A DNS kémiája a bölcsőtől a sírig
Vértessy Beáta
MTA Kémiai Tudományok Osztálya
Felolvasó ülés
2013. június 18.
Vázlat • • • • • •
Általános elvek Célzott problémára fókuszálás DNS módosulások szerepei Egy szokatlan bázis a DNS-ben Enzimatikus reakció mechanizmus: dUTPáz Racionális inhibitor tervezés
Hogyan tegyünk fel kérdéseket a mai molekuláris biológiában (kémiában)? Kísérlet-vezérelt kutatás Adatbázisok / rendszerbiológia Omikák
Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!! mindazon adatokra, melyeket a rendszerszemlélet begyűjtött
Omikák - Technológiák
SAGE journals
Választott megközelítés Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák
Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!!
Kémiai biológia – mi az? • Az élettudományok és a kémia/fizika közti határmezsgye • Kémiai technológiákat használ a biológiai folyamatok leírásához és megértéséhez • Rendszerszemléletű megközelítés: szintetikus biológia/kémia, szerkezeti/molekuláris/sejtbiológiai módszerek • Kvantitatív megközelítési módok • Dinamikus analízis – kinetika! • Ismert példa: farmakogenomika – kémiai genomika
A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett
Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil
Timin
Uracil – a leggyakoribb hiba Uracil – talán nem csak hiba? Jelátvitel!
DNS – kémiai nézőpontból H
O N P C
Reaktív csoportok sokasága egy lineáris polimerre fűzve
DNS-polimer reaktív centrumai és a javítás útjai
Replikációs UV sugárzás hibák
Ionizáló sugárzás Radioterápia Kemoterápia Szabadgyökök Repliszóma leállás
Környezeti toxinok
Alkilezés
adduktok
Száltörés Pirimidin dimerek
Hamis párok, inzerciók, deléciók
MMR
NER
DSB
BER
BRCA
UDG, dUTPáz
NER
Adott hibákra specializált javítás Alapvető: a módosított kémiai szerkezet felismerése
DNS károsodások G
A
T
ds DNS törés
ss törés Timidin dimer
©M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen’s University of Belfast.
C Hamis pár
C-U deaminálás
AP hely Kovalens keresztkötés
Figure 1. Schemes for target site location. ÉRZÉKELÉS: 3D 1D
Csúszik
Ugrál
Áthurkol
Halford S E , Marko J F Nucl. Acids Res. 2004;32:3040-3052 ©2004 by Oxford University Press
Bázis kivágó DNS hibajavítás (BER) DNS-glikoziláz felismeri a sérült/hibás bázist A sérült/hibás bázis lehasítása, szubsztrát elengedés, AP hely AP endonukleáz a cukor-foszfát gerincet a hibától 5’ irányban elvágja Polβ hidrolizálja az 5’ dezoxiribóz foszfátot és kitölti a lyukat; ligáz összevarr Jacobs and Schär, DNA glycosylases: in DNA repair and beyond. 2012, Chromosoma
DNS módosulás Érzékelők Jelátalakítók Végrehajtók
Jelátvitel
DNS javítás
Sejtciklus leállítás
Továbbírás
Sejthalál
Orvosbiológiai vonatkozások DNS-módosulások a karcinogenezisben: mutációs gyakoriság – hibás gének, pl BRCA Tumorsejtek támadása a DNS-károsodás válaszreakciói útján Fertőző mikroorganizmusok elleni küzdelem (mikobaktérium stratégia: hibatűrő polimerázok)
Kutatási módozatok Organizmus-szint: humán tumoros vs normál sejtvonalak Drosophila modellek (Szeged, Budapest)
In vitro: molekuláris és szerkezeti biológia, kinetika, egyedi molekulavizsgálatok
BRCA: egy DNS-javító fehérje mutációi a karcinogenezisben
A DNS kémiai tere limitált! • Ez sok korlátot jelent • De vannak azért érdekes, ritkább alkotók is! • Ritka bázisok: lehet hiba, lehet jel
A DNS kémiai tere limitált! • METILÁCIÓ: citozin, adenin • Prokarióták: „saját” DNS definiálása • Eukarióták: génkifejeződés szabályozása, epigenetika
Szokatlan alkotóelemek: szokatlan szerepek Uracil - Hiba - Jel a immunoglobulin gének diverzifikációjához - Fejlődésbiológiai kapcsoló - HIV genom integrálódáshoz kell - U-DNS fágok Ribonukleotidok - Hiba - Távtartó-vezérelt száltörés indukálás (architektúra-elem)
Első fejezet: Uracil: hiba, amit javítani kell
G-C A-U
Dezaminált citozin: mutagén uracil H H
O
N NH
NH
CH3
HN O
O
H
O
N
NH N H
guanin
dezaminálás NH N
N
N
N H
N
H N
N H
uracil
citozin
DNS replikáció H
H N H
N NH
N
O
O
N H
N NH
HN
N
adenin
CH3
N H
timin vagyis: 5-metil-uracil
N
O HN
N O
adenin
CH3
N H
uracil
Timin-helyettesítő uracil: ártalmatlan uracil dATP
dTTP >>
A-T A-U dATP
dUTP
H
H N H
NH
N
O
CH3
O
N H
N NH
HN
N
adenin
dUTP
DNS szintézis
DNS szintézis
N
dTTP <<
N H
timin vagyis: 5-metil-uracil
N
O HN
N O
adenin
CH3
N H
uracil
Uracil a DNS-ben? Két útvonal Citozin dezaminálás
Timin-helyettesítő
500/nap/genom MUTAGÉN Javító rendszert igényel: báziskivágó javítás (BER)
beépülés
magas sejtbeli dUTP/dTTP ÁRTALMATLAN nem feltétlenül javítandó, de BER szubsztrát hiábavaló ciklust generál
* * T G A C T C
T A G C T A C A T C G T C pol G U A G C A G
A G A T C U C A UG A G T
Uracil (dUMP) DNS-ben
Bázis kivágó javítás uracil-DNA UDG Glycosylase
Hogyan jön létre?
Hogyan távolítható el?
A T C G A T
T C C A
G A G T
APendonuclease APE T C C A
G A G T
dNTP pool safeguarding
Uracil mentesség biztosítása
KIVÁGÁS : UDG Dezaminált citozinra és timin-helyettesítő uracilra egyaránt NDP
dNMP
dUTPase dUTP hydrolysis
MEGELŐZÉS : dUTPáz Csak timin-helyettesítő uracilra
dUTPáz hiánya genomi instabilitást okoz dUMP dUMP dUMP
dTTP dTTP dTTP
dUTPáz dUTPase dUTPase
A dUMP-nek, a provides provides dTTP dTTP dTTP prekurzorának precursor precursor termelése A dUTP szint decreases decreasesdUTP dUTP csökkentése
dUTP dUTP
level level
high dUTP/dTTP DNA polymerase DNA polymerase UU UU
UU
UU U CU
UU
Lack of dUTPase Lack of dUTPase
Uracil(U) (U)substituted substituted Uracil DNA DNA BER C C
DNA double strand breaks Chromosome fragmentation
CELL DEATH
Pécsi et al, 2011 PNAS Toth et al 2007 JBC Kovári et al 2004 JBC Dubrovay et al 2004 JBC Barabás et al 2004 JBC Békési et al 2004 JBC Németh et al 2007 NAR Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Merényi et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 NAR Horváth et al, 2010 NAR Békési et al, 2011 FEBS J Muha et al, 2012 PLoS Genetics
Timinmentes sejthalál: a kemoterápia egyik fő eszköze dUTPáz inhibitor dUTP
dUMP Fluorouracil (FdUMP)
DNA dTTP
dTDP
TS dTMP
THF DHF reductase
Methotrexate
dihydrofolate
Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dTTP / dUTP arány perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát reduktáz (DHF) vagy a dUTPáz gátlásával. p53-deficiens tumorsejtekben is működő stratégia!
Főbb céljaink • A timinmentes sejthalál vizsgálata humán tumoros és normál sejtvonalakban • Az uracil-DNS szerepének felderítése különböző organizmusokban • dUTPáz-gátló gyógyszerjelöltek azonosítása: tumorok ellen, de patogén mikroorganizmusok ellen is!
Projektek/Módszerek Szerkezeti biológia Mechanistic studies Species-specific characteristics Folding Enzyme kinetics Low resolution conformational spectroscopies (CD, fluoresc.) EPR-ENDOR Multidimensional NMR X-ray crystallography Mit vizsgálunk: Uracil-DNS metabolizmus
Élettani szerep Developmental and cellcycle-dependent regulation Role in DNA repair / apoptosis Mechanism of thymine-less cell death Expression patterns Subcellular localisation Proteomic search for interacting networks Overexpression Knock-out / RNA interference Nucleo-cytoplasmic trafficking
SuperNova egykristály diffraktométer
Biostruct Laboratórium Kristályosítás és röntgenkrisztallográfia -kis- és makromolekuláris/komplexek-
Mosquito kristályosító robot 96 csepp/2 perc
Contact: BME CH épület Homepage: Biostruct laboratórium Budapest, 1113 Szt Gellért tér 4 www.biostruct.enzim.hu E-mail:
[email protected],
[email protected]
Képalkotó rendszer/Rock Imager
dUTPáz szerkezet Szimmetrikus homotrimer B
A
B C
A
N
C
1
2
3
4
5
C
Három aktív centrum Mindhárom monomer részt vesz az aktív centrum felépítésében
Mg2+
Mg2+
dUTPáz +
+
Ala39
I Asp42
IV
Gln123
Arg120 Wcat
Mg
Asp95 Val93 Ile94 mc
III
Arg79 Ser80
II Ser81
Tyr98 nucleotide
2H+
Intermedierek a reakció koordináta mentén
b
E-S
S c Approach Intermediate, (E-AI)
E a d
*
TS mimic intermediate (E-S/E-piP mix)
e Post-attack Intermediate (E-piP)
f
P E-P
Intermedierek a reakció koordináta mentén: 3D szerkezetek különböző intermedierekre E-I int, mix density Near-attack conformer
2.5 A
Note: Wcat and aP densities separate.
Intermediate model shown in dark red. Mixture model shown in two shades of green. Light green: the product dUMP, dark green: the substrate a,b-imino-dUTP
Expected intermediate
Dissociative mechanism
Reactants
Products Expected intermediate
Associative mechanism
Crystallographic intermediate 1 (E-AI)
Experimentally described intermediates 1-3
Crystallographic intermediate 3 (E-piP) Crystallographic intermediate 2 (E-S/E-piP mix)
dUTPáz gátlás hatása a sejt proliferációra 5-FdUR jelenlétében gyakran használt kemoterápiás szer
dUTPaz gatolt kontroll1 kontroll2
110
Survival (% of Control)
100 90
dUTPáz gátlás nagyban növeli az érzékenységet 5-FdUR-re
80 70 60 50 40 30 20 0
24h
48h
72h
Incubation time (hours)
96h
Timinmentes sejthalál: a kemoterápia egyik fő eszköze Proof of concept: igazoltuk, hogy itt a több helyen való támadás előnyös! dUTPáz inhibitor. siRNS dUTP
dUMP Fluorodezoxi-uridin
DNA dTTP
dTDP
TS dTMP
THF DHF reductase
Methotrexate
dihydrofolate
Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dTTP / dUTP arány perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát reduktáz (DHF) vagy a dUTPáz gátlásával.
Szerkezet és mechanizmus alapú inhibitor tervezés Munkafolyamat 1.
HTS In silico screening 2 millió vegyületre 2. In vitro enzimtesztek 100-200 vegyületre 3. Sejtbeli gátlás 350 vegyületre 4. Humán sejt vizsgálatok 50 vegyületre
5.
Állatkísérletek
6.
Szabadalmaztatás
Humán dUTPáz: rákos sejtekben túltermelt, védő faktor a tumornak Ha gátoljuk, csökken a tumorsejt életképessége
Tuberkulózis és malária: dUTPáz, mint közös target fehérje Mycobacterium tuberculosis és Plasmodium falciparum Két fontos enzim hiányzik -dCMP dezamináz -Timidin kináz
dUTPáz: Nemcsak a dUTP elbontásában, hanem a dUMP/dTTP termelésben is kulcsszerepe van
M. tuberculosis dUTPáz Mikobaktérium-specifikus szegmensek
Specificitási szegmensek : fajspecifikus inhibitorok Varga et al 2008, Pécsi et al 2012 PDB ID: 2PY4
Második fejezet: Uracil: jel, ami élettanilag fontos
Paradigma váltás Korábban csak hibaként tekintetbe vett DNS módosulások új szerepei
Uracil, illetve egyéb DNS-hibák a javító útvonalakon kívül más jelátviteli útvonalakba is bekapcsolódhatnak
Az uracil bázis fontos jelátviteli szignál: IgG gének, indukált dezaminálás adott helyen
A megfelelő helyen keletkezett uracil elindítja a DNS-száltöréshez vezető utat UNG enzim hiánya egérben: immundeficiens tünetegyütteshez vezet
DNS károsodások G
A
T
ds DNS törés
ss törés Timidin dimer
©M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen’s University of Belfast.
C Hamis pár
C-U dezaminálás
AP hely Kovalens keresztkötés
BER javítás és epigenetika kapcsolata
Hibás bázis vagy metil-citozin
DNS glikoziláz UNG/TDG
TDG(UDG)-függő aktív demetiláció
Kivágott bázis
Uracil-DNS: - közvetlen mérés a genomi DNS-ből a személyre szabott gyógyítás indikátora lehet - mintázatának feltérképezése a jelátviteli funkciók megértéséhez is kell
• Hogyan mérhető a genomi uracil? • Több módszer létezik: kvalitatív, kevéssé érzékeny • Tömegspektrometria: viszonylag megbízható, de hosszadalmas, indirekt • EGYIK SEM ALKALMAS A KÖRNYEZET FELDERÍTÉSÉRE!
wt N N N N N N N NPfu N N pol N N N N N N N N N N N N N U N N N N N N N
5’
N N N N N N N N N N N N N U N N N N N N N
50000
40000
40000
if t
30000 Sh
10000
Pfu V93 (544b) Pfu wt (544b)
0
0
10
20
30
cycle number
40
fluorescence
50000
20000
5’
V93 pol Pfu N N N N N N N N N N
Cq
fluorescence
PCR-alapú assay: Közvetlen Egylépcsős Kvantitatív
5’
5’
Pfu V93 (1057b) Pfu wt (1057b)
30000 20000 Cq shift
10000 0
0
10
20
30
cycle number
40
Horváth and Vértessy, Nucleic Acids Research, 2010 Muha et al PLoS Genetics, 2012
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
wt MEF Ung-,- MEF
Génhiányos sejtek és FUdR kezelés
0 100 5FUdR added (M)
deoxyuridine content (1/million
8500 8000 7500 7000 6500
Génhiányos sejtek FUdR kezelés Sejtciklus állapotok
750 500 250 0 dut
+
+
-
+
+
+
+
-
ung
+
-
-
+
-
-
-
-
5FUdR (µM)
-
-
-
-
-
30.7
61.3
-
D 100
Viability (%)
deoxyuridine content (1/million)
Cq (Pfu wt)
A B wt E. coli A DNS-beli uracil tartalom Ung- E. coli 40 a kvantitatív PCR módszerrel Dut-,UngE. coli 35 az 30 egyes különböző sejtekben és 25 állapotokban Génhiányos sejtek -sejtciklus fázisok, 20 15 - gyógyszeres kezelés, 10 - génkiütések 5 jól mérhető, 5 10 15 „tetszőlegesen” 20 25 30 35 40 Cq (Pfu V93) feltérképezhető C
75 50 wt MEF Ung-,- MEF
25 1
10
100
5FUdR (M)
1000
Uracil-DNA in Drosophila
dUTPáz jelenléte negatív korrelációt mutat a DNS-beli uracil szinttel
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 E
L1
L2
L3
Developmental stages
Uracil szint
1.0
WT 0.8
DAPI
dUTPáz szint
0.6 0.4 0.2
dUTPase
1,0
Relative dUTPase mRNA level
Relative dUTPase mRNA level
Muha et al. 2012, PLoS Gen.
0.0
P
disc
sal.gl.
RNAi
Uracil-DNA in Drosophila
dUTPáz gátlása transzgénikus muslicában letális Muha et al. 2012, PLoS Gen.
WT
WT
RNAi
RNAi
no of TUNEL positive cells/img. disc
TUNEL assay
Báb-állapotbeli elhalás
500 400 300 200 100 0
WT
dut RNAi
dUTPáz gátlás egyes szöveti régiókra irányítható: ahol gátolva van, pontosan ott elhal a szövet! 100%
blistered
80%
deformed
60% 40%
WT
20% 0%
MS1096 siRNA
21883
21883; 21883; DmDut20 DmDut29
21884
21884; 21884; DmDut20 DmDut29
Ecetmuslica modellszervezet: A dUTPáz élet/halál döntést közvetít, a DNS-beli uracil jelenléte a fejlődési állapottól függ
A dUTPáz jelenlétében túlélnek, hiányában elhalnak a szövetek
Konklúziók: A DNS módosulások karcinogén hatásuk mellett más szerepeket is betöltenek A DNS-beli uracil adekvát példája a kettős szerepnek A rákterápiában gyakori gyógyszerek hatásmechanizmusát vizsgáljuk többféle nézőpontból Módszert alkottunk a DNS-beli uracil genom-környezetbeli feltérképezésre A dUTPáz lényegi voltát igazoltuk, jelenleg a kapcsolódó jelátviteli utakat vizsgáljuk
Köszönet: Hudecz Ferenc Perczel András ELTE Erdélyi Miklós Szabad János Henn László SZBK Genetika
Genom Metabolizmus Laboratórium
