13. REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA; GYAKORLATI ALKALMAZÁSOK. RFLP és a restrikciós (fizikai) térképek. Southern és Northern analízis. VNTR. In situ hibridizáció és a FISH technika. Riportergének, transzgénikus élőlények és génterápia.
A fágokban levő génkönyvtárak szűrése lényegében az itt bemutatott technológia alapján történik, természetesen a baktériumpázsiton létrejött, egyedi fágok által képzett tarfoltok, azaz plakkok alapján. Denaturált DNS
A fejezetet Szabad János egyetemi tanár állította össze, módosította Lippai Mónika.
A 12. fejezet bemutatta, hogy egy genom- vagy cDNS-könyvtár vektorok sokaságából áll, és egy-egy vektor egy-egy idegen DNS-szakaszt tartalmaz. Hogyan választható ki a sok vektor közül az, amely éppen azt az idegen DNS-t tartalmazza, amelyre szükség van? Hogyan és milyen célokra használhatóak a felszaporított DNS-darabok a molekuláris biológiában és az orvostudományban? Génkönyvtárak szűrése A könyvtárakból ki kell tudni választani azt a vektort, amely azt a DNS-szakaszt tartalmazza, amelyikre éppen szüksége van a kutatónak. A kiválasztott vektor szaporítható, majd izolálható belőle az immáron megfelelő mennyiségű, molekulárisan klónozott DNS. A plazmidon alapuló génkönyvtárak szűrésének menete a következő (13.1. ábra). Első lépésben táptalajon növesztik az idegen DNS-t tartalmazó baktériumok kolóniáit, és róluk a másolatokat készítenek, úgy, hogy a baktériumkolóniákból baktériumokat visznek át egy nitrocellulóz filterre. A nitrocellulóz filtert, rajta az egyes telepekről rátapadt baktériumsejtekkel, NaOH-val kezelik, hogy (i) feltárják a baktériumokat, (ii) denaturálják a DNS-t és (iii) az egyszálú DNS-t a nitrocellulóz filterhez kössék. A DNS-t 90-95 oC-on „rásütik” a filterre, hogy a továbbiakban stabilan a filteren maradjon. A következő lépésben a filtert 32P-vel, vagy - ma már többnyire fluoreszcensen jelölt DNS- (vagy RNS-) próbával inkubálják. Az inkubáció alatt a próba-DNS hibridizál a komplementer DNS szekvenciákkal. A hibridizáció alapja a renaturáció, azaz a komplementer nukleotid szekvenciák egyesülése. A nitrocellulóz filtert radioaktív jelölés esetében röntgenfilmmel borítják. A 32P bomlása során képződő β-sugárzás hatására fotokémiai reakció játszódik le a röntgenfilmben. A reakció eredményét az előhívás nyomán képződő fekete ezüstszemcsék jelzik a röntgenfilmben. Az ezüstszemcsék megmutatják, hogy melyik kolónia tartalmazza a próbával komplementer DNS-szakaszt (13.1. ábra). Fluoreszcens próba esetében az emittált fény hullámhosszát érzékelő detektorral azonosítják a jelet. A megfelelő baktériumokat az eredeti mesterlemezről ki lehet választani, majd szaporítani lehet. A baktériumokból a már ismertetett módon kinyerhetőek a plazmidok, a plazmidokból pedig restrikciós enzimmel folytatott emésztés és gélelektroforézis után izolálható a klónozott DNS.
Génkönyvtár
Replika nitrocellulóz filteren
Nitrocellulóz filter
Röntgenfilm
Telep, benne a keresett DNS
Autoradiogram
Hibridizáció P-jelzett próbával
32
13.1. ábra. Génkönyvtár szűrése. A KLÓNOZOTT DNS FELHASZNÁLÁSA A fenti módszerrel „használható” mennyiségű, viszonylag rövid, de azonos szekvenciából álló DNS szakaszok sokszorosíthatóak vektorok segítségével, vagy akár a PCR módszerével. A megsokszorozott DNS felhasználására a továbbiakban említünk példákat. Ahogy erről már szó volt, a restrikciós enzimek a DNS-ben meghatározott szekvenciákat ismernek fel és vágják el ott a DNS-t (ezeket nevezik restrikciós helynek). A hasítás nyomán olyan restrikciós fragmentek képződnek, amelyek mérete megfelel a restrikciós helyek egymástól mért fizikai távolságának (amit a restrikciós helyek között levő bázispárok számával jellemeznek). A restrikciós fragmenteket gélelektroforézissel el lehet különíteni. Mint ismeretes, az elektroforézis során a hosszabb fragmentek rövidebb, a rövidebb fragmentek hosszabb utat tesznek meg (a sávok helyzete fordítottan arányos a restrikciós fragmentek hosszának logaritmusával). Az azonos hosszúságú fragmentek egy sávot képeznek. A sávok láthatóvá tételére két megoldás: (1) A DNS-hez kapcsolódó festékkel Ha a DNS emésztése nyomán csak kevés számú fragment képződik (a DNS-t vektorból izolálták, vagy PCR-rel készítették), a gélelektroforézis során csak néhány sáv képződik (13.2. ábra). A sávokban levő DNS-t régebben többnyire etidium-bromiddal tették láthatóvá. A DNS-hez kötődő, erősen mutagén etidiumbromid UV fényben narancssárgás színben fluoreszkál. Ma már inkább a kereskedelmi forgalomban kapható, a felhasználó számára nem mutagén hatású fluoreszcens festékeket alkalmaznak.
