyben több szabályozó molekula vesz részt (120). Ezek közül legfontosabbnak a VEGF-t tartják (121). A VEGF alapvető szerepet játszik az angiogenesis elindításában és az endothel sejtek proliferációjának kiváltásában (122). Ezen kívül szabályozó funkciót tölt be az új érhálózat kialakításában is (123). Az elsőként felfedezett formája, a VEGF-A, fokozza a kapillárisok
permeabilitását
és vasodilatiot is okoz elsősorban az
endothelium sejtek NO-szintáz rendszerének stimulációjával (124). Emellett elősegíti az endothelsejtek migrációját és gátolja apoptosisukat is (125).
24
A.
B.
3. ábra. A. A VEGF háromdimenziós szerkezetének modellje és B. a VEGF által szabályozott tumor angiogenesis folyamatának sémás ábrázolása (126).
25
Szerkezetét tekintve a VEGF, egy heparinhoz kötődő glycoprotein, molekulatömege 45 kDa és homodimer formában választódik ki (3. ábra A.)(127). Az elsőként leírt formája, a VEGF-A növeli az erek áteresztőképességét, ezért vascularis permeabilitási faktornak is nevezték (128). A VEGF-A csoportnak több variánsa ismeretes, a fontosabbak 121, 165, 189 illetve 206 aminosavat tartalmaznak (129). A csoport legtöbbet vizsgált és legfontosabb tagja a VEGF165. A VEGF 206-os formája csak ritkán expresszálódik és leginkább a foetalis májban fordul elő. A közelmúltban két újabb VEGF-A proteint a 145-ös és 183-as variánst is leírtak (130). A VEGF 121, 165, 189 illetve 206 aminosavat tartalmazó variánsai heparinhoz kötődő doméneket tartalmaznak, amelyek segítségével az extracellularis matrixhoz és a VEGF receptorokhoz kapcsolódhatnak (131). Ez a kötődés kulcsfontosságú a hatékony működéshez és ennek megfelelően a heparint tartalmazó variánsok aktívabbak (132). A fentieken kívül a VEGF család más tagjait is leírták. Ezek közül a VEGF-B, -C, és -D csoportnak tulajdonítanank fontosabb szerepet (133; 134). Az utóbbiak nem vesznek részt közvetlenül az angiogenesisben és hatásmechanizmusuk is különböző (135; 136). Három VEGF-receptorcsaládot ismerünk, ezek a következők: a VEGF-R1 vagy Flt-1, a VEGF-R2 vagy Flk-1 és a VEGF-R3 vagy Flt-4 (137). Közös jellemzőjük, hogy többszörös IgG-szerű extracelluláris doméneket tartalmaznak és tyrosine kináz aktivitással rendelkeznek (138; 139). A fentieken kívül az endothel sejteken két másik VEGF receptor, a Neuropillin-1 és -2 is expresszálódik (140). A VEGF-A a VEGF-R1 és VEGF-R2 receptorhoz, valamint a Neuropillin 1-2-höz kötődik elsősorban (141). A VEGF-B a VEGF-R1-hez, míg a VEGF-C és D a VEGFR2-höz és –R3 hoz kötődik (142; 143). A VEGF-C/VEGF-R3 kapcsolatnak a nyirokerek képződésében, a lymphangiogenesisben tulajdonítanak szerepet (144). A VEGF-R1-nek létezik egy szolubilis formája is, amely a perifériás vérben is detektálható és erőteljesen kötődik a VEGF-hez (145). Ezt kihasználva, a szolubilis VEGF receptor adása alkalmas lehet arra, hogy a VEGF kötődését és ezáltal az angiogenesist gátolja (146). A VEGF-R1 és VEGF-R2 receptorok fokozottan expresszálódnak a tumorokon és a proliferáló endothel sejteken. Ennek kiváltásában a hypoxia és a VEGF-A közvetlen hatása játszik szerepet. A VEGF-R1 erőteljesebb és ezáltal hatékonyabb kötődést biztosít, szabályozza az endothel sejtek motilitását és a 26
kapillárisok permeabilitását, a VEGF-R2 viszont nélkülözhetetlen az endothel sejtek proliferációjához (147). A VEGF-A transzkripcióját a hypoxiás állapot és egyes aktivált onkogének váltják ki és tartják fent. A regulációban különböző transzkripciós faktorok vesznek részt, ezek a
hif-1α és hif-2 α, (hif = hypoxia inducible factor) (148).
Jellegzetességük, hogy normoxiás állapotban inaktívak és a proteosomák lebontják, hypoxiás állapotban viszont aktiválódnak (149; 150). A hypoxia által bekövetkező indukció a VEGF-A-ra jellemző leginkább. A VEGF-A transzkripciót normoxia esetén a különböző onkogének, mint pl. a H-ras illetve egyes transmembán tyrosine kinázok, mint az epidermalis growth factor receptor és az erbB2 aktiválják (151; 152). Ezek a folyamatok a VEGF-A expresszió fokozódásához vezetnek a tumoros szövetekben, és a prognosztikai jelentőségük van a daganatok angiogenesise és növekedése szempontjából (3. ábra B.) (153). A VEGF egyik legfontosabb forrását a thrombocyták képezik, amelyek aggregáció esetén VEGF-t választanak ki (154). A magas keringő VEGF tartalom detektálható a betegek
szérumában (155). Számos tanulmány igazolta, hogy a
szérumban észlelt magas VEGF tartalom szoros összefüggésben van a
magas
thrombocyta számmal. A tumorok ugyanis olyan cytokineket termelnek, amelyek a csontvelőben stimulálják a megakaryocyták képzését és ezáltal a thrombocyták számának növelésével fokozzák az angiogenesishez szükséges VEGF képzést (156; 157). A VEGF-t fontos szerepet játszik különböző angiogenesist igénylő kórképekben is. A diabeteses retinopathia például magas intraocularis VEGF koncentrációval jár (158). Oki tényezőnek tartják a psoriasis és a rheumatoid arthritis kialakulában is (159). A VEGF termelődés gátlása -a corpus luteum működésének blokkolásával- infertilitást okozhat (160). Legfontosabb szerepet talán a tumorok angiogenesisében
játszik. A VEGF által szabályozott folyamatok lépéseinek
feltárásával lehetőség nyílik az angiogenesis gátlására illetve az erre ható gyógyszerek előállítására (161). Ide sorolhatjuk a VEGF receptor antagonistákat, a szelektív tyrosine kináz gátlókat és azon génterápiás módszereket, amelyek a hypoxiás mechanizmuson át szabályozzák a VEGF termelődését (162-165). A fentiek miatt, a VEGF által meghatározott jelátviteli mechanizmus kiemelt jelentőséggel bír számos kórkép potenciális gyógyításában. 27
A VEGF tehát egy jelentős angiogenesist indukáló és érpermeabilitást fokozó mitogén factor, amely elsősorban az endothel sejtekből származik. Mindkét folyamat alapvető fontosságú a beültetett
szigetsejtek túléléséhez. Az izoláció során
megszakad az afferens és efferens arteriolák hálózata és megsérül a kapillárisokat alkotó fenesztrált endotheliális réteg. A devascularisált szigetek hypoxiás állapotban vannak, ennek megfelelően az oxigén- és transzplantáció utáni napokban.
tápanyagellátásuk elégtelen a
A csökkent vérellátás miatt kialakult szöveti
ischaemia a szigetekben centrálisan elhelyezkedő béta-sejteket érinti leginkább (166). Emiatt a mielőbbi revascularisatio alapvető fontosságú a szigetek túlélése és megfelelő működése szempontjából. A revascularisatio során megváltozhat a véráram iránya is a szigeteken belül, ennek közvetlen hatása van a
regulációs
mechanizmusokra és az endokrin funkcióra (167). Az új erek természetes képződése lassan megy végbe, ezalatt a szigetek egy része elpusztulhat. Ezért
szigetsejt
revascularisatiot elősegítő faktorok lényegesen javíthatják a szigetsejtek túlélését és megfelelő endocrin működésést a transzplantáció után. E tekintetben is az egyik legfontosabb faktor a VEGF. Hogyan kapcsolódik a VEGF a Langerhans- szigetekhez? Gorden és mtsai a VEGF és
receptorainak (flt és flk-1) expresszióját vizsgálták izolált patkány
Langerhans-szigeteken (168).
RT-PCR technikával bizonyították, hogy a VEGF
receptorok (flt és flk-1) jelen vannak és expresszálódnak a frissen izolált szigetekben. Azt találták, hogy az in vitro sejtkultúrában,
feltehetően a hypoxiás környezet
hatására, a szigetekben levő VEGF- mRNA 4-6-szorosára növekedik. Hypoxiás illetve anoxiás körülmények között
a szigetekben levő VEGF termelődés is
fokozódik. A növekedési faktor két izoformája, a VEGF120 és a VEGF164, megtalálható a szigetekben illetve az egér inzulinomából származó, a kutatásokban gyakran használt (RINm5F-2A, INS-1, and MIN6) béta-sejtvonalakban is (168). Ezek az eredmények első ízben tanusították, hogy a devascularisatio és a társuló hypoxiás állapot növeli a VEGF elválasztást a szigeteken belül és a VEGF egyik fontos kiváltó faktora lehet az in vivo szigetsejt revascularisationak. Felvetik annak lehetőségét is, hogy a VEGF elválasztás növelése a szigetekben, a beültetés előtt, elősegítheti a szigetsejt implantációt és revascularisatiot a transzplantáció után (168). Ugyanehhez a gondolatsorhoz csatlakozva, mások 28
az exogén VEGF hatását
vizsgálták, nevezetesen azt, hogy a növekedési faktor külső hozzáadása a szigetsejt preparátumhoz milyen hatással van a transzplantációt követő neo-vascularisatiora. Stagner és mtsai azt találták, hogy a szigetsejt izoláció után adott külső VEGF növeli a
szigetsejt-graftok
túlélését
Lewis
patkányokban
(169).
Mikroelektródás
vizsgálatokkal kimutatták, hogy a VEGF növeli a graft környezetében levő oxigén mennyiségét. Az immunhisztokémiai elemzés során felmerült, hogy a VEGF gátolta az MHC II antigén expresszálódását és a szigetsejtek apoptosisának illetve nekrózisának gátlásával jelentősen javította a transzplantációt követő szigetsejt túlélést. Sigrist és mtsai szintén azt találták, hogy az encapsulált, tehát báriummembránnal a környező immunhatásoktól izolált, transzplantált patkány szigetek túlélése és funkciója
jelentősen javult exogén humán VEGF jelenlétében (170).
Tillmar és mtsai in vitro vizsgálatai kimutatták, hogy izolált patkány szigetsejtekben 19 olyan gén expresszálódik, amelyek serkentik vagy gátolják az angiogenesist (171). Hypoxiás körülmények között azonban csak a VEGF és a Tie-1 (epidermal growth factor homology domains 1) túltermelődését lehetett igazolni (171). A szigetekben tehát, az angiogenesist serkentő és gátló faktorok termelődnek. A serkentő faktorok túlsúlya szükséges a transzplantációt követő angiogenesishez. Véleményünk szerint a szigetek illetve a béta-sejtek genetikai módosítása lehetővé teheti ezen egyensúlynak az angiogenesist serkentő irányba történő elmozdítását. A folyamat egyik kulcsmolekulája a VEGF lehet (171).
29
3. CÉLKI TŰZÉS Jelen értekezés célja a szigetsejt transzplantáció korai eredményeit befolyásoló tényezők vizsgálata az átültetést követő béta-sejt funkció javításának érdekében. Két tényezővel foglalkoztam kiemelten a szigetsejt transzplantáció komplex folyamatából, a szigetek izolációjához szükséges emésztőenzimek vizsgálatával és a transzplantációt követő szigetsejt revascularisatio sajátosságaival. A sziget izolációk sikerének kulcsa a megfelelő emésztőenzim használata. Számos előnyük mellett, a napjainkban alkalmazott enzimek egyik fő jellemzője a kiszámíthatatlan aktivitás. Ez az egyik legfontosabb oka annak, hogy a sziget izolációknak átlagosan csak a fele sikeres. Ezért, munkám első részében egy új, több komponensű enzimet vizsgáltam és hasonlítottam össze a humán szigetsejt izolációk jelenlegi gyakorlatában elterjedt Liberase HI enzimmel. A fentiek tükrében a következő kérdéseket tettem fel: 1. Milyen az új enzimkészítmény aktivitásának stabilitása a Liberase HI enzimmel összehasonlítva? 2. Különbözik-e a két enzimmel izolált szigetek morfológiája? 3. Milyen az új enzimmel izolált szigetek in vitro inzulin elválasztása? 4. Hogyan változik az izolált szigetek in vivo endokrin funkciója állatkísérletes modellben… 5. ..és humán transzplantációk esetében? A transzplantáció után észlelt nagyfokú szigetsejt veszteség egyik fő oka a szigetek
elégtelen
vascularisatioja.
Ezért,
a
transzplantált
szigetsejtek
revascularisatioját kutatva, választ kerestem arra, hogy a fokozott VEGF-A expresszió a transzplantált szigetek környezetében hogyan befolyásolja a revascularisatiot és a szigetek működését. Figyelembe véve a kontrollálatlan VEGF szekréció potenciálisan káros hatásait, célom volt a VEGF expressziót és a következményes szigetsejt vascularisatiot gyógyszeresen szabályozható transzplantációs modell kidolgozása is.
30
Az első állatkísérletes modell során homozigóta Rip-VEGF-A transzgenikus egerekkel dolgoztam, amelyek jellegzetessége, hogy béta-sejtjeikben fokozottan expresszálják a VEGF-A-t. Itt a következő kérdésekre kerestem választ: 6. Milyen hatást gyakorol a fokozott VEGF-A génexpresszió a Rip-VEGF-A szigetek in vitro inzulin elválasztására? 7. Javítják-e a Rip-VEGF-A homozigóta transzgenikus egerekből izolált szigetek a diabeteses recipiensek szénhidrát anyagcseréjét a transzplantációt követően? További vizsgálataim során ezt a témát részletesebben elemeztem, választ kerestem a béta-sejtek fokozott VEGF expressziójának szerepére az in vitro angiogenesisben, illetve a transzplantált szigetsejtek revascularisatiojában és működésében. Vizsgáltam az in vitro és in vivo folyamatok szabályozhatóságát tetracyclinnel. Kérdéseim a következők voltak: 8. Képes-e az általunk kialakított és genetikailag módosított béta-sejtvonal stabil VEGF-A szekrécióra ? 9. Hogyan befolyásolja a béta-sejtek fokozott VEGF-A expressziója az in vitro angiogenesist? 10. Szabályozható-e ez a folyamat tetracyclin hozzáadásával in vitro? 11. Hatással van-e a genetikai módosítás a béta-sejt szigetek in vitro inzulin elválasztására? 12. Milyen a transzplantált béta-sejt szigetek in vivo endokrin működése? 13. Hogyan befolyásolja a fokozott VEGF-A szekréció a transzplantációt követő revascularisatiot és ez milyen összefüggésben van a transzplantált béta-sejtek funkciójával?
31
14. Szabályozható-e tetracyclin hozzáadásával a transzplantációt követő lokális VEGF expresszió és a revascularisatio?
32
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. A COLLAGENASE NB1 ENZIMMEL VÉGZETT VIZSGÁLATOK 4.1.1. Az enzimkészítmények jellemzői, összetétele A Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 (Serva Electrophoresis GMBH, Heidelberg, Németország) enzimpreparátumot vizsgáltuk a humán szigetsejt izolációkban. A készítmény újdonsága, hogy a collagenase-t és a neutral protease-t külön választották. A szétválasztás előnye, hogy a két fő komponens külön adagolható és az aktivitás a pancreas összetételétől függően titrálható. Az egyes összetevők nagyfokban tisztítottak, az enzimek elhanyagolható mennyiségű endotoxint tartalmaznak. Az új enzimmel nyert adatokat a humán izolációkban leggyakrabban
használt
Liberase
HI
(Roche)
enzimkészítménnyel
kapott
eredményekkel hasonlítottuk össze. Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 optimális arányát előzetes állatkísérletek során határoztuk meg (61). A Liberase HI tisztított collagenase és neutral protease keverékéből áll és endotoxin tartalma szintén minimális (14). A két enzikészítmény jellemzőit az alábbi táblázatban foglaltuk össze. U/mg
Collagenase NB1
Liberase HI
Collagenase aktivitás
4,02
3,43
Trypsin aktivitás
0,013
0,041
Neutral protease aktivitás
0,02
0,17
Endotoxin tartalom
1,3
33
1. táblázat A humán izolációkhoz használt két enzimkészítmény jellemzői Az első csoportban végzett izolációk során egy adag gyári kiszerelésű Collagenase NB1 enzimkészítményt használtunk, amelynek a gyárilag megadott collagenase aktivitása 4,02 PZ U/mg, endotoxin tartalma 1,3 EU/mg volt. Ehhez, az előzetes kísérleteink eredménye alapján, 20 dimethyl casein (DMC) egységnyi Neutral Protease-NB1-t adtunk, hogy elérjük a 30 DMC –s neutral protease aktivitást.
33
A második csoportban, egy és egy negyed adag (625 mg) adag Liberase HI enzimet használtunk, az elfogadott és ajánlott nemzetközi gyakorlatnak megfelelően. Ennek a gyárilag megadott aktivitása 2,124 Wünsch (a PZ egységnek megfelelő aktivitás), neutral protease aktivitása 77,798 U/mg (caseinase módszerrel). Ez 4,25 U/mg-os collagenase aktivitásnak felel meg. A készítmény endotoxin tartalma 35,7 EU/mg-os volt. Az enzimeket 300 ml Hank’s Balanced Saline Solution (Mediatech, Herndon, VA, US) oldatban oldottuk fel, Pefabloc SC plus-t (Roche-Boerhringer-Mannheim) adtunk hozzá 4mM-os koncentrációban, valamint HEPES-t (Mediatech) 25mM-os végső koncentrációban. 4.1.2. A humán szigetek izolációja A pancreasokat különböző centrumokban távolították el agyhalott donorokból. A szállítás 4°C-os University of Wisconsin oldatban történt asepticus körülmények között. A szigetek izolációja, a Genfi Szigetsejt Izolációs és Transzplantációs Központban alkalmazott, módosított félautomata Ricordi-módszerrel történt minden esetben (65). Röviden, a fő pancreas vezetéket asepticus műtői körülmények között feltártuk, két irányban kanüláltuk, majd a szervet hideg enzimoldattal feltöltöttük kontrollált nyomást biztosító folyadék-adagoló pumpa segítségével (4. ábra).
4. ábra A kanülált pancreas vezeték és az enzimoldattal feltöltött pancreas
34
Ezt követően a szervet feldaraboltuk és az enzimmel együtt a Ricordi-kamrába helyeztük (5.ábra).
