A neutrofil granulociták és monociták fagocitózis indexe egészséges és preeclampsiás terhességben Kövér Ágnes ÁOK VI. évfolyam Debreceni Egyetem Klinikai Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Lampé Rudolf
A preeclampsia 1.
A humán terhesség legveszélyesebb megbetegedése
Terhesség specifikus, multiszisztémás
Világszerte vezető oka az anyai és magzati morbiditásnak és mortalitásnak
A preeclampsia és az eclampsia évente az anyai halálesetek körülbelül 14%-áért felelős, ami 50000-75000 nőt érint
A preeclampsia 2.
Korábban egészséges nők terhességének 20. hete után kialakuló hypertonia és proteinuria
Terhességi magas vérnyomás: •
legalább kétszer mért 140/90 Hgmm feletti érték esetén
Fehérjevizelés (>300 mg/nap)
A terhesség okozza, közvetlen oka nem ismert, de az utóbbi időben egyre inkább a károsodott anyai immunfunkció kerül előtérbe
Hajlamosító tényezők
Életkor
Elhízás
Első terhesség
Ikerterhesség
Cukorbetegség
Vesebetegség
Korábban megállapított magas vérnyomás
Genetikai háttér (protein C, protein S, antitrombin deficienciák, Leiden mutáció)
Szövődményei 1. Magzati szövődmények
2. Anyai szövődmények
Koraszülés
Görcs (eclampsia)
Tartós méhen belüli oxigénhiány
HELLP szindróma
Magzati retardáció
Lepényleválás
Halál
Veseelégtelenség
Tüdővizenyő
Májelégtelenség Stroke Halál
A preeclampsia pathogenezise
A gyulladás központi szerepe.
Tüneteinek megjelenése előtt megfigyelhető a károsodott vaszkuláris endothel funkció.
A gyulladásos stimulus kialakításához: a nem megfelelő placentáció okozta hipoxia – trofoblaszt mikropartikulumok útján – gyulladás és endothel diszfunkció másik lehetséges okozója, az infekció is nagy valószínűséggel részt vesz a preeclampsia etiológiájában.
A trofoblaszt mikropartikulumok és az infekciót okozó mikróbák eliminálásában fontos szerepe van a fagocitózisra képes fehérvérsejteknek.
Mikropartikulumok szerepe
Egészséges terhesség során is, de preeclampsiában szignifikánsan nagyobb mennyiségű syntitiotrophoblast mikropartikulum (STMP) jut az anyai vérkeringésbe
Kísérletesen bizonyított, hogy preeclampsiában ezen mikropartikulumok endothélsejt diszfunkciót okoznak
Nem tisztázott, hogy a mikropartikulumok eliminálása hogyan történik, de a fagocita funkció jelentős szerepet játszhat benne
Fagocita funkció
A fagocitózis olyan folyamat, melynek során az erre képes fehérvérsejtek (pl. neutrofil granulociták, monociták) részecskéket kebeleznek be.
A fagocitózis funkciója kettős: egyrészt a bekebelezett mikróbák elpusztítása – effektor funkció, másrészt kapocs a veleszületett és szerzett immunitás között. Lizoszóma Partikulum Aktin filamentum Fagolizoszóma
Fagoszóma Opszonin
Stern et al.: Particle and Fibre Toxicology 2012, 9:20
Lizoszóma
Monociták szerepe
Anyai és magzati vérben is jelen vannak, szerepet játszanak a preeclampsiában megfigyelhető megnövekedett vaszkuláris rezisztenciában.
Nagy mennyiségben termel gyulladásos citokineket (pl.:IL-6, IL-8).
A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit- Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.
Granulociták szerepe
Perifériás vérben aktiválódnak, az endothel-diszfunkció okozói
Oxidatív stressz indukálta gyulladásos folyamatok
Szuperoxid-anion termelés (nem csökken le, ellentétben az egészséges terheseknél mért értékkel)
A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit: Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.
Tudományos előzmények, célkitűzés
Egészséges terhességben és preeclampsiában a fehérvérsejtek fagocita funkciójának jellemzésére nincs ismert irodalmi adat.
Célunk volt mind egészséges terhességben, mind preeclampsiában a fagocita funkció megfigyelése neutrophil granulocitákban és monocitákban.
Egészséges terhesség fiziológiájának és preeclampsia pathofiziológiájának jobb megismerése.
Vizsgált betegek
Egészséges, nem terhes (n=20) hasonló életkorúak és testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek
Egészséges terhes (n=25) hasonló életkorúak, gesztációs korúak, testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek
Preeclampsiás (n=25) vérnyomásuk egyenlő, vagy nagyobb, mint 140/90 Hgmm, egy nap kétszer mérve, min. 6 óra különbséggel, valamint vizeletük fehérjetartalma több, mint 0,3 gramm/24 óra
Vizsgálatban résztvevő személyek klinika adatai Nem terhesek (n=20)
Egészséges terhesek (n=25)
Preeclampsiások (n=25)
P érték
Életkor Gestatios kor a vérvételkor (hét) Gestatios kor a szüléskor (hét)
29,1 3,2
29,0 5,2
29,3 3,4
>0,05
NA
36,4 1,2
36,1 0,9
0,05
NA
40,4 1,7
37,6 2,6
<0,01*
Terhesség előtti BMI (kg/m2)
NA
23,3 1,2
24,2 1,7
0,05
BMI a szüléskor (kg/m2) Paritás a Systolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) Diastolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) Újszülött súlya (gramm) Proteinuria a vérvételkor (vizeletben kereszt) a
21,2 2,5 NA
24,9 1,5 0 (0-2)
29,8 1,3 0 (0-2)
<0,05* 0,05
106,5 6,1
108,9 7,4
148,9 7,9
<0,001*
66,9 5,4
70,9 7,3
100,7 7,4
<0,001*
NA
3578 526,5
3030 710,1
<0,01*
0 (0-0)
0 (0-0)
2 (1-3)
<0,001*
a
Az értékek átlagot jelölnek (tartomány). BMI= testtömeg-index (kg/m2). NA: nem értelmezhető. *szignifikáns különbség egészséges terhesek és preeclampsiás terhesek között.
