1
I. A mikroorganizmusok vizsgálatának alapvető eszközei és anyagai 1. A fénymikroszkóp és használata, az elektronmikroszkóp 2. A sterilizálási folyamatok, eszközei 3. A mikroorganizmusok izolálásának és tenyésztésének módszerei, eszközei
A fénymikroszkóp és használata: A mikroszkóp a mikroorganizmusok nagyságrendjéből következően azok vizsgálatának alapvető eszköze. Az első komoly kísérletezésre alkalmazott fénymikroszkópot Antony Leeuwenhoek (1632-1723) holland kutató készítette el: segítségével mintegy 50-250-szeres nagyítást ért el. A mai összetett mikroszkóp megalkotása Jansen nevéhez fűződik az 1590-es évekből.
A fénymikroszkóp képalkotása Minden olyan olyan optikai eszközt, amely arra szolgál, hogy a látás tiszta távolságán belül a látószöget megnövelje abból a célból, hogy a szabad szemmel nem látható részleteket az emberi szem számára láthatóvá tegye, nagyítónak nevezünk. (tehát nem sorolható ide a távcső...) A látószög az a szög, amely alatt a szemlélt tárgy szabad szemmel történő szemlélés esetén látszik.
(1. fólia) Az emberi szem felbontóképességének határa 1 ívperc (1´). Ez az a minimális látószög, amely alatt két különálló pontot még külön pontként képesek vagyunk észlelni (x=0,066 mm, 250 mm távolságnál). Kisebb látószögnél is ugyan látjuk még a két pontot, de nem vagyunk képesek elkülöníteni őket! A tárgy nagysága ebből a szempontból közömbös, csak a látószög nagysága mérvadó. távolabb fekvő nagyobb tárgy = közelebb fekvő kisebb tárgy. Mivel egy adott méretű tárgy közelítésével nő a látószög, elméletileg a nagyon kicsi tárgyak közelítésével növelni lehetne a látószöget. A tiszta látás távolságán belül azonban már nem lát élesen a szemünk, ezért van szükség optikai eszközre, amely a látószöget megnöveli → fénymikroszkóp
2
A nagyítás és a méretarány A szemlélt tárgy és a szemünk ideghártyáján megjelenő képének nagyságviszonyát fizikailag nem tudjuk megmérni, csak azt észleljük, hogy a tárgynak a nagyított képét látjuk. E viszony jellemzésére vezették be a látszólagos nagyság fogalmát: A látszólagos nagyság mértékegysége az a látószög, amely alatt a tárgy látszik, ha a nagyított kép a tiszta látás távolságában jelenik meg a szemünk előtt. (A tiszta látás távolsága nemzetközi megegyezés alapján: 250 mm. Ez az érték a valóságban valamivel kisebb, számolni azonban ezzel a standard értékkel szokás.) A nagyító alkotta kép látszólagos látószögének és a szemlélt tárgy valóságos látószögének arány a nagyítás
(2. fólia). Erről a fogalomról csak akkor beszélhetünk, ha a szemlélt kép látszólagos kép, melyet szubjektív szemléléssel vizsgálunk. A nagyítás fogalma ezért a szem látásképességével függ össze. A szubjektív mikroszkópos vizsgálatnál a tárgynak csak egy látszólagos képét szemléljük, tehát ebben az esetben beszélhetünk arról, hogy n-szeres nagyítással vizsgáltunk egy tárgyat a mikroszkóppal.
Ellentétben ezzel, bizonyos mikroszkópi eljárásoknál (vetítés, mikrofotográfia) a tárgy valódi, nagyított képét hozzuk létre, pl. a fényképezőlemezen, filmen. Ilyen esetben a valódi kép nagysága közvetlenül mérhető és viszonyítható a szemlélt tárgyéhoz. Ilyenkor a kép és a tárgy nagyságának arányát méretaránynak (M) nevezzük
(2. fólia t/3 ábrája). A méretarányt mindig 1-re vonatkoztatjuk, az n:1 arány nagyított, az 1:n arány kicsinyített képet jelent, ha n>1. A méretarány mindig a végső képre vonatkozik (pl. nyomtatott végső verzió...)