5. ábra A Genfben módosított Ricordi-kamra (Raymond Mage engedélyével) A fenti ábrán látható Ricordi-kamra jellegzetessége, hogy a beépített ablakon nyomon követhető az emésztés menete. A rendszer hőmérséklete szabályozható, a kamrát az enzim optimális működéséhez szükséges 37°C-ra melegítettük. Az enzimatikus emésztést mechanikus mozgatás is segítette. 10-15 perc elteltével mintákat vettünk a preparátumból, a szigeteket dithizone festékkel festettük, amelynek jellegzetessége, hogy az életképes szigetekben felhalmozódik. A preparátumból ítéltük meg a pancreas szövet emésztettségének fokát és amennyiben ez megfelelő volt, az emésztés leállítása mellett döntöttünk. Ez 4°C–os, humán albumint is tartalmazó oldattal történt. Ezt követte a preparátum gyors centrifugálása hűtött centrifugában. 35
A szigetek elválasztását az emésztett exocrin szövettől hűtött COBE 2991-es sejtszeparátorral (COBE, Lakewood, Co) végeztük, folyamatas sűrűség grádiensű Ficoll cukoroldat alkalmazásával (6. ábra).
COBE Cell Processor®
6. ábra A szigetek szétválasztására használt számítógép vezérelt sejtszparáló centrifuga Ezt követően, a szigeteket elkülönítettük a különbőző tisztasági foknak megfelelően, megszámoltuk és szigetsejt-equivalensre konvertáltuk. A szigetek számának
és
morfológiájának
vizsgálatát
fénymikroszkóppal
végeztük.
Az
életképességet (vitalitását) fluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiphot, Felbach, Svájc)
vizsgáltuk,
fluorescein-diacetát
és
propidium-jodid
(Sigma-Aldrich,
Gillingham, UK) festéssel, az irodalomban elfogadott módszerek alapján (172). Az izolációkat ugyanazon team végezte mindkét csoportban, a szigetek számolása és a vitalitás értékelése két különböző személy által történt.
36
4.1.3. Az enzimek gyártási vonalainak vizsgálata 2002 és 2003 között a Genfi Szigetsejt Izoláló Központban végzett nyolcvan egymást követő humán szigetsejt izoláció adatait dolgoztuk fel. Három különböző Collagenase-NB1 és hat Liberase HI enzim gyártási vonalát elemeztük és azt vizsgáltuk, hogy egy pancreasból milyen mennyiségű sziget nyerhető ki a különböző enzimekkel. 4.1.4. Az izolált humán szigetek morfológiai vizsgálatai A két enzimmel kilenc-kilenc humán szigetsejt izolációt végeztünk (I. csoport Collagenase NB1, II. csoport Liberase HI). Az eredményeket összevetettük a donor adatokkal. Megvizsgáltuk, hogy egy pancreasból milyen mennyiségű sziget nyerhető ki, elemeztük és összehasonlítottuk a szigetek morfológiáját, in vitro funkcióját és a szigeteket alkotó sejtek apoptosisát az izolációkat követően. 4.1.5. A szigetek apoptosisának és inzulin szekréciójának vizsgálata Az apoptosis vizsgálatokat 100-100 szigetsejt equivalensből,
12 órás
sejtkultúra után végeztük, TUNEL módszerrel. Erre a célra Cell Death Detection ELISA kittet (Roche-Boehringer-Mannheim) használtunk, amely az apoptosis miatt létrejövő és a cytoplasmában található microsomalis particulumokat (sejt lysatumok) detektálja. Az in vitro inzulin elválasztást 50-50 izolált szigeten, 2,8 mmol/l-es, 25 mmol/l-es majd ismételten 2,8 mmol/l-es
glukóz stimuláció után vizsgáltuk. A
felülúszóban levő inzulin mennyiségét Ultrasensitive Human Insulin ELISA-val (Marcomedia AB, Uppsala, Svédország) mértük. A stimulációs indexet (SI) a basalis és a stimulációt követő inzulin elválasztás arányából kaptuk. Az akut inzulin választ (AIR) a stimulált és a basalis inzulin válasz különbségéből számítottuk. 4.1.6. In vivo vizsgálatok: állatkísérletes és humán transzplantációk Állatkísérleteink során diabeteses thymushiányos (nude) egereket használtunk recipiensként. Ebben az esetben, nem kell rejectioval számolnunk a humán sejtekkel 37
történő xenotranszplantáció ellenére sem. A kísérletek a genfi Egyetemi Tanács Etikai Bizottságának engedélyével történtek. A diabetest Streptozotocin (200 mg/kg) intraperitonealis injekciójával idéztük elő. A vércukorszintet naponta mértük az állatok
farokvénájából
strip-glukométerrel
(Abbott
Medisense,
Wiesbaden,
Németország). Az állatokat akkor használtuk recipiensként, ha a vércukor meghaladta a 16 mmol/l-es értéket három egymást követő napon. Négy-négy humán szigetsejt preparátumból 3x1000 szigetsejt-equivalensnyi szigetet transzplantáltunk a kísérleti állatok bal vesekapszulája alá. A graftokat akkor tekintettük működőképesnek, ha a diabeteses recipiensek vércukorértéke 11 mmol/l alá csökkent a transzplantáció után és ez az érték legalább két napig fennállt. A vizsgálat során kilenc humán transzplantációt is végeztünk a két enzimmel izolált szigetekkel. A szigetek beültethetőségének kritériumai a következők voltak: 70%-ot meghaladó vitalitás, 30%-ot meghaladó tisztaság, minimum 5000 IEQ/recipiens testsúly kilogramm, kevesebb mint 10 ml-es végső térfogat és a végső preparátumból negatív Gram festés. A transzplantációk megoszlása és a recipiensek kiválasztása független volt a jelen vizsgálattól. A beültetés minden esetben percutan transhepaticus módszerrel történt a vena portae rendszerébe. A szigetsejt graftok funkcióját a beültetés előtti és a transzplantáció után egy hónap múlva szükséges napi külső inzulin mennyiség összehasonlításával vizsgáltuk. A statisztikai méréseket a GraphPad InStat softver 3.00 for Windows (GraphPad, San Diego, CA) verziójával végeztük. A változók összehasonlítása Student t próbával, illetve Fischer-exact teszttel történt. A P értéket 0.05 alatt tekintettük szignifikánsnak.
38
4.2. A FOKOZOTT VEGF-A EXPRESSZIÓ VIZSGÁLATA 4.2.1. A RIP-VEGF szigetekkel végzett kutatások 4.2.1.1. A RIP-VEGF szigetek izolációja és in vitro glukóz stimulációs vizsgálata A RIP-VEGF transzgenikus egereket Gannon és mtsai írták le, jellemzőjük, hogy a pancreas béta-sejtjeiben, a RIP (Rat-Insulin-Promoter) által szabályozott módon, szelektív humán VEGF-A termelésre képesek (173). heterozigóta
egérvonalból,
a
VEGF
expresszió
fokozásának
A
érdekében,
homozigóta vonalat hoztunk létre, az irodalomban elfogadott tenyésztési módszerek alkalmazásával (174). A transzgenikus egerek és a kontroll egerek pancreasából, collagenase emésztéssel izoláltuk a szigeteket, az irodalomban elfogadott módszerek alapján (175).
Röviden
összefoglalva:
a
szigetsejt
donorokat
intraperitonealis
pentobarbital injekcióval elaltattunk, majd cervicalis dislocatiot végeztünk. A hasüreget megnyitottuk, a pancreast látótérbe hoztuk. A choledochust a máj felé egy fém klippel lefogtuk és distal felől kanülálva, 4°C-os,
V-ös típusú
collagenase-t tartalmazó (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) oldattal ((Hank’s balanced salt solution (HBSS), 2mg/7ml-es koncentrációban)) a pancreast feltöltöttük. Ezután eltávolítottuk és a jégen tárolt hideg enzim oldatba tettük. Ezt követően, 37°C-os melegvizes fürdőbe helyeztük 18 percre, ahol az enzim aktiválódott és megtörtént az emésztés. A szövetek szétválasztását, a folyamat végén erőteljes rázással tettük teljessé. A
túlemésztés megakadályozására a
preparátumhoz hideg HBSS-t adtunk és ezáltal az emésztést leállítottuk.
A
készítményt 450 μm-es fémszűrőn átszűrtük, majd Euro-Ficoll cukoroldatban 800 g-al 16 percig centrifugáltuk a szigetek és az exocrin elemek szétválasztására. A szigetek tisztaságát és méretét dithizone (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) festés után ítéltük meg. Ezt követően a szigeteket megszámoltuk. A különböző méretű szigeteket, egy erre a célra kifejlesztett képlettel, 150 µm-es szigetsejtequivalensre (IEQ) konvertáltuk az irodalomban leírt módszer alapján (175).
39
A RIP-VEGF-Tg egerekből és a kontroll csoportból izolált 50-50 szigetet, éjszakai inkubálást követően, 2,8mmol/l glukózt tartalmazó Krebs-Ringer bikarbonát (kontroll KRB) oldatban, 37C-on előinkubáltuk. Ezt követően, háromszor egy órás inkubációt végeztünk, egy órát friss kontroll KRB-vel, egy órát 16,7 mmol/l glukózt tartalmazó KRB-vel, majd ismételten egy órát kontroll KRB-vel. A felülúszó inzulin tartalmát ELISA-val (Mercodia, Svédország) mértük. A kísérleteket három-három mintán, háromszor ismételtük. 4.2.1.2. A RIP-VEGF szigetek transzplantációja A
szuboptimális
mennyiségű
szigetsejt
transzplantáció
módszerét
Kaufman és mtsai dolgozták ki a transzplantált szigetek mikrokörnyezetére ható effektusok vizsgálatára (176). Eszerint, a kedvező faktorokat tartalmazó szigetek, marginális
mennyiségben
(esetünkben
3500
IEQ/tskg)
transzplantálva,
gyorsabban képesek a diabeteses recipiensek vércukorértékeinek normalizálására, mint a kontroll csoportból izoláltak.
Recipiensként
streptozotocinnal (STZ,
Sigma, Buchs, Svájc) (200 mg/kg i.p.) diabetesessé tett syngenicus egereket használtunk. A szigeteket a bal vese kapszulája alá transzplantáltuk az irodalomban leírt metodika szerint (177). Röviden, a recipienseket Isoflurannal altattuk, majd dezinficiálást követően a baloldalon végzett lumbalis metszéből a bal vesét előemeltük és a jégen tartott szigetsejt preparátumot a bal vese kapszulája alá injektáltuk. Ezt követően a sebet csomós öltésekkel zártuk. A nem-éhomi szérum glukóz szintet naponta mértük a kísérleti állatok farokvénájából. végpontja a diabeteses egerek vércukorszintjének
normalizálásáig eltelt idő
mérése és a kontrollcsoporttal történő összehasonlítása volt.
40
Kísérletünk
4.2.2.
A
TET-VEGF
BÉTA-SEJTEKKEL
VÉGZETT
KUTATÁSOK 4.2.2.1. In vitro kísérletek: angiogenesis és tetracyclines gátlás A kísérletes munkánknak ebben a részében gyógyszeresen szabályozható VEGF-A szekréciót mutató béta-sejtvonalat hoztunk létre. Ehhez Dupraz és mtsai által módosított immortalizált egér inzulinoma sejtvonal további
genetikai
átalakítását végeztük (178). A CDM3D sejtek, Efrat és mtsai (Albert Einstein college, NY) által izolált és leírt, βTC-tet sejtvonalból származó, immortalizált egér béta-sejtek, amelyek a genetikai módosítás révén, human bcl-2-t is expresszálnak (179). A sejteket Dulbecco szerint módosított Eagle mediumban (DMEM, Life Technologies Inc.) tenyésztettük, 15%-os borjúszérum, 2.5%-os lószérum, 10mmol/l Hepes, 1mmol/l nátrium-pyruvate és 2mmol/l glutamine hozzáadásával, az irodalmi adatoknak megfelelően (180). A médiumhoz Tetracycline-t (TC) (Fluka) is adtunk, 1μg/ml-es koncentrációban. A stabil inzulin szekréciót mutató, felhasználásával átalakítottuk,
és ezáltal
CDM3D sejtvonalat adenovírus vektor egy, a VEGF-t fokozottan expresszáló
sejtvonalat hoztunk létre (TET-VEGF sejtek). A VEGF-164 egér cDNS Dr. W. Risau (Max-Planck-Institut für Psychiatrie, Martinsried, Germany) szívélyes ajándéka. Ezt, a Xho-I és Not-I site-okat felhasználva, klónozással átalakítottuk és egy SIN-18phosphoglycerate kinase-woodchuck hepatitis vírus vektort (SIN-18-PGK-WHV) hoztunk létre (181; 182). A tetracycline-el indukálható VEGF vírus vektort a következő módon állítottuk össze: a pUHD-13-3 plasmidot (amelyet Dr. H. Bujard-tól -ZMBH Zentrum für Molecular Biology, Heidelberg, Németország kaptunk), amely a minimal-hCMV-tetn promotert is magába foglalta, EcoRI-vel emésztettük. Az mVEGF-164 cDNs molekulát,
az
EcoRI site-ok felhasználásával,
pUHD-13-3
molekulává klónoztuk. Ezt követően a minimal-hCMV-tetop és az mVEGF164 cDNS expressziós kazettát PGK promoterre cseréltük a SIN-18-PGK-WHV vírus vektorban (183). Magas vírustitert hoztunk létre, a VSV-G envelope
felhasználásával, az
irodalomban leírt módszereknek megfelelelően (180). A vírustitert
41
p24 enzyme-
linked immunosorbent assay-el (ELISA; NEN Life Science Products Inc. Boston, MA) határoztuk meg, a gyártó útmutatásainak figyelembevételével. A CDM3D sejteket többszörös (10-20x) vírusinfekcióval hoztuk létre (7. ábra). Az infekciót követően 48 órával szelektáltuk az új sejteket, G418 hozzáadásával (800μg/ml egy hétig, majd 400μg/ml adagban még egy hétig). A PGKVEGF lentivírussal fertőzött sejteket CDM3D-PGK-VEGF sejteknek, a tet-op-VEGF lentivírussal infektált sejteket pedig CDM3D-TET-VEGF sejteknek neveztük (7. ábra). A CDM3D, CDM3D-PGK és CDM3D-TET sejteket, 12-üreges lemezen tenyésztettük, 100.000 sejt/üreg-es sűrűségben. A következő napon, újra inkubáltuk 1ml friss médiumban (DMEM, 15% HS, 2.5% FCS) hat órán át. Ezt 48 órás ismételt inkubálás követte TC (1μg/ml) jelenlétében, majd a sejteket további hat órán át TC-t tartalmazó médiumban tenyésztettük. A VEGF szekréciót a médiumban egér VEGFELISA-kittel (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) mértük. A klónozott borjú microvascularis endothel sejtek (BME)
a Columbia
Egyetemről (NY) származtak, M.B. Furie és S.C. Silverstein nagylelkű ajándékaként (182). A BME sejteket 1.5%-os gelatinnal bevont szövettenyésztési flakonokban (Falcon, Beckton Dickinson Labware, Franklin Lanes, NJ) tenyésztettük, alfamódosított (α-MEM, Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Scotland) médiumban, 15%-os borjúszérum (DCS, Gibco) és antibiotikumok hozzáadásával.
7. ábra A lentivírus infekció sematicus ábrája: A. Az egér PGK promoter indukálja a VEGF 164 expresszióját, B. A tetracycline operatorhoz kötődő hCMV promoter kicseréli a PGK promotert tetracyclinnel szabályozható tet-OP VEGF164 szekvenciára.
42
A kollagén gélt 16 mm2 –es, 4 üreges sejtkultúra lapokon preparáltuk (Nunc, Roskilde, Denmark), az irodalomban leírt módszer alapján (182). Patkány-farok preparátumból készült I-es típusú kollagént (1.5mg/ml-es koncentrációban) minimal essential médiumban (MEM) nátrium bikarbonáttal (11.76 mg/ml) kevertünk, majd a preparátumot 37ºC-on hagytuk géllé formálódni (184). A kontroll sejtkultúrákban (8.ábra A.), a BME sejteket 500μl kollagén gélre helyeztük, 100.000 sejt/üreg koncentrációban, 500μl
α-MEM (endothel sejt
médium)/DMEM (βTC-tet sejt médium) médiumban, 1:1-es arányban, 5% DCS hozzáadásával. Három nap elteltével, a médiumot cseréltük és a sejteket rekombináns human VEGF-el (165 amino acid isoform) (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) vagy egér rekombináns VEGF-el (164 amino acid isoform) (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) kezeltük. A médiumot és a VEGF-t kétnaponta cseréltük és a praparátumot 5 nap VEGF kezelés után fixáltuk. A béta-sejt/endothelialis sejt kulturában, a sejteket (CDM3D, CDM3D-PGK or CDM3D-TET), 10’000 or 35’000 sejt/üreg koncentrációban, 350μl kollagén gélre helyeztük. Ezt követte második rétegként, egy sejt-mentes kollagénréteg illetve harmadikként a BME sejtek (100.000 sejt/üreg koncentrációban 500μl αMEM/DMEM médiumban, 1:1 5%-os DCS hozzáadásával) (8.ábra B.) (185). A kontrollhoz hasonlóan, a médiumot cseréltük és 5 nap múlva fixáltuk. Egyes esetekben
egér rekombináns VEGF164-t semlegesítő ellenanyagot adtunk a
rendszerhez 2ug/ml-es koncentrációban. (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Az endothelsejtekből kialakult új erek penetrációját a gélben véletlenszerűen kiválasztott mezőkben mértük az irodalmi leírásoknak megfelelően (186). Az eredmények kísérletenként legalább három adatsor átlagát és legalább két kísérlet adatait tükrözik.
43
8. ábra In vitro angiogenesis három dimenziós modellje. A. Az endothel sejtek konfluáló rétege a gél felszínén B. A béta-sejtek és a BME endothel sejtek a kollagén gél által elválasztva
44
A béta-sejt szigeteket, (2x106 sejt/sejttípus), 15 ml DMEM-ben, 37°C-on történő, nem-adherens, agarózzal bevont sejtkultúra lapokon történő tenyésztésével hoztuk létre (110). Két nap elteltével, 95%-ban 250-300μm átmérőjű, stabil, szigetszerű (islet-like) aggregátumokat kaptunk (8. ábra).
9. ábra A béta-sejtekből 48 órás tenyésztés után kialakult pseudo-szigetek (400x-os nagyítás)
6
A CDM3D-TET-VEGF és a kontroll CDM3D sejtekből (2x10 béta-sejtből), 48 órás tenyésztést követően kialakult szigetekkel, a fentiekhez hasonlóan, 2,8 illetve 16,7 mmol/l glukózt tartalmazó KRB-vel szekvenciális inkubálást végeztünk, azzal a különbséggel, hogy a 16,7 mmol/l-es glukózoldathoz 0,25mmol/l-es iso-butyl-metylxantint (IBMX) is adtunk. A kísérleteket három-három mintán, háromszor ismételtük.
