PANNON EGYETEM, GEORGIKON KAR KESZTHELY NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
A MACROPHOMINA PHASEOLINA KÁROSÍTÁSÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZİK VIZSGÁLATA ELTÉRİ GAZDA-PARAZITA KAPCSOLATOKBAN KÉSZÍTETTE: CSÖNDES IZABELLA okleveles agrármérnök
TÉMAVEZETİ: Dr. GÁBORJÁNYI RICHARD egyetemi tanár, az MTA doktora
TÁRSTÉMAVEZETİ: Dr. KADLICSKÓ SÁNDOR nyugalmazott egyetemi docens, mezıgazdasági tudományok kandidátusa
Keszthely 2009
1. A kutatómunka elızményei és célkitőzései Az olajnövények közül hazánk ökológiai adottságai elsısorban a napraforgó és a repce termesztésére alkalmasak. Napjainkban a napraforgót 400.000-500.000 hektáron termesztik, átlag 1,8 t/ha terméssel. Magyarországon jelenleg a biztonságos napraforgó termesztést a különbözı gombafajok által elıidézett betegségek határozzák meg. A napraforgót húsznál több kórokozó támadhatja meg, amelyek közül öt faj képes a teljes kár elıidézésére is. Ezek közül az egyik a napraforgó hamuszürke szárkorhadás a kórokozója, a Macrophomina phaseolina (=M. phaseolina). Ez a gomba polifág, több mint 500 gazdanövénye ismert. Kedvezı számára a száraz, meleg, aszályos idıjárás. Az utóbbi években egyre nagyobb jelentıséggel bír, a 2007-es év egyértelmően a M. phaseolina éve volt hazánkban. A kórokozó károsításának eredménye teljes növénypusztulás vagy minıségi és mennyiségi termésveszteség lesz. Betakarítás után a fertızıdött szárral a gomba mikroszkleróciumainak milliói kerülnek a talajba, ahol akár tíz évig is megırzik életképességüket. A mikroszkleróciumok hosszú élettartama és a sokféle gazdanövény magyarázza, hogy rendkívül nehéz a védekezés a kórokozó ellen. A rezisztencianemesítés eddig nem vezetett eredményre és a vegyszeres védekezés sem adott kielégítı eredményt. Ugyanakkor számolni kell azzal is, hogy a gomba populációiban olyan változások zajlanak le, amelyek a fertızıképesség hirtelen felerısödését okozzák, ami robbanásszerő járványok kialakulásához vezethet. Bár évtizedek óta ismert a kórokozó hazai elıfordulása, mégis több kérdés tisztázatlan még a M. phaseolina-val kapcsolatban. Tudomásunk szerint az elmúlt években, évtizedekben nem vizsgálták részletesen a Magyarország különbözı termıhelyein elıforduló gomba populációit, és csak részben a növényfajok és azok fajtáinak, hibridjeinek gomba iránti
2
magatartását, elsısorban a megfelelı anyagi háttér hiánya miatt. A kórokozó hazai elterjedésével, fiziológiai, morfológiai és patogenitási tulajdonságaival, genetikai hátterével kapcsolatos ismereteink bıvítése érdekében végeztünk kísérleteket a M. phaseolina-val. Ennek megfelelıen munkánk során az alábbi célokat tőztük ki:
• magyarországi termıhelyekrıl származó M. phaseolina izolátumok győjtése;
• in vitro körülmények között az izolátumok növekedésének tanulmányozása eltérı hımérséklet, pH és táptalaj függvényében, hogy ezáltal alkalmunk nyíljon az izolátumok fenotípusos összehasonlítására; • az izolátumok mikro- és makromorfológiai jellemzése; • kapcsolat teremtése az összes izolátum között Petricsészében, hogy megtudjuk, mely helyekrıl származó izolátumok mutatnak micéliális kompatibilitást, ezáltal is jellemzve a kórokozó változékonyságát; • az UV-C sugárzás M. phaseolina micélium növekedésére és mikroszklerócium képzésére gyakorolt hatásának vizsgálata; • RAPD és PCR-RFLP alkalmazása az izolátumok közti genetikai távolságok feltárására, illetve a genetikai különbségek megállapítására, továbbá annak felderítése, hogy a gomba növekedésében kapott fenotípusosan megnyilvánuló különbségek igazolhatóak-e genetikailag; • tenyészedényes vizsgálatban hazai M. phaseolina izolátumokkal olyan növényfajok csírakori fogékonyságának, illetve ellenállóságának elemzése, amelyek a gomba gazdanövényeként eddigi szakirodalmi adatok alapján nem ismeretesek; • a M. phaseolina izolátumok patogenitásának vizsgálata üvegházi körülmények között, napraforgó és paprika növényen, a növények kelési, szárhossz, szártömeg, gyökérhossz és gyökértömeg eredményeit alapul véve.
