A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi Nobel-díjak:
Francis Harry James Dewey Maurice Hugh Compton Crick Watson Frederick Wilkins
1962
DNS molekuláris szerkezetének felismeréséért
Kary B. Mullis
1993 Polimeráz láncreakció (PCR)
Michael Smith
Irányított mutagenezis
Paul Berg
Walter Gilbert
1980 rekombináns-DNS
Sir James W. Black
Gertrude B. Elion
Frederick Sanger
Nukleinsavak szekvenálásáért
George H. Hitchings
1988 Purin alapú kemoterápiás gyógyszerek
memo: nucleus = sejtmag
NUKLEINSAVAK - dezoxiribonukleinsavak (DNS) - ribonukleinsavak (RNS)
Olyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek eredményeként a sejt összes fehérjéje megszintetizálódik. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.)
Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok O HO
P
heterociklusos bázis
O 5'
OH
N
O 4'
3'
OH
2'
β-N-glikozidos kötés 1'
OH
egy nukleotid
hidrolízis •heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin •ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz •foszfátion
146 bázispár 8 histon fehérje és ezt is Hhidak tartják össze . A nukleoszóma komplexet stab. a H1 linker fehérje
A „supercoiling” 15000* kondenzációt tesz lehetővé
mindig jobb menetes, antiparallel, Z-DNS az egészet a H-hidak tartják egyben
Eukarióta sejtek génjében van nemkódoló rész; intronok. (Prokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az intron a pre-mRNS-be átíródik, majd az RNS érés során az kivágódik.
Nukleinsav (polinukleotid)
Foszforsavészterek hidrolízise: N NH2 N O
HO
O
P
N
N
enyhe degradáció 1N NaOH, 25 °C
nukleáz
O
OH
Nukleotid (monomer)
Q
HO
Q=OH Q=H
adenozin-5'-monof oszf át dezoxiadenozin-5'-monof oszf át N
nukleotidáz
NH2
cc. NH3, 180 °C
N O
H O
Q=OH Q=H HO
Nukleozid (glikozid) + H3PO4
N
N
Q
A N-glikozidkötés hidrolízise:
adenozin dezoxiadenozin
purin nukleozid foszforiláz*
H+
Nukleotidbázis + pentóz (nucleobase)
* Ez a foszforiláz az valójában egy hidroláz
A cukorrész: D-ribóz D-arabinóz
D-xilóz
memo:
D-lixóz
O
O
pirán
f urán
O
O
tetrahidro-2H -pirán
tetrahidrofurán
Ciklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat: A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi H 1
H C
O
H
C 2
OH
H
C 3
OH
H
C 4
OH
5 CH2OH
4
CH2OH C
H2COH O
H C 3 OH
H
C
H
C H
H
1
3C
C
2
OH
OH
nyílt láncú D-ribóz
Nukleozidokban mindig 5 tagú (furanóz) gyűrű formájában van a cukor jelen.
O
O 4
HO
H
5
5
H
C
H
1
C
2
OH
nyílt láncú D-ribóz 5
5
HOCH2 C
4
H
O
H
H
C
C 2
OH
OH
3
OH
HOCH2
C1
4C
H
β-D-ribofuranóz
H
H 3C
OH
H
O H C
C1 OH
2
OH
α-D-ribof uranóz
A nukleinsavak építőelemei: a heterociklusok Pirimidinszármazékok:
HO
N
pirimidin-2,4,6-triol HO
N
N
HO
N
citozin
pirimidin-2,4-diol
4-amino-pirimidine-2-ol
HO
N
timin
OH
5-methyl-pyrimidine-2,4-diol
O
O H
H N HO
N
N N
CH3
N
uracil OH
Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
OH
N
N
OH
barbitursav
NH2
OH
HO
N
O
N H
dilaktim f orma
laktim-laktám forma
dilaktám forma legstabilabb
Purinszármazékok:
OH
NH2 N
N N
NH
6-amino-purin adenin
A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
Melyik tautomerforma a stabilabb?