45
4.2.2.2. A revascularisatio és a tetracyclines gátlás vizsgálata a TET-VEGF szigetek transzplantációja után A béta-sejt szigeteket, a fent leírt módon, egy szintén syngeneticus modell keretében, STZ diabeteses egerek vesekapszulája alá transzplantáltuk. Az átültetett
sejtek működését, a korábban leírtakhoz hasonlóan, a
vércukorszint rendszeres meghatározásával és intraperitonealis glukóz tolerancia teszttel (IPGTT) követtük, az irodalomban elfogadott módszerek szerint (177). Röviden, 16 órás éhhomi állapot és vércukor mérés után, intraperitonealis (i.p.) glukóz injekciót (2g/kg) adtunk, majd 15, 30, 60, 90 és 120 perc múlva ismételten megmértük a szérum glukóz szinteket. A szigetsejt graftokat tartalmazó veséket, hat héttel a transzplantációt követően eltávolítottuk és szövettani vizsgálatokat végeztünk. A szerveket 10%-os formalinban fixáltuk, etanollal dehydráltuk és paraffinos metszeteket készítettünk. Az 5μm-es metszeteket üveglemezre vittük, majd neuraminidase X-el (SigmaAldrich) előkezeltük. Az endothelium sejtekhez speciálisan kötődő Bandeiraea simplicifolia (BS-1) lektin alapú festést alkalmaztunk a vizsgálatára,
revascularisatio
Mattsson és mtsai által leírt módszernek megfelelően (187).
Röviden: a metszeteket normál kecske szérummal (Dakopatts, Glostrup, Denmark) 30 percig inkubáltuk szoba hőmérsékleten. Ezt követően, felvittük a BS-1 készítményt a metszetekre, és két órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Tris-buffered sóoldatban (TBS) 3x5 percig mostuk, és Strept AB Complexben (Dakopatts) szoba hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Az ismételt mosást követően, frissen preparált fuchsin szubtrátum rendszert (Dakopatts) adtunk hozzá és a metszeteket előhívtuk. A fuchsin szubsztrátumban levő endogen alkalikus phosphatase aktivitás kizárására, 1 mol/l, desztillált vízben oldott levamisol-t (Sigma-Aldrich) adtunk a rendszerhez az előhívás előtt. A metszeteket Haematoxyllinnal is megfestettük. A kontroll metszeteket kecske szérummal inkubáltuk, amelyet TBS-en oldottunk, és amely 0.1%-os borjú szérum albumint tartalmazott (1:20-as hígítási arányban) a BS-1 helyett. Legalább tizenkét, véletlenszerűen kiválasztott szeletet elemeztünk minden graftból. A BS-1-el
46
festett endotheliális sejteket két különböző személy kétszer számolta. A neovascularisatio mértékét a megfestett endothel sejtekből határoztuk meg. Két különálló kísérletsorozatot végeztünk az in vivo tetracylines gátlás vizsgálatára. Az elsőben tetracyclinnel előkezelt (1ug/ml 48 órán át) kontroll bétasejteket és TET-VEGF sejteket transzplantáltunk diabeteses egerekbe. Ezt követően, a recipiensek folyamatos tetracyclin kezelésben részesültek (1mg/ml az ivóvízben). A második csoportban, a fenti két sejttípus átültetése mellett, a recipienseket csak akkor kezeltük tetracyclinnel (1mg/ml), ha a vércukorszint már normalizálódott a transzplantáció után. Mindkét csoportban IPGTT vizsgálatot is végeztünk. Hat kísérleti állatot vizsgáltunk minden csoportban. Kísérletes munkánkat Svájcban, a Genfi Egyetemi Központban végeztük, a helyi egyetemi tanács etikai engedélyével és az érvényben levő helyi és általános állatvédelmi előírások maradéktalan betartásával. A statisztikai számításokhoz az SPSS 10.0 (SPSS Institute, Chicago, IL, USA) számítógépes programot használtuk.
Az összehasonlító számítások Student-t
próbával illetve ANOVA teszttel készültek. A különbséget P<0.05 esetén tartottuk szignifikánsnak.
47
5. EREDMÉNYEK 5.1. AZ ENZIMVIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI 5.1.1. A gyártási vonalak vizsgálatának eredményei Az agyhalott donorok adatai között nem volt szignifikáns különbség, tehát a pancreasok minősége összehasonlítható volt a két csoport között. Eszerint az agyhalál oka 6 illetve 31 esetben trauma, 10 ill. 33 esetben cerebrovascularis vérzés (p=0,4) volt; a donorok életkora 44,3+4,4 év ill. 43,7+2,9 év (p=0,5) között mozgott; donorok testtömeg indexe (BMI) 25,3+ 0,7kg/m ill. 25,5+ 0,7 kg/m volt az NB1-es illetve a Liberase csoportban. Pozitív inotrop
készítmény adására 81% ill. 75%-ban volt
szükség (p=0,6), a pancreasok tömege 93+ 4,5 gramm ill. 98+ 2,5 gramm és a hideg ischaemiás idő (CIT) 5,9+ 0,1 illetve 5,9+ 0,1 óra volt a két csoportban. A Liberase HI enzimmel végzett izolációk során nyert szigetsejt-equivalensek száma (IEQ) 150.000 és 303.000 között mozgott, míg a Collagenase NB1 enzim alkalmazása esetén ez a szám lényegesen nagyobb volt, a szigetek száma (IEQ) 267.000 és 368.000 között változott. Hasonló eltérést kaptunk akkor is, ha az izolált szigetek számát egy gram pancreas szövetre számoltuk ki (1370+3460 a Liberase HI esetében és 3160+3540 a Collagenase-NB1 alkalmazásakor). A standard deviáció is nagyobb volt a Liberase HI esetében, ami az egy gyártási vonalon belüli változékonyságra utal. 5.1.2. Az izolált humán szigetek morfológiai vizsgálatainak eredményei Kilenc-kilenc humán izolációt végeztünk a két enzim aktív és hatékony gyártási vonalával. Az első csoportban Collagenase NB1-t míg a másodikban Liberase HI-t használtunk. A donorok tekintetében nem volt lényeges különbség a két csoport között (2. táblázat). A meleg ischaemiás idő átlaga volt kissé hosszabb az első csoportban (p<0,05). Az egy gram pancreasszövetből kinyerhető szigetek száma szignifikánsan magasabb volt az első csoportban (4020+1240) a Liberase csoporttal (2360+1350) 48
összehasonlítva (p<0,05) (10. ábra). Az izolált szigetek és a sziget-equivalens adatainak aránya, amely az izolált szigetek méretét tükrözi, szignifikánsan magasabb volt az I-es (NB1) csoportban (1,35+0,5) összehasonlítva a II-es (Liberase) csoporttal (2,14+0,6, p<0,01). A szigetsejt preparátumok végső térfogata hasonló volt a két csoportban, de a preparátum tisztasága magasabb volt az első csoportban (62%+6% illetve 53 %+8%, p<0,05) (3. táblázat). Az izolált szigetek életképessége (vitalitása) hasonló volt a két csoportban. Az in vitro glukóz stimulációs teszt is hasonló volt a két csoportban.
Az első csoportban viszont szignifikánsan alacsonyabb volt a
szigetekben levő sejtek apoptosisa
a 12 órás
sejtkulturát követően. Magasabb
százalékban találtunk intakt szigeteket és kisebb volt a fragmentálódott, valamint az exocrin szövettel még körülvett (trapped) szigetek aránya is (11. és 12. ábra). 2.. táblázat A donorok adatai a humán izolációkban (n=9/ csoport)
Életkor [év]
I. csoport NB1 48 ± 11
II. csoport Liberase 46 ± 11
0,4
BMI [kg/m2]
25 ± 2
26 ± 4
0,3
WIT [perc]
54 ± 19
38 ± 9
<0,05
CIT [óra]
5,4 ± 2
5,6 ± 2
0,5
Pancreas súlya [gr]
93 ± 16
111 ± 35
0,09
49
p
8000
SzSejt és IEQ/1 gram pancreas
7000 6000
*
5000 Islet IE
4000 3000 2000 1000 0
Group I
Group II
10. ábra A szigetsejtek száma és a szigetsetj-equivalens (IEQ) egy gram pancreasra számítva az enzimatikus emésztés és tisztítás után (*p<0,02), (I csoport NB1, II. csoport Liberase HI) 3. táblázat Az izolált szigetsejtek jellemzői a két csoportban
IEQ (103)
I. csoport NB1 354,4 ± 65
II. csoport Liberase 271,9 ± 147
0,08
IEQ/g pancreas (103)
4,02 ± 1,20
2,36 ± 1,35
<0,05
IEQ/Szigetek száma
0,83 ± 0.2
0,51 ± 0,1
<0,01
62 ± 6
53 ± 8
<0,05
3,8 ± 1,6
4,2 ± 2,1
0,3
96 ± 1
94 ± 2
0,1
1,25 ± 0,03
7,25 ± 1,23
<0,05
Tisztaság (%) Végső szövet térfogat (ml) Vitalitás (%) Apoptoticus sejtek a 12 órás sejtkultúra után (%)
50
p
80 *
70 60 "trapped"
50
szabad fragmentált
40 30
*
20 10 0 I . csoport
(NB1)
II. csoport (Liberase)
11. ábra A két enzimmel izolált szigetek morfológiai jellemzői 9-9 humán izoláció során (*p<0,05). A következő ábra a Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 enzimkészítménnyel végzett egyik humán izoláció során készült. Első részében dithizone-al festett szigetek láthatók a szeparáció előtt, körülvéve az exocrin szövetelemekkel. A szigetek épek és környezetüktől jól elkülönülnek (12. ábra A.). Az ábra második része a tisztított szigeteket mutatja be hasonló festéssel az elválasztást követően. Látható, hogy a preparátum tiszta, exocrin elemeket nem tartalmaz. A szigetek nem fragmentálódtak és a nagyobb (>150µm) méretűek is megőrizték integritásukat (12. ábra B.).
51
A.
B. 12. ábra A. Szigetek (nyilak) és exocrin szövet az új enzimmel történt enzimatikus emésztés után és a szeparálás előtt (400x-os nagyítás, dithizone festés) B. Collagenase NB1 enzimkészítménnyel izolált tisztított szigetek. Látható, hogy a nagyobb (>150µm) szigetek(nyíl) is megőrizték integritásukat. (400x-os nagyítás, dithizone festés)
52
5.1.3. Az állatkísérletes és humán sziget transzplantációk eredményei Az izolált humán szigetek in vivo működésésnek megítélésére, első körben, állatkísérletes
transzplantációkat
végeztünk.
Kémiai
úton,
streptozotocinnal
diabetesessé tett „nude” egerek bal vesekapszulája alá transzplantáltuk a szigeteket az irodalomban leírt és a későbbiekben részletezett módszer szerint. A diabeteses recipiensek normoglykaemiássá váltak a beültetést követő 48 órán belül mindkét csoportban. A magas vércukorszint normalizálódásáig eltelt idő 1,2+0,4 nap volt a Collagenase NB1 és 1,1+0,3 nap a Liberase HI csoportban. A különbség nem volt szignifikáns (p=0,28). Miután meggyőződtünk a Collagenase NB1-el izolált szigetek kiváló in vitro és in vivo működéséről előzetes humán transzplantációkat is végeztünk. Kilenc sziget izoláció után öt esetben végeztünk transzplantációt az első csoportban (56%), míg négy esetben a második csoportban (44%). A transzplantált betegek napi exogén inzulin szükséglete több mint felére csökkent az első csoportban, míg ugyanezt mindössze két esetben észleltük a II. csoportban. Az átlagos napi inzulin szükséglet a transzplantáció előtt 38+10U/nap illetve 50+11U/nap volt a két csoportban. Egy hónappal a transzplantáció után ez 8+3U/napra illetve 32+13U/napra csökkent az első és a második csoportban. A különbség nem volt szignifikáns. Két beteg az első, míg egy beteg a második csoportból teljesen elhagyhatta a külső inzulint egy hónappal a transzplantáció után. Mindkét csoportban volt olyan beteg aki már részesült szigetsejt transzplantációban és az újabb beültetés second transzplantációnak minősült (két beteg az első és egy beteg a második csoportban). Ezért, ezen kezdeti eredmények mindössze arra utalnak, hogy az új enzimmel izolált szigetek a humán transzplantációk vonatkozásában is működőképesek. A további következtetésekhez azonban nagyobb esetszám, homogén betegcsoport és részletesebb adatelemzés szükséges.
53
13. ábra Percutan transhepaticus portographia a szigetsejt-transzplantáció előtt. A vena portae-ba helyezett kanülön történt a szigetek lassú infúziója.
54
5.2. A FOKOZOTT VEGF-A EXPRESSZIÓ VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI 5.2.1. A RIP-VEGF szigetek transzplantációjának eredményei Kísérleteinkben a VEGF-t fokozottan elválasztó szigetek in vitro és a transzplantációt követő in vivo funkcióját vizsgáltuk. Az in vitro glukóz stimulációs teszttel arra kerestünk választ, hogy a VEGFA génexpresszió hatással volt-e a RIP-VEGF-A szigetek inzulin elválasztására. A 2,8 mmol/l glukóz koncentrációval végzett stimulációra adott válasz gyakorlatilag azonos volt a kontrollcsoportéval. A 16,7 mmol/l-es koncentráció mellett mintegy háromszorosára emelkedett inzulin szekréciót mértünk a Rip-VEGF egerekből izolált szigeteknél és a kontrollcsoportnál egyaránt. Eredményeink arra utalnak, hogy a VEGF-A
fokozott expressziója a Rip-VEGF-A szigetekben nem
befolyásolta számottevően a szigetsejtek in vitro glukóz stimulációra adott válaszát. A Rip-VEGF transzgenikus egerek pancreasából collagenase emésztéssel izolált szigetek az alábbi ábrán láthatók (14. ábra).
14. ábra A Rip-VEGF transzgenikus homozigóta egerek pancreasából izolált szigetek natív fáziskontraszt mikroszkópos átnézeti képe (200x-os nagyítás).
55
A vesekapszula alá transzplantált szigetek jól elkülöníthetően szervültek (15. ábra A.), új ereket képeztek és inzulin termeltek (15. ábra B.).
A. 15.ábra A. A vesekapszula alá transzplantált Rip-VEGF-Tg szigetek (nyíl), HE festés 20x-os nagyítás
56
B. 15. ábra B. A vesekapszula alá transzplantált és inzulint termelő Rip-VEGF-Tg szigetek (nyíl), inzulin festéssel, 20x-os nagyítás A transzplantált diabeteses állatok felének szérum glukóz szintje 26 nap után, a teljes csoporté átlagosan 39 nap után normalizálódott, ha a kontroll állatokból izolált szigeteket transzplantáltuk. Ezzel szemben, a Rip-VEGF egerekből izolált és transzplantált szigetek szignifikánsan (p=0,008) gyorsabban korrigálták a diabeteses egerek vércukorszintjét, így a recipiensek fele 16 nap után, a teljes csoport pedig 21 nap után vált normoglikaemiássá (16. ábra).
57
* 100
Normoglikaemiás recipiensek %
90 80
Kontroll Rip-VEGF Tg
70 60 50 40 30 20 10
35
28
21
14
7
0
0
A transzplantációt követő napok
16. ábra A normoglykemiát elérő recipiensek %-os aránya szuboptimális mennyiségű (3500 IEQ/tskg) Langerhans-sziget transzplantációja esetén n=5, *p=0,008
58
5.2.2. A TET-VEGF BÉTA-SEJTEKKEL VÉGZETT KUTATÁSOK EREDMÉNYEI 5.2.2.1.
Az
in
vitro
angiogenesis
és
tetracyclines
gátlás
vizsgálatának eredményei Kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy a genetikailag módosított béta-sejtek fokozott VEGF expressziója hatással van-e a revascularisatiora in vitro és a transzplantációt követően in vivo. Választ kerestünk arra is, hogy a revascularisatio milyen összefüggésben van a transzplantált szigetsejtek endokrin működésével és hogyan lehetne a folyamatot tetracyclinnel szabályozni. A három dimenziós kollagén gélen tenyésztett endothel sejtek (BME sejtek) konfluáltak, de a gél felszínén maradtak a vizsgálat során, és ez nem változott tetracyclin hozzáadásakor sem (17. ábra a, b). A BME sejtek és a kontroll CDM3D sejtek együttes tenyésztése esetében minimális érképződést észleltünk, amely TC hozzáadásakor gyakorlatilag mérhetetlenné vált (17. ábra e, f). A külső rekombináns humán vagy egér VEGF hozzáadása a rendszerhez (17. ábra c, d) illetve ha a VEGF-t szekretáló béta-sejtekkel történő együttes tenyésztéskor (17. ábra g, i), az endothel sejtek a gélbe penetráltak és elágazó, majd hálózatot alkotó kapillárisokat hoztak létre. Az érinvázió mértéke egyenes arányban volt a sejtkultúrához adott, VEGF-t expresszáló béta-sejtek számával. VEGF ellenes antitest hozzáadása a rendszerhez 92%(±5)-al csökkentette az érinváziót. Hasonló jelenséget észleltünk akkor is, ha kontrollként rekombináns humán vagy egér VEGF-t adtunk a kontroll sejtekhez. Az érinvázió arányos volt a rekombináns humán és egér VEGF dózisával és ezt a folyamatot a tetracyclin hozzáadása nem befolyásolta ). A BME sejtek és a CDM3DPGK-sejtek együttes tenyésztése az egér VEGF-t neutralizáló antitest jelenlétében nem
váltott
ki
angiogenesist
(17.
ábra
h).
Hasonlóan
nem
észletünk
kapillárisképződést a TC-al 48 óráig előkezelt CDM3D-TET sejtek és a BME-sejtek ko-kulturája esetén sem.
59
17. ábra Az in vitro angiogenesis fázis kontrasztos képei: (a) BME sejt monolayer a gél felszínén; (b)BME sejtek tetracyclin (TC) jelenlétében; (c) humán rekombináns VEGF-165-el kezelt BME sejtek kapillárisokat képeznek a gélben; (d) az érinvázió hasonló TC hozáadása esetén; (e) BME és CDM3D sejtek ko-kulturája; (f) BME sejtek és CDM3D sejtek ko-kulturája TC jelenlétében; (g) BME és CDM3D-PGK sejtek ko-kulturája; (h) BME és CDM3D-PGK sejtek ko-kulturája egér VEGF-t neutralizáló antitest jelenlétében; (i) BME és CDM3D-TET sejtek ko-kulturája; (j) TC-el két napig előkezelt CDM3D-TET sejtek ko-kulturája BME sejtekkel.
60
Az érinvázió mértékét a gélbe penetráló endothel sejtekből képződő tubulusok és kapillárisok összhosszának mérésével határoztuk meg (18. ábra).
4000
nm +anti-rmVEGF TC at d=0 TC at d=0+anti-rmVEGF TC at d=-2
Total additive sprout length (mm)
3000
2000
1000
0
CDM3D
CDM3D-TET
Cells co-cultivated with BME cells
18. ábra Az endothel sejtinvázió mértéke CDM3D és CDM3D-TET sejtekkel történő ko-kulturában. Tetracyclint (1µg/ml) adtunk a rendszerhez a TC-vel jelzett helyen. Az egér VEGF-t semlegesítő antitestet (anti-rmVEGF) 2 µg/ml dózisban adtuk a kísérlet kezdetétől. Kontroll ko-kultúra (fekete oszlop), anti-rmVEGF antitest jelenléte (csíkos oszlop), TC jelenléte a 0. naptól (kis pontok), TC from és anti-rmVEGF (pepita oszlop). TC adása a 2. naptól kezdve (üres oszlop).
