A nitrogén-oxid szintáz enzim és a piridin dinukleotidok szerepének vizsgálata monoaminerg neurotoxinok által okozott károsodások kialakulásában

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

A nitrogén-oxid szintáz enzim és a piridin dinukleotidok szerepének vizsgálata monoaminerg neurotoxinok által okozott károsodások kialakulásában Doktori (PhD) értekezés

HALÁSZ ATTILA SÁNDOR Témavezető: Dr. Magyar Kálmán, DSc

Szigorlati Bizottság: Elnök: Dr. Gyires Klára, DSc Tagok: Dr. Nagy Zoltán, DSc Dr. Tóth Miklós, DSc Hivatalos Bírálók: Dr. Tímár Júlia, PhD Dr. Gáspár Róbert, PhD

Semmelweis Egyetem, Gyógyszerésztudományi Doktori Iskola Budapest, 2005.

It is a good morning exercise for a research scientist to discard a pet hypothesis every day before breakfast. It keeps him young. (Konrad Lorenz)

2

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke........................................................................................................ 5 Ábrák és táblázatok jegyzéke ........................................................................................... 7 Összefoglaló ..................................................................................................................... 9 Summary......................................................................................................................... 10 1. Bevezetés .................................................................................................................. 11 2. Irodalmi háttér .......................................................................................................... 13 2.1. A szelektív neurotoxinok feltételezett hatásmódja............................................. 13 2.2. A NOS enzim és az NO szerepe a neurodegenerációban................................... 20 2.3. A piridin dinukleotidok szerepe a neurotoxikus folyamatokban........................ 26 3. Célkitűzések ............................................................................................................. 29 4. Módszerek ................................................................................................................ 30 4.1. A vizsgálatok során felhasznált vegyületek........................................................ 30 4.2. A vizsgálatok során felhasznált állatok és kezelésük ......................................... 30 4.3. A NOS enzim aktivitásának meghatározása....................................................... 31 4.4. A striatum és a hippocampus redukált és oxidált piridin dinukleotid tartalmának meghatározása ................................................................................ 32 4.4.1. A minta-előkészítés folyamata .................................................................... 32 4.4.2. A HPLC-FD meghatározás körülményei..................................................... 33 4.5. A nNOS által termelt NADP+/NO arány meghatározása ................................... 34 4.6. A striatum dopamintartalmának meghatározása................................................. 35 4.7. Az eredmények statisztikai értékelése................................................................ 36 5. Eredmények .............................................................................................................. 37 5.1. A dopaminszint változása egerek striatumában a neurotoxinok (MPTP, METH) adását követően..................................................................................... 37 5.1.1. Az MPTP hatása az egér striatum dopaminszintjére ................................... 37 5.1.2. A METH hatása az egér striatum dopaminszintjére .................................... 38 5.2. Az egér agy NOS aktivitásának vizsgálata neurotoxinok adását követően........ 38 5.2.1. Az MPTP hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban 38 5.2.2. A METH hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban . 40 5.2.3. A DSP-4 hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban .. 41 5.3. A nNOS kapcsoltsági állapotának vizsgálata ..................................................... 42 5.4. Az egér agy redox státuszának vizsgálata neurotoxinok adását követően ......... 43 5.4.1. Az MPTP hatása a piridin dinukleotid szintekre egér striatumban és hippocampusban .......................................................................................... 43 5.4.1.1. Az MPTP egyszeri adásának hatása .................................................... 43 5.4.1.2. Az MPTP többszöri adásának hatása................................................... 44 5.4.2. A METH hatása a piridin dinukleotid szintekre egér striatumban és hippocampusban .......................................................................................... 46 5.4.2.1. A METH egyszeri adásának hatása ..................................................... 46 5.4.2.2. A METH többszöri adásának hatása ................................................... 49 6. Megbeszélés ............................................................................................................. 50 6.1. A NOS szerepe a neurotoxinok hatásában ......................................................... 50 6.1.1. A nNOS szerepe az MPTP neurotoxicitásában ........................................... 50 6.1.2. A nNOS szerepe a METH neurotoxicitásában ............................................ 53 6.1.3. A nNOS szerepe a DSP-4 neurotoxicitásában............................................. 55 6.2. A NOS kapcsoltsági állapotának vizsgálata – NADP+/NO arány...................... 56

3

6.3. Az agyi pridin dinukleotidok szerepe a neurotoxinok által kiváltott oxidatív károsodásban ...................................................................................................... 57 6.3.1. Az MPTP kezelés hatása a piridin dinukleotidok szintjére agyszövetben .. 59 6.3.2. A METH kezelés hatása a piridin dinukleotidok szintjére agyszövetben ... 59 7. Összefoglalás ............................................................................................................ 62 8. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................. 64 9. Saját közlemények jegyzéke..................................................................................... 65 10. Az értekezés témájában bemutatott saját előadások és poszterek ............................ 65 11. Irodalomjegyzék ....................................................................................................... 67

4

Rövidítések jegyzéke 3-NT 7-NI AIF AP-1 BH4 cGMP Cit CREB CuZnSOD DA DAT DHBA DOPA DOPAC DSP-4 eNOS GPX GR GSH GSSG iNOS L-[14C]-Arg L-Arg L-NNA LPS LTP MAO-B METH MnSOD MPP+ MPTP NA NAD+ NADH NADP+ NADPH NGF NHD+ NHDH NMDA nNOS NO NOS • O2– • OH

3-nitrotirozin 7-nitroindazol apoptózis indukáló faktor activator protein 1 (transzkripciós faktor) tetrahidro-biopterin ciklikus guanozin-monofoszfát citrullin cyclic AMP-responsive element binding protein (transzkripciós faktor) réz-cink szuperoxid diszmutáz (szolubilis) dopamin dopamin-transzporter dihidroxi-benzoesav 3,4-dihidroxifenilalanin 3,4-dihidroxifenilecetsav N-(2-kloroetil)-N-etil- 2-bromobenzil-amin endotheliális nitrogén-oxid szintáz glutation-proxidáz glutation reduktáz glutation oxidált gluthation indukálható nitrogén-oxid szintáz L-[14C]-arginin L-arginin Nω-nitro-L-arginin lipopoliszaccharid long-term potentiation monoamin-oxidáz B metamfetamin mangán szuperoxid diszmutáz (mitokondriális) 1-metil-4-fenil-2,3-dihidro-piridinium ion 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridin noradrenalin nikotinamid-adenin-dinukleotid, oxidált forma nikotinamid-adenin-dinukleotid, redukált forma nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát, oxidált forma nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát, redukált forma nerve growth factor, idegi növekedési faktor nikotinamid hipoxantin dinukleotid, oxidált forma nikotinamid hipoxantin dinukleotid, redukált forma N-metil-D-aszpartát neuronális nitrogén-oxid szintáz nitrogén-monoxid nitrogén-oxid szintáz szuperoxid anion hidroxil gyök

5

ONOO– PARP PC12 PTP RONS ROS sGC SOD VMAT

peroxinitrit anion poli-(ADP-ribóz)-polimeráz patkány pheocromocytoma sejtvonal permeability transition pore reaktív oxigén és nitrogén gyökök reaktív oxigén gyökök szolubilis guanilát-cikláz szuperoxid-diszmutáz vezikuláris monoamin transzport

6

Ábrák és táblázatok jegyzéke 1. ábra

Az MPTP toxikus metabolitja, az MPP+ kialakulása és neuronális akkumulációja ...........................................................................................14

2. ábra

Az MPP+ intraneuronális célpontjai .........................................................15

3. ábra

A METH intracelluláris célpontjai ............................................................18

4. ábra

A NOS által katalizált reakció és a szükséges kofaktorok ........................20

5. ábra

A reaktív oxigén és nitrogén gyökök képződésének fontosabb celluláris mechanizmusai és hatástalanításuk útjai....................................23

6. ábra

A NOS enzim teljesen kapcsolt (A) és csökkent L-Arg és BH4 mennyiség mellett részlegesen szétkapcsolt (B) állapota..........................24

7. ábra

Jellemző kromatogram az oxidált (A) és a redukált (B) piridin dinukleotidok elválasztására......................................................................34

8. ábra

A DA szintjének változása 4×20 mg/kg MPTP (●) és 4×5 mg/kg METH (○) i.p. adását követően egér striatumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 .......................37

9. ábra

A nNOS aktivitásának változása a 20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér sriatum homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 ......................38

10. ábra

A nNOS aktivitásának változása a 20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 ......................39

11. ábra

A nNOS aktivitásának változása a 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér striatum homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 ......................40

12. ábra

A nNOS aktivitásának változása a 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 ......................41

13. ábra

A nNOS aktivitásának változása a 50 mg/kg DSP-4 i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6 .........................................................42

14. ábra

A piridin dinukleotidok szintjének változása 40 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll.......................................................................................................44

7

15. ábra

A piridin dinukleotidok szintjének változása 4×20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll.......................................................................................................45

16. ábra

A piridin dinukleotidok szintjének változása 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll.......................................................................................................47

17. ábra

A piridin dinukleotidok szintjének változása 4×5 mg/kg METH 2 óránkénti i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll ..............................................................48

1. táblázat

A NOS három izoformájának szöveti előfordulása, és a termelt NO hatásai ........................................................................................................22

2. táblázat

Az L-Arg koncentráció változásának hatása a nNOS kapcsoltsági állapotára (átlag ± S.D.).............................................................................42

8

ÖSSZEFOGLALÓ Doktori (PhD) értekezés Készítette: Halász Attila Sándor Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézet Témavezető: Dr. Magyar Kálmán, akadémikus, egyetemi tanár A neurodegeneratív betegségek kialakulására vonatkozóan értékes információt szolgáltat a neurotoxikus vegyületek hatásmechanizmusának elemzése. Az 1-metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridin (MPTP) és a metamfetamin (METH) a dopamin-tartalmú idegsejteket károsítják, míg az N-(2-kloroetil)-N-etil-2-bromobenzil-amin (DSP-4) szelektív noradrenerg neuronkárosodást vált ki. Ezekkel a vegyületekkel végzett korábbi vizsgálatok felvetik annak a lehetőségét, hogy a reaktív nitrogén és oxigén gyökök fontos szerepet játszanak a neurotoxikus hatás kialakulásában. Vizsgálatainkban arra kerestünk választ, hogy a nitrogén-oxid szintáz (NOS) enzim aktivitásának megváltozása szerepet játszik-e a neurotoxikus hatás kialakulásában? Másrészt vizsgáltuk azt is, hogy a piridin dinukleotidok szintje megváltozik-e a neurotoxikus vegyületek adását követően, hozzájárulva ezzel a sejt normális redox állapotának megváltozásához, érzékennyé téve a sejtet a káros hatásokkal szemben. Megállapítottuk, hogy MPTP hatására a NOS aktivitása átmenetileg növekszik egér striatumban, míg a hippocampusban csökkent enzimaktivitást tapasztaltunk. Valószínűsíthető, hogy a növekedés a glutamát rendszer fokozott működésének következménye. METH adás hatására a NOS aktivitása mind egér striatumban, mind hippocampusban átmenetileg csökkent. Feltételezhető, hogy a METH hatására a NOS enzim működése szétkapcsolt állapotba kerül, így a NOS kevesebb nitrogén monoxid (NO) termelése mellett szuperoxid gyököt képez. DSP-4 kezelés hatására a NOS aktivitása nem változott meg egér striatumban és hippocampusban. Módszert dolgoztunk ki a piridin dinukleotidok szintjének biológiai mintából történő közvetlen meghatározására. A HPLC elválasztást követően fluoreszcens detektálást alkalmaztunk, a meghatározás során megállapítottuk, hogy a striatum NADH/NAD+ aránya növekedett egyszeri, nagy dózisban adott MPTP hatására. Ez a változás valószínűleg az MPTP mitokondriális complex I gátló hatásának tulajdonítható, és a striatalis neuronok redox állapotának oxidatív irányba történő eltolódását jelenti. Egyszeri, nagy dózisban adott METH hatására a striatalis és hippocampalis neuronok állapota redukált irányba tolódott el, amit a NADH/NAD+ arányának megnövekedése jelzett. Többszöri METH hatására csökkent a striatum és a hippocampus neuronjainak NADPH-tartalma, aminek oka a METH hatására bekövetkező fokozott oxidatív terhelés lehet.

9

SUMMARY PhD thesis Prepared by: Attila Sándor Halász Department of Pharmacodynamics, Semmelweis University, Budapest Supervisor: Prof. Kálmán Magyar, DSc The analysis of action of neurotoxic compounds plays a major role in the investigation of the development of neurodegenerative disorders. The 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydro-pyridine (MPTP) and the methamphetamine (METH) have detrimental effect on dopaminergic neurons, while N-(2-cloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzylamine (DSP4) impairs the norepinephrine containing neurons. The possible contribution of reactive oxygen and nitrogen species (RONS) to neurodegenerative processes came up after the investigations with these neurotoxins. The first aim of our study was to examine, whether altered nitric oxide synthase (NOS) enzyme activity can be involved in the damaging effect of these neurotoxins. We also investigated the change in the level of pyridine dinucleotids after the administration of neurotoxins to assess the shifting in the redox state of neurons. This shifting can sensitize the neurons against other harmful actions. According to our results, the activity of NOS was transiently increased in mouse striatum after administration of MPTP. The elevated glutamate transmission induced by MPTP administration could be responsible for this elevation. We observed transitional decrease of NOS activity in mouse hippocampus as well as in striatum after administration of METH, possibly due to uncoupled enzyme function of NOS. Superoxide anions besides lower level of NO can be produced by the uncoupled reaction of NOS enzyme. After administration of DSP-4 we could not observe any significant changes on NOS activity. We have developed a sensitive method for the measurement of oxidized and reduced pyridine nucleotides. We have found elevated NADH/NAD+ ratio in mouse striatum after administration of single dose of MPTP. The mitochondrial complex I blocking action of MPTP could be responsible for this shifting to the oxidative state of the neurons. After administration of a single dose of METH we have observed transitional shift in the pyridine nucleotide redox status of the cells towards a more reducing state. Multiple dose of METH administration caused a reduced level of NADPH content in mouse striatum and hippocampus possibly due to the oxidative challenge induced by METH.

10

BEVEZETÉS

1. Bevezetés Az elmúlt évszázadban a fejlett országok népességének öregedésével párhuzamosan a neurodegeneratív betegségek előtérbe kerülése figyelhető meg. A várható élettartam növekedésével egyre nagyobb számban fordulnak elő a Parkinson-kórban, Alzheimertípusú dementiában és egyéb idegi elemek károsodásával járó betegségekben szenvedők. Emellett a nem csak időseket érintő, és számos országban vezető halálokként szereplő stroke is komoly neuronális károsodásokat idézhet elő. Ezen kórképek előtérbe kerülése jelentősen előremozdította a gyógyítást, a progresszió megállítását vagy az esetleges prevenciót célzó kutatásokat. Szükség is van ezekre a vizsgálatokra, hiszen jelenlegi tudásunk szerint e betegségek etiológiája – a stroke és a Huntigton-kór kivételével – ismeretlen előttünk. Amíg a Huntigton-betegség tisztán öröklött génhibán alapszik, a többi betegség esetében inkább a sporadikus előfordulás a jellemző. További probléma, hogy bár a betegségek – ha nem is 100%-osan – tüneteik alapján felismerhetők, gyógyításukra – a Parkinson-kór tüneteit jelentősen enyhítő szerek kivételével – jelenleg nem áll rendelkezésünkre hatékony gyógyszer. A neuronok károsodásával járó kórképek nagy részében a végső elváltozás, hogy bizonyos fehérjék a sejtműködés szempontjából kedvezőtlen konformációba kerülnek, hibás térszerkezetet vesznek fel. Számos neurodegeneratív kórképben ugyanazon fehérjéket érintő elváltozások fordulnak elő (tau-fehérjék, α-synuclein), ezek a betegségek mégsem tekinthetők egységesnek, hiszen az egyes betegségek esetében specifikus agyrégiók, sőt, sejtcsoportok szenvednek pusztulást. Mivel a neurodegeneratív betegségek tüneteinek észlelésekor már nagyfokú neuronpusztulás áll fenn, nagy előrelépést jelenthetne a terápiában, ha időben felismerhetővé és korai stádiumában befolyásolhatóvá válnának ezek a betegségek. Amennyiben megismernénk, hogy milyen folyamatok vezetnek el a fehérjeaggregátumok kóros kialakulásához, akkor esetleg prevenciós beavatkozásra is lehetőségünk nyílna. Ezért a kutatások a neurodegeneráció folyamatának megismerésére és megértésére irányulnak. A neurodegeneratív betegségek vizsgálatának fontos eszközei az állatkísérletes modellek, amelyekben kémiai anyagok alkalmazásával hozhatók létre a betegségekhez hasonló állapotok. Számos vegyületet ismerünk, amelyek neuronkárosodást okoznak, de limitált azoknak a toxinoknak a száma, amelyek a humán idiopátiás kórhoz hasonló tüneteket produkálnak. Ezért fontos a kutatás számára az a néhány vegyület, amely szelektív

11

BEVEZETÉS

neuronkárosodást képes előidézni az agy bizonyos területein. A katekolaminerg neuronok szelektív károsodását okozza a 6-hidroxi-dopamin, de alkalmazását nehezíti, hogy intracerebrálisan kell alkalmazni, mert nem jut át a vér-agy gáton. Elsősorban a dopamin és a szerotonin rendszer károsodását okozza a metamfetamin (METH), de kisebb mértékben a noradrenerg rendszer működését is képes befolyásolni. Szelektívebb toxinok is a rendelkezésünkre állnak, az N-(2-kloroetil)-N-etil-2-bromobenzil-amin (DSP-4) toxikus hatása az agyi noradrenalin (NA) tartós depletálása, míg az 1-metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridin (MPTP) a dopaminerg neuronok pusztulását okozza.

12

IRODALMI HÁTTÉR

2. Irodalmi háttér 2.1. A szelektív neurotoxinok feltételezett hatásmódja Az MPTP idegrendszeri károsító hatását 1982-ben fedezték fel, amikor egy csoport kábítószer-élvező fiatal súlyos bradikynesiával és izomrigiditással – az idiopátiás Parkinson-kórra nagyon hasonlító tünetekkel – került kórházba. Kiderült, hogy a fiatalok egy szintetikusan előállított morfinszármazékot, meperidint fogyasztottak, ami MPTP-vel volt szennyezve. A Parkinson-kórhoz hasonló idegkárosodás akkor vált nyilvánvalóvá, amikor a betegek tünetei levodopa adására javultak. Az MPTP tehát a Parkinson-kórra jellemző tünetegyüttest képes létrehozni, mivel szelektíven a substantia nigrából kiinduló és a striatumba projektáló dopaminerg sejteket károsítja. A károsító hatás nem csak emberben jön létre, számos állatban, köztük kutyában, macskában, egérben [1] és majomban [2] is a dopamint (DA) szolgáltató rendszer károsodása következik be. Az autopsziás vizsgálatok eredményei szerint az alacsony dózisban adott MPTP kezelés hatására majmokban [3] és egerekben [4] a Parkinson-kórra jellemező neuronális elváltozások jönnek létre: a substantia nigra pars compacta részében nagyobb mértékű dopaminerg neuronpusztulás következik be, mint a ventrális tegmentum területén. A néhány nap alatt kialakuló tünetek is megegyeznek a késői Parkinson-kórra jellemző tünetekkel, létrejön a tremor, az izomrigiditás, a hypokinesia, és a tartási instabilitás [5]. Habár az MPTP által okozott kórkép meglehetősen hasonlít a Parkinsonkórra, egyetlen Parkinson-kóros betegből sem sikerült MPTP-t, vagy ahhoz hasonló szerkezetű vegyületet kimutatni. Ezen kívül az MPTP hatására a betegség hisztológiai jellemzője, a Lewy-testek képződése sem mutatható ki, és a dopaminerg neuronokon kívül a Parkinson-kórra jellemző locus ceruleusban jelentkező neuronkárosodás sem alakul ki [2]. Tehát az MPTP valószínűleg nem játszik szerepet az idiopátiás Parkinsonkór kialakulásában. Viszont a neurotoxin által okozott változások nagyon hasonlítanak a kórképben lezajló folyamatokhoz, így a Parkinson-kór állatkísérleti modelljének létrehozására ma a legalkalmasabb vegyületnek mutatkozik. Az MPTP hatásmódjának részletes megismeréséből nyert adatok lehetőséget adhatnak a Parkinson-kór patogenezisének feltárásához, és talán egy potenciális preventív terápia kidolgozásához. Az MPTP könnyen bejut az agyba, ahol a gliában található monoamino-oxidáz B (MAO-B) enzim 1-metil-4-fenil-2,3-dihidro-piridinium ionná alakítja, ami valószínűleg

13

IRODALMI HÁTTÉR

spontán oxidációval 1-metil-4-fenil-piridinium ionná (MPP+) alakul (1. ábra) [6]. A MAO-B enzim szelektív MAO-B

gátlása képes megakadályozni a toxikus metabolit kialakulását [7]. Az MPP+ az extracelluláris térbe kerül, jelenleg ismeretlen aktív mechanizmus segítségével. Mivel poláros, töltéssel rendelkező molekula, önmagában nem képes átjutni a sejtmembránon, a dopaminerg neuronokba az MPP+ a dopamin-transzporter (DAT)

N

+ N

CH3

CH3

MPTP

MPP+

segítségével kerül felvételre. Bár a szélesebb körű vizsgálatok azt mutatják, hogy nem csak a dopaminerg neuronok tudják akkumulálni az MPP+-t, hanem a noradrenalin és a szerotonin transzporter is a neuronokba tudja szállítani azt [8, 9], mégis a dopaminerg neuronok az igazán érzékenyek az MPTP káros hatásával szemben. Az MPP+ feldúsulhat a vezikulákban [10] és a mitokondriumban [11], de a citoszol – főleg negatív töltésű – enzimjeivel is kölcsönhatásba léphet [12]. A vezikulákba a

vezikuláris

monoamin

transzport

(VMAT) segítségével jut be [10]. Az MPTP-nek

erőteljes

DA-felszabadító

hatása van [13], a vezikulákból nagy mennyiségben kikerülő dopamin pedig oxidációs

folyamatokon

keresztül

metabolizálódik. A dopamin lebontása – melyet a MAO enzim végez – során hidrogén-peroxid (H2O2) képződik [14]. Az enzimatikus átalakítás mellett a dopamin a 1. ábra Az MPTP toxikus metabolitja, az MPP+ kialakulása és neuronális akkumulációja

molekuláris O2 hatására is oxidálódhat, szemi-ubikinonokat és •O2–-t képezve [15,

16]. Amíg a vezikulákban való felhalmozódás részben védi a sejtet a további károsodástól, addig a citoplazmában maradt molekulák a neuron számos struktúráját károsíthatják.