Az egyszerű nagyító nagyítása Az egyszerű nagyító csak egyetlen lencséből vagy lencserendszerből áll. Működési elve azonos az összetett nagyító vagy összetett mikroszkóp működési elvével, annak ellenére, hogy az utóbbi két vagy több lépcsőben állít elő nagyított képet. A megkülönböztetés elsősorban gyakorlati jellegű. Az egyszerű nagyító leképezési aránya a tiszta látás távolságával egyenesen és a lencse (-rendszer) gyújtótávolságával fordítottan arányos:
3
(3. fólia). Az összetett nagyító vagy mikroszkóp nagyítása A mikroszkópban két lencse (-rendszer) állítja elő a szemlélt képet. Ezek messzebb vannak egymástól, mint a gyújtótávolságaik összege. A tárgy felé eső lencse a mikroszkópban az objektív vagy tárgylencse, a szem felé eső lencse pedig az okulár vagy szemlencse. (nem a szem lencséje!) Az objektívlencse az elülső gyújtótávolságánál valamivel távolabb eső tárgyról nagyított képet hoz létre. Ez a kép valódi, fordított kép!!! Neve köztes, vagy elsődleges kép. A tárgynagyság-képnagyság viszony, mivel valódi képről van szó, az objektív leképezési aránya, amit az objektíven ebben a formában, vagyis 1-hez viszonyítva fel is tüntetnek. Ez egyúttal a tárgy lineáris nagyítása is, hiszen amennyiben a tárgy egy vonal, akkor képe ennyiszer hosszabb nála. A lineáris nagyítás számértékét még méretarányszámnak is nevezik, és régebben csak a lineáris nagyítás számértéke került az objektívre feliratként (pl. 40:1 helyett csak 40). lineáris nagyítás fogalma ≠ nagyítás fogalma hanem a lineáris nagyítás a valódi képet létrehozó optikai rendszerek esetében szolgál a leképezési arány mértékének kifejezésére. A szubjektív mikroszkópos szemlélés során (az objektívlencse által előállított) valódi köztes képet az okulárlencsével mint lupéval nézzük, és megkapjuk a tárgy valódi nagyított képének az okulár által továbbított nagyított virtuális képét. Mivel az okulárlencse egy egyszerű lupe, az okulárnak nagyítása van, amelyet foglalatán fel is tüntetnek. Az összetett mikroszkóp össznagyítása (Nm) az objektív méretarányszáma (Mobj) és az okulár lupenagyítása (Nok) számértékének szorzatával egyenlő
(3. fólia). Nm = Mobj * Nok Ezt a mikroszkóp össznagyítást egyes szerkezeti elemek (pl. váltótubus, fényképezőfeltét) megváltoztathatják, ekkor ezek szorzófaktorát rajtuk fel kell tüntetni. Ilyenkor az össznagyítás:
Nm = Mobj * Nok * fsz
4
A mikroszkóp hasznos nagyítása: Az objektívlencse feloldóképességének határai vannak, melyet számos tényező, így az objektív numerikus apertúrája (nyílásszöge) is befolyásol
(4. fólia). A numerikus apertúra nagysága az objektív teljesítőképességének mutatója. A tárgylemezen fekvő tárgypontból kiinduló fénysugaraknak először át kell jutniuk a fedőlemezen, amellyel a preparátum rendszerint le van fedve. Amikor a fénysugarak a fedőlemezt elhagyják, fénytörés lép fel.