N
N H2N
N
NH
2-amino-6-hidroxi-purin guanin
Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út:
AMP → nukleotidáz
GMP →
Adenozin dezamináz
PNPáz
purinvázas alkaloidok: di- és trimetil származékok
PNPáz:= Purin nukleozid foszforiláz
N NH2 N
Nukleozidok:
O
H O
A megfelelő purin- és pirimidinbázisok N-glikozidjai
N
N
Q=OH Q=H
adenozin dezoxiadenozin
Q
HO
N NH2 N
Nukleotidok: A nukleozidok foszforsavészterei
O
HO
O
P OH
N
N
O
HO
Q=OH Q=H
Q
adenozin-5'-monofoszf át dezoxiadenozin-5'-monofoszf át
NH2 N
adenozin H
N
O
NH 2 N
N
N
N
RNS építőelem
N
N
HO
O
O H
OH
HO
H
H
H
OH OH adenozin 9-(β-D-ribofuranozil)-adenin op= 235 oC NH 2 N
adenozid
N
O -O
P
O H
O
H
OH
N
N
N
N HO
O
-
NH 2
N
O
H
H
H
O
H OH
H
H OH
adenozin-5'-foszfát 5'-AMP
N
O
P O-
O-
NH2
adenozin-3'-foszfát 3'-AMP
DNS építőelem
dezoxiadenozin
N
O
N
H
NH 2 N
N
N
N
N
N
HO
O
O H
HO
H
H
H
OH H dezoxiadenozin 9-(2'-dezoxi-β -D-ribofuranozil)-adenin op= 190oC NH 2 N
dezoxiadenozid
N
O -
O
P
O
O
H
N
N
N
N HO
O
-
NH 2
H
H
OH
H
N
O H
H
O
H
H
H
dezoxiadenozin-5'-foszfát 5'-dAMP
N
O
P O-
O-
H
dezoxiadenozin-3'-foszfát 3'-dAMP
OH N
guanozin
N
O
H
OH N
N N
N
NH2
RNS építőelem
N
N
NH 2
HO
O
O H
OH
HO
H
H
H
OH OH guanozin 9-(β-D-ribof uranozil)-guanin op= 240 oC OH N
guanozid
N
O -
O
P
O H
O
H
OH
N
N
N
N
NH 2 HO
O
-
OH
N
NH 2
O
H
H
H
O
H OH
H
H OH
guanozin-5'-foszfát 5'-GMP
N
O
P O-
-
O
OH
guanozin-3'-foszfát 3'-GMP dezoxiguanozin
DNS építőelem
N N
O
H
OH N
N
N
NH2
N
N
N
HO
O
NH 2
O H
H
H
HO
OH H dezoxiguanozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-guanin OH N
dezoxiguanozid
N
O -
O
P
O H
O
H
OH
N
N
NH 2 HO
O
-
OH
N
N
H
H
O
H
H
H
dezoxiguanozin-5'-foszfát 5'-dGMP
N
N
NH 2
O
H H
H
O
P O-
O-
H
dezoxiguanozin-3'-foszfát 3'-dGMP
NH2 N
citidin H
N
O
N
O
RNS építőelem
NH 2
HO
O
N
O
O H
OH
HO
H
H
H
OH OH citidin 3-(β-D-ribof uranozil)-citozin op= 230oC
NH 2
NH 2
citidinf oszfátok
N
N O -O
P
O
N
O H
OH
OH
O
N
HO
H
H
H
O
H OH
H
H OH
citidin-5'-f oszfát 5'-CMP
O
O
O
O-
P -
NH2
citidin-3'-f oszf át 3'-CMP dozoxicitidin
N
DNS építőelem O
H
NH 2
N
O
N HO
O
N H
O
H
H
OH H dezoxicitidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-citozin
HO
dezoxicitidin foszf átok
O
O H
NH 2
NH 2
N
N O -O
P
O
N
O H
OH
OH
O
N
HO
H H
H
H
O
H
H
H
dezoxicitidin-5'-foszf át 5'-dCMP
O
O
O
P O-
O-
H
dezoxicitidin-3'-f oszfát 3'-dCMP
OH
uridinn H
OH
N
RNS építőelem
N
O
N
O
HO
O
N
O
O H
H
H
H
OH OH uridin o 3-(β-D-ribofuranozil)-uracil op= 165 C