3
2. Anyag és módszer 2. 1. Laboratóriumi vizsgálatok 2. 1. 1. Klasszikus mikológiai vizsgálatok Klasszikus mikológiai vizsgálatainkat az 53 M. phaseolina izolátum fenotípusos jellemzéséhez Keszthelyen, a Pannon Egyetem Növényvédelmi Intézet növénykórtani laboratóriumában végeztük. Klasszikus mikológiai
vizsgálataink során összesen megközelítıleg 5000 db Petri-csészét használtunk. 2. 1. 1. 1. A hımérséklet, a táptalaj és a pH hatásának vizsgálata a micélium növekedésére és a mikroszkleróciumok képzésére Ötvenhárom M. phaseolina izolátum micélim növekedését és mikroszklerócium képzıdését mértük 10, 15, 20, 25, 30, 35 és 40 °C-on, 2,0-9,0 közötti pH tartományban, valamint burgonya-dextróz agar, Czapek-Dox agar, kukorica-liszt agar, maláta-extrakt agar, Sabouraud-glükóz agar és vizes agar táptalajok esetén. A hımérséklet, a táptalaj és a pH hatását a patogén növekedésére négyszeres ismétlésben vizsgáltuk. A gombatenyészetek telepátmérıjét mindhárom esetben az oltástól számított 3., 5. és 6. napon mértük. Az eredmények statisztikai értékeléséhez Microsoft Excel 2003 programcsomag segítségével egytényezıs varianciaanalízist és szignifikáns differenciaszámítást alkalmaztunk. 2. 1. 1. 2. Morfológiai- és tenyészbélyegek meghatározása A kórokozó makro- és mikromorfológiai jellemzıit burgonya-dextróz agar, Czapek-Dox agar, kukorica-liszt agar, maláta-extrakt agar, Sabouraud-glükóz agar és vizes agar
4
táptalajokon vizsgáltuk. A telepmorfológiai bélyegeket az oltástól számított 6. napon jegyeztük fel. A mikroszkleróciumok méreteinek vizsgálatához mind a hat táptalajra oltott összes tenyészetbıl az inokulálástól számított 7. napon kezelésenként 60-60 db mikroszklerócium átmérıjét mértük Ergawal fénymikroszkóppal, 64-szeres nagyításnál. Ez összesen 19080 darab mikroszklerócium mérését jelentette. A mikroszkleróciumok telepben való sőrőségének megállapításához okulár mikrométerrel egy általunk egységnyinek (281250 µm2) vett látótérben elıforduló mikroszkleróciumokat számoltuk meg. 2. 1. 1. 3. Micélium kompatibilitás vizsgálat Vizsgálatunk során ahhoz, hogy megtudjuk, mely helyekrıl származó izolátumok mutatnak micélium kompatibilitást, Petri-csészénként 3 izolátumot oltottunk egymás mellé. Az inokulálástól számított 7. napon kompatibilis kapcsolatot állapítottunk meg, ha az izolátumok micéliumai össze tudtak nıni oly módon, hogy határuk nem látszott, hanem egy telepet alkottak. Inkompatibilisnek ítéltük az izolátumok közötti kapcsolatot, ha a tenyészetek között gátlási zóna alakult ki. Az inokulálácókat az izolátumok minden lehetséges kombinációjában elvégeztük. 2. 1. 1. 4. UV-C sugárzás hatásának vizsgálata a micélium növekedésére és a mikroszkleróciumok képzésére Az UV fénnyel való besugárzáshoz 125 W-os Hg gız töltéső lámpát használtunk, a fény nagy részben 254 nm hullámhosszú volt. A fényforrás és a tenyészetek közti távolság 60 cm volt. A morfogenetikai hatást kiváltó elnyelt dózis a sugárzás intenzitásának és a besugárzás idıtartamának a szorzata, ezért a különbözı dózisok beállítására a besugárzás idıtartamát változtattuk. A tenyészetek a leoltás után 48 órával kapták az
5