61
Összehasonlítva tehát a TET-VEGF-sejtek és a kontroll CDM3D sejtek együttes tenyésztését az endothelsejtekkel, ötször nagyobb érinváziót észleltünk az előbbi esetben és ez az in vitro a folyamat gátolható volt tetracyclin hozzáadásával. A VEGF-A fokozott expressziója a módosított béta-sejtekben nem befolyásolta számottevően a szigetsejtek in vitro glukóz stimulációra adott válaszát, a mért különbség nem volt szignifikáns.
5.2.2.2.
A
transzplantált
TET-VEGF
szigetek
működésének,
revascularisatiojának, és a tetracyclines szabályozás vizsgálatának eredményei Az eredeti CDM3D béta-sejtvonalból képzett szigetszerű sejtcsoportok transzplantációjakor
(kontrollcsoport),
vércukorszintje átlagosan
a
diabeteses
recipiensek
felének
harminc nap után, a teljes csoporté 38 nap után
normalizálódott. A TET-VEGF csoportban viszont, mindez szignifikánsan (p<0,05) gyorsabban következett be, a csoport fele átlagosan húsz nap után, a teljes csoport pedig 24 nap után vált normoglikaemiássá (19. ábra). Hasonló eredményt mutatott, a 28. posztoperatív napon végzett intraperitonealis glukóztolerancia teszt (IPGTT) is (20. ábra). Eszerint, a glukózterhelésre adott válasz szignifikánsan jobb volt a VEGF-t expresszáló sejtek transzplantációjakor.
62
* 100
Kontroll CDM3D sejtek TET-VEGF sejtek
Normoglikaemiás recipiensek %
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
35
A transzplantációt követő napok
19. ábra A normoglykaemiát elérő recipiensek %-os aránya TET-VEGF béta-sejt szigetek transzplantációja esetén n=10, *p<0,001
63
Kontroll
40
TET-VEGF
35
Szérum glukóz mmol/l
30 25
*
20 15 10 5 0 0
15
30
60
90
120
180
Idő (perc)
20. ábra IPGTT 28 nappal a béta-sejt transzplantáció után. A szérum glukóz mérése, 16 órás éhezést követően, 2g/kg glukóz i.p. injekciója után : 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel történt.* p < 0,01
A tetracyclinnel előkezelt sejtekkel (kontroll sejtek illetve TET-VEGF sejtek) transzplantált állatok, a transzplantáció ellenére diabetesesek maradtak. Ez a tény arra utal, hogy a tetracyclin hatásosan gátolta a VEGF expressziót és a sejtek proliferációját. A másik csoportban, ahol a vércukorszint normalizálódása után adtunk tetracyclint a transzplantációt követően, a szérum glukóz tartósan a normál tartományban maradt, azt sugallva, hogy a VEGF expresszió és a sejtproliferáció a tetracyclin hozzáadásával hatásosan szabályozható (21. ábra).
64
30
Szérum glukóz (mmol/l)
Graftectomia
TET
25 20 15 10 5 0 0
1
5
10
15
20
25
30
35
40
43
A transzplantációt követő napok
21. ábra TET-VEGF béta-sejt szigetekkel transzplantált és tetracyclinnel kezelt recipiensek szérum glukóz értékei. A normoglykaemia elérése után adott tetracyclin leállította a VEGF termelését a graftfunkció megtartása mellett. A graftectomia után a recipiensek újra diabetesessé váltak. n = 5
A szigetsejt graftokat tartalmazó veséket hat héttel a transzplantáció után eltávolítottuk. Ezt követően ismételt vércukorszint mérésekkel győződtünk meg arról, hogy a vércukorszint normalizálódását nem a saját pancreasban lévő bétasejtek regenerációja okozta. Az operált állatok kivétel nélkül újra diabetesessé váltak a graft-nephrectomiát követő órákban (21. ábra). A revascularisatiot az endothel sejtekhez kötődő speciális festéssel vizsgáltuk a graftokban (22. ábra). Szignifikánsan (p<0,05) több kapillárist illetve endothel sejtet találtunk a VEGF-t expresszáló TET-VEGF béta-sejteket tartalmazó graftokban. (23. ábra). Adataink tehát arra utalnak, hogy a VEGF fokozott expressziója elősegítette a transzplantációt követő szigetsejt revascularisatiot.
65
A.
B.
22. ábra A Langerhans-sziget érhálózata egy kontroll egér szigetben (A.) és egy RIPVEGF-A transzgenikus homozigota egér szigetben (B.) az endotheliumhoz kötődő Bandeiraea simplicifolia lektint tartalmazó festéssel (vörös). A nyilak egy-egy kapillárist jelölnek a szigetek belsejében, 400-szoros nagyítás.
66
*
BS-1-el jelölt endothel sejtek
70 60 50 40 30 20 10 0 Kontroll
TET-VEGF
Béta-sejt szigetek
23. ábra Érsűrűsűg a béta-sejt szigetek körül 6 héttel a transzplantáció után. *p<0,005
67
5.3. AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA Ebben a fejezetben a célkitűzésekben feltett kérdésekre adott válaszokat fogalmazom meg: 1. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az NB1 enzimkészítmény gyártási vonalai stabilabbak és aktivitásuk kiszámíthatóbb a Liberase HI készítményeknél. 2. Adataink azt mutatják, hogy az új enzimmel végzett izolációk során nagyobb, kevésbé fragmentált szigeteket nyertünk, amelyek között az apoptoticus sejtek aránya szignifikánsan kisebb volt. 3. Az NB1-es enzimmel izolált szigetek in vitro inzulin elválasztása lényegében hasonló volt a Liberase csoportéhoz. 4.-5. A két enzimmel izolált szigetek in vivo funkciója a transzplantációk után hasonlóan jó volt a két csoportban, azonban a kis esetszám további részletesebb elemzést tesz szükségessé. 6. Nem volt szignifikáns különbség az izolált szigetek in vitro inzulin elválasztásában a kontrollcsoporthoz képest. 7. Adataink azt mutatják, hogy a RIP-VEGF-Tg szigetek in vivo funkciója a transzplantációt követően szignifikánsan jobb volt a kontrollcsoporténál és ez, összhangban az irodalmi adatokkal, összefügghet a transzplantációt követő hatékonyabb revascularisatioval. 8. A genetikailag módosított TET-VEGF béta-sejtvonal stabil VEGF szekréciót mutatott in vitro és ez a folyamat szabályozható volt tetracyclinnel. 9. Az új sejtvonal jól mérhető angiogenesist indukált az endothel sejtekkel történő együttes tenyésztése esetén a három dimenziós kollagén gél modellen. 10. Az in vitro angiogenesis szabályozható volt tetracyclin hozzáadásával. 11. A genetikai átalakítás lényegében nem befolyásolta a TET-VEGF béta-sejt szigetek in vitro inzulin elválasztását. 12. Adataink alapján elmondhatjuk, hogy a TET-VEGF szigetek transzplantáció után mért in vivo funkciója szignifikánsan jobb volt a kontrollcsoporténál. 13. Szignifikánsan jobb revascularisatiot mértünk a sziget graftok körül a TET-VEGF sejtek transzplantációja után. A revascularisatio szoros összefüggést mutatott a szigetsejtek endokrin működésével.
68
14. A transzplantációt követő VEGF szekréció és revascularisatio szabályozható volt tetracyclinnel. A VEGF expressziót hatékonyan le tudtuk állítani a revascularisatio kiteljesedése után, így a VEGF túlprodukciót csak a szigetek implantációjához szükséges optimális ideig tartottuk fent.
69
6. MEGBESZÉLÉS 6.1. AZ ENZIMVIZSGÁLATOK EREDMÉNYEINEK ÉRTÉKELÉSE A Liberase HI enzim nyolc különböző gyártási vonalának (lot) vizsgálatával szerzett eredményeink megerősítik, hogy a készítmények emésztő aktivitása változó. Adataink összhangban vannak Goto és mtsai, valamint O’Gorman és mtsai eredményeivel, akik szintén változó aktivitást találtak a Liberase HI-val végzett humán izolációk során (188; 189). Mások felhívták a figyelmet arra, hogy az enzimet nem találták hatékonyabbnak a foetalis sertés (190) és patkány (191) pancreas emésztésében a tisztítatlan nyers collagenase készítményeknél. Továbbá kimutatták, hogy a készítmény funkcionális károsodást okoz az izoláció során a patkány (58) és a humán szigetekben (192). A fenti adatok ellenére, a Liberase HI kifejlesztése, vitathatalanul jelentős előrelépést jelentett a sziget izolációk fejlődésében, elsősorban a tisztított összetevők és az alacsony endotoxin tartalom miatt (51; 193; 194). Korábbi kísérletes adatok kimutatták, hogy a collagenase-ok mellett a neutral protease is fontos szerepet játszik a pancreas enzimatikus emésztésében (195). Felhívták a figyelmet arra is, hogy a neutral protease „kétélű fegyver”, mert alkalmazása hatékonnyabbá és gyorsabbá teszi ugyan a pancreasszövet emésztését, de a szigetek fragmentációját okozhatja pár perces túlemésztés esetén (194). Ezért a szerzők hangsúlyozták, hogy a neutral protease és a collagenase megfelelő aránya alapvető
fontosságú
a
sikeres
sziget
izolációk
kivitelezéséhez
Az
NB1
készítményekben ez a két komponens külön adagolható, ami lehetővé teszi a megfelelő enzimaktivitás eléréséhez szükséges egyedi kombinációt. A Liberase HI és a Collagenase NB1/Neutral Protease NB1 enzimek gyártási vonalainak összehasonlító vizsgálatából megállapíthatjuk, hogy az utóbbi gyártási vonalai stabilabbak és az enzimaktivitás kiszámíthatóbb. A kilenc humán sziget izoláció eredményeinek feldolgozásából kiemelhetjük, hogy a donorok adatai kedvezőbbek voltak a Liberase HI csoport javára. Ezek közül a rövidebb meleg ischaemiás idő (WIT) jelentőségét hangsúlyoznám, amely az irodalmi adatok szerint összefüggést mutat az izolálható szigetek számával és életképességével. (38; 189). A Collagenase NB1 enzimkészítménnyel több szigetet tudtunk kinyerni 70
egy
pancreasból mint a Liberase HI enzimmel. Az egy gram pancreasra számolt szigetsejt equivalens (IEQ) tekintetében a különbség szignifikáns volt az új enzim javára. Az izolációk sikeressége, (min. 250.000 IEQ izolálása) 100%-os (9/9) volt a Collagenase NB1 és 55%-os (5/9) a Liberase HI esetében. Figyelembe véve a világszerte jellemző szervdonor hiányt, az a tény, hogy az új enzimmel több szigetet lehetett izolálni egy pancreasból és az izolációk sikerének aránya is növelhető volt, fontos előrelépés jelenthet a szigetsejt transzplantációban. Adataink azt mutatják, hogy az izolált szigetek morfológiája is szignifikánsan jobb volt a Collagenase NB1 csoportban, ahol kevesebb fragmentált szigetet találtunk a fénymikroszkópos vizsgálat során. Ezt alátámasztotta a sziget-equivalensek(IEQ) és a szigetek valódi számának magasabb aránya is, amely a nagyobb méretű szigetek előfordulását mutatja. Az izolált szigetek vitalitásának vizsgálatakor nem találtunk szignifikáns különbséget a fluorescein festékanyag intracellularis halmozódásában. Az apoptoticus sejtek aránya viszont lényegesen alacsonyabb volt az első csoportban a 12 órás sejt kultúrát követően. Ez is arra utal, hogy az új enzim kíméletesebb izolációt tesz lehetővé, tehát a szigetsejtek kevésbé károsodtak az izoláció során. A szeparált szigetek in vitro endokrin funkcióját glukóz stimulációs teszttel vizsgáltuk, amelynek során a külső glukóz adására adott inzulin elválasztást mértük. Adataink azt mutatják, hogy jóllehet a
stimulációs index hasonló volt a két
csoportban, a stimulációra adott akut inzulinválasz (AIR) szignifikánsan jobb volt a Collagenase NB1 enzimmel izolált szigetek esetében. Ez szintén az életképesebb, több inzulint szekretáló szigetek kinyerését igazolja az új enzimkészítménnyel. A szigetek in vivo funkcióját athymicus nude-egerekben és
humán
transzplantációkban vizsgáltuk. Eredményeink megerősítették, hogy az új enzimmel izolált szigetek in vivo funkciója kiváló és összehasonlítható a szigetsejt izolációk általános gyakorlatában elterjedt Liberase HI-vel izolált szigetek működésével a transzplantációt követő egy hónapban. A Collagenase NB1 enzimmel izolált szigetek működésének további elemzésére és pontosabb megítélésére azonban, megítélésünk szerint, nagyobb esetszám és hosszabb utánkövetés szükséges.
71
6.2. A FOKOZOTT VEGF-A EXPRESSZIÓ HATÁSAINAK ÉRTÉKELÉSE A Langerhans-sziget transzplantáció tömeges alkalmazását jelentős mértékben nehezíti a transzplantációt követő nagyfokú szigetsejt veszteség, amely a beültetett szigetek 40-50%-át is érintheti (19; 196; 197). A közelmúlt kísérletes vizsgálatai arra utalnak, hogy a korai szigetsejtveszteség egyik fontos oka, a befogadó szervezet immunreakciói mellett, a transzplantált graft elégtelen vascularisatioja.
Számos
vizsgálat igazolta, hogy a collagenase alapú, emésztéses izolációs folyamat során a szigetek érkapcsolatai megszakadnak, komplex belső érhálózatuk sérül és az izolációs folyamat végére gyakorlatilag avascularissá válnak (198; 199). A vérellátás csökkenése elsősorban a szigetek centrumában elhelyezkedő inzulintermelő bétasejteket érinti, azokban hypoxiás károsodást és következményes necrosist okozva a transzplantáció után(11; 16). A hypoxia jelentőségére Schrezenmeir, Gerő és mtsai is felhívták a figyelmet enkapszulált szigetek esetében (200).
A hypoxiás szigetek
nehezen védekeznek a májban levő lokális és szisztemás immunreakciókkal szemben a transzplantációt követő napokban (201; 202). A beültetés után fellépő, nemspecifikus gyulladásos reakciók és a revascularisatio kapcsolatának vizsgálata intenzív kutatás tárgyát képezi napjainkban is (203; 204). Az irodalmi adatok tehát felhívják a figyelmet a szigetek gyors és hatékony revascularisatiojának fontosságára a transzplantáció után. (11; 19; 170);(11; 205) . A folyamat a transzplantációt követő második-harmadik napon kezdődik és átlagosan két hétig tart (11; 206). Az első kapillárisok kialakulásához legalább öt napra, működőképes érhálózat létrejöttéhez viszont legalább 12-15 napra van szükség (207). Ez a késleltetett revascularisatio az oxigén és tápanyagellátásának átmeneti zavarához vezet (202), amely gyakran társul a szigetsejtek apoptosisával és/vagy necrosisával (208; 209). A molekuláris mechanizmusok részletei nem tisztázottak. A szigetek vérellátását vizsgáló kutatások szerint, a revascularisatio egyik központi eleme a VEGF (11; 86; 210); (211). Ezért felmerült az a kérdés, hogy a VEGF szekréció helyreállításával illetve fokozásával javítani lehetne a szigetek revascularisatioját a transzplantáció után.
72
A fenti irodalmi adatokból kiindulva, kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy a transzplantált szigetsejtek VEGF termelődésének helyreállítása illetve fokozása képes-e javítani a revascularisatiot és milyen hatással van a beültetett szigetsejtek endokrin működésére. Kérdéseink megválaszolásához, először a pancreas bétasejtjeiben humán VEGF-et expresszáló transzgenikus egereket használtunk. A VEGF termelődés további fokozásának érdekében, a korábban leírt RIP-VEGF heterozigóta egerekből homozigóta egérvonalat fejlesztettünk ki. Collagenase emésztéssel izoláltuk a Langerhans-szigeteket, amelyeket diabeteses syngeneticus egerek vesekapszulája alá transzplantáltuk. Kimutattuk, hogy a homozigóta RipVEGF egerekből izolált szigetek gyorsabban korrigálták a diabeteses recipiensek vércukorszintjét, mint a kontroll egerekből izoláltak. Eredményeink arra utalnak, hogy
a béta-sejtek fokozott VEGF expressziója a szigetekben javítja
a
transzplantációt követő graft funkciót és összefüggésben lehet a hatékonyabb angiogenesissel. Eredményeink összhangban vannak az újabb irodalmi adatokkal. Zhang és mtsai izolált egér szigeteket humán VEGF elválasztására késztettek adenovírus transfectioval, majd diabeteses egerekbe transzplantálták őket (20). Azt találták, hogy a fokozott VEGF elválasztás serkentette a beültetett szigetek angiogenesisét. Továbbá, Lai és mtsai a tanulmányunkban is
alkalmazott
RIP-VEGF-A, de
heterozigóta egerekből izolált szigeteket transzplantálva kimutatták, hogy a szigetek körül fokozódott az érképződés, a véráramlás és az inzulintermelés, mivel ezek a folyamatok serkentetették a béta-sejtek proliferációját is (21). Ezzel szemben,
Schramm és mtsai-nak az a megfigyelése, hogy a VEGF-receptorok
farmakológiai blokkolása nem gátolja a transzplantált szigetek angiogenesisét, más tényezők szerepét is felveti (212). Ezt a gondolatsort továbbfűzve, Iwashita és mtsainak újabb eredményei rávilágítanak arra, hogy a szigetek saját érhálózata hiányos és sorvadt VEGF-A gén-hiányos egerekben és jelentősen különbözik a normál kontrollcsoportétól (213). Adataik megerősítik a VEGF kulcsszerepét a revascularisatios folyamatban. Brissova és mtsai felhívták a figyelmet arra is, hogy elégtelen VEGF-A expresszió esetén a béta-sejtek inzulin elválasztása csökken és a VEGF-A szekréció szabályozásával a keringésbe kerülő inzulin mennyisége befolyásolható (201). 73
Az irodalmi adatok azt igazolják, hogy a VEGF-A korlátlan elválasztása káros mellékhatásokkal járhat és bizonyos körülmények között értumorok kialakulásához vezethet (23; 214). Ezt a tényt szem előtt tartva, célunk volt a VEGF elválasztást gyógyszeresen szabályozható modell kialakítása az indukált revascularisatio megfelelő időpontban történő leállítása érdekében.
Ehhez egy korábban leírt,
immortalizált béta-sejtvonalat adenovírus mediálta géntranszfer segítségével úgy módosítottunk, hogy az új sejtek a VEGF-A-t fokozottan expresszálták és a szekréció leállítható volt tetracyclin segítségével. A módosított béta-sejtekkel és az endothelsejtekkel végzett in vitro vizsgálataink azt mutatták, hogy a VEGF expresszió közvetlen hatást gyakorolt az endothelsejtekre és képes volt indukálni az új erek képződését. A folyamat szabályozható volt tetracyclinnel. Az endothelsejtek és a béta-sejtek közötti köcsönhatások jelentőségére az újabb kutatások is felhívják a figyelmet (213; 215; 216). Olsson és mtsai rávilágítanak arra, hogy a szigetekben levő endothelsejtek transzport funkciója károsodik az elégtelen revascularisatio során, ami korlátozhatja a szigetek megfelelő működését a transzplantáció után (217). A fokozott VEGF expressziót mutató TET-VEGF sejtek transzplantációjakor szignifikánsan gyorsabb revascularisatiot észleltünk és ezzel párhuzamosan a beültetett sejtek endokrin funkciója is jobb volt. Tetracyclin adásával le tudtuk állítani a VEGF expresszióját a normoglykaemiás állapot elérése után, megakadályozva ezáltal a VEGF túlprodukció transzplantációt követően.