A vizsgálat menete 1. Fehérvérsejt szeparálás • Plazma • PMNLs • Ficoll 1.077 g/cm³ centrifugálás 24˚C 400 G 30 min
• Ficoll 1,110g/cm³ • PMNLs • Vvt. PMNLs: polimorfonukleáris sejtek: monocita, granulocita; Vvt: vörösvértest
2. Sejtek kitapasztása
Sejttenyésztő kamra: granulocyták és monocyták kitapasztása
Sejttenyésztő kamra
3. Zymosan hozzáadása és fixálás
Zymosan A hozzáadása, mely jelölve van fluorescein- isothiocyanate-tal(FITC)
Opszonizált fagocitózist indukál
Sejtek fixálása tárgylemezre 4%-os Paraformaldehid oldattal Paraformaldehid oldat
4. Festés 4.1 Granulocyták festése
DAPI-t tartalmazó fedőmédiummal sejtmagok festése (DAPI: 4’6’-diamidino-2-fenilindol)
4.2 Monocyták festése
Kettős antitest jelölés (indirekt):
A monocita specifikus antitestet (egérben termeltetett) anti humán CD 14+
Egér IgG ellenes fluoreszcensen jelölt (Texas Red) másodlagos antitest
Fedés
5.Kiértékelés Kiértékelés: Fluoreszcens mikroszkóppal történt
Fagocitózis index=
Fagocitált részecskék száma 100
Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikanciaszint: p<0,05
Granulociták
Egészséges nem terhes (kontroll)
Egészséges terhes
Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: granulociták sejtmagja
Preeclampsiás
Monociták
Egészséges nem terhes (kontroll)
Egészséges terhes
Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: monociták sejtmagja; piros: monociták sejthártyája
Preeclampsiás
Neutrofil granulociták fagocitózis indexe 5
* p<0,001 (b vs. a)
* Fagocitózis index
4
# p<0,001
(c vs. b, c vs. a)
# 3 Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes
2
1
0
a
b
c
Monociták fagocitózis indexe 5
* p<0,001 (b vs. a)
*
Fagocitózis index
4
# p<0,001
(c vs. b, c vs. a)
#
3
Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes
2
1
0
a
b
c
Konklúzió I.
Egészséges terhességben mindkét vizsgált fehérvérsejt típus fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges nem terhes kontrollokéhoz képest.
Ez egy védekező mechanizmus lehet a magzat, mint hemiallograft érdekében, az anyai immunszuppresszió jeleként.
Magyarázatot adhat arra a jelenségre, hogy egészséges terhességben az anyai fertőzések nagyobb számban fordulnak elő, mint nem terhesekben; illetve a fertőzések lefolyása súlyosabb.
Konklúzió II.
Preeclampsiás betegeknél mind neutrofil granulociták, mind monociták esetében a sejtek fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges terhesek és egészséges nem terhesek fagocita funkciójához viszonyítva.
A preeclampsiában mért csökkent fagocita funkció része lehet a kórkép immunregulációs zavarának.
A keringő STMP-k eliminálása ezáltal zavart szenvedhet, így azok kifejthetik károsító hatásukat az endothel sejtekre, következményes endothel diszfunkciót okozva, ami a preeclampsiára jellegzetes szisztémás endothelsejt károsodást kialakíthatja.
Köszönetnyilvánítás
Dr. Lampé Rudolf
Prof. Dr. Póka Róbert
Prof. Dr. Ádány Róza
DE Megelőző Orvostani Intézet dolgozóinak: Dr. Szűcs Sándor
Dr. Pál László Dr. Árnyas Ervin
Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
Függelék A bemutatott eredmények közül önállóan végeztem az alábbiakat:
Fehérvérsejtek szeparálása, kitapasztása (neutrofil granulociták, monociták)
Kezelés zymosan-nal (opszonizált fagocitózist utánozza, jelölve van fluoresceinisothiocyanate-tal)
Sejtek festése (DAPI-sejtmag, monociták - Kettős AB jelölés: monocita specifikus antitestet, azaz anti humán CD 14+ és IgG ellenes antitest Texas Red fluoreszcens festékkel van konjugáltatva, ami anti CD14-hez kötődik)
Kiértékelés: fagocitózis index: fagocitált részecskék száma/100
Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikancia szint: p<0,05
Előadás, táblázatok és diagramok készítése
A részt vevő személyek klinika adatainak gyűjtése