elsı 30 perces megvilágítást, majd 48 óránként feleztük a besugárzás idıtartamát. A tenyészeteket összesen hatszor sugároztuk be 0,9 mW/cm2 intenzitású UV fénnyel. Ennek megfelelıen a dózisok a következık voltak: 1,62, 0,81, 0,41, 0,20, 0,10, 0,05 J/cm2. A tenyészetek átmérıit minden besugárzás elıtt mértük a Petri-csésze alján húzott, két, egymásra merıleges átló mentén. 2. 1. 2. Molekuláris genetikai vizsgálatok Molekuláris genetikai vizsgálatainkat a Növénytudományi és Biotechnológia Tanszék laboratóriumában végeztük. A M. phaseolina izolátumok közötti rokoni kapcsolat felderítése céljából RAPD és mitokondrium PCR-RFLP vizsgálatot hajtottunk végre. Ezek a módszerek jól mutatják az izolátumok közötti polimorfizmusokat. 2. 1. 2. 1. RAPD analízis A DNS-kivonáshoz a M. phaseolina 48 izolátumának 7 napos tenyészeteibıl 5 mg kaparékot szedtünk, majd folyékony nitrogénben porítottuk. A genomi DNS-t a Gentra Genomic DNA Purification Kittel izoláltuk. A 48 M. phaseolina izolátum DNS polimeráz-láncreakción (PCR) alapuló RAPD-módszerrel történı felszaporításához 20 random 12-mer primerpárt használtunk. A 20 µl végtérfogatú PCR-elegy összetétele mintánként a következı volt: 50 ng DNS, 2 µl 10XPCR puffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 100 µM mindegyik dNTPbıl, 0,2 µM mindkét primerbıl és 0,5 egység DynaZyme DNS polymeráz. A felszaporítás Robocycler készülékkel történt, a következı program szerint: denaturáció 94 oC-on 3 percig; egymást követı 35 ciklus, mely ciklusonként 94 oC-on 30 másodpercig, 37 oC-on 1 percig, 72 oC-on 2 percig tartott; záró inkubáció 72 oC-on 10 percig. Mintánként a 15 µl PCR
6
termékeket 1.5%-os agarózgélben választottuk szét, 0,5X TBE pufferben, 300 V-on, 90 percen keresztül. A mintázatot etídium bromiddal festettük és UV megvilágításnál GeneGenius gél dokumentációs rendszerrel fényképeztük. A kapott termékek méretét párhuzamosan futtatott 50 bp, 100bp és 1 Kbp mérető DNS (marker)„létra” segítségével és a GeneTools számítógépes program használatával határoztuk meg. Az adatelemzés során a reprodukálható
fragmentumokat vettük figyelembe. Ezek meglétét (1) vagy hiányát (0) értékeltük, majd a kapott adatokat elemeztük. Súlyozatlan csoportátlag módszerrel klaszteranalízist végeztünk és az értékelés során dendrogramot szerkesztettünk. Az adatokat 1000 ismétléses bootstrap analízisnek vetettük alá. 2. 1. 2. 2. ITS felszaporítás és PCR-RFLP Az LR5 és az ITS5 PCR primereket használtunk az rDNS ITS régió felszaporításához. Az LR5 és ITS5 primerekkel végzett PCR program megegyezett a RAPD analízisnél alkalmazottal. Ezt követıen 10 µL PCR terméket emésztettünk 10 unit mennyiségő BstU I, EcoR I, Hae III, Hinf I, Mbo I, Msp I, Rsa I és Taq I restrikciós endonukleázokkal a gyártó elıírásai szerint. A gélelektroforézis és a géldokumentáció megegyezett a RAPD analízisnél leírtakkal. 2. 2. Tenyészedényes vizsgálatok Tenyészedényes vizsgálatainkat Keszthelyen, a Pannon Egyetem Növényvédelmi Intézet üvegházában végeztük, melynek során összesen 892 darab tenyészedényt használtunk. 2. 2. 1. Gazdanövénykör vizsgálat A M. phaseolina-val szembeni csíranövénykori fogékonyságot, illetve ellenállóságot 39 növényfajon
7