14

IRODALMI HÁTTÉR

Az MPP+-ról leírták, hogy a mitokondriumban a befelé irányuló aktív transzport révén feldúsul, ahol képes a légzési lánc complex I részét gátolni (2. ábra) [17], míg a légzési lánc többi tagjának aktivitását nem befolyásolja. Más kutatócsoport viszont azt találta, hogy idős egerekben a complex I mellett a complex III-at és IV-et is képes gátolni [18]. A

complex

rendszer

gátlása

megakadályozza

az

elektronok

áramlását

az

elektrontranszport láncon, ami végeredményben az ATP-termelés csökkenéséhez vezet. Az ATP képződés zavara fontos folyamatok működését veszélyeztetheti. Károsodik a Na/K-ATP-áz működése, ami az intracelluláris Ca2+ felhalmozódásához, proteázok aktivitásfokozódásához, és a neuron depolarizációjához vezet. A membránpotenciál pozitív irányba tolódása a Mg2+ NMDA receptoron érvényesülő blokádjának oldását okozhatja, ami az NMDA receptorok glutamát általi könnyebb aktiválását eredményezheti. Az így bekövetkező NMDA receptor aktivitás-fokozódás további Ca2+beáramlást eredményez, ami az NMDA receptorokhoz kapcsolt neuronális NOS (nNOS)

aktivitását

is

megnöveli. A

mitokondrium

légzési

láncának károsítása a citokróm c

mitokondriumból

való

kiáramlását is előidézi, ami egy, a mitokondrium külső membránján

átmenetileg

létrejött csatornán keresztül történik

(mitochondrial

2. ábra Az MPP+ intraneuronális célpontjai

permeability transition pore). Az MPP+-ről leírták, hogy ennek a csatornának a nyitását képes indukálni [19]. Az MPTP hatására a citoszolba kiáramló citokróm c az apoptózis aktiváló faktor 1-gyel és a kaszpáz 9-cel komplexet képez, ami a kaszpáz-9 aktiválását vonja maga után [20]. Az aktivált kaszpáz-9 már képes a prokaszpáz-3 hasítására, ezáltal aktivált kaszpáz-3 képződik, ami az apoptózis kaszkád folyamatainak beindulásához vezet [összefoglaló: 21]. Számos vizsgálat kimutatta, hogy az MPP+ hatására megnő az egér substantia nigrában a citokróm c tartalom valamint a kaszpáz-9 és kaszpáz-3 aktivitás. Ugyanez a munkacsoport arról is beszámolt, hogy a p35-transzgenikus egér fokozott rezisztenciát

15

IRODALMI HÁTTÉR

mutatott az MPTP-vel szemben [22]. A p35 a kaszpáz-1, kaszpáz-3, kaszpáz-6, kaszpáz-7, kaszpáz-8 és a kaszpáz-10 hatékony, irreverzibilis inhibítora [23]. Irodalmi adatok arról is beszámolnak, hogy az MPTP apoptózist képes indukálni in vitro is, számos sejtvonalon [összefoglaló: 24]. A légzési lánc normális funkciójának gátlása nem csak a sejt energiaháztartását veszélyezteti, hanem fokozott ROS-képződéssel is jár. NADH-függő módon nagy mennyiségű •O2– termelődik [25]. Önmagában a •O2– nem nagyon reaktív, direkt módon nem okoz súlyos sejtkárosodást. Viszont forrásául szolgálhat egyéb, a neuronok számára kifejezetten kártékony oxidatív gyök, mindenekelőtt a hidroxil gyök (•OH) képződésének. A •OH elsősorban a H2O2 és az átmeneti fémek között lezajló Fenton reakcióban keletkezik, amit a •O2– gyorsít, pl. azáltal, hogy a •O2– intracelluláris hatástalanítására hivatott enzim, a szuperoxid dizmutáz (SOD) a •O2–-ból H2O2-ot képez. Az MPTP-vel végzett vizsgálatok szerint a toxin in vivo •OH képződést képes indukálni [26]. A mitokondriumból felszabaduló •O2– egyéb reakcióban is részt vehet. A NOS által termelt nitrogén-monoxiddal (NO) peroxinitrit aniont (ONOO–) képez [27], aminek a képződési valószínűsége mindkét anyag jelenléte esetén nagy, mert a •O2– és a NO közötti reakció sebessége ötször nagyobb, mint a •O2– SOD által katalizált inaktivációja. Számos vizsgálat szolgáltat bizonyítékot a reaktív oxigén és nitrogén gyökök MPTP toxicitásban játszott lényeges szerepére. Azok a transzgenikus egerek, amelyek megnövekedett mennyiségben termelik a réz-cink szuperoxid diszmutáz (CuZnSOD) enzimet, és így nagyobb mennyiségű •O2– hatástalanítására képesek, ellenállóbbak az MPTP által kiváltott toxikus hatásokkal szemben [28]. A ONOO– az MPTP ártalmas hatásában való jelenlétére utal, hogy egerek toxinnal való kezelését követően emelkedett 3-nitrotirozin (3-NT) szintet találtak a striatumban [29]. A NOS enzim elsősorban neuronális izoformájára ható gátlószerével, a 7-nitroindazollal (7-NI) végzett előkezelésben csökkentette az MPTP hatására bekövetkező 3-NT szint emelkedést. A metamfetamin (METH) az amfetamin aminocsoporton metilezett származéka, annál potensebb központi idegrendszeri stimulatív hatással rendelkező, erős

pszichés

és

fizikai

függőséget okozó neurotoxikus vegyület. Kábítószerként való

NHCH3

(+)-METH

16

IRODALMI HÁTTÉR

alkalmazása

széles

körben

elterjedt,

a

fiatalok

körében

nagyon

kedvelt

pszichostimuláns. A METH hatásaihoz nagymértékű tolerancia alakul ki, nagy a pszichés dependencia-kapacitása, mind akut, mind krónikus használata számos veszélyt hordoz magában [30]. A METH használata során jelentősen nő a kardiovaszkuláris mellékhatások, a stroke kockázata, valamint megfigyelhető a magatartás markáns megváltozása és pszichózisos állapotok; hallucinációk, paranoia kialakulása. A METH eufóriát okozó hatását a központi idegrendszeri dopaminerg rendszer aktivitásának fokozásával éri el, növeli az extracelluláris dopamin mennyiségét, ez felelős az örömérzet kialakulásáért. Ugyanakkor hosszú távon maradandóan károsítja a központi idegrendszer monoaminerg pályáit. Állatkísérleti eredmények mutatják, hogy a METH befolyásolja a szerotonerg [31] és a noradrenerg [32] rendszer aktivitását, de a dopaminerg rendszert károsító hatása a legnagyobb mértékű [33]. A METH jobbra forgató módosulata, a (+)-METH toxikusabb a központi idegrendszer neuronjaira, mint a balra forgató enantiomer [33].

A METH-t krónikusan használó emberek

vizsgálatainak adatai is rendelkezésünkre állnak; a tirozin-hidroxiláz (TH) aktivitásának és a DA agyi szintjének drámai csökkenését figyelték meg [34]. Ez a hatás hetekig fennállt, és szelektíven a dopaminerg rendszer károsodása volt megfigyelhető. Később más munkacsoportok egyéb paraméterek vizsgálatát is elvégezték, így azt találták, hogy krónikus METH adagolás után majmokban a DAT funkciója is károsodik [35]. Ezek az eredmények igazolást nyertek később emberben is, amikor pozitron emissziós tomográfiás vizsgálatokkal kimutatták, hogy detoxikált, de a METH-t korábban krónikusan, nagy mennyiségben fogyasztók esetében a DAT aktivitása még 11 hónappal a használatot követően is csökkent volt, amihez motoros lassulás és memóriazavar is társult [36]. A DA mennyiségének, a DAT és a TH aktivitásának perzisztens csökkenését figyelték meg METH fogyasztók postmortem vizsgált agyszövetében is, ugyanakkor a VMAT és a DOPA-dekarboxiláz aktivitása nem mutatott változást, ami arra utal, hogy METH használata során nem sejthalál, hanem inkább valamilyen típusú axonális degeneráció következhet be [37]. A vizsgálatok során arra is fényt derítettek, hogy magának a dopaminnak is fontos szerepe van a METH által kiváltott toxikus hatásokban. Patkányokon végzett vizsgálat során a dopaminerg neuronok DA tartalmát α-metil-para-tirozinnal előkezelésben depletálva a többszöri METH-adás toxikus hatásai nem következtek be [38].

17

IRODALMI HÁTTÉR

A METH, hasonlóan az MPTP-hez, számos ponton támadja a neuronok működését, az általa okozott károsodások hosszú távúak, és eddigi ismereteink szerint a krónikus használat után kevéssé vagy egyáltalán nem térnek vissza a csökkent dopaminerg neuronfunkciók. A METH diffúzióval és a VMAT segítségével a vezikulákban és a mitokondriumban halmozódik fel (3. ábra). A striatum neuronjaiban csökkenti a tirozinhidroxiláz aktivitását [39], csökkenti a dopamin intraneuronális mennyiségét is [40], mert egyrészt az újonnan szintetizált transzmitter felszabadítását okozza, másrészt gátolja a transzmitter szinapszisból történő visszavételét [41]. A dopamin lebontásakor, amit a MAO enzim végez, toxikus reaktív gyökök keletkezhetnek, hasonlóan, mint a transzmitter autoxidációja során [14, 15]. A METH hatására bekövetkező dopaminfelszabadulás

következményes

felszabaduláshoz

vezet,

glutamát-

köszönhetően

a

kortiko-striato-hypothalamo-kortikális negatív feedbacknek [42]. A METH-nal végzett vizsgálatok során emelkedett glutamát szintet találtak

[43],

antagonistája, bizonyult

a

és az

az

NMDA

MK-801

METH

receptor

hatékonynak

toxocitásának

a

kivédésében [44]. A glutamát mennyiségének megnövekedése, 3. ábra A METH intracelluláris célpontjai

és

ezáltal

az

NMDA

receptorok aktivitásának fokozódása a Ca2+ intracelluláris mennyiségének növekedésével

az NMDA receptorhoz kapcsolt nNOS aktivitásának fokozódásával jár. A NO által mediált neurotoxicitás a reaktív oxigén és nitrogén gyökök (RONS) fokozott képződésének a következménye [45]. A METH a mitokondrium működését direkt és indirekt módon is károsítja. A pozitív töltésű METH bediffundál a mitokondriumba, majd ott a mátrixban felhalmozódik, az elektrontranszport lánc által létrehozott elektrokémiai grádiens pedig a felszaporodó pozítív töltések hatására megszűnik [46]. Az elektrontranszport lánc működése jelentős kárt szenved, és a mitokondriális membrán épsége sem megtartott. A mitokondriális károsodás a légzési láncból ROS-felszabadulást okoz, és emellett az átmeneti pórusokon

18

IRODALMI HÁTTÉR

keresztül citokróm c kiáramlása következik be. Ez kaszpázok aktiválásához, és apoptózis indukciójához vezet. A korábban ismertetett adatokkal ellentétben számos kutatócsoport a jutott METH-nal történt vizsgálatok során arra az eredményre, hogy a METH adását követően apoptózis-indukció történik. Többen sejtkultúrákban és állatkísérletes modellekben DNS lánctöréseket [47], proapoptotikus és antiapoptotikus faktorok megjelenését [48] mutatták ki METH-kezelést követően. Sejtkultúrán vizsgálva a citokróm c extramitokondriális mennyiségének megnövekedését, az oxigén felhasználás csökkenését, a kaszpáz-9 majd kaszpáz-3 aktiválását mutattak ki Dang és mtsai [49]. A METH neurotoxikus hatásai jelentősen csökkenthetők a reaktív gyökök képződésének gátlásával. A NO termelése transzgenikus egerekben kiiktatható, a nNOS enzimre hiányos egerek rezisztensek a METH neurotoxikus hatásaival szemben [50]. A CuZnSOD overexpresszált egerek, akárcsak az MPTP esetében [51] rezisztensek a METH neurotoxicitására [52]. Sokkal hatékonyabban védi ki a METH adagolás hatására bekövetkező idegkárosodást a szelén [53], ami a különböző oxidáló ágensek egyik leghatékonyabb scavengere. Képes hatástalanítani a két szabad elektront tartalmazó ONOO–-et, de az egy szabad elektronnal rendelkező, a ONOO– forrásának tekinthető NO és •O2– semlegesítésére is alkalmas.

N Br

C2H5

DSP-4

Cl

A DSP-4 szelektív noradrenerg neurotoxin, kifejezett toxicitást mutat rágcsálókban a locus ceruleusból a hippocampusba projektáló neuronok axonterminálisaira [54]. A DSP-4 átjut a vér-agy gáton, és az agyi noradrenalin szint

csökkenését idézi elő. A periférával szemben, ahol a DPS-4 által kiváltott NA-szint csökkenés után gyors regeneráció következik be, a központi idegrendszerben tartós NAdepléciót okoz. A legkifejezettebben a cortex, a cerebellum és a hippocampus NAszintjét befolyásolja, az egyéb agyterületeken előidézett neurotranszmitterszint-változás elhanyagolható. A DSP-4-ből spontán ciklizációval egy aziridium ion képződik, és ez a pozitív töltéssel rendelkező molekula képes a biomolekulák alkilálására [55]. A masszív, és hosszan tartó NA-depléció feltételezett oka, hogy a DSP-4 inaktiválja a noradrenerg neuronokban található dopamin-β-hidroxiláz enzimet, és meggátolja a noradrenalin axonterminálisba történő visszavételét is [56,57]. Emellett leírták, hogy

19

IRODALMI HÁTTÉR

alkalmazását követően kis mértékű csökkenés figyelhető meg a szerotonin agyi szintjében is [58]. Ezek a hatások kivédhetők tiol csoportot tartalmazó vegyületekkel, valamint az uptake rendszert blokkoló anyagokkal, mint amilyen az antidepresszáns dezipramin [59]. Feltételezések szerint a DSP-4 gátolja a mitokondriális oxidatív foszforilációt [60], valamint a MAO-B enzim működését is [61]. Korábban Gibson leírta, hogy a (-)-deprenyl kivédi a DSP-4 neurotoxikus hatását [62], amiért a vegyület szelektív MAO-B gátló hatását tette felelőssé. Egyéb, a (-)-deprenylnél erősebb MAO-B gátló szerek, pl. a MDL 72974 1,25 mg/kg-os dózisban adva viszont nem képes meggátolni a DSP-4 okozta hatásokat [63]. Annak ellenére nem protektív, hogy az MDL 72974 a fenti dózisban a deprenylhez teljesen hasonló MAO-B gátló profilt képes létrehozni. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatai szerint a (-)-deprenyl már 0,25 mg/kgos dózisban is képes befolyásolni a DSP-4 okozta toxicitást [64]. Valószínűsíthető, hogy a (-)deprenyl DSP-4-gyel szemben tapasztalt protektív hatásában a MAO-B gátló hatáson kívül egyéb faktorok is szerepet játszanak, mint pl. a (-)-deprenyl metabolitjainak uptake-gátló hatása. Emellett azt is kimutattuk, hogy a relatív szelektív nNOS gátló 7-NI-lal való előkezelés is képes csökkenteni a DSP-4-indukálta NAdepléciót [65]. A noradrenerg neuronokban gazdag locus ceruleus glutamaterg neuronokat is tartalmaz, a NA felszabadulást pedig a glutamaterg rendszer is befolyásolja [66]. A glutamát-felszabadulás megnövekedése, és így az NMDA receptorok aktiválása megnövekedett nNOS aktivitással járhat. Mindez felveti a lehetőségét annak, hogy a reaktív nitrogén gyökök szerepet játszhatnak a DSP-4 noradrenerg rendszert károsító hatásában. 2.2. A NOS enzim és az NO szerepe a neurodegenerációban A NO a szervezetünk múlt század végén felfedezett gáz típusú mediátora, képződését a test különböző szöveteiben elhelyezkedő, három izoformával rendelkező NOS enzim katalizálja. A NOS egy oxidoreduktáz (E.C. 1.14.13.39.), kétlépéses monooxigenáz reakciót katalizál, ahol a szubsztrát az L-arginin (L-Arg) [összefoglaló a NOS

4. ábra A NOS által katalizált reakció és a szükséges kofaktorok

20

IRODALMI HÁTTÉR

működéséről: 67]. D-argininnel a reakció nem megy végbe, és nem is gátolható. A NADPH és oxigén jelenlétében zajló reakcióban az NO mellett citrullin (Cit) és NADP+ keletkezik [4. ábra]. Az enzimnek három izoformája ismert, a nNOS-t az agyból izolálták, míg az endotheliális forma (eNOS) elsősorban az ér endothelsejtjeiben fordul elő. Mindkét forma konstitutíven van jelen a megfelelő szövetekben, működésüket jelentősen befolyásolja a Ca2+ jelenléte vagy hiánya. A fenti két izoformával ellentétben a harmadik, az indukálható forma (iNOS), működése nem függ Ca2+ jelenlététől, gyulladásos ingerek hatására expresszálódik főleg makrofágokban és a mikrogliában [68]. Mindhárom izoforma esetében igaz a megállapítás, hogy az enzim által termelt NO fiziológiás és patológiás szabályozó folyamatokban egyaránt részt vehet. A NO nem egy klasszikus

neurotranszmitter,

nem

tárolódik

vezikulákban,

és

hatásai

nem

membránreceptor-mediáltak. A NO kiválóan diffundál keresztül a membránokon, hatásait így a származási helyétől néhány száz mikrométerre is képes kiváltani [69]. A célsejtbe bediffundálva ott a szolubilis guanilát cikláz (sGC) enzim hem csoportjához kapcsolódva az enzim aktivitását megnöveli, az enzim által termelt ciklikus guanozinmonofoszfát (cGMP) mennyisége növekszik. A cGMP jelenlétében további jelátviteli utak is előtérbe kerülhetnek, pl. protein kinázok aktiválódhatnak. A sGC aktivitását és így a cGMP mennyiségét az exogén NO is növelni tudja. Az endothelium eredetű relaxáló faktorként (endothelium-derived relaxing factor, EDRF) megismert anyagról kiderült, hogy az eNOS által termelt NO-nak felel meg, amely fiziológiás hatásként a periférián az erek simaizmának elernyedését váltja ki, vazodilatációt okozva (1. táblázat). Csökkenti a thrombocyták aggregációját, és endothéliumhoz való kitapadását. Emellett a mikrovaszkuláris permeabilitás és integritás fenntartásában játszik fontos szerepet. Az iNOS és az általa szintetizált NO az immunrendszer fontos védekező eszköze. Eredendően a makrofágokban fedezték fel. Ezekben a sejtekben endotoxin, LPS és γ-interferon hatására de novo iNOS expresszió zajlik le. Ez nagy mennyiségű NO képződését eredményezi, ami hozzájárul a makrofágok baktériumok, gombák, vírusok, egyéb kórokozók és a tumorsejtek elleni citosztatikus/citotoxikus aktivitásához.

21

IRODALMI HÁTTÉR 1. táblázat A NOS három izoformájának szöveti előfordulása, és a termelt NO hatásai

szöveti elõfordulás

fiziológiás funkció

nNOS központi és perifériás idegrendszer izomszövet méhnyálkahártya macula densa neurotranszmisszió vese tubuláris-glomeruláris kapcsolat bélmotolitás szbályozása

iNOS makrofágok szív máj simaizom endothel antimikróbás hatás citotoxikus hatás gyulladás kialakulása szeptikus shock

endothel agy epithel

eNOS

vazorelaxáció csökkent thrombocyta aggregáció angiogenesis

Habár az NO-t az endothelium által termel anyagként ismertük meg, ma már tudjuk, hogy a legnagyobb mennyiségben az agyban keletkezik. Az elmúlt években számos adat gyűlt össze az irodalomban arról, hogy a NO-nak alapvető szerepet kell tulajdonítanunk a központi idegrendszerben. Neurotranszmitterként szerepet játszik a long term potentiation (LTP) kialakításában, amikor a hippocampusban retrográd messenger molekulaként működik közre a szinaptikus plaszticitás kialakításában. A NO a posztszinaptikus neuronokban szintetizálódik, és diffúzióval a preszinaptikus neuronhoz eljutva azon direkt hatást fejt ki; növeli a neurotranszmitter felszabadulását, erősítve ezzel a szinaptikus választ [70]. Ebben a folyamatban a legújabb irodalmi adatok szerint a nNOS és eNOS egyaránt részt vesz. A sem a nNOS-t, sem az eNOS-t nem expresszáló egerek memóriafunkciója jelentősen károsodott. Csak az egyik génre hiányos egerekben a funkció megtartott volt, tehát valószínű, hogy az egyik gén hiányát a másik NOS jelenléte kompenzálni képes [71]. Hasonlóan a mutáns egerekhez, a NOS inhibitorok alkalmazása is gátolni képes a tanulási folyamatokat egerekben [72], vagy patkányokban [73]. A NO neuromodulátorként a neurotranszmisszió szabályozásában vesz részt, mind in vitro [74], mind in vivo [75] képes a neurotranszmitterek felszabadulását megváltoztatni. A NO képes szabályozni a monoaminerg rendszerek neurotranszmisszióját [76], gátolja a dopamin, a noradrenalin és a szerotonin visszavételét is. Ezekben az esetekben a NO célpontja nem a sGC enzim, hanem direkt módon befolyásolja a monoaminerg transzporterek működését. A nNOS működésének 7-NI-lal történő gátlása potenciálja a noradrenalin dimethylphenylpiperaziniummal indukált felszabadulását egér hippocampus szeleteken [77]. Egér striatumának szeletein az elektromos stimulálás hatására létrejövő dopamin-felszabadulás csökken a NOS gátló L-NAME jelenlétében [78]. Ugyanakkor a NO az acetil-kolin neuronális felszabadulását serkenti [75]. Számos bizonyíték szolgál annak alátámasztására is, hogy a NO-nak

22

IRODALMI HÁTTÉR

döntő szerepe van az agyfejlődésben, ahol fontos tényezőkét szerepel a proliferatív állapotból a differenciált állapotba kerülésben. PC12 sejtkultúrán mutatták ki, hogy a proliferáció csökkenésével, és a neuron-szerű fenotípus kialakulásával egyidőben a nNOS megnövekedett expressziója és aktivitása figyelhető meg [79], a funkciómentes nNOS enzimet tartalmazó PC12 sejtekben a NGF proliferációt biztosító hatása pedig nem érvényesül [80]. A NO fiziológiás szerepének megismerésével együtt fény derült arra is, hogy számos neuronkárosodással járó kórkép vagy betegség kialakulásában lehet szerepe a NO-nak, illetve a belőle származó reaktív nitrogén gyököknek (5. ábra). Az ischaemiás állapotokban folytatott széleskörű vizsgálatok eredményei a NO kettős szerepére hívják fel a figyelmet; az, hogy az NO neuroprotektív vagy a neurodegeneratív hatása érvényesül-e, elsősorban attól függ, hogy melyik izoforma működéséből származik [81]. A leggyakoribb, dementiával járó kórkép az Alzheimer-kór, amely a β-amyloid fehérjék jelenlétével karakterizálható. Ezek a fehérjék in vitro a mikrogliában és az asztrocitákban a NO termelését stimulálják

[82],

ami

az

expresszió

növekedésén

iNOS

keresztül

valósul meg [83], míg a konstitutív izoformák aktivitását gátolni képesek [84].