74
káros mellékhatásait a
7. KÖVETKEZTETÉSEK Az enzimvizsgálatok eredményeiből megállapíthatjuk, hogy adataink új ismeretekkel szolgálnak egy új enzim bevezetéséhez a humán szigetsejt izolációkban. A Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 kombinációjának emésztő aktivitása kiszámíthatóbbnak bizonyult az általános gyakorlatban elterjedt Liberase HI készítménynél. Külön előnyt jelentett a collagenase és neutral protease szétválasztása, mert a két komponens aránya változtatható volt. Ez lehetővé teszi az enzimkészítmény összetételének a mindenkori pancreasszövethez történő igazítását. Ha a pancreas fiatalabb donorból származik és kevesebb kötőszövetet tartalmaz, akkor kevesebb, míg a tömöttebb, fibroticusabb pancreas esetén több neutral protease hozzáadása lehetséges. Ennek a pancreas sziget autotranszplantáció vonatkozásában is jelentősége lehet, mivel ott az eltávolított chronicus pancreatitises állomány általában sok kötőszövetet tartalmaz (218, 219). A két komponens szétválasztása a készítmény tárolhatóságát is javíthatja, mert a kombinált enzimek aktivitása csökkenhet a tárolás során (194). Az új enzim bevezetésének legfontosabb előnye és gyakorlati haszna, hogy szélesíti a humán izolációk fegyvertárát és lehetővé teszi az egyes pancreas sajátosságaihoz igazított, „egyénre szabott” sziget izolációk kivitelezését. Ezáltal javulhat az izolációk eredményessége és bővülhet a szigetsejt transzplantációra alkalmas donorok skálája. A
VEGF-t
expresszáló
szigetsejt
transzplantációs
kísérleteinkből
megállapíthatjuk, hogy a szigetsejtek közvetlen környezetében fokozott VEGF elválasztás nagymértékben elősegíti a beültetést követő revascularisatiot és jelentősen javítja a szigetek endokrin funkcióját. Az értekezésben ismertetett módszer újdonsága, hogy átmeneti lokális VEGF expressziót tesz lehetővé a transzplantált szigetsejtek környezetében és a VEGF-A expresszió a megfelelő revascularisatio kialakulása után leállítható. angiogenesis
modell
alkalmas
lehet
a
kölcsönhatásainak további vizsgálatára.
75
A dolgozatban bemutatott in vitro béta-sejtek
és
az
endothelsejtek
Az angiogenesis serkentését, VEGF génterápiával, sikeresen alkalmazták coronaria- illetve perifériás érbetegségekkel kapcsolatos klinikai vizsgálatokban (220; 221).
Az általunk kidolgozott, gyógyszeresen szabályozható VEGF-
expressziós modell hozzájárulhat a transzplantáció után észlelt szigetsejt veszteség mérsékléséhez és a génterápia mai lendületes fejlődése mellett, alapját képezheti hasonló klinikai módszer kidolgozásának a szigetsejt transzplantációban is (222). Összegezve megállapíthatjuk, hogy a szigetsejt transzplantáció ezirányú további fejlődésével a világszerte jellemző donor hiány is áthidalható lehet. A szigetsejtek ugyanis elvileg korlátlan mértékben elérhetőek lehetnek, ha a jelenleg intenzív fejlesztés alatt álló genetikailag módosított béta-sejtvonalak,
xenogén
szigetek-(196) és az in vitro illetve in vivo sziget expanziós technikák elérik a klinikai alkalmazhatóság határait (223-225). Fontos szempont az is, hogy a szigetsejtek sejtkultúrában tenyészthetők, ami további lehetőséget ad a transzplantáció optimálisabb időzítésére és az implantációt elősegítő faktorok in vitro hozzáadására (226; 227). A szigetsejt transzplantáció újabb kapukat nyitott a transzplantációs tolerancia indukciós protokollok kidolgozása és klinikai bevezetése felé is (228; 229). Ezzel, valamint a mikroenkapszulációval történő megvalósulásával,
a
szigetsejt
transzplantáció
immunoizoláció klinikai
magában
immunszupresszió elhagyásának elvi lehetőségét is (230; 231).
76
hordozza
a
tartós
8. ÖSSZEFOGLALÁS A Langerhans-sziget transzplantáció sikerét korlátozza a sziget izolációk változó hatásfoka és a beültetést követően észlelt jelentős szigetsejt veszteség. Ennek egyik oka az izoláló enzimek eltérő aktivitása illetve a transzplantációt követő elégtelen revascularisatio. Az utóbbi folyamat fontos tényezője a VEGF. Értekezésem célja egy új, kétkomponensű enzimkészítmény vizsgálata humán sziget transzplantációkban, valamint a béta-sejtekben előidézett
fokozott VEGF-A
expresszió hatásainak elemzése a transzplantált szigetsejtek revascularisatiojára és működésére a transzplantációt követő veszteség csökkentése érdekében. A Collagenase NB1 és a Neutral Protease NB1 enzimek kombinációjából kialakított új készítménnyel végzett humán sziget izolációk eredményeit összehasonlítottam a Liberase HI enzimmel végzett izolációk adataival.
Továbbá, RIP-VEGF
transzgenikus homozigóta egerekből izolált szigeteket és génterápiával átalakított, a VEGF-A-t
tetracyclinnel
szabályozható
módon
expresszáló
béta-sejteket
transzplantáltam diabeteses egerekbe. Vizsgáltam a transzplantációt követő revascularisatiot,
az
endokrin
funkciót
és
a
folyamat
gyógyszeres
szabályozhatóságát. Elemeztem a VEGF-A expresszió hatásait az in vitro az angiogenesisre. Az új enzimmel növelhető volt a sikeres humán izolációk aránya és jobb volt az izolált szigetek morfológiája, életképessége és funkciója (232). A fokozott VEGF expressziót mutató RIP-VEGF transzgenikus homozigóta egerek pancreasából izolált szigetek szignifikánsan gyorsabban korrigálták a diabeteses recipiensek hyperglykaemiáját a transzplantáció után (233). A módosított bétasejtek fokozott VEGF-A expressziója mérhető angiogenesist indukált in vitro, javította a transzplantációt követő revascularisatiot, kedvezően befolyásolta a transzplantált
szigetsejtek
működését
és
a
folyamat
szabályozható
volt
tetracyclinnel. (234). Kutatásaim gyakorlati hasznát egyrészről abban látom, hogy az új, kétkomponensú enzimkészítmény lehetővé teszi a különböző pancreasok szöveti szerkezetéhez igazított sziget izolációk kivitelezését, ami javíthatja az izolációk sikerét és hozzájárulhat a transzplantálható szigetek számának növeléséhez. Másrészről, az értekezésben bemutatott, tetracyclinnel szabályozható VEGF-A expressziós modell elősegítheti a revascularisatio optimalizálását és hozzájárulhat a szigetsejt veszteség csökkentéséhez a transzplantáció után.
77
FACTORS INFLUENCING THE EARLY RESULTS OF PANCREATIC ISLET TRANSPLANTATION: STUDIES ON ISOLATION ENZYMES AND ISLET REVASCULARISATION - SUMMARY The success of islet transplantation is hampered by variability of islet isolations and the considerable loss of islets early after transplantation. Causes of these are the lotto-lot variability of isolation enzymes and the inadequate revascularisation of islets. It has been shown that VEGF plays a crucial role in this process. The aim of my thesis is to study a new two-component enzyme blend for human islet isolations and to assess the effects of VEGF-A upregulation in beta-cells on islet cell revascularisation and function after transplantation. We compared the results of human islet isolations performed either with Collagenase NB1/Neutral Protease NB1 enzyme combination (group I, n=9) or with traditional
Liberase HI (group II, n=9). Islet yield,
morphology, apoptosis, in vitro and in vivo functions were analysed. Islets from RIPVEGF transgenic mice were isolated, studied in vitro, then transplanted into chemically diabetic mice. Moreover, we modified the CDM3D beta cells using a lentiviral vector to promote secretion of VEGF-A in a Tetracycline (TC)-controlled manner (CDM3D-TET-VEGF cells). In vitro VEGF secretion, angiogenesis and stimulated insulin secretion were assessed. The cells were transplanted into syngeneic STZ-diabetic mice to assess the effects of this controlled VEGF expression in vivo. Time to normoglycaemia, IPGTT, graft vascular density were evaluated. Total IEQ/gr of pancreas was higher, islet morphology was improved and there was a higher proportion of free and intact islets with less apoptosis when the new NB1 enzyme was used (232). The time for diabetic mice to return to normoglycemia and the stimulated plasma glucose clearence were significantly accelerated in mice grafted with RIP-VEGF islets or CDM3D-TET-VEGF cells (233). VEGF delivery resulted in well defined TC controlled angiogenesis in vitro. There was a significant increase in vascular density of grafted CDM3D-TET-VEGF cells versus control cells. VEGF was only needed during the first 2-3 weeks after transplantation, when removed, normoglycemia and graft vascularisation were maintained (234). The most important benefit of the studied new enzyme blend is that it makes the human islet isolations adjusted to the characteristics of a given pancreas possible. On the other hand, TCregulated temporal expression of VEGF using a gene therapy could present a novel way to improve early revascularisation and engraftment after islet cell transplantation. 78
9. IRODALOMJEGYZÉK 1. Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H: Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27:1047-1053, 2004 2. Boyle JP, Honeycutt AA, Narayan KM, Hoerger TJ, Geiss LS, Chen H, Thompson TJ: Projection of diabetes burden through 2050: impact of changing demography and disease prevalence in the U.S. Diabetes Care 24:1936-1940, 2001 3. Gyurus E, Green A, Patterson CC, Soltesz G: Dynamic changes in the trends in incidence of type 1 diabetes in children in Hungary (1978-98). Pediatr Diabetes 3:194-199, 2002 4. McCarter RJ, Hempe JM, Chalew SA: Mean blood glucose and biological variation have greater influence on HbA1c levels than glucose instability: an analysis of data from the Diabetes Control and Complications Trial. Diabetes Care 29:352-355, 2006 5. Hypoglycemia in the Diabetes Control and Complications Trial. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. Diabetes 46:271-286, 1997 6. Turner RC, Holman RR: The UK Prospective Diabetes Study. UK Prospective Diabetes Study Group. Ann Med 28:439-444, 1996 7. Ryan EA: Pancreas transplants: for whom? Lancet 351:1072-1073, 1998 8. Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM, Rajotte RV: Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 343:230-238, 2000 9. Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR, Shapiro AM: Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes 54:2060-2069, 2005 10. Poggioli R, Faradji RN, Ponte G, Betancourt A, Messinger S, Baidal DA, Froud T, Ricordi C, Alejandro R: Quality of life after islet transplantation. Am J Transplant 6:371-378, 2006 11. Menger MD, Yamauchi J, Vollmar B: Revascularization and microcirculation of freely grafted islets of Langerhans. World J Surg 25:509-515, 2001
79
12. Ryan EA, Lakey JR, Paty BW, Imes S, Korbutt GS, Kneteman NM, Bigam D, Rajotte RV, Shapiro AM: Successful islet transplantation: continued insulin reserve provides long-term glycemic control. Diabetes 51:2148-2157, 2002 13. Froud T, Ricordi C, Baidal DA, Hafiz MM, Ponte G, Cure P, Pileggi A, Poggioli R, Ichii H, Khan A, Ferreira JV, Pugliese A, Esquenazi VV, Kenyon NS, Alejandro R: Islet transplantation in type 1 diabetes mellitus using cultured islets and steroidfree immunosuppression: Miami experience. Am J Transplant 5:2037-2046, 2005 14. Lakey JR, Burridge PW, Shapiro AM: Technical aspects of islet preparation and transplantation. Transpl Int 16:613-632, 2003 15. Barnett MJ, Zhai X, LeGatt DF, Cheng SB, Shapiro AM, Lakey JR: Quantitative assessment of collagenase blends for human islet isolation. Transplantation 80:723728, 2005 16. Carlsson PO, Mattsson G: Oxygen tension and blood flow in relation to revascularization in transplanted adult and fetal rat pancreatic islets. Cell Transplant 11:813-820, 2002 17. Merchant FA, Diller KR, Aggarwal SJ, Bovik AC: Angiogenesis in cultured and cryopreserved pancreatic islet grafts. Transplantation 63:1652-1660, 1997 18. Mattsson G, Jansson L, Nordin A, Carlsson PO: Impaired revascularization of transplanted
mouse
pancreatic
islets
is
chronic
and
glucose-independent.
Transplantation 75:736-739, 2003 19. Jansson L, Carlsson PO: Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia 45:749-763, 2002 20. Zhang N, Richter A, Suriawinata J, Harbaran S, Altomonte J, Cong L, Zhang H, Song K, Meseck M, Bromberg J, Dong H: Elevated vascular endothelial growth factor production in islets improves islet graft vascularization. Diabetes 53:963-970, 2004 21. Lai Y, Schneider D, Kidszun A, Hauck-Schmalenberger I, Breier G, Brandhorst D, Brandhorst H, Iken M, Brendel MD, Bretzel RG, Linn T: Vascular endothelial growth factor increases functional beta-cell mass by improvement of angiogenesis of isolated human and murine pancreatic islets. Transplantation 79:1530-1536, 2005 22. Del Bo R, Scarlato M, Ghezzi S, Maestroni A, Sjolind L, Forsblom C, Wessman M, Groop PH, Comi GP, Bresolin N, Luzi L, Zerbini G: VEGF gene variability and type 1 diabetes: evidence for a protective role. Immunogenetics 58:107-112, 2006
80
23. Lee RJ, Springer ML, Blanco-Bose WE, Shaw R, Ursell PC, Blau HM: VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression. Circulation 102:898-901, 2000 24. Springer ML, Chen AS, Kraft PE, Bednarski M, Blau HM: VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults. Mol Cell 2:549-558, 1998 25. Banting FG, Best CH, Collip JB, Campbell WR, Fletcher AA: Pancreatic extracts in the treatment of diabetes mellitus: preliminary report. 1922. Cmaj 145:1281-1286, 1991 26. Moskalewski S: Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol 44:342-353, 1965 27. Lacy PE, Kostianovsky M: Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes 16:35-39, 1967 28. Ballinger WF, Lacy PE: Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery 72:175-186, 1972 29. Najarian JS, Sutherland DE, Matas AJ, Steffes MW, Simmons RL, Goetz FC: Human islet transplantation: a preliminary report. Transplant Proc 9:233-236, 1977 30. Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olack BJ, Scharp DW: Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 37:413-420, 1988 31. Scharp DW, Lacy PE, Santiago JV, McCullough CS, Weide LG, Boyle PJ, Falqui L, Marchetti P, Ricordi C, Gingerich RL, et al.: Results of our first nine intraportal islet allografts in type 1, insulin-dependent diabetic patients. Transplantation 51:7685, 1991 32. Ricordi C, Tzakis AG, Carroll PB, Zeng YJ, Rilo HL, Alejandro R, Shapiro A, Fung JJ, Demetris AJ, Mintz DH, et al.: Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation 53:407-414, 1992 33. Luzi L, Perseghin G, Brendel MD, Terruzzi I, Battezzati A, Eckhard M, Brandhorst D, Brandhorst H, Friemann S, Socci C, Di Carlo V, Piceni Sereni L, Benedini S, Secchi A, Pozza G, Bretzel RG: Metabolic effects of restoring partial beta-cell function after islet allotransplantation in type 1 diabetic patients. Diabetes 50:277-282, 2001 34. Farkas G, Csajbok E, Voros P, Adam E, Palotai M: Successful simultaneous transplantation of kidney and fetal pancreatic islet masses. Transpl Int 8:229-233, 1995
81
35. Kenyon NS, Fernandez LA, Lehmann R, Masetti M, Ranuncoli A, Chatzipetrou M, Iaria G, Han D, Wagner JL, Ruiz P, Berho M, Inverardi L, Alejandro R, Mintz DH, Kirk AD, Harlan DM, Burkly LC, Ricordi C: Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154. Diabetes 48:1473-1481, 1999 36. Shapiro AM, Ricordi C, Hering BJ, Auchincloss H, Lindblad R, Robertson RP, Secchi A, Brendel MD, Berney T, Brennan DC, Cagliero E, Alejandro R, Ryan EA, DiMercurio B, Morel P, Polonsky KS, Reems JA, Bretzel RG, Bertuzzi F, Froud T, Kandaswamy R, Sutherland DE, Eisenbarth G, Segal M, Preiksaitis J, Korbutt GS, Barton FB, Viviano L, Seyfert-Margolis V, Bluestone J, Lakey JR: International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N Engl J Med 355:1318-1330, 2006 37. Nano R, Clissi B, Melzi R, Calori G, Maffi P, Antonioli B, Marzorati S, Aldrighetti L, Freschi M, Grochowiecki T, Socci C, Secchi A, Di Carlo V, Bonifacio E, Bertuzzi F: Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia 48:906-912, 2005 38. Toso C, Oberholzer J, Ris F, Triponez F, Bucher P, Demirag A, Andereggen E, Buehler L, Cretin N, Fournier B, Majno P, Hong Y, Lou J, Morel P: Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc 34:826-827, 2002 39. Benhamou PY, Watt PC, Mullen Y, Ingles S, Watanabe Y, Nomura Y, Hober C, Miyamoto M, Kenmochi T, Passaro EP, et al.: Human islet isolation in 104 consecutive cases. Factors affecting isolation success. Transplantation 57:1804-1810, 1994 40. Watt PC, Mullen Y, Benhamou PY, Hober C, Nomura Y, Watanabe Y, Kleinman R, Miyamoto M, Passaro EP, Jr., Zinner MJ, et al.: Donor factors affecting successful isolation of islets from the human pancreas. Transplant Proc 26:594-595, 1994 41. Matsumoto I, Sawada T, Nakano M, Sakai T, Liu B, Ansite JD, Zhang HJ, Kandaswamy R, Sutherland DE, Hering BJ: Improvement in islet yield from obese donors for human islet transplants. Transplantation 78:880-885, 2004 42. Labruzzo C, El Tayar AR, Hakim NS: Graft pancreatitis: literature review. Int Surg 91:107-111, 2006 43. Bucher P, Mathe Z, Buhler LH, Andres A, Bosco D, Berney T, Morel P: [Diabetes Type I therapy through transplantation]. Ann Chir 130:374-383, 2005
82