(2) DNS/DNS vagy DNS/RNS hibridek kimutatásával A DNS/DNS vagy a DNS/RNS hibridek jelzett „próbával” folytatott hibridizáció nyomán képződnek. Nagy mennyiségű heterogén, például teljes genomból származó DNS emésztése során olyan sok különböző hosszúságú fragment képződik, hogy azok a gélben nem diszkrét sávokat, hanem egyetlen folyamatos fragmentpástot alkotnak. Azt a módszert, amellyel a pástba olvadó fragmentek közül kiválasztható(ak) a megfelelő(ek), Southern blottolásnak vagy Southern analízisnek nevezik. Southern blottolás Ha sejtekből, szövetekből izolált DNS-t restrikciós enzimmel emésztenek, száz és ezerszám képződnek nagyon különböző hosszúságú restrikciós fragmentek. A sokféle hosszúságú restrikciós fragment a gélelektroforézis során egy olyan hosszú „DNS fragment-pástot” képez, amelyen belül egyedi sávok nem ismerhetőek fel. A megfelelő sávok felismerését a "sávtengerben” lehetővé tevő módszert - kidolgozója neve után Southern blottolásnak nevezik, célja pedig DNSfragmentek detektálása jelzett DNS próbával. A gélelektroforézissel elkülönített DNS fragmenteket nitrocellulóz vagy nejlon filterre „blottolják” (13.2. ábra). (A blottolás azt jelenti, hogy a gélből egy nitrocellulóz filterre húzzák át, pozíciójukat megőrizve, a DNS fragmenteket.) A nitrocellulóz filtert NaOH-al kezelik, majd néhány tíz percen át 90-95 oC-on „sütik”, hogy denaturálják a DNS-t, és hogy az egyszálú DNS fonalakat a nitrocellulóz filterhez kössék. A filtert 32Pvel jelzett, vagy ma már inkább fluoreszcensen jelölt DNS próbával inkubálják, hogy a próba egyszálú szálai hibridizáljanak a komplementer szekvenciákkal. A nem hibridizáló próba DNS-t mosással eltávolítják, majd radioaktív jelölés esetében a filterre röntgenfilmet tesznek. A 32P bomlása nyomán képződő -sugárzás a
13.2. ábra. A Southern (vagy RNS gélelektroforézise esetében Northern) blottolás elvi alapjai.
röntgenfilm előhívása után fekete ezüstszemcsék formájában válik láthatóvá. A képződő sötét sávok tehát megmutatják a hibrid DNS-szálak helyét a különböző hosszúságú restrikciós fragmentek között (13.2. ábra). Northern blottolás RNS-t szintén lehet izolálni sejtekből, szövetekből. Az RNS-molekulákat (bár az RNS reaktivitása miatt jóval körülményesebben) gélelektroforézissel el lehet különíteni, nitrocellulózra blottolni, majd sütni, és közülük DNS próbával kimutatni azokat, amelyek a DNS próbának komplementerei, így azzal hibridizálnak. Az eljárást Northern blottolásnak nevezik. Western blottolás Az ún. Western blottolás során fehérjéket különítenek el gélelektroforézissel, majd blottolnak nitrocellulóz filterre. A különféle méretű fehérjék közül specifikus ellenanyaggal detektálják és teszik láthatóvá a keresett fehérjét. Az ellenanyagok a magasabbrendű eukarióták immunrendszerének fontos fehérjéi, nagy affinitással és specifitással képesek a szervezet számára idegen anyagokhoz kötődni. Ezt használják ki a molekuláris biológiában, úgy, hogy a kimutatni kívánt anyaggal (antigénnel) mesterségesen immunizálnak egy állatot, majd véréből ellenanyagot izolálnak, és később ezt használják fel az antigén kimutatására. In situ hibridizáció és a FISH technika A komplementer nukleinsav-szekvenciák akkor is hibridizálnak egymással, ha az egyik DNS-fonal pl. egy kromoszóma része. A hibrid molekula megfelelő módszerrel láthatóvá tehető, és mikroszkópban tanulmányozható. Annak az eljárásnak, amely egy sejtvagy szövet-preparátumon „helyben”, a nukleotidtartalom külön izolálása nélkül specifikus kromoszomális DNS-szakaszt vagy RNS-molekulákat tesz láthatóvá, in situ hibridizáció a neve. Az egyedi,