vizsgáltuk három földrajzilag egymástól távol levı és eltérı gazdanövényrıl származó magyarországi M. phaseolina izolátumot használva. Növényfajonként 15-15 magot helyeztünk 3 napos gombatenyészetet tartalmazó, 9 cm-es Petri-csészékbe, majd azokat 20°C-os, sötét termosztátban egy hétig inkubáltuk. Ezután a magvakat – gombatenyészetekkel együtt – 1 literes tenyész-edényekbe, majd üvegházba tettük. A gomba károsító hatását 5 hét elteltével vizsgáltuk. 2. 2. 2. Patogenitás-vizsgálat Ötvenhárom M. phaseolina izolátum patogenitását mértük fel 5049A jelő napraforgó vonal és Belecskai paprikafajtán. Növényfajonként 10-10 magot helyeztünk 3 napos M. phaseolina tenyészetet tartalmazó 9 cm-es Petri-csészékbe, majd azokat 20°C-os, sötét termosztátban egy hétig inkubáltuk. Ezután a magvakat – gombatenyészetekkel együtt – 1 literes tenyészedényekbe, majd üvegházba tettük. A növények kelését, a kialakult tüneteket, továbbá száruknak, illetve gyökerüknek a hosszát és tömegét napraforgó esetében 7 hét, paprikánál 12 hét elteltével állapítottuk meg.
3. Új tudományos eredmények 1. In vitro vizsgálatok során értékeltük az egyes M. phaseolina izolátumok micélium növekedését és mikroszklerócium képzıdését 10-40 ºC hımérséklet és 2,0-9,0 pH tartományban, valamint hat táptalaj (burgonya-dextróz agar, Czapek-Dox agar, kukorica-liszt agar, maláta-extrakt agar, Sabouraud-glükóz agar, vizes agar táptalajok) esetén. Elsıként megállapítottuk, hogy a különbözı régiókból származó hazai M. phaseolina izolátumok milyen fenotípusos különbségeket mutattak az egyes hımérsékletek, az eltérı kémhatás és a hat különbözı táptalaj függvényében.
8
2. A táptalajok hatásának vizsgálatában helyet kapott a vizes agar táptalaj is, hogy megtudjuk, képes-e növekedni a gomba tápanyagszegény körülmények között. Elsıként mutattuk ki a M. phaseolina növekedésének lehetıségét ezen a táptalajon, ami a kórokozó nagy ökológiai tőrıképességére utal. Egyetlen izolátum, a Mp 38 esetében megfigyeltük, hogy a gomba növekedése közben a SGA táptalajt halványpirosra színezte el. 3. Elsıként vizsgáltuk Magyarországon a M. phaseolina izolátumok micéliumainak kompatibilitását. Megállapítottuk, hogy izolátumaink többnyire kompatibilisek egymással, továbbá az izolátumok összes lehetséges párosításából csupán 24 esetben tapasztaltunk inkompatibilis kapcsolatot. Ezek közül a legtöbb esetben a Mp 34 volt inkompatibilis más izolátumokkal, ami részben az izolátum különbözıségét jelzi. 4. Bizonyosságot szereztünk a felıl, hogy a távoli UV sugárzás negatív hatással van a micélium növekedésére és a mikroszkleróciumok képzıdésére. Az 1,62 J/cm2 dózisú UV-C sugárzás szignifikánsan csökkentette a M. phaseolina tenyészetekben a micélium és a mikroszkleróciumok alkotta telepátmérıt, a kontrollhoz képest. Összefüggésvizsgálatokkal statisztikailag igazoltuk, hogy a besugárzás dózisának csökkenésével emelkedett a gomba növekedésének mértéke. Új adatnak számít, hogy az 1,62 J/cm2 dózisú UV-C sugárzás a Mp 1, a Mp 10, a Mp 19, a Mp 22 és a Mp 24 izolátumok mikroszklerócium képzését 48 órára gátolta. 5. A M. phaseolina izolátumok molekuláris genetikai vizsgálatát hazánkban elsıként kezdtük el. A RAPD vizsgálat eredményezte dendrogram formájában jellemeztük az izolátumok genetikai távolságát, ami megerısítette az izolátumok morfológiai alapon történt elkülönülését. A dendrogram szerint izolátumaink genetikailag 4 csoportba tartoztak. Bizonyítottuk, hogy a gomba izolátumainak fenotípusos tulajdonságaiban megnyilvánuló különbségei