44. Lakey JR, Warnock GL, Rajotte RV, Suarez-Alamazor ME, Ao Z, Shapiro AM, Kneteman NM: Variables in organ donors that affect the recovery of human islets of Langerhans. Transplantation 61:1047-1053, 1996 45. Goto M, Johansson U, Eich TM, Lundgrem T, Engkvist M, Felldin M, Foss A, Kallen R, Salmela K, Tibell A, Tufveson G, Nilsson B, Korsgren O: Key factors for human islet isolation and clinical transplantation. Transplant Proc 37:1315-1316, 2005 46. Langer RM, Mathe Z, Doros A, Mathe ZS, Weszelits V, Filo A, Bucher P, Morel P, Berney T, Jaray J: Successful islet after kidney transplantations in a distance over 1000 kilometres: Preliminary results of the Budapest-Geneva collaboration. Transplant Proc 36:3113-3115, 2004 47. Noguchi H, Ueda M, Nakai Y, Iwanaga Y, Okitsu T, Nagata H, Yonekawa Y, Kobayashi N, Nakamura T, Wada H, Matsumoto S: Modified two-layer preservation method (M-Kyoto/PFC) improves islet yields in islet isolation. Am J Transplant 6:496-504, 2006 48. Tsujimura T, Kuroda Y, Kin T, Avila JG, Rajotte RV, Korbutt GS, Ryan EA, Shapiro AM, Lakey JR: Human islet transplantation from pancreases with prolonged cold
ischemia
using
additional
preservation
by
the
two-layer
(UW
solution/perfluorochemical) cold-storage method. Transplantation 74:1687-1691, 2002 49. Saito K, Iwama N, Takahashi T: Morphometrical analysis on topographical difference in size distribution, number and volume of islets in the human pancreas. Tohoku J Exp Med 124:177-186, 1978 50. Lakey JR, Warnock GL, Shapiro AM, Korbutt GS, Ao Z, Kneteman NM, Rajotte RV: Intraductal collagenase delivery into the human pancreas using syringe loading or controlled perfusion. Cell Transplant 8:285-292, 1999 51. Berney T, Molano RD, Cattan P, Pileggi A, Vizzardelli C, Oliver R, Ricordi C, Inverardi L: Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation 71:125-132, 2001 52. Linetsky E, Lehmann R, Li H, Fernandez L, Bottino R, Selvaggi G, Alejandro R, Ricordi C: Human islet isolation using a new enzyme blend. Transplant Proc 29:1957-1958, 1997
83
53. Linetsky E, Inverardi L, Kenyon NS, Alejandro R, Ricordi C: Endotoxin contamination of reagents used during isolation and purification of human pancreatic islets. Transplant Proc 30:345-346, 1998 54. Jahr H, Pfeiffer G, Hering BJ, Federlin K, Bretzel RG: Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med 77:118-120, 1999 55. Eckhardt T, Jahr H, Federlin K, Bretzel RG: Endotoxin impairs the engraftment of rat islets transplanted beneath the kidney capsule of C57BL/6-mice. J Mol Med 77:123-125, 1999 56. Vargas F, Vives-Pi M, Somoza N, Armengol P, Alcalde L, Marti M, Costa M, Serradell L, Dominguez O, Fernandez-Llamazares J, Julian JF, Sanmarti A, PujolBorrell R: Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation 65:722-727, 1998 57. Olack BJ, Swanson CJ, Howard TK, Mohanakumar T: Improved method for the isolation and purification of human islets of langerhans using Liberase enzyme blend. Hum Immunol 60:1303-1309, 1999 58. Vargas F, Julian JF, Llamazares JF, Garcia-Cuyas F, Jimenez M, Pujol-Borrell R, Vives-Pi M: Engraftment of islets obtained by collagenase and Liberase in diabetic rats: a comparative study. Pancreas 23:406-413, 2001 59. O'Gorman D, Kin T, McGhee-Wilson D, Shapiro AM, Lakey JR: Multi-lot analysis of custom collagenase enzyme blend in human islet isolations. Transplant Proc 37:3417-3419, 2005 60. Brandhorst H, Brandhorst D, Hesse F, Ambrosius D, Brendel M, Kawakami Y, Bretzel RG: Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes 52:1143-1146, 2003 61. Bucher P, Bosco D, Mathe Z, Matthey-Doret D, Andres A, Kurfuerst M, RamschGunther N, Buhler L, Morel P, Berney T: Optimization of neutral protease to collagenase activity ratio for islet of Langerhans isolation. Transplant Proc 36:11451146, 2004 62. Wolters GH, Vos-Scheperkeuter GH, van Deijnen JH, van Schilfgaarde R: An analysis of the role of collagenase and protease in the enzymatic dissociation of the rat pancreas for islet isolation. Diabetologia 35:735-742, 1992
84
63. Wolters GH, van Suylichem PT, van Deijnen JH, van Schilfgaarde R: Factors influencing the isolation process of islets of Langerhans. Horm Metab Res Suppl 25:20-26, 1990 64. Rose NL, Palcic MM, Shapiro AM, Lakey JR: An evaluation of the activation of endogenous pancreatic enzymes during human islet isolations. Transplant Proc 35:2455-2457, 2003 65. Mathe Z, Langer R, Bucher P, Thierry B, Morel P, Jaray J, Perner F: [New results in allotransplantation of pancreatic islet cells]. Orv Hetil 145:1053-1059, 2004 66. Benhamou PY, Oberholzer J, Toso C, Kessler L, Penfornis A, Bayle F, Thivolet C, Martin X, Ris F, Badet L, Colin C, Morel P: Human islet transplantation network for the treatment of Type I diabetes: first data from the Swiss-French GRAGIL consortium (1999-2000). Groupe de Recherche Rhin Rhjne Alpes Geneve pour la transplantation d'Ilots de Langerhans. Diabetologia 44:859-864, 2001 67. Oberholzer J, Triponez F, Mage R, Andereggen E, Buhler L, Cretin N, Fournier B, Goumaz C, Lou J, Philippe J, Morel P: Human islet transplantation: lessons from 13 autologous and 13 allogeneic transplantations. Transplantation 69:1115-1123, 2000 68. Owen RJ, Ryan EA, O'Kelly K, Lakey JR, McCarthy MC, Paty BW, Bigam DL, Kneteman NM, Korbutt GS, Rajotte RV, Shapiro AM: Percutaneous transhepatic pancreatic islet cell transplantation in type 1 diabetes mellitus: radiologic aspects. Radiology 229:165-170, 2003 69. Bucher P, Mathe Z, Bosco D, Becker C, Kessler L, Greget M, Benhamou PY, Andres A, Oberholzer J, Buhler L, Morel P, Berney T: Morbidity associated with intraportal islet transplantation. Transplant Proc 36:1119-1120, 2004 70. Casey JJ, Lakey JR, Ryan EA, Paty BW, Owen R, O'Kelly K, Nanji S, Rajotte RV, Korbutt GS, Bigam D, Kneteman NN, Shapiro AM: Portal venous pressure changes after sequential clinical islet transplantation. Transplantation 74:913-915, 2002 71. Bonner-Weir S, Orci L: New perspectives on the microvasculature of the islets of Langerhans in the rat. Diabetes 31:883-889, 1982 72. Mendola JF, Goity C, Fernandez-Alvarez J, Saenz A, Benarroch G, FernandezCruz L, Gomis R: Immunocytochemical study of pancreatic islet revascularization in islet isograft. Effect of hyperglycemia of the recipient and of in vitro culture of islets. Transplantation 57:725-730, 1994 85
73. Murakami T, Fujita T, Miyake T, Ohtsuka A, Taguchi T, Kikuta A: The insuloacinar portal and insulo-venous drainage systems in the pancreas of the mouse, dog, monkey and certain other animals: a scanning electron microscopic study of corrosion casts. Arch Histol Cytol 56:127-147, 1993 74. Orci L, Unger RH: Functional subdivision of islets of Langerhans and possible role of D cells. Lancet 2:1243-1244, 1975 75. Brunicardi FC, Stagner J, Bonner-Weir S, Wayland H, Kleinman R, Livingston E, Guth P, Menger M, McCuskey R, Intaglietta M, Charles A, Ashley S, Cheung A, Ipp E, Gilman S, Howard T, Passaro E, Jr.: Microcirculation of the islets of Langerhans. Long Beach Veterans Administration Regional Medical Education Center Symposium. Diabetes 45:385-392, 1996 76. Stagner JI, Samols E: The vascular order of islet cellular perfusion in the human pancreas. Diabetes 41:93-97, 1992 77. Styrud J, Eriksson UJ, Jansson L: A continuous 48-hour glucose infusion in rats causes both an acute and a persistent redistribution of the blood flow within the pancreas. Endocrinology 130:2692-2696, 1992 78. Jansson L, Sandler S: Pancreatic and islet blood flow in the regenerating pancreas after a partial pancreatectomy in adult rats. Surgery 106:861-866, 1989 79. Svensson AM, Abdel-Halim SM, Efendic S, Jansson L, Ostenson CG: Pancreatic and islet blood flow in F1-hybrids of the non-insulin-dependent diabetic GK-Wistar rat. Eur J Endocrinol 130:612-616, 1994 80. Persson-Sjogren S, Forsgren S, Taljedal IB: Peptides and other neuronal markers in transplanted pancreatic islets. Peptides 21:741-752, 2000 81. Carlsson PO, Iwase M, Jansson L: Intraportal glucose infusion and pancreatic islet blood flow in anesthetized rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 279:R12241229, 2000 82. Olsson R, Jansson L, Andersson A, Carlsson PO: Local blood flow regulation in transplanted rat pancreatic islets: influence of adenosine, angiotensin II, and nitric oxide inhibition. Transplantation 70:280-287, 2000 83. Petruzzo P, Cappai A, Congiu T, Riva A, Brotzu G: Pancreatic islet microcirculation: a scanning electron microscopic study of corrosion casts. Transplant Proc 29:2050-2051, 1997 84. Griffith RC, Scharp DW, Hartman BK, Ballinger WF, Lacy PE: A morphologic study of intrahepatic portal-vein islet isografts. Diabetes 26:201-214, 1977 86
85. Vajkoczy P, Olofsson AM, Lehr HA, Leiderer R, Hammersen F, Arfors KE, Menger
MD:
Histogenesis
and
ultrastructure
of
pancreatic
islet
graft
microvasculature. Evidence for graft revascularization by endothelial cells of host origin. Am J Pathol 146:1397-1405, 1995 86. Brissova M, Fowler M, Wiebe P, Shostak A, Shiota M, Radhika A, Lin PC, Gannon M, Powers AC: Intraislet endothelial cells contribute to revascularization of transplanted pancreatic islets. Diabetes 53:1318-1325, 2004 87. Mattsson G, Jansson L, Carlsson PO: Decreased vascular density in mouse pancreatic islets after transplantation. Diabetes 51:1362-1366, 2002 88. Vajkoczy P, Menger MD: Improved islet isolation by 10% albumin does not influence graft angiogenesis and vascularization. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:152-155, 1997 89. Webb MA, Illouz SC, Pollard CA, Musto PP, Berry D, Dennison AR: Long-term maintenance of graft function after islet autotransplantation of less than 1000 IEQ/kg. Pancreas 33:433-434, 2006 90. Farney AC, Najarian JS, Nakhleh RE, Lloveras G, Field MJ, Gores PF, Sutherland DE: Autotransplantation of dispersed pancreatic islet tissue combined with total or near-total pancreatectomy for treatment of chronic pancreatitis. Surgery 110:427-437; discussion 437-429, 1991 91. Oberholzer J, Mathe Z, Bucher P, Triponez F, Bosco D, Fournier B, Majno P, Philippe J, Morel P: Islet autotransplantation after left pancreatectomy for nonenucleable insulinoma. Am J Transplant 3:1302-1307, 2003 92. Gray DW, Sutton R, McShane P, Peters M, Morris PJ: Exocrine contamination impairs implantation of pancreatic islets transplanted beneath the kidney capsule. J Surg Res 45:432-442, 1988 93. Heuser M, Wolf B, Vollmar B, Menger MD: Exocrine contamination of isolated islets of Langerhans deteriorates the process of revascularization after free transplantation. Transplantation 69:756-761, 2000 94. Wolf B, Heuser M, Vollmar B, Menger MD: [Significance of the size of islands of Langerhans for successful vascularization after free transplantation]. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 115:153-154, 1998 95. Rush BT, Fraga DW, Kotb MY, Sabek OM, Lo A, Gaber LW, Halim AB, Gaber AO: Preservation of human pancreatic islet in vivo function after 6-month culture in serum-free media. Transplantation 77:1147-1154, 2004 87
96. Goss JA, Goodpastor SE, Brunicardi FC, Barth MH, Soltes GD, Garber AJ, Hamilton DJ, Alejandro R, Ricordi C: Development of a human pancreatic islettransplant program through a collaborative relationship with a remote islet-isolation center. Transplantation 77:462-466, 2004 97. Sandler S, Jansson L: Blood flow measurements in autotransplanted pancreatic islets of the rat. Impairment of the blood perfusion of the graft during hyperglycemia. J Clin Invest 80:17-21, 1987 98. Moldovan S, Livingston E, Zhang RS, Kleinman R, Guth P, Brunicardi FC: Glucose-induced islet hyperemia is mediated by nitric oxide. Am J Surg 171:16-20, 1996 99. Olle K, Karlsten R, Sundler F, Jansson L: Blood flow regulation in the transplanted fetal endocrine pancreas. Acquisition of a nitric oxide-dependent glucose-induced increase in blood flow. Transplantation 61:772-777, 1996 100. Vajkoczy P, Vollmar B, Wolf B, Menger MD: Effects of cyclosporine A on the process of vascularization of freely transplanted islets of Langerhans. J Mol Med 77:111-114, 1999 101. Mendola JF, Goity C, Esmatjes E, Saenz A, Fernandez-Cruz L, Gomis R: Cyclosporine does not inhibit the process of revascularization of pancreatic islet transplantation. Cell Transplant 6:69-76, 1997 102. Beger C, Menger MD: RS-61443 prevents microvascular rejection of pancreatic islet xenografts. Transplantation 63:577-582, 1997 103. Toso C, Morel P, Bucher P, Mathe Z, Demuylder-Mischler S, Bosco D, Berney T, Oberholzer J, Shapiro J, Philippe J: Insulin independence after conversion to tacrolimus and sirolimus-based immunosuppression in islet-kidney recipients. Transplantation 76:1133-1134, 2003 104. Guba M, von Breitenbuch P, Steinbauer M, Koehl G, Flegel S, Hornung M, Bruns CJ, Zuelke C, Farkas S, Anthuber M, Jauch KW, Geissler EK: Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat Med 8:128-135, 2002 105. Cantaluppi V, Biancone L, Romanazzi GM, Figliolini F, Beltramo S, Ninniri MS, Galimi F, Romagnoli R, Franchello A, Salizzoni M, Perin PC, Ricordi C, Segoloni GP, Camussi G: Antiangiogenic and immunomodulatory effects of rapamycin on islet endothelium: relevance for islet transplantation. Am J Transplant 6:2601-2611, 2006 88
106. Desai NM, Goss JA, Deng S, Wolf BA, Markmann E, Palanjian M, Shock AP, Feliciano S, Brunicardi FC, Barker CF, Naji A, Markmann JF: Elevated portal vein drug levels of sirolimus and tacrolimus in islet transplant recipients: local immunosuppression or islet toxicity? Transplantation 76:1623-1625, 2003 107. Hirshberg B, Mog S, Patterson N, Leconte J, Harlan DM: Histopathological study of intrahepatic islets transplanted in the nonhuman primate model using edmonton protocol immunosuppression. J Clin Endocrinol Metab 87:5424-5429, 2002 108. Halban PA, Powers SL, George KL, Bonner-Weir S: Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes 36:783-790, 1987 109. Lipsett M, Aikin R, Hanley S, Al-Maleek J, Laganiere S, Rosenburg L: Islet neogenesis: a potential therapeutic tool in type 1 diabetes. Int J Biochem Cell Biol 38:715-720, 2006 110. Beger C, Cirulli V, Vajkoczy P, Halban PA, Menger MD: Vascularization of purified pancreatic islet-like cell aggregates (pseudoislets) after syngeneic transplantation. Diabetes 47:559-565, 1998 111. Folkman J: Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J Med 333:1757-1763, 1995 112. Gerber HP, Hillan KJ, Ryan AM, Kowalski J, Keller GA, Rangell L, Wright BD, Radtke F, Aguet M, Ferrara N: VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159, 1999 113. Folkman J, Shing Y: Angiogenesis. J Biol Chem 267:10931-10934, 1992 114. Borgstrom P, Gold DP, Hillan KJ, Ferrara N: Importance of VEGF for breast cancer angiogenesis in vivo: implications from intravital microscopy of combination treatments with an anti-VEGF neutralizing monoclonal antibody and doxorubicin. Anticancer Res 19:4203-4214, 1999 115. Dubois S, Demetri G: Markers of angiogenesis and clinical features in patients with sarcoma. Cancer, 2007 116. Verhoef C, de Wilt JH, Verheul HM: Angiogenesis inhibitors: perspectives for medical, surgical and radiation oncology. Curr Pharm Des 12:2623-2630, 2006 117. Ferrara N: VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat Rev Cancer 2:795-803, 2002
89
118. Gerber HP, Ferrara N: The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis. J Mol Med 81:20-31, 2003 119. Chatterjee SK, Zetter BR: Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future. Future Oncol 1:37-50, 2005 120. Carmeliet P: Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6:389395, 2000 121. Ferrara N: Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 56:794-814, 1999 122. Ferrara N: Vascular endothelial growth factor and the regulation of angiogenesis. Recent Prog Horm Res 55:15-35; discussion 35-16, 2000 123. Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, Rudge JS, Wiegand SJ, Holash J: Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407:242-248, 2000 124. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9:669-676, 2003 125. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 246:1306-1309, 1989 126. Bergers G, Benjamin LE: Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer 3:401-410, 2003 127. Houck KA, Ferrara N, Winer J, Cachianes G, Li B, Leung DW: The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 5:1806-1814, 1991 128. Dvorak HF, Nagy JA, Feng D, Brown LF, Dvorak AM: Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and the significance of microvascular hyperpermeability in angiogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 237:97-132, 1999 129. Kowanetz M, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor signaling pathways: therapeutic perspective. Clin Cancer Res 12:5018-5022, 2006 130. Kozlowska U, Blume-Peytavi U, Kodelja V, Sommer C, Goerdt S, Majewski S, Jablonska S, Orfanos CE: Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle. Arch Dermatol Res 290:661-668, 1998 131. Relf M, LeJeune S, Scott PA, Fox S, Smith K, Leek R, Moghaddam A, Whitehouse R, Bicknell R, Harris AL: Expression of the angiogenic factors vascular 90
