A CHRONICUS LYMPHOCYTÁS LEUKAEMIA ÉS A DIFFÚZ NAGY B-SEJTES LYMPHOMA IMMUNGLOBULIN NEHÉZLÁNC GÉNJEINEK MUTÁCIÓS STÁTUSZA RICHTER SZINDRÓMÁBAN

A CHRONICUS LYMPHOCYTÁS LEUKAEMIA ÉS A DIFFÚZ NAGY B-SEJTES LYMPHOMA IMMUNGLOBULIN NEHÉZLÁNC GÉNJEINEK MUTÁCIÓS STÁTUSZA RICHTER SZINDRÓMÁBAN

Doktori értekezés Dr. Timár Botond Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Matolcsy András egyetemi tanár, MTA doktora Hivatalos bírálók:

Dr. Magyarosy Edina egyetemi docens, Ph.D. Dr. Sápi Zoltán főorvos, orvostud. kandidátusa

Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Demeter Judit egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Simon Károly osztályvezető főorvos, orvostud. kandidátusa Dr. Várkonyi Judit egyetemi adjunktus, Ph.D.

Budapest 2006.

TARTALOMJEGYZÉK I. Összefoglalás

4

II. Summary

5

III. Bevezetés

6

III.1. A chronicus lymphocytás leukaemia

6

III.1.1 A B-CLL morfológiája

7

III.1.2 A B-CLL immunfenotípusa és genetikája

10

III.1.3. A B-CLL sejteredete

11

III.1.3.1 Az immunglobulin (Ig) gének szerveződése

11

III.1.3.2 Az IgH génátrendeződés

12

III.1.3.3 A B-sejtek fejlődési fázisai

14

III.1.3.4 A B-CLL sejteredete

16

III.2 A Richter szindróma

19

III.2.1 A lymphoma progresszió

19

III.2.2 A Richter szindróma

19

III.2.3 A diffúz nagy B-sejtes lymphoma

20

III.2.4 A Richter szindróma gyakorisága, klinikuma

21

III.2.5 A Richter szindróma morfológiája és immunfenotípusa

21

III.2.6 A Richter szindrómában előforduló genetikai változások

22

III.2.7 A B-CLL és a Richter szindróma klonális kapcsolata

24

IV. Célkitűzés

28

V. Anyag és módszer

29

V.1 Szövetminták

29

V.2 DNS izolálás

29

V.3 Az IgVH CDR3 régiójának PCR vizsgálata

31

V.4 Az IgVH gének PCR amplifikációja, klónozása és szekvenálása

32

VI. Eredmények

36

VI.1 Klonális kapcsolat a CLL és a kialakuló DLBCL minták között

36

VI.2 A mintákban előforduló VH géncsaládok

37

VI.3 Az IgVH gének szomatikus mutációi

38

VI.4 A szomatikus mutációk elemzése

38

-2-

VII. Megbeszélés

44

VIII. Eredeti megállapítások

49

IX. Rövidítések jegyzéke

50

X. Irodalomjegyzék

53

XI. Saját közlemények jegyzéke

66

XII. Köszönetnyilvánítás

68

-3-

I. ÖSSZEFOGLALÁS

A

chronicus

lymphocytás

leukaemia

(CLL)

indolens

lefolyású

lymphoproliferatív kórkép. Az esetek egy részében a megbetegedés klinikai és morfológiai progressziót mutat diffúz nagy B-sejtes lymphomába (DLBCL), amit Richter szindrómaként ismerünk. Az immunglobulin nehézlánc gének (IgVH) mutációs státuszának prognosztikai szerepe van a CLL-ben. Azoknál a betegeknél, akik mutált IgVH gént hordoznak, a betegség jobb prognózisú, míg azon betegek esetében akiknek az IgVH génjük nem mutált, a betegség sokkal agresszívebb lefolyású. Azon CLL-ek mutációs

státusza,

amelyek

DLBCL-be

transzformálódnak,

nem

ismert.

Tanulmányunkban ezért azt vizsgáltuk, hogy a Richter szindróma a mutált vagy a nem mutált IgVH génekkel rendelkező CLL-ből alakul-e ki.

Nyolc eset mintapárjain

végeztük el az IgVH gének mutációs státuszának elemzését. A CLL-es és a DLBCL-es tumorklónok öt esetben azonosnak és három esetben különbözőnek bizonyultak. Hat CLL-es minta nem mutált, két minta mutált IgVH gént hordozott. A hat nem mutált CLL esetből ötben a DLBCL-ek IgVH génje sem tartalmazott szomatikus hipermutációt és a DLBCL klónok a CLL-es tumorklónokból származtak. Egy nem mutált és két mutált CLL-es esetben a DLBCL mutált IgVH-t hordozott, de ebben a három esetben a tumorklónok nem egyeztek meg egymással, ami független, második tumor létrejöttét jelenti. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy a klinikai lefolyás szerint egységes Richter szindróma keletkezési mechanizmusa alapján két úton, transzformációval és de novo második tumorként is kialakulhat. A CLL-ek DLBCL-be való transzformációja azonban csak a nem mutált altípusba tartozó CLL-ekben lép fel.

-4-

II. SUMMARY

Patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) may develop diffuse large Bcell lymphoma (DLBCL), also known as Richter’s syndrome. Mutational status of immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH) genes have prognostic impact in CLL. Patients with mutated IgVH genes have stable disease, whereas patients with unmutated IgVH gene have more aggressive disease. The mutational status of CLLs that transform to DLBCL is unknown. To reveal whether Richter’s syndrome occurs in CLLs with mutated or unmutated IgVH genes, we have performed mutational analysis on serial specimens from eight patients. CLL and DLBCL tumorclones were identical in five cases and they were different in three cases. Six CLL expressed unmutated and two cases expressed mutated IgVH genes. In five of the six unmutated CLLs, the DLBCL clones evolved from CLL tumorclones and the IgVH genes expressed by DLBCLs were also unmutated. In one unmutated and two mutated CLLs, the DLBCL expressed mutated IgVH genes, but in these three cases the DLBCL tumorclones developed as independent secondary neoplasm. These result suggest that Richter’s syndrome may develop in both mutated or unmutated CLLs, but clonal transformation of CLL to DLBCL occur only in the unmutated subgroup of CLL.

-5-

III. BEVEZETÉS III.1. A CHRONICUS LYMPHOCYTÁS LEUKAEMIA A chronicus lymphocytás leukaemia (CLL)/ kis lymphocytás lymphoma (SLL) klonális lymphoproliferatív megbetegedés, amelynek az incidenciája 3/100000

1

,

és amely az összes non-Hodgkin lymphoma (NHL) 6,7 %-át alkotja.2 Megjelenésekor az átlagos életkor 65-70 év, a betegség férfiaknál kétszer gyakoribb, mint nőknél. A 65 év feletti felnőtt lakosságban előforduló leukaemiák 40%-át teszi ki, a betegség az esetek 20-30%-ában az 55 év alatti populációban jelenik meg, ugyanakkor a 30 év alattiakban nagyon ritka. 1 A betegség klinikai lefolyása heterogén. A betegek többsége hosszabb-rövidebb ideig is tünetmentes lehet, és csak később jelentkeznek az általában aspecifikus tünetek, mint például gyengeség, fáradékonyság, súlyvesztés, jellemző lehet a splenomegalia, hepatomegalia, lymphadenopathia is.3,

4

Vannak esetek, ahol a hosszú tünetmentes

túléléshez sem kell terápiás beavatkozás, de vannak olyanok is, ahol az agresszív kezelés ellenére sem sikerül biztosítani a betegek túlélését.5 A CLL diagnózisakor a betegekben a csontvelő lymphocytás infiltrációja és a perifériás vér abszolút lymphocytosisa (több mint 5000 érettnek tűnő lymphocyta/μl) figyelhető meg (B-CLL), az esetek kisebb részében csak a nyirokcsomók érintettek (B-SLL).

A

betegség

ezen

két

megjelenési

sem prognosztikailag nem különbözik egymástól.

-6-

formája

sem

klinikailag,

III.1.1 A B-CLL morfológiája A B-CLL/SLL az érett B-sejtek daganatos betegsége. A B-CLL-es betegek vérében és csontvelejében is kis, heterokromatinizált magvú, keskeny, enyhén basophil cytoplasmával rendelkező lymphocyták szaporodnak fel (1A. ábra). A vérből készült kenetben a daganatos sejtek mellett gyakran megfigyelhetők a szétesett sejteknek megfelelő felhők, az úgynevezett Grumprecht rögök, amelyek a kenetkészítés során széteső, fizikai behatásra érzékeny tumorsejtek maradványai (1B. ábra).

A

B

1. ábra CLL megjelenése perifériás kenetben. (A) Heterokromatinizált magvú, keskeny, enyhén basophil cytoplasmával rendelkező lymphocyták a beteg vérében. (Giemsa, 1000X) (B) A perifériás kenetben azonosítható károsodott lymphocyták (Grumprecht-rögök, nyíl) (Giemsa, 400X).

CLL-ben a prolymphocyták száma kevesebb mint 3%. A 10% feletti prolymphocyta-arány a kórkép agresszívebb klinikai lefolyású variánsát jelzi, amelyet krónikus lymphocytás leukémia / prolymphocytás lymphoma (CLL/PLL) diagnózissal jelölnek.7 A csontvelői infiltráció általában noduláris, intersticiális vagy diffúz jellegű, de a csontvelő peritrabecularis tereit nem érinti (2. ábra).

-7-

A

B

C

D

E

F

2. ábra CLL szövettani megjelenése csontvelőben. (A) Kis, kerek magvú, keskeny cytoplasmájú sejtek diffúzan infiltrálják a csontvelőt (HE, 40X). (B) Az immuhisztokémiával láthatóvá válnak CD20+ infiltráló sejtek (CD20 immunhisztokémia, 40X). (C-D) Hasonló módon tehető láthatóvá a noduláris (HE, 40X; CD20, 40X) és az (E-F) intersticiális (HE 100X; CD20 100X) típusú infiltráció is.

-8-

Nyirokcsomó érintettség esetén annak follicularis alapszerkezete felbomlik. Állományában a sötétebb, kisebb sejteket tartalmazó háttér mellett nagyobb sejteket tartalmazó világosabb területek, úgynevezett pseudofolliculusok vannak jelen.6 Az infiltrátumban a kis 6-12 μm átmérőjű keskeny cytoplasmájú lymphocyták dominálnak, amelyeknek

kerek, heterokromatinizált magjuk van7 (3A. ábra).

A mitotikus aktivitás általában nagyon alacsony. A pseudofolliculusok, vagy más néven proliferációs centrumok, kis, középnagy és nagy sejtekből állnak. A közepes méretű sejtek a prolymphocyták, melyek laza kromatinnal és kis nucleolusszal rendelkeznek. A paraimmunoblastok középnagy-nagy sejtek, amelyeknek kerek vagy ovális sejtmagjuk, centrálisan elhelyezkedő eosinophil nucleolusuk és enyhén basophil cytoplasmájuk van8, 9 (3B. ábra). A lépben a betegség a fehér pulpában van jelen, de a folyamat előrehaladtával az infiltrátum diffúzzá válhat. 10

A

B

3. ábra CLL szövettani megjelenése nyirokcsomóban és kenetben. (A) A nagyobb sejteket tartalmazó világosabb területek (pseudofolliculusok) a nyirokcsomó felbomlott állományában (HE, 40X). (B) A pseudofolliculuson belül nagyobb prolymphocyták, immunoblastok és paraimmunoblastok láthatóak a kis, kerek, tömött kromatinnal rendelkező sejtek mellett. (HE, 200X)

-9-

III.1.2 A B-CLL immunfenotípusa és genetikája A tumorsejtek a B-sejtes markerek közül a CD19, CD20, CD23-at expresszálják a T-sejtekre jellemző CD5-tel együtt. Alacsony intenzitással fejezik ki a felszíni IgM-et és/vagy IgD-t. A tumorsejtek CD10, Cyclin D1, CD22 és FMC7 negatívak (4. ábra).11-14

4. ábra CLL kimutatása áramláscitometria segítségével. A lymphocyták CD19-CD23-CD5 koexpressziót mutatnak lambda könnyűlánc izotípusexklúzió mellett, amely a CLL jellemzője.

Az immunglobulin könnyű- és nehézláncok klonális átrendeződést mutatnak. Az immunglobulin nehézlánc variábilis régiójának (IgVH) génjei 40-50%-ban nem hordoznak szomatikus mutációkat, 50-60%-ban azonban az IgVH gének szomatikus hipermutációja figyelhető meg, amivel jól korrelál a ZAP70 és a CD38 markerek expressziója (nem mutált IgVH esetén a CD38 és a ZAP70 emelkedett). Fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) az esetek 80%-ában mutatható ki valamilyen abnormális kariotípus15 (5.ábra). A 12-es kromoszóma triszómiája az esetek 20%-ában, a 13q14 deléció az esetek 50%-ában fordul elő.16, 17 Míg a 12-es triszómiás esetek nagy részében

- 10 -

az IgVH nem mutált, addig a 13q14 deléciót hordozó esetekben gyakrabban írtak le mutációt18. A 11q22-23 deléció 20%-ban, a 6q21 5%-ban és a 17p13 az esetek 10%-ában jelenik meg.19

A

B

13

11

C

D

12 5. ábra CLL citogenetikai eltérései. (A) A 11q22 régió deléciója FISH (2 piros jel helyett csak 1 látható) és metafázis kromoszóma vizsgálattal. (B) 13q14 deléció. (C) A 12-es kromoszóma triszómiája (három zöld centroméra-specifikus jel látható a normális kettő helyett). (D) A 17p13 régió deléciója.