(5. fólia) A fedőlemezt csak azok a fénysugarak képesek elhagyni, amelyek beesési szöge az üveg-levegő határfelületen kisebb, mint ennek a felületnek a teljes reflexiós szöge, vagyis az a szög, amelynél nagyobb szögben a határfelületre érkező fénysugarak teljes visszaverődést szenvednek. A fedőlemezt elhagyó sugárnyaláb nyílásszögének nagyságát a teljes reflexió szöge határozza meg (vagyis azon közeg törésmutatójától függ, amelybe a fedőlemezből a fény kilép). Ha a fedőlemezt elhagyó sugarak olyan közegbe lépnek át, amelynek törésmutatója a levegőénél nagyobb, a teljes reflexió szöge és a fedőlemezt elhagyó sugárnyaláb nyílásszöge is nagyobb lesz (vagyis nagyobb össznagyítást tudunk elérni). Ha a közeg törésmutatója azonos az üvegével, a fedőlemezt elhagyó fénysugarak azt minden törés nélkül hagyják el, és a sugárnyaláb nyílásszögét csak a mikroszkópobjektív nyílásátmérője határozza meg. Mivel a fedőlemez és az objektívlencse közti közeg törésmutatója nem közömbös a nyílásátmérő szempontjából – amely egyúttal a beeső fénymennyiséget is szabályozza –, ABBE bevezette a numerikus apertúra fogalmát. A numerikus apertúra a fél nyílásszög szinuszának és a törésmutatónak a szorzata: A = n * sin α . A nyílásszög fogalmát és a törésmutatók hatását a sugármenetre ld. az ábrán. - értéke száraz objektíveknél levegőre van megadva - immerziós objektíveknél az előírt immerziós folyadékra van megadva A numerikus apertúra a lencsék felbontóképességét is jellemző szám. A lencse felbontóképessége két faktor függvénye. Az egyik faktor a lencseátmérő és a fókusztávolság viszonya, a másik pedig azoknak a közegeknek a törésmutatója, amelyeken a fénysugár a tárgytól a lencséig áthalad. A numerikus apertúra
ismeretében kiszámíthatjuk a felbontóképességet, vagyis azt a legkisebb távolságot, amely távolságra levő két pont még különálló pontnak látszik megfelelő nagyítás során. A felbontóképesség optimális megvilágítás esetében: használt fény hullámhossza λ ––––––––––––––––––––––– = –––––– 2 * numerikus apertúra 2A
5
A numerikus apertúra maximális értéke 1,4 lehet. Miután a látható fény hullámhossza adott tartományú, az elérhető felbontóképesség látható fényben 0,16 µm. Az objektíven a numerikus apertúra értéke mindig fel van tüntetve. Az emberi szem élességét figyelembe véve ABBE bevezette a hasznos nagyítás fogalmát. Ez a mikroszkóp numerikus apertúrájának függvényében elérhető maximális össznagyítás, értéke A * 500 < és < A * 1000 közé esik. A mikroszkóp össznagyítása, vagyis a végső nagyítása értékének a fenti kefejezésből kapott két érték közé kell esnie: A * 500 < Nh = Mobj * Nok * fsz < A * 1000 Az okulárlencsénket tehát mindig az objektívlencse nagyításának és numerikus apertúrájának függvényében választhatjuk csak meg, nem pedig korlátlanul nagy nagyítást választva!!!!! A hasznos nagyítás értékét elméletileg vezették be, de a gyakorlatban a gyártás során az objektívek korrekciójakor alkalmazták. A hasznos nagyítás túllépése az üres nagyítás, mely a korrigált lencsehibákat láthatóvá teszi. Ugyanis tökéletes lencsehibakorrekció nincs, a lencséket úgy korrigálják színi és egyéb hibákra, hogy azok a hasznos nagyítás felső határáig ne jelentkezzenek. Ha a nagyítást növelni akarjuk, akkor nem elég a lineáris nagyítást növelnünk, nagyobb bumerikus apertúrájú objektívet is kell hasznlni, hogy a hasznos nagyításon belül maradjunk. Az elmondottak alapján a fénymikroszkóppal elérhető maximális hasznos nagyítás a maximális 1,4-es apertúra ezerszerese, vagyis 1400 x -os össznagyítás.
A mikroszkóp felépítése: A tárgy szemlélése szempontjából közömbös, hogy a fénysugarakat maga a tárgy bocsájtja-e ki, vagy azok róla csak visszaverődnek, vagy ha áttetsző, akkor rajta áthaladnak, miközben egy más fényforrásból származnak. Ha a tárgy képét optikai eszközzel nyerjük és azt felnagyítva szemléljük, akkor ugyanannyi fénynek nagyobb képfelületen kell megoszlania, ezért a kép fényszegényebb lesz. A kép fényessége, mivel területegységről van szó, négyzetes arányban csökken a lineáris nagyítás növekedésével. Ezért a mikroszkópoknak alapvető szerkezeti elemük a megfelelő erősségű fényforrás is. Mai fejlett formájában a fénymikroszkópoknál a fényforráshoz lencserendszer kapcsolódik, amely a fényt megfelelően irányítja és a vizsgálati kívánalmaknak megfelelően vezeti. A tárgy megvilágításának módjai szerint többféle vizsgálati módról beszélünk:
6
I.
vizsgálatok áteső fényben: - világos látóterű, - sötét látóterű és - ferde megvilágítású vizsgálatok.