9
igazolhatóak genetikailag. Megállapítottuk, hogy a Mp 34, a Mp 38 és a Mp 45 izolátumok nemcsak fenotípusosan, hanem genetikailag is nagy variabilitást mutattak. 6. A mitokondriális DNS PCR-RFLP elemzését elsıként alkalmaztuk hazánkban M. phaseolina izolátumok genetikai eltéréseinek megállapítása céljából. A vizsgált nyolc restrikciós enzim közül az EcoR I és a Taq I enzimekkel monomorf, a BstU I, a Hae III, a Hinf I, az Mbo I, az Msp I és az Rsa I enzimekkel polimorf restrikciós mintázatot kaptunk. A feltárt különbségek alapján az ITS felszaporításán alapuló PCR-RFLP módszert a M. phaseolina esetében alkalmasnak találtuk a polimorfizmus kimutatására. 7. Magyarországon elsıként közöltünk adatokat 39 olyan növényfaj M. phaseolina-val szembeni csíranövénykori fogékonyságáról, illetve ellenállóságáról, amelyek a gomba gazdájaként eddigi szakirodalmi adatok alapján nem ismeretesek. Vizsgálataink során bizonyítottuk, hogy 2 növényfaj (Phytolacca americana, Aegilops cylindrica) ellenálló a gombával szemben, 5 növényfaj (Amaranthus caudatus, Apera spica-venti, Lepidium sativum, Spergula arvensis, Trifolium hybridum) kifejezetten fogékony, 13 közepesen fogékony, 19 pedig kevésbé volt fogékony a kórokozóra. 8. A M. phaseolina patogenitását napraforgó és paprika növényekkel jellemeztük. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a gomba patogenitása növényfajonként és növényi szervenként (szár, gyökér) eltérı. Statisztikailag bizonyítottuk, hogy a gomba napraforgón és paprikán mutatott patogenitása között nincs összefüggés. Megállapítottuk, hogy a fertızés hatására csökkent az átlag szárhossz, szártömeg, gyökérhossz és gyökértömeg. Az izolátumok patogenitása tág határok között mozgott, amelyet a kelési eredmények alapján öt
10
csoportba soroltunk. Napraforgón a Mp 35, paprikán a Mp 38 károsított a legnagyobb mértékben.
A
DOKTORI DISSZERTÁCIÓHOZ PUBLIKÁCIÓK, ELİADÁSOK
KAPCSOLÓDÓ
Magyar nyelvő cikkek Csöndes, I. és Kadlicskó, S. (2007): A hımérséklet hatása a Macrophomina phaseolina izolátumok növekedésére. Növényvédelem, 43 (9): 407-413. Fischl, G., Csöndes, I. és Kadlicskó, S. (2008): Az ezüstfenyı (Pinus pungens ENGELM.) vörösödését és pusztulását okozó tényezık vizsgálata. Növényvédelem, 44 (8): 401-402. Magyar nyelvő elıadások Csöndes, I., Balikó, K. és Dégenhardt A. (2006): Különbözı mőtrágyakombinációk hatása a szója [(Glycine max (L.) Merill] Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich fertızöttségére. XVI. Növényvédelmi Fórum, Keszthely. Összefogl. 22-26. Csöndes, I., Kadlicskó, S. és Kovács, J. (2006): Adatok a paprikafajták Macrophomina phaseolina-val szembeni ellenállóságáról. XLVIII. Georgikon Napok, Keszthely, Összefoglalás. 134. Csöndes I. (2007): A Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich-ról röviden. Növényorvosi Kamara ülésén elhangzott elıadás. Fejér Megyei Növényvédelmi Szolgálat, Velence.
11
Csöndes, I. és Kadlicskó, S. (2007): A hımérséklet szerepe a Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich növekedésében. XVII. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, 7-11. Csöndes, I. és Kadlicskó, S. (2007): A Macrophomina phaseolina tenyészthetıségének és mikroszklerócium méretének alakulása különbözı táptalajokon. 53. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, Összefoglalás. 42. Csöndes, I., Kadlicskó, S. és Gáborjányi, R. (2008): A Macrophomina phaseolina új gazdanövényei. XVIII. Növényvédelmi Fórum, Keszthely. 76-81. Idegen nyelvő cikkek Csöndes, I., Kadlicskó, S. and Gáborjányi R. (2006): Growth of Macrophomina phaseolina isolates depend on different temperature. Analele Universitatii din Oradea, 12: 58-62. Csöndes, I., Kadlicskó, S. and Cseh A. (2007): Susceptibility of different pepper varieties to Macrophomina phaseolina in field trials. Cereal Research Communications, 35: 333-336. Csöndes, I., Kadlicskó, S. and Gáborjányi, R. (2007): Effect of different temperature and culture media on the growth of Macrophomina phaseolina. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences. 72 (4): 839-848. Csöndes, I., Balikó, K. and Dégenhardt A. (2008): Effect of different nutrient levels on the resistance of soybean to Macrophomina phaseolina infection in field experiments. Acta Agronomica Hungarica, 56 (3): 357-362.
12
Csöndes, I., Kadlicskó, S. and Gáborjányi, R. (2008): Susceptibility of different plant species to Macrophomina phaseolina. Herbologia, 9: 41-48. Csöndes, I., Kadlicskó, S. and Gáborjányi, R. (2008): A contribution to the host-range of Macrophomina phaseolina. Cereal Research Communications, 36: 1423-1426. Csöndes, I., Cseh, A., Taller, J., and Poczai P. (2009): Effect of temperature and pH on the growth of Macrophomina phaseolina isolates and their genetic diversity. Acta Agronomica Hungarica, (megjelenés alatt) Idegen nyelvő elıadások Balikó, K., Csöndes, I. and Dégenhardt A. (2006): Correlation between the natural infection of Macrophomina phaseolina and parameters characterizing nutrient supply and yield of soybean. Bibliotheca fragmenta agronomica. IX. ESA Congress, Warszawa, Poland, Book of proceedings, Part I., 37-38. Csöndes I. and Kadlicskó S. (2006): Effect of temperature on the growth of Macrophomina phaseolina isolates. 4th International Plant Protection Symposium at Debrecen University, Debrecen, Proceedings. 197-204. Csöndes, I., Balikó, K. and Dégenhardt, A. (2006): Changes in the Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich natural infection in soybean [(Glycine max (L.) Merill] as affected by different NPK combinations. Within The European Union, 3rd International Conference, Mosonmagyaróvár. Summaries of presentations and posters. 87.
13
MÁS TÉMÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK, ELİADÁSOK Cseh, A., Csöndes, I. Varga, Zs., Taller, J. és Fischl, G. (2008): Genetikai vizsgálatok a Keszthely térségi fagyöngy (Viscum album L.) és a Botryosphaerostroma visci populációiban. 54. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest. Összefogl. 66. Fischl, G., Taller, J., Csöndes, I., Varga, Zs. és Jandrasits, L. (2008): Adatok a fehér fagyöngy elterjedéséhez (Viscum album L.) és a Botryosphaerostroma visci (DC.) PETRAK gazda-parazita kapcsolathoz. XVIII. Növényvédelmi Fórum, Keszthely. Összefogl. 1. Jolánkai, R., Csöndes, I., Fischl, G., Wágner, L. and Husvéth, F. (2008): Fungal contamination and mycotoxin content of sheep feeds. Cereal Research Communications, 36: 759-762.
14