endothelial cell growth factor, acidic and basic fibroblast growth factor, tumor growth factor beta-1, platelet-derived endothelial cell growth factor, placenta growth factor, and pleiotrophin in human primary breast cancer and its relation to angiogenesis. Cancer Res 57:963-969, 1997 132. Ferrara N: Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer 32A:2413-2422, 1996 133. Ferrara N, Houck KA, Jakeman LB, Winer J, Leung DW: The vascular endothelial growth factor family of polypeptides. J Cell Biochem 47:211-218, 1991 134. Eriksson U, Alitalo K: Structure, expression and receptor-binding properties of novel vascular endothelial growth factors. Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57, 1999 135. Olofsson B, Jeltsch M, Eriksson U, Alitalo K: Current biology of VEGF-B and VEGF-C. Curr Opin Biotechnol 10:528-535, 1999 136. Joukov V, Kaipainen A, Jeltsch M, Pajusola K, Olofsson B, Kumar V, Eriksson U, Alitalo K: Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C. J Cell Physiol 173:211-215, 1997 137. Shibuya M, Ito N, Claesson-Welsh L: Structure and function of vascular endothelial growth factor receptor-1 and -2. Curr Top Microbiol Immunol 237:59-83, 1999 138. Terman BI, Carrion ME, Kovacs E, Rasmussen BA, Eddy RL, Shows TB: Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6:1677-1683, 1991 139. Soker S, Gollamudi-Payne S, Fidder H, Charmahelli H, Klagsbrun M: Inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced endothelial cell proliferation by a peptide corresponding to the exon 7-encoded domain of VEGF165. J Biol Chem 272:31582-31588, 1997 140. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. Faseb J 13:9-22, 1999 141. Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsbrun M: Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92:735-745, 1998 142. Makinen T, Olofsson B, Karpanen T, Hellman U, Soker S, Klagsbrun M, Eriksson U, Alitalo K: Differential binding of vascular endothelial growth factor B splice and proteolytic isoforms to neuropilin-1. J Biol Chem 274:21217-21222, 1999 91
143. Migdal M, Huppertz B, Tessler S, Comforti A, Shibuya M, Reich R, Baumann H, Neufeld G: Neuropilin-1 is a placenta growth factor-2 receptor. J Biol Chem 273:22272-22278, 1998 144. Jeltsch M, Kaipainen A, Joukov V, Meng X, Lakso M, Rauvala H, Swartz M, Fukumura D, Jain RK, Alitalo K: Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice. Science 276:1423-1425, 1997 145. Aiello LP, Pierce EA, Foley ED, Takagi H, Chen H, Riddle L, Ferrara N, King GL, Smith LE: Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using soluble VEGF-receptor chimeric proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 92:10457-10461, 1995 146. Takayama K, Ueno H, Nakanishi Y, Sakamoto T, Inoue K, Shimizu K, Oohashi H, Hara N: Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ. Cancer Res 60:2169-2177, 2000 147. Rousseau S, Houle F, Landry J, Huot J: p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene 15:2169-2177, 1997 148. Kallio PJ, Wilson WJ, O'Brien S, Makino Y, Poellinger L: Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem 274:6519-6525, 1999 149. Abu El-Asrar AM, Missotten L, Geboes K: Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1alpha and the Protein Products of its Target Genes in Diabetic Fibrovascular Epiretinal Membranes. Br J Ophthalmol, 2007 150. Maxwell PH, Dachs GU, Gleadle JM, Nicholls LG, Harris AL, Stratford IJ, Hankinson O, Pugh CW, Ratcliffe PJ: Hypoxia-inducible factor-1 modulates gene expression in solid tumors and influences both angiogenesis and tumor growth. Proc Natl Acad Sci U S A 94:8104-8109, 1997 151. Arbiser JL, Moses MA, Fernandez CA, Ghiso N, Cao Y, Klauber N, Frank D, Brownlee M, Flynn E, Parangi S, Byers HR, Folkman J: Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 94:861-866, 1997 152. Petit AM, Rak J, Hung MC, Rockwell P, Goldstein N, Fendly B, Kerbel RS: Neutralizing antibodies against epidermal growth factor and ErbB-2/neu receptor tyrosine kinases down-regulate vascular endothelial growth factor production by 92
tumor cells in vitro and in vivo: angiogenic implications for signal transduction therapy of solid tumors. Am J Pathol 151:1523-1530, 1997 153. Lungu GF, Li ML, Xie X, Wang LV, Stoica G: In vivo imaging and characterization of hypoxia-induced neovascularization and tumor invasion. Int J Oncol 30:45-54, 2007 154. Pinedo HM, Verheul HM, D'Amato RJ, Folkman J: Involvement of platelets in tumour angiogenesis? Lancet 352:1775-1777, 1998 155. Banks RE, Forbes MA, Kinsey SE, Stanley A, Ingham E, Walters C, Selby PJ: Release of the angiogenic cytokine vascular endothelial growth factor (VEGF) from platelets: significance for VEGF measurements and cancer biology. Br J Cancer 77:956-964, 1998 156. O'Byrne KJ, Dobbs N, Propper D, Smith K, Harris AL: Vascular endothelial growth factor platelet counts, and prognosis in renal cancer. Lancet 353:1494-1495, 1999 157. Salgado R, Vermeulen PB, Benoy I, Weytjens R, Huget P, Van Marck E, Dirix LY: Platelet number and interleukin-6 correlate with VEGF but not with bFGF serum levels of advanced cancer patients. Br J Cancer 80:892-897, 1999 158. Errera FI, Canani LH, Silva ME, Yeh E, Takahashi W, Santos KG, Souto KE, Tschiedel B, Roisenberg I, Gross JL, Passos-Bueno MR: Functional Vascular Endothelial Growth Factor -634G>C SNP Is Associated With Proliferative Diabetic Retinopathy: A case-control study in a Brazilian population of European ancestry. Diabetes Care 30:275-279, 2007 159. Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemori EN, Wong WL, Pope RM, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor. A cytokine modulating endothelial function in rheumatoid arthritis. J Immunol 152:4149-4156, 1994 160. Ferrara N, Chen H, Davis-Smyth T, Gerber HP, Nguyen TN, Peers D, Chisholm V, Hillan KJ, Schwall RH: Vascular endothelial growth factor is essential for corpus luteum angiogenesis. Nat Med 4:336-340, 1998 161. Millauer B, Longhi MP, Plate KH, Shawver LK, Risau W, Ullrich A, Strawn LM: Dominant-negative inhibition of Flk-1 suppresses the growth of many tumor types in vivo. Cancer Res 56:1615-1620, 1996 162. Laakkonen P, Waltari M, Holopainen T, Takahashi T, Pytowski B, Steiner P, Hicklin D, Persaud K, Tonra JR, Witte L, Alitalo K: Vascular endothelial growth
93
factor receptor 3 is involved in tumor angiogenesis and growth. Cancer Res 67:593599, 2007 163. Piossek C, Thierauch KH, Schneider-Mergener J, Volkmer-Engert R, Bachmann MF, Korff T, Augustin HG, Germeroth L: Potent inhibition of angiogenesis by D,Lpeptides derived from vascular endothelial growth factor receptor 2. Thromb Haemost 90:501-510, 2003 164. Saleh M, Stacker SA, Wilks AF: Inhibition of growth of C6 glioma cells in vivo by expression of antisense vascular endothelial growth factor sequence. Cancer Res 56:393-401, 1996 165. Dachs GU, Tozer GM: Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation. Eur J Cancer 36:1649-1660, 2000 166. Davalli AM, Scaglia L, Zangen DH, Hollister J, Bonner-Weir S, Weir GC: Vulnerability of islets in the immediate posttransplantation period. Dynamic changes in structure and function. Diabetes 45:1161-1167, 1996 167. Lai EY, Persson AE, Bodin B, Kallskog O, Andersson A, Pettersson U, Hansell P, Jansson L: Endothelin-1 and Pancreatic Islet Vasculature: Studies in Vivo and on Isolated, Vascularly Perfused Pancreatic Islets. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007 168. Gorden DL, Mandriota SJ, Montesano R, Orci L, Pepper MS: Vascular endothelial growth factor is increased in devascularized rat islets of Langerhans in vitro. Transplantation 63:436-443, 1997 169. Stagner J, Mokshagundam S, Wyler K, Samols E, Rilo H, Stagner M, Parthasarathy L, Parthasarathy R: Beta-Cell sparing in transplanted islets by vascular endothelial growth factor. Transplant Proc 36:1178-1180, 2004 170. Sigrist S, Mechine-Neuville A, Mandes K, Calenda V, Legeay G, Bellocq JP, Pinget M, Kessler L: Induction of angiogenesis in omentum with vascular endothelial growth factor: influence on the viability of encapsulated rat pancreatic islets during transplantation. J Vasc Res 40:359-367, 2003 171. Tillmar L, Welsh N: In vitro cultured rat islets express genes that both prevent and promote angiogenesis. Jop 5:81-91, 2004 172. Barnett MJ, McGhee-Wilson D, Shapiro AM, Lakey JR: Variation in human islet viability based on different membrane integrity stains. Cell Transplant 13:481-488, 2004 173. Gannon G, Mandriota SJ, Cui L, Baetens D, Pepper MS, Christofori G: Overexpression of vascular endothelial growth factor-A165 enhances tumor 94
angiogenesis but not metastasis during beta-cell carcinogenesis. Cancer Res 62:603608, 2002 174. Hanahan D: Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature 315:115-122, 1985 175. Berney T, Molano RD, Cattan P, Pileggi A, Vizzardelli C, Oliver R, Ricordi C, Inverardi L: Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation 71:125-132., 2001 176. Kaufman DB, Gores PF, Field MJ, Farney AC, Gruber SA, Stephanian E, Sutherland DE: Effect of 15-deoxyspergualin on immediate function and long-term survival of transplanted islets in murine recipients of a marginal islet mass. Diabetes 43:778-783, 1994 177. Ricordi C, Zeng YJ, Alejandro R, Tzakis A, Venkataramanan R, Fung J, Bereiter D, Mintz DH, Starzl TE: In vivo effect of FK506 on human pancreatic islets. Transplantation 52:519-522, 1991 178. Dupraz P, Rinsch C, Pralong WF, Rolland E, Zufferey R, Trono D, Thorens B: Lentivirus-mediated Bcl-2 expression in betaTC-tet cells improves resistance to hypoxia and cytokine-induced apoptosis while preserving in vitro and in vivo control of insulin secretion. Gene Ther 6:1160-1169., 1999 179. Efrat S: Regulation of insulin secretion: insights from engineered beta-cell lines. Ann N Y Acad Sci 1014:88-96, 2004 180. Dupraz P, Rinsch C, Pralong WF, Rolland E, Zufferey R, Trono D, Thorens B: Lentivirus-mediated Bcl-2 expression in betaTC-tet cells improves resistance to hypoxia and cytokine-induced apoptosis while preserving in vitro and in vivo control of insulin secretion. Gene Ther 6:1160-1169, 1999 181. Dupraz P, Cottet S, Hamburger F, Dolci W, Felley-Bosco E, Thorens B: Dominant negative MyD88 proteins inhibit interleukin-1beta /interferon-gamma mediated induction of nuclear factor kappa B-dependent nitrite production and apoptosis in beta cells. J Biol Chem 275:37672-37678, 2000 182. Furie MB, Cramer EB, Naprstek BL, Silverstein SC: Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J Cell Biol 98:1033-1041, 1984
95
183. Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J Virol 73:2886-2892, 1999 184. Montesano R, Orci L: Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro. Cell 42:469-477, 1985 185. Montesano R, Pepper MS, Vassalli JD, Orci L: Phorbol ester induces cultured endothelial cells to invade a fibrin matrix in the presence of fibrinolytic inhibitors. J Cell Physiol 132:509-516, 1987 186. Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R: Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro. Biochem Biophys Res Commun 189:824-831, 1992 187. Mattsson G, Carlsson PO, Olausson K, Jansson L: Histological markers for endothelial cells in endogenous and transplanted rodent pancreatic islets. Pancreatology 2:155-162, 2002 188. Goto M, Eich TM, Felldin M, Foss A, Kallen R, Salmela K, Tibell A, Tufveson G, Fujimori K, Engkvist M, Korsgren O: Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation 78:1367-1375, 2004 189. O'Gorman D, Kin T, Murdoch T, Richer B, McGhee-Wilson D, Ryan EA, Shapiro JA, Lakey JR: The standardization of pancreatic donors for islet isolations. Transplantation 80:801-806, 2005 190. Georges P, Muirhead RP, Williams L, Holman S, Tabiin MT, Dean SK, Tuch BE: Comparison of size, viability, and function of fetal pig islet-like cell clusters after digestion using collagenase or liberase. Cell Transplant 11:539-545, 2002 191. Hyder A: Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biol Int 29:831834, 2005 192. Balamurugan AN, He J, Guo F, Stolz DB, Bertera S, Geng X, Ge X, Trucco M, Bottino R: Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant 5:2671-2681, 2005 193. Linetsky E, Bottino R, Lehmann R, Alejandro R, Inverardi L, Ricordi C: Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes 46:1120-1123, 1997 96
194. Kin T, Johnson PR, Shapiro AM, Lakey JR: Factors influencing the collagenase digestion phase of human islet isolation. Transplantation 83:7-12, 2007 195. Brandhorst H, Brendel MD, Eckhard M, Bretzel RG, Brandhorst D: Influence of neutral protease activity on human islet isolation outcome. Transplant Proc 37:241242, 2005 196. Rood PP, Bottino R, Balamurugan AN, Smetanka C, Ayares D, Groth CG, Murase N, Cooper DK, Trucco M: Reduction of Early Graft Loss After Intraportal Porcine Islet Transplantation in Monkeys. Transplantation 83:202-210, 2007 197. Noguchi H: Activation of c-Jun NH(2)-terminal Kinase during Islet Isolation. Endocr J, 2006 198. Menger MD, Jager S, Walter P, Hammersen F, Messmer K: A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. Int J Microcirc Clin Exp 9:103-117, 1990 199. Carlsson PO, Palm F, Mattsson G: Low revascularization of experimentally transplanted human pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab 87:5418-5423, 2002 200. Schrezenmeir J, Gero L, Laue C, Kirchgessner J, Muller A, Huls A, Passmann R, Hahn HJ, Kunz L, Mueller-Klieser W, et al.: The role of oxygen supply in islet transplantation. Transplant Proc 24:2925-2929, 1992 201. Brissova M, Shostak A, Shiota M, Wiebe PO, Poffenberger G, Kantz J, Chen Z, Carr C, Jerome WG, Chen J, Baldwin HS, Nicholson W, Bader DM, Jetton T, Gannon M, Powers AC: Pancreatic islet production of vascular endothelial growth factor--a is essential for islet vascularization, revascularization, and function. Diabetes 55:2974-2985, 2006 202. Linn T, Schmitz J, Hauck-Schmalenberger I, Lai Y, Bretzel RG, Brandhorst H, Brandhorst D: Ischaemia is linked to inflammation and induction of angiogenesis in pancreatic islets. Clin Exp Immunol 144:179-187, 2006 203. Lammert E, Gu G, McLaughlin M, Brown D, Brekken R, Murtaugh LC, Gerber HP, Ferrara N, Melton DA: Role of VEGF-A in vascularization of pancreatic islets. Curr Biol 13:1070-1074, 2003 204. Johansson U, Olsson A, Gabrielsson S, Nilsson B, Korsgren O: Inflammatory mediators expressed in human islets of Langerhans: implications for islet transplantation. Biochem Biophys Res Commun 308:474-479, 2003 205. Kumagai N, O'Neil JJ, Barth RN, LaMattina JC, Utsugi R, Moran SG, Yamamoto S, Vagefi PA, Kitamura H, Kamano C, Sachs DH, Yamada K: 97
Vascularized islet-cell transplantation in miniature swine. I. Preparation of vascularized islet kidneys. Transplantation 74:1223-1230, 2002 206. Menger MD, Beger C, Vajkoczy P: Restitution of intra-islet portal system in pancreatic islet isografts. Transplant Proc 26:688, 1994 207. Vasir B, Jonas JC, Steil GM, Hollister-Lock J, Hasenkamp W, Sharma A, Bonner-Weir S, Weir GC: Gene expression of VEGF and its receptors Flk-1/KDR and Flt-1 in cultured and transplanted rat islets. Transplantation 71:924-935, 2001 208. Paraskevas S, Maysinger D, Wang R, Duguid TP, Rosenberg L: Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas 20:270-276, 2000 209. Giannoukakis N, Mi Z, Rudert WA, Gambotto A, Trucco M, Robbins P: Prevention of beta cell dysfunction and apoptosis activation in human islets by adenoviral gene transfer of the insulin-like growth factor I. Gene Ther 7:2015-2022, 2000 210. Konstantinova I, Lammert E: Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays 26:1069-1075, 2004 211. Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, Rudge JS, Wiegand SJ, Holash J: Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407:242-248., 2000 212. Schramm R, Yamauchi J, Vollmar B, Vajkoczy P, Menger MD: Blockade of in vivo VEGF-KDR/flk-1 signaling does not affect revascularization of freely transplanted pancreatic islets. Transplantation 75:239-242, 2003 213. Iwashita N, Uchida T, Choi JB, Azuma K, Ogihara T, Ferrara N, Gerber H, Kawamori R, Inoue M, Watada H: Impaired insulin secretion in vivo but enhanced insulin secretion from isolated islets in pancreatic beta cell-specific vascular endothelial growth factor-A knock-out mice. Diabetologia 50:380-389, 2007 214. Carmeliet P: VEGF gene therapy: stimulating angiogenesis or angioma-genesis? Nat Med 6:1102-1103, 2000 215. Johansson M, Mattsson G, Andersson A, Jansson L, Carlsson PO: Islet endothelial cells and pancreatic beta-cell proliferation: studies in vitro and during pregnancy in adult rats. Endocrinology 147:2315-2324, 2006 216. Nikolova G, Jabs N, Konstantinova I, Domogatskaya A, Tryggvason K, Sorokin L, Fassler R, Gu G, Gerber HP, Ferrara N, Melton DA, Lammert E: The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Dev Cell 10:397-405, 2006 98