OH
HO
OH
OH
uridinnfoszfátok
N
N O -O
P
O
N
O
OH
H
H
OH
H OH
uridin-5'-foszfát 5'-UMP
O
N
HO
O
O H
H
O
H OH
H O
P -
O-
OH
uridin-3'-foszfát 3'-UMP
O
DNS építőelem
H3C
H 3C
N
timidin H
OH
N
O
N
HO
O
N
O
O H
O
H
H
H
OH H timidin HO 3-(2'-dezoxi-β-D-ribof uranozil)-timin op= 183o
timidinf oszfátok
OH
OH H 3C
H 3C
N
N
O -O
P
O
N
O H
OH
OH
O
N
HO
H H
H
H
O
H
H
H
timidin-5'-f oszfát 5'-TMP
O
O
O
P O-
O-
H
timidin-3'-f oszfát 3'-TMP
A DNS kémiai szerkezete
foszforsavdiészter típusú lineáris polimerek
NH2
citidin N O N
O
O H
H
H
O
H O
guanozin
H N
O
P
O
NH
N
N
O
O
H
NH2
H
H
O
timidin
H O
O
H
P
H3C
NH
O N
O
O
O H
adenozin
H
H
NH2 H
O O
H P
N
O
N O
O
H
H
O
H
H
H
O
P O
O
N N
Az RNS kémiai szerkezete
C is G is amino-laktám forma
T dilaktám, míg az A amino (aromás) forma
H
H
N
N
O
H
H
N
N
citozin oxo-f orma
O
H
O
N
N
N ribóz
H3C
N H
N
ribóz
guanin oxo-f orma
Nukleotidok belső arányai a DNS-ben: Σ(pur.)/Σ(pir.) ≈ G+A/(C+T) ≈ 1 és - A bázispárok miatt a DNS két szála komplementer jellegű
H
H
N
N N
N
N ribóz
timin oxo-f orma
N adenin
O
A/T ≈ 1 és
ribóz
G/C ≈ 1 1953
-Az intermolekuláris H-hidak jelentősége -A cukor-foszforsav diészter gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak A heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt.
Francis Harry James Dewey Compton Crick Watson
A DNS térszerkezete: jobbmenetes kettős hélix, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat H-hidak tartják össze. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3-H híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban.
citozin
2,8 Â
timin 2,8 Â adenin
guanin
3,0 Â 3,0 Â
H
H N
N
O
H
H
N
N
citozin oxo-f orma
O
H
O
N
N
N ribóz
H 3C
N H
guanin oxo-f orma
N ribóz
N ribóz
timin oxo-f orma
O
H
H
N
N
N N N adenin
ribóz
Mutáció I: Normális és „abnormális” bázispárok szülő H H
O
N N
N
N
-G-C-
N
H
Rib N
N N
Rib
O
H
guanin laktám tautomerje H STABILABB
gyerek
unoka
-G-C-
-G-C-
-G-C-
-G-C-
citozin amino-latkám f orma
mutáció O
N N Rib
O
H
N
CH3
N N
N N guanin laktim tautomerje H LABILIS
H
O
Rib timin dilaktámf orma
-G-C-
-G*-T-
-A-T-
-G-C-
-G-C-
Mutáció II: Kémiai reagensek indukálta mutációk Salétromossav
magyarázat:
mutáció
indukált mutáció:
-H*-C-A-Tszülő
-A-T-
-G-C-
-A-A-T-Tgyerek unoka -A-T-
-A-T-
-A-T-
-A-T-
A DNS térszerkezete: A leggyakoribb forma a B-DNS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű
nagyárok
kisárok
memo: Az A olyan mint a B-forma, csak „tömörebb”.