II.
vizsgálatok ráeső fényben: - világos látóterű, - sötét látóterű és - ferde megvilágítású vizsgálatok.
Világos látómezőben elsősorban a festett és nagy fénytörésű objektumok tanulmányozhatók kielégítő eredménnyel. Mivel a gyakorlatban leginkább világos látóterű, áteső fényű vizsgálatokkal van dolgunk, ezért a mikroszkópok néhány optikai jellemzőjét most erre az esetre adjuk meg: Az objektívek néhány optikai jellemzője: Az objektívek lencséi mint minden lencse – ha azt különböző techikai fogtásokkal a gyrátásnál nem küszöbölik ki – olyan lencsehibákkal rendelkeznek, amelyek leképezési hibákat okoznak. A leképezési hibák következtében a lencse által létrehozott kép torz lesz, és a torzítás mértéke a kép nagyításának mértékével növekszik. A gyártó cégek természetesen igyekeznek ezeket a lencsehibákat kiküszöbölni. Ilyen lencsehibák a: - szférikus aberráció, - párna- és hordótorzítás, - asztigmatizmus, - kromatikus aberráció és a - képmezőhajlás. Az asztigmatizmus azt jelenti, hogy a lencse tengelyétől távoli pontok leképezésében jelentkezik hiba. A lencsére ferdén beeső párhuzamos sugárnyaláb nem egyetlen pontban, hanem két egymásra merőlegesen kitérő vonalban (gyújtóvonal) mentén egyesül. A szférikus aberráció (gömbi eltérés) abból adódik, hogy a vizsgált tárgy egy pontjának kis vonal felel meg a képen. Ez abból adódik, hogy a lencsék nem egyformán törik meg a szélükön és közepükön áthaladó sugarakat. A kromatikus aberráció (színi eltérés) a különböző hullámhosszúságú fénysugarak eltérő törési szögéből adódó életlenség, színes képszegély.
(6. fólia) Két szín korrekciója → akromát lencse Három szín korrekciója → apokromát lencse
7
A képmező hajlása oka az, hogy a kép közepén és szélén, ill. különböző pontjain áthaladó fénysugarak gyújtópontja nem egy síkba esik.
(7. fólia) Gyakorlatilag ez úgy jelentkezik, hogy a kép közepét és szélét egyszerre nem lehet élesre állítani. Kiküszöbölése az ún. plánlencséknél (planochromat) történik meg. A plánlencséket főleg mikrofotográfiára használják.
Különleges mikroszkópi eljárások A sötét látóteres mikroszkópizálás az ún. Tyndall-elven alapszik, amely sötét szobában is gyakran megfigyelhető, ha keskeny csíkban fényt bocsátunk be. Ilyenkor a fénysugárban láthatóvá válnak az igen apró porszemek, amelyek világosan nem észlelhetők. A sötét látóteres vizsgálatokban az objektumot a kondenzorlencse szélén áthaladó ferde sugarak világítják meg. Ezek nem jutnak az objektívbe, ezért a mikroszkóp látómezője sötét marad, viszont a tárgyról szóródó fény bejut az objektívbe, ezért az fényesnek látszik a sötét háttér előtt.