217. Olsson R, Carlsson PO: The pancreatic islet endothelial cell: emerging roles in islet function and disease. Int J Biochem Cell Biol 38:710-714, 2006 218. Wahoff DC, Papalois BE, Najarian JS, Kendall DM, Farney AC, Leone JP, Jessurun J, Dunn DL, Robertson RP, Sutherland DE: Autologous islet transplantation to prevent diabetes after pancreatic resection. Ann Surg 222:562-575; discussion 575569, 1995 219. Berney T, Mathe Z, Bucher P, Demuylder-Mischler S, Andres A, Bosco D, Oberholzer J, Majno P, Philippe J, Buhler L, Morel P: Islet autotransplantation for the prevention of surgical diabetes after extended pancreatectomy for the resection of benign tumors of the pancreas. Transplant Proc 36:1123-1124, 2004 220. Isner JM: Myocardial gene therapy. Nature 415:234-239, 2002 221. Khan TA, Sellke FW, Laham RJ: Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther 10:285-291, 2003 222. Fodor A, Harel C, Fodor L, Armoni M, Salmon P, Trono D, Karnieli E: Adult rat liver cells transdifferentiated with lentiviral IPF1 vectors reverse diabetes in mice: an ex vivo gene therapy approach. Diabetologia 50:121-130, 2007 223. Newgard CB, Clark S, BeltrandelRio H, Hohmeier HE, Quaade C, Normington K: Engineered cell lines for insulin replacement in diabetes: current status and future prospects. Diabetologia 40 Suppl 2:S42-47, 1997 224. Chen S, Ding JH, Bekeredjian R, Yang BZ, Shohet RV, Johnston SA, Hohmeier HE, Newgard CB, Grayburn PA: Efficient gene delivery to pancreatic islets with ultrasonic microbubble destruction technology. Proc Natl Acad Sci U S A 103:84698474, 2006 225. Mendez AJ, Inverardi L, Ricordi C, Kenyon NS: The Miami results on porcine islet-Sertoli cell xenotransplantation. Xenotransplantation 14:89, 2007 226. Narang AS, Cheng K, Henry J, Zhang C, Sabek O, Fraga D, Kotb M, Gaber AO, Mahato RI: Vascular endothelial growth factor gene delivery for revascularization in transplanted human islets. Pharm Res 21:15-25, 2004 227. Narang AS, Sabek O, Gaber AO, Mahato RI: Co-expression of vascular endothelial growth factor and interleukin-1 receptor antagonist improves human islet survival and function. Pharm Res 23:1970-1982, 2006 228. Mai G, Bucher P, Morel P, Mei J, Bosco D, Andres A, Mathe Z, Wekerle T, Berney T, Buhler LH: Anti-CD154 mAb treatment but not recipient CD154 99
deficiency leads to long-term survival of xenogeneic islet grafts. Am J Transplant 5:1021-1031, 2005 229. Itakura S, Asari S, Rawson J, Ito T, Todorov I, Liu CP, Sasaki N, Kandeel F, Mullen Y: Mesenchymal stem cells facilitate the induction of mixed hematopoietic chimerism and islet allograft tolerance without GVHD in the rat. Am J Transplant 7:336-346, 2007 230. Toso C, Mathe Z, Morel P, Oberholzer J, Bosco D, Sainz-Vidal D, Hunkeler D, Buhler LH, Wandrey C, Berney T: Effect of microcapsule composition and short-term immunosuppression on intraportal biocompatibility. Cell Transplant 14:159-167, 2005 231. Pileggi A, Molano RD, Ricordi C, Zahr E, Collins J, Valdes R, Inverardi L: Reversal of diabetes by pancreatic islet transplantation into a subcutaneous, neovascularized device. Transplantation 81:1318-1324, 2006 232. Bucher P, Mathe Z, Morel P, Bosco D, Andres A, Kurfuest M, Friedrich O, Raemsch-Guenther N, Buhler LH, Berney T: Assessment of a novel two-component enzyme preparation for human islet isolation and transplantation. Transplantation 79:91-97, 2005 233. Máthé Z, Zbinden M, Bosco D, Berney T, Pepper M.: A fokozott VEGF-A génexpresszió javítja a transzplantált szigetsejtek revascularisatioját és működését. Diabetologia Hungarica 14 (3), 217-225, 2006 234. Mathe Z, Dupraz P, Rinsch C, Thorens B, Bosco D, Zbinden M, Morel P, Berney T, Pepper MS: Tetracycline-regulated expression of VEGF-A in beta cells induces angiogenesis: improvement of engraftment following transplantation. Cell Transplant 15:621-636, 2006 235. Williams P.: Notes on diabetes treated with extract and by grafts of sheep's pancreas. Br Med J 1894; 2:1303 236. Ricordi C.: Automated method for pancreatic islet separation. In: Ricordi C, ed. Methods in Cell Transplantation. R.G. Landes, Austin, TX, 1995 pp. 433-438
100
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 10.1. AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK 1. Zoltan Mathe, Philippe Dupraz, Chris Rinsch, Bernard Thorens, Domenico Bosco, Marie Zbinden, Philippe Morel, Thierry Berney, Michael S. Pepper: TetracyclineRegulated Expression of VEGF-A in Beta Cells Induces Angiogenesis: Improvement of Engraftment Following Transplantation Cell Transplantation, 2006, 15(7), 621-36
IF: 3.481
2. Máthé Zoltán; Zbinden, Marie; Bosco, Domenico; Berney,Thierry; Pepper, Michael: A fokozott VEGF-A génexpresszió javítja a transzplantált szigetsejtek revascularisatióját és működését Diabetologia Hungarica, 2006, 14 (3), 217-225 3. Máthé, Z., Langer, R., Bucher, P., Thierry, B., Morel, P., Járay, J., Perner, F.: A pancreas szigetsejt-allotranszplantá́ció új eredmé́nyei. Orvosi Hetilap 2004; 145 (20), 1053-9 4. Máthé Zoltán, Langer Róbert, Pascal Bucher, Thierry Berney: A hasnyálmirigy és szigetsejtátültetés helyzete, új lehetőségek Focus Medicinae, 2004, 6, (2):10-15 5. Bucher, P., Mathe, Z., Morel, P., Bosco, D., Andres, A., Kurfuest, M., Friedrich, O., Buchler, L.H., Wendrey, C., Berney, T.: Assessment of a novel two-component enzyme preparation for human islet isolation and transplantation Transplantation 2005; 79 (1), 91-7
IF: 3,879
6. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Andres, A., Kurfuerst, M., Ramsch-Gunther, N., Buhler, L., Morel, Ph., Berney, T.: Serva collagenase NB1: A new enzyme preparation for human islet isolation Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1143-4
101
IF:0, 511
7. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Andres, A., Buhler, L.H., Morel, P., Berney, T.: Islet of Langerhans transplantation for the treatment of type 1 diabetes Swiss Surgery 2003; 9 (5), 242-6 8. Bucher, P., Bosco, D., Mathe, Z., Matthey-Doret, D., Andres, A., Kurfuerst, M., Ramsch-Gunther, N., Buhler, L., Morel, P., Berney, T.: Optimization of neutral protease to collagenase activity ratio for islet of langerhans isolation Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1145-6
IF:0, 511
9. Bucher, P., Mathe, Z., Buhler, L.H., Andres, A., Bosco, D., Berney, T., Morel, P.: Diabetes Type I therapy through transplantation Annales de Chirurgie 2005; 130 (6-7), 374-83
IF: 0,455
10. Berney, T., Bucher, P., Mathe, Z., Andres, A., Bosco, D., Mage, R., Toso, C., Oberholzer, J., Becker, C., Philippe, J., Buhler, L., Morel, P.: Islet of Langerhans allogeneic transplantation at the University of Geneva in the steroid free era in islet after kidney and simultaneous islet-kidney transplantations Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1121-2
IF:0,511
11. Berney, T., Mathe, Z., Bucher, P., Andres, A., Bosco, D., Toso, C., Buhler, L., Morel, P.: Islet of Langerhans autotransplantation for the prevention of surgical diabetes after extensive pancreatic resection | [Autotransplantation d'ilots de Langerhans pour la prévention du diabète après résection pancréatique étendue] Medecine et Hygiene 2003; 61 (2442), 1313-8
Össz IF: 9,348
102
10.2. AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ ABSZTRAKTOK, PREZENTÁCIÓK 1. Mathe, Z; Langer, R M.; Jaray, J ; Filo, A ; Doros, A ; Weszelits, V; Remport, A; Varga, M; Mathe, Zs; Perner, F; Andres, A; Bosco, D; Morel, Ph ; Berney, T: Human Pancreatic Islet Transplantation in International Collaboration with a Distant Islet Isolation Center: Preliminary Results from the Budapest-Geneva Experience. Transplantation. 78(2) Supplement 1:353, July 27, 2004. 2. Z. Mathe, Ph, Dupraz, D. Bosco, P. Bucher, M. Zbinden, C. Rinsch, B. Thorens, Th. Berney and M. S. Pepper: Retroviral Transduction of Pancreatic Beta-cells by VEGF-164 Improves Glycemic Control in a Syngeneic Model of Islet Cell Transplantation. IPITA 2003, 8-11 July, Dublin, Ireland 3. Z. Mathe1,2, Ph. Dupraz3, M. Zbinden4, D. Bosco1, A. Filo², P. Bucher1, C. Rinsch3, B. Thorens5, T. Berney1 and M.S. Pepper4 Regulated Gene Expression of VEGF-164 by
Pancreatic Beta-cells Improves Revascularization and
Engraftment after Transplantation. EASD, 5-9 Sept, 2004, Munich, Germany 4. Bucher, Pascal; Bosco, Domenico; Morel, Philippe; Mathe, Zoltan; Kurfuest, Manfred; Buhler, Leo; Berney, Thierry: The Role of Neutral Protease During Islet Isolation Evaluated with a New Enzyme Preparation. American Journal of Transplantation Supplement. 4 Supplement 8:470-471, March 2004. 5. Z. Mathe, P. Bucher, D. Bosco, J. Oberholzer, C. Wandrey, L.Buhler, Th. Berney, Ph. Morel:
Short Term Immunosuppression Reduces Pericapsular Fibrotic
Infiltration Around Barium-M-Alginate Microbeads. 22th
Workshop of the
AIDPIT and EASD; Igls, Austria, January 27-29, 2003 6. Z. Mathe, D. Bosco, P. Bucher, C. Wandrey, D. Sainz, Th. Berney, L. Bühler and Ph. Morel: Microencapsulation for Immunoprotection of Islets of Langerhans NRP 46-International Workshop on Implants and Transplants, 20-21 February, 2003, Bern, Switzerland
103
7. Z. Mathe, P. Bucher, D. Bosco, C. Toso, J. Oberholzer, C. Wandrey, D. Sainz, L. Bühler, Ph. Morel and Th. Berney: Fibrotic Infiltration Around Barium-alginate Microbeads Can be Reduced by a Short Course of Immunosuppression IPITA 2003, 8-11 July, Dublin, Ireland 8. Baertschiger, Reto M.; Bosco, Domenico; Morel, Philippe; Andres, Axel; Armanet, Mathieu; Wojtusciszyn, Anne; Mathe, Zoltan; Bucher, Pascal; Pernin, Nadine; Charvier, Solange; Toso, Christian; Berney, Thierry: How to select good donors of pancreatic islets? A difficult task Abstract# 1296 Poster Board #-Session: P226III. American Journal of Transplantation Supplement. 5 Supplement 11:486, May 2005. 9. Berney, Thierry; Bucher, Pascal; Mathe, Zoltan; Kempf, Marie-Claude; Bosco, Domenico; Andres, Axel; Oberholzer, Jose; Becker, Christoph ; Philippe, Jacques; Mage, Raymond; Majno, Pietro; Buhler, Leo H.; Morel, Philippe: Islet of Langerhans Allogeneic Transplantation at the University of Geneva in the steroid-free era. American Journal of Transplantation Supplement. 3 Supplement 5:254, May 2003. 10. Mai, G 1; Bucher, P 1; Mathe, Z 1; Bosco, D 1; Pernin, D 1; Berney, T 1; Morel, Ph 1; Buhler, L 1 Retransplantation of Discordant Xenogeneic Islets using Costimulatory Blockade. Xenotransplantation. 10(5):493, September 2003. 11. Mai, G 1; Bucher, P 1; Mathe, Z 1; Bosco, D 1; Berney, T 1; Morel, Ph 1; Buhler, L 1 Inhibition of Signals 2 and 3 Allows Long-term Graft Survival of Concordant and Discordant Islet Grafts. Xenotransplantation. 10(5):492, September 2003. 12. Z. Mathe, F. Triponez, C. Toso, P. Bucher, Ph. Morel: Pancreatic Islet Autotransplantation in a Patient with Severe Pancreatic Injury: Systemic, Preand Posthepatic C-peptide and Insulin Levels during Intravenous Glucose Tolerance Test. 7th Congress of the United Surgical Societies of Switzerland, 19-22 June 2002, Lausanne, Switzerland
104
13. Bucher, P.; Mai, G.; Mathe, Z.; Bosco, D.; Berney, T. H.; Buhler, L. H.; Morel, P. H. Retransplantation of discordant xenogeneic islets using costimulatory blockade. British Journal of Surgery. 91(7):905, July 2004.
105
10.3. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK
1. *Toso, C., Mathe, Z., Morel, P., Oberholzer, J., Bosco, D., Sainz-Vidal, D., Hunkeler, D., Buhler, L.H., Wandrey, C., Berney, T.: Effect of microcapsule composition and short-term immunosuppression on intraportal biocompatibility Cell Transplantation 2005; 14 (2-3), 159-67
IF: 3,481
* A két első szerző egyenlő mértékben járult hozzá a közlemény létrejöttéhez 2. Mathe, Z., Bucher, P., Bosco, D., Andres, A., Fux, C., Toso, C., Oberholzer, J., Wandrey, C., Sainz-Vidal, D., Espinosa, D., Buhler, L., Morel, P., Berney, T.: Shortterm immunosuppression reduces fibrotic cellular infiltration around BariumM-alginate microbeads injected intraportally Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1199-1200
IF:0,511
3. Maedler, K., Sergeev, P., Ehses, J.A., Mathe, Z., Bosco, D., Berney, T., Dayer, J.M., Reinecke, M.C., Halban, P.A., Donath, M.Y.: Leptin modulates β cell expression of IL-1 receptor antagonist and release of IL-1β in human islets Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004;
101 (21), 8138-43
IF:10,452
4. Oberholzer, J., Mathe, Z., Bucher, P., Triponez, F., Bosco, D., Fournier, B., Majno, P., Philippe, J., Morel, P.: Islet autotransplantation after left pancreatectomy for non-enucleable insulinoma American Journal of Transplantation 2003; 3 (10), 1302-7
IF:5,678
5. Mai, G., Bucher, P., Morel, P., Mei, J., Bosco, D., Andres, A., Mathe, Z., Wekerle, T., Berney, T., Buhler, L.H.: Anti-CD154 mAb treatment but not recipient CD154 deficiency leads to long-term survival of xenogeneic islet grafts American Journal of Transplantation 2005; 5 (5), 1021-31
IF:6,002
6. Berney, T., Mathe, Z., Bucher, P., Demuylder-Mischler, S., Andres, A., Bosco, D., Oberholzer,
J.,
Majno,
P.,
Philippe,
106
J.,
Buhler,
L.,
Morel,
P.:
Islet
autotransplantation for the prevention of surgical diabetes after extended pancreatectomy for the resection of benign tumors of the pancreas Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1123-4
IF:0,511
7. Bucher, P., Mai, G., Mathe, Z., Bosco, D., Pernin, N., Berney, Th., Morel, Ph., Buhler, L.: Retransplantation of discordant xenogeneic islets with costimulatory blockade . Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1201-2
IF:0,511
8. Andres, A., Toso, C., Morel, P., Bosco, D., Bucher, P., Oberholzer, J., Mathe, Z., Mai. G., Wekerle, T., Berney, T., Buhler, L.H.: Macrophage depletion prolongs discordant but not concordant islet xenograft survival Transplantation 2005; 79 (5), 543-9
IF: 3,879
9. Andres, A., Toso, C., Morel, P., Bosco, D., Bucher, P., Oberholzer, J., Mathe, Z., Mai. G., Wekerle, T., Berney, T., Buhler, L.H.: Phylogenetic disparity influences the predominance of direct over indirect pathway of antigen presentation in islet xenotransplantation . Transplantation Proceedings 2005; 37 (1), 463-5 IF:0,799 10. Bucher, P., Gang, M., Morel, P., Mathe, Z., Bosco, D., Pernin, N., Wekerle, T., Berney, T., Buhler, L.H.: Transplantation of discordant xenogeneic islets using repeated therapy with anti-CD154 . Transplantation 2005; 79 (11), 1545-52 IF: 3,879 11. Mai, G., Bucher, P., Morel, P., Mei, J., Bosco, D., Andres, A., Mathe, Z., Wekerle, T., Berney, T.,
Bühler, L.H.: Role of CD40-CD154 pathway in the
rejection of concordant and discordant xenogeneic islets Transplantation Proceedings 2005; 37 (1), 460-2
IF:0,799
12. . Bucher, P., Oberholzer, J., Bosco, D., Mathe, Z., Toso, C., Buhler, L.H., Berney, T., Morel, P.: Microbial surveillance during human pancreatic islet isolation Transplant International 2005; 18 (5), 584-9
IF: 1, 797
13. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Oberholzer, J., Toso, C., Andres, A., Buhler, L., Morel, P., Berney, T.: Microbial surveillance during human pancreatic islet isolation. Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1147-8 107
IF:0,511
14. Langer, R.M., Máthé, Z., Doros, A., Máthé, Zs., Weszelits, V., Filó, A., Bucher, P., Morel, P., Berney, T., Járay, J.: Successful islet after kidney transplantation in a distance over 1000 kilometres: Preliminary result of the Budapest-Geneva collaboration.
Transplantation Proceedings 2004; 36 (10), 3113-5
IF:0, 511
15. Bucher, P., Mathe, Z., Demirag, A., Morel, Ph.: Appendix tumors in the era of laparoscopic appendectomy Surgical Endoscopy 2004; 18 (7), 1063-6 16. Bucher, P., Mathe, Z., Bosco, D., Becker, C., Kessler, L., Greget, M., Benhamou, P.Y., Andres, A., Oberholzer, J., Buhler, L., Morel, Ph., Berney, T.: Morbidity associated with intraportal islet transplantation Transplantation Proceedings 2004; 36 (4), 1119-20
IF:0,511
17. Vegso G, Mathe Z, Peter A, Perner F, Jaray J, Langer RM: Improving results of renal transplantation with the use of elderly donors: the Budapest experience. Transplantation Proceedings 2005 Dec, 37(10):4225-7.
IF:0,799
18. Bucher, P., Mathe, Z., Buehler, L., Chilcott, M., Gervaz, P., Egger, J.-F., Morel, P.: Paraganglioma of the ampulla of vater: A potentially malignant neoplasm Scandinavian Journal of Gastroenterology 2004; 39 (3), 291-5
IF:1,824
19. Toso, C., Morel, P., Bucher, P., Mathe, Z., Demuylder-Mischler, S., Bosco, D., Berney, T., Oberholzer, J., Shapiro, J., Philippe, J.: Insulin independence after conversion to tacrolimus and sirolimus-based immunosuppression in islet-kidney recipients. Transplantation 2003; 76 (7), 1133-4
Kumulatív IF: 55,409
108
IF:3,608
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet fejezem ki Perner Ferenc és Járay Jenő Professzor úrnak, mert lehetőséget biztosítottak számomra, hogy a klinikai munka mellett a kísérletes alapkutatásban is elmélyedhessek. Köszönettel tartozom témavezetőmnek Gerő László Professzor úrnak, aki hasznos tanácsaival, építő észrevételeivel munkámat és az értekezés megírását jelentősen segítette. Hálával tartozom Philippe Morel Professzor úrnak, aki lehetővé tette, hogy az általa létrehozott világszínvonalú Genf-i laboratóriumban dolgozhattam két évig. Külön
köszönettel
tartozom
Domenico
Bosco
dr.-nak,
Michael
Pepper
Professzornaknak, valamint Thierry Berney dr.-nak akik révén az alapkutatás egy igen érdekes, rendkívül dinamikusan fejlődő területét megismerhettem és akik megtanítottak arra, hogyan kell a tudományos kutatómunkát tervezni, elvégezni, értékelni, elemezni és közölni. Hálával gondolok dr. Pascal Bucher barátomra, akivel a kísérletek jelentős részét együtt végeztük. E helyen köszönöm Catherine Fux, Nadine Pernin , David Mathey-Doret és Raymond Mage kitűnő és nélkülözhetetlen technikai segítségét. Hálás köszönettel tartozom feleségemnek és gyermekeimnek, akik megértéssel elviselték gyakori távolléteimet és szeretettel támogattak a tudományos közlemények és az értekezés megírásában.
109