jobbmenetes α-hélix jobbmenetes α-hélix
Az A-DNS hélix tömzsibb és rövidebb, mint a B-DNS, a főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( ┴ képest 19o).
balmenetes α-hélix
Az B-DNS hélixben a főtengelyhez képest a bázispárok síkja merőleges (┴ képest 1o).
O R
O H H O
H
C-3' a sík felett C-3' endo
Az Z-DNS hélix karcsúbb, főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött (┴ képest 9o).
O O
H
R
H O
H
C-2' a sík felett C-2' endo
DNS és RNS hidrolízisének részletei: 1) Savas hidrolízis Pl. „depurinálás” (A v. G)
memo: az RNS és a DNS kb. egyformán hidrolízál savban kérdés: a ribóz félacetálja savban felnyílik-e?
2) Lúgos hidrolízis (az RNS lúgos hidrolízise):
(RNS) P B
O
H O
H
O P O
B
O
O H
P
P
O O
H H
O
O H
OH
H
O
H
P O
R
H O
OH
H
H
H
O
H OH
PO3 O
H R-O
O
H
O
O H
B
R-OH O
H
eredmény: lánchasadás
memo: ezért az RNS kevésbé, míg a DNS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek
DNS szilárdfázisú szintézise: észter kötés kialakítása (egy SN reakció foszfor centrumon) O
Védőcsoportok I: a bázisok védelme „permanens” csoportokkal Cél a primer aminok védelme, avagy a nukleofil csoportok álcázása, hogy a kapcsolásnál az 5’ OH legyen már csak az egyetlen Nu.
HN
A
C
N
N
N
N 6-benzoilezés
N
Rib
O
O HN
HN C
C
N4-benzoilezés
N4-acetilezés
N
N
C
CH3
vagy
O
N
Rib
O
NH
G
N
Rib
O N
O
N
N 2-izobutiril
C N
Rib
N H O H
CH3
N
T
nem kell védeni
O
N Rib
Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme „permanens” csoporttal B O H
H
H
O
H
H
N C O cianoetilészter formában
P
O B
O
O
CNE
H
Mindkét típusú permanens védőcsoport eltávolítható:
memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoportot vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható vizes NH3-val
H
H
O
H
H
Védőcsoport: az 5’-OH csoport „ideiglenes” védelme Dmtr MeO
OMe (enyhén savas rendszer)
CH2Cl2 +
B
O
O H H
H
O P O
O
3% CCl3-COOH
H
H H
H
H
O
H
N C O
N C O
B
HO
O
P O
MeO
narancs szín
OMe
O
H
Szilárd hordozó: CPG
(controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg -kémiailag inert -nem duzzad -amino funkcionalizált
„Linker”: O
Pl. borostyánkősav H2C
COOH
H2C
COOH
OMe CPG Si (CH2)n NH2 OMe
O C
H C O
N
OMe (CH2)n Si CPG OMe
NH3 / H2O hasító hely O
DNS szintézis:
-szilárdfázisú szintézis 3’-től 5’ irányba a „Caruthers”-módszer
Dmtr
O
memo: a bioszintézis iránya 5’-től 3’ irányba
B1 O H H
1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil)
O
H
O
H
H
C
H N
C O
OMe (CH2)n
Si CPG OMe
enyhe savas detritilezés (3% TCA)
H
O
B1 O H H
O
2. Aktiválás és kapcsolás
O C
H H
H
C O
H N
OMe (CH2)n
Si CPG OMe