(8. fólia) A sötét látóteres vizsgálat hátránya az, hogy negatív képet kapunk: az eredetileg világos helyek sötétek lesznek és fordítva. Ezenkívül sötét látótérben nehezebb a különbségeket észlelni a készítmény egyes részeinek vastagsága között. A mikroorganizmusok több csoporját, mint a kékalgákat, zöldalgákat, gombák hifáit jól meg lehet szemlélni világos látóterű, áteső fényű mikroszkóppal, mivel ezek az őket körülvevő közegtől szín- és fényáteresztő-képességbeli különbözőségük miatt jól elkülönülnek. Más, nagyon kis méretű objektumok, mint például a baktériumsejtek, csak nagyon kis mértékben különböznek adszorpciójukban az őket körülvevő környezettől, ezért élő, színezetlen sejtekként alig észlelhetők. Mind ezeket az apró élőlényeket, mind pedig nagyobb sejtek szövettani finomságait kontrasztban gazdaggá lehet tenni fáziskontraszt-berendezés alkalmazásával, amely világos látómezőben rendkívül kontrasztos képet ad az élő festetlen objektumról. A fáziskontraszt-mikroszkópot ZERNIKE holland fizikus elgondolásai alapján hozták létre. Lényege: Ha a fényhullám olyan objektumon halad keresztül, amelyben a fényt gyengébben és erősebben elnyelő pontok váltakoznak, akkor az áthaladó fény amplitúdója nem változik meg, de megváltozik a fázisuk. Az emberi szem csupán az amplitúdóváltozásokat képes érzékelni: a fáziskülönbségeket csak interferencia esetén tudja felfogni. Ehhez azonban egy másik sugár is kell, amelynek fázisa 180°-ban tér el az előzőtől. A létrejövő interferenciában a fáziskülönbség amplitúdókülönbségeket eredményez.
8
A mikroszkóp látómezejében levő objektumok rendszerint átlátszóak, s ezért nem idéznek elő olyan amplitúdóváltozásokat, amelyek kontrasztdús képet adnának. Ennek kiküszöbölésére ZERNIKE az objektívnek a kép felé eső fókuszsíkjába ún. fázislemezt helyezett, mely 180°-ra növelte az egyébként csak 90°-os fáziskülönbséget az áthaladó sugaraknál, ezzel az emberi szem számára is érzékelhetővé azokat. Így erős kontraszthatású kép keletkezett. A fókuszsíkban levő lencsebevonat nemcsak a fénysugarak fázisát tolja el, hanem egyben azok 70%-át el is nyeli, így a szemlélt objektumok sötéten és kontrasztosan jelnnek meg, a fényes környezetükben (pozitív fáziskontraszt). A bevonat vastagságának változtatásával ez a fáziskontraszt megfordítható (világos tárgy, sötét háttér). A fluoreszcensz mikroszkópi eljárás elvének alapját azon fénykibocsátási jelenségek képezik, amelyek hőenergia közlése következtében jönnek létre (ezek neve lumineszcencia). (fluoreszkálás ↔ foszforeszkálás)... A vizsgálandó tárgyat ezért hosszú hullámú ultaribolya sugarakkal (300-375 nm) vagy kék fénnyel világítják meg. A tárgy által el nem nyelt ultraibolya sugarakat az okulárjába helyezett különleges szűrővel el kell távolítani, egyébként szemkárosodást okoz. A legtöbb baktérium csak igen gyengén fluoreszkál, ezért a vizsgálatokhoz a készítményt fluorkromokkal, speciális fluoreszkáló festékekkel kezeljük. A mikrobiológiai gyakorlatban legelterjedtebb ilyen festék az acridin orange, amelyet 1:5000, 1:10000 higításban alkalmazunk. Ez az anilinfesték az élő sejtek protoplazmáját sötétzöldre, a magot világoszöldre, a kromatinszemcséket pirosra, a vakuolumokat pedig rózsaszínűre festi. Mivel az acridin orange kimondottan vitális festék, segítségével elkülöníthetjük az élő sejteket az elpusztultaktól, ugyanis az utóbbiak protoplazmája vörösre festődik. Ugyancsak jó fluorkromáló festék a neutrálvörös, amely a protoplazmát zöldessárgára, a sejtmag kromatinját pedig sötétvörösre festi. A berberin-szulfátos fluorkromálás hatására a protoplazma szürkéssárga színt vesz fel, a magkromatin pedig sárga színben fluoreszkál. A sztereómikroszkóp alkalmas mind áteső, mind ráeső fényben történő vizsgálatokra. Nagy mélységélessége és a kapott térhatású kép alkalmassá teszi az