A citoszkeletális rendszer Az eukarióta sejtek dinamikus fehérje-vázrendszere, amely specifikus fehérjepolimer filamentumokból épül fel. • Mikrofilamentumok • Mikrotubulusok • Intermedier filamentumok
Aktin a citoszkeletális rendszer fő fehérjéje Aktin monomer (G aktin): • az eukarióta sejtek legnagyobb mennyiségben termelt fehérjéje • 375 aa, 43 kDa • erősen konzerválódott • ATP kötés és hidrolízis • polimerizációra képes (F aktin)
Aktin filamentumok A polimerizáció szakaszai: ¾ a polimerizációs centrumok kialakulása (lag fázis) ¾ a filamentumok növekedése (log fázis) ¾ egyensúlyi állapot kialakulása
• átmérő: 7 nm, hossz: ~ μm • alegységenként 2 kötőhely • aszimmetrikus szerkezet: + és - vég • alegységek 166º-ban elforgatva Æ kettőshélix megjelenés (λ = 72 nm)
Aktin polimerizáció • reverzibilis • a két végen eltérő sebességgel folyik • dinamikus egyensúlyi állapot alakul ki (monomer cc) • az ionerősséggel szabályozható • az ATP-aktin gyorsabb polimerizációra képes • a beépült alegységek az ATP-t lassan hidrolizálják
Treadmilling (taposómalom): a két végre jellemző kritikus koncentrációk közötti koncentráció tartományban a + végen folyamatosan ATP-aktin épül be, a - végen ADPaktin válik le. A filamentum átlagos hossza nem változik.
A polimerizáció szabályozása Aktinkötő fehérjék: • szabályozzák a filamentumok leépülését (pl. cofilin) • gátolják a filamentumvégen a beépülést (sapkafehérjék: gelsolin ← Ca++ aktiválás) • elősegítik a GDPÆGTP cserét (profilin) • az aktin filamentumok kölcsönhatását
Aktin-kötegek és hálózatok A sejtekben az aktin filamentumok magasabb rendű szerkezeteket formálnak. Ezt kötegképző és hálózatformáló fehérjék segítik. A kötegek pl. a sejtnyúlványok képződésében fontosak, a hálózatok a plazmamembrán alatti sejtfelszínt erősítik.
14 nm
Aktin-kötegek Az aktin kötegekben párhuzamos szálak vannak keresztkötve aktinkötő fehérjék által. Aktin-kötegképző fehérjék: • viszonylag kis méretűek és merev szerkezetűek • legalább 2 kötődomént tartalmaznak • meghatározzák a kötegek pakoltságát és mechanikai tulajdonságait • általában külső jellel (Ca++) vezérelhetők 40 nm
Fimbrin (66 kDa monomer): azonos polaritású szálakból szorosan pakolt köteget hoz létre α aktinin (2 x 102 kDa dimer): lazább, flexibilis kötegeket képez
Aktin hálózatok Hálózatképző fehérjék: • nagyok és flexibilisek • akár merőleges filamentumokat is rögzíthetnek • dimer szerkezetűek
Diamin: 280 kDa dimer A dimerizációs és aktinkötő domének a molekula két végén találhatók, két hosszú flexibilis kar választja el őket.
A miozin molekuláris motor A miozin molekuláris aktinszálak mentén képes ATP kémiai energiáját mechanikai energiává, s és mozgást generál.
motor az mozogni. Az alakítja át közben erőt
A miozin fejrészének szerkezete
Az izomsejt alapegysége a szarkomer Izomsejt Æ miofibrillum Æ szarkomer
A szarkomer szerkezete
Z lemez
Z lemez
M vonal vastag filamentum
vékony filamentum
Az aktinszálakat a nebulin filamentumok stabilizálják. A titin óriásfehérje (3000 kDa) a Z lemezt az M vonallal köti össze és az izom nyugalmi tenziójáért felelős.
A vastag filamentum felépítése
A miozin szerkezete
Az akto-miozin komplexum A miozin fejek keresztkötéseket alakítanak ki a vastag és vékony filamentumok között.
A csúszó filamentum modell (Huxley, 1954) Az izomműködés során a vastag és vékony filamentumok elmozdulnak egymáshoz képest Æ a szarkomer hossza megváltozik. Az elmozdulást a miozin motorfehérje generálja.
In vitro motilitás vizsgálat
A miozin motorfehérje • 500 kDa oligomer fehérje • 2 nehézlánc, 4 könnyűlánc • nehézlánc: globuláris fejrész, hosszú helikális farokrész • fejrész: aktin kötőhely, ATP kötőhely • farokrész: helikális kötegképződés Æ dimerizáció • a fejrészekhez 1-1 könnyűlánc pár kötődik
A miozin működése ATP hiányában a miozin kötődik az aktinhoz ATP kötés Æ fejrész leválik ATP hidrolízis Æ konformációváltozás Æ fejrész előre lendül A miozin fej új pozícióban kötődik Æ Pi disszociál Pi leválása erőlökést indukál Æ filamentum elmozdul, ADP leválik, eredeti konformáció helyreáll
A miozin motorok az aktin filamentumok + vége felé haladnak. Az ATP hidrolízis biztosítja az elmozduláshoz szükséges energiát.
A miozin működésének szabályozása A tropomiozin és a troponin fehérjék szabályozzák az izomműködést. A tropomiozin az aktinfilamentum árkába kötődik. A troponin 3 alegysége – C (Ca++ kötő), I (gátló), T (tropomiozin kötő) - kötődik az aktin tropomiozin komplexhez és megakadályozza az aktin-miozin kölcsönhatást. Magas Ca++ koncentráció hatására a troponin C konformációváltozása megszünteti a gátlást
Sejtnyúlványok képződése
Mikrotubulusok
Alapvető szerepet játszanak a sejtek alakjának meghatározásában és többféle sejtmozgásban. Részt vesznek a sejtorganellumok intracelluláris transzportjában és a mitózis során a kromoszómák szétválasztásában.
A mikrotubulusok felépítése • 25 nm átmérőjű merev, üreges csövek • 13 tengelyirányú protofilamentum • aszimmetrikus felépítés • Tubulin fehérje: ¾ molekulatömeg 2 x 55 kDa ¾ dimer: α és β alegység ¾ GTP kötés és hidrolízis ¾ GTP-β tubulin stabilizál
Filamentumképződés mechanizmusa: • treadmilling • dinamikus instabilitás
A mikrotubulusok szerkezete
A mikrotubulusok polimerizációja ¾ Dinamikus polimerizációs egyensúly ¾ + végen a polimerizáció gyors, - végen lassú ¾ Ciklikusan váltakozó növekedési és fogyási fázisok (dinamikus instabilitás) ¾ Egy polimerizálódó filamentum egy sejtorganellumra erőt képes kifejteni ¾ A polimerizációt befolyásoló szerek (pl. kolhicin, taxol) fontosak a rákterápiában ¾ A mikrotubulusok növekedése a mikrotubulus-szervező centrumokból indul (γ tubulin) ¾ A polimerizációt a MAP fehérjék szabályozzák
Dinamikus instabilitás A lassú felépülést gyors depolimerizáció követi.
A sejtek alakjának meghatározása
Sejtnyúlványok kialakítása
Mikrotubuláris motorok
A kinezin motorfehérje szerkezete ¾ 2-2 nehéz- (110 kDa) és könnyűlánc (70 kDa) ¾ Nehézlánc: • N-terminális fejrész: mikrotubulus kötőhely, ATPáz aktivitás (motordomén) • egymásba fonódó helikális farokrészek ¾ Könnyűláncok: • célobjektum felismerése és megkötése • a nehézláncok C-terminális részéhez kötődnek ¾ Rokonság a miozin motorfehérjével
A kinezin mozgása • lépések hossza 8 nm • ~ 20-100 lépés/s • + vég felé halad • erőt képes kifejteni • minden lépés során elbont egy ATP molekulát • szorosan csatolt mechanikai és enzimatikus ciklus • processzivitás
Hogyan mozog a kinezin? catalytic core ATP binding to the leading head initiates neck linker docking
tubulin heterodimer
α-tubulin
β-tubulin
tightly docked neck linker
detached neck linker
Neck linker docking is completed by the leading head, which throws the partner head forward by 160 Å toward the next tubulin binding site
The trailing head hydrolyzes ATP to ADP-Pi
The new leading head docks tightly onto the binding site
The trailing head, which has released its Pi and detached its neck linker (red) from the core, is in the process of being thrown forward. Adapted from: Figure 1 in Vale & Milligan (2000) Science, Vol 288, Issue 5463, 88-95
A dienin motorfehérje szerkezete
¾ Óriásfehérje (2000 kDa) ¾ 2-3 nehéz és számos könnyűlánc ¾ Nehézláncok végén globuláris ATP-kötő motordomén ¾ A molekula bazális része kötődik a szállítandó szubcelluláris struktúrához
Mit szállítanak a kinezinek és dieninek?
Fig. 20-23
Egyéb mikrotubuláris mozgások
Motorfehérjék általános jellemzése ¾ N-terminális globuláris fej: motordomén Æ nukleotid kötés és hasítás, specifikus kötődés a (citoszkeletális) polimerhez ¾ C-terminális részen célobjektum kötőhelye ¾ ciklusos működés ¾ mechanikai ciklusonként egy nukleotid (ATP) hidrolízise
Vizsgálati módszerek: • in vitro motilitás próba • lézercsipesz • teljes visszaverődéses fluoreszcencia (TIRF)
Lézercsipesz
Erőmérés lézercsipesszel
TIRF (Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia)
A mikrotubulusok mentén haladó kinezin motorfehérjék
Rotációs motorok: ATP szintetáz Mitchell-féle kemiozmotikus hipotézis (1961): a mitokondriumokban lejátszódó respirációs folyamatok a belső membránon megjelenő protongradiens révén csatoltak az ATP szintézishez.
Kísérleti igazolás: Mesterséges lipid vezikulába épített bakteriorodopszin – ATP szintetáz rendszer megvilágítás hatására ATP szintézisre képes.
Az ATP szintetáz (F1F0ATPáz) felépítése F1 alegység: • α3, β3, γ, δ, ε láncok • α3β3 hexamer gyűrűt képez • γ az α3β3 gyűrű tengelyében forog F0 alegység: • a1, b2, c10-14 láncok • membránba ágyazott c gyűrű (forgórész) • protoncsatorna az a alegység belsejében
Az F1 szerkezete:
Az ATP szintetáz kötődési állapot változásai
A β alegység zárt és nyitott állapota:
Az F0 C-gyűrű forgási mechanizmusa Az a alegység belsejében 2 elkülönült fél protoncsatorna található:
A protonmozgás útvonala
Az ATP szintetáz forgásának kísérleti igazolása
Biológiai motorok (összefoglalás)
Lineáris motorok: • Aktin alapú motorfehérjék (miozinok)
• Mikrotubulus alapú motorfehérjék (dineinek, kinezinek, dynaminok) • DNS alapú motorok (polimerázok)
Rotációs motorok: • F1F0 ATP-áz
• Flagelláris motor