memo: a bioszintézis iránya 5’-től 3’ irányba
2. Aktiválás és kapcsolás H
O
B1 O H H
O
H
C
O
Dmtr
H H
C O
O
H N
Si CPG
B2 H
CNE
(CH2)n
OMe
O foszforamidit
OMe
H
O
H
O P
MeCN
H
H
+
N
N tetrazol
N (gyenge sav) N
H
N SN (5' OH SN reakciója)
3. Lánczárás (az elreagálatlan 5’-OH-t acetilezzük)
Dmtr
O
B2 O H
4. Oxidálás I2 (H2O vagy THF) CNE
Ciklus végén NH4OH-val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás Legvégén: kromatográfiás tisztítás
O
H
H
O
H
H
P O O
B1 O H
O
H
H
O
H
C
H
C O
H N
OMe (CH2)n Si CPG OMe
Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr
O O
HO
B2
O
O DMTr
O
B3
O
O RO
B3
P
O O
RO P
O
B
O
O
1
O
B2
P RO
O
NiPr2
RO
tetrazol
O
P
B1
O O
O
CPG 1. lépés
O
Kapcsolás
CPG 1
2
3
B ,B ,B : védett bázisok
DMTr : tetrazol:
R: N C CH2 β-cianoetil
H
CH2
N
O
O
egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport CPG: "controlled pore glass" (porózus üveg)
N
dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport
H
N N
DMTr
O O
HO
B3
O O
O RO
P
O O
O
RO
B2
RO
O O
P
B1
O
RO
O O
Oxidáció
B2
O
HA
O 2. lépés
P O
O
I2
B3
P
B1
O O
O 3. lépés
CPG
Védõcsoport eltávolítása
O CPG
1., 2. és 3. lépés ismétlése NH4OH
szintetikus uligonukleotid
hasítás a szilárd hordozóról, a foszfát-észterek és a bázisok védõcsoportjainak egyidejû eltávolítása
Polimeráz láncreakció (PCR) egyszerű és hatékony módszer a DNS-molekulák számának növelésére
Ízelítő a nukleotidok és nukleozidok laboratóriumi szintéziséből: 1) Hilbert-Johnson-nukleozid szintézisből
O
-Bz:
C
benzoilcsoport
BSA: Si
O C
N
Si
N,O-bisz(trimetilszilil)acetamid nukleofil O- ill.N-atomok szililezõ reagense
2) Ribozilaminhoz kapcsolás
A reakció javasolt mechanizmusa: O BzO
NH
NH2
O
+
OBz
O
EtO
O
O
H N
EtO
N
OEt Rib
-etoxi-N -etoxikarbonil-akrilamid
O NH
limináció
NH
-EtOH
Rib
NH
-EtOH
EtO EtO
O
N
gyûrûzáródás
NH
Michael addíció
OBz
2,3,5-tri-O-benzoil-D-ribof uranózilamin
EtO
O
O
HO
N O OBz
OBz
benzoilcsoporttal védett uridin
O
Rib
O
Cl N
3) Szubsztituált purinszármazékok továbbalakítása:
HO
N
O
N
N N
R
H2 / Ni
H2S
NH2 N
N
OH
OH NH3
N
S H
N N
H N
N
R adenozin R: β-D-ribofuranozil
N N R
N N
4) Foszforilezés: dibenzil-foszfokloridáttal
H2C O P Cl H2C
Orvosi alkalmazások SH N
N
dibenzil-foszfokloridát
OH
O
N
N
H N
N H
6-merkapto-purin
Gyerekeknél akut leukémia kezelésére 80%-os gyógyulás
N
N H
N
N
OH H2N
N
allopurinol
N O
aciklovir
köszvény kezelésére
Herpes virus kezelésére 2 C-atom hiányzik a ribózból
A DNS replikációja A genetikai kód megkettőződése: A kettőshélix az egyik vége felől letekeredik, majd a templátok mentén kialakulnak a komplemnter szálak.