III.1.3. A B-CLL sejteredete III.1.3.1 Az immunglobulin (Ig) gének szerveződése Az Ig nehézlánc-gének (IgH) a 14-es kromoszómán, a könnyűlánc-gének (IgL) közül a κ könnyűlánc a 2-es, a λ könnyűlánc a 22-es kromoszómán található. A konstans κ-lánc domént (Cκ) egyetlen exon kódolja, míg a variábilis domént a nagy számban jelenlévő V (variábilis) és J („joining”) szegmentumok. A mintegy 40 Vκ gén egyike a V-domén N-terminális szekvenciájának nagyobbik részét, míg a fennmaradó részt az 5 Jκ szegmentum valamelyike kódolja (6A. ábra). A λ-láncokat kódoló gének 3 szegmentumba rendeződnek: 30 Vλ, 4 funkcionális Cλ, és mindegyik Cλ mellett egy-

- 11 -

egy Jλ szegmentum található (6B. ábra). A nehézlánc variábilis doménjét kódoló ~40 VH, 25 D (diverzitás) és 6 JH szegmentum egy csoportban helyezkedik el.20 A VH szegmentumot alkotó kb. 40 funkcionális gén a szekvenciáik homológiája alapján 6 géncsaládba (VH1, VH2, ... VH6) sorolható (6C. ábra).

6. ábra Az immunglobulin könnyű- (A, B) és nehézlánc-gének (C) szerveződése.

III.1.3.2 Az IgH génátrendeződés A B-sejtek fejlődése során az Ig-gének előbb említett sorrendje a gének jellegzetes átrendeződése miatt megváltozik. A B-sejtek kivételével valamennyi sejt a csíravonalban (germline) található elrendeződésben tartalmazza az Ig-géneket. A B-sejt érés során megindul az Ig-gének átrendeződése. A folyamat első szakaszában egy véletlenszerűen kiválasztott D és egy JH gén kerül egymás mellé, majd az így kialakult D-JH szakaszhoz egy VH gén kapcsolódik. E szomatikus rekombináció során az egymás mellé kerülő szegmentumok közötti DNS-szakaszok kiesnek és létrejön a funkcionális VHDJH génszegmentum. Az átrendeződött IgH génkonfiguráció az adott B-sejtre jellemző és végigkíséri a B-sejt fejlődés folyamatát. A VH-szegmentum kódolja a variábilis domén N-terminálisának nagy részét. A variábilis doménen belül, a vázszekvenciák között („framework” régió – FR) hipervariábilis régiók helyezkednek el (komplementaritást meghatározó régiók – CDR), amelyek az antigénkötő hely

- 12 -

kialakításában vesznek részt. Ezeket CDR1-, CDR2 és CDR3-nak nevezzük, amelyek közül legutóbbi mutatja a legnagyobb variabilitást. A CDR3 variabilitását az átrendeződő génszakaszok pontatlan kapcsolódása (kapcsolódási diverzitás) és az ún. N-szekvenciáknak nevezett, a terminális deoxiribonukleotidil-transzferáz (TdT) enzim által véletlenszerűen beépített addicionális nukleotidok fokozzák (N-régió-diverzitás). A variábilis domént konstans domének követik (CH)20 (7. ábra).

7. ábra Az IgH génátrendeződés sematikus ábrája.

- 13 -

III.1.3.3 A B-sejtek fejlődési fázisai Az a fejlődési folyamat, amelynek során a haemopoeticus őssejtek a

B-lymphocyta-érés

különböző

fázisain

keresztül

ellenanyagokat

termelő

plazmasejtekké vagy memória sejtekké alakulnak, jellegzetes és jól karakterizálható szakaszokban zajlik (8. ábra). A szakaszokat az immunglobulin génátrendeződés és az immunglobulin nehéz- és könnyűláncok expressziója határozza meg. A legkorábbi B-sejt irányba elkötelezett sejt a progenitor tulajdonságokkal rendelkező pro-B-sejt. Ezekben a sejtekben történik az IgH gének átrendeződése. A korai pro-B-sejtekben a D-JH szakaszok, majd a késői pro-B-sejtekben a VH-DJH szakaszok rendeződnek át. A produktív VHDJH átrendeződés következménye a sejt μ-lánc termelése, ami már a következő fejlődési stádiumban levő pre-B-sejtekre jellemző. A μ-lánc a nagy pre-B-sejtekben termelődik és nagy része intracytoplasmatikusan található meg, egy része azonban a felszínen is megjelenik és a „pót”-L-lánccal (surrogate light-chain) együtt a pre-B-sejt receptort (pre-BcR) hozzák létre. A pre-BcR-en keresztül közvetített hatások eredményeképp a B-sejt befejezi az IgH-lókusz génjeinek további átrendeződését és néhány osztódás után megindítja az IgL-génátrendeződést, ami immár a kis pre-B-sejtekben zajlik. Amint létrejön egy működő könnyűlánc, a sejt teljes értékű IgM (BcR) komplexet expresszál a felszínén. A teljes értékű receptor viszont olyan jeleket közvetít, amelyek az átrendeződést vezérlő RAG-1, RAG-2 gének represszióját, következésképp a VDJ rekombináz aktivitás teljes megszűnését eredményezik. Ebben a stádiumban a sejteket éretlen B-sejteknek nevezzük. A fejlődés eddig a pontig a csontvelőben, antigéntől függetlenül zajlik. Ennél a pontnál történik a B-sejtek szelekciója is, amelynek eredményeképpen létrejön a nem-saját antigének felismerésére alkalmas, felszíni IgM és IgD molekulát hordozó érett B-sejt készlet20 (8.ábra).

- 14 -

8.ábra

A B-sejtek fejlődési fázisai.

SHM: szomatikus hipermutáció,

GC: centrum germinatívum, H-lánc: nehézlánc, L-lánc: könnyűlánc.

- 15 -

Az érett B-sejtek elhagyják a csontvelőt és a perifériás nyirokszervekbe jutnak, ahol immár antigéntől függő módon tovább differenciálódnak. Az antigénnel való kapcsolat megfelelő specificitású B-sejtek klonális szelekcióját indukálja. Ezek a sejtek (centroblastok) jellegzetes morfológiai és funkcionális változáson mennek keresztül, amelynek módjai a következők: - Nehézlánc-izotípusváltás. Megfelelő hatásokra a felszíni IgM és IgD expressziót más izotípusba tartozó nehézláncokat tartalmazó Ig molekulák termelése váltja fel. - Affinitásérés. Az immunglobulin variábilis régiókban bekövetkező szomatikus hipermutációk (SHM), amelyeket az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) fehérje vezérel és aminek következtében az érett B-sejt receptorának antigén iránti affinitása fokozódik. A centroblastokból ezek után centrocyták lesznek, amelyek, ha megfelelő antigénnel találkoznak proliferálni kezdenek, míg antigénstimulus hiányában néhány napon belül elpusztulnak. Ez leggyakrabban a T-sejtektől függő folyamat és a nyirokcsomók centrum germinatívumaiban következik be.21 Ebben az esetben mindig létrejön a

variábilis

régió

szomatikus

hipermutációja.

Az

érési

folyamat

azonban

T-sejt független módon a centrum germinatívumokon kívül a marginális zónában is létrejöhet. Ilyenkor a további érésnek nem feltétele a variábilis régió szomatikus hipermutációja.22-25 A B-sejt-érés utolsó fázisaként mindkét folyamat eredményeképpen memória B-sejt és ellenanyag termelő plazmasejt alakul ki (9. ábra). III.1.3.4 A B-CLL sejteredete A B-sejtes lymphomák csoportjába olyan betegség típusok tartoznak, amelyek a különböző mértékben differenciált B-sejtek daganatos megbetegedései. A lymphomás transzformáció a progenitor B-sejtektől a plazmasejtes differenciációt elérő B-sejtekig terjedő érési stádiumok közül bárhol előfordulhat. Az esetek többségében a tumorsejtek morfológiai megjelenésükben, fenotípus és genotípus jellegzetességeikben hasonlítanak a B-sejt-differenciáció egyes érési stádiumaira, illetve a normális nyirokszövetet felépítő B-sejt-populációkra.

- 16 -

Marginális zóna

PC

BN: Nyugvó naiv BA: Aktivált naiv CB: Centroblast CC: Centrocyta PC: Plazmasejt

Köpenyzóna BA

BA T

BA

BM: Memória sejt T: T-sejt FDC: Follicularis dendriticus sejt

BM

FD

BM PC

CC CC

Apikális világos zóna

CB CB

Bazális világos zóna

BN BN

Sötét zóna

BN T

Perifériás vér és T-sejt zóna

Klonális expanzió Szomatikus hipermutáció

Apoptosis

Differenciáció Izotípusváltás

9. ábra A nyirokcsomó folliculusban történő B-sejt érés sematikus ábrája. A folliculus több zónára osztható, amelyekben az érési folyamatok zajlanak. A B-sejtek antigéntől függő érése a másodlagos nyirokszervekben zajlik, ahol a T-helper-sejtektől kapják meg a további fejlődéshez szükséges ingereket. A folyamat azonban T-sejt független módon is létrejöhet.

Korábban azt tartották, hogy a CLL-es sejtek a follicularis köpenyzóna B1-sejtjeiből keletkeznek, amelyekre jellemző, hogy a sejtek CD5, CD23 pozitívak, CD38 negatívak, valamint felszíni IgM-et és IgD-t expresszálnak és nem mutált IgVH génekkel

rendelkeznek.

Ezt

azzal

magyarázták,

hogy

a

sejtek

a

centrum

germinatívumban (GC) még nem találkoztak antigénnel.26-29 A korai vizsgálatok a VH géneket csíravonal konfigurációjúnak találták30-34, ami úgy tűnt, hogy alátámasztja a naiv B-sejtes eredetet. Ez az elképzelés sokáig tarotta magát, azonban később az irodalomban megjelentek olyan munkák, ahol azt bizonyították, hogy az esetek 50-60%-ában

az

IgVH

gének

szomatikusan

hipermutáltak,

ami

a

centrum

germinatívumon már áthaladt B-sejtekre jellemző. Az, hogy GC vagy post-GC stádiumot képvisel az adott tumorsejt, az ún. intraklonális diverzitás, vagyis a mutációk kontinuus („ongoing”) jellegének vizsgálatával állapítható meg. Ez azt jelenti, hogy

- 17 -

a neoplasticussá vált sejtek megőrzik hipermutációs aktivitásukat és folyamatosan újabb mutációkat szereznek, ami a tumorklónok genetikailag instabil állapotát jelenti. Az adatok szerint a CLL-ek biológiailag és klinikailag két különböző csoportra oszthatóak, az egyikre az IgVH gének csíravonal expressziója jellemző és rosszabb klinikai prognózist jelent, a másikra pedig az IgVH gének szomatikus hipermutációja jellemző és a klinikailag kedvezőbb csoportba tartozik.18,

35-39

Frissebb tanulmányok

szerint a CLL-re egy közös génexpressziós mintázat jellemző, amely leginkább a memória B-sejtekére hasonlít és az IgVH genotípustól független, jóllehet az IgVH régióban mutált és nem mutált esetek egy 30 génből álló expressziós panellel elkülöníthetőek.40,

41

Fenotípus tekintetében az aktivációs markerek (CD23, CD69,

CD71), valamint a memória sejtekre jellemző CD27 szintén a posztgerminális eredetet valószínűsíti. Ez ugyan nehezen egyeztethető össze azokkal az esetekkel, amelyeknél az

IgVH

szomatikus

mutációja

hiányzik.

Ez

az

ellentmondás

feloldható,

ha feltételezzük, hogy a naiv B-sejtek a nyiroktüszőkön kívül T-independens antigénekkel,

vagy

szuperantigénekkel

találkoznak,

amelyek

a

sejtfelszíni

immunglobulinhoz (BcR) nem az antigén-felismerő régiónál, hanem a „framework” régiónál kötődnek; így elmarad a IgVH szomatikus mutációin alapuló affinitás-érés.39, 42 A CLL-ben leggyakrabban átrendeződő IgVH gének (VH1-69, VH3-7 és a VH4-34) előfordulása is lényegesen magasabb, mint ami véletlenszerűen várható lenne. Tehát sejteredet szempontjából a CLL sejtek a legújabb kutatások alapján egységesek, mégpedig érett, antigénszelekción átesett B-sejtekből alakulnak ki.43, 44

- 18 -

III.2. A RICHTER SZINDRÓMA III.2.1 A lymphoma progresszió A szolid tumorok kialakulásához hasonlóan a lymphomák létrejöttét is többlépcsős folyamatnak tartják, ahol a genetikai változások a lymphoid sejtek autonóm növekedését okozzák az érési folyamat különböző fázisaiban. Klinikai megnyilvánulása ennek a folyamatnak lehet lymphoma és/vagy leukaemia. Az új lymphoma klasszifikációk, amelyek egy-egy lymphoma entitás morfológiai, genetikai és klinikai tulajdonságait is figyelembe veszik, teret nyújtottak azoknak a szemléleteknek, amelyek dinamikus biológiai és morfológiai heterogenitásról beszélnek egyetlen lymphoma entitáson belül is. A lymphomagenezis

többlépcsős

modelljének megfelelően a lymphomák gyakran válnak agresszív fenotípusúvá a lefolyásuk során, amit lymphoma progressziónak nevezünk.

45-48

Habár a lymphoma

progresszió morfológiai, klinikai és biológiai aspektusai nincsenek mindig átfedésben, a lymphoma morfológiájában történő változások gyakran együtt járnak a klinikai és biológiai viselkedésben történő változással. Egy progressziót mutató lymphoma „eredeti“ és „progrediált“ komponense közötti klonális kapcsolat esetén lymphoma transzformációról beszélünk. A progresszió azonban egy de novo másodlagosan kialakuló lymphomát is jelenthet, amely klonálisan független az azt megelőző komponenstől. Ezekben az esetekben kompozit lymphomáról beszélünk. III.2.2 A Richter szindróma A klinikailag indolens lefolyású alacsony malignitású B-CLL/SLL magas malignitású non-Hodgkin lymphomába való progresszióját Richter szindrómának (RS) nevezzük. A szindrómát először Maurice N. Richter írta le 1928-ban, mint egy CLL-hez társuló, gyorsan progrediáló agresszív lymphomát, amely generalizált lymphadenopathiával és hepatosplenomegaliával jár.49 1964-ben Lortholary és munkatársai vezették be a "Richter szindróma" megjelölést azokra az esetekre, ahol szövettanilag a CLL-ből "malignus reticulopathia" alakul ki.50 A későbbiekben kiterjesztették a Richter szindróma fogalmát olyan más

- 19 -

lymphoid malignitásokra is, amelyek a CLL-es páciensekben alakulnak ki. Ezekben az esetekben prolymphocytás leukaemia (PLL), kis nem hasadt sejtes lymphoma51, lymphoblastos lymphoma52, hajas sejtes leukaemia53 és Hodgkin lymphoma (HL), amely a Richter transzformáció Hodgkin variánsaként ismert54, alakulhat ki. Leggyakrabban azonban a progresszió során DLBCL alakul ki. III.2.3 A diffúz nagy B-sejtes lymphoma A diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBCL) az érett B-sejtek tumoros megbetegedése. A felnőttkori NHL-ák 30-40%-át teszi ki. A DLBCL-ek

mind

morfológiailag, fenotípus és molekuláris tulajdonságok tekintetében valamint a klinikai viselkedés szempontjából is heterogén csoportot alkotnak. A tumor az esetek többségében a nyirokcsomóból vagy az extranodalis szövetekből indul ki és csak másodlagosan érinti a csontvelőt. Morfológiai megjelenésük alapján centroblastos, immunoblastos, multilobulált, T-sejt/histiocyta gazdag, plasmoblastos és anaplasticus variánsokra oszthatóak.8 A génexpressziós vizsgálatok alapján két fő csoportot különítettek el az alapján, hogy a tumorsejtek az aktivált B-sejtek expressziós mintázatához

(ABC-DLBCL),

vagy

a

centrum

germinatívum

B-sejtjeinek

(GCB-DLBCL) mintázatához hasonlítanak. Tanulmányok szerint klinikailag a GCB-DLBCL a betegség sokkal kedvezőbb lefolyását jelenti, míg az ABC-DLBCL sokkal rosszabb prognózissal jár.55 A DLBCL kialakulhat de novo vagy „megelőző” alacsony malignitású lymphoma talaján (pl. CLL). A DLBCL tumorsejtjei az IgVH régióiban szomatikus mutációkat hordoznak, ami alapján két csoportra lehet őket osztani aszerint, hogy az ún. intraklonális divergencia kimutatható-e vagy sem. Tanulmányok szerint az esetek egy részében kimutatható a kontinuus („ongoing”) jellegű mutáció, ami ezen sejtek GC eredetére utal. A többi esetben antigén szelektált B-sejtes eredetre (post-GC) jellemző mutációkat találtak.56-59 Azonban egyik tanulmány sem említi, hogy a Richter szindróma DLBCL-jeiben milyen az IgVH gének mutációs profilja.

- 20 -

III.2.4 A Richter szindróma gyakorisága, klinikuma A CLL-es betegekben a kialakuló RS gyakoriságát 3-10%-ra teszik, azonban a valós incidencia ennél nagyobb lehet, mivel post mortem ritkán történnek ez irányban vizsgálatok.60 Egy 1011 B-CLL-es betegen végzett vizsgálat szerint a betegek 2,2%-ában alakult ki RS, ebből 1,8%-ban DLBCL és 0,4%-ban HL. Felfigyeltek arra is, hogy a fiatalabb (≤55 év) és az idősebb (>55év) betegek közül a fiatalabbakban az RS előfordulása magasabb (5,9% ill. 1,2%), aminek legvalószínűbb oka az, hogy az idősebb, kezelésre nem reagáló betegeknél kevesebbszer végeznek biopsziát.61 Egy másik retrospektív vizsgálat során, ahol 1374 CLL-el diagnosztizált beteget kezeltek 1972 és 1992 között, 39 betegben (2,8%) észlelték a RS kialakulását. Egy harmadik tanulmány szerint 1992-2002 között 2147 beteg követése során 105-ben (4,9%) figyeltek meg RS-t. A transzformáció incidenciája a sorozatos kezelések következtében nőtt meg.62 Földrajzilag a B-CLL Európában és az Egyesült Államokban a leggyakoribb haematológiai megbetegedés, ezért a kialakuló RS-át is ezekben az országokban észlelik a legtöbbször. Más földrajzi területeken a pontos előfordulás nem ismert, de nagyon ritka, bár Japánban és Tajvanon is írtak már le eseteket.63 A Richter szindrómát általános tünetek (láz, súlycsökkenés, éjszakai izzadás) megjelenése és az általános állapot gyors romlása jellemzi. Emellett nyirokcsomó megnagyobbodás,

valamint

hasi

panaszokat

okozó

hepatomegalia

és/vagy

splenomegalia esetleg központi idegrendszeri érintettségre utaló jelek kísérik.64-67 A leggyakoribb közös tulajdonság a RS-ás eseteknél az emelkedett LDH szint, amely a tumornövekedés egyik markere. Egy tanulmány szerint az RS esetek 82%-ában az LDH szint a normálisnak legalább kétszerese volt, míg ugyanezt a CLL-es esetek csupán 8%-ában találták. Paraproteinemiát a betegek 44%-ában figyeltek meg.62 Természetesen a RS diagnózisának megállapításához nyirokcsomó biopszia szükséges. III.2.5 A Richter szindróma morfológiája és immunfenotípusa 1928-ban Richter a leírt eset szövettani vizsgálata során a nyirokcsomókban, a májban és a lépben leukaemiás és tumorsejteket egyaránt leírt. A leukaemiás sejteket kis méretű lymphocytaként, a tumorsejteket pedig számos, a lymphocytánál néhányszor

- 21 -

nagyobb, bő basophil cytoplasmával, határozott maggal és néhány prominens nucleolusszal rendelkező polymorph endotheloid sejtként azonosította.49 Ez a szövettani kép a jelenlegi WHO osztályozás szerint a DLBCL immunoblastos variánsának (DLBCL-IB) felel meg8 (10. ábra). Irodalmi adatok szerint a DLBCL centroblastos variánsa (DLBCL-CB) is előfordulhat.68 Ebben az esetben a centroblastok diffúz, monoton proliferációját lehet látni, amibe esetenként immunoblastok is keveredhetnek. Az összes DLBCL közül az IB esetek aránya kb. 10%69, de RS-ban ez az arány jóval magasabb. A RS immunfenotípusáról igen kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. Bizonyos esetekben a RS megőrzi a megelőző B-CLL immunfenotípusát (IgM+, IgD+/-, CD5+, CD19+, CD23+)

70, 71

, egyéb esetekben viszont a RS immunhisztokémiai

megjelenése eltér a B-CLL-től (CD5-, IgD-).72-74 A proliferáló sejtek aránya a CLL-hez képest jelentősen megemelkedik.

III.2.6 A Richter szindrómában előforduló genetikai változások A legtöbb indolens B-sejtes NHL a lymphomagenezis jelenleg elfogadott elvei szerint leginkább az apoptotikus folyamatok zavarával jellemezhető.75 A lymphocyták hiperproliferációja az agresszív lymphomák velejárója, ami számos esetben a másodlagosan bekövetkező genetikai zavaroknak tudható be.76 Ezek a másodlagos genetikai zavarok különböző alacsony malignitású B-sejtes NHL progresszióját egyaránt jellemezhetik, függetlenül azok típusától.77-79 A jelenség független a kemoterápiától, kemoterápiában nem részesült betegekben is előfordulhat.68, 80 A megfigyelt genetikai eltérések gyakran komplex módon fordulnak elő. A leírt eltérések közé tartozik a 12-es triszómia, 14q expanzió, a 11q23, 13q és a 17p régió deléciója. Citogenetikai vizsgálatok eredményei megerősítették azt a feltételezést, miszerint

a

valószínűséggel

B-CLL-ben vezetnek

detektálható RS-hoz,

komplex

mint

vagy a 12. triszómia önmagában. 62, 81-83

- 22 -

a

kariotípus-eltérések

kromoszomális

eltérések

nagyobb hiánya,

B

A

C *

*

**

10. ábra A Richter szindróma szövettani megjelenése nyirokcsomóban és perifériás kenetben. (A) A CLL sejtjei keverednek a DLBCL nagyobb sejtjeivel (nyíl) (HE, 200X). (B) DLBCL-IB. A csontvelőt infiltráló immunoblastok nagy, mérsékelten pleiomorph sejtek és centrálisan elhelyezkedő, erősen bazofil nagy nucleolusszal rendelkeznek (HE, 200X). (C) A kenetben a CLL lymphocytái (*) mellett nagy, közepesen széles cytoplasmájú, laza kromatin szerkezetű multiplex nucleolust tartalmazó centroblast sejtek láthatók (**). (Giemsa, 1000X).

A p53 gén mutációját először B-sejtes RS-ában írták le.84 Akkoriban azt gondolták, hogy a p53 gén mutációja lehet a kulcs az alacsony malignitású lymphoma magas malignitású lymphomába való progressziójához. Kutatási eredmények viszont azt mutatták, hogy a RS előfordulhat p53 mutációval illetve anélkül is, és hogy a p53 inaktiválódása már a B-CLL stádiumban is bekövetkezhet, így nem feltétlen velejárója

- 23 -

a RS-nak sem.84-86 A p16INK4A/ARF gén inaktiválódása is kapcsolatba hozható a RS kialakulásával.87,

88

A p16INK4A/ARF gátló hatással van a sejtciklusra azáltal, hogy

a CDK4 és CDK6 enzimek regulatorikus alegységeihez kapcsolódva inaktiválja a ciklinD/ CDK4/6 komplex hatását a G1/S fordulóponton.89 A p16INK4A/ARF inaktivációját a progrediált CLL, follicularis lymphoma (FL) és a köpenysejtes lymphoma blastos variánsának 33%-ában, azonban ezek indolens megfelelőjében csak 5%-ában észlelték.90 p53 mutáció és/vagy p16INK4A/ARF homozigóta deléció a RS-ás esetek 60%-ában fordul elő. 84, 85, 90, 91 A többszörös genetikai léziók a CLL transzformált stádiumában arra utalhatnak, hogy szerzett genetikai instabilitás van jelen genomszerte, ami a Richter szindróma kialakulását segíti.92,

93

Munkacsoportunk egy korábbi tanulmányában azt a kérdést

vizsgálta, hogy a B-CLL Richter transzformációja során szerepet tölt-e be a mikroszatellita instabilitás (MSI), és az instabilitás kialakulásának hátterében állhat-e a hMLH1 és hMSH2 mismatch repair gének esetleges genetikai alterációja. 19 CLL-es betegből 9 beteg volt RS-ás. Eredményeink arra utaltak, hogy a B-CLL Richter transzformációjának egyes eseteiben a hMLH1 gén epigenetikai inaktiválódása által kiváltott genetikai instabilitás hozzájárulhat a B-CLL progressziójához, ugyanakkor a hMLH1 és hMSH2 gének a folyamat során strukturálisan nem érintettek92 III.2.7 A B-CLL és a Richter szindróma klonális kapcsolata A megelőző B-CLL-ből kialakuló DLBCL nem mindig az eredeti tumorklónból származik, de novo is kialakulhat. A molekuláris genetikai vizsgálómódszerek elterjedése előtt a klonalitást a B-sejtek sejtfelszíni immunglobulin könnyűlánc (IgL) immunfenotípusa alapján állapították meg. Amennyiben a RS és a B-CLL neoplasztikus B-sejtjei ugyanazon IgL-t hordozták, akkor a RS feltételezhetően a megelőző B-CLL klónból alakult ki, különböző IgL-k detektálása de novo megjelenő RS-ra utalt.94-96 A molekuláris biológia fejlődése lehetővé tette a molekuláris technikák alkalmazását a klonális kapcsolat bizonyítására. A korai vizsgálatok során a Southern hibridizáció bizonyult a legalkalmasabbnak ennek eldöntésére. Ehhez az immunglobulin nehézlánchoz (IgH) kötődő próbát alkalmaztak, amivel ki lehetett mutatni, a csíravonal konfigurációt és a génátrendeződést is. Az átrendeződés mérete alapján lehetett

- 24 -

a

klonális

kapcsolatra

következtetni.96-99

Amennyiben

a

Southern

blottal

a génátrendeződés azonos méretű sávot eredményez mind a B-CLL, mind a másodlagosan kialakuló DLBCL mintában, akkor ez a tumoros sejtek közös eredetére utalhat. Azonban eltérő migrációs kép esetén egy új malignitás meglétét támasztja alá100-104 (11. ábra).

1

2

4

3

G

23 kb

9 kb 6.6 kb 11. ábra Southern-blot analízis klonalitás meghatározása céljából. EcoRI restrikciós endonukleáz emésztést követően a JH régióra tervezett próba segítségével mutatható ki a klonális génátrendeződés. Az 1-2 minták migrációs mintázata azonos, ami közös klonális eredetre utal. A 3-4-es minták esetén a migrációs mintázat különbözik, vagyis a két minta között klonális kapcsolat nem mutatható ki.

A lymphomák klonális kapcsolatának modern módszerekkel történő igazolása szükségessé teszi az IgH harmadik komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakcióval (PCR) történő vizsgálatát. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendeződő variábilis (VH), diverzitás (D) és JH génszakaszok egyedi, adott sejtre

specifikus

kombinációját,105,

106

amely

végigkíséri

az

adott

B-sejt

differenciálódásának folyamatát.107 A CDR3 régió PCR-amplifikációja a VH és JH-génekre specifikus primerpárokkal érhető el. A megegyező hosszúságú és bázissorrendű amplifikált CDR3 szekvenciák a lymphomák közös klonális eredetére utalnak, a különböző hosszúságú termékek kizárják a klonális kapcsolatot 108 (12.ábra).

- 25 -

1

2

3

4

5

6

M

100 bp

12. ábra PCR vizsgálat a minták klonalitásának meghatározására. A CDR3 régióra tervezett specifikus primerekkel végzett PCR reakció segítségével is meghatározható a klonalitás és a két minta közötti kapcsolat is kimutatható. Az 1-es, 2-es minták klonális génátrendeződést mutatnak, azonban az termékek hossza nem azonos, ami arra utal, hogy a két minta klonális eredete különbözik. A 3-as, 4-es mintákban reaktív eredetre utaló futási mintázat látható. Az 5-ös, 6-os mintában is klonális génátrendeződés figyelhető meg, a termékek hossza megegyezik, ami a minták közös klonális eredetére utal.

Kevés irodalmi adat áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a RS esetek hány százaléka mutat valódi klonális evolúciót a megelőző B-CLL-ből, és hány százalékban alakul ki de novo a B-CLL mellett. Az esetek nagy részében Southern blot hibridizációval következtetnek a klonális eredetre.60,

109, 110

Eddig kevés olyan

tanulmány jelent meg, ahol a klonalitást az IgVH gének szekvencia elemzésével mutatják ki. Ilyen az (a)

egyik korábbi tanulmányunk, ahol a CLL és DLBCL minták mindössze négy Richter szindrómás betegben lettek összehasonlítva. Az eredmények azt mutatták, hogy a klonális progresszióban stabil, nem mutált IgVH szekvenciák vettek részt.85

(b)

Cherepakhin és munkatársai azonban “ongoing” jellegű szomatikus hipermutációt mutattak ki, igaz csak egy esetben.111

- 26 -

(c)

Nakamura munkacsoportja két esetet közölt, ahol a DLBCL-es tumorklónok mutált IgVH szekvenciákkal rendelkeztek, de ezek a tumorklónok klonálisan függetlenek voltak az eredeti CLL-től.63

Sajnos ezekből az adatokból az esetek alacsony száma miatt konklúziót levonni nagyon nehéz.

- 27 -

IV. CÉLKITŰZÉS

Tanulmányunkban – a közelmúltban leírt eredményeket figyelembe véve – arra kerestük a választ, hogy a Richter szindróma kialakulását az eddigi ismeretek mellett, milyen más genetikai hatások befolyásolják. Főbb kérdéseink a következők voltak: 1.

A korábbiaknál nagyobb számú Richter szindrómás eset keresése, amelyhez az adott betegből mind a progressziót megelőző CLL, mind a DLBCL minta rendelkezésre áll.

2.

Az ugyanazon betegekből származó CLL-es és DLBCL-es mintákban kimutatható-e klonális kapcsolat?

3.

Az IgVH gének szomatikus hipermutációjának elemzése a CLL-es és a DLBCL-es mintákban.

4.

Van-e összefüggés a lymphoma transzformáció és a CLL IgVH génjeinek mutációs profilja között?

- 28 -

V. ANYAG ÉS MÓDSZER V.1 Szövetminták Tanulmányunkhoz nyolc beteg szövettani mintáit használtuk, akiknél CLL-t, illetve DLBCL-be történő progressziót diagnosztizáltak. A betegek klinikai adatait az 1.táblázat tartalmazza. Vizsgálatainkhoz molekuláris biológiai vizsgálatok végzésére alkalmas fagyasztott biopsziás mintákat, illetve vérmintákat használtunk. A szövettani diagnózis hisztopatológiai, immunfenotípus és immungenotípus vizsgálatokon alapult a WHO lymphoma klasszifikációjának megfelelően.8 Az összes DLBCL-es mintában a tumorsejtek aránya meghaladta a 90%-ot. Mind a nyolc esetben a CLL és az ennek megfelelő DLBCL azonos fenotípust mutatott (CD5+, CD19+, CD20+, CD23+). V.2 DNS izolálás Genomikus DNS-t a szövetmintákból telített NaCl felhasználásával, kisózásos módszerrel nyertük.112 A fagyasztott szövetmintákat 20 μm vastagságú szeletekre metszettük, majd 3ml maglízis pufferből (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA), 20 μl 20%-os Na-dodecilszulfátból (SDS), és 50 μl Proteináz K-ból (1 mg Proteináz K, 2 mM EDTA) álló oldatban homogenizáltuk. A sejteket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, majd 1 ml telített NaCl hozzáadását követően az elegyet intenzíven ráztuk egy percig. 20 perces, 2500 fordulat/perc fordulatszámmal történő centrifugálást követően a felülúszóból a DNS-t kétszeres térfogatnyi 100%-os etanol segítségével csaptuk ki. A kivont DNS-t kétszeri 70%-os alkohollal történő mosás után 200 μl TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA) oldottuk fel, koncentrációját 260 nm-es hullámhosszon fotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével határoztuk meg. A DNS minták tárolása 4 °C-on történt. Vérmintákból a mononuclearis sejteket, Histopaque (Sigma, St. Louis, MO) segítségével, sűrűség-grádiens centrifugálással különítettük el. A szeparálást követően a DNS izolálása a sejtekből az előbb leírtaknak megfelelően történt.

- 29 -

1. táblázat Nyolc beteg klinikai adatai, valamint a mintavétel helye és ideje. PB: perifériás vér; BM: csontvelő; LN: nyirokcsomó; CLL: chronicus lymphocytás leukaemia; DLBCL: diffúz nagy B-sejtes lymphoma; N: nő; F: férfi

Eset 1 2 3 4 5 6 7 8

Nem N N N F F F N N

Életkor Minta

Mintavétel

Mintavétel

(év)

dátuma

helye

A

1989-01-05

BM

CLL

B

1989-01-28

LN

DLBCL

A

1989-11-09

PB

CLL

B

1989-11-13

LN

DLBCL

A

1988-10-28

PB

CLL

B

1988-10-26

LN

DLBCL

A

2001-02-20

PB

CLL

B

2003-01-21

LN

DLBCL

A

1999-05-05

PB

CLL

B

2003-01-27

LN

DLBCL

A

1990-08-20

BM

CLL

B

1992-09-21

LN

DLBCL

A

1991-10-28

PB

CLL

B

1992-10-26

LN

DLBCL

A

2001-12-10

LN

CLL

B

2003-02-03

LN

DLBCL

83 92 73 63 62 51 78 77

- 30 -

Szövettan

V.3 Az IgVH CDR3 régiójának PCR vizsgálata A mintapárok klonalitásának elemzéséhez az IgH-gén CDR3 régiójának szekvenciáját vizsgáltuk polimeráz láncreakcióval (PCR). A vizsgálathoz az IgH-gén 3.

„framework”

régiójában

(FR3)

előforduló

veleszületett

polimorfizmus

kiküszöbölésére az FR3 régióra tervezett “degenerált” sense primer keveréket és az IgH kapcsolási régióra tervezett (JH)

univerzális antisense primert használtunk fel85

(13. ábra).

Primer FR3 JH

Szekvencia 5’- ACA CGG C[C/T][G/C] TGT ATT ACT GT -3’ 5’- ACC TGA GGA GAC GGT GAC C -3’

13. ábra Az IgH CDR3 PCR reakciókban használt primerek szekvenciája és kötődési helyének sematikus ábrázolása.

A PCR reakciók 25 μl végtérfogatban, 100 ng DNS templát, 10 μM sense és antisense primer, 1.5 mM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH8, 1 mM MgCl2, 1 unit (U) Taq polimeráz jelenlétében zajlottak. A Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR készülékben végzett reakciók optimális körülményei a következők voltak: denaturálás 94°C-on 1 percig, annealing 57°C-on 1 percig, extenzió 72°C-on 1 percig, 30 cikluson keresztül. Negatív kontrollként minden reakciósorozathoz reaktív nyirokszövetből izolált DNS-t használtunk. Az amplifikálást követően a polimeráz láncreakció termékeinek detektálása ethidium-bromidot tartalmazó 3%-os agaróz gélelektroforézissel történt. Abban az esetben, ha a vizsgált DNS monoklonális sejtpopulációból származott, diszkrét DNS sávok megjelenése volt várható 70-120 bázispár magasságában. Ha egy adott beteg mindkét biopsziás mintájából amplifikált PCR termékek azonos hosszúságot

- 31 -

mutattak (azonos magasságban helyezkedtek el a gélben), az az IgH génátrendeződés egyezésére, az adott mintapár klonális kapcsolatára utalt (14. ábra).

14. ábra Az IgH PCR termékek migrációs mintázatának sematikus ábrája. Abban az esetben, ha a mintapárok klonálisak, a migrációs mintázat mindkét mintánál azonos magasságban egy sávot mutat (1-2 minta). Ha mindkét minta monoklonális, de közöttük nincs klonális kapcsolat, akkor a sávok különböző magasságban helyezkednek el. (3-4) Reaktív minta esetén a minta migrációs képe egy „smear”, amit a számos B-sejtből amplifikált különböző méretű termék ad. (5)

V.4 Az IgVH gének PCR amplifikációja, klónozása és szekvenálása A mintapárok DNS-ét a különböző VH(1-6) géncsaládokra tervezett specifikus sense és a JH régió konszenzus szakaszára tervezett antisense primerekkel amplifikáltuk külön-külön reakcióban (15. ábra). A PCR reakcióelegyek az V.3 pontban leírtakkal azonosak, azonban a ciklusparaméterek a következők voltak: denaturálás 30 másodperc, 95 °C; annealing 30 másodperc, 60 °C; elongáció 45 másodperc, 72 °C, 35 cikluson át. A PCR termékeket pCR-2.1 vektorba klónoztuk a TOPO TA klónozó kit (Invitrogen, San Diego, CA) segítségével. A kompetens sejtek transzformációját követően, legalább 10 olyan kolóniának a plazmid DNS-ét izoláltuk, amelyek a megfelelő méretű inzertet tartalmazták. Az inzert jelenlétének meghatározására a plazmidban az inzerttől 5’ és 3’ irányban is megtalálható M13 szekvenciára specifikus PCR reakciót végeztünk el.

- 32 -

Primer

Szekvencia

VH1-FR1 5’-GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G-3’ VH2-FR1 5’-GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C-3’ VH3-FR1 5’-CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G-3’ VH4-FR1 5’-CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G-3’ VH5-FR1 5’-CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T-3’ VH6-FR1 5’-TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G-3’ JH

5’-CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C-3’

15. ábra Az IgVH gének PCR reakcióiban használt primerek szekvenciája.

Ezt követően az inzertek szekvenálását BigDye 3.1 „cycle sequencing” kittel ABI 310 automata kapilláris elektroforézis készülékkel (Applied Biosystems, Foster City, CA) végeztük el (16. ábra). A kapott szekvenciákat összehasonlítottuk az Immunogenetics Information System (IMGT) adatbázisban lévő IgVH szekvenciákkal és meghatároztuk a legközelebbi csíravonal (germline) megfelelőjét. Ha a csíravonal szekvenciától való eltérés 2%-nál nagyobbnak mutatkozott, akkor a Casali-Chang formulát113 alkalmaztuk (2. táblázat). A formula felhasználásával a CDR és az FR régió R mutációt elemezve az IgVH gének antigénszelekció általi érintettségére következtettünk.

- 33 -

2. táblázat A Casali-Chang formula. (A) Az IgVH gén CDR és FR régióiban várható R mutációk száma. (B) Annak a valószínűsége, hogy az R mutáció a CDR ill. FR régióban van (C) Binomiális modell annak a valószínűségnek a meghatározására, hogy a megfigyelt R mutációk a véletlen folytán alakulnak-e ki.

A. Rmut = N × RFCDR v. FR × LCDRrel v. Frrel Rmut – a várt R mutációk száma N – a megfigyelt mutációk száma RF – a CDR és FR régiók szekvenciából adódó mutációs gyakoriság L – a CDR és FR régió mérete B. q = RFCDR v. FR × LCDRrel v. Frrel C. p=

n! × q k × (1 − q ) n − k k !( n − k ) !

n – megfigyelt mutációk száma k – megfigyelt R mutációk száma a CDR illetve az FR régióban q – annak a valószínűsége, hogy az R mutáció a CDR ill. FR régióban van p = annak a valószínűsége, hogy az R mutációk a véletlen folytán alakulnak ki

- 34 -

klónozás

baktérium transzformációja

vektor

A helyes inzert mérete

PCR termék

Inzert ellenőrzése

klónok az agar táptalajon kék – nincs inzert fehér – van inzert

SZEKVENÁLÁS

16. ábra A klónozás és a szekvenálás sematikus folyamatábrája.

- 35 -

VI. EREDMÉNYEK VI.1 Klonális kapcsolat a CLL és a kialakuló DLBCL minták között A CLL és a DLBCL minták klonális kapcsolatát az IgVH gén CDR3 régiójára specifikus PCR-rel határoztuk meg. Minden, a vizsgálatban szereplő minta monoklonális Ig nehézlánc (IgH) génátrendeződést mutatott. Öt esetben (1.-5. esetek), az adott mintapárok DNS-éből származó PCR termékének hossza és az IgVH-D-JH szekvenciája azonosnak bizonyult, ami a tumorminták közös klonális eredetét támasztja alá. Három esetben (6.-8. esetek) az első és a második biopsziás minta PCR termékének hossza és az IgVH-D-JH szekvenciák sem egyeztek meg, ami az egy betegben kialakult CLL és DLBCL különböző klonális eredetére utal (17. ábra, 3. táblázat). M

1A. 1B. 2A. 2B. 3A. 3B. 6A. 6B. T1 T2

125 bp

100 bp

17. ábra A CDR3 régió PCR amplifikációját követő agaróz gélelektroforézis

képe

néhány

reprezentatív

mintával.

Az 1.,2., 3. és 6. minta az egy beteghez tartozó CLL-ből (A) illetve az abból kialakult DLBCL-ből (B) származik. A migrációs mintázat alapján az 1.,2.,3. esetek szekvenciális mintái között klonális kapcsolat mutatható ki. A 6A és 6B minta esetén eltérő a migrációs mintázat, ami kizárja a közös klonális eredetet. M - DNS marker; T1, T2 – negatív kontroll

- 36 -

VI.2 A mintákban előforduló VH géncsaládok A minták IgVH génjeit a 6 VH géncsaládra specifikus sense és a JH-ra specifikus antisense PCR segítségével amplifikáltuk. A minták azzal a VH specifikus primerrel adtak terméket, amely VH család a tumorklón IgH génjét alkotja (18. ábra). A teljes IgVH gén (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3) amplifikációja is alátámasztotta a monoklonális minták közötti klonális kapcsolatot vagy annak hiányát.

300 bp

300 bp

18. ábra 6 VH régió PCR amplifikációját követő agaróz gélelektroforézis két reprezentatív eset mintpárjain. Látható, hogy 2A. és a 2B. minta a VH3 régióra specifikus primerekkel amplifikált és adott azonos méretű terméket. A 7A. minta a VH1, a 7B. minta a VH5-ben adott megfelelő méretű terméket.

A klónozást és a kompetens baktérium transzformációját követően a klónozott PCR terméket egy újabb PCR reakció segítségével ellenőriztük (19. ábra). Megfelelő méretű terméket adó reakció esetén a mintákat szekvenáltuk (20A, B, C. ábra). *

*

*

*

500 bp 19. ábra A pCR2.1 plazmid M13 szekvenciájára specifikus PCR amplifikáció egy reprezentatív minta esetén. A *-gal jelölt termékek tartalmazzák a megfelelő inzertet.

- 37 -

Minden

mintában

a

vizsgált

IgVH-D-JH

szekvenciák

funkcionális

génátrendeződést mutatnak, mivel nem tartalmaznak stop kodont vagy „crippling” mutációt. A minták VH génjeit az adatbázisban levő csíravonal szekvenciákkal hasonlítottuk össze. Négy CLL-es eset (1., 3., 4., 7.) a VH1, három eset (2., 5., 6.) a VH3 és egy eset (8. eset) a VH4 családba tartozó génszegmenst hordozott. Öt esetben (1-5. eset) a DLBCL és a hozzá tartozó CLL-es minta azonos VH génszegmenst tartalmazott. Három esetben (6-8) a DLBCL-es minta és a CLL-es minta VH génszegmense különböző volt. A három DLBCL-es mintából kettőben (6., 8.) a VH3, egyben (7.) pedig a VH5 volt megtalálható (3. táblázat). VI.3 Az IgVH gének szomatikus mutációi A vizsgált IgVH gének csíravonal szekvenciától való báziseltéréseinek száma alapján a nyolc CLL-es esetet két csoportra tudtuk osztani. Azokat az eseteket, amelyeknél a báziseltérések száma kevesebb volt 2%-nál, a nem mutált csoportba soroltuk (1.-6. eset). Azokat az eseteket, amelyeknél a báziseltérések száma meghaladta a 2%-ot mutáltnak tekintettük (7.-8.). Abban az öt Richter szindrómás esetben, ahol a CLL és a DLBCL minták IgVH génjei azonosnak bizonyultak (1.-5. eset), az IgVH gének a nem mutált csoportba tartoztak. Három esetben (6.-8. eset), ahol az egy betegből diagnosztizált CLL-es és DLBCL-es minták IgVH génjei különbözőek voltak, a DLBCL-es minták IgVH génjei 91,8-96,9%-os homológiát mutattak a hozzájuk legközelebb eső csíravonal szekvenciákkal. Egy tumormintában sem észleltük az IgVH gének intraklonális diverzitását. VI.4 A szomatikus mutációk elemzése Egy génre gyakorolt negatív vagy pozitív szelekciós hatás hiányában a báziscserék – amelyek aminosav cserében nyilvánulnak meg (R, „replacement” mutációk), illetve amelyek esetében a mutáció nem jár aminosav cserével (S, „silent” mutációk) – az egész kódoló szekvenciában random módon helyezkednek el. Ha egy DNS szakaszon az R mutációk száma nagyobb, mint a véletlenből fakadóan várt

- 38 -

mutációk száma, akkor valószínűsíthető, hogy a génen pozitív szelekciós hatás érvényesült.

3. táblázat Nyolc Richter szindrómás betegből vett CLL és DLBCL mintákban előforduló VH

géncsaládok és azok mutációinak és klonális kapcsolatának

összehasonlítása. *, VH szekvenciák, ahol a CDR régióban több, az FR régióban kevesebb R mutációt találtunk, mint ami a véletlen folytán is létrejött volna (p<0.05); CLL, chronicus lymphocytás leukaemia; DLBCL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma

VH Mutációk géncsalád Száma

Szekvencia homológia (%)

Klonális kapcsolat

Eset

Minta

1

CLL DLBCL

VH1-08 VH1-08

2 2

99.3 99.3

Van

2

CLL DLBCL

VH3-11 VH3-11

0 0

100 100

Van

3

CLL DLBCL

VH1-02 VH1-02

0 0

100 100

Van

4

CLL DLBCL

VH1-24 VH1-24

0 0

100 100

Van

5

CLL DLBCL

VH3-11 VH3-11

0 0

100 100

Van

6

CLL DLBCL*

VH3-74 VH3-48

0 13

100 95.6

Nincs

7

CLL DLBCL

VH1-18 VH5-51

10 9

96.6 96.9

Nincs

8

CLL DLBCL*

VH4-61 VH3-30

20 24

93.3 91.8

Nincs

- 39 -

Ezzel ellentétben, ha az észlelt R mutációk száma kevesebb, mint a várt mutációk száma, az a negatív szelekciós nyomással magyarázható, amely így tartósítja azt a struktúrát, amelyet a gén kódol. A mutált DLBCL-es esetek szomatikus mutációinak elemzéséhez a Casali-Chang formulát alkalmaztuk113. A modell binomiális eloszlást használ, ami alapján kiszámolható, hogy a CDR régiók többlet R mutációi illetőleg az FR régió R mutációinak hiánya a véletlen folytán alakul-e ki. A számolás eredményeit a 4. táblázat tartalmazza, amiből kiderül, hogy a három esetből kettőben a CDR régiók a vártnál több, az FR régiók a vártnál kevesebb R mutációt hordoztak, tehát antigén szelekciós hatásra alakultak ki.

4. táblázat

Az IgVH gének analízise azokban a Richter szindrómás betegekben, ahol

a DLBCL-es minták mutáltnak bizonyultak. DLBCL, diffúz nagy B-sejtes lymphoma; R, az észlelt és zárójelben feltüntetve a várt R mutációk száma; S, az észlelt S mutációk száma; p, valószínűség; *, szignifikáns különbség (p<0.05)

CDR1 és CDR2

FR1, FR2 és FR3

Eset

Minta

VH géncsalád

R

S

P

R

6 7 8

DLBCL DLBCL DLBCL

VH3-48 VH5-51 VH3-30

5 (1.63) 2 (1.80) 9 (5.00)

2 0 1

0.008* 0.301 0.032*

2 (6.90) 4 (5.10) 9 (15.9)

- 40 -

S

P

4 0.005* 3 0.198 8 0.004*

IGVH1-8 CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

____________CDR1_______________ IGVH1-8 AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACC AGT TAT GAT ATC AAC TGG GTG CGA CAG GCC ACT GGA CAA GGG 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

____________CDR2_______________ IGVH1-8 CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATG AAC CCT AAC AGT GGT AAC ACA GGC TAT GCA CAG AAG TTC CAG GGC 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

IGVH1-8 AGA GTC ACC ATG ACC AGG AAC ACC TCC ATA AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT 1. eset (CLL) --- --- --- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --1. eset (Richter) --- --- --- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --____________________CDR3_______________________ IGVH1-8 GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 1. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA TCC ATT TAT TAC TAT GAT AGT AGT GGT TAC 1. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

20A. ábra Az 1. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL és a DLBCL szekvenciája (IgVH1-8) megegyezik és mindkettő ugyanazt a két mutációt hordozza. Piros betű: „replacement” mutáció, Kék betű: „silent” mutáció.

- 41 -

IGVH3-11 CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC AAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

____________CDR1_______________ IGVH3-11 GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT GAC TAC TAC ATG AGC TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

____________CDR2_______________ IGVH3-11 CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT AGT GGT AGT ACC ATA TAC TAC GCA GAC TCT GTG AAG GGC 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

IGVH3-11 CGA TTC ACC ATC TCC AGG GAC AAC GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

_____________________________CDR3______________________ IGVH3-11 GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 2. eset (CLL) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT TGG GCC GCC TGG TGG TTC GGG GAG TCC CAC TTT 2. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT TGG GCC GCC TGG TGG TTC GGG GAG TCC CAC TTT _______ IGVH3-11 ... ... 2. eset (CLL) GAC TAC 2. eset (Richter) GAC TAC

20B. ábra Az 2. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL és a DLBCL szekvenciája (IgVH3-11) megegyezik és egyik eset sem hordoz mutációt.

- 42 -

IGVH1-18 7. eset (CLL)

IGVH1-18 7. eset (CLL)

IGVH1-18 7. eset (CLL)

IGVH1-18 7. eset (CLL)

IGVH1-18 7. eset (CLL)

________________CDR3___________________ GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA GAT CAT CTT CCC ACT ACG ATT TTT

AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACG AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- --- --- --- --- ---

_______________CDR2____________ CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AGC GCT TAC AAT GGT AAC ACA AAC TAT GCA CAG AAG CTC CAG GGC --- --- --- --- --G --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- -T- --G --- ---

___________CDR1________________ AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC AGC TAT GGT ATC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG --- --- --- --- --- --- --- -GT –-A –T- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- ---

CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

IGVH5-51 GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG AAG ATC TCC TGT 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

_____________CDR1______________ IGVH5-51 AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AGC TAC TGG ACC GGC TGG GTG CGC CAG ATG CCC GGG AAA GGC 7. eset (Richter) --- -A- --- --- --- --- --- --- -C- --- --- -A- -A- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

_____________CDR2______________ IGVH5-51 TTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TAT CCT GGT GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGC CCG TCC TTC CAA GGC 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -A- --- --- --- --- --- --- --- ---

IGVH5-51 CAG GTC ACC ATC TCA GCC GAC AAG TCC ATC AGC ACC GCC TAC CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --C --- --- --T --- --- --T --A --- --- --- --- --- --- ---

_________________________CDR3__________________ IGVH5-51 TCG GAC ACC GCC ATG TAT TAC TGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 7. eset (Richter) --- --- --- --- --- --- --- --- GCG AGA CAG ACT ACA CTG ACT ATG TCC ATT GAC GAC

20C. ábra A 7. eset IgVH szekvenciája. Ebben az esetben a CLL (IgVH1-18) és a DLBCL (IgVH5-51) szekvenciája nem egyezett meg és mindkettő tartalmaz mutációkat. Piros betű: „replacement” mutáció, Kék betű: „silent” mutáció.

- 43 -

VII. MEGBESZÉLÉS A hisztológiai transzformáció jelensége follicularis lymphoma, köpenysejtes lymphoma és CLL esetén jöhet létre, amikoris a progressziót követően sokkal agresszívebb lefolyású betegség alakul ki. Richter szindrómának nevezzük az alacsony malignitású CLL talaján másodlagosan kialakuló magas malignitású DLBCL-t. A folyamat során a betegség terápia rezisztenssé és klinikailag rossz prognózisúvá válik. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy a Richter szindróma mutált vagy nem mutált IgVH génekkel rendelkező CLL-ből alakul-e ki. Ehhez az IgVH gének mutációs státuszát elemeztük olyan betegek mintapárjaiban, ahol az egyik minta a betegség korai CLL-es stádiumából származik, a másik pedig a Richter szindróma fennállását megállapító DLBCL-t tartalmazó nyirokcsomó

volt. A vizsgálat

időpontjában nyolc beteg mintapárja állt rendelkezésünkre, ami kevésnek tűnhet, azonban a RS előfordulását és a szekvenciális minták ritkaságát figyelembe véve mindenképpen jelentős. Az 1-3. esetben a CLL és a DLBCL diagnózisa gyakorlatilag egyidőben került felállításra. Ezekben az esetekben a DLBCL okozta nyirokcsomómegnagyobbodás miatt végzett teljes kivizsgálás során derült fény a feltehetően korábban meglévő, panaszt nem okozó CLL-re. Eredményeink arra utalnak, hogy a DLBCL mind mutált, mind nem mutált IgVH génnel rendelkező CLL-es betegekben is kialakulhat, de csak a nem mutált IgVH gént hordozó DLBCL fejlődik ki a CLL-es tumorklónból, amely szintén nem mutált. A mutált IgVH génnel rendelkező DLBCL-ek klonálisan független, másodlagos tumorként jönnek létre. Munkacsoportunknak e dolgozat alapját képző cikk megjelenése óta 5 újabb Richter szindrómás esetet sikerült vizsgálni. Az újabb esetek IgVH génjeinek szekvenálása és elemzése megerősíti a fent leírtakat. 114 A RS során a DLBCL kialakulása biológiai szempontból két különböző utat foglal magába. A DLBCL kifejlődhet a már meglévő CLL-es tumorklónból, vagy kialakulhat mint egy másodlagos, független tumor47, 85. Ezt figyelembe véve javasolták a következő terminológiák használatát. A „lymphoma transzformáció” olyan eseteket jelöl, ahol a DLBCL a CLL-es klónból alakul ki. Ezzel ellentétben a „kompozit lymphoma” fogalmát azokra az esetekre tartják fenn, ahol a DLBCL és a CLL klonálisan függetlenek egymástól115 (21. ábra).

- 44 -

21. ábra A VH gének mutációs státusza és a DLBCL kialakulásának útvonalai közötti kapcsolat Richter szindrómában. (A, lymphoma transzformáció) A CLL klonális transzformációja DLBCL-be a nem mutált VH génnel rendelkező CLL-es esetekben történik. (B, kompozit lymphoma) A CLL-től klonálisan független DLBCL, amely mutált VH gént hordoz, kialakulhat mutált illetve nem mutált VH géneket hordozó CLL mellett is.

A munkánk során végzett IgVH gén mutációs státuszának analízise arra enged következtetni, hogy a „lymphoma transzformáció”-val kialakult DLBCL csak nem mutált IgVH génnel rendelkező CLL-es betegekben fordul elő. A nem mutált CLL gyakran hordoz egyéb genetikai eltéréseket is, amelyek között meg kell említeni a 12-es triszómiát, a 17p és a 11q deléciót.18, 116, 117 Ezeket az eltéréseket leírták a transzformált DLBCL klónokban is, de leírtak más a Richter transzformációval társuló molekuláris és kromoszómális szintű anomáliát is92,

118

(5. táblázat). Ezen tanulmányok alapján arra

- 45 -

következtethetünk, hogy a nem mutált IgVH génnel rendelkező CLL-ek, olyan klonális fejlődésen mennek keresztül, ahol a felhalmozódó molekuláris és kromoszómális eltérések eredményezik a DLBCL-es tumorklónok kialakulását.

5. táblázat Összefoglaló táblázat a CLL-ben és a RS-ban előforduló immunfenotípusos és genetikai eltérésekről. Az eddigi ismeretekhez hozzájáruló eredményeink dőltbetűsek. SHM: szomatikus hipermutáció, MSI: mikroszatellita instabilitás, NA: nincs rá adat

Genetikai és fenotípus eltérés Immunfenotípus Genetikai eltérés +12 del(13q14) del(11q22-23) del(6q21) del(17p13) és p53 mutáció 14q expanzió p16INK4a/ARF deléció MSI92 hMLH1 hipermetiláció92 IgVH SHM

CLL

RS (DLBCL)

CD19+, CD20+, CD23+, CD5+

CD19+, CD20+, CD23+, CD5+, de CD5-, IgD- is lehet.

20% 50% 20% 5% 10% Nincs 5% Előfordul Nincs

30% 45% 20% NA 50%-60% előfordul 33% jóval több, mint CLL-ben van

40-50% nincs 50-60% van lymphoma transzformáció esetén: nincs SHM kompozit lymphoma esetén: van SHM

Érdekesség, hogy más típusú, nem mutált IgVH gént hordozó alacsony malignitású NHL is transzformálódhat DLBCL-be. Egy tanulmány négy nem mutált IgVH génnel rendelkező splenicus marginalis zóna lymphomás (SMZL) esetet mutatott be, ahol transzformáció során DLBCL alakult ki.119 Ez tovább erősíti azt a feltételezést, miszerint azok a tumorklónok, ahol az IgVH gén nem mutált, sokkal érzékenyebbek a klonális fejlődésre és a morfológiai átalakulásra. Azokban a CLL-es esetekben, ahol az IgVH gének nem hordoztak mutációkat, a VH1-02, VH1-08, VH1-24 és VH3-11 géncsaládok alkották az IgH gén variábilis régióját. Ezek a VH géncsaládok nem, vagy csak aránylag ritkán fordulnak elő

- 46 -

a korábban mások által leírt nem mutált CLL-es esetekben.37,

38

A tanulmányunkban

közölt esetek közül egyik sem hordozta a nem mutált esetek között egyébként leggyakrabban előforduló VH1-69 gént.37, 38 A vizsgált eseteink alacsony száma alapján nem következtethetünk a CLL klonális transzformációja során előnyben részesített géncsaládra, de azon gének megjelenésének hiánya, amelyek a nem mutált esetekben fordulnak a leggyakrabban elő, magyarázata lehet annak, hogy a Richter transzformáció a nem mutált CLL-ek egy külön alcsoportjában jön létre. Az IgVH gének analízisével kapcsolatos munkák szerint a CLL-es betegek nem változtatják meg mutációs státuszukat a betegség lefolyása során.120 Nagy érzékenységű cDNS SSCP analízissel kimutatták, hogy a szomatikus hipermutáció működőképes marad a CLL-es sejtekben és így szerepet játszhat a tumorklónok evolúciójában.121 Ezt az intraklonális diverzitást még nem mutált CLL-ekben is észlelték. Jelen munkában vizsgált RS-ás betegek tumoros mintáiban az IgVH gének mutációs státusza a CLL hisztológiai transzformációja során nem változott és a mutációs mechanizmusok nem aktiválódtak. A nyolc RS-ás esetből háromban a DLBCL mint másodlagos, független lymphoma – amelyet „kompozit lymphoma”-nak is nevezhetünk – alakult ki. Klonálisan független DLBCL-t a mutált és a nem mutált IgVH gént hordozó CLL-es esetekben is találtunk, de mindhárom kompozit lymphoma mutáltnak bizonyult az intraklonális heterogenitás jelei nélkül. A mutált IgVH gén státusz ezekben a lymphomákban megegyezik azzal az elképzeléssel, miszerint a másodlagosan kialakuló DLBCL-ek centrum germinatívumon áthaladt B-sejtekből keletkeznek. A CD5 koexpresszió ezekben az esetekben egy sajátos patogenezist sejtet, mely közös lehet a CD5+ DLBCL de novo, korábbi CLL jelenléte nélkül kialakult DLBCL-ekkel.122 A de novo CD5+ DLBCL és a Richter szindróma során független, másodlagos tumorként kialakult DLBCL hasonlóságot mutat az IgVH gének mutációs státuszában, ami arra enged következtetni, hogy mindkét lymphoma olyan CD5+ B-sejtekből származik, amelyek stabilan mutált IgVH géneket hordoznak.123, 124 A B-sejtes lymphoproliferatív kórképeket a B-sejt fejlődés különböző stádiumában lévő normál lymphocytákból eredőnek tartják. A DLBCL-es mintákon végzett génexpressziós vizsgálatok alapján ezeket a tumorokat két jelentősen különböző csoportra lehet osztani. Az egyik csoport a centrum germinatívum típusú DLBCL

- 47 -

(GCB-DLBCL), amelynek génexpressziós profilja leginkább a normál centrum germinatívum B-sejtjeihez hasonlít. A másik csoport génexpressziós profilja, melyet aktivált B-sejt típusú DLBCL-nek (ABC-DLBCL) nevezünk, a periférián lévő aktivált B-sejtek mintázatához hasonlít.55 A DLBCL ezen két altípusa az IgVH gének szomatikus a

hipermutációjának

GCB-DLBCL-ben

a

jellegében

szomatikus

különbözik

hipermutáció

egymástól.

„ongoing”

jellegű,

az ABC-DLBCL-ben annak „ongoing” jellegét nem tudták kimutatni.56,

57

Míg addig

A RS-ban

másodlagos, független tumorként kialakuló DLBCL-ben az IgVH gének mutált jellege és az intraklonális heterogenitás hiánya aktivált B-sejtes eredetre utal. A CLL klónból kialakuló DLBCL nem mutált IgVH génkonfigurációja azonban meglehetősen ritkán észlelt jelenség a DLBCL-ek csoportjában.56,

57

Ezekből az adatokból arra lehet

következtetni, hogy azok a DLBCL-ek, amelyek CLL klónból alakultak ki, a DLBCL-eknek egy külön alcsoportját képezik, és amelyek különböznek a de novo DLBCL-ek biológiai és klinikai viselkedésétől. Összefoglalva eredményeinket arra következtethetünk, hogy a Richter szindróma két csoportra osztható, amelyek sejteredete különbözik egymástól. Egyik a CLL klonális transzformációja során, a másik másodlagos formában, klonálisan független úton jön létre. Klonális transzformáció csak nem mutált IgVH-t hordozó CLL-es betegben keletkezik.125

- 48 -

VIII. EREDETI MEGÁLLAPÍTÁSOK

Eredeti megállapításaink tehát a következők: 1. Richter szindróma esetén a lymphoma progresszió független a CLL sejtek IgVH mutációs státuszától, A) de csak a nem mutált IgVH-t hordozó CLL klónból fejlődik ki DLBCL, (Lymphoma transzformáció, Richter transzformáció) B) ellentétes esetben az eredeti tumortól független "kompozit lymphoma" jön létre. 2. A független, másodlagos tumorként kialakuló DLBCL mutációs státusza alapján inkább az aktivált típusú DLBCL-hez hasonlít. A CLL-es tumorklónból transzformált DLBCL mutációs státusza alapján egy új altípus létére utalhat.

- 49 -

IX. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ABC-DLBCL: aktivált B-sejt típusú diffúz nagy B-sejtes lymphoma antisense: 3’ primer AID: aktiváció-indukált citidin deamináz B-CLL/SLL: B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemia/kis lymphocytás lymphoma BcR: B-sejt receptor BM: csontvelő CD: „cluster of differentiation”, sejtdifferenciálódási immunológiai marker CDK: ciklin-dependens kináz CDR: komplementaritást meghatározó régió az immunglobulin génben CGH: komparatív genomikus hibridizáció CH: az immunglobulin nehézlánc gén konzervatív szakasza D: diverzitás régió del: deléció DLBCL: diffúz nagy B-sejtes lymphoma DLBCL-CB: DLBCL centroblastos variánsa DLBCL-IB: DLBCL immunoblastos variánsa DNS: dezoxiribonukleinsav dNTP: dezoxi-nukleotidfoszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav FISH: fluoreszcens in situ hibridizáció FL: follicularis lymphoma FR: „framework“- váz szekvencia az immunglobulin génben GC: centrum germinatívum GCB-DLBCL: centrum germinatívum B-sejt típusú diffúz nagy B-sejtes lymphoma germline: csíravonal HCl: hidrogén-klorid HE: hematoxilin-eozin HL: Hodgkin lymphoma hMLH: humán mutL homológ, mismatch repair géncsalád hMSH: humán mutS homológ, mismatch repair géncsalád

- 50 -

Ig: immunglobulin IgD: immunglobulin, D izotípus IgH:immunglobulin nehézlánc gén IgL: immunglobulin könnyűlánc gén IgM: immunglobulin, M izotípus IgVH: immunglobulin variábilis régiója Jκ: immunglobulin κ könnyűláncának joining régiója Jλ: immunglobulin λ könnyűláncának joining régiója JH: joining régió, az immunglobulin nehézlánc gén kapcsolódási szakasza kb: kilobázis Ki-67: sejtproliferációs marker LDH: laktát dehidrogenáz LN: nyirokcsomó MSI: mikroszatellita instabilitás NaCl: nátrium-klorid NHL: non-Hodgkin lymphoma p16INK4A/ARF: tumorszuppresszor gén p53: tumorszuppresszor gén PB: perifériás vér PCR: polimeráz láncreakció PLL: prolymphocytas lymphoma primer: próba, a vizsgált gén egy adott szakaszával komplementer szintetizált oligonukleotid RAG: Recombinázt aktiváló gén RS: Richter szindróma SDS: nátrium-dodecil-szulfát sense: 5’ primer SHM: szomatikus hipermutáció SMZL: splenicus marginalis zóna lymphomás SSCP: „single strand conformation polymorphism” Taq: Thermus aquaticus DNS polimeráz TdT: terminális deoxiribonukleotidil-transzferáz enzim

- 51 -

Tris-HCl: tris-(hidroximetil)-aminometán szabad bázisának és sójának keveréke U: „unit“ - nemzetközi egység, enzimaktivitás egysége Vκ: immunglobulin κ könnyűláncának variábilis régiója Vλ: immunglobulin λ könnyűláncának variábilis régiója VH: az immunglobulin nehézlánc gén variábilis szakasza WHO: „World Health Organisation“ – Egészségügyi Világszervezet

- 52 -

X. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Oscier D, Fegan C, Hillmen P, Illidge T, Johnson S, Maguire P, Matutes E,

Milligan D: Guidelines on the diagnosis and management of chronic lymphocytic leukaemia, Br J Haematol 2004, 125:294-317 2.

The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification P: A Clinical Evaluation of the

International Lymphoma Study Group Classification of Non-Hodgkin's Lymphoma, Blood 1997, 89:3909-3918 3.

Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS:

Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia, Blood 1975, 46:219-234 4.

Binet JL, Auquier A, Dighiero G, Chastang C, Piguet H, Goasguen J, Vaugier

G, Potron G, Colona P, Oberling F, Thomas M, Tchernia G, Jacquillat C, Boivin P, Lesty C, Duault MT, Monconduit M, Belabbes S, Gremy F: A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis, Cancer 1981, 48:198-206 5.

Zwiebel JA, Cheson BD: Chronic lymphocytic leukemia: staging and prognostic

factors, Semin Oncol 1998, 25:42-59 6.

Ben-Ezra J, Burke JS, Swartz WG, Brownell MD, Brynes RK, Hill LR,

Nathwani BN, Oken MM, Wolf BC, Woodruff R: Small lymphocytic lymphoma: a clinicopathologic analysis of 268 cases, Blood 1989, 73:579-587 7.

Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR,

Sultan C: Proposals for the classification of chronic (mature) B and T lymphoid leukaemias. French-American-British (FAB) Cooperative Group, J Clin Pathol 1989, 42:567-584 8.

Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.

Edited by Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Lyon, IARCPress, 2001, p 9.

Bonato M, Pittaluga S, Tierens A, Criel A, Verhoef G, Wlodarska I, Vanutysel

L, Michaux L, Vandekerckhove P, Van den Berghe H, De Wolf-Peeters C: Lymph node histology in typical and atypical chronic lymphocytic leukemia, Am J Surg Pathol 1998, 22:49-56

- 53 -

10.

Rozman C, Montserrat E: Chronic Lymphocytic Leukemia, N Engl J Med 1995,

333:1052-1057 11.

Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, Garcia Marco J, Houlihan A, Que

TH, Catovsky D: The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL, Leukemia 1994, 8:1640-1645 12.

Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, O'Brien S, Rai KR:

National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment, Blood 1996, 87:4990-4997 13.

Inghirami G, Foitl DR, Sabichi A, Zhu BY, Knowles DM: Autoantibody-

associated cross-reactive idiotype-bearing human B lymphocytes: distribution and characterization, including Ig VH gene and CD5 antigen expression, Blood 1991, 78:1503-1515 14.

Klein U, Rajewsky K, Kuppers R: Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+

peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B cells, J Exp Med 1998, 188:1679-1689 15.

Dohner H, Stilgenbauer S, Dohner K, Bentz M, Lichter P: Chromosome

aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis, J Mol Med 1999, 77:266-281 16.

Dohner H, Stilgenbauer S, Fischer K, Bentz M, Lichter P: Cytogenetic and

molecular cytogenetic analysis of B cell chronic lymphocytic leukemia: specific chromosome aberrations identify prognostic subgroups of patients and point to loci of candidate genes, Leukemia 1997, 11 Suppl 2:S19-24 17.

Matutes E, Oscier D, Garcia-Marco J, Ellis J, Copplestone A, Gillingham R,

Hamblin T, Lens D, Swansbury GJ, Catovsky D: Trisomy 12 defines a group of CLL with atypical morphology: correlation between cytogenetic, clinical and laboratory features in 544 patients, Br J Haematol 1996, 92:382-388 18.

Oscier DG, Thompsett A, Zhu D, Stevenson FK: Differential rates of somatic

hypermutation in V(H) genes among subsets of chronic lymphocytic leukemia defined by chromosomal abnormalities, Blood 1997, 89:4153-4160 19.

Dohner H, Stilgenbauer S, James MR, Benner A, Weilguni T, Bentz M, Fischer

K, Hunstein W, Lichter P: 11q deletions identify a new subset of B-cell chronic

- 54 -

lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis, Blood 1997, 89:2516-2522 20.

Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M: Immunobiology, 5th edition,

2005, 21.

Kelsoe G: B cell diversification and differentiation in the periphery, J Exp Med

1994, 180:5-6 22.

de Vinuesa CG, Cook MC, Ball J, Drew M, Sunners Y, Cascalho M, Wabl M,

Klaus GG, MacLennan IC: Germinal centers without T cells, J Exp Med 2000, 191:485494 23.

Weller S, Faili A, Garcia C, Braun MC, Le Deist FF, de Saint Basile GG,

Hermine O, Fischer A, Reynaud CA, Weill JC: CD40-CD40L independent Ig gene hypermutation suggests a second B cell diversification pathway in humans, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98:1166-1170 24.

Toellner KM, Jenkinson WE, Taylor DR, Khan M, Sze DM, Sansom DM,

Vinuesa CG, MacLennan IC: Low-level hypermutation in T cell-independent germinal centers compared with high mutation rates associated with T cell-dependent germinal centers, J Exp Med 2002, 195:383-389 25.

William J, Euler C, Christensen S, Shlomchik MJ: Evolution of autoantibody

responses via somatic hypermutation outside of germinal centers, Science 2002, 297:2066-2070 26.

Antin JH, Emerson SG, Martin P, Gadol N, Ault KA: Leu-1+ (CD5+) B cells. A

major lymphoid subpopulation in human fetal spleen: phenotypic and functional studies, J Immunol 1986, 136:505-510 27.

Nicholson IC, Brisco MJ, Zola H: Memory B lymphocytes in human tonsil do

not express surface IgD, J Immunol 1995, 154:1105-1113 28.

Berek C, Milstein C: Mutation drift and repertoire shift in the maturation of the

immune response, Immunol Rev 1987, 96:23-41 29.

Caligaris-Cappio F: B-chronic lymphocytic leukemia: a malignancy of anti-self

B cells, Blood 1996, 87:2615-2620 30.

Kipps TJ, Tomhave E, Pratt LF, Duffy S, Chen PP, Carson DA:

Developmentally restricted immunoglobulin heavy chain variable region gene expressed

- 55 -

at high frequency in chronic lymphocytic leukemia, Proc Natl Acad Sci U S A 1989, 86:5913-5917 31.

Deane M, Norton JD: Preferential rearrangement of developmentally regulated

immunoglobulin VH1 genes in human B-lineage leukaemias, Leukemia 1991, 5:646650 32.

Ebeling SB, Schutte ME, Akkermans-Koolhaas KE, Bloem AC, Gmelig-

Meyling FH, Logtenberg T: Expression of members of the immunoglobulin VH3 gene families is not restricted at the level of individual genes in human chronic lymphocytic leukemia, Int Immunol 1992, 4:313-320 33.

Kipps TJ, Tomhave E, Chen PP, Carson DA: Autoantibody-associated kappa

light chain variable region gene expressed in chronic lymphocytic leukemia with little or no somatic mutation. Implications for etiology and immunotherapy, J Exp Med 1988, 167:840-852 34.

Pratt LF, Rassenti L, Larrick J, Robbins B, Banks PM, Kipps TJ: Ig V region

gene expression in small lymphocytic lymphoma with little or no somatic hypermutation, J Immunol 1989, 143:699-705 35.

Schroeder HW, Jr., Dighiero G: The pathogenesis of chronic lymphocytic

leukemia: analysis of the antibody repertoire, Immunol Today 1994, 15:288-294 36.

Matsuda F, Kyun Shin E, Nagaoka H, Matsumura R, Haino M, Fukita Y, Taka-

ishi S, Imai T, Riley JH, Anand R, Soeda E, Honjo T: Structure and physical map of 64 variable segments in the 3[prime] 0.8-megabase region of the human immunoglobulin heavy-chain locus, Nat Genet 1993, 3:88 37.

Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, Sellars B, Valetto A, Allen SL, Schulman P,

Vinciguerra VP, Rai K, Rassenti LZ, Kipps TJ, Dighiero G, Schroeder HW, Jr., Ferrarini M, Chiorazzi N: Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells Express Restricted Sets of Mutated and Unmutated Antigen Receptors, J. Clin. Invest. 1998, 102:15151525 38.

Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK: Unmutated Ig VH

Genes Are Associated With a More Aggressive Form of Chronic Lymphocytic Leukemia, Blood 1999, 94:1848-1854 39.

Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Valetto A, Allen SL, Buchbinder A,

Budman D, Dittmar K, Kolitz J, Lichtman SM, Schulman P, Vinciguerra VP, Rai KR,

- 56 -

Ferrarini M, Chiorazzi N: Ig V Gene Mutation Status and CD38 Expression As Novel Prognostic Indicators in Chronic Lymphocytic Leukemia, Blood 1999, 94:1840-1847 40.

Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, Yu X, Yang L,

Pickeral OK, Rassenti LZ, Powell J, Botstein D, Byrd JC, Grever MR, Cheson BD, Chiorazzi N, Wilson WH, Kipps TJ, Brown PO, Staudt LM: Relation of Gene Expression Phenotype to Immunoglobulin Mutation Genotype in B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia, J. Exp. Med. 2001, 194:1639-1648 41.

Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H, Freedman

A, Inghirami G, Cro L, Baldini L, Neri A, Califano A, Dalla-Favera R: Gene Expression Profiling of B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia Reveals a Homogeneous Phenotype Related to Memory B Cells, J. Exp. Med. 2001, 194:1625-1638 42.

Hamblin T: Chronic lymphocytic leukaemia: one disease or two? Ann Hematol

2002, 81:299-303 43.

Dighiero G: Unsolved issues in CLL biology and management, Leukemia 2003,

17:2385-2391 44.

Guipaud O, Deriano L, Salin H, Vallat L, Sabatier L, Merle-Beral H, Delic J: B-

cell chronic lymphocytic leukaemia: a polymorphic family unified by genomic features, Lancet Oncol 2003, 4:505-514 45.

Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J,

Lister TA, Bloomfield CD: World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee meeting-Airlie House, Virginia, November 1997, J Clin Oncol 1999, 17:3835-3849 46.

Harris NL, Jaffe ES, Stein H, Banks PM, Chan JK, Cleary ML, Delsol G, De

Wolf-Peeters C, Falini B, Gatter KC, et al.: A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group, Blood 1994, 84:1361-1392 47.

Matolcsy

A:

High-grade

transformation

of

low-grade

non-Hodgkin's

lymphomas: mechanisms of tumor progression, Leuk Lymphoma 1999, 34:251-259 48.

Warnke RA: Tumor progression in malignant lymphomas, Bull Cancer 1991,

78:181-186

- 57 -

49.

Richter MN: Generalized reticular cell sarcoma of lymph nodes associated with

lymphatic leukemia., Am J Pathol 1928, 4:285-292 50.

Lortholary P, Boiron M, Ripault P, Levy JP, Manus A, Bernard J: [Chronic

Lymphoid Leukemia Secondarily Associated With A Malignant Reticulopathy: Richter's Syndrome.], Nouv Rev Fr Hematol 1964, 78:621-644 51.

Litz CE, Arthur DC, Gajl-Peczalska KJ, Rausch D, Copenhaver C, Coad JE,

Brunning RD: Transformation of chronic lymphocytic leukemia to small non-cleaved cell lymphoma: a cytogenetic, immunological, and molecular study, Leukemia 1991, 5:972-978 52.

Pistoia V, Roncella S, Di Celle PF, Sessarego M, Cutrona G, Cerruti G,

Boccaccio GP, Grossi CE, Foa R, Ferrarini M: Emergence of a B-cell lymphoblastic lymphoma in a patient with B-cell chronic lymphocytic leukemia: evidence for the single-cell origin of the two tumors, Blood 1991, 78:797-804 53.

Duchayne E, Delsol G, Kuhlein E, Klein B, Zhang XG, Attal M, Cassard G,

Laurent G: Hairy cell transformation of a B-cell chronic lymphocytic leukemia: a morphological, cytochemical, phenotypic and molecular study, Leukemia 1991, 5:150155 54.

Brecher M, Banks PM: Hodgkin's disease variant of Richter's syndrome. Report

of eight cases, Am J Clin Pathol 1990, 93:333-339 55.

Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick

JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J, Jr., Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Levy R, Wilson W, Grever MR, Byrd JC, Botstein D, Brown PO, Staudt LM: Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling, Nature 2000, 403:503 56.

Lossos IS, Alizadeh AA, Eisen MB, Chan WC, Brown PO, Botstein D, Staudt

LM, Levy R: Ongoing immunoglobulin somatic mutation in germinal center B cell-like but not in activated B cell-like diffuse large cell lymphomas, Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:10209-10213 57.

Lossos IS, Okada CY, Tibshirani R, Warnke R, Vose JM, Greiner TC, Levy R:

Molecular analysis of immunoglobulin genes in diffuse large B-cell lymphomas, Blood 2000, 95:1797-1803

- 58 -

58.

Ottensmeier CH, Thompsett AR, Zhu D, Wilkins BS, Sweetenham JW,

Stevenson FK: Analysis of VH genes in follicular and diffuse lymphoma shows ongoing somatic mutation and multiple isotype transcripts in early disease with changes during disease progression, Blood 1998, 91:4292-4299 59.

Stevenson F, Sahota S, Zhu D, Ottensmeier C, Chapman C, Oscier D, Hamblin

T: Insight into the origin and clonal history of B-cell tumors as revealed by analysis of immunoglobulin variable region genes, Immunol Rev 1998, 162:247-259 60.

Giles FJ, O'Brien SM, Keating MJ: Chronic lymphocytic leukemia in (Richter's)

transformation, Semin Oncol 1998, 25:117-125 61.

Mauro FR, Foa R, Giannarelli D, Cordone I, Crescenzi S, Pescarmona E, Sala R,

Cerretti R, Mandelli F: Clinical characteristics and outcome of young chronic lymphocytic leukemia patients: a single institution study of 204 cases, Blood 1999, 94:448-454 62.

Robertson LE, Pugh W, O'Brien S, Kantarjian H, Hirsch-Ginsberg C, Cork A,

McLaughlin P, Cabanillas F, Keating MJ: Richter's syndrome: a report on 39 patients, J Clin Oncol 1993, 11:1985-1989 63.

Nakamura N, Kuze T, Hashimoto Y, Hoshi S, Tominaga K, Sasaki Y,

Shirakawa A, Sato M, Maeda K, Abe M: Analysis of the immunoglobulin heavy chain gene of secondary diffuse large B-cell lymphoma that subsequently developed in four cases with B-cell chronic lymphocytic leukemia or lymphoplasmacytoid lymphoma (Richter syndrome), Pathol Int 2000, 50:636-643 64.

Harousseau JL, Flandrin G, Tricot G, Brouet JC, Seligmann M, Bernard J:

Malignant lymphoma supervening in chronic lymphocytic leukemia and related disorders. Richter's syndrome: a study of 25 cases, Cancer 1981, 48:1302-1308 65.

Armitage JO, Dick FR, Corder MP: Diffuse histiocytic lymphoma complicating

chronic lymphocytic leukemia, Cancer 1978, 41:422-427 66.

Trump DL, Mann RB, Phelps R, Roberts H, Conley CL: Richter's syndrome:

diffuse histiocytic lymphoma in patients with chronic lymphocytic leukemia. A report of five cases and review of the literature, Am J Med 1980, 68:539-548 67.

Foucar K, Rydell RE: Richter's syndrome in chronic lymphocytic leukemia,

Cancer 1980, 46:118-134

- 59 -

68.

Nakamura N, Abe M: Richter syndrome in B-cell chronic lymphocytic

leukemia, Pathol Int 2003, 53:195-203 69.

Diebold J, Anderson JR, Armitage JO, Connors JM, Maclennan KA, Muller-

Hermelink HK, Nathwani BN, Ullrich F, Weisenburger DD: Diffuse large B-cell lymphoma: a clinicopathologic analysis of 444 cases classified according to the updated Kiel classification, Leuk Lymphoma 2002, 43:97-104 70.

Miyamura K OH, Yamauchi T, Itoh M, Kodera Y, Suchi T, Takahashi T, Ueda

R: Single clonal origin of neoplastic B-cells with different immunoglobulin light chains in a patient with Richter's syndrome., Cancer 1990, 66:140-144 71.

Matolcsy A SE, Knowles DM, Casali P: Clonal evolution of B cells in

transformation from low- to high-grade lymphoma., Eur J Immunol 1999, 29:1253-1264 72.

Matolcsy A IG, Knowles DM: Molecular genetic demonstration of the diverse

evolution of Richter's syndrome (chronic lymphocytic leukemia and subsequent large cell lymphoma). Blood 1994, 83:1363-1372 73.

Bayliss KM KB, Hanson CA, Matthaeus WG, Almagro UA: Richter's syndrome

presenting as primary central nervous system lymphoma. Transformation of an identical clone., Am J Clin Pathol 1990, 93:117-123 74.

Cordone I ME, Catovsky D: Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and T cells

in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity., Leukemia 1992, 6:902-906 75.

Capello D, Gaidano G: Molecular pathophysiology of indolent lymphoma,

Haematologica 2000, 85:195-201 76.

Knutsen T: Cytogenetic changes in the progression of lymphoma, Leuk

Lymphoma 1998, 31:1-19 77.

Matolcsy A: Primary effusional lymphoma: A new non-Hodgkin s lymphoma

entity, Pathol Oncol Res 1999, 5:87-89 78.

Johansson B, Mertens F, Mitelman F: Cytogenetic evolution patterns in non-

Hodgkin's lymphoma, Blood 1995, 86:3905-3914 79.

Whang-Peng J, Knutsen T, Jaffe ES, Steinberg SM, Raffeld M, Zhao WP,

Duffey P, Condron K, Yano T, Longo DL: Sequential analysis of 43 patients with nonHodgkin's

lymphoma:

clinical

correlations

with

cytogenetic,

immunophenotyping, and molecular studies, Blood 1995, 85:203-216

- 60 -

histologic,

80.

Horning SJ, Rosenberg SA: The natural history of initially untreated low-grade

non-Hodgkin's lymphomas, N Engl J Med 1984, 311:1471-1475 81.

Han T, Henderson ES, Emrich LJ, Sandberg AA: Prognostic significance of

karyotypic abnormalities in B cell chronic lymphocytic leukemia: an update, Semin Hematol 1987, 24:257-263 82.

Catovsky D: The search for genetic clues in chronic lymphocytic leukemia,

Hematol Cell Ther 1997, 39 Suppl 1:S5-11 83.

Brynes RK, McCourty A, Sun NC, Koo CH: Trisomy 12 in Richter's

transformation of chronic lymphocytic leukemia, Am J Clin Pathol 1995, 104:199-203 84.

Gaidano G, Ballerini P, Gong JZ, Inghirami G, Neri A, Newcomb EW, Magrath

IT, Knowles DM, Dalla-Favera R: p53 mutations in human lymphoid malignancies: association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia, Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88:5413-5417 85.

Matolcsy A, Inghirami G, Knowles DM: Molecular genetic demonstration of the

diverse evolution of Richter's syndrome (chronic lymphocytic leukemia and subsequent large cell lymphoma), Blood 1994, 83:1363-1372 86.

Fenaux P, Preudhomme C, Lai JL, Quiquandon I, Jonveaux P, Vanrumbeke M,

Sartiaux C, Morel P, Loucheux-Lefebvre MH, Bauters F, et al.: Mutations of the p53 gene in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a report on 39 cases with cytogenetic analysis, Leukemia 1992, 6:246-250 87.

Cobo F, Martinez A, Pinyol M, Hernandez L, Gomez M, Bea S, Esteve J,

Rozman M, Bosch F, Lopez-Guillermo A, Montserrat E, Campo E: Multiple cell cycle regulator alterations in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia, Leukemia 2002, 16:1028-1034 88.

Cordone I, Matutes E, Catovsky D: Monoclonal antibody Ki-67 identifies B and

T cells in cycle in chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease activity, Leukemia 1992, 6:902-906 89.

Serrano M, Gomez-Lahoz E, DePinho RA, Beach D, Bar-Sagi D: Inhibition of

ras-induced proliferation and cellular transformation by p16INK4, Science 1995, 267:249-252 90.

Pinyol M, Cobo F, Bea S, Jares P, Nayach I, Fernandez PL, Montserrat E,

Cardesa A, Campo E: p16(INK4a) gene inactivation by deletions, mutations, and

- 61 -

hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of nonHodgkin's lymphomas, Blood 1998, 91:2977-2984 91.

Pinyol M, Hernandez L, Martinez A, Cobo F, Hernandez S, Bea S, Lopez-

Guillermo A, Nayach I, Palacin A, Nadal A, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Campo E: INK4a/ARF locus alterations in human non-Hodgkin's lymphomas mainly occur in tumors with wild-type p53 gene, Am J Pathol 2000, 156:1987-1996 92.

Fulop Z, Csernus B, Timar B, Szepesi A, Matolcsy A: Microsatellite instability

and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia, Leukemia 2003, 17:411-415 93.

Volpe G, Gamberi B, Pastore C, Roetto A, Pautasso M, Parvis G, Camaschella

C, Mazza U, Saglio G, Gaidano G: Analysis of microsatellite instability in chronic lymphoproliferative disorders, Ann Hematol 1996, 72:67-71 94.

Splinter TA, Noorloos BV, Van Heerde P: CLL and diffuse histiocytic

lymphoma in one patient: clonal proliferation of two different B cells, Scand J Haematol 1978, 20:29-36 95.

Hebert J, Jonveaux P, d'Agay MF, Berger R: Cytogenetic studies in patients with

Richter's syndrome, Cancer Genet Cytogenet 1994, 73:65-68 96.

Michiels JJ, van Dongen JJ, Hagemeijer A, Sonneveld P, Ploemacher RE,

Adriaansen HJ, van der Kwast TH, Brederoo P, Abels J: Richter's syndrome with identical immunoglobulin gene rearrangements in the chronic lymphocytic leukemia and the supervening non-Hodgkin lymphoma, Leukemia 1989, 3:819-824 97.

Ostrowski M, Minden M, Wang C, Bailey D: Immunophenotypic and gene

probe analysis of a case of Richter's syndrome, Am J Clin Pathol 1989, 91:215-221 98.

Cofrancesco E, Baldini L, Ciani A, Neri A, Masini T, Chinaglia D, Cortellaro

M: Evidence of clonal progression in a case of Richter syndrome, Cancer 1993, 71:741744 99.

Traweek ST, Liu J, Johnson RM, Winberg CD, Rappaport H: High-grade

transformation of chronic lymphocytic leukemia and low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Genotypic confirmation of clonal identity, Am J Clin Pathol 1993, 100:519526

- 62 -

100.

Miyamura K, Osada H, Yamauchi T, Itoh M, Kodera Y, Suchi T, Takahashi T,

Ueda R: Single clonal origin of neoplastic B-cells with different immunoglobulin light chains in a patient with Richter's syndrome, Cancer 1990, 66:140-144 101.

van Dongen JJ, Hooijkaas H, Michiels JJ, Grosveld G, de Klein A, van der

Kwast TH, Prins ME, Abels J, Hagemeijer A: Richter's syndrome with different immunoglobulin light chains and different heavy chain gene rearrangements, Blood 1984, 64:571-575 102.

McDonnell JM, Beschorner WE, Staal SP, Spivak JL, Mann RB: Richter's

syndrome with two different B-cell clones, Cancer 1986, 58:2031-2037 103.

Sun T, Susin M, Desner M, Pergolizzi R, Cuomo J, Koduru P: The clonal origin

of two cell populations in Richter's syndrome, Hum Pathol 1990, 21:722-728 104.

Matolcsy A, Casali P, Knowles DM: Different clonal origin of B-cell

populations of chronic lymphocytic leukemia and large-cell lymphoma in Richter's syndrome, Ann N Y Acad Sci 1995, 764:496-503 105.

Grawunder U, West RB, Lieber MR: Antigen receptor gene rearrangement, Curr

Opin Immunol 1998, 10:172-180 106.

Hozumi

N,

Tonegawa

S:

Evidence

for

somatic

rearrangement

of

immunoglobulin genes coding for variable and constant regions, Proc Natl Acad Sci U S A 1976, 73:3628-3632 107.

Kuppers R, Klein U, Hansmann ML, Rajewsky K: Cellular origin of human B-

cell lymphomas, N Engl J Med 1999, 341:1520-1529 108.

Trainor KJ, Brisco MJ, Story CJ, Morley AA: Monoclonality in B-

lymphoproliferative disorders detected at the DNA level, Blood 1990, 75:2220-2222 109.

Foon KA, Thiruvengadam R, Saven A, Bernstein ZP, Gale RP: Genetic

relatedness of lymphoid malignancies. Transformation of chronic lymphocytic leukemia as a model, Ann Intern Med 1993, 119:63-73 110.

Bessudo A, Kipps TJ: Origin of high-grade lymphomas in Richter syndrome,

Leuk Lymphoma 1995, 18:367-372 111.

Cherepakhin V, Baird SM, Meisenholder GW, Kipps TJ: Common clonal origin

of chronic lymphocytic leukemia and high-grade lymphoma of Richter's syndrome, Blood 1993, 82:3141-3147

- 63 -

112.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF: A simple salting out procedure for

extracting DNA from human nucleated cells, Nucleic Acids Res 1988, 16:1215 113.

Chang B, Casali P: The CDR1 sequences of a major proportion of human

germline Ig VH genes are inherently susceptible to amino acid replacement, Immunol Today 1994, 15:367-373 114.

Reiniger L, Bödör C, Bognár Á, Balogh Z, Csomor J, Szepesi Á, Kopper L,

Matolcsy A: Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activation-induced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation, Leukemia 2006, (megjelenés alatt): 115.

Muller-Hermelink HK, Zettl A, Pfeifer W, Ott G: Pathology of lymphoma

progression, Histopathology 2001, 38:285-306 116.

Krober A, Seiler T, Benner A, Bullinger L, Bruckle E, Lichter P, Dohner H,

Stilgenbauer S: V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia, Blood 2002, 100:1410-1416 117.

Stilgenbauer S, Bullinger L, Lichter P, Dohner H: Genetics of chronic

lymphocytic leukemia: genomic aberrations and V(H) gene mutation status in pathogenesis and clinical course, Leukemia 2002, 16:993-1007 118.

Bea S, Lopez-Guillermo A, Ribas M, Puig X, Pinyol M, Carrio A, Zamora L,

Soler F, Bosch F, Stilgenbauer S, Colomer D, Miro R, Montserrat E, Campo E: Genetic imbalances in progressed B-cell chronic lymphocytic leukemia and transformed largecell lymphoma (Richter's syndrome), Am J Pathol 2002, 161:957-968 119.

Camacho FI, Mollejo M, Mateo MS, Algara P, Navas C, Hernandez JM, Santoja

C, Sole F, Sanchez-Beato M, Piris MA: Progression to large B-cell lymphoma in splenic marginal zone lymphoma: a description of a series of 12 cases, Am J Surg Pathol 2001, 25:1268-1276 120.

Schettino EW, Cerutti A, Chiorazzi N, Casali P: Lack of intraclonal

diversification in Ig heavy and light chain V region genes expressed by CD5+IgM+ chronic lymphocytic leukemia B cells: a multiple time point analysis, J Immunol 1998, 160:820-830 121.

Gurrieri C, McGuire P, Zan H, Yan X-J, Cerutti A, Albesiano E, Allen SL,

Vinciguerra V, Rai KR, Ferrarini M, Casali P, Chiorazzi N: Chronic Lymphocytic

- 64 -

Leukemia

B

Cells

Can

Undergo

Somatic

Hypermutation

and

Intraclonal

Immunoglobulin VHDJH Gene Diversification, J. Exp. Med. 2002, 196:629-639 122.

Matolcsy A, Chadburn A, Knowles DM: De novo CD5-positive and Richter's

syndrome-associated diffuse large B cell lymphomas are genotypically distinct, Am J Pathol 1995, 147:207-216 123.

Taniguchi M, Oka K, Hiasa A, Yamaguchi M, Ohno T, Kita K, Shiku H: De

novo CD5+ diffuse large B-cell lymphomas express VH genes with somatic mutation, Blood 1998, 91:1145-1151 124.

Katzenberger T, Lohr A, Schwarz S, Dreyling M, Schoof J, Nickenig C,

Stilgenbauer S, Kalla J, Ott MM, Muller-Hermelink HK, Ott G: Genetic analysis of de novo CD5+ diffuse large B-cell lymphomas suggests an origin from a somatically mutated CD5+ progenitor B cell, Blood 2003, 101:699-702 125.

Timar B, Fulop Z, Csernus B, Angster C, Bognar A, Szepesi A, Kopper L,

Matolcsy A: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter's syndrome, Leukemia 2004, 18:326-330

- 65 -

XI. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

A dolgozat alapját képező közlemények: Timar B, Fulop Z, Csernus B, Angster C, Bognar A, Szepesi A, Kopper L, Matolcsy A: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richter's syndrome, Leukemia, 2004, 18: 326-330. IF: 5.810 Fulop Z, Csernus B, Timar B, Szepesi A, Matolcsy A: Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia, Leukemia, 2003, 17: 411-415. IF: 5.116 Nagy M, Balazs M, Adam Z, Petko Z, Timar B, Szereday Z, Laszlo T, Warnke RA, Matolcsy A: Genetic instability is associated with histological transformation of follicle center lymphoma, Leukemia 2000, 14:2142-2148. IF: 3.736 Csernus B, Timar B, Fulop Z, Bognar A, Szepesi A, Laszlo T, Jakso P, Warnke R, Kopper L, Matolcsy A. Mutational Analysis of IgV(H) and BCL-6 Genes Suggests Thymic B-cells Origin of Mediastinal (Thymic) B-cell Lymphoma. Leuk Lymphoma, 2004, 45:2105-2110 IF: 1.147 Idézhető absztraktok: Timar B, Chadburn A, Knowles DM, Cesarman E: The alternative NF-κB pathway is active in the majority of diffuse large B-cell lymphomas. Laboratory Investigation 2006 (86): 248A IF: 3.702

- 66 -

Timar B, Chadburn A, Knowles DM, Cesarman E: Activation of classical and alternative nuclear factor-kappaB (NF-κB) pathways in diffuse large B-cell lymphomas. Blood 104 (11): 12A-13A 29 Part 1 NOV 16 2004 IF: 9.782 Timár B, Fülöp Zs, Csernus B, Matolcsy A: Analysis of the methylation in lymphomas with the cytosine extension assay. Magyar Onkológia 2002, 46:104. Matolcsy A, Csernus B, Fülöp Zs, Timár B, Jakso P, Kopper L: Mutational analysis of IgH and BCL-6 genes suggests thymic B-cell origin of mediastinal B-cell lymphoma. Ann Oncol 2002, 13 (suppl 2):128. IF: 3.114 Csernus B, Timár B, Fülöp Zs, Jáksó P, Matolcsy A: Mutational analysis of IgH and BCL-6 genes suggests thymic B-cell origin of mediastinal B-cell lymphoma. Magyar Onkológia 2002, 46:90. Fülöp Zs, Csernus B, Timár B, Matolcsy A: The role of genetic instability and hMLH1 promoter hypermethylation in the Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Magyar Onkológia 2002, 46:92.

- 67 -

XII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni Dr. Kopper Lászlónak, a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatójának, hogy PhD tanulmányaimat intézetében végezhettem. Köszönettel tartozom Dr. Matolcsy Andrásnak, hogy a kutatás iránti elkötelezettségemet messzemenőkig támogatta és munkámat minden részletére kiterjedően irányította. Külön szeretném megköszönni Dr. Sebestyén Annának a dolgozatom elkészítése során kapott sok hasznos tanácsot és értékes bírálatot. Dr. Csomor Juditnak, hogy dolgozatomat a tapasztalt patológus szemszögéből nézve adott tanácsokat. Barátaimnak és kollégáimnak szeretném megköszönni, hogy munkám során segítettek és hogy a kutatással eltöltött napokat élvezetesebbé, élménydússá tették. Név szerint Dr. Fülöp Zsolt, Dr. Csernus Balázs, Bödör Csaba, Reiniger Lilla és Dr. Bognár Ágnes. Szeretném megköszönni Dr. Hirné Perkecz Anikónak a tudományos ténykedéseim kezdetén tőle szerzett metodikai ismereteket és a sok segítséget. Családomnak hálával tartozom, amiért mindvégig mellettem álltak és nélkülözhetetlen segítséget nyújtottak eddigi pályám során.

- 68 -