agarlemezen kinőtt kis méretű mikroorganizmus-kolóniák, valamint az egyes gombák termőtestjeinek ráeső fényben való tanulmányozására. Az első elektronmikroszkópot 1932-ben Knell és Ruska német kutatók szerkesztették. Az elektronmikroszkóp működési elve hasonlít a fénymikroszkópéhoz, a különbségek a következők: - Az elektronmikroszkópban a vizsgált anyagot nem látható fény-, hanem elektronsugarakkal világítják át. Az elektronsugarak hullámhossza jelentősen rövidebb, mint a fényé, csupán a nm törtrészét teszik ki. Az elektronsugár hullámhossza a gyújtófeszültség négyzetgyökével fordítottan arányos, pl. 40 kV-on 0,006 nm, 100 kV-on 0,004 nm. A fénymikroszkóphoz hasonlóan az elektronmikroszkópra is igaz, hogy a megvilágításra szolgáló sugár hullámhossza és mikroszkóp feloldóképessége között fordított arányosság áll fenn (emlékezz a numerikus apertúrára). Az elektronmikroszkóp nagyon kis hullámhossza így ma már 0,5-1 nm felbontást is
9
lehetővé tesz (ez 100-200ezerszeres nagyítás!!!). Ez a kép még tovább nagyítható, de már nem ad jobb felbontást. - A második lényeges különbség, hogy az elektronmikroszkópban az elektronoknak negatív töltése van, míg a fény fotonjai semlegesek. Az elektronok mozgása igen erősen korlátozott, sőt teljesen megszűnik, ha valamilyen anyagba ütközik. Ilyen anyagok a gázok is. Ezért van szükség igen erős vákuum létrehozására az elektronnyaláb útjában a mikroszkópban. - Az előzőekben leírtaknak megfelelően természetesen az optikai rendszereik is lényegesen eltérőek: míg a fénymikroszkópban a fénysugarak összegyűjtésére és megtörésére különlegesen csiszolt üveglencse-rendszerek szolgálnak, addig az elektronmikroszkópban ezeket a típustól függően mágneses vagy elektrosztatikus mezőket létrehozó elektronoptikai lencsék helyettesítik. A vizsgált tárgy képét a mikroszkópban közvetlenül megfigyelhetjük, az elektronsugarakat pedig egy különleges ernyő teszi láthatóvá (lényegében a tv-képernyő működésével megegyezően). Minden elektronmikroszkópnak jellemző része a törzs, amely az elektronforrást, az elektronoptikai lencserendszert, a vizsgálandó tárgy befogadására szolgáló preparátumtartót, a különböző blendéket, a megfigyelőernyőt és a fényképező berendezést foglalja magába. Az elektronmikroszkóp másik fontos része a nagy vákuumot előállító szivattyúrendszer, amely az elővákuumot és a nagy vákuumot létrehozó két alegységből áll össze. Az elektromos részhez tartozik a nagyfeszültségű egyenáramot létrehozó tápegység és az elektronoptikai lencserendszer feszültségmentes gerjesztésére szolgáló stabilizátor vagy akkumulátor. Az elektronokat az ún. elektronágyú lövi a vákuumba. A minták elhelyezésére az elektronmikroszkópos vizsgálatoknál nem használhatók a fénymikroszkópnál megszokott üveglemezek, mivel ezeken az elektronsugarak nem képesek áthatolni. A vizsgálandó tárgyat itt különleges anyagból készült hártyára kell rávinni. A hárgya vastagsága a vizsgálandó objektummal együtt nem haladhatja meg a 250 nm-t. A vizsgálandó tárgyat először gondosan meg kell tisztítani az idegen anyagoktól. Ügyelni kell arra, hogy teljesen száraz legyen, mivel a nedves készítményből kiváló pára lehetetlenné teszi a megfigyelést. A tárgyat a hártya felületén egyenletesen kell eloszlatni. A mikrobiális sejtek, valamint a növényi és állati szövetek vizsgálatához metszeteket készítenek. Ezek vastagsága nem haladhatja meg a 80-90 nm-t. Az elektronmikroszkóppal élő szervezetek nem vizsgálhatók, mert a nagy vákuum, valamint az elektronsugarak minden élő szervezetet elpusztítanak. A vizsgálandó tárgy felületét a kontraszthatás fokozására különböző anyagokkal vákuumgőzöléssel szokás bevonni. A gőzöléshez elpárologtatott anyagokat (arzén, platina, arany, alumínium, palládium) egyenként vagy a kívánt effektus eléréséhez szükséges variációkban alkalmazhatjuk.