sokszor csak egy kópiában jelenlévő DNS- vagy RNSszekvenciák in situ kimutatása során a hibrid szakasz kimutatásához különleges megoldásra, a gyenge jel erősítésére van szükség. Egy lehetséges megoldás a próba-DNS megjelölése egy erősen immunogén molekulával, pl. digoxigeninnel (DIG). A DIG-et, és ezzel együtt a hibrid DNS-t egy olyan, ún. elsődleges ellenanyag ismeri fel, amely a DIG-gel specifikusan reagál. Az elsődleges ellenanyaghoz viszont olyan másodlagos ellenanyag kapcsolódik, amely fluoreszcens festékkel van megjelölve. Mivel egyetlen egyszálú DNS próba több DIG molekulát tartalmaz, a DNS hibrid több elsődleges ellenanyaggal kapcsolódhat. Egyetlen elsődleges ellenanyaghoz több másodlagos ellenanyag kapcsolódik. Egyetlen másodlagos ellenanyag több fluoreszcens csoporttal van megjelölve. Végeredményben tehát egy olyan szendvicsszerű szerkezet képződik, amely kellő intenzitással fluoreszkál, és egy fluoreszcens mikroszkópban észrevehető, tanulmányozható. A technika neve: fluoreszcens in situ hibridizáció, röviden FISH. A FISH technikát általánosan használják DNS szekvenciák azonosítására kromoszómákban, vagy mRNS molekulák helyének megállapítására sejtekben, szövetekben (13.3. ábra). 13.3. ábra. Telomer DNS kimutatása a FISH technikával. A telomer szekvencia helyét sárga pöttyök mutatják. A kromatin egy általános DNSfestéknek köszönhetően kéken fluoreszkál.
A restrikciós vagy fizikai térképek Ahhoz, hogy a DNS mentén eligazodjunk, kiváló lehetőséget nyújtanak a restrikciós vagy fizikai térképek. A restrikciós térkép olyan ábrázolásmód, amely megmutatja, hogy a különféle restrikciós enzimek hasítási helyei milyen sorrendben és távolságban követik egymást a DNS mentén (13.4. ábra). A restrikciós térképeket azért szokták fizikai térképeknek is nevezni, mert a restrikciós helyek helyzete, egymástól mért távolsága arányos az emésztés során képződő fragmentek hosszával, lényegében a DNS-t alkotó bázispárok számával. Ugyanakkor a genetikai térképek nem egyeznek pontosan a fizikai térképekkel, torzítanak, mert a crossing overek nem azonos gyakorisággal következnek be a kromoszómák különböző szakaszain! A restrikciós térképek készítése során valamely DNSszakaszt különféle restrikciós enzimekkel külön-külön és együtt is emésztik. Az emésztés után képződő fragmenteket gélelektroforézissel elkülönítik, és meghatározzák a fragmentek méretét. A restrikciós fragmenteket méretük alapján sorrendbe lehet rendezni, restrikciós térképet lehet készíteni (13.4. ábra).
Sok faj esetében (beleértve az embert is) részletes térképek készültek a restrikciós helyek alapján. A restrikciós helyek nemcsak a gének térképezését tették lehetővé, hanem molekuláris klónozásukat is. A restrikciós térképek készítése a génfunkció molekuláris szintű megismerésének fontos mozzanata volt - és ma is az, amennyiben nem ismerjük az adott faj genomjának szekvenciáját. Emésztés az egyik enzimmel Restrikciós enzim #1 0,6 0,4
1,0 kbp DNS
Emésztés a másik enzimmel Restrikciós enzim #2 0,9 0,1
Kettős emésztés 1,0 Enzim #2
0,1
0,5
Enzim #2 Enzim #1
Enzim #1
0,4
vagy
0,6
0,3
0,1
vagy
13.4. ábra. Restrikciós térkép készítésének elvi alapja. Az egy-egy restrikciós enzimmel illetve kombinációjukkal folytatott emésztés és gélelekroforézis után meghatározhatóak a restrikciós helyek, és ún. restrikciós (fizikai) térkép szerkeszthető.
RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfizmus) Természetesen egy populációban sok génnek sok allélja létezhet egyidejűleg. Ilyenkor a populáció valamely tulajdonságot illetően polimorf. A mutációk időnként restrikciós helyeket szüntethetnek meg, és újakat alakíthatnak ki, megteremtve a DNSpolimorfizmus vizsgálatának egyik alapját. A DNS polimorfizmusa a szekvencia valamilyen eltérését jelenti a DNS ugyanazon szakaszán a homológ kromoszómák DNS-ében. A DNS-polimorfizmus a lehetséges restrikciós helyek vizsgálatának szempontjából két dolgot jelent. (1) Azt, hogy egy faj különböző egyedeiből származó azonos kromoszómák DNS-ének adott pontjában valamely restrikciós hely jelen van vagy sem. Polimorfizmus esetén megfelelő restrikciós enzimmel folytatott emésztés után eltérő hosszúságú restrikciós fragmentek képződnek (13.5. ábra). (2) A különféle hosszúságú restrikciós fragmentek eltérő gyakorisággal lehetnek jelen a különféle populációkban. Vagyis a restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) a különféle hosszúságú restrikciós fragmentek meglétét és gyakoriságát is mutathatja egy populációban. Mivel mindegyikünk genetikailag egyedi kombináció, mindegyikünkre egyedi RFLP mintázat jellemző. Ha tehát elegendően sok polimorf genombeli helyet, azaz lokuszt vettek figyelembe, az RFLP alkalmas módszer volt személyek azonosítására - éppen úgy, mint az ujjlenyomat. Ma azonban erre a célra már egy másik eljárást (VNTR, lásd később) alkalmaznak.
Egy másik restrikciós enzim a mutáns DNS-t vágja, az ép DNS-t nem
+ m
d d
m m
+ d
Valamely restrikciós enzim az ép DNS-t vágja, a mutáns DNS-t nem + +
+/+ +/m m/m
A gélelektroforézis eredménye
+/+ +/m m/m Az elektroforézis iránya
Az elektroforézis iránya
13.5. ábra. A restrikciós fragmentek diagnosztikus értéke. Sokszorozzák (PCR-rel) az adott DNS-szakaszt +/+, +/m és m/m genotípusú emberek genomjáról. A PCR-terméket az első esetben olyan restrikciós enzimmel emésztik, amely a DNS-t a -el jelölt helyen elvágja. A +/+ genotípusú emberek esetében mindkét homológ kromoszómáról kétféle méretű fragment képződik: egy rövid és egy hosszabb. Ezért a fragmentek a gélelektroforézis során két vastag sávot alkotnak. Az m mutáns allélban a mutáció megszüntette a restrikciós helyet, ami miatt a restrikciós enzim nem vágja el (nem emészti) a PCR-terméket. Ezért az m/m emberek esetében egyetlen vastag sáv képződik. A +/m heterozigóták sáv-mintázata különbözik mind a +/+, mind pedig az m/m emberekétől. Az is megtörténhet (második példa), hogy a mutáció nyomán olyan új restrikciós hely képződik, amelyet egy restrikciós enzim éppen felismer és elvágja ott a DNS-t. Nyilvánvaló, hogy a +/+, a +/m és az m/m emberek fragmentmintázata a második esetben is különbözik.
RFLP markerek és a genetikai térképezés A rekombinációs valószínűségen alapuló genetikai térképek készítéséhez. markermutációkat használtak/ használnak. A markermutációk látható fenotípust eredményező mutáns allélok, tájékozódási pontokká váltak a kromoszómákon. A restrikciós helyek, hasonlóan a markermutációkhoz , tájékozódási pontként szolgálnak a kromoszómák mentén, és fizikai térképezésre használhatóak (13.4. ábra). Az RFLP hasznos eljárás a genetikai eredetű tulajdonságok vizsgálatára, és sokáig a legfontosabb
kimutatási módszer volt a prenatális diagnosztikában. Tételezzük fel, hogy az m/m homozigóták olyan betegség miatt halnak meg, mint pl. a cisztás fibrózis (mukoviszcidózis). Ha az m mutáció megszüntet (vagy éppen létrehoz) egy restrikciós helyet, az RFLP mintázat alapján különbséget lehet tenni a +/+, a +/m, valamint az m/m genotípusú magzatok között (13.5. ábra). A +/m heterozigóta szülőket figyelmeztetni lehet a veszélyre, és magzatjaik genotípusát prenatálisan meg lehet határozni. Nem minden génmutáció mutatható ki azonban RFLPvel, mert nem szüntet meg vagy hoz létre restrikciós helyet. Egyes gének látható fenotípust okozó markermutációi megfelelő közelség esetében a kapcsoltság miatt (lásd 5. fejezet) alkalmas eszközöknek bizonyultak a kromoszómák adott pontjának öröklődési vizsgálatára. A gének azonban a magasabbrendű eukarióták DNS-ének csak kis hányadát foglalják magukba, és közöttük csak nagyon kevésnek van markermutáció értékű (azaz könnyen detektálható fenotípusú) allélja. Polimorf restrikciós helyek viszont bőségesen vannak a genom azon szakaszain is, amelyek nem részei semmilyen génnek sem. Ha egy adott restrikciós hely közel van, és így nagy valószínűséggel kapcsoltan öröklődhet valamely gén mutáns alléljával, a restrikciós hely lehetővé teszi a mutáns allél öröklődésének nyomon követését – akkor is, ha maga a génmutáció nem alkalmas RFLP-analízisre (nem szüntet meg vagy hoz létre restrikciós helyet). Minél közelebb van a restrikciós hely a mutáns allélhoz, annál jobban használható a mutáns allél öröklődésének nyomon követéséhez (13.6. ábra).
mutáns allél (M)
anya
apa
RFLP marker (R) spermium
petesejt
M R
M R
M R
M
utódok
13.6. ábra. A restrikciós helyek haszna a géntérképezésben. A mutáció (M) és egy RFLP marker (R) közötti kapcsoltság lehetővé teszi a mutáció követését az utódokban (a M és az R jel az M mutáció és az R marker meglétét jelzi). Számolni kell azonban azzal, hogy az R marker és az M mutáció között bizonyos valószínűséggel (a távolság függvényében) rekombináció következik be (lásd az utolsó esetet az utódok genotípusai közül)!
SNP (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) Az egypontos vagy egyedi nukleotid-polimorfizmus (angolul Single Nucleotide Polymorphism, SNP) egyetlen bázis mutációján alapuló DNS szekvenciavariáció. Akkor alkalmazzák az SNP-t a genom egy adott helyének genetikai jellemzőjeként, ha a mutáns változat a vizsgált populációban az egyedek legalább 1%-ában jelen van (például az AAGCCTA szekvencia C helyén T bukkan fel: AAGCTTA). Az SNP-k teszik ki az ismert humán genetikai variációk 90%-át, és minden 100-300 bázispáronként jelen vannak a humán genomban. Az SNP-k kétharmadában a C helyén T van. Mivel egyik generációról a másikra az SNP-k csak kis eséllyel változnak meg, komoly segítséget jelentenek - egyebek mellett - a gyógyászatban. Érthető, hogy az SNP-k értékes „markerek” a leszármazási vizsgálatokban is. Rekombináns DNS technológia és prenatális diagnosztika Minthogy az öröklődő betegségek az örökítő anyag változásaival kapcsolatosak, az örökítő anyag változása pedig gyakran jár a restrikciós helyek változásával, lehetőségek kínálkoznak a magzat genotípusának megállapítására már a terhesség 10. hetében. Magzati sejtek gyűjtésére négy megoldást alkalmaznak. (1) Az amniocentézis során a magzatvízből gyűjtenek magzati sejteket (13.7. ábra). (2) Korionboholyból vesznek kis mintát (a korionboholy genotípusa a magzatéval azonos). (3) A magzat köldökvénájából vesznek pár csepp vért. (4) Az anya véréből össze lehet gyűjteni a belekerült magzati sejteket. A magzati sejteken kromoszóma-, enzim- és/vagy DNS-vizsgálatokat lehet elvégezni. A DNS-vizsgálat is többféle lehet. Régebben a DNS-t először restrikciós enzimmel emésztették, a fragmenteket gélelektroforézissel elkülönítették és nitrocellulóz filterre blottolták, majd elvégezték a Southern analízist alkalmasan megjelölt DNS próbával (13.2. ábra). Ma leggyakrabban a DNS jól meghatározott szakaszát először PCR-rel amplifikálják,
majd a PCR-terméket vizsgálják, pl. az RFLP módszerével (13.5. ábra). Egyre gyakoribbak az olyan vizsgálatok, amelyekben meg is szekvenálják a PCRterméket. Természetesen a mutáns allélokat nemcsak magzatokban, hanem felnőttekben is ki lehet mutatni, és fel lehet használni a genetikai tanácsadás során. VNTR: példa a molekuláris technikák igazságügyi orvostani felhasználására Az igazságügyi orvostan gyakran kihasználja azt a tényt, hogy mindannyian (kivéve az egypetéjű ikreket) egyedi genetikai kombinációk vagyunk. A molekuláris módszerekkel csekély mennyiségű DNS-ből kiindulva azonosítanak embereket az ún. DNS-alapú ujjlenyomatvizsgálat valamelyik módszerével. Az eukromatinban rövid DNS-szekvenciák tandem módon ismétlődő kópiái találhatóak. Ezen mérsékelten ismétlődő szekvenciák egyik típusát VNTR-eknek (angolul: variable number of tandem repeats) nevezik. Mivel a kópiák száma az egyes VNTR-blokkokban és az emberekben is gyakran különböző, a VNTR-analízis az igazságügyi orvostanban jól használható személyek azonosítására (13.8. ábra). Első lépésben a különböző típusú VNTR-régiókat PCR-rel amplifikálják (13.8. ábra). A PCR-primerek közvetlenül a VNTR-hely szomszédságában lévő, az anyai és az apai eredetű kromoszómákban azonos DNS szekvenciákhoz hibridizálnak. A PCR termékek hossza két dologtól függ: (i) milyen hosszú annak az „egység” DNS szakasznak a hossza, amely a VNTR-ben ismétlődik, és (ii) a kópiák számától.
Magzatvíz köldökvéna
korionboholy
13.7. ábra. Egy 13. hetes emberi embrióról készült felvétel.
13.8. ábra. A VNTR-analízis elvi alapjai. Magyarázat a szövegben.
A VNTR-ekről képződött PCR-termékeket gélelektroforézissel elkülönítik. Az adott VNTR-régióra jellemző „egységnyi” DNS-szakasz hosszának ismeretében, valamint a PCR-termék mérete alapján meghatározható a PCR-termékeket alkotó kópiák száma (az apai és az anyai eredetű kromoszómákból származó DNS jó eséllyel eltérő mintázatot ad). Végeredményben egy, az adott emberre jellemző mintázat képződik (13.8. ábra). A VNTR-analízis, miután PCR-en alapul, nagyon érzékeny: egyetlen hajhagymában, vagy egy vércsöppben van annyi DNS, amely alapján elvégezhető a VNTR-analízis. Riporter- és transzgének A rekombináns DNS technológia (vagyis a különböző eredetű DNS-szakaszok tervszerű kombinálása és használata) lehetővé teszi a DNS-szekvenciák mérnöki pontosságú kombinálását, tetszés szerinti módosítását, a rekombináns DNS-szekvenciák transzformálását sejtekbe, élőlényekbe. A DNS-t különféle módszerekkel lehet a sejtekbe juttatni. Vannak kereskedelmi forgalomban beszerezhető preparátumok, amelyekbe a DNS becsomagolható, és miután a sejtekhez keverik, bejuttatják a DNS-t a sejtekbe. Az ún. génpuskák olyan apró fémgömböket lőnek be a sejtekbe, amelyek felszínére DNSmolekulákat rögzítettek. Az elektroporáció során DNSoldatba tesznek sejteket, elektromos kisüléssel apró pórusokat nyitnak a sejthártyán, amelyeken át DNSmolekulák áramlanak a sejtbe, amíg a pórusok nyitva vannak. Gyakori eljárás, hogy a DNS oldatot vékony kapillárissal injektálják be a sejtekbe, embriókba (13.9. ábra). DNS-oldat sejtmag
sarki plazma
ősivarsej t
13.9. ábra. Idegen DNS bejuttatása muslicába. A muslica leendő ősivarsejtjei a pete citoplazma hátulsó végének (sarki plazma) megfelelő területen alakulnak majd ki, úgy, hogy a korai embrióban itt található sejtmagvak körül kialakuló sejtmembránok magukba zárják ezt a részt. A sejthatárok kialakulása előtt a sarki plazmába injektált DNS-molekulák tehát bekerülhetnek a leendő ősivarsejtekbe. Ha az injektált DNS ráadásul módosított transzpozont tartalmaz, egy része - transzpozáz enzim hatására - beékelődhet valamelyik ősivarsejt egyik kromoszómájába, és a továbbiakban a kromoszóma részeként, transzgénként öröklődik (lásd a szövegben). A vastag fekete nyíl egy olyan ősivarsejtre mutat, amely egyik kromoszómájába belekerült egy transzgén.
A sejtekbe juttatott DNS gyakran nem válik a kromoszómák részévé. Ekkor a benne kódolt genetikai információ átmeneti, tranziens módon expresszálódik: addig kódolhatja fehérjék képződését, amíg le nem bomlik. A képződő fehérjék szerepe viszont addig is tanulmányozható. A bejuttatott DNS olyan szekvenciákat is tartalmazhat azonban, amelyek lehetővé teszik, hogy a DNSkonstrukció a kromoszómák DNS-ébe beépüljön (inszertálódjon). Ekkor transzgénként öröklődik tovább, sejtről sejtre, generációról generációra (13.9. és 13.10. ábra). Sokszor módosított transzpozonokat, retrotranszpozonokat vagy retrovírusokat alkalmaznak az idegen DNS genomba építésére, hiszen ezek eredeti működésük szerint képesek a befogadó sejt kromoszómájába inszertálódni. A beékelődéshez szükséges enzimet (pl. transzpozázt vagy integrázt) általában külön juttatják a sejtbe. kromoszóma
transzgén IR
IR marker gén regulátor szekvencia
expresszálandó gén
termeltetendő idegen fehérje 13.10. ábra. Egy tipikus transzpozon alapú transzgén szerkezete. A regulátor szekvencia szabályozza az expresszálandó gén működését. A marker gén a transzgén jelenlétének kényelmes detektálását teszi lehetővé. Az IR (inverted repeat) az a szekvencia, amely a mobilis genetikai elemek DNS-be történő beékelődését biztosítja. A transzgén tehát olyan idegen eredetű DNS egy élőlény valamelyik kromoszómájában, amely az ember céltudatos tevékenységének eredménye. A transzgént minden sejtjükben hordozó élőlényeket nevezik transzgénikus élőlényeknek. Ők egyben az ún. genetikailag manipulált organizmusok (GMO) egyik típusát alkotják. A riporter-konstrukciók egy részében a vizsgálandó gén szabályozó (promóter) részét, vagy annak jól meghatározott részeit olyan gének átíródó - strukturális részével (gyakran cDNS-ével) kombinálják, amelyek terméke könnyen felismerhető (13.11. ábra). Az átíródó részt riportergénnek nevezik. Minthogy az ilyen DNSkonstrukciók által kódolt ún. riporterfehérjék megjelenési mintázatát a másik gén szabályozó része határozza meg, a riporterfehérje jelenléte alapján vizsgálandó gén expressziós mintázatára lehet következtetni.
Riportergénként gyakran használják az E. coli lac operonjának lacZ génjét, amely terméke - a βgalaktozidáz - az X-gal nevű színtelen vegyületből kékszínű, jól felismerhető terméket készít (13.12. ábra). Riporterként - egyebek mellett - használják pl. a szentjánosbogár luciferáz génjét is, amely terméke - a luciferáz enzim - bontja a luciferint, és közben lumineszkál. Ma a leggyakrabban használt riportergén az Aequorea victoria medúzafaj GFP génje, amely a zölden fluoreszkáló proteint (GFP, green fluorescent protein) kódolja. Sőt, a GFP génnek vannak olyan mutáns változatai, amelyek kéken, sárgán, vagy vörösen „világítanak” (13.13. ábra).
A Promóter DNS
Gén
Átíródó rész
mRNS fehérje
B
Riportergén Promóter Riporter DNS
DNS mRNS riporterfehérje
C Promóter
DNS
Embrió
3 2 7
G CNS Sz
Petekezdemény
f b
n c
32 + 76 → 32 8 +4 78 2 06 → 20 0 - 7 tra +6 44 7 4 nsg 8 → 74 4 ene tra +6 → nsg 8 +4 ene tra 13.12. ábra. A Drosophila melanogaster 06 nsg (ecetmuslica) Importin-β képződését kódoló Ketel tra ene génje promóterének itt kivastagított szakaszait az E. nsg ene coli LacZ (riporter)génjével kombinálva lehetett
f c
megállapítani, hogy a promóter mely része biztosítja a Ketel gén szövetspecifikus expresszióját. A jel egy olyan in vitro indukált mutáció helyét mutatja, amely megszüntette egy transzkripciós faktor kötőhelyét. G: gonád (ivarszervkezdemény a lárvában); CNS: központi idegrendszer a lárvában; Sz: szemdiszkusz (a szemet kialakító sejtek csoportja a lárvában) (Lásd: Villányi et al., Mechanisms of Development 125, 822, 2008.)
Riportergén Átíródó rész
mRNS rekombináns fehérje 13.11. ábra. Riportergén-típusok. (A) A vizsgálandó gén expresszióját saját promótere (a szabályozó rész) szabályozza. (B) A vizsgálni kívánt promótert valamilyen riporterfehérjét kódoló DNS-sel kombinálják: a kódolt riporterfehérje expressziós mintázata jól követhető, és a promóter szabályozása alatt áll (C) A tanulmányozandó génben a kódoló szakasz mellé, a leolvasási keret megtartásával pl. a GFP-t kódoló DNS-szakaszt illesztik - a képződő rekombináns fehérje „ki van világítva”. A riportergéneket sejtekben vagy teljes élőlényekben kifejeztetve tanulmányozható a vizsgált (itt az A ábrán feltüntetett) gén expressziójának sajátosságai. Transzgénikus élőlények Gyakori eljárás, hogy baktériumgének erős promóterét kombinálják eukarióta gének cDNS-ével, és transzformálják mikroorganizmusokba, élesztőkbe, növényekbe vagy akár emlősökbe, azért, hogy bennük a cDNS által kódolt idegen fehérjét termeltessék. Ma már génsebészeti eljárással készített rekombináns DNS alapján termeltetnek baktériumokban pl. emberi inzulint, növekedési hormont, vagy antigéneket vakcináláshoz, termesztenek olyan transzgénikus növényeket, amelyek
13.13. ábra. Az ábrán a mikrotubulusok zöldek, az aktin mikrofilamentumok vörösek, mert a mikrotubulusokat alkotó tubulint zölden, a mikrofilamentumokat alkotó aktint vörösen fluoreszkáló riporterfehérjéhez fuzionálták. A sejtmagok DNS-festékkel kéken vannak „kivilágítva”.
például kártékony rovarokat távoltartó fehérjéket szintetizálnak és tartalmaznak. Léteznek olyan transzgénikus növények, amelyek valamilyen gyomirtószerre rezisztensek, ezért környezetükből a gyomokat ezzel a gyomirtószerrel ki lehet irtani, anélkül, hogy magát a haszonnövényt károsítaná. Vannak olyan transzgénikus birkák, amelyek teje az ember egyik véralvadási faktorát tartalmazza.
Restrikciós enzim
Homológ rekombináció
Ligáz
Elektroporáció
neoR gén
Ép gén
Embrionális csírasejtek tenyészete
Mutáns allél, benne a neoR gén
Embrionális csírasejt
Embrionális csírasejt egy mutáns és egy ép alléllal
13.14. ábra. Módszer géncserére. Az ép gén klónozott DNS-ét két restrikciós enzimmel „felnyitják”. A génbe idegen eredetű DNS-t ékelnek, ezért a gén elveszti funkcióját. A génbe illesztett DNS valamilyen (pl. neomicin) rezisztenciát kódol (neoR), valamint tartalmaz olyan markert is, ami a transzgénikus állatot azonosíthatóvá teszi (egerekben ez leggyakrabban szőrszín-marker). Ezt a rekombináns DNS-t megfelelő vektorban embrionális őssejtek tenyészetébe keverik, majd elektroporációval lehetővé teszik, hogy a sejtekbe bejussanak a DNS-molekulák. A sejtek némelyikében ritkán két homológ rekombináció következik be, amelynek hatására az ép allél a mutánsra cserélődik ki. Minthogy a mutáns allélt hordozó (arra heterozigóta) sejtek neomicinre rezisztensek, neomicin kezeléssel kiszelektálhatóak, szaporíthatóak.
Elvben az öröklődő betegségek is gyógyíthatóak lehetnek génsebészeti módszerekkel egy olyan folyamatban, amit génterápiának neveznek. DNS-el ugyanis elvileg bármelyik génfunkció hiányát pótolni lehet, úgy, hogy a sejtekbe/élőlényekbe transzformálják az ép fehérjét kódoló gént. Ez rutinszerű eljárás prokariótákban, élesztőkben és Drosophilában (azzal a különbséggel, hogy ott nem nevezik génterápiának). A gerincesek legtöbb génje sokkal nagyobb, semhogy egyetlen vektorba beleférne: túlságosan hosszú az a DNS szakasz, amely mind a strukturális, mind pedig a génexpressziót szabályozó szekvenciákat magába foglalja. Ilyenkor a cDNS egy alkalmasan megválasztott promóterrel megoldhatja a problémát, más kísérletekben mesterséges kromoszómákba építenek be nagy DNS-blokkokat, és ezek a kromoszómák vektorként funkcionálhatnak. A nehézségektől függetlenül már emberben is folyamatban vannak az első génterápiás próbálkozások. A génsebészeti és sejtbiológiai módszerek azt is lehetővé teszik, hogy pl. egerek adott génjének ép alléljait kémcsőben készített, ún. in vitro mutagenezissel előállított mutáns allélokra cseréljék ki (13.14. és 13.15. ábra). Az ilyen „géncserés” egerekben aztán tanulmányozható a mutáció hatása, és következtetni lehet az ép gén szerepére is. Azokat a kísérleti állatokat, amelyekben egy gén ép allélját egy funkcióját vesztett allélra cserélték ki, „knock out”oknak (pl. „knock out” egereknek) nevezik. A géncserés vagy a „knock-out” egér példa a genetikailag manipulált organizmusok másik típusára: nem idegen eredetű gént hordoz (azaz nem transzgénikus), hanem céltudatos emberi tevékenység nyomán az egyik saját génjének változott meg a genetikai tartalma.
Embrionális sejtek beültetése fejlődő embrióba
Az embrió beültetése álterhes egér méhébe
és
kiméra utódok
Megfelelő keresztezések után olyan egerek születnek, amelyek valamennyi sejtje egy genetikailag módosított, beültetett sejtből származik
13.15. ábra. Módszer olyan egerek „készítésére”, amelyek homozigóták a 13.14. ábrán bemutatott, a „génkiütött” mutációra.
Rekombináns DNS technológia; alkalmazások.
ÖSSZEFOGLALÁS Az elmúlt nagyjából három évtizedben kifejlődött génsebészet nemcsak a DNS-en alapuló diagnózist tette lehetővé, hanem a génexpresszió szabályozásának molekuláris szintű megértését, származástani kapcsolatok megismerését vagy genetikailag módosított élőlények előállítását is. A molekuláris biológia alapvetően megváltoztatta az életről, az élővilágról alkotott elképzeléseinket.
9
