A BIOTECHNOLÓGIA ALAPJAI ÉS EGYES TERMÉKEI

A biotechnológia alapjai és egyes termékei

1

A BIOTECHNOLÓGIA ALAPJAI ÉS EGYES TERMÉKEI 1. Bevezetés • A biotechnológia definiciója Biokémiai, mikrobiológiai és vegyészmérnöki ismeretek integrált alkalmazása mikroorganizmusok, növényi vagy állati szövetek, vagy részeinek technológiai felhasználása hasznos termékek előállítása céljából. • Tudományos integrációja az adott területen: Biológiai tudományok: biológia, mikrobiológia, genetika, biokémia, enzimológia és immunológia Mérnöki tudományok: Kémia, Vegyipari Művelettan, Géptan, Méréstechnika, Irányítástechnika. • A biotechnológia alkalmazási területei: • Gyógyszeripar: + Antibiotikumok és vírus ellenes szerek + Enzimek, aminosavak, vitaminok, peptidek és szteroidok előállítása • Élelmiszeripar: + Keményítők, cukrok + Illat és színanyagok + Sör- és alkoholos italok előállítása • Mezőgazdaság: + Állat- és növényegészségügy + Takarmánykiegészítők + Vitaminok, adalékanyagok + Embriómanipuiláció (génsebészet) • Biometallurgia + Biológiai ásványfelhasználás (Meddő kőzetek hasznosítása, amelyek hagyományos módon nem dolgozhatók fel) • Fermentáció Definiciója: Mikroorganizmusok optimális körülmények melletti tenyésztése és metabolitok hasznos metabolitok előállítása. Alkalmazása pl.: + Szövettenyésztés + Rögzített sejtek, enzimek alkalmazása gyógyszerek stb. előállítására • Vegyipar: + Etanol, szerves savak, mosószerek, biopolimerek stb. előállítása. 2. A biokatalizátorok alaptípusai A biokatalizátorok bizonyos fokig úgy kezelhetők mint a szervetlen, vagy szerves ill. fémorganikus katalizátorok. Azonban ez a megközelítés csak a termodinamika szempontjából helytálló, szerkezetükben, működésükben és kezelésükben már rendkívül különbözőek.


2

Két nagy csoportjuk különböztethető meg: •

Izolált katalizátorok, enzimek: Jól definiált, izolált, kristályos fehérjemolekula. A gyakorlatban a tiszta enzim előállítása rendkívül költséges, így tisztított enzimeket alkalmaznak. Alkalmazásánál fontos követelmény a fehérjestruktúra fenntartása.

•

Mikroorganizmusok: Úgynevezett multi-enzim rendszerek Metabolizmus (anyagcsere)

Katalízis (bikémiai reakciók sorozatának eredménye)

Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai: - Baktériumok és aktinomeciták, - Élesztők - Penészek 2.1 Enzimek • Definició: Fajlagos, katalitikus aktivitású fehérjék, (fajlagosság szempontjából sokkal specifikusabbak, mint bármely fém ill. elemorganikus katalizátor) • Elnevezésük: + Szubsztrát alapján pl.: Ureáz, Oxidáz… + Reakció alapján pl.: Alkohol-dehidrogenáz… + Triviális név pl.: Pepszin, Tripszin… • Osztályozási rendszerük: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

•

Oxidoreduktázok (e-, p+ átvitel reakciói) Transzferázok (csoportátvitel pl.:foszfát) Hidrolázok (hidrolizist katalizáló enzimek pl.: ureáz) Liázok (kettős kötésre történő addició katalízise) Izomerázok (molekulán belüli átrendezdés) Ligázok (ATP átmenet reakciói)

Fajlagosság szerint két nagy csoportot különböztetünk meg: + Szubsztrátfajlagosság, amely lehet: 1. Csoportfajlagosság: kifejezetten egy csoport „kezelésére” alkalmasak, pl.: lipázok, glicerinészterek bontása (Az észter csoportot alakítja át de a zsirsav szénatomszáma már közömbös): H2C O CR1 HC O CR2

+

3H2O

glicerin + R1,2,3 COOH

C O CR3 H2

2. Abszolút fajlagosság Kifejezetten egy reakciót katalizál: NH2 CO NH2

+

H2O

Ureáz

NH2 CO

Spontán

ONH4

3. Sztereokémiai fajlagosság: Optikai aktivitás – biológiai aktivitás

(NH4)2CO3 + CO2 + H2O


3

Az enzim képes megkülönböztetni a R illetve S izomereket. Ezen katalizátorok specifitása > 98% COOH

COOH

R CH

R CH

Amino-aciláz

NH CO

CO

C R' H2

C R' H2

D,L-acil-aminosav racém elegy

COOH

NH

+

COOH

+

R CH NH2

D-acil-aminosav racém elegy

CH2 R'

L-aminosav

Acilezõ sav

+ Hatásfajlagosság: Csak az adott reakciót katalizálja és csak egy adot anyag keletkezik (tehát abszolút fajlagosság is fennáll): H H H

C OH

C

HO C HO

O

O OH H

O

+

FAD

OH

GOD O2

H

OH

HO

H

H

O

+

H2O

FADH2

H

beta-D-glükóz

OH H OH OH CH2OH

CH2OH

CH2OH

HO H

OH

H

H

H

D-glukonsav

D-glukonsav

FAD: Flavin-Adenin-Dinukleotid GOD: Glükóz-oxidáz

• •

Specifitás: Oka: Fehérjeszerkezet Primer-Szekunder-Tercier-Kvaterner Enzimszerkezetek: + Apoenzim: az önálló fehérjemolekula. + Koenzim: Működéshez szükséges nem fehérje rész. + Holoenzim: Enzim-szubsztrát komplex, ez a szerkezet a katalízis kulcsa.

2.2 Az enzimreakciók mechanizmusa és kinetikája •

A mechanizmus sematikus megközelítése: zár-kulcs elmélet, a reakció az ún. aktív centrumokon játszódik le. S S P E

E

(ES)x

E+P

E

E

Az emzimkatalizis több lépésben játszódik le, általánosan a reakcióegyenlet: S+E

Ahol:

(ES)x1

(ES)x2

E – enzin (ES)x – enzim-szubsztrát komplex S – szubsztrátum P – termék

........

(EP)x

P + E


4

Az ureáz ezmim működési mechanizmusán bemutatva: N H

O O

O

O

+ +

H2N

O..

O

H O. . H N

O

H H

O ..