A

modellvegyületével,

Parkinson-kór az

MPTP-vel

végzett vizsgálatok is a NOS e kórképben utalnak Huntigton

betöltött

fontosságára

[összefoglaló: betegség

[86]

85].

A

és

az

amyotrophiás lateral sclerosis [87, 88] esetében is előtérbe kerül a NOképződés megváltozásának patológiás

5. ábra A reaktív oxigén és nitrogén gyökök képződésének fontosabb celluláris mechanizmusai és hatástalanításuk útjai

fontossága. Számos faktor határozza meg azt, hogy a keletkezett NO kedvező vagy kedvezőtlen hatást produkál. A NO és az egyéb reaktív gyökök koncentrációja, az expozíció akut

23

IRODALMI HÁTTÉR

vagy

krónikus

volta,

a

potenciális célpontok jelenléte vagy

hiánya,

a

mechanizmusok

védő

aktivitása

mind döntő tényezők. A NO direkt

módon

módon,

a

és

indirekt

belőle

képződő

reaktív gyökök által is képes károsítani. A lipoxigenáz, a xantin-oxidáz, a ciklooxigenáz és

a

mitokondriális

elektrontranszport lánc •O2–-ot termel, de a •O2– a NOS enzim működéséből is származhat. Amennyiben

a

működéséhez

nem

rendelkezésre

NOS áll

elegendő

mennyiségű szubsztrát vagy a tetrahidro-biopterin 6. ábra A NOS enzim teljesen kapcsolt (A) és csökkent L-Arg és BH4 mennyiség mellett részlegesen szétkapcsolt (B) állapota

(BH4)

kofaktor, akkor ez a NOS enzim

működésének

úgynevezett szétkapcsolásához vezet (6. ábra). A szétkapcsolt NOS enzim esetében a NADPH kofaktor és a szubsztrát L-Arg közötti elektronáramlás megszakad, de a NADPH oxidációja tovább folyik. A NADPH által szolgáltatott elektron a molekuláris O2-re kerül, és •O2– képződik, ami a NO-dal gyors reakcióba léphet, ONOO–-et képezve [89]. A ONOO–, hasonlóan a NOhoz képes áthatolni a membránokon, és károsító hatását a képződés helyétől távolabb kifejteni. Irodalmi adatok szerint a NOS enzim minden mól L-Arg oxidációjához, és így 1 mól Cit képzéséhez 1,5 mól NADPH-t fogyaszt az enzim teljesen kapcsolt állapotában; tehát ideális esetben az enzimreakció során képződő NADP+/Cit aránya 1,5 [90]. Amennyiben ez az arány megnő, akkor az enzim több NADPH-t oxidál, mint ami

24

IRODALMI HÁTTÉR

a jelenlevő L-Arg átalakításához szükséges lenne, ebben az esetben tehát feltételezhető a szétkapcsolt enzimreakció megléte, és a •O2– képződése. A NO és a ONOO– számos változást idézhetnek elő a neuron több organellumán. A NO és a ONOO– oxidációs reakcióba léphetnek a tiol csoportokat tartalmazó lizin, metionin, hisztidin és kifejezetten a cisztein aminosavakkal, amikor a kén atomon történő nitrozilálás következik be [91]. Olyan fehérjék konformációja és/vagy aktivitása változhat meg ezáltal, mint pl. a protein kináz C [92], kaszpázok [93], glicerinaldehid-3foszfát-dehidrogenáz [94], de az NMDA receptor alegységei is nitrozilálódhatnak [95]. A nitrozilált kaszpáz aktivitása csökken, így az apoptózis ellenében hat, de a mátrix metalloproteinázok aktivitásának növelésével [96] az apoptózist elősegíti. Az oxidációs folyamatok mellett a NO és a ONOO– nitrálni képes a heterociklusos aminosavakat, a triptofánt, a guanint, és a fenolos tirozint. Megfigyelték, hogy a tirozin nitrálása káros, mert megváltoztatja a foszforilációs/defoszforilációs jelátviteli mechanizmusokat [97]. Nitrált

fehérjéket

mutattak

ki

idős

majmok

agyában

[98],

és

különböző

neurodegeneratív betegségekben is. Nitrotirozin jelenlétét fedezték fel az Alzheimerkórban [99], de a Parkinson-kórra jellemző Lewy-testekben is kimutatható volt [100]. ALS-ben mutatták ki, hogy a nitrált fehérjék jelenlétével egyidőben a nNOS és az eNOS expressziója is megnövekedett [101]. A ONOO– a fehérjék mellett a membránok lipidperoxidációját is képes aktiválni [102]. Ebben a reakcióban a foszfolipidek hidroperoxiddá történő oxidációja, majd aldehidek, főleg a meglehetősen reaktív 4hidroxi-nonenal képződése figyelhető meg. Ugyanakkor a NO maga képes gátolni is a lipidperoxidációs folyamatot azáltal, hogy scavengeli a OH•-t, ami a reakció valószínű elindítója [103]. Alzheimer-kórban a presenilin-1 fehérje patológiás mechanizmusában szerepet játszik a ONOO– által indukált lipidperoxidáció [104]. A neurodegeneratív kórképek patológiájában a mitokondrium károsodásának fontos szerepet tulajdonítanak. A reaktív nitrogén gyökök pedig nagymértékben károsítják a mitokondriumot. Maga a NO nanomoláris koncentrációban gátolja a citokróm c oxidázt. A gátlás reverzibilis, és az NO az enzim O2-kötő helyén fejti ki a gátló hatást [105]. A ONOO– viszont a mitokondriális légzési lánc irreverzibilis blokkolását okozza. A NOdal ellentétben nem gátolja a complex IV-et, de kötődik a complex I-hez, a complex IIhöz és a complex V-höz is. A ONOO– a mitokondrium membránján a permeability transition pore (PTP) nyitását is előidézheti, ami az apoptózis és a nekrózis

25

IRODALMI HÁTTÉR

folyamatában is szerepet játszik, mert a PTP-n keresztül Ca2+ és citokróm c kiáramlását okozza, valamint a mitokondrium duzzadásához és depolarizációhoz vezet [106]. Fontos tényező a patológiás folyamatokban, hogy a NO-ból képződő reaktív gyökök a DNS irreverzibilis károsodását idézhetik elő. A ONOO– egyfelől nitrálni, másfelől oxidálni képes a DNS-t, a DNS lánc törését okozza [107], a károsodott DNS javítására szolgáló poli-(ADP-ribóz)-polimeráz (PARP) enzim aktivitása fokozódik, és mivel az enzim a DNS hibáinak javításához nagy mennyiségű NAD-ot fogyaszt, végső soron az energiatermelő

folyamatok

elégtelenségéhez,

a

neuronokban

az

ATP

szint

csökkenéséhez, az energiaraktárak kiürüléséhez vezet [108]. A DNS ilyen sérüléseit számos kórképben megfigyelték; pl. ischaemiás agyban [109], Alzheimer-kórban [110]. Nemrégiben azt is sikerült kimutatni, hogy a mitokondriális DNS érzékenyebb a reaktív nitrogén gyökök által kiváltott károsodásokra, mint a celluláris DNS [111]. Végső soron a NO apoptotikus vagy nekrotikus sejthalált képes előidézni. Amennyiben a NO nagy mennyiségben termelődik, és sok reaktív gyök képzésére van lehetőség, a tipikus sejtkárosodások a mitokondrium duzzadása, az iongrádiensek sérülése, a plazmamembrán épségének sérülése; a sejt végül nekrózisban elpusztul. A nekrotikus halál kiváltásához szükséges koncentrációnál kisebb mennyiségű NO képződése is képes a sejt repair mechanizmusait károsítani, ebben az esetben viszont apoptotikus folyamatok indulnak el. A NO proapoptotikus, hiszen a PTP nyitásával a citokróm c és az apoptózis indukáló faktor (AIF) plazmába való áramlását okozza, beindítva ezzel a kaszpázok működését [106]. Kimutatták, hogy a NOS gátlása és a ONOO–-scavenger húgysav alkalmazása megvédte a PC12 sejteket a presenilin-1 által indukált apoptózistól, ami az NO Alzheimer-kór etiológiájában betöltött szerepére utalhat [112]. A NO emellett az ishaemiás attack következtében indukálódó apoptózis esetében is fontos lehet [113]. 2.3. A piridin dinukleotidok szerepe a neurotoxikus folyamatokban A piridin dinukleotidok az élő szervezetekben mindenütt nagy mennyiségben megtalálhatók, hiszen meghatározó szerepük van a katabolikus folyamatokban. A NAD és NADP redukált formái a szervezet antioxidáns rendszereivel szoros kapcsolatban

26

IRODALMI HÁTTÉR

vannak,

a

reaktív

gyökök

ártalmatlanításában

és

az

oxidált

biomolekulák

regenerálásában szerepet játszó enzimek számára biztosítják a redukáló kapacitást. A glutation (GSH) az első számú redukáló ágens, ami a sejtek oxidatív károsodásának kivédésére szolgál. A reaktív oxigén gyököket elimináló reakciók folyamán oxidált glutation (GSSG) keletkezik, a redukált formává történő visszaalakítást a glutation reduktáz (GR) enzim végzi. Az enzim működése NADPH jelenlétéhez kötött, a piridin dinukleotid mennyiségének csökkenése tehát a szervezet oxidáló ágensekkel szembeni védekező kapacitásának a károsodásához vezethet. Ugyanakkor a NAD és a NADP a szabadgyökök képződésében is szerepet játszik. A NADPH-oxidáz enzim szuperoxid gyök képződését katalizálja, fiziológiás körülmények között a fagocitáló sejtek baktericid kapacitását teremti meg. A NADPH-oxidázt azonosították a perifériás és a központi idegrendszerben is, fiziológiás hatásai mellett a vizsgálatok szerint az enzim által előállított •O2–-nak szerepe van neuronális sejtkultúrán vizsgált neurotoxikus folyamatokban [114], vagy egérben az ischaemiás stroke káros hatásának kialakulásában [115], de az MPTP toxikus hatásában is [116]. Több vizsgálat mutatott rá arra, hogy az Alzheimer-kór patológiájában is felfedezhetjük a NADPHoxidáz által termelt •O2–-ot. [117,118]. A NADPH-oxidáz mellett a •O2– képződését a már említett módon a NOS is katalizálhatja. Az általunk vizsgált neurotoxinoknak az energiatermelő folyamatokra és ezáltal a sejt védekező mechanizmusaira kifejtett károsító hatása hátterében a piridin dinukleotidok mennyiségének változása is állhat. Számos vizsgálat bizonyítja, a nicotaniamid, mint NAD+ prekurzor protektív hatását; kivédi a pszichostimuláns METH [119] és amfetamin [120] által indukált tartós dopamin depléciót és az ATP szint csökkenését, de gátolja a butilhidroperoxid [121], vagy az MPTP [122] adását követően tapasztalható apoptotózist is. Feltételezhető, hogy a nicotinamid azáltal véd, hogy megemeli a NAD+ és ezáltal az összes piridin dinukleotid szintjét. Alátámasztja ezt a feltételezést, hogy az MPTP és METH adását követően a PARP aktivitása jelentős mértékben megnövekszik, az enzim működéséhez pedig nagy mennyiségű NAD+-ra van szükség. A PARP fokozott aktivitását a neurotoxinok adását követő sejthalálért teszik felelőssé; a PARP gátló benzamid adása képes meggátolni az MPTP által okozott sejtpusztulást [123]. Tehát a neurotoxinok adását követően valószínűsíthető oxidatív stressz a neuronok redox státuszának megváltozását okozza. A sejtek redox státuszát több rendszer

27

IRODALMI HÁTTÉR

szabályozza, a glutation és a thioredoxin, mindkettő redukciós kapacitásának hátterét a NADP+/NADPH biztosítja [összefoglaló: 124]. A rendszer érintettségét tanulmányozó vizsgálatok többnyire a glutation szint neurotoxikus behatást követő megváltozását kísérik figyelemmel, ellentmondó eredményekkel. A piridin dinukleotidok szintjének mérése eddig nem valósult meg, annak ellenére, hogy a piridin dinukleotidok mennyisége és hozzáférhetősége nagyban befolyásolja az oxidált tiol komponensek redukcióját [125].

28

MÓDSZEREK

3. Célkitűzések Vizsgálataink során a neurotoxinok: MPTP, METH, DSP-4 neuronkárosító hatásában szerepet játszó mechanizmusok vizsgálatát tűztük ki célul. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ: 1. Szerepet játszik-e a NOS enzim aktivitásának megváltozása a neurotoxinok hatásának kialakulásában? 2. Ad-e felvilágosítást a NOS enzim kapcsoltsági állapotáról a reakcióban keletkező NADP+ és Cit aránya? 3. Megváltozik-e a sejtekben a piridin dinukleotidok mennyisége a neurotoxinok adását követően?

29

MÓDSZEREK

4. Módszerek 4.1. A vizsgálatok során felhasznált vegyületek Vizsgálatainkban a METH toxikusabb, jobbra forgató módosulatát, a (+)-METH-t használtuk, amelyet a Sanofi-Aventis (CHINOIN) Gyógyszergyár Rt. (Budapest, Magyarország) szintetizált és ingyen bocsátotta rendelkezésünkre, amiért köszönetünket fejezzük ki. Vizsgálataink során csak a METH jobbra forgató, (+) módosulatát használtuk, METH alatt a későbbiekben tehát mindig (+)-METH-t értünk. A citromsavat, a nátrium-dihidrogén-foszfátot, a hangyasavat, a metanolt, az acetonitrilt a Merck-től

(Darmstadt,

Németország),

az

acetofenont

a

Merck-Schuchardttól

(Hohenbrunn, Németország), az L-[14C]-Arg-t (>11 GBq/mmol, >300 mCi/mmol) az Amersham Biosciences Europe-tól (Freiburg, Németország) szereztük be. A HPLC tisztaságú desztillált-ioncserélt víz előállítására a Milli-Q Plus rendszert használtuk (Millipore, Bedford, MA, Amerikai Egyesült Államok). Minden egyéb vegyszer a Sigma-Aldrich-tól származott (St. Luis, MO, Amerikai Egyesült Államok). 4.2. A vizsgálatok során felhasznált állatok és kezelésük A vizsgálatok során használt állatok tartása és kezelése a Semmelweis Egyetem Állatvédelmi Szabályzatának megfelelően történt. Vizsgálatainkat hím, NMRI egereken végeztük (súly: 25-30g, TOXICOOP, Budapest, Magyarország). A kísérletekben felhasznált állatokat állandó hőmérsékleten, 22±2ºC-on tartottuk. Az egereket csoportokban tartottuk, egy csoport 5-7 állatból állt, minden csoport állat egy megfelelő méretű ketrecben lett elhelyezve. Az állatok vizet és rágcsálók etetésére alkalmas tápot ad libitum fogyaszthattak. A kísérletek minden esetben az állatok beérkezése után két nappal kezdődtek meg, az állatokat 10 napnál tovább nem tartottuk. A kísérletek során az egerek a vizsgálandó vegyületeket 10μl/10g (az állat tömegére vonatkoztatva) mennyiségű oldatban kapták intraperitoneálisan, az oldatok fiziológiás sóoldattal készültek. Minden oldat frissen készült, különös tekintettel a rövid bomlási idővel rendelkező DSP-4-re. A kontroll csoport állatait ugyanilyen mennyiségű fiziológiás sóoldattal kezeltük.

30

MÓDSZEREK

Az MPTP esetében az állatokat egyszer 40 mg/kg vagy négyszeri 20 mg/kg toxinnal kezeltük. METH esetében a kezelést egyszeri 7,5 mg/kg, vagy négyszeri 5 mg/kg dózissal végeztük. A DPS-4-ből az egerek egyszeri 50 mg/kg dózist kaptak. Minden kezelés után különböző időpontokban az állatokat dekapitáltuk, az egerek agyát azonnal jéghideg tálcára vettük ki, majd a megfelelő agyrészleteket (hippocampus, striatum cerebellum) azonnal szárazjégre helyeztük. A szárazjégen lefagyasztott szövetmintákat mélyfagyasztóba tettük, ahol ⎯80ºC-on tároltuk őket a felhasználás napjáig. A mintákat nem tároltuk hosszabb ideig, mint egy hónap. Méréseink szerint a minták NOS aktvitása egy hónap alatt nem változott. 4.3. A NOS enzim aktivitásának meghatározása A NOS enzimaktivitását Bredt és Snyder [126] módosított módszere alapján mértük. A módszer lényege: a NOS az L-[14C]-Arg-ből [14C]-Cit-t képez sztöchiometrikus módon, ami szcintillációs technikával mérhető. A mélyhűtőből kivett agyszöveteket azonnal 20 térfogategységnyi „A”-pufferbe (pH=7,4) téve homogenizáltuk (DZM-5, IKA-Tron, Németország), ami 50mM Tris-HCl-t, 1 mM EDTA-t, 20 mM L-valint, 10 mM aprotinint, 10 mM leupeptint tartalmazott. A homogenizátumot 20000g-n, 4ºC-on, 15 percig centrifugáltuk (EBA 12R, Hättich, Németroszág). A NOS enzim aktivitásának mérésére az inkubációs elegy az „A”-puffer volt, ami a fentieken kívül tartalmazott még 100μM NADPH-t, 2,25 mM CaCl2-ot, 2,4 mM L-Arg-t és 0,1 μCi L-[14C]-Arg-t. 100 μl inkubációs elegybe 25 μl felülúszót mértünk, és 30 percen keresztül 25ºC-on inkubáltuk. A reakciót 500 μl DOWEX 50WX-8-400 kationcserélő gyanta:víz 1:1 arányú elegye (pH<7,0) és 800 μl 1 mM EDTA és 1 mM EGTA tartalmú 50 mM-os HEPES puffer (pH=5,5) hozzáadásával állítottuk le, majd az elegyet újra centrifugáltuk 20000g-n, 4ºC-on, 5 percig. A felülúszó 800 μl-ét 5 ml UltimaGold szcintillációs folyadékhoz (Packard Biosciences, Groningen, Hollandia) mértük, és vortexelés után Beckman LS 5000 TA (Fullerton, CA, Amerikai Egyesült Államok) folyadékszcintillációs számlálóval mértük. Az enzimreakcióban képződött, és általunk mért [14C]-Cit mennyiségéből az L-Arg/L-[14C]-Arg arány felhasználásával a teljes Cittermelés számolható. A képződött Cit mennyisége az enzim által képzett NO mennyiségével

sztöchiometrikusan

megegyezik.

Az

enzimaktivitás-értékeket

a

31

MÓDSZEREK

reakcióelegy fehérjetartalmára és időegységre vonatkoztatva adjuk meg. Az elegyek fehérjetartalmát Lowry és mtsai módszerével [127] határoztuk meg. A NOS aktivitásának kontroll értékei: 22,34±1,39 pmol/perc/mg fehérje a hippocampusban és 30,85±2,05 pmol/perc/mg fehérje a striatumban. 4.4. A striatum és a hippocampus redukált és oxidált piridin dinukleotid tartalmának meghatározása A hippocampus és a striatum koenzimtartalmának meghatározását HPLC elválasztáshoz kapcsolt fluoreszcens detektálással valósítottuk meg. Míg a redukált koenzimek saját fluoreszcens aktivitással rendelkeznek, addig az oxidált piridin dinukleotidok ketonos származékképzéssel tehetők fluoreszcensen aktívvá, és így mérhetővé. Az oxidált és redukált koenzimek ezenkívül különböző stabilitást mutatnak savas, illetve bázikus közegben. Ezen okok miatt az oxidált és a redukált koenzimek meghatározására két különböző módszert dolgoztunk ki. Az oxidált koenzimeket a jobb, a redukált koenzimeket a bal hippocampusból illetve striatumból határoztuk meg. Előzetes méréseink szerint sem az oxidált, sem a redukált koenzimek mennyiségében nincs különbség a jobb és bal szervrészek között. 4.4.1. A minta-előkészítés folyamata Az oxidált piridin dinukleotidok meghatározásához az általunk korábban kidolgozott módszert [128] használtuk fel, kisebb módosításokkal. Mivel az oxidált piridin dinukleotidok savas közegben stabilak, a minta-előkészítéshez a striatumokat 500 μl 0,25 M-os perklórsavban homogenizáltuk, amely tartalmazott 0,1 M EDTA-t, 5 μM NHD+-t, mint a piridin dinukleotid meghatározás belső standardja, és 0,5 μM dihidroxibenzoesavat (DHBA), mint a dopamintartalom meghatározás belső standardja. A homogenizátumokat 15 percig centrifugáltuk (20000g, 4ºC), és a felülúszó 25μl-ét használtuk az oxidált piridin dinukleotidok HPLC analízisére, míg ugyanezen felülúszó 50 μl-éből a dopamin-koncentrációt határoztuk meg. Az oxidált piridin dinukleotidok fluoreszcenciáját előidéző ketonos derivatizáció elvégzéséhez a 25 μl felülúszóhoz 75 μl 100 mM-os acetofenont (metanolban), és 150 μl 6M-os NaOH-ot tettünk, majd a 10

32

MÓDSZEREK

perc reakcióidő után a stabil fluoreszcens termék kialakításához 75 μl tömény hangyasavat adtunk a reakcióelegyhez 15 percre. Az idő letelte után a reakcióelegyet 3 percre 90ºC fölé melegítettük, majd azonnal hűtöttük jégbe helyezve a kémcsöveket. Méréseink szerint az így előállított fluoreszcens terméket tartalmazó minták ⎯20ºC-on tárolva legalább egy hétig stabilak maradnak. A redukált piridin koenzimek – szemben az oxidáltakkal – lúgos közegben stabilak [129]. A bal hippocampusok és striatumok homogenizálása ennek megfelelően 400 μl 0,5M-os NaOH-ban történt, ami belső standardként 4 μM NHDH-t tartalmazott. A mintákat 90ºC fölé melegítettük, hogy az oxidált koenzimek elbomoljanak, hogy csak a redukált koenzimmennyiséget mérhessük. A három percig tartó melegítést követően a homogenizátumokat azonnal 0ºC-ra hűtöttük. A minta fehérje- és lipidmentesítését 1,5 térfogatnyi kloroformmal való kirázással értük el. A kloroformos elegyet 20000g-n centrifugáltuk (4ºC, 10 perc), majd a hatékonyság növelése érdekében a vizes fázissal a fenti kirázási folyamatot megismételtük. A felülúszót eltávolítottuk, és ⎯20ºC-on tároltuk a mérésig. Vizsgálataink szerint az így tárolt minták legalább 6 órán keresztül stabilak. Az analízis napján a tárolt mintákat kétszeres térfogatú 0,1 M-os citromsav oldattal hígítottuk, hogy a minta pH-ja 6-7 körül legyen a megfelelő mintastabilitás érdekében. 4.4.2. A HPLC-FD meghatározás körülményei A piridin dinukleotidok minta-előkészítéséhez hasonlóan HPLC meghatározásukhoz is két rendszerre volt szükségünk. Az injektált mintatérfogat mind a két esetben 50 μl volt, az elválasztásra pedig egy PU-1580 HPLC pumpából (Jasco, Tokyo, Japan) és egy FP920 fluoreszcens detektorból (Jasco, Tokyo, Japan) álló rendszert használtunk. Az oxidált piridin koenzimek elválasztását egy Zorbax SB-CN oszlopon (4,6 mm × 250 mm × 5 μm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, Amerikai Egyesült Államok) valósítottuk meg. Az izokratikus elválasztásra 0,1M-os citromsav (pH=3,0)/acetonitril (92,5/7,5, v/v) elegyét használtuk mobil fázisnak, amit 1,2 ml/perc sebességgel áramoltattunk. A fluoreszcens detektáláshoz 380 nm-es gerjesztési, és 440 nm-es emissziós hullámhosszt használtunk. A 7. ábra egy jellemző kromatogramot ábrázol az

33

MÓDSZEREK

oxidált (A) (NADP+, NHD+ (belső standard), NAD+) és a redukált (B) piridin dinukleotidok (NADPH, NHDH, NADH) elválasztásával. A

redukált

koenzimeket

Supelcosil

ABZ+PLUS

oszlopon

választottuk

el,

előtétoszlopként Abl&e Jasco (Budapest, Magyarország) oszlopot használtunk. A mobil fázis 0,1M-os citromsav/acetonitril (97,5/2,5, v/v) elegye volt, az oldat pH-ját pedig 6,0ra állítottuk be, ami biztosította az elválasztandó komponensek stabilitását. A mobil fázis áramlási sebessége 0,75 ml/perc volt. A fluoreszcens detektort 340 nm-es extinkciós és 450 nm-es emissziós hullámhosszra állítottuk be.

A

B Fluoreszcencia intenzitás

Fluoreszcencia intenzitás

NADP+

NAD+ NHD+

0

1

2

3

4

5

6

7

8

NADH

NHDH

NADPH

0

1

2

3

Idő (perc)

4

5

6

7

8

Idő (perc)

7. ábra Jellemző kromatogram az oxidált (A) és a redukált (B) piridin dinukleotidok elválasztására.

4.5. A nNOS által termelt NADP+/NO arány meghatározása A nNOS kapcsoltsági állapotának meghatározására az enzim által termelt oxidált piridin dinukleotid, a NADP+ mennyiség mérését alkalmaztuk, ami az enzim által felhasznált NADPH mennyiségnek felel meg. A specifikusan nNOS által képzett NADP+ mennyiséget két mérésből határoztuk meg. Első lépésben a nNOS aktivitásának mérése során meghatároztuk a keletkezett teljes NADP+ mennyiséget. A második lépésben az

34

MÓDSZEREK

irreverzibilis NOS gátlószer L-NNA jelenlétében mértük a keletkező NADP+ mennyiségét. Az első és a második mérés különbsége adja a specifikusan nNOS által képzett NADP+-t. Ez a szövethomogenizátum teljes NADP+ termelésének 5-15%-át adja, ami mérőmódszerünkkel jól detektálható. Az enzimreakciót 0,1N perklórsavval állítottuk le, mert ennek hatására az enzim aktivitása megszűnik, és a reakcióelegyben még jelenlévő maradék NADPH is elbomlik. A reakció során esetleges nem enzimatikus hatásra keletkező, vagy a savas közegben a NADPH bomlástermékeként megjelenő NADP+ mennyiségét is meghatároztuk. Szövethomogenizátum-mentes közegben is meghatároztuk a NADP+ mennyiséget a reakció elején és 30 perces inkubáció után. Méréseink szerint a NADP+-mennyiség a reakció kezdetekor 1,0±0,5%, az inkubáció után 1,2±0,5% volt. Ha NADPH-t nem tettünk a reakcióelegybe, akkor a NADP+ mennyisége a detektálási határ alatt volt. Tehát a nem enzimatikus NADPH oxidáció mértéke a NADPH mennyiségének 1%-át érinti. Ez az oxidáció bekövetkezhet a reakcióelegy O2 tartalmának vagy a perklórsavnak köszönhetően. A striatumban mérhető teljes NADP+ mennyiség nagyobb volt, mint a hippocampusban mérhető, de a specifikusan a nNOS által termelt NADP+ mennyiségek között nem volt szignifikáns eltérés. Az enzim által katalizált reakcióban képződő NADP+ és Cit arányát állapítottuk meg, ami a nNOS által katalizált oxidációs reakció kapcsoltsági állapotáról ad információt. Az irodalomban fellelhető eredmények szerint több munkacsoport 1,5 körüli értéket határozott meg az enzim kapcsolt működése esetén [90, 130]. 4.6. A striatum dopamintartalmának meghatározása A

dopamin

elválasztására

fordított

fázisú,

ionpár-képzésen

alapuló

folyadékkromatográfiás módszert használtunk, elektrokémiai detektálással kombinálva. Az oxidált piridin dinukleotidok minta-előkészítése során nyert felülúszó 50 μl-ét injektáltuk közvetlenül a HPLC rendszerbe. Az elválasztó rendszer egy PU-1580 HPLC pumpából (Jasco, Tokyo, Japan), és egy DECADE VT-03 elektrokémia detektorból (Antec Leyden, Zoeterwoude, The Netherlands) állt. Az elválasztás egy Supelcosil LC18-DB (4,6 mm × 150 mm × 3 μm) (Sigma-Aldrich, St. Luis, MO, Amerikai Egyesült Államok) oszlopon történt, egy Abl&eJasco (Budapest, Magyarország) előtétoszlop

35

MÓDSZEREK

közbeiktatásával, eluensként 0,1 M nátrium-dihidrogén foszfát, 20 mg/ml EDTA, 3 mM nátrium-oktánszulfonsav és 10 % (v/v) metanol tartalmú, 3,7-es pH-jú oldatot alkalmaztunk. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt, a detektálási potenciál +0,7V volt, grafit elektródot használtunk, Ag/AgCl referencia elektróddal. A kontroll striatum dopamintartalma 59,88±2,97 pmol/mg volt. 4.7. Az eredmények statisztikai értékelése Az eredmények átlag ± szórás (S.D.) formában vannak kifejezve. Az adatok analízisére a STATISTICA 6.0 szoftvert használtuk, egyutas varianciaanalízist végeztünk, a szignifikáns eltéréseket LSD post-hoc teszttel állapítottuk meg. Az eltérések minden esetben a kontroll csoporthoz viszonyítva értendők, a szignifikanciaszintet p < 0,05-nél állapítottuk meg.

36

EREDMÉNYEK

5. Eredmények 5.1. A dopaminszint változása egerek striatumában a neurotoxinok (MPTP, METH) adását követően Vizsgálatainkban többszöri dózisban adagoltuk a neurotoxinokat az egér striatum dopamintartalmára gyakorolt hatásuk igazolására.

DA tartalom (a kontroll %-ában)

120 110 100

*

**

90

**

80 70 60 50

**

40 30

*

**

20 0

1

2

3

4

5

6

7

Kezelést követően eltelt idő (nap) 8. ábra A DA szintjének változása 4×20 mg/kg MPTP (●) és 4×5 mg/kg METH (○) i.p. adását követően egér striatumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01

5.1.1. Az MPTP hatása az egér striatum dopaminszintjére Akut (4×20 mg/kg, 2 óránként) MPTP kezelés hatására 1 héten belül az egér striatum dopamintartalmának folyamatos csökkenését tapasztaltuk [8. ábra]. Egy nappal a kezelést követően a striatum dopamintartalma már a kontroll 89,2±11,62%-a volt, egy héttel a kezelés után a kontroll szint 76,2±18,91%-ára csökkent.

37

EREDMÉNYEK

5.1.2. A METH hatása az egér striatum dopaminszintjére Akut METH kezelés (4x5mg/kg, 2 óránként) után az egér striatumában a dopaminszint folyamatos csökkenést mutatott [8. ábra]. 1 nappal a kezelés után a kontroll szint 65,2±13,64%-át mértük. Három nappal a kezelés után tovább csökkent a striatum dopamin tartalma, ami még egy héttel a kezelést követően is szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll egerek esetében (68,0±28,9%). 5.2. Az egér agy NOS aktivitásának vizsgálata neurotoxinok adását követően 5.2.1. Az MPTP hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban Egyszeri 20 mg/kg MPTP kezelést követően szignifikánsan növekedett NOS aktivitás volt mérhető egér striatumában [9. ábra]. A kezelést követő 4 óra múlva már a kontroll érték 124,2±7,0%-át mértük. Az enzimaktivitás megnövekedése hat órával a kezelést követően érte el a maximális értéket. Ekkor a kontroll érték 151,7±2,6%-a volt az

NOS aktivitás (a kontroll %-ában)

enzimaktivitás.

160

**

140

**

*

120 100 80 60 40 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 24

Kezelést követően eltelt idő (óra) 9. ábra A nNOS aktivitásának változása a 20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér sriatum homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01

38

EREDMÉNYEK

12 órával az MPTP adása után még mindig szignifikánsan emelkedett, 139±5,7%-os NOS aktivitást mértünk, ami egy nap elteltével már nem különbözött szignifikánsan a kontroll értékektől. Megvizsgáltuk az aktivitás-növekedés Ca2+-függőségét. A megnövekedett NOS aktivitás csak Ca2+ jelenlétében következett be, Ca2+-mentes közegben nem volt mérhető NOS aktivitás (nem ábrázolt adat). Az MPTP 20 mg/kg-os egyszeri adása után a hippocampusban a striatumban tapasztaltakkal ellentétben az enzimaktivitás szignifikáns csökkenését tapasztaltuk [10. ábra]. Már 20 perccel a kezelést követően a NOS aktivitás a kontroll érték 73,9±5,5%-a volt. A maximális csökkenést 1 órával a kezelés után találtuk, ami a kontroll érték 69,1±5,1% volt, de még négy óra múltán is szignifikánsan alacsonyabb volt az enzim aktivitása, mint a kontroll csoport esetében. Hat órával az adagolás után a mért aktivitás visszatért a kontroll szintre, és későbbi időpontokban sem tapasztaltunk eltérést a kontroll értékekhez képest.

NOS aktivitás (a kontroll %-ában)

110 100

**

90

**

80 70

*

* **

60 50 40 0

1

2

3

4

5

6

Kezelést követően eltelt idő (óra) 10. ábra A nNOS aktivitásának változása a 20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01

39

EREDMÉNYEK

5.2.2. A METH hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban A 7,5 mg/kg intraperitoneálisan adott METH adása után szignifikánsan csökkent NOS aktivitást mértünk mind az egér striatumában [11. ábra], mind a hippocampusban [12. ábra]. A két agyrészletben hasonló volt a NOS aktivitás időbeli lefutása. 45 perccel a kezelés után már szignifikáns volt a csökkenés, a striatumban a kontroll érték 86,5±3,4%-át, a hippocampusban 77,6±2,9%-át találtuk.

NOS aktivitás (a kontroll %-ában)

110 100

** **

90 80

*

** **

70 60 50 40 0

1

2

3

4

5

6 12 18 24

Kezelést követően eltelt idő (óra) 11. ábra A nNOS aktivitásának változása a 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér striatum homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01

2 órával a kezelés után tapasztaltuk mindkét agyrészletben a maximális hatást, a striatumban 67,1±7,7%, a hippocampusban 53,5±4,4% volt a NOS kontrollhoz viszonyított aktivitása. Az enzimaktivitás ezután növekedett mindkét agyrészlet esetén, a hippocampusban még szignifikáns változás volt mérhető 6 órával a kezelés után is, a striatumban viszont magasabb, a kontrollhoz képest már nem szignifikáns eltérést találtunk. 18-24 órával a kezelést követően a NOS aktivitások a kontroll szintektől szignifikánsan nem tértek el.

40

EREDMÉNYEK

NOS aktivitás (a kontroll %-ában)

110 100

** **

90 80

**

**

**

70 60

**

50 40 0

1

2

3

4

5

6 12 18 24

Kezelést követően eltelt idő (óra) 12. ábra A nNOS aktivitásának változása a 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01

5.2.3. A DSP-4 hatása a NOS aktivitásra egér striatumban és hippocampusban A DSP-4 kezelést követően a hippocampusban mérhető, NOS aktivitás-változásokat vizsgáltuk [13. ábra]. A kezelést követően egy hétig követtük a nNOS aktivitását, de eredményeink szerint kisebb eltérésektől eltekintve nem változott meg szignifikánsan a DSP-4 kezelés hatására.

41

EREDMÉNYEK

NOS aktivitás (a kontroll %-ában)

120 110 100 90 80 70 60 50 40 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 24

168

Kezelést követően eltelt idő (óra) 13. ábra A nNOS aktivitásának változása a 50 mg/kg DSP-4 i.p. adását követően egér hippocampus homogenizátumában. Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.E.M., n=6

5.3. A nNOS kapcsoltsági állapotának vizsgálata Három különböző L-Arg koncentrációt alkalmazva határoztuk meg a nNOS által termelt NADP+ és Cit arányát: 24 μM (telítési szubsztrát-koncentráció), 2,4 μM (féltelítési szubsztrát-koncentráció) és 0,16 μM (a [14C]-L-Arg mennyisége) [2. táblázat]. Telítési szubsztrát-koncentráció esetén a NADP+/Cit arányt 1,63-nak találtuk 5mind a hippocampusban, mind a striatumban. 2. táblázat Az L-Arg koncentráció változásának hatása a nNOS kapcsoltsági állapotára (átlag ± S.D.)

szövet

n

[L-Arg] (μM)

[NADP+] (μM)

[Cit] (μM)

NADP+/Cit

hippocampus

8

24

0,76 ± 0,13

0,47 ± 0,07

1,63 ± 0,18

10

2,4

0,86 ± 0,19

0,18 ± 0,04

4,67 ± 0,40

6

0,16

0,99 ± 0,05

0,03 ± 0,01

32,0 ± 3,40

5

24

0,72 ± 0,16

0,44 ± 0,10

1,63 ± 0,19

8

2,4

0,73 ± 0,21

0,16 ± 0,04

4,57 ± 0,39

4

0,16

0,97 ± 0,13

0,03 ± 0,00

30,2 ± 2,70

striatum

42

EREDMÉNYEK

Alacsonyabb (2,4 μM) L-Arg koncentráció esetén ez az arány a hippocampus esetében 4,67-re, a striatum esetében 4,57-re növekedett. Nagyon kis koncentrációban (0,16 μM) jelenlévő L-Arg esetében az arány tovább nőtt 32,0-re és 30,2-re. 5.4. Az egér agy redox státuszának vizsgálata neurotoxinok adását követően 5.4.1. Az MPTP hatása a piridin dinukleotid szintekre egér striatumban és hippocampusban 5.4.1.1. Az MPTP egyszeri adásának hatása Egyszeri 40 mg/kg-os MPTP adását követően a NAD+ és a NADH mennyisége változott szignifikánsan [14. ábra, D, E]. A striatumban a NADH koncentráció szignifikáns növekedése volt mérhető a neurotoxin adását követően már 20 perc múlva, az emelkedés egy óra múlva volt szignifikáns (133,1±9,4%). Másfél órával az MPTP injekció után a NADH koncentráció a kontroll értékre tért vissza. A striatumban a NAD+ mennyisége csökkent 120 perccel a toxin adását követően, amikor a kontroll érték 82,7±2,8%-a volt. Az egyidejű NAD+-csökkenésnek és NADH-növekedésnek köszönhetően a NADH/NAD+ arány szignifikánsan emelkedett [14. ábra, F]. A hippocampusban a NAD+ szintje a hippocampusban 40 perccel az MPTP adását követően mutatott egy átmenti, szignifikáns csökkenést. A NADP+ és a NADPH szintje nem változott meg egyik agyterületen sem az MPTP adása után.

43

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

A

0

20

40

60

80

100

120

NADH (a kontroll százalékában)

NADPH (a kontroll százalékában)

EREDMÉNYEK

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

D

0

**

**

20

40

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

+

B

0

20

40

60

80

100

120

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

+

+

NADPH/NADP

NADH/NAD 20

40

60

80

100

120

†

0

20

40

* 60

80

100

120

idő (perc)

C

0

80

E

idő (perc) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

60

idő (perc) NAD (a kontroll százalékában)

+

NADP (a kontroll százalékában)

idő (perc)

**

100

120

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

F

0

idő (perc)

**

20

40

**

*

60

80

100

120

idő (perc)

14. ábra A piridin dinukleotidok szintjének változása 40 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll

5.4.1.2. Az MPTP többszöri adásának hatása A 4×20 mg/kg MPTP adását követően a piridin dinukleotidok mennyisége lényegesen nem változott, csupán a NADP+ szint csökkent egér striatumban a negyedik 20 mg/kg MPTP dózis adását követően 2 és 12 óra között [15. ábra, B]. A kontroll érték 71,0±12,4%-ának megfelelő maximális csökkenést 4 órával a toxin adását követően

44

EREDMÉNYEK

mértük. Ez a csökkenés a NADPH/NADP+ arány növekedését vonta maga után a csökkenéseknek megfelelő időpontokban, ami a nagy szórások miatt csak 4 órával a

130

A

120

††

††

*

110

NADH (a kontroll százalékában)

NADPH (a kontroll százalékában)

kezelést követően volt szignifikáns [15. ábra, C].

††

100 90 80 70 60 50 0

4

8

12 16 20 24

84 168

130

D

120 110 100 90 80 70 60 50 0

4

8

12 16 20 24

††

B

†

* 0

*

** ** 4

8

+

140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

idő (óra) NAD (a kontroll százalékában)

+

NADP (a kontroll százalékában)

idő (óra)

12 16 20 24

84 168

130

E

120 110 100 90

†

80

*

70 60 50 0

4

8

12 16 20 24

+

C* * †† †† 0

†† 4

8

12 16 20 24 idő (óra)

84 168

idő (óra)

NADH/NAD

NADPH/NADP

+

idő (óra) 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

84 168

84 168

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

F *

**

††

*

*

† †† 0

4

8

12 16 20 24

84 168

idő (óra)

15. ábra A piridin dinukleotidok szintjének változása 4×20 mg/kg MPTP i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll

45

EREDMÉNYEK

5.4.2. A METH hatása a piridin dinukleotid szintekre egér striatumban és hippocampusban 5.4.2.1. A METH egyszeri adásának hatása Egyszeri 7,5 mg/kg METH intraperitoneális adását követően a redukált piridin dinukleotidok szintjében emelkedés, míg az oxidált piridin dinukleotidok szintjében csökkenés volt tapasztalható [16. ábra]. A striatumban a NADPH mennyisége szignifikánsan nőtt (a kontroll érték 107,3±5,5%-a) 60 perccel a METH adását követően, a NADH mennyisége nem változott szignifikánsan. A striatumban szignifikáns NADP+-szint csökkenést, 40 perccel a kezelés után a kontroll érték 82,7±2,3%-át mértük, de még 60 perccel a kezelés után is hasonlóan szignifikáns volt a csökkenés (85,0±9,2%). A striatalis NAD+ mennyisége a kontroll csoportban mérhető mennyiség 86,8±3,0%-ára csökkent le 40 perccel a kezelés után.

46

130

A

120

†

†

110 100

*

90 80 70 60 50 0

20

40

60

80

100

120

NADH (a kontroll százalékában)

NADPH (a kontroll százalékában)

EREDMÉNYEK

130

†

D

120 100 90 80 70 60 50 0

20

40

100 90

**

70

*

+

60

NAD (a kontroll százalékában)

+

NADP (a kontroll százalékában)

110

80

50 0

20

40

60

80

100

120

130

** +

**

†

0

20

40

60

80

idő (perc)

100

120

100

120

100

120

110 100

††

90 80

**

70 60 50 0

20

40

60

80

idő (perc)

NADH/NAD

+

NADPH/NADP

C

80

E

120

idő (perc) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

60

idő (perc)

B

120

†

110

idő (perc) 130

††

100

120

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

††

F

†

**

0

20

40

60

80

idő (perc)

16. ábra A piridin dinukleotidok szintjének változása 7,5 mg/kg METH i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll

A hippocampusban a NADPH szintje 60 perccel a METH injekció után a kontroll érték 111,9±5,4%-a volt, de szignifikáns volt a növekedés 120 perccel a kezelést követően is (109,8±7,5%). A NADH szintje a METH adása után 40, 60 és 120 perccel volt szignifikánsan magasabb, mint a kontroll csoport esetében, ekkor a kontroll érték 114,1±8,9%, 114,2±3,3% és 119,2±9,3%-a volt mérhető. A NADP+ szintje ugyan

47

EREDMÉNYEK

csökkent, de ez nem volt szignifikáns, míg a NAD+ szintjében bekövetkező változás hasonló a striatum esetében tapasztalhatóhoz, szignifikáns csökkenés volt észlelhető 40 perccel a kezelés után (87,7±3,9% a kontrollhoz viszonyítva). A redukált és az oxidált koenzimek arányában mindkét agyrészlet esetében növekedést

130

NADH (a kontroll százalékában)

NADPH (a kontroll százalékában)

láthatunk 40 és 60 perccel a kezelést követően, ami 90 percnél már nem volt szignifikáns.

A

120 110

†

100 90 80

**

**

70

††

**

60 50 0

4

8

12 16 20 24

84 168

130

D

120 110 100 90 80

†

70 60 50 0

4

8

130

B

120 110 100

**

90 80

*

70

††

+

60 50 0

4

8

12 16 20 24

84 168

130

††

110 100

**

90 80

††

70 60 50 0

4

8

84 168

F

120 +

NADH/NAD

+

NADPH/NADP

130

110 100 90 80

*

70

12 16 20 24 idő (óra)

C

120

84 168

E

120

idő (óra) 130

12 16 20 24 idő (óra)

NAD (a kontroll százalékában)

+

NADP (a kontroll százalékában)

idő (óra)

60

110 100 90 80

†

70 60

50

50 0

4

8

12 16 20 24 idő (óra)

84 168

0

4

8

12 16 20 24

84 168

idő (óra)

17. ábra A piridin dinukleotidok szintjének változása 4×5 mg/kg METH 2 óránkénti i.p. adását követően egér striatumban (○) és hippocampusban (●). Az adatpontok az átlagot reprezentálják ± S.D., n=5-7, ¸ p<0,05, ¸¸ p<0,01 striatum vs. kontroll, † p<0,05, †† p<0,01 hippocampus vs. kontroll

48

EREDMÉNYEK

5.4.2.2. A METH többszöri adásának hatása A METH-t négyszer adagolva azt tapasztaltuk, hogy a NADPH szintje a striatumban csökkent 4 órával a kezelést követően, a hatás a maximumát 6 óránál érte el (87,0±2,4% a kontrollhoz viszonyítva). 12 órával a kezelést követően még szignifikáns volt a NADPH mennyiségének változása, míg a kontroll szintre 24 órával a kezelést követően tért vissza [17. ábra, A]. A hippocampusban hasonlóan változást észleltünk, a NADPH szintje a 6 órával a kezelést követően a kontroll érték 92,5±3,3%-a volt. A NAD+ szintjében szignifikáns növekedést mértünk (a kontroll 109,1±3,1%-a) két órával az utolsó METH dózis után. 24 órával a kezelést követően a piridin dinukleotidok szintje – hasonlóan a sriatumban tapasztaltakhoz – a kontroll értékre tért vissza, de a következő napokban a dinukleotidok szintjének csökkenését figyelhettük meg minden piridin dinukleotid esetében. Habár három nappal a kezelés után mért piridin dinukleotid mennyiségek kontrolltól való eltérése nem szignifikáns, a tendencia érzékelhető minden esetben. Egy héttel az utolsó METH adás után – a striatalis NADH és NADPH szint kivételével – minden esetben szignifikáns piridin dinukleotid szint csökkenés látható.

49

MEGBESZÉLÉS

6. Megbeszélés 6.1. A NOS szerepe a neurotoxinok hatásában 6.1.1. A nNOS szerepe az MPTP neurotoxicitásában Az MPTP neurotoxikus hatása a belőle képződő MPP+-nak tulajdonítható. Az MPTP nigrostriatalis

dopaminerg

neuronokat

károsító

hatása

több

módon

is

megakadályozható. A MAO-B enzim gátlószereivel blokkolható az MPTP átalakulása a káros MPP+-ná. A MAO-B szelektív gátlószerei, mint pl. a (-)-deprenyl [131] vagy a PF 9601N [132] kivédi az MPTP által okozott neuronkárosodást. Az MPP+ a dopaminerg neuronokba a DAT segítségével jut be. A DAT gátlószerei, mint pl. a mazindol, képesek egérben teljes védelmet nyújtani az MPTP-vel szemben [8], akárcsak a DAT-ot kódoló gén eltávolítása [133]. A nigrostriatalis dopaminerg neuron mitokondriumában felhalmozódó MPP+ az elektron-transzportlánc károsodását okozza, és •O2– termelését indukálja. A •O2– önmagában nem túl reaktív molekula, viszont számos más, sokkal reaktívabb és károsabb gyök képződhet belőle. A •O2–-ból a SOD hatására képződő H2O2 nem szabadgyök, mert nincs párosítatlan elektronja. Az MPTP hatására a citoszolba dopamin kerül a vezikulákból, ami két úton is oxidációra kerül; egyrészt nem enzimatikusan molekuláris oxigén jelenlétében H2O2 képződik és emellett kinon származékká alakul, másrészt a MAO-B enzim alakítja át 3,4-dihidroxifenilecetsavvá (DOPAC) – ugyancsak H2O2 képződése mellett. A SOD által termelt és a dopamin oxidációjából képződő H2O2 és a striatumban nagy mennyiségben megtalálható Fe2+ között Fenton-reakció zajlik le, ami a rendkívül ártalmas ROS, a •OH képződéséhez vezet. A

•

OH reaktív, károsítja az aminosavakat, a cukrokat, foszfolipideket, és a

nukleinsavakat is. Elindítója lehet a lipidperoxidációnak, ami a sejtmembrán károsításával annak ionokra és vízre való permeabilitását növeli meg. Mindezen folyamatok a sejt duzzadásához, majd a citoplazma proteázainak aktiválásához vezetnek. A •OH károsítja a DNS-t is, a DNS-en létrejövő lánctörések a hibák kijavítására szolgáló PARP enzim aktivitásának megnövekedéséhez vezetnek, ami szubsztrátként nagy mennyiségű NAD+-ot használ fel.

50

MEGBESZÉLÉS

Korábbi vizsgálatok szerint az MPTP kezelés által kiváltott ROS termelés hatására a glutamát transzmisszió aktiválódik. 5 napos MPTP kezelést követően a striatum glutamát szintjének növekedését találták [134], egy másik vizsgálatban az MPP+ intrasriatalis infúziója után a glutamát mennyisége szintén jelentősen megnövekedett [135]. Későbbi vizsgálatok megerősítették a glutamát MPTP toxicitásában betöltött szerepét; az MK-801, az AP7, a CPP, amely vegyületek a glutamát szelektív antagonistái az NMDA receptoron, protektív hatásúnak bizonyultak a MPP+ által kiváltott dopaminerg toxicitással szemben [136]. A lamotrigin egy antiepileptikus hatással rendelkező vegyület, hatásmódját tekintve gátolja a glutamát felszabadulását. Ezt a vegyületet is hatásosnak találták az MPTP toxicitásával szemben [137]. A glutamát extracelluláris mennyiségét növelheti, hogy a légzési lánc gátlása és a hozzá kapcsolódó depolarizáció a GSH felszabadulásához vezet, a felszabadult GSH a γglutamil transzpeptidáz segítségével glutamáttá és ciszteinglicinné bomlik [138]. Az NMDA receptorokat gátló Mg2+-blokk a légzési lánc gátlásából következő ATP szint csökkenés hatására feloldódik [139], így a receptorokat akár a kis mennyiségben jelenlévő glutamát is aktiválni képes. Az NMDA receptorok aktiválása Ca2+-belépést idéz elő a neuronba, a szinapszisban jelenlévő excesszív mennyiségű glutamát jelenléte esetén ez még nagyobb mennyiségű lehet. A beáramló Ca2+ a calmodulinnal komplexet képezve aktiválja a nNOS enzimet, ami a nNOS tartalmú neuronok esetében az NMDA receptorok egyik alegységének intracelluláris -COOH végéhez PSD-95 fehérjével kötődik [140]. Vizsgálatainkban a toxin adagolásának hatására létrejövő NOS enzimaktivitás-változást mertük. Eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, hogy a nNOS enzim által szintetizált NO-nak szerepe van az MPTP által kiváltott neurotoxicitásban. Vizsgálataink szerint az MPTP adását követően a NOS aktivitása 4 órával a kezelés után megnövekedett a striatumban, a maximális, mintegy 50%-os növekedés 6 órával a kezelést követően volt mérhető. Az általunk mért NOS aktivitás-növekedés Ca2+függőnek bizonyult, ami azt mutatja, hogy a konstitutív izoforma tehető felelőssé a mért emelkedésért. A növekedés időbeli lefutása és mértéke is arra utal, hogy a megemelkedett enzimaktivitásért a neuronális izoforma lehet felelős. A nNOS által termelt NO képes áthatolni a sejtmembránokon, és a dopaminerg neuronokban a légzési lánc gátlásakor képződő •O2– gyökkel ONOO–-t képezhet. Ennek

51

MEGBESZÉLÉS

a reakciónak a sebessége ötször nagyobb, mint a •O2– SOD által katalizált lebontása [89]. A keletkezett ONOO–, szemben a reakció kiindulási molekuláival, meglehetősen reaktív, számos biomolekulával képes reakcióba lépni. Lipidperoxidációt [141], DNS lánctörést [142], a cisztein oxidációját [143], a triptofán [144], és a tirozin [145] nitrálását okozza. Az utóbbi reakcióban a ONOO– legfontosabb terméke, a nitrozatív stressz indirekt markerének is tekinthető 3-NT képződik [146]. A ONOO– képződését követően számos enzim tirozincsoportja nitrálódhat. A nitrált tirozin csoportok képződése az enzim funkciójának csökkenéséhez, vagy megszűnéséhez is vezethet. A tirozin-kinázok a nitrált tirozint már nem tudják foszforilálni, ezzel a jeltovábbító funkció károsodik. A 3-NT szintjének meghatározása fontos információt ad arról, hogy az adott patológiás folyamatban részt vesz-e a ONOO–. Kimutatták, hogy az MPTP kezelést követően egyrészt a szabad 3-NT szint emelkedett [147], másrészt a dopamin képződésében a sebesség-meghatározó lépést katalizáló tirozin-hidroxiláz enzim tirozin csoportjainak

nitrálódását is megfigyelték [148]. Az MPTP adása után általunk

tapasztalt megemelkedett NOS aktivitás és a valószínűleg fokozott RNS képződés így egyaránt hozzájárulhat az MPTP toxicitásához. Az MPTP-vel végzett vizsgálatokban azt találták, hogy a NOS enzim működésének különböző módon történő meggátlása csökkenti a toxinkezelést követő káros hatásokat. A nNOS in vivo viszonylag szelektívnek tartott gátlószere, a 7-NI radikálisan csökkentette az MPTP hatására megnövekedett 3-NT immunoreaktivitást [149]. A nNOS egy újabb, szelektív gátlószere dózisfüggő módon szignifikánsan csökkentette az MPTP kezelés utáni dopamin-depléciót és a substantia nigra TH immunoreaktivitásának csökkenését [150]. Abban az esetben is protektív hatás volt kimutatható, amikor a nNOS aktivitását nem gátlószerekkel csökkentették, hanem a nNOS génjét eltávolították. A nNOS gént nem expresszáló homozigóta egerekben az MPTP által okozott dopamin, DOPAC és HVA szint csökkenés szignifikánsan kisebb mértékű volt, mint a vad típusú állatokban [151]. iNOS génhiányos egereket is megvizsgáltak, de azt találták, hogy a homozigóta iNOS génhiány nem okoz a vad típushoz képest változást az MPTP által okozott dopaminszint-csökkenésben, ahogyan a dopamin metabolitjai szintjének csökkenését sem befolyásolja az iNOS gén hiánya [152]. Eredményeink megerősítik azt a feltételezést, hogy a nNOS aktivitás növelése hozzájárulhat az MPTP toxikus hatásához.

52

MEGBESZÉLÉS

Az MPTP a szerotonerg és a noradrenerg neuronokat csak kis mértékben károsítja, a striatum dopaminerg neuronjaira szelektívnek mondható toxikus hatással rendelkezik; szelektíven vevődik fel ezekbe a neuronokba. Valószínűleg ennek köszönhető, hogy a vizsgálataink során a hippocampusban a striatumban mért NOS aktivitás-növekedéstől eltérően nem a NOS aktivitásának növekedését, hanem csökkenését tapasztaltuk. 6.1.2. A nNOS szerepe a METH neurotoxicitásában A METH, miután diffúzióval bekerül a neuronokba, károsító hatásának fő célpontja a mitokondrium és a dopaminerg vezikula. A METH adásának hatására a dopamin tartalmú neuronok hosszú távú depléciója következik be. A rágcsálók striatalis neuronjaiban csökken a dopamin mennyisége, csökken a dopamin szintézisében sebesség-meghatározó TH aktivitása, és a DAT immunohisztokémiai kimutathatósága is csökken. Ezek a markerek hasonló változást szenvednek humán METH használók esetében is. Viszont a VMAT és a DOPA-dekarboxiláz funkcióinak károsodása nem mutatható ki a METH-t hosszú távon kábítószerként használóknál [37]. Feltételezhető a ROS szerepe a METH neurotoxicitásában, amit alátámaszt az, hogy a ROS képződést redukáló vagy eliminálását serkentő beavatkozások csökkentik a METH toxicitását. A SOD enzim végzi a

•

O2– lebontását. Amennyiben a SOD aktivitását dietil-

ditiokarbamáttal gátoljuk, a METH által kifejtett toxikus hatás erősödik [153]. Cadet és munkatársai olyan egértörzset használtak a METH-nal végzett vizsgálataikban, amelyik a SOD enzimet a vad törzsnél nagyobb mértékben expresszálja. Ennek a transzgenikus egértörzsnek a striatumában és a cortexében a krónikus METH kezelés hatására sem csökkent a DA és a DOPAC szintje [154]. A ROS mellett a RNS szerepe is felvetődik a METH toxicitásában. A •O2– és a nNOS enzim által termelt NO reakciójából képződő ONOO– oxidáló és nitráló tulajdonságú ONOO– lipidperoxidációt indukál, a DNS lánctörését okozza és fehérjéket károsít. A ONOO– képződés biomarkerének tekinthető 3-NT mennyiségének METH kezelés hatására bekövetkező növekedését találta Imam és munkacsoportja

patkányban

[155].

A

mitokondrium

elektrontranszport

lánca

kifejezetten érzékeny a RNS károsító hatásaival szemben [156], végső lépésben a mitokondriális Ca2+ és a citokróm c citoplazmába való áramlása következik be, ami apoptotikus folyamatokat indukál [157].

53

MEGBESZÉLÉS

Vizsgálatainkban a NOS aktivitásának 30-50%-os csökkenését találtuk. hasonló mértékű és időbeli lefutású csökkenést mértünk egér striatumban és hippocampusban is, tehát hasonló változások zajlanak le a METH adását követően mindkét agyrészletben. A vizsgálatainkban észlelt enzimaktivitás-csökkenés a NO és Cit csökkent termelését jelenti, de bizonyos állapotokban az enzim ettől eltérő terméket is szolgáltathat. Felismerték, hogy a NOS enzim bizonyos körülmények között képes a NADPH oxidációjára anélkül, hogy a reakció végterméke a NO lenne. Ebben az esetben a NOS enzim „szétkapcsolt” állapotban van, a normális esetben tapasztalható két monomer közötti elektronáramlás megszűnik, a NADPH által adott elektron az L-Arg guanidino csoportja helyett egy molekuláris O2-re kerül, a reakció terméke így NO helyett •O2– lesz. Ez a reakció végbemehet részlegesen is úgy, hogy az enzim csökkent mennyiségű NO-t termel. A reakció olyan esetekben kerülhet előtérbe, amikor az enzim számára nem áll rendelkezésre elegendő szubsztrát, illetve az elektrontranszportban katalitikus funkcióval bíró BH4 kofaktor [158]. Ha az L-Arg és a BH4 is telítési koncentrációban áll rendelkezésre, akkor az enzim NO-t termel, viszont ha se a szubsztrát, se a kofaktor nincs jelen, akkor a reakció végterméke csak a •O2– lesz. A két állapot között, tehát amikor nem áll rendelkezésre elegendő szubsztrát, vagy BH4 kofaktor, az enzim mind a két végterméket készítheti. Ebben az esetben viszont a keletkezett NO és •O2– könnyen reakcióba tudnak egymással lépni. A •O2– és a NO reakciója sokkal gyorsabb, mint amilyen sebességgel a SOD a •O2–-ot lebontja [45]. Ez a gyorsaság, és az, hogy a két komponens

ugyanabban

a

környezetben

képződik,

jelentősen

megnöveli

a

valószínűségét, hogy ONOO– keletkezzen. Tehát a •O2– forrásaként nem csak a károsodott funkciójú mitokondriális légzési lánc szolgálhat, hanem a szétkapcsolt állapotban működő NOS is. A vizsgálatainkban mért csökkent enzimaktivitás jelentheti a NOS működésének a szétkapcsolt állapot felé való eltolódását is. Eredményeink az irodalomban leírtakkal ellentmondásosnak tűnnek, hiszen számos NOS-gátló vegyületről leírták annak METH-toxicitást kivédő hatását. A 7-NI-lal történő előkezelés megakadályozza a METH által indukált DA-, DOPAC- és HVA-szint csökkenést [159]. A nNOS szelektívebb gátlószerei, mint az S-methylthiocitrullin, a 3bromo-7-nitroindazol [160] vagy az AR-R17477AR [161] ugyancsak képesek a METH által kiváltott dopamin-depletáló hatás kivédésére. Imam és munkatársai a nNOS génjére hiányos homozigóta egértörzsön végzett vizsgálatokat, és eredményeik szerint

54

MEGBESZÉLÉS

ezekben az egerekben a METH kezelés hatására nem nőtt meg a 3-NT szint, és a DA, DOPAC, HVA szintje sem különbözött szignifikánsan a kontroll, kezeletlen állatok szintjeitől [162]. Egy korábbi tanulmányban azt is kimutatták, hogy a iNOS-gén hiányos egerek nem védettek a METH toxicitásával szemben [163]. Imam és munkacsoportjának vizsgálata rámutat a ONOO– METH toxicitásában betöltött fontos szerepére is, de a munkacsoport más eredményei is egyértelműen rámutatnak a RNS szerepére. Fiziológiás körülmények között számos Fe-porfirin katalizálja a ONOO– nitráttá

történő

porphyrinato-Fe3+

bomlását.

Ilyen

(FeTMPyP)

és

az

5,10,15,20-tetrakis-(N-methyl-4’-pyridyl)a

5,10,15,20-tetrakis-(2,4,6-trimethyl-3,5-

sulfonatophenyl)-porphinato-Fe3+, amelyek képesek meggátolni, hogy a METH hatására 3-NT képződjön, és a dopamin depléciója következzen be egér striatumban [164]. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a METH a nNOS szétkapcsolását idézi elő. Ez az enzimaktivitás-változás átmeneti a METH adása után, viszont a nNOS szétkapcsolása, és ezáltal a ONOO–-képződés megnövekedése jelentős terhet ró a neuronokra, mert a sejtek számos komponense nagyon érzékeny a ONOO– károsító hatására. A nNOS gátlóinak protektív hatása is alátámasztja ezt a feltételezést, mert a thiocitrullin képes meggátolni az elektronáramlást a nNOS-on, ezáltal csökkentve mind a kapcsolt (NO-termelő), mind a szétkapcsolt (•O2–-termelő) izoforma működését. Tehát a NOS gátlószerei képesek megakadályozni a szétkapcsolt enzim működéséből keletkező •O2– képződését, és így csökkenteni tudják a káros ONOO– termelődését. Kérdés, hogy az enzim szétkapcsolt állapota milyen mechanizmuson keresztül jön létre. Elképzelhető, hogy a METH közvetlenül befolyásolja az enzim működését, de az is elképzelhető, hogy közvetett módon, a szubsztrát L-Arg vagy a BH4 ellátottságának módosításával jön létre a szétkapcsolás. Ennek a mechanizmusnak a tisztázása további összetett vizsgálatokat igényel. 6.1.3. A nNOS szerepe a DSP-4 neurotoxicitásában A DSP-4 szelektív neurotoxikus hatását elsősorban a hippocampus noradrenerg rostjain fejti ki. A toxikus hatás a belőle képződő azirídium ion származéknak tulajdonítható, a pontos hatásmechanizmust illetően viszont csak feltételezések állnak rendelkezésünkre. A DSP-4-gyel szemben protektív hatást mutat néhány vegyület, illetve vegyületcsoport.

55

MEGBESZÉLÉS

A noradrenerg uptaket blokkoló vegyületeken kívül protektív hatású a (-)-deprenyl. A DSP-4 és a nNOS kapcsolata nem egyértelmű. Munkacsoportunk vizsgálatai szerint a 7NI, a nNOS in vivo szelektív gátlószerével végzett előkezelés is védő hatásúnak bizonyult [165], a NOS nem szelektív, irreverzibilis gátlása L-NAME előkezeléssel viszont nem jelent védelmet a DSP-4 toxicitásával szemben. Mindez felveti a kérdést, hogy a nNOS enzim szerepet játszik-e a DSP-4 károsító hatásában. Vizsgálataink során a DSP-4 kezelést követő rövid időszakban ugyan változott a nNOS enzim aktivitása, de ezek az inkonzisztens és kismértékű változások nem voltak szignifikánsak. A kezelést követően egy nappal és egy héttel is mértük a nNOS aktivitását, és ezekben az időpontokban sem találtunk szignifikáns enzimaktivitásváltozást. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a DSP-4 hatásában a nNOS aktivitásának megváltozása közvetlenül nem játszik szerepet. Munkacsoportunk korábbi eredményeit, miszerint a 7-NI előkezelés kivédte a DSP-4 NA-depletáló hatását, a jelen eredmények kiegészítik, és valószínűsítik, hogy a 7-NI kedvező hatása nem valószínű, hogy a vegyület nNOS gátló hatásából ered. 6.2. A NOS kapcsoltsági állapotának vizsgálata – NADP+/NO arány A NOS enzim aktivitásának szokásos mérési módszere, ami az L-Arg-ből képződő Cit-t határozza meg, a NO termelés mértékére ad felvilágosítást, de nem alkalmas a NOS szétkapcsolt működésének követésére. Erre olyan módszer alkalmas, amelyik a keletkezett Cit mellett a szétkapcsolt NOS enzim által termelt •O2– vagy az oxidációs reakció során elfogyasztott NADPH mennyiségének mérésére is lehetőséget biztosít. Az irodalomban találhatók ilyen mérőmódszerek, de azok tisztított enzimpreparátumon, vagy rekombináns enzimmel végzett mérések során alkalmazhatók. A módszerek a NADPH mennyiségének csökkenését mérik spektrofotometriásan 340nm-en, vagy a •

O2– mennyiségét határozzák meg EPR spin trapping módszerrel [166, 167, 168]. Ezen

módszerek azonban biológiai mátrixban nem használhatók elég specifikusan és nem is elég érzékenyek. Az általunk kidolgozott HPLC/FD módszer a NADP+ szelektív és érzékeny mérését teszi lehetővé. A NADP+/Cit arány megfelel a NADP+/NO aránynak – hiszen a sztöchiometrikus reakció során a NO és a Cit ekvimoláris mennyiségben képződik –, ez az arány pedig a NOS enzim szétkapcsolt, szubsztrátfüggetlen NADPH

56

MEGBESZÉLÉS

oxidációjáról adhat felvilágosítást. Az irodalmi 1,5-es NADP+/Cit arány a NOS teljesen kapcsolt állapotát jelzi. Ezek az eredmények tisztított enzimpreparátumokon, illetve rekombináns enzimekkel végzett vizsgálatokban születtek. In vitro körülmények között vizsgálva a szöveti enzimműködést, megfelelő szubsztrát-ellátottság mellett a NAD+/Cit arányra 1,63 értéket kaptunk, ami az irodalmi értékkel egybevág. Amennyiben a szubsztrát mennyiségét csökkentettük, a termelt Cit mennyisége csökkent, míg a keletkezett NADP+ mennyisége nem változott jelentősen. Tehát a csökkent NO/Cit képződés mellett az enzim további oxidációs folyamatot katalizál, hiszen a felhasznált NADPH mennyisége nem csökkent. Az L-Arg-tól szétkapcsolt NADPH oxidáció akkor növekedhet meg, amikor a NOS nem kellően ellátott L-Arg-nal, vagy a NOS enzim folyamatos aktivációba kerül nagy mennyiségű Ca2+ jelenlétében. Ilyen eset fordulhat elő pl. stroke-ban [90], ahol a keletkezet agykárosodáshoz hozzájárulhat a szétkapcsolt nNOS enzimből származó •O2– gyök, illetve az abból képződő ONOO–. Méréseinkkel demonstráltuk, hogy in vitro körülmények között a NOS enzim szétkapcsolásának mértéke meghatározható az enzim által képzett NADP+ és Cit mennyiségének arányából. 6.3. Az agyi pridin dinukleotidok szerepe a neurotoxinok által kiváltott oxidatív károsodásban Számos patológiás állapotban felmerült, hogy a megváltozott piridin dinukleotid redox státusz hozzájárul a további sejtkárosodáshoz. Glutamát expozíciónak kitett agyszeleteken a NAD+/NADH arány növekedését, ischaemiás állapotban korai csökkenését majd későbbi növekedését találták [169]. Sarlósejtes vérszegénységben az erythrocitákban ugyancsak csökkent NADH/NAD+ arány volt kimutatható [170]. A redukált és oxidált koenzimek arányának megváltozása a diabeteszes mikroangiopátiás szövődménye kialakulásának korai fázisában is kimutatható [összefoglaló: 171]. Ismert az is, hogy a NAD+ prekurzor nicotinamid kedvező hatású számos olyan in vivo és iv vitro neurotoxikus modellben, ahol feltételezhető, hogy a piridin dinukleotidok szintjének változása hozzájárul a kórkép kialakulásához [172, 173]. A neurodegeneratív betegségek kialakulásában a RONS szerepe egyértelműen fontos. Ezek a reaktív gyökök a neuron makromolekuláit támadják meg, így a DNS láncot is. A DNS-ben keletkező

57

MEGBESZÉLÉS

hibák kijavítására szolgáló PARP fokozott aktivitását figyelték meg mind a METH, mind az MPTP által kiváltott toxicitásban. A PARP fokozott aktivitása a NAD+ mennyiségének azonnal bekövetkező drámai csökkenését eredményezheti, ami a sejt energiaháztartásának

felborulásához

vezethet,

mivel

új

piridin

dinukleotidok

szintéziséhez nagy mennyiségű ATP-re van szükség [174]. A reaktív gyökök azáltal is az energiaháztartás zavarát okozzák, hogy direkt károsítják a mitokondriális légzési láncot [175]. Mivel a celluláris antioxidáns mechanizmusok működése a piridin nukeotidoktól függ – főleg a NADPH-tól – a piridin nukelotidok szintjének csökkenése az antioxidáns kapacitás csökkenéséhez, esetleg kimerüléséhez vezethet. Másrészről a redukált és oxidált piridin dinukleotid arány változása a sejt redox állapotának megváltozását okozhatja [összefoglaló: 176]. A sejt redoxállapota számos szabályozó

funkcióra

van

hatással,

így

befolyásolja

a

gén

expressziót,

a

fehérjeszintézist, a sejtek proliferációját, differenciációját és a halálát is. A redoxaktív jelátviteli rendszer a cisztein reziduumok oxidációján és redukcióján keresztül valósul meg, ami a fehérjék tiol-státuszával van kapcsolatban [177]. A legfontosabb redox puffer rendszerek a gluthation és a thioredoxin rendszer, mindkettő szoros kapcsolatban van a NADPH/NADP+ rendszerrel, a NADPH szolgáltatja a redukáló kapacitást. A legtöbb, oxidatív stresszel kapcsolatos in vivo és in vitro kutatás a gluthation rendszert állítja a vizsgálat középpontjába. Az oxidatív stressz korai fázisának jellemző markereként aposztrofálták a redukált és oxidált gluthation szintjének változását [178], de a kiterjedt vizsgálatok eredményei ellentmondásosak, pl. akut METH adagolást követően csökkent illetve növekedett GSH szintet is találtak [179, 180]. METH kezelést követően a GPX aktivitásának csökkenését találták, ami annak lehet a következménye, hogy a METH alkalmazását követően a ONOO– mennyisége megnövekszik, és a hatására a szelenocisztein rész oxidálódik [53]. Más vizsgálatok viszont nem találtak semmilyen GPX-aktivitásváltozást METH adása után [179]. A gluthation rendszerrel kapcsolatos bizonytalanságok miatt mi a vizsgálataink során a redox státusz másik szereplőjének, a redukált/oxidált piridin dinukleotidoknak a koncetráció-változásait mértük.

58

MEGBESZÉLÉS

6.3.1. Az MPTP kezelés hatása a piridin dinukleotidok szintjére agyszövetben Egyszeri MPTP adását követően csak a striatalis NADH/NAD+ rendszer érintettsége volt kimutatható. A NADH mennyisége 20 perccel az MPTP adását követően emelkedni kezdett, majd további emelkedés volt tapasztalható. Ez a hatás valószínűleg az MPTP compex I-et blokkoló hatásának a következménye, ami az energiaháztartás azonnali károsodását eredményezi. Az MPTP aktív metabolitjának, az MPP+-nak a koncentrációja az MPTP adását követően annak metabolizmusával folyamatosan növekszik, és egy órával a beadást követően éri el a maximumát [181], és fejti ki a maximális complex I gátló hatást, ami összecseng az általunk mért eredménnyel, miszerint a NADH szint maximális emelkedését egy órával a beadást követően mértük. A 120 percnél tapasztalható NAD+ mennyiség csökkenés a PARP átmeneti aktivitásnövekedésére utalhat, amit más szerzők is leírtak [181]. A hippocampusban nem mértünk a stritumhoz hasonló változásokat a piridin nukletoidok szintjében, ami az MPTP szelektív striatalis károsító hatásának következménye lehet. Az MPTP többszöri dózisát követően az egyszeri dózist követő változásokhoz hasonló változás nem volt mérhető. Egyedül a NADP+ szintjében tapasztalható a többszöri MPTP adást követően egy átmeneti csökkenés. Valószínű, hogy a neurotoxin adását követő átmeneti változásokat, amelyek ekkorra már lezajlanak, a sejt az energiaháztartás és a piridin dinukleotidok szintjének helyreállításával megpróbálja kompenzálni. 6.3.2. A METH kezelés hatása a piridin dinukleotidok szintjére agyszövetben Az egyszeri dózisban adott METH adását követően a sejt redox állapota a redukáló irányba tolódott el. Ez meglepőnek tűnik, mert a METH hatására bekövetkező oxidatív károsodás várható. Az általunk talált változás átmeneti jellegű, és jelentősége a redoxreszponzív transzkripciós faktorok aktiválásán keresztül megvalósuló gén expresszió korai szabályozásában lehet. Leírták a METH-ról, hogy 2 órával a kezelést követően mind a striatumban, mind a hippocampusban számos transzkripciós faktor (CREB, AP1) DNS-hez való kapcsolódását aktiválja [182], az AP-1 komplexről pedig ismert, hogy a intracelluláris környezet redukált állapota indukálni képes [összefoglaló: 183]. Ennek a METH korai toxicitásában betöltött szerepe még kérdéses, mindenesetre az AP-1

59

MEGBESZÉLÉS

gyulladásos válaszokat mediálhat azáltal, hogy számos proinflammatorikus gén upregulációját indítja be [184]. Mindez a c-Fos-on keresztül protektív hatású lehet, hiszen ismert, hogy a c-fos knock-out egér fokozott érzékenységet mutat a METH toxicitásával szemben [185]. A megnövekedett NADH/NAD+ arány a fokozott glukózmetabolizmusra, az így megemelkedett laktát/piruvát arányra és fokozott hypoxiára is utalhat, ami egybevág a korábbi megfigyelésekkel, melyek szerint a METH megemeli az agy számos területén a lokális glukóz felhasználást patkányoknak történő intravénás alkalmazását követő egy órán belül [186]. A METH azáltal is növelheti a NAD mennyiségét, hogy – mint ismert, és mint fentebb tárgyaltuk – gátolja a mitokondriális elektrontranszport-láncot, ezáltal gátolt a NADH oxidációja. A megnövekedett glükóz metabolizmus, és az elektrontranszport lánc gátlása megnöveli a pentóz-foszfát ciklusba kerülő szubsztrát mennyiségét, ami a NADPH mennyiségét növeli, a NADP+ mennyiségét csökkenti, ezáltal egy korai antioxidáns miliőt hoz létre. Ez nem mond ellent azoknak az eredményeinknek, hogy a METH hatására csökkent nNOS aktivitást találtunk. Ez a csökkenés az enzim szétkapcsolt működéséből is eredhet, ami, mint az enzim kapcsoltsági állapotának vizsgálatából kiderült, nem növeli az enzim által felhasznált NADPH mennyiségét. A METH által okozott változás átmeneti, de a génexpresszió módosításán keresztül egy hosszabb távú folyamat elindítója lehet, és a sejt energiaállapotának függvényében a neuron állapotának megőrzéséhez vagy a károsodásához vezethet. Többszöri METH-adást követően a striatumban és kisebb mértékben a hippocampusban is csökkent a NADPH mennyisége, ez a csökkenés egyértelműen a megnövekedett oxidatív behatásnak és az antioxidatív kapacitás csökkenésének köszönhető változás, tehát a NADP redox státusza az oxidált állapot felé tolódott el. Ezzel a gluthation rendszer legfontosabb elektrondonorának mennyisége csökken, ami a gluthation szint csökkenéséhez, és ezáltal a gluthationnnal kapcsolatban álló enzimrendszerek aktivitásának csökkenéséhez vezet. Emellett a NADPH maga is közvetlen antioxidáns hatással bíró molekula így a fokozott ROS képződés tovább csökkenthetik a NADPH intracelluláris koncentrációját [187]. A METH alkalmazását követően egy hét múlva tapasztalható, hogy minden piridin dinukleotid mennyisége csökken, ezáltal a neuron általános redox állapota sérül. Ez a monoaminerg neuron-terminálisok pusztulásának

60

MEGBESZÉLÉS

jeleként értelmezhető, és – legalábbis részben – a PARP aktivitás nagymértékű megnövekedésének és koenzimfogyasztásának a következménye is lehet. Összehasonlítva a METH és az MPTP piridin dinuleotidok szintjére gyakorolt hatását, elmondható, hogy a METH koenzimekre gyakorolt hatása kifejezettebb, a hippocampusban és a striatumban egyaránt. Ismert a METH hatásáról, hogy nem csak a dopaminerg, hanem más monoaminerg rendszerek károsodását is képes előidézni, ezért tapasztalható, hogy a METH hatása nem szelektív a dopaminerg neuronokat tartalmazó striatumra, ellentétben az MPTP-vel, amely hatása jelentős szelektivitást mutat a striatum dopamintartalmú neuronjai iránt. A neurotoxinok akut alkalmazása által előidézett változásokat kis mértékűeknek és átmenetieknek találtuk vizsgálatainkban. Valószínű, hogy a neurotoxinok monoaminerg neuronokra kifejtett specifikus hatása eredményezi azt, hogy a detektált változások kismértékűek. Mi a teljes hippocampus illetve striatum homogenizátumában vizsgáltuk a piridin dinukleotidok szintjének változását. A teljes szövet mennyiségét tekintve a monoaminerg neuronok mennyisége azonban csak néhány százalék, és mivel a neurotoxikus hatás valószínűleg csak az arra érzékeny neuronokon jelentkezik, a teljes szövet vizsgálata ezt a hatást részben elfedheti. A szelektív monoaminerg neuronok vizsgálatára ez a kísérleti elrendezés nem adott lehetőséget. Valószínűnek tartjuk, hogy a szelektív neurotoxinok által produkált átmeneti változások mögött akut neurotoxikus hatást láttunk, a piridin dinukleotidok szintjében beállt változásokat azonban a neuronok redox rendszere egy rövid idő elteltével kompenzálni képes. Hosszabb távú krónikus kezelés esetén feltételezhető, hogy markánsabb, maradandóbb változás áll be a piridin dinukleotidok szintjében, esetleg jelezve a már irreverzibilisen károsodott neuronokat is.

61

ÖSSZEFOGLALÁS

7. Összefoglalás Vizsgálatainkban megállapítottuk, hogy nagy dózisban adott, egyszeri MPTP kezelés hatására egér striatumában növekszik a nNOS aktivitása. Ez a növekedés csak a striatumban tapasztalható, hippocampusban átmenetileg csökkent a nNOS enzim által szintetizált NO mennyisége. A két agyrész közötti különbség valószínűleg az MPTP striatumra kifejtett szelektív hatásának köszönhető. A növekedés valószínű oka az MPTP által aktivált glutamát rendszer fokozott működése. Nagy dózisban adott, egyszeri METH hatására nem szelektív módon csökken a nNOS enzim aktivitása egér hippocampusban és striatumban is. A csökkenés valószínűsíthető oka, hogy a METH a nNOS enzim szétkapcsolását idézi elő, amikor a csökkent NO/LCit termelés mellett a NADPH oxidációja megtartott, és NO helyett •O2– képződik. További vizsgálat szükséges annak eldöntésére, hogy az enzimműködés feltételezett szétkapcsolása milyen mechanizmussal jön létre. A DSP-4 adását követően nem változott meg a nNOS enzim aktivitása, tehát nem valószínű, hogy a szelektív neurotoxin hatásában közvetlenül szerepet játszhatna a nNOS enzim működésének befolyásolása. Az eredmények nem zárják ki azonban, hogy indirekt módon a nNOS hozzájáruljon a DSP-4 noradrenerg rendszert károsító hatásához. Módszert dolgoztunk ki az oxidált és a redukált piridin dinukleotidok szelektív, és érzékeny meghatározására. A módszer HPLC elválasztást követő fluoreszcens detektálással kombinált meghatározás. A módszer előnye, hogy érzékeny és kis mintatérfogat esetén is alkalmas a koenzimek mennyiségének meghatározására. Agyszövet homogenizátumban is mérhető a piridin dinukleotidok koncentrációja, szemben

a

csak

rekombináns

vagy

tisztított

enzimpreparátumon

végezhető

spektrofotometriás meghatározásokkal. A piridin dinukleotidok meghatározására alkalmas módszert felhasználtuk a nNOS enzim kapcsoltsági állapotának vizsgálatára. Az irodalmi adatokkal egybehangzóan megállapítottuk, hogy elégtelen mennyiségű szubsztrát esetén a nNOS NO termelése

62

ÖSSZEFOGLALÁS

csökken, de NADPH oxidáló képessége nem változik, ez az enzim által termelt NADP+/Cit arány növekedését okozza. Vizsgáltuk a neurotoxinok hatására bekövetkező piridin dinukleotidok mennyiségi változását agyszövetben. Megállapítottuk, hogy az egyszeri, nagy dózisban adott MPTP hatására a striatum NADH/NAD+ aránya növekedett, ami valószínűleg az MPTP komplex I gátló hatásából következik. Többszöri MPTP adagolása után nem volt tapasztalható szignifikáns változás a piridin dinukleotidok mennyiségében. Megállapítottuk továbbá, hogy egyszeri nagy dózisban adott METH hatására a neuronok állapota redukált irányba tolódott el, a NADH/NAD+ arány megnövekedett. A növekedés átmeneti, valószínűsíthető, hogy a METH korai toxicitásában, a génreguláció megváltozásában lehet szerepe. Többszöri METH adását követően csökkent a NADPH mennyisége, aminek hátterében a METH hatására fokozódó oxidatív terhelés valószínűsíthető. A neurodegeneratív betegségek kialakulásában fontos szerepet töltenek be az oxigén és nitrogén tartalmú reaktív gyökök. Ezek képződésében egyebek mellett fontos szerepet tulajdonítanak

a

nNOS

enzimnek.

Eredményeink

szerint

ezen

betegségek

modellvegyületei által okozott elváltozások hátterében ugyancsak megtalálható a nNOS enzim megváltozott aktivitása, noha nem minden esetben egyértelmű a nNOS szerepe. Valószínű azonban, hogy a neurotoxinok által okozott azonnali sejtszintű változásokhoz hozzájárul a NO és a belőle képződő RNS-k is. További vizsgálatokra van szükség annak eldöntésére, hogy az általunk talált változások milyen közvetlen, vagy közvetett hatások következményei.

63

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

8. Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom Dr. Magyar Kálmán Professzor Úrnak, témavezetőmnek, akinek segítségével a tudományos pályán elindulhattam; aki mindig értékes szakmai tanácsokkal segítette munkámat, és mindig támogatott. Köszönettel tartozom Dr. Török Tamás Professzor Úrnak, akinek vezetése alatt részt vehettem a Gyógyszerhatástani Intézet tudományos munkájában, ahol a mindennapi kutatási tevékenységemet zavartalanul folytathattam. Köszönettel tartozom Dr. Szökő Éva Docens Asszonynak, aki igen értékes elméleti és gyakorlati javaslataival a tudományos tevékenységem első percétől folyamatosan ösztönzött és segített, hogy mindig a legjobb eredményre juthassak. Köszönettel tartozom Pálfi Melindának, aki felbecsülhetetlen értékű segítséget nyújtott a piridin dinukleotidok szintjének mérésében. Köszönettel tartozom Dr. Lengyel József tudományos munkatársnak, továbbá Szarkáné Bolehovszky Andreának és Nagy Tibornak a labormunka mindennapi kérdéseinek megoldásában nyújtott folyamatos szakmai segítségükért. Köszönet illeti a Gyógyszerhatástani Intézet és a Központi Izotóp Labor minden munkatársát, akik nem csak szakmai ismereteik megosztásával segítették munkámat, de mosolyukkal, kedvességükkel kellemes légkört biztosítottak a mindennapi munkához. Köszönöm szüleimnek, hogy a kutatói pályafutásom első pillanatától ösztönöztek, és lelkesen támogattak.

64

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK, POSZTEREK

9. Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Halász AS, Pálfi M, Tábi T, Magyar K, Szökő É. Altered nitric oxide production in mouse brain after administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro-pyridin or methamphetamine Neurochem. Int.,2004;44 (8):641-6. 2. Pálfi M, Halász AS, Tábi T, Magyar K, Szökő É., Application of the measurement of oxidized pyridine dinucleotides with high-performance liquid chromatographyfluorescence detection to assay the uncoupled oxidation of NADPH by neuronal nitric oxide synthase Anal Biochem, 2004;326(1):69-77 3. Szökő É, Haberle D, Halász AS, Tekes K., Magyar K. Protective effect of 7nitroindazole against DSP-4 induced noradrenaline depletion in mouse hippocampus J Neural Transm. 2001;108(4):407-13. 4. Haberle D, Szökő É, Halász AS, Magyar K. The effect of low oral doses of (-)deprenyl and its metabolites on DSP-4 toxicity J Neural Transm. 2001;108(11):1239-47. Egyéb közlemények 1. Tábi T, Halász AS, Pálfi M, Magyar K, Szökő É. Chiral separation of deprenyl-Noxide isomers by capillary electrophoresis using various cyclodextrin derivatives. J. Chromat. Sci. 2004; 42:21-26 2. Szökő É, Tábi T, Halász AS, Pálfi M, Magyar K. High sensitivity analysis of nitrite and nitrate in biological samples by capillary zone electrophoresis with transient isotachophoretic sample stacking. J Chromatogr A. 2004 Oct 8;1051(1-2):177-83. 3. Szökő É, Tábi T, Halász AS, Pálfi M., Kalász H., Magyar K. Chiral characterization and quantification of deprenyl-N-oxide and other deprenyl metabolites in rat urine by capillary electrophoresis Chromatographia, Suppl. 2004, 60:S245-S251.

10. Az értekezés témájában bemutatott saját előadások és poszterek Előadások Attila Sándor Halász, Éva Szökő, Tamás Tábi, Diána Haberle, Kálmán Magyar Effect of neurotoxins: changes of nitric oxide synthase enzyme activity PhD Tudományos Napok, Budapest, 2002.

65

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK, POSZTEREK

Attila Sándor Halász, Éva Szökő, Diána Haberle, Kálmán Magyar Role of nitric oxide synthase enzyme in the effect of neurotoxins Pharmacia „Leonardo Award” Symposium, Nerviano, 2002. Halász Attila Sándor, Szökő Éva, Tábi Tamás, Magyar Kálmán Neurotoxinok okozta nitrogén-oxid szintáz enzim aktivitás változás Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság V. Kongresszusa, Debrecen, 2002. Halász Attila Sándor, Szökő Éva, Magyar Kálmán A nitrogén-oxid szintáz enzim szerepének vizsgálata a DSP-4 neurotoxikus hatásában Ph.D. Tudományos Napok, Budapest, 2001. Attila Sándor Halász, Éva Szökő, Kálmán Magyar A nitrogén-oxid szintáz enzim szerepének vizsgálata a DSP-4 neurotoxikus hatásában MTA Gyógyszerésztudományi Bizottsága tudományos ülése, Budapest, 2001. Poszterek Attila Sándor Halász, Melinda Pálfi, Tamás Tábi, Kálmán Magyar, Éva Szökő Nitricoxide-synthase activity alteration after administration of monoaminergic neurotoxins in mice. A Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005. Attila Sándor Halász, Melinda Pálfi, Tamás Tábi, Kálmán Magyar, Éva Szökő Effect of administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro-pyridin or methamphetamine on nitric oxide production in mouse brain 4th Meeting of the Federation of European Pharmacological Societes, Porto, 2004. Fundamental & Clinical Pharmacology 18 Suppl. 1 (2004) 67. Halász Attila Sándor, Pálfi Melinda, Tábi Tamás, Magyar Kálmán, Szökő Éva Metamfetamin hatására bekövetkező változások a piridin dinukleotid szintekben és a nitrogén oxid szintáz enzim aktivitásában Farmakokinetika és Metabolizmus Szimpózium, Mátraháza, 2004. Halász Attila Sándor, Pálfi Melinda, Tábi Tamás, Magyar Kálmán, Szökő Éva Neurotoxinok által okozott nitrogén-oxid szintáz enzimaktivitás változás Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XII, Budapest, 2003. Attila Sándor Halász, Éva Szökő, Diána Haberle, Kálmán Magyar Does nitric-oxide synthase play any role in neurotoxic effect of DSP-4? 3rd Meeting of the Federation of European Pharmacological Societes, Lyon, 2001. Fundamental & Clinical Pharmacology 15 Suppl. 1 (2001) 136.

66

IRODALOMJEGYZÉK

11. Irodalomjegyzék

1

Pileblad E, Nissbrandt H, Carlsson A. Biochemical and functional evidence for a marked dopamine releasing action of N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (NMPTP) in mouse brain. J Neural Transm. 1984;60(3-4):199-203.

2

Forno LS, DeLanney LE, Irwin I, Langston JW. Similarities and differences between MPTP-induced parkinsonsim and Parkinson's disease. Neuropathologic considerations. Adv Neurol. 1993;60:600-8.

3

Moratalla R, Quinn B, DeLanney LE, Irwin I, Langston JW, Graybiel AM. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 1;89(9):3859-63.

4

Seniuk NA, Tatton WG, Greenwood CE, Brain Res. 1990 Sep 10;527(1):7-20

5

Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 1983 Feb 25;219(4587):97980.

6

Chiba, K., Trevor, A., Castagnoli, N.J., 1984 Biochem. Biophys. Res. Commun., 120:574-578

7

Heikkila RE, Manzino L, Cabbat FS, Duvoisin RC. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 1984 Oct 4-10;311(5985):467-9.

8

Javitch JA, D'Amato RJ, Strittmatter SM, Snyder SH., Parkinsonism-inducing neurotoxin,

N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6

-tetrahydropyridine:

uptake

of

the

metabolite N-methyl-4-phenylpyridine by dopamine neurons explains selective toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Apr;82(7):2173-7. 9

Mayer RA, Kindt MV, Heikkila RE., J Neurochem. 1986 Oct;47(4):1073-9.

10 Liu Y, Peter D, Roghani A, Schuldiner S, Prive GG, Eisenberg D, Brecha N, Edwards RH. A cDNA that suppresses MPP+ toxicity encodes a vesicular amine transporter. Cell. 1992 Aug 21;70(4):539-51. 11 Ramsay RR, Singer TP. J Biol Chem. 1986 Jun 15;261(17):7585-7.

67

IRODALOMJEGYZÉK

12 Klaidman LK, Adams JD Jr, Leung AC, Kim SS, Cadenas E. Redox cycling of MPP+: evidence for a new mechanism involving hydride transfer with xanthine oxidase, aldehyde dehydrogenase, and lipoamide dehydrogenase. Free Radic Biol Med. 1993 Aug;15(2):169-79. 13 Rollema H, Damsma G, Horn AS, De Vries JB, Westerink BH. Brain dialysis in conscious rats reveals an instantaneous massive release of striatal dopamine in response to MPP+. Eur J Pharmacol. 1986 Jul 31;126(3):345-6. 14 Cohen G. Monoamine oxidase and oxidative stress at dopaminergic synapses. J Neural Transm Suppl. 1990;32:229-38. 15 Graham DG, Tiffany SM, Bell WR Jr, Gutknecht WF. Autoxidation versus covalent binding of quinones as the mechanism of toxicity of dopamine, 6hydroxydopamine, and related compounds toward C1300 neuroblastoma cells in vitro. Mol Pharmacol. 1978 Jul;14(4):644-53. 16 Klegeris A, Korkina LG, Greenfield SA. Autoxidation of dopamine: a comparison of luminescent and spectrophotometric detection in basic solutions. Free Radic Biol Med. 1995 Feb;18(2):215-22. 17 Mizuno

Y,

Sone

N,

Saitoh

T.

Effects

of

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J Neurochem. 1987 Jun;48(6):1787-93. 18 Desai VG, Feuers RJ, Hart RW, Ali SF. MPP(+)-induced neurotoxicity in mouse is age-dependent: evidenced by the selective inhibition of complexes of electron transport. Brain Res. 1996 Apr 9;715(1-2):1-8 19 Cassarino DS, Parks JK, Parker WD Jr, Bennett JP Jr. The parkinsonian neurotoxin MPP+ opens the mitochondrial permeability transition pore and releases cytochrome c in isolated mitochondria via an oxidative mechanism. Biochim Biophys Acta. 1999 Jan 6;1453(1):49-62 20 Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997 Nov 14;91(4):479-89.

68

IRODALOMJEGYZÉK

21 Nunez G, Benedict MA, Hu Y, Inohara N. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene. 1998 Dec 24;17(25):3237-45. 22 Viswanath V, Wu Y, Boonplueang R, Chen S, Stevenson FF, Yantiri F, Yang L, Beal MF, Andersen JK. Caspase-9 activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridineinduced Parkinson's disease. J Neurosci. 2001 Dec 15;21(24):9519-28. 23 Zhou Q, Krebs JF, Snipas SJ, Price A, Alnemri ES, Tomaselli KJ, Salvesen GS. Interaction of the baculovirus anti-apoptotic protein p35 with caspases. Specificity, kinetics, and characterization of the caspase/p35 complex. Biochemistry. 1998 Jul 28;37(30):10757-65. 24 Blum D, Torch S, Lambeng N, Nissou M, Benabid AL, Sadoul R, Verna JM. Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory in Parkinson's disease. Prog Neurobiol. 2001 Oct;65(2):135-72. 25 Hasegawa E, Takeshige K, Oishi T, Murai Y, Minakami S. 1-Methyl-4phenylpyridinium (MPP+) induces NADH-dependent superoxide formation and enhances NADH-dependent lipid peroxidation in bovine heart submitochondrial particles. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Aug 16;170(3):1049-55. 26 Obata T, Chiueh CC. In vivo trapping of hydroxyl free radicals in the striatum utilizing intracranial microdialysis perfusion of salicylate: effects of MPTP, MPDP+, and MPP+. J Neural Transm Gen Sect. 1992;89(1-2):139-45. 27 Huie, R.E., Padmaja, S., 1993. The reaction of NO with superoxide. Free Radic. Res. Commun. 18, 195–199. 28 Przedborski, S., Kostic, V., Jackson-Lewis, V., Naini, A.B., Simonetti, S.,Fahn, S., Carlson, E., Epstein, C.J., Cadet, J.L., 1992. Transgenic mice with increased Cu/Zn-superoxide dismutase activity are resistant to N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine-induced neurotoxicity. J. Neurosci. 12, 1658–1667. 29 Schulz, J.B., Matthews, R.T., Muqit, M.M.K., Browne, S.E., Beal, M.F., 1995. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 7-nitroindazole protects against MPTP-induced neurotoxicity in mice. J. Neurochem. 64, 936–939.

69

IRODALOMJEGYZÉK

30 Cadet JL, Jayanthi S, Deng X. Speed kills: cellular and molecular bases of methamphetamine-induced nerve terminal degeneration and neuronal apoptosis. FASEB J. 2003 Oct;17(13):1775-88. 31 Ricaurte, G.A., Schuster, C.R., Seiden, L.S., 1980. Long-term effects of repeated methylamphetamine administration on dopamine and serotonin neurons in the rat brain: a regional study. Brain Res. 193, 153–163. 32 Seiden LS, MacPhail RC, Oglesby MW., Catecholamines and drug-behavior interactions. Fed Proc. 1975 Aug;34(9):1823-31. Review. 33 Kogan, F.J., Nichols, W.K., Gibb, J.W., 1976. Influence of methamphetamine on nigral and striatal tyrosine hydroxylase activity and on striatal dopamine levels. Eur. J. Pharmacol. 36, 363–371. 34 Morgan ME, Gibb JW. Short-term and long-term effects of methamphetamine on biogenic

amine

metabolism

in

extra-striatal

dopaminergic

nuclei.

Neuropharmacology. 1980 Oct;19(10):989-95. 35 Seiden LS, Fischman MW, Schuster CR. Long-term methamphetamine induced changes in brain catecholamines in tolerant rhesus monkeys. Drug Alcohol Depend. 1976 Feb;1(3):215-9. 36 Volkow ND, Chang L, Wang GJ, Fowler JS, Leonido-Yee M, Franceschi D, Sedler MJ, Gatley SJ, Hitzemann R, Ding YS, Logan J, Wong C, Miller EN. Association of

dopamine

transporter

reduction

with

psychomotor

impairment

in

methamphetamine abusers. Am J Psychiatry. 2001 Mar;158(3):377-82. 37 Wilson JM, Kalasinsky KS, Levey AI, Bergeron C, Reiber G, Anthony RM, Schmunk GA, Shannak K, Haycock JW, Kish SJ. Striatal dopamine nerve terminal markers in human, chronic methamphetamine users. Nat Med. 1996 Jun;2(6):699703. 38 Schmidt CJ, Ritter JK, Sonsalla PK, Hanson GR, Gibb JW. Role of dopamine in the neurotoxic effects of methamphetamine. J Pharmacol Exp Ther. 1985 Jun;233(3):539-44. 39 Hotchkiss AJ, Gibb JW. Long-term effects of multiple doses of methamphetamine on tryptophan hydroxylase and tyrosine hydroxylase activity in rat brain. J Pharmacol Exp Ther. 1980 Aug;214(2):257-62.

70

IRODALOMJEGYZÉK

40 Kogan FJ, Nichols WK, Gibb JW. Influence of methamphetamine on nigral and striatal tyrosine hydroxylase activity and on striatal dopamine levels. Eur J Pharmacol. 1976 Apr;36(2):363-71. 41 Cook JD, Schanberg SM. Effect of methamphetamine on norepinephrine metabolism in various regions of brain. J Pharmacol Exp Ther. 1975 Oct;195(1):8793. 42 Carlsson M, Carlsson A. Interactions between glutamatergic and monoaminergic systems within the basal ganglia--implications for schizophrenia and Parkinson's disease. Trends Neurosci. 1990 Jul;13(7):272-6. 43 Abekawa T, Ohmori T, Koyama T. Effects of repeated administration of a high dose of methamphetamine on dopamine and glutamate release in rat striatum and nucleus accumbens. Brain Res. 1994 Apr 18;643(1-2):276-81. 44 Sonsalla PK, Nicklas WJ, Heikkila RE. Role for excitatory amino acids in methamphetamine-induced nigrostriatal dopaminergic toxicity. Science. 1989 Jan 20;243(4889):398-400. 45 Beckman JS, Beckman TW, Chen J, Marshall PA, Freeman BA. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(4):1620-4. 46 Davidson C, Gow AJ, Lee TH, Ellinwood EH. Methamphetamine neurotoxicity: necrotic and apoptotic mechanisms and relevance to human abuse and treatment. Brain Res Brain Res Rev. 2001 Aug;36(1):1-22 47 Cadet JL, Ordonez SV, Ordonez JV. Methamphetamine induces apoptosis in immortalized neural cells: protection by the proto-oncogene, bcl-2. Synapse. 1997 Feb;25(2):176-84 48 Stumm G, Schlegel J, Schafer T, Wurz C, Mennel HD, Krieg JC, Vedder H. Amphetamines induce apoptosis and regulation of bcl-x splice variants in neocortical neurons. FASEB J. 1999 Jun;13(9):1065-72. 49 Deng X, Cai NS, McCoy MT, Chen W, Trush MA, Cadet JL. Methamphetamine induces apoptosis in an immortalized rat striatal cell line by activating the mitochondrial cell death pathway. Neuropharmacology. 2002 May;42(6):837-45.

71

IRODALOMJEGYZÉK

50 Itzhak, Y., Martin, J.L., Ali, S.F., 1999. Methamphetamine- and 1-methyl- 4phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced dopaminergic neurotoxicity in inducible nitric oxide synthase-deficient mice. Synapse 34, 305–312. 51 Cadet, J.L., Sheng, P., Ali, S., Rothman, R., Carlson, E., Epstein, C., 1994. Attenuation of methamphetamine-induced neurotoxicity in copper/zinc superoxide dismutase transgenic mice. J. Neurochem. 62, 380–383. 52 Cadet, J.L., Sheng, P., Ali, S., Rothman, R., Carlson, E., Epstein, C., 1994. Attenuation of methamphetamine-induced neurotoxicity in copper/zinc superoxide dismutase transgenic mice. J. Neurochem. 62, 380–383. 53 Imam SZ, Newport GD, Islam F, Slikker W Jr, Ali SF. Selenium, an antioxidant, protects against methamphetamine-induced dopaminergic neurotoxicity. Brain Res. 1999 Feb 13;818(2):575-8. 54 Ross SB, Renyi AL. On the long-lasting inhibitory effect of N-(2-chloroethyl)-Nethyl-2-bromobenzylamine (DSP 4) on the active uptake of noradrenaline. J Pharm Pharmacol. 1976 May;28(5):458-9. 55 Zieher LM, Jaim-Etcheverry G. Neurotoxicity of N-(2-chloroethyl)-N-ethyl-2bromobenzylamine hydrochloride (DSP 4) on noradrenergic neurons is mimicked by its cyclic aziridinium derivative. Eur J Pharmacol. 1980 Jul 25;65(2-3):249-56. 56 Hallman H, Jonsson G. Pharmacological modifications of the neurotoxic action of the noradrenaline neurotoxin DSP4 on central noradrenaline neurons. Eur J Pharmacol. 1984 Aug 17;103(3-4):269-78. 57 Ross SB, Renyl AL. On the long-lasting inhibitory effect of N-(2-chloroethyl)-Nethyl-2-bromobenzylamine (DSP 4) on the active uptake of noradrenaline.J Pharm Pharmacol. 1976 May;28(5):458-9. 58 Lookingland KJ, Chapin DS, McKay DW, Moore KE. Comparative effects of the neurotoxins N-chloroethyl-N-ethyl-2-bromobenzylamine hydrochloride (DSP4) and 6-hydroxydopamine on

hypothalamic noradrenergic, dopaminergic and 5-

hydroxytryptaminergic neurons in the male rat. Brain Res. 1986 Feb 19;365(2):22834.

72

IRODALOMJEGYZÉK

59 Ross SB. Long-term effects of N-2-chlorethyl-N-ethyl-2-bromobenzylamine hydrochloride on noradrenergic neurones in the rat brain and heart. Br J Pharmacol. 1976 Dec;58(4):521-7. 60 Dudley MW, Howard BD, Cho AK. The interaction of the beta-haloethyl benzylamines, xylamine, and DSP-4 with catecholaminergic neurons. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1990;30:387-403. 61 Lyles GA, Callingham BA. The effect of DSP-4 (N-[2-chloroethyl]-N-ethyl-2bromobenzylamine) on monoamine oxidase activities in tissues of the rat. J Pharm Pharmacol. 1981 Oct;33(10):632-8. 62 Gibson CJ. Inhibition of MAO B, but not MAO A, blocks DSP-4 toxicity on central NE neurons. Eur J Pharmacol. 1987 Sep 2;141(1):135-8. 63 Finnegan KT, Skratt JJ, Irwin I, DeLanney LE, Langston JW. Protection against DSP-4-induced neurotoxicity by deprenyl is not related to its inhibition of MAO B. Eur J Pharmacol. 1990 Aug 2;184(1):119-26. 64 Haberle D, Szoko E, Halasz AS, Magyar K. The effect of low oral doses of (-)deprenyl

and

its

metabolites

on

DSP-4

toxicity.

J

Neural

Transm.

2001;108(11):1239-47. 65 Szoko E, Haberle D, Halasz AS, Tekes K, Magyar K. Protective effect of 7nitroindazole

against

DSP-4

induced

noradrenaline

depletion

in

mouse

hippocampus. J Neural Transm. 2001;108(4):407-13. 66 Fink K, Schultheiss R, Gothert M. Stimulation of noradrenaline release in human cerebral cortex mediated by N-methyl-D-aspartate (NMDA) and non-NMDA receptors. Br J Pharmacol. 1992 May;106(1):67-72. 67 Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001 Aug 1;357(Pt 3):593-615. 68 Hierholzer C, Harbrecht B, Menezes JM, Kane J, MacMicking J, Nathan CF, Peitzman AB, Billiar TR, Tweardy DJ. Essential role of induced nitric oxide in the initiation of the inflammatory response after hemorrhagic shock. J Exp Med. 1998 Mar 16;187(6):917-28.

73

IRODALOMJEGYZÉK

69 Gally JA, Montague PR, Reeke GN Jr, Edelman GM. The NO hypothesis: possible effects of a short-lived, rapidly diffusible signal in the development and function of the nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 May;87(9):3547-51. 70 Schuman EM, Madison DV. A requirement for the intercellular messenger nitric oxide in long-term potentiation. Science. 1991 Dec 6;254(5037):1503-6. 71 Son H, Hawkins RD, Martin K, Kiebler M, Huang PL, Fishman MC, Kandel ER. Long-term potentiation is reduced in mice that are doubly mutant in endothelial and neuronal nitric oxide synthase. Cell. 1996 Dec 13;87(6):1015-23. 72 Okere CO, Kaba H, Higuchi T. Failure of intrabulbar and peripheral administration of N omega-nitro-L-arginine to prevent the formation of an olfactory memory in mice. Physiol Behav. 1995 Aug;58(2):387-91. 73 Gribkoff VK, Lum-Ragan JT. Evidence for nitric oxide synthase inhibitor-sensitive and insensitive hippocampal synaptic potentiation. J Neurophysiol. 1992 Aug;68(2):639-42. 74 Lonart G, Wang J, Johnson KM. Nitric oxide induces neurotransmitter release from hippocampal slices. Eur J Pharmacol. 1992 Sep 22;220(2-3):271-2 75 Prast H, Philippu A. Nitric oxide releases acetylcholine in the basal forebrain. Eur J Pharmacol. 1992 May 27;216(1):139-40. 76 Kiss,

JP.

Role

of

nitric

oxide

in

the

regulation

of

monoaminergic

neurotransmission. Brain Res Bull. 2000 Aug;52(6):459-66. Review. 77 Kiss JP, Sershen H, Lajtha A, Vizi ES. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase potentiates the dimethylphenylpiperazinium-evoked carrier-mediated release of noradrenaline from rat hippocampal slices. Neurosci Lett. 1996 Sep 6;215(2):115-8. 78 Sandor NT, Brassai A, Puskas A, Lendvai B. Role of nitric oxide in modulating neurotransmitter release from rat striatum. Brain Res Bull. 1995;36(5):483-6. 79 Peunova N, Enikolopov G. Nitric oxide triggers a switch to growth arrest during differentiation of neuronal cells. Nature. 1995 May 4;375(6526):68-73. 80 Phung YT, Bekker JM, Hallmark OG, Black SM. Both neuronal NO synthase and nitric oxide are required for PC12 cell differentiation: a cGMP independent pathway. Brain Res Mol Brain Res. 1999 Feb 5;64(2):165-78.

74

IRODALOMJEGYZÉK

81 Dalkara T, Yoshida T, Irikura K, Moskowitz MA. Dual role of nitric oxide in focal cerebral ischemia. Neuropharmacology. 1994 Nov;33(11):1447-52. 82 Wallace MN, Geddes JG, Farquhar DA, Masson MR. Nitric oxide synthase in reactive astrocytes adjacent to beta-amyloid plaques. Exp Neurol. 1997 Apr;144(2):266-72 83 Akama KT, Van Eldik LJ. Beta-amyloid stimulation of inducible nitric-oxide synthase in astrocytes is interleukin-1beta- and tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha)-dependent, and involves a TNFalpha receptor-associated factor- and NFkappaB-inducing kinase-dependent signaling mechanism. J Biol Chem. 2000 Mar 17;275(11):7918-24. 84 Venturini G, Colasanti M, Persichini T, Fioravanti E, Ascenzi P, Palomba L, Cantoni O, Musci G. Beta-amyloid inhibits NOS activity by subtracting NADPH availability. FASEB J. 2002 Dec;16(14):1970-2. Epub 2002 Oct 18. 85 Przedborski S, Vila M. The 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model: a tool to explore the pathogenesis of Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci. 2003 Jun;991:189-98. 86 Deckel AW. Nitric oxide and nitric oxide synthase in Huntington's disease. J Neurosci Res. 2001 Apr 15;64(2):99-107. 87 Sasaki S, Shibata N, Komori T, Iwata M. iNOS and nitrotyrosine immunoreactivity in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 2000 Sep 8;291(1):44-8. 88 Shaw PJ, Williams R. Serum and cerebrospinal fluid biochemical markers of ALS. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 2000 Jun;1 Suppl 2:S61-7. 89 Huie RE, Padmaja S. The reaction of no with superoxide. Free Radic Res Commun. 1993;18(4):195-9. 90 Griffith OW, Stuehr DJ. Nitric oxide synthases: properties and catalytic mechanism. Annu Rev Physiol. 1995;57:707-36. 91 Jaffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH. Protein Snitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol. 2001 Feb;3(2):193-7.

75

IRODALOMJEGYZÉK

92 Gopalakrishna R, Chen ZH, Gundimeda U. Nitric oxide and nitric oxide-generating agents induce a reversible inactivation of protein kinase C activity and phorbol ester binding. J Biol Chem. 1993 Dec 25;268(36):27180-5. 93 Tenneti L, D'Emilia DM, Lipton SA. Suppression of neuronal apoptosis by Snitrosylation of caspases. Neurosci Lett. 1997 Nov 7;236(3):139-42. 94 Jaffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH. Protein Snitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol. 2001 Feb;3(2):193-7. 95 Choi YB, Lipton SA. Redox modulation of the NMDA receptor. Cell Mol Life Sci. 2000 Oct;57(11):1535-41. 96 Gu Z, Kaul M, Yan B, Kridel SJ, Cui J, Strongin A, Smith JW, Liddington RC, Lipton SA. S-nitrosylation of matrix metalloproteinases: signaling pathway to neuronal cell death. Science. 2002 Aug 16;297(5584):1186-90. 97 Klotz LO, Schroeder P, Sies H. Peroxynitrite signaling: receptor tyrosine kinases and activation of stress-responsive pathways. Free Radic Biol Med. 2002 Sep 15;33(6):737-43. 98 Sloane JA, Hollander W, Moss MB, Rosene DL, Abraham CR. Increased microglial activation and protein nitration in white matter of the aging monkey. Neurobiol Aging. 1999 Jul-Aug;20(4):395-405. 99 Smith MA, Richey Harris PL, Sayre LM, Beckman JS, Perry G. Widespread peroxynitrite-mediated damage in Alzheimer's disease. J Neurosci. 1997 Apr 15;17(8):2653-7. 100 Good PF, Hsu A, Werner P, Perl DP, Olanow CW. Protein nitration in Parkinson's disease. J Neuropathol Exp Neurol. 1998 Apr;57(4):338-42. 101 Abe K, Pan LH, Watanabe M, Konno H, Kato T, Itoyama Y. Upregulation of protein-tyrosine nitration in the anterior horn cells of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol Res. 1997 Apr;19(2):124-8. 102 Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys. 1991 Aug 1;288(2):481-7.

76

IRODALOMJEGYZÉK

103 Kanner J, Harel S, Granit R. Nitric oxide as an antioxidant. Arch Biochem Biophys. 1991 Aug 15;289(1):130-6. 104 Guo Q, Fu W, Holtsberg FW, Steiner SM, Mattson MP. Superoxide mediates the cell-death-enhancing action of presenilin-1 mutations. J Neurosci Res. 1999 Jun 1;56(5):457-70. 105 Bolanos JP, Peuchen S, Heales SJ, Land JM, Clark JB. Nitric oxide-mediated inhibition of the mitochondrial respiratory chain in cultured astrocytes. J Neurochem. 1994 Sep;63(3):910-6. 106 Packer MA, Murphy MP. Peroxynitrite causes calcium efflux from mitochondria which is prevented by Cyclosporin A. FEBS Lett. 1994 May 30;345(2-3):237-40. 107 Szabo C. & Ohshima H. (1997) DNA damage induced by peroxynitrite : subsequent biological effects. Nitric Oxide 1,373-385. 108 Zhang J, Dawson VL, Dawson TM, Snyder SH. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthetase in neurotoxicity. Science. 1994 Feb 4;263(5147):6879. 109 Eliasson MJ, Sampei K, Mandir AS, Hurn PD, Traystman RJ, Bao J, Pieper A, Wang ZQ, Dawson TM, Snyder SH, Dawson VL. Poly(ADP-ribose) polymerase gene disruption renders mice resistant to cerebral ischemia. Nat Med. 1997 Oct;3(10):1089-95. 110 Simic G, Lucassen PJ, Krsnik Z, Kruslin B, Kostovic I, Winblad B, Bogdanovi. nNOS expression in reactive astrocytes correlates with increased cell death related DNA damage in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer's disease. Exp Neurol. 2000 Sep;165(1):12-26. 111 Ballinger SW, Patterson C, Yan CN, Doan R, Burow DL, Young CG, Yakes FM, Van Houten B, Ballinger CA, Freeman BA, Runge MS. Hydrogen peroxide- and peroxynitrite-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in vascular endothelial and smooth muscle cells. Circ Res. 2000 May 12;86(9):960-6. 112 Guo Q, Fu W, Holtsberg FW, Steiner SM, Mattson MP. Superoxide mediates the cell-death-enhancing action of presenilin-1 mutations. J Neurosci Res. 1999 Jun 1;56(5):457-70.

77

IRODALOMJEGYZÉK

113 Estevez AG, Crow JP, Sampson JB, Reiter C, Zhuang Y, Richardson GJ, Tarpey MM, Barbeito L, Beckman JS. Induction of nitric oxide-dependent apoptosis in motor neurons by zinc-deficient superoxide dismutase. Science. 1999 Dec 24;286(5449):2498-500. 114 Tammariello SP, Quinn MT, Estus S. NADPH oxidase contributes directly to oxidative stress and apoptosis in nerve growth factor-deprived sympathetic neurons. J Neurosci. 2000 Jan 1;20(1):RC53. 115 Walder CE, Green SP, Darbonne WC, Mathias J, Rae J, Dinauer MC, Curnutte JT, Thomas GR. Ischemic stroke injury is reduced in mice lacking a functional NADPH oxidase. Stroke. 1997 Nov;28(11):2252-8. 116 Wu DC, Teismann P, Tieu K, Vila M, Jackson-Lewis V, Ischiropoulos H, Przedborski S. NADPH oxidase mediates oxidative stress in the 1-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100(10):6145-50. Epub 2003 Apr 29. 117 Bianca VD, Dusi S, Bianchini E, Dal Pra I, Rossi F. beta-amyloid activates the O-2 forming NADPH oxidase in microglia, monocytes, and neutrophils. A possible inflammatory mechanism of neuronal damage in Alzheimer's disease. J Biol Chem. 1999 May 28;274(22):15493-9. 118 Shimohama S, Tanino H, Kawakami N, Okamura N, Kodama H, Yamaguchi T, Hayakawa T, Nunomura A, Chiba S, Perry G, Smith MA, Fujimoto S. Activation of NADPH oxidase in Alzheimer's disease brains. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jun 24;273(1):5-9. 119 Stephans SE, Whittingham TS, Douglas AJ, Lust WD, Yamamoto BK. Substrates of energy metabolism attenuate methamphetamine-induced neurotoxicity in striatum. J Neurochem. 1998 Aug;71(2):613-21. 120 Wan FJ, Lin HC, Kang BH, Tseng CJ, Tung CS. D-amphetamine-induced depletion of energy and dopamine in the rat striatum is attenuated by nicotinamide pretreatment. Brain Res Bull. 1999 Oct;50(3):167-71. 121 Klaidman LK, Mukherjee SK, Adams JD Jr. Oxidative changes in brain pyridine nucleotides and neuroprotection using nicotinamide. Biochim Biophys Acta. 2001 Feb 16;1525(1-2):136-48.

78

IRODALOMJEGYZÉK

122 Mukherjee SK, Klaidman LK, Yasharel R, Adams JD Jr. Increased brain NAD prevents neuronal apoptosis in vivo. Eur J Pharmacol. 1997 Jul 2;330(1):27-34. 123 Cosi C, Chopin P, Marien M. Benzamide, an inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase, attenuates methamphetamine-induced dopamine neurotoxicity in the C57B1/6N mouse. Brain Res. 1996 Oct 7;735(2):343-8. 124 Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Biol Med. 2001 Jun 1;30(11):1191-1212. 125 Adams JD Jr, Klaidman LK, Chang ML, Yang J. Brain oxidative stress--analytical chemistry and thermodynamics of glutathione and NADPH. Curr Top Med Chem. 2001 Dec;1(6):473-82. 126 Bredt DS, Snyder SH. Nitric oxide mediates glutamate-linked enhancement of cGMP levels in the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Nov;86(22):90303. 127 Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75 128 Palfi M, Halasz AS, Tabi T, Magyar K, Szoko E. Application of the measurement of oxidized pyridine dinucleotides with high-performance liquid chromatographyfluorescence detection to assay the uncoupled oxidation of NADPH by neuronal nitric oxide synthase. Anal Biochem. 2004 Mar 1;326(1):69-77. 129 Kaplan NO, Colowick SP, Barnes CC. Effect of alkali on diphosphopyridine nucleotide. J Biol Chem. 1951 Aug;191(2):461-72. 130 Mayer B, John M, Heinzel B, Werner ER, Wachter H, Schultz G, Bohme E. Brain nitric oxide synthase is a biopterin- and flavin-containing multi-functional oxidoreductase. FEBS Lett. 1991 Aug 19;288(1-2):187-91. 131 Magyar K, Haberle D. Neuroprotective and neuronal rescue effects of selegiline: review. Neurobiology (Bp). 1999;7(2):175-90. 132 Perez

V,

Unzeta

M.

PF

9601N

[N-(2-propynyl)-2-(5-benzyloxy-indolyl)

methylamine], a new MAO-B inhibitor, attenuates MPTP-induced depletion of striatal dopamine levels in C57/BL6 mice. Neurochem Int. 2003 Feb;42(3):221-9.

79

IRODALOMJEGYZÉK

133 Bezard E, Gross CE, Fournier MC, Dovero S, Bloch B, Jaber M. Absence of MPTP-induced neuronal death in mice lacking the dopamine transporter. Exp Neurol. 1999 Feb;155(2):268-73. 134 Serra PA, Sciola L, Delogu MR, Spano A, Monaco G, Miele E, Rocchitta G, Miele M,

Migheli

R,

Desole

MS.

The

neurotoxin

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridine induces apoptosis in mouse nigrostriatal glia. Relevance to nigral neuronal death and striatal neurochemical changes. J Biol Chem. 2002 Sep 13;277(37):34451-61. 135 Carboni S, Melis F, Pani L, Hadjiconstantinou M, Rossetti ZL. The noncompetitive NMDA-receptor antagonist MK-801 prevents the massive release of glutamate and aspartate from rat striatum induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+). Neurosci Lett. 1990 Sep 4;117(1-2):129-33. 136 Turski L, Bressler K, Rettig KJ, Loschmann PA, Wachtel H. Protection of substantia nigra from MPP+ neurotoxicity by N-methyl-D-aspartate antagonists. Nature. 1991 Jan 31;349(6308):414-8. 137 Jones-Humble SA, Morgan PF, Cooper BR. The novel anticonvulsant lamotrigine prevents dopamine depletion in C57 black mice in the MPTP animal model of Parkinson's disease. Life Sci. 1994;54(4):245-52. 138 Tate SS, Meister A. gamma-Glutamyl transpeptidase: catalytic, structural and functional aspects. Mol Cell Biochem. 1981 Sep 25;39:357-68. 139 Zeevalk GD, Nicklas WJ. Mechanisms underlying initiation of excitotoxicity associated with metabolic inhibition. J Pharmacol Exp Ther. 1991 May;257(2):8708. 140 Christopherson KS, Hillier BJ, Lim WA, Bredt DS. PSD-95 assembles a ternary complex with the N-methyl-D-aspartic acid receptor and a bivalent neuronal NO synthase PDZ domain. J Biol Chem. 1999 Sep 24;274(39):27467-73. 141 Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys. 1991 Aug 1;288(2):481-7. 142 Salgo MG, Bermudez E, Squadrito GL, Pryor WA. Peroxynitrite causes DNA damage and oxidation of thiols in rat thymocytes [corrected] Arch Biochem

80

IRODALOMJEGYZÉK

Biophys. 1995 Oct 1;322(2):500-5. Erratum in: Arch Biochem Biophys 1995 Dec 1;324(1):200. 143 Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. J Biol Chem. 1991 Mar 5;266(7):4244-50. 144 Alvarez B, Rubbo H, Kirk M, Barnes S, Freeman BA, Radi R. Peroxynitritedependent tryptophan nitration. Chem Res Toxicol. 1996 Mar;9(2):390-6. 145 Ischiropoulos

H,

al-Mehdi

AB.

Peroxynitrite-mediated

oxidative

protein

modifications. FEBS Lett. 1995 May 15;364(3):279-82. 146 van der Vliet A, Eiserich JP, Kaur H, Cross CE, Halliwell B. Nitrotyrosine as biomarker for reactive nitrogen species. Methods Enzymol. 1996;269:175-84. 147 Schulz JB, Matthews RT, Muqit MM, Browne SE, Beal MF. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 7-nitroindazole protects against MPTP-induced neurotoxicity in mice. J Neurochem. 1995 Feb;64(2):936-9. 148 Ara J, Przedborski S, Naini AB, Jackson-Lewis V, Trifiletti RR, Horwitz J, Ischiropoulos H. Inactivation of tyrosine hydroxylase by nitration following exposure

to

peroxynitrite

and

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

(MPTP). Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jun 23;95(13):7659-63. 149 Ferrante RJ, Hantraye P, Brouillet E, Beal MF. Increased nitrotyrosine immunoreactivity in substantia nigra neurons in MPTP treated baboons is blocked by inhibition of neuronal nitric oxide synthase. Brain Res. 1999 Mar 27;823(12):177-82. 150 Klivenyi P, Andreassen OA, Ferrante RJ, Lancelot E, Reif D, Beal MF. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase protects against MPTP toxicity. Neuroreport. 2000 Apr 27;11(6):1265-8. 151 Przedborski S, Jackson-Lewis V, Yokoyama R, Shibata T, Dawson VL, Dawson TM. Role of neuronal nitric oxide in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced dopaminergic neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 May 14;93(10):4565-71.

81

IRODALOMJEGYZÉK

152 Itzhak Y, Martin JL, Ali SF. Methamphetamine- and 1-methyl-4-phenyl- 1,2,3, 6tetrahydropyridine-induced dopaminergic neurotoxicity in inducible nitric oxide synthase-deficient mice. Synapse. 1999 Dec 15;34(4):305-12. 153 De Vito MJ, Wagner GC. Methamphetamine-induced neuronal damage: a possible role for free radicals. Neuropharmacology. 1989 Oct;28(10):1145-50. 154 Cadet JL, Sheng P, Ali S, Rothman R, Carlson E, Epstein C. Attenuation of methamphetamine-induced neurotoxicity in copper/zinc superoxide dismutase transgenic mice. J Neurochem. 1994 Jan;62(1):380-3. 155 Imam SZ, Ali SF. Aging increases the susceptiblity to methamphetamine-induced dopaminergic neurotoxicity in rats: correlation with peroxynitrite production and hyperthermia. J Neurochem. 2001 Sep;78(5):952-9. 156 Heales SJ, Bolanos JP, Stewart VC, Brookes PS, Land JM, Clark JB. Nitric oxide, mitochondria and neurological disease. Biochim Biophys Acta. 1999 Feb 9;1410(2):215-28. 157 Lemasters JJ, Qian T, Bradham CA, Brenner DA, Cascio WE, Trost LC, Nishimura Y, Nieminen AL, Herman B. Mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of necrotic and apoptotic cell death. J Bioenerg Biomembr. 1999 Aug;31(4):305-19. 158 Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001 Aug 1;357(Pt 3):593-615. 159 Itzhak Y, Ali SF. The neuronal nitric oxide synthase inhibitor, 7-nitroindazole, protects against methamphetamine-induced neurotoxicity in vivo. J Neurochem. 1996 Oct;67(4):1770-3. 160 Itzhak Y, Martin JL, Ail SF. nNOS inhibitors attenuate methamphetamine-induced dopaminergic neurotoxicity but not hyperthermia in mice. Neuroreport. 2000 Sep 11;11(13):2943-6. 161 Sanchez V, Zeini M, Camarero J, O'Shea E, Bosca L, Green AR, Colado MI. The nNOS inhibitor, AR-R17477AR, prevents the loss of NF68 immunoreactivity induced by methamphetamine in the mouse striatum. J Neurochem. 2003 Apr;85(2):515-24. 162 Imam SZ, Newport GD, Itzhak Y, Cadet JL, Islam F, Slikker W Jr, Ali SF. Peroxynitrite

plays

a

role

in

methamphetamine-induced

dopaminergic

82

IRODALOMJEGYZÉK

neurotoxicity: evidence from mice lacking neuronal nitric oxide synthase gene or overexpressing

copper-zinc

superoxide

dismutase.

J

Neurochem.

2001

Feb;76(3):745-9. 163 Itzhak Y, Martin JL, Ali SF. Methamphetamine- and 1-methyl-4-phenyl- 1,2,3, 6tetrahydropyridine-induced dopaminergic neurotoxicity in inducible nitric oxide synthase-deficient mice. Synapse. 1999 Dec 15;34(4):305-12. 164 Imam SZ, Crow JP, Newport GD, Islam F, Slikker W Jr, Ali SF. Methamphetamine generates peroxynitrite and produces dopaminergic neurotoxicity in mice: protective effects of peroxynitrite decomposition catalyst. Brain Res. 1999 Aug 7;837(1-2):15-21. 165 Szoko E, Haberle D, Halasz AS, Tekes K, Magyar K. Protective effect of 7nitroindazole

against

DSP-4

induced

noradrenaline

depletion

in

mouse

hippocampus. J Neural Transm. 2001;108(4):407-13 166 Pou S, Pou WS, Bredt DS, Snyder SH, Rosen GM. Generation of superoxide by purified brain nitric oxide synthase. J Biol Chem. 1992 Dec 5;267(34):24173-6 167 Pou S, Keaton L, Surichamorn W, Rosen GM. Mechanism of superoxide generation by neuronal nitric-oxide synthase. J Biol Chem. 1999 Apr 2;274(14):9573-80. 168 Vasquez-Vivar J, Hogg N, Martasek P, Karoui H, Pritchard KA Jr, Kalyanaraman B. Tetrahydrobiopterin-dependent inhibition of superoxide generation from neuronal nitric oxide synthase. J Biol Chem. 1999 Sep 17;274(38):26736-42. 169 Kannurpatti SS, Joshi NB. Energy metabolism and NAD-NADH redox state in brain slices in response to glutamate exposure and ischemia. Metab Brain Dis. 1999 Mar;14(1):33-43. 170 Al-Ali AK. Pyridine nucleotide redox potential in erythrocytes of saudi subjects with sickle cell disease. Acta Haematol. 2002;108(1):19-22. 171 Wahlberg G, Adamson U, Svensson J. Pyridine nucleotides in glucose metabolism and diabetes: a review. Diabetes Metab Res Rev. 2000 Jan-Feb;16(1):33-42.

83

IRODALOMJEGYZÉK

172 Huang

NK,

Wan

FJ,

Tseng

CJ,

Tung

CS.

Nicotinamide

attenuates

methamphetamine-induced striatal dopamine depletion in rats. Neuroreport. 1997 May 27;8(8):1883-5. 173 Stephans SE, Whittingham TS, Douglas AJ, Lust WD, Yamamoto BK. Substrates of energy metabolism attenuate methamphetamine-induced neurotoxicity in striatum. J Neurochem. 1998 Aug;71(2):613-21. 174 Cosi C, Marien M. Implication of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in neurodegeneration and brain energy metabolism. Decreases in mouse brain NAD+ and ATP caused by MPTP are prevented by the PARP inhibitor benzamide. Ann N Y Acad Sci. 1999;890:227-39. 175 Nicklas WJ, Vyas I, Heikkila RE. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 1985 Jul 1;36(26):2503-8. 176 Adams JD Jr, Klaidman LK, Chang ML, Yang J. Brain oxidative stress--analytical chemistry and thermodynamics of glutathione and NADPH. Curr Top Med Chem. 2001 Dec;1(6):473-82. 177 Arrigo AP. Gene expression and the thiol redox state. Free Radic Biol Med. 1999 Nov;27(9-10):936-44. 178 Sen CK. Nutritional biochemistry of cellular glutathione. J Nutr Biochem. 1997 Dec;8(12):660-72. 179 Moszczynska A, Turenne S, Kish SJ. Rat striatal levels of the antioxidant glutathione are decreased following binge administration of methamphetamine. Neurosci Lett. 1998 Oct 9;255(1):49-52. 180 Harold C, Wallace T, Friedman R, Gudelsky G, Yamamoto B. Methamphetamine selectively alters brain glutathione. Eur J Pharmacol. 2000 Jul 14;400(1):99-102. 181 Cosi C, Marien M. Decreases in mouse brain NAD+ and ATP induced by 1methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): prevention by the poly(ADPribose) polymerase inhibitor, benzamide. Brain Res. 1998 Oct 26;809(1):58-67. 182 Asanuma M, Hayashi T, Ordonez SV, Ogawa N, Cadet JL. Direct interactions of methamphetamine with the nucleus. Brain Res Mol Brain Res. 2000 Sep 15;80(2):237-43

84

IRODALOMJEGYZÉK

183 Gius D, Botero A, Shah S, Curry HA. Intracellular oxidation/reduction status in the regulation of transcription factors NF-kappaB and AP-1. Toxicol Lett. 1999 Jun 1;106(2-3):93-106. 184 Flora G, Lee YW, Nath A, Maragos W, Hennig B, Toborek M. Methamphetamineinduced TNF-alpha gene expression and activation of AP-1 in discrete regions of mouse brain: potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation. Neuromolecular Med. 2002;2(1):71-85. 185 Deng X, Ladenheim B, Tsao LI, Cadet JL. Null mutation of c-fos causes exacerbation of methamphetamine-induced neurotoxicity. J Neurosci. 1999 Nov 15;19(22):10107-15. 186 Pontieri FE, Crane AM, Seiden LS, Kleven MS, Porrino LJ. Metabolic mapping of the effects of intravenous methamphetamine administration in freely moving rats. Psychopharmacology (Berl). 1990;102(2):175-82. 187 Kirsch M, De Groot H. NAD(P)H, a directly operating antioxidant? FASEB J. 2001 Jul;15(9):1569-74.

85