H

N H .. O

.O H.

C O

O

.. O H N H ..O Az eredeti kötések lazulása

NH2

CO

N. .O H H . H . O . .H . O O. H. N. H . O O. H . N C

Az enzim az aktív centrumán megköti a reagenseket

O.

Új kötések kialakulása

O

NH3

NH3 CO2

•

A reakciók kinetikája: 1913-ban MICHAELIS – MENTEN értelmezték először az enzimreakciók kinetikáját. A reakciók jellemzőit három pontban foglalhatjuk össze: + Az enzimek csak a termodinamikailag lehetséges, szabadenergia csökkenéssel járó reakciókat katalizálnak. + Az enzimek a reakciók egyensúlyi állapotát nem változtatják meg, csak ezen állapot elérését siettetik. + Az enzimek fehérje természete teszi lehetővé a specifikus aktív centrumok kialakulását. Ebből következik a pH- és hőmérsékletérzékenység, ill. optimum is. Az általános reakcióegyenlet: S

+

E

k+1 k-1

ES

k2

P +

E

A reakció felírásánál feltételeztük, hogy a második lépés irreverzibilis, továbbá, hogy a teljes enzimkoncentráció állandó: (1) (Et) = (E) + (ES) ahol:

(Et): teljes enzimkoncentráció. (E): szabad állapotban lévő enzimkoncentráció. (ES): komplex formájában kötött enzimkoncentráció.

Felírható négy differenciálegyenlet: d (P ) = k (ES ) dt

2

(2)

d (ES ) = k +1 (E )(S ) − k −1 (ES ) − k 2 (ES ) = k +1 (E )(S ) − (k −1 + k 2 )(ES ) dt

(3)

d (E ) = − k +1 (E )(S ) + k −1 (ES ) + k 2 (ES ) dt

(4)

d (S ) = − k +1 (E )(S ) + k −1 (ES ) dt

(5)

Bizonyos egyszerűsítéseket alkalmazunk a megoldáshoz: - elhanyagolható a k-2 - (ES) állandósul állapotban van, azaz d(ES)/dt=0 - S >> E


5

Ha a (3) egyenletbe behelyettesítjük a (1)-t és fenti feltételezések alkalmazzuk: d (ES ) = 0 = k +1 (E t )(S ) − [k +1 (S ) + k −1 + k 2 ](ES ) dt

(6)

ebből:

(ES )

k +1 (E t )(S ) = k +1 (S ) + k −1 + k 2

(E t )(S ) (E t )(S ) =  k + k 2  (S ) + K m  (S ) +  −1  k +1 

(7)

Ahol Km az enzim-szubsztrát komplex állandósult állapotú disszociációs konstansa, vagy másnéven Michaelis-Menten állandó. A (2) és a (7) egyenletet kombinálva megkapjuk a sebességre vonatkozó végeredményt: v=

k 2 (E t )(S ) K m + (S )

(8)

A fenti (8) egyenletet vizsgálva: o Feltételezve, hogy (S) >> Km esetben a nevezőben Km elhanyagolható így: v = k2 (E) = vmaximális azaz nagy szubsztrátkoncentráció esetén az enzim teljes mennyisége komplexben van, így a reakciósebesség maximális és a rendszer 0-ad rendű kinetikával jellemezhető. A (8) egyenlet ennek megfelelően: v=

v max (S) K m + (S)

(9)

o Ha S = Km akkor v = vmax / 2 (Ez lehetőséget ad Km numerikus értékének meghatározásához) o Ha (S) << Km akkor a (9) egyenlet nevezőjében (S) elhanyagolható, így: v=

v max (S ) = k ' (S ) Km

(10)

A fenti három szempont figyelembevételével elkészíthető az enzimreakciók szubsztrátkoncentrációfüggésének általános alakja: v

Telítési tartomány 0-ad rendű kinetika

vmax/2

Lineáris tartomány elsőrendű kinetika

(S)=Km

(S)


6

A (2) - (5) egyenletek alapján a rendszerben lévő komponensek koncentrációinak időbeli alakulása: [X]

[P]

[S]

[ES]

[E]

t

2.3 Enzimmodulációk Enzimmoduláció alatt aktivációs és inhibiciós mechanizmusokat értünk, melyek lehetnek károsak ill. hatékonyak. Általánosan: Modulátorok

Aktivátorok

Inhibitorok

Kompetitív

Nem kompetitív

Az inhibitorok kétféleképpen gátolhatják az enzimműködést: + A kompetitív inhibitorok helyettesítik a szubsztrátumot az aktív centrumon, így inaktiválódik. A molekula alakja „kísértetiesen” hasonlít a szubsztrátumra, megtéveszti az enzimet. + A nem kompetitív inhibítorok nem az aktív centrumon, hanem a fehérje más részén, vagy annak szerkezetében fejtenek ki roncsoló hatást (a konformációt támadják), így az enzim-jelleg megszűnéséhez vezetnek. Ilyenek pl.: oxidálószerek, nehézfémek (a Cu, Hg pl.: a –S-H csoportokat támadja) „Egy enzimen bemutatva”: Szubsztrátum

Kompetitív inhibítor

Enzimfehérje Nem kompetitív inhibítor

2.4 Az enzimek gyakorlati felhasználása A megfelelő enzimaktivitás gyakorlati megvalósításához jól definiált és pontosan szintentartott körülmények szükségesek. A legfontosabb hatást az enzimműködésre a hőmérséklet és a pH gyakorol: o A hőmérséklet hatása: optimumot kell keresni az aktivitás és a reakciósebesség között:


7

reakciósebesség aktivitás dezaktiválódás

T [K]

Magas hőmérsékleten a molekularezgések megváltoztatják a konformációt, megszűnik az enzim-jelleg, alacsony hőmérsékleten pedig alacsony a reakciósebesség: ( k = A exp − E A  ).  RT 

o A pH hatása Lehetnek savas ill. bázikus résztvevői a reakciónak (pl.: aminosavak különböző oldallánccal) Az aktív centrum töltése miatt lehet érzékeny, a fehérjemolekula pl.: a Hhidak miatt. A pH-ban már egy egységnyi változás is megölheti a biokatalizátort. A legtöb enzim semleges pH-n működik optimálisan, bár vannak extrém kivételek pl.: pepszin a gyomorban aktivitás

1

~7

14

pH

2.5 Enzimrögzítés •

Rögzítés: fizikai elhatárolás

•

Cél:

•

Megoldás: Az enzimeket valamilyen módon rögzíteni kell. Ezek néhány alternatívája: + Keresztkötések létrehozása az enzimmolekulák között (polimerizáció): pl: „Glutáraldehid hálóra felfűzni” az enzimeket: Biomassza (enzim) + Glutáraldehid ! Formázás ! Szárítás: Enzimet tartalmazó töltetet lehet előállítani. A módszer hátránya: nehéz a konformáció megtartása + Kovalens kötés szilárd szemcséhez (szilikát, ioncserélő gyanta vagy molekulaszűrő) rögzíteni, ez már gyakrabban alkalmazott megoldás. + Adszorpciós technika: a fehérjén található poláris csoportok jelenlétének kihasználása. Leginkább időbeni stabilitást ad. + Ionos kölcsönhatás a hordozó és az enzim között

- A vízoldható enzim elválasztható legyen a terméktől - A biokatalitikus hatás megmaradjon + Térben: Magában a bioreaktorban + Időben: Minél tovább tartsa az aktivitását


8

+ Gélbezárás: az enzimet gélgyöngyökbe zárják. Ez bizonyos körülmények között folyadékként ill. szilárd anyagként jelenik meg. Előnye: könnyű szeparálni. + Szemipermiábilis hártya mögé történő elzárás: Az enzim nem, de a termék és a szubsztrát átfér a hártyán. Csak térbeli stabilitást ad. •

•

A rögzítés előnyei: - Folyamatos üzemű bioreaktorokat tudnak üzemeltetni - Nő a fehérje stabilitása - Hosszabb élettartam A rögzítés hátrányai: - Diffúziós gátlás lép fel, az enzim és a szubsztrátum nehezebben mozog. Sebességmeghatározó lehet! - Drága, nagy költségnövekedés - Aktivitás csökkenésével kell számolni az eredeti enzimtömeghez képest: Hordozó

Hordozó

Aktív centrum E

E Inaktiválódás

vagy

Az aktiv centrum leárnyékolása

3. Mikroorganizmusok alkalmazása A fermentációs techniak során a mikroorganizmusok segítségével állítunk elő számunkra fontos anyagokat. Ezekben a reakciókban leggyakrabban gombák és baktériumok vesznek részt. A mikroorganizmusok növekedési rátájának lehetséges típusai: 1. Batch-fermentáció (szakaszos fermentáció): Ez a fermentációtípus képezi az összes ma alkalmazott technika alapját, így a mennyiségi összefüggéseket ez alapján mutatjuk be •

A paraméterek többségére nézve zárt rendszer. Lépései: + A sterilezett tápoldat beoltása mikrobatenyészettel, optimális fiziológiai körülmények között + Levegő adaolása + Egyéb szükséges anyagok pl.: habzásgátlók, sav-lúg … adagolása + Optimális körülmények további fenntartása

•

A mikroorganzmusok növekedési rátája: x 108

C

104 A B

D

E F t

A biotechnológia alapjai és egyes termékei ahol:

9

x – sejtszám A – lag periódus, a beoltás után az új környezethez történő alkalmazkodás B – Gyors növekedési szakasz C – Állandó növekedési, vagy logaritmukis szakasz (log-fázis) D – Lassú növekedési szakasz E – Állandósult állapot, (szaporodás = pusztulás) F – Elhalási szakasz t – idő

A C szakasz elérésével a sejtek adaptálódtak az új körülményekhez. A növekedés, ami a sejttömeg megtöbszöröződését jelenti, az élesztőknél és a baktériumoknál a sejtek számának a generációs idő alatti megkétszereződésével, a gombáknál pedig a biomassza időegység alatti megkétszereződésével fejezhető ki. Ha a mikroorganizmusok számát logaritmikus skálán ábrázoljuk akkor ez közel egyenesnek tekinthető, innen ered a logaritmikus szakasz (log-fázis) elnevezés.

Ha µx a specifikus növekedési sebesség, t az idő és x a sejtszám akkor: dx (11) = µx X dt

Hasonlóan a Michaelis-Menten kinetikához: µx µmax

S

és

µ = µ max

(S ) K s + (S )

(12)

ahol: Ks : telítési állandó

•

Nagyszámban elterjedt technika, a feed-batch fermentációval azonban kicsit csökkent a jelentősége.

2. Feed-batch (rátáplálásos) fermentáció • A paraméterekre névze „félig-nyitott” rendszer + Kezdetben nem az összes mikroorganizmust tápláljuk be, hanem szakaszosan rátáplálunk + A paraméterek követik a tápanyagtartalmat 3. Folyamatos fermentáció • Folyamatos tápoldat bevezetés, és termékelvétel • A paraméterekre nézve nyilt rendszer • Megvalósítása: + Kemosztátban. + Turbidosztátban. + Plug-flow reaktorban.


10

4. Bioreaktorok Olyan tartályok, amelyekben a kiindulási anyagokat biológiailag alakítjuk át megfelelő termékekké, mikrobákat, állati-, növényi, vagy emberi sejteket ill. enzimeket alkalmazva. • A nagy produktivitás feltétele: + Megfelelő energiabevitel + Optimális reakciókörülmények, p, T, pH, coxigén + Sterilitás, eredmény: bonyolult szerelvényezés • •

Többfázisú rendszerek Osztályozásuk az oxigén, mint szubsztrát bevitele szempontjából: + Aerob reaktorok, amelyeke négy nagy csoportba sorolhatóak: -

Gázelosztás beépített mozgó alkatrészekkel: levegőelvezetés

levegőbevezetés 1. Turbina keverőmű

-

2. Vezetőcsöves keverő

3. Önfelszívó keverő

Gázelosztás szivattyúkkal:

levegőbevezetés 4. Buborékoszlop kényszerkörforgással

5. Hajtósugárhurok

6. Szabad sugaras szellőztető


-

11

Gázelosztás a gáz előnyomásával:

levegőbevezetés 7. buborékoszlop

-

8. Mammut-hurok reaktor

9. Airlift reaktor

Folyamatos gázfázis biztosítása:

8. Permetező hártyás reaktor

+ Anaerob reaktorok •

Speciális többfázisú reaktorok: ezekben a szilárd fázis makroméretben van jelen. Másszóval, reaktorok rögzített biokatalizátorokkal. Ezel lehetnek: kevert tank, töltött oszlop, fluidizációs oszlop, membránszeparátorral kombinált reaktor.

•

A bioreaktorok leggyakoribb alkatrészei és segédberendezései: + + + + + + + +

Reaktortartály, és annak állványzata Hűtő ill. fűtőszerelvények Levegőztető rendszer Sterilező rendszer Keverőrendszer Szabályozó és vezérlőredszer Mikroorganizmusok előkészítő és adagoló rendszere Termékelvételi rendszer

A bioreaktorok szerelvényi rendkivüli pontosságot követelnek a megfelelő reakciókörülmények és a sterilitás fenntartása érdekében.


12

5. Ipari mikrobiológiai műveletek kivitelezése A mikrobiológiai iparok termékeinek előállítása, történjen az enzimek vagy mikroorganizmusok segítségével, a következő részlépések sororzatából áll: 1. Oltótenyészet készítése: 2. Tápoldat készítése 3. Sterilezés 4. Fermentáció levezetése 5. Termékek elkülönítése 6. Termékek további feldolgozása 5.1 Oltótenéyszet készítése Fokozatos méretnöveléssel érik el az üzemi fermentor legjobb kapacitásához szükséges mikroorganizmus mennyiséget. A külön tenyésztést sok esetben indokolja, hogy mikroorganizmusok megfelelő növekedéséhez más körülmények kellenek, mint amelyen a kívánt biokémiai reakció lejátszódik. Egy fermentációs folyamat lépései az oltótenyészet utja szerint: Sűrített levegő

Kémcső tenyészet (10 ml)

Rázott lombikos tenyészet (100 ml)

Labor fermentoros tenyészet (10 l)

Inokulum fermentoros tenyészet (2-3 m3)

Üzemi fermentor (50-150 m3)

5.2 Tápoldat készítése A tápoldat készítése az alapanyagok előkészítéséből, oldásából, szükség szerint az oldat tisztításából és sterilezéséből, majd a fermentáció szempontjából kedvező paraméterek (koncentráció, pH, hőmérséklet) beállításából áll. 5.3 Sterilezés •

Sterilezésre elvileg minden olyan behatás alkalmas, ami a mikrooragnizmusok pusztulását okozza, vagy távoltartja azokat. A sterilezési módszer kiválasztásánál figyelembe kell venni, hogy a művelet után nem maradjon vissza olyan tényező, amely a hasznos mikroorganizmusokra káros hatással lenne, vagy elpusztítja azokat ill. a reaktor berendezéseibe kár tesz.

•

Leggyakrabban alkalmazott sterilezési módok: + Az élő szervezetek elpusztítása, inaktiválása vegyszerrel, besugárzással, hőkezeléssel + A sejtszerkezet szétroncsolása erős oxidálószerekkel + Minden élő szervezet eltávolítása fizikai módszerekkel

•

A folyamat lefutását az elhalási görbe jelzi: Elsőrendő kinetika:


dN N = kN = k (N 0 − N t ) → ln 0 = − kt dt N

13

ahol : k - specifikus elölési állandó, t - idő N0 − kiindulási sejtszám, Nt - aktuális sejtszám

•

Tápoldatok sterilezése + Besugárzással (UV, X-ray, γ) bár ezeknek ipari jelentősége csekély + Kémiai eljárások + Csírák mechanikus eltávolítása + Gőzsterilezés: Vegetatív sejtek és spórák pusztítása

•

Szakaszos sterilezés + Minden egyes berendezést külön ki kell sterilezni, hátrány: rendkívüli idői- és energiaigény + Sterilezőszer: 1,5-3bar nyomású gőz

•

Folyamatos sterilezés + A szakaszos sterilezés hátrányit kiküszöbölik + Sterilezőszer: szintén gőzbefúvatás + Hátránya lehet: A nagy hőmérsékletkülönbség miatt sók csapódhatnak ki.

•

A fermentációs levegőáram sterilezése A mikroorganimusokra a legnagyobb veszélyt a levegővel bekerülő szennyeződések jelentik, ezért ennek sterilitására különösen kell figyelni. Meoldások: + Szűrés, besugárzás, hőkezelés + Régebben mélyszűrők (üveggyapot) + Ma: üvegszálbetétes szűrőpatronok + Mai napig megoldatlan a bakteriofágok eltávolítása

•

Fermentációs laboratóriumok sterilezése Fertőtlenítőszerek alkalmazása (70%-os etil-alkohol oldat, formaldehid, 3%-os formalin, klórmész…) folyamatos légszűrés mellett Reaktortartozékok sterilezése: Túltelített gőzzel

• 5.4

A

fermentáció

levezetése

és

termékelválasztás

(biotechnológiai

feldolgozás) •

A megfelelően előkészített bioeaktorban a sejtek működéséhez optimális körülmények fenntartásával vezetik le a fermentációt. A fermentáció levezetése után a kapott biomasszát fel kell dolgozni, attól a célterméket el kell különíteni.

•

Biotechnológiai feldolgozáson azokat a folyamatokat, eljárásokat, lépéseket értjük, amelyek a fermentációs oldatból a céltermékhez vezetnek. A biokémiai reakciók után a fermentációs közeg feldolgozásának módja attól függ, hogy a


14

végtermék a mikroorganizmuson kívüli folyadékfázisban található (extracellulárisan), vagy a hatóanyagot a mikroorganizmus test tartalmazza (intracellulárisan). Extracelluláris eset - Antibiotikumok - Enzimek - Poliszacharidok - Aminosavak

Intracelluláris eset - Vitaminok (B12) - Szteroidok - Élesztő - Proteinek génsebészeti úton előállított baktériumokkal

Az utóbbi esetben a sejtet ’’fel kell tárni’’, hogy a hatóanyag át tudjon oldódni a folyadékfázisba, majd a felszabadított hatóanyagot meg kell kötni egy alkalmas adszorbensen. A fermentációs közegben több olyan melléktermék (sejtmaradványok, anyagcsere melléktermékek stb.) található, amely a hatóanyaggal párhuzamosan megkötődik az adszorbens felületén csökkentve ezzel annak adszorpciós kapacitását. Ezért szükséges az adszorbens regenerálása, amelynek során olyan anyagot vagy elegyet alkalmaznak, amely szelektíven deszorbeálja a felületről az aktív hatóanyagot és a különböző szennyeződéseket. A bioszeparációs műveletek során tehát az első lépés -ha a hatóanyagot a mikroorganizmus tartalmazza- a sejt feltárása. A sejtek mechanikai szilárdságát a protein, lipopoliszacharid polimer és peptidoglycan rétegek biztosítják, a feltárás tulajdonképpen ezen rétegek roncsolását jelenti, amely történhet fizikai, kémiai-biológiai úton.

•

Fizikai sejtfeltárási módszerek Termikus kezelés során a fermentációs közeget hirtelen hőmérsékletváltozásnak vetik alá, amely során a cellák belső nyomása ugrásszerűen megnövekszik, és a sejtfal szétreped, fontos azonban, hogy ezen műveletek során az előállított hatóanyag nem szenvedhet kémiai átalakulást. Nyomásnövekedést előidézhetünk még ozmotikus folyamatokkal is, a sejtet tiszta vízbe helyezve fellép az ozmózisnyomás és ez eredményezi a sejtfal repedését. Mechanikai módszerek közül legelterjedtebb a nagynyomású (600-800bar) folyadéksugár alkalmazása, melynek során a sejteket tartalmazó folyadékot nagy sebességgel sikfelületre lövik és a hirtelen ütközés okozza a sejtfal széttörését. A legmodernebb feltáró módszerek közé tartozik a sejtfal ultrahangos roncsolása.

•

Kémiai, biológiai módszerek A szervetlen lúgok heves reakciója során olyan átalakulások mennek végbe, amelyek lehetővé teszik az aktív hatóanyag kioldódását, azonban ügyelni kell arra, hogy a lúg a céltermékkel ne lépjen reakcióba. A hidrolízis történhet savakkal is, azonban itt nagyobb a hatóanyag roncsolódásának veszélye. Kíméletesebb feltárási módszer a detergensek alkalmazása. A felületaktív anyagok amfipatikus molekulái a Hardy-Harkins elvnek megfelelően mind a vízzel, mind a lipidekkel kölcsönhatásba lépnek és ezáltal oldhatóvá teszik azt. A sejtfalat szerves oldószerekkel is feltárhatjuk, bizonyos oldószerek kioldják a sejtfal lipid tartalmát, duzzasztják a sejtfalat, amely ennek hatására felrepedezik. A

leghatékonyabb és legszelektívebb módszer azonban az enzimes feltárás, azonban az enzimek ára miatt csak kritikusabb esetekben alkalmazzák.


•

15

Izolálás, dúsítás Extracelluláris hatóanyagtartalom esetén a sejtek és egyéb szennyeződések, roncsolás után pedig a sejtmaradványok szeparációjára szűrési, centrifugálási műveleteket alkalmaznak. A szűrést 1-2µm sejtméret alatt alkalmazzák, felette a centrifugálás gazdaságosabb. Az izolálás és termékdúsítás legfontosabb műveletei: ultraszűrés, mikroszűrés, lecsapás, adszorpció fluid rétegen, folyadék-folyadék-szilárd extrakció, bepárlás és kristályosítás. Ezen műveletek közül a leglényegesebbek az adszorpció jelenségén alapuló kromastográfiás eljárások (adszorpciós-, gél-, affinitási-, királis kromatográfia), amely nemcsak az izolálás de a terméktisztítás műveletében is kitűnik. Tisztítási műveletek közül nagy jelentősége van az elektroforézis, a dialízis és az elektrodialízis módszerének is. A kromatográfiás műveletek során a szétválasztandó komponensek egy álló és egy mozgó fázis között oszlanak meg. Az elektroforézis során elektromos térben választják külön a folyadék elektromosan töltött részecskéket. Dialízis során olyan anyagokat választanak szét egymástól vagy kolloidoktól egy szemipermiábilis hártya segítségével, amelyek molekulasúlya jelentősen eltér egymástól. A dialízis a két oldott anyag relatív diffúziós sebességétől függ és ezért legelőnyösebben akkor alkalmazható, ha a kis molekulasúlyú oldott anyagot nagy molekulasúlyú anyagtól kívánnak elválasztani. Tökéletes elkülönítés csak akkor lehetséges, ha ez utóbbi anyagok molekulái túl nagyok ahhoz, hogy a membrán pórusain áthatoljanak. Az elektrodializist a vízben disszociált molekulák elválasztására alkalmazzák elektromos térben, de a szeparáció során membrán közbeiktatása is gyakori.

6. A biotechnológiai ipar végtermékei 6.1 A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai • • • • • • • •

Alkoholok (etanol, butanol, glicerin, alkoholos oldatok – sör – , …). Szerves savak (Ecetsav, citromsav, glukonsav, tejsav, …). Aminosavak (Glu, Lys, Arg, Try, …). Enzimek (Amilázok, katalázok, …). Vitaminok (Bx, β-karotin). Antibiotikumok (penicillinek). Szteroidok (fogamzásgátló intermedierek). Poliszacharidok.

6.2 Szeszgyártás • • • •

Etanol: szintelen, kellemes illatú, égető ízű, gyúlékony folyadék. Vízzel és a legtöbb szerves oldószerrel korlátlanul elegyeik. Gőze a levegővel robbanóelegyet képez. A szesztermelés (etanoltermelés) 2/3 részét világviszonylatban fermentációval végzik. Felhasználása: Élvezeti cikk, technikai etanol, energiaforrás Ipari etanolforrások: + Burgonya, elsősorban ipari szesz előállítására, + hulladék gyümölcs, főként pálinkafélék készítésére, + gabona, főként whisky és vodka előállítása.


16

1 tonna burgonyából átlagosan 83liter, rozsból és tengeriből 300, melaszból 250 és barackból 45 liter ~95%-os szesz állítható elő. •

Szeszes erjedés: + Az élesztők a cukrokat anearob körülmények között úgy erjesztik, hogy termékként etanol és szén-dioxid keletkezik. A bruttó reakció: C6H12O6 = 2 C2H5OH + 2 CO2 + Az alkalmazott mikroorganizmusok: " Sörélesztő (Saccharomysec cerevisiae) – szesz és sörgyártás " Borélesztő (Saccharomyces ellipsoideus) – borászat + A szeszes erjedés során kis mennyiségben mindig keletkeznek melléktermékek: glicerin, aldehidek, savak (tejsav, borostyánkősav), észreke és nagyobb szénatomszámú alkoholok (butil- és amilalkohol).

•

Az erjesztéses szeszgyártás műveletei: Ca2+

Tápoldat készítés

(Az enzim működéséhez szükséges)

α-amiláz, vagy elfolyósító enzim Bevitel: csíráztatott árpa

Felmelegítés 100-140°C sterilezés céljából

Nyomáscsökkentés, hűtés Elfolyósítás 60-80°C Elcukrosítás

Levegőn tenyésztett aerob előkultúra

Anaerob fermentáció 30-35°C, pH=4,5-5,5 24-48óra, 48-72óra (nyersanyagtól függően) Szeparáció, sejtek elválasztása a fermentlétől

Sejtanyag

Desztilláció Etanol

+ Tápoldat előkészítés (cefrézés): Attól függ, hogy erjeszthető cukrokat használnak, vagy keményítőt tartalmazó nyersanyagot. " Erjeszthető cukrok esetén, olyan tápoldatot kell készíteni, melyben a cukor koncentrációja nem haladja meg a 14-18%-ot. " Keményítő tartalmazó termények esetén több műveletet kell alkalmazni. A keméynítőt nem izolálják, hanem megfelelő előkészítés után egyeben használják fel tápoldat készítésre. Előnye, hogy olcsó, és a terménnyel hasznos plussz anyagok is jutnak a tápoldatba.


17

+ Elfolyósítás, cukrosítás: Cefrefőzőkádakban, vagy közvetlenül az erjesztőkádakban végzik. Az enzimkatalizált (α-amiláz) művelet kb. 40-50 percet vesz igénybe 6065°C-on játszódik le és eredményeként a keményítő 75-80%-a bomlik le maltózzá, 20-25%-a pedig dextrinekké. Minthogy az enzimek a fermentáció során is aktívak maradnak, a dektrinek tovább bomlanak maltózzá, (a cefre hőfoka ezért nem mehet 70°C fölé). A cukrosítás után a fermentáció hőmérsékletére hűtik a rendszert. + Fermentáció: " A művelet a mikroorganizmusok szempontjából három részből áll: szaporodás, etanoltermelés és utószakasz. " Egyaránt ismeretes a szakaszos és a folyamatos erjesztés. - Szakaszos erjesztésnél, hasonlóan a többi fermentációs technikához oltótörzset készítenek, majd ezzel oltják be a termelő fermentort: oltótörzs injektálás

gázelvezetés

cefre bevezetés

gázelvezetés Inukulum fermentor

Termelő fermentor

termék elvezetés

Kritikus alkoholtolerancia: A „bacik sem szeretika sok alkoholt” elven, folyamatosan ellenőrizni kell a főfermentor alkoholtartalmát. 5v/v%-nál leáll a mikrobák szaporodása, 10v/v%-nál puszutlás ami a termelés leállását eredméyenzi. - Folyamatos erjesztés esetén a cefrét „átvágják”: Amikor a cefre főerjedésben van, akkor bizonyos mennyiségét egy következő fermentorba vezetik, és ezzel indítják meg az újabb adag cefre erjedését, egyidejűleg az első kádat pedig friss tápoldattal töltik fel. Három reaktor alkalmazásával a megvalósítható a folyamatos üzem, melyel időt és oltóanyagot takarítanak meg.


18

+ Desztilláció („szeszfőzés”): Két lépésben végzik:

2. fokozat

nyersszesz

1. fokozat

fermentlé

finomszesz

szeszmoslék

elő- és utópárlat

kozmaolaj

Az elő és utópárlatot denaturált szesz készítésére, a kozmaolajat oldószerként értékesítik vagy észterelőállítás alapanyagaként hasznosítják.

+ A vizes etanol desztillációjakor max. 95,5 m/m%-os alkohol állítható elő. További töményítés csak kombnált műveletek segítségével lehet.

6.5 Sörgyártás •

A sör a maláta cukrosított vizes kivonatának szeszes erjesztésével készült, komlóval ízesített, kis alkoholtartalmú és viszonylag nagy szárazanyagtartlmú, szénsavdús ital. Leggyakoribb összetevői: + + +

1,5 – 6 % Etil-alkohol 0,25 – 0,4 % aldott szén-dioxid 3 – 10 % nem illó extrakt anyag (dextrinek, sók, cukrok, aminosavak, polipeptidek, fehérjék, szinező és zamatanagok)

•

Jelentős a tápértéke, 1liter átlagos minőségű sör megfelel :

•

Gyártásának menete vázlatosan:

+ + +

150g kenyérnek szénhidráttartalmat tekintve. 120g tejnek, 25g húsnak nitrogéntartalmat tekintve.

Maláta készítése sörárpából Őrlés Víz Cukrosítás Szűrés Komló Főzés nyers sörlé Erjesztés Érlelés Palackozás

(ászokolás)


19

+ Malátagyártás: A csíráztatást megelőzően a sörárpát áztatókádakban 10-12°C hőmérsékleten vízben 2-3 napig áztatják, többszöri vízcsere (levegőztetés) mellett. A szemek 44-46% vizet vesznek fel, kiázik a kellemetlen izt adó csersavak nagyrésze és megindul a magok élettevékenysége. A következő fázis a csíráztatás: 5-30°C közötti hőmérsékleten a magok kicsíráznak és olyan enzimek keletkezése indul meg, melyeknek hatására a keményítőt tartalmazó sejtek közötti vázanyagok feloldódnak, megindul a tartalék tápanyagok lebontása és a sejtlégzés. A keletkező enzimek közül " Az amilázok (cukrosítás), " peptidázok és proteázok (fehérjehidrolízis) a legfontosabbak. A világossör gyártásnál a csíráztatás általában 6-8 napig tart, ügyelni kell a enzimek keletkezésére, ugyanakkor arra is, hogy a szénhidráttartalom ne csökkenjen jelentősen (a szeszmalátánál csak az enzimtartalom a fontos!). A malátaaszalás a következő lépés, melyben a kicsirázott gabonát 4045°C-on szárítják, majd majd magasab hőmérsékleten aszalják. Eközben enimatikus folyamatok lévén íz és színezőanyagok keletkeznek. Az aszalt malátáról a megszáradt csírát forgó dobokban letördelik, szitálással eltávolítják, majd nagy tápértáke miatt takarmányozási céloka használják. + Cukrosítás vagy cefrézés: A megőrölt sörmalátát vízzel keverik és a kívánt enzimes folyamatok számára kedvező körülmények biztosításával, a malátában lévő keményítőt maltózzá és dextrinekké, a fehérjék egy részét pedig aminosavakká és polipeptidekké alakítják. A többi műveletet már a „főzőház”-ban végzik: cefrézőüst páraelvezető kürtő

szűrőkád melegvíz

gőz

sörmaláta törköly

.... . .. . .. . .. .

megszűrt cefere

komlófőző üst

gőz

cefrézőkád

A cefrézőkádban vízzel elkeverik a sörmalátát, azután a cefre egy részét a cefrézőüstbe szivattyúzzák, felforralják, majd visszavezetik a törzscefréhez , és ezzel annak hőmérsékletét 50°C-ra emelik. A cefrét ezen a hőmérsékleten pihentetik (~1óra), majd a műveletet még kétszer ismétlik. Ily módon a cefre hőmérséklete a 2. lépcsőben 6065°C-ra emelkedik,a 3. lépcsőben 70-75°C-ra. A cefrézés után a


20

törkölyt a szűrőkádban leválasztják, majd takarmányozásra feldolgozzák. A komlófőzéshez a szűrőből a szürletet a főzőüstbe vezetik, majd átlagosan 1hl sörre számolva 0,1-0,17kg komlót adnak hozzá, ezután felfőzik. A főzés után kapjuk a sörlét. + Erjesztés: A lehűtött és megzűrt lét a sörgyárak saját kultúrélesztőiket használják, melyek alkalmazkodtak a sörgyártás sajátos körülményeihez. Az erjesztés alacsonyabb hőfokon, lassan, gyakran nyitott kádakban végzik. A gyakran betonból készült kádakat paraffinszurok védőréteggel vonják be, azonban alkalmaznak aluminium, vas és zománcozott kádakat is. + Érlelés: Az erjesztésből kikerült sör (fickó) kellemetlen ízű, zavaros folyadék, ezér hordókban nyomás alatt 1-2 hónapon át, 0-3°C hőmérsékleten érlelik. Ilyen körülméynek között lassú utóerjedés játszódik le, a sör kitisztul, kialakul végső állaga és telítődik szén-dioxiddal. A kész sör nyomás alatt szűrik majd palackozzák. 6.6 Ciromsavgyártás • • • •

•

Általában a trikarbonsavak, így a citromsav is jó hozammal állíthatók elő fermentációs úton Az alábbi törzsek viszonylag kevés melléktermékkel állítják elő a citromsavat: + Aspergillus niger + Aspergillus wentii Az éves citromsavtermelés ~350 000 t Felhsználása: + Élelmiszeripar (ízesítő, konzerválószer) + Gyógyszeripar (Fe-citrát, vasbevitelre) + Vegyipar (Habzásgátló, lágyító anyag, detergensek előállítása PO43-helyett.) Előállítása: + Tápoldatok: Burgonykeményítő, glükózszirup, szacharóz szirup + Termelőeljárások: "

Felületi eljárás, amely lehet szilárd, vagy folyadék táptalajos. Lényege, hogy a táptalaj tálcákon van elhelyezve a reaktorba, növelve ezzel a folyadék-gáz fázisérintkeztetést. A spóraszaporítás kb. 12-14 nap, fermentációs időtartam: 8-12 nap, aktivizálásuk előfermentorban történik. Az eljárás előnye: kevésbé energiaigényes ezáltal olcsóbb, egyszerűbb technikai megoldások szükségesek. Hátránya: maximum 60m3 lehet a térfogat.

"

Szubmerz eljárás, amely a hagyományos fermentációs technikán alapul, a mikroorganizmusok kevert bioreaktorban „dolgoznak”. Átlagos reaktortérfogat 120-200m3, amely lehet kevert fermentor vagy air lift reaktor.


21

6.7 Gyógyszerek – Vitaminok és előállításuk • •

•

•

A vitaminok olyan szerves vegyületek, melyeket általában az emberi szervezet nem tud előállítani (szintetizálni), energiát nem szolgáltatnak, de az anyag- és energiaforgalom lebonyolításában kis mennyiségben is nélkülözhetetlenek. Csoportosításuk: + Oldhatóság: zsíroldható, vízoldható + Biokémiai szerep + Kémiai szerkezet … A legfntosabb ismert vitaminok: Zsírban oldódóak: A, D, E és K Vízben oldódóak: B1-(tiamin), B2-(ribofalvin), B3-(pantoténsav), B5-(nikorinsavamid), B6(piridoxin), B7-(biotin), B10-(folsav), B12-(cianokobalaminok), B15-(pangaminsav), C-(aszkorbinsav), P-(citrin) és U-(S-metil-metionin) A vitaminok előállítására szintetikus és biotechnológiai eljárásokat (legtöbbször ezek kombinációit) dolgoztak ki. Manapság a korszerű génsebészeti eljárásokkal olyan mikroorganizmusok állíthatók elő, melyek már nagyobb mennyiségben és jobb kihozatallal termelnek mint „őseik”. Néhány vitamin előállítása: + B1-vitamin szintézise: NH2 NH2

NH2

+

H3C C

N

C NC H3C

CH-OEt

NH

NH2 CN

N

H2 Pd

CH2NH2

N H3C

N + CS2 + NH3

NH2 N H3C

H2 Cl + C N

O Cl

NH2

H2 H C N

N

HS

N

C S

CH2CH2OH

S

N

H H3C C C CH2CH2OH

CH3

H3C

+ B2-vitamin szintézise A gyógyászati célokra felhasznált B2-vitamint szintézissel, állattakarmányozás céljára fermentációval állítják elő. A clostridium és candida élesztők által termelt 500-1000 mg/liter koncentrációjú fermentlé a vitamint flavin-adenindinukleotid formában tartalmazza: OH OH OH H2C C C C C O H H H H2 H3C H3C

N

P

N NH

N O

O O

O

NH2

P O

N

N

O CH2 O

N

N

OH OH Adenozin-foszfát


22

+ C-vitamin A C-vitamin előállítására többféle ipari szintézis ismeretes, de csak a Dglükózból kiindulónak van ipari jelentősége. A REICHSTEN és GRÜSSNER által 1934-ben kidolgozott eljárás: CH2OH O

H2C OH

OH OH

OH OH

HC OH H2 Raney-Ni HO CH

O2 Acetobacter

HC OH

OH

O

CH2OH

OH-H2C

HC OH Aceton

CH2OH H3C O H HO C O C OH H2

O O

aszkorbinsav

CH3

O sav

O H2C O H3C

H3C

O

O

C OH O

CH3

CH3 O

O

KMnO4

O H2C O H3C

O

CH2OH

CH3

+ B12-vitamin Hiánya a vészes vérszegénységet eredményezi. A molekultát 1948-ban sikerült először elkülöníteni (egy tonna nyers májból 20mg-ot!) A szerkezetét 1955-ben röntgenkrisztallográfiás adatok alapján HODGKIN határozta meg. Kémiai szintézisét 1973-ban végezték le először, de ipari jelentősége nincs. Napjainkban fermentációs úton állítanak elő B12 vitamint (Richter Gedeon Rt.): Rhodopseudomonas protamicus protoplaszt fúzióval előállított rekombináns baktérium 135 mg/liter koncentrációju fermentlét ad, megfelelő szubsztrát és aktivátor anyagok mellett. A termék szeparációját extrakcióval és adszorpcióval, tisztítását preparatí kromatográfiás módszerekkel végzik. 6.7 Gyógyszerek - Antibiotikumok előállítása •

Az antibiotikumok elnevezést 1945-ben fogalmazódott meg WAKSMAN, számos antibiotikum (szteptomicin, aktinomicin…) felfedezője által:

„Antibiotikum minden olyan kémiai anyag, melyet mikroorganizmusok termelnek és (minimális koncentrációban) gátolják más mikroorganizmusok növekedését, vagy elpusztítják azokat”. A jelenlegi legtágabb definició: „Antibiotikumnak tekintünk minden olyan anyagot, melyek élő organizmusok termékei (mikro- és makroorganizmusok, ill. prokarióták és eukarióták, beleértve tehát a magasabb rendű növényeket és az állati organizmusokat is), melyek biokémiai mechanizmuson keresztül gátolják (befolyásolják) más élő szervezetek (pl.: vírusok, ráksejtek, növények…) növekedését”. •

Az antibiotikumok kutatása közel 150 évre vezethető viszza, PASTEUR és kortársai már megfigyelték a különböző mikroorganizmusok – gombák és baktériumok – közötti kölcsönös gátlóhatását az ún. antagonizmus jelenségét.


• • •

•

23

A leghíresebb felfedezés 1928-ban esett, amikor FLEMING észrevette, hogy egy penészgomba (Penicillium notatum) baktériumölő hatással bír. A fenti felfedezés és a II. világháboró miatt bekövetkező gyógyszerszükséglet vezetett a penicillin nagyipari fermentációs eljárásának kidolgozásához, és vetette meg a mai korszerű antibiotikumgyártás alpjait. Napainkban a legfontosabb antibiotikumforrások, amelyekből a forgalmazott gyógyszerek hatóanyagait nyerik : + Sugárgombák (Actinomycetales rend), különös tekintettel a Streptimycesekre + Mikroszkópikus gombák + Baktériumok Napjainkban a fenti három mikroorganizmus család „segítségével” előállított ismert antibiotikumok száma ~12 000. Csoportosításuk: + Termelő organizmus szerint: Termelő organizmus típusa Sugárgomba Mikroszkópikus gomba Baktérium Alga Zuzmó Növény (magasabb rendű) Állati szervezetek Összesen

Ismert antibiotikumok száma 5 500 1 500 1000 300 100 3 000 1 000 12 400

+ Félszintetikus antibiotikum családok: Antibiotikum család Cefalosporinok Penicillinek Egyéb β-laktámok Aminoglikozidok Tetraciklinek Makrolidok Anzamicinek Antraciklinek Peptidek Kloramfenikolok Egyéb antibiotikumok összesen

Közelítő szám 40 000 30 000 7 000 4 000 3 000 2 500 1 500 1 000 1 000 800 3 000

Azoknak a természetes antibiotikumoknak a száma, melyeket a gyógyászatban aktívan alkalmaznak (elsősorban mint baktérium-, gomba- és rákellenes szerek kb. 100 körül mozog, az igazi „nagy antibiotikumok” száma amelyek a bakteriális fertőzés ellen alkalmaznak csupán 10-15-re tehető.

•

Napjainkban egy új antibiotikum bevezetése kb. 10 évi munkába és 50-100 millió dollárba kerül.


•

24

Előállításuk az alkalmazott mikrobiológia legfontosabb területe:

+ Az általános folyamat: Oltóanyag (inokulum) tenyésztés Mikroorganizmus liofilizátum

Agar tenyészet

Rázott kultúra 0,1 - 2 liter

25-30°C 3-6 nap

Előfermentorok (inokulumok) levegő levegő

hűtés/fűtés

Szűrő Termelő fermentor levegő

Feldolgozás: Extrakció Ioncsere Adszorpció ...

+ Fermentor anyaga: KO-36 saválló acél, üveg, Ni-Cr ötvözet + Irányítástechnika: Teljes folyamatirányitás + Elkülönítés szeparálás: " Extrakció " Adszorpció – Kromatográfiás eljárások (PHPLC) (Preparative High Pressure Liquid Cromatography) " Ioncsere " Lecsapásos eljárások " A fentiek kombinációja + Az elkülönítés hozama átlagosan 65-70%. •

Napjainkban forgalmazott néhány közismert antibiotikum: + Semicillin + Amoxicillin + Aktil + Doxicillin


25

6.8 Pennicilinek és előállításuk •

A penicillin egyike a ma legtöbbet használt antibiotikumoknak. A pennicilin név valójában egy vegyületcsoportot jelöl, melynek alapváza: H R C N O H

1 S

5 6

O

N

CH3 2

4

CH3

COO3 H

Eltérés egyedül az ’R’ szubsztituensben lehetséges, néhány fontosabb példa: R csoport szerkezete H O C CH3 H O C C2H5

H O C

Készítmény neve pheneticillin

propicillin phenbenicillin

C6H5

Cl Cl

H C

clometocillin

R csoport szerkezete H C

HO

NH2 H C NH2 H C NH2

H C H2C

OMe OMe

methicillin

Készítmény neve amoxicillin

ampicillin epicillin

betacin NH2

H C N CH2

metampicillin

OMe

Vízben és több szerves oldószerben jól oldódik. Szobahőfokon vizes oldata 5.5-7.5-es pH érték között a legállandóbb. Savas és lúgos oldatokban csak alacsony hőfokon és rövid ideig tartható bomlás nélkül.


•

26

Előállítási folyamatábrája: habzásgátló anyag

prekurzorok

levegőbevezetés

tápoldat oldás

levegőszűrő

levegőszűrő

előfermentorba áramlásmérő

áramlásmérő

csíráztatott spóraszuszpenzió

előfermentor

hűtő hűtőkeverék

oltótenyészet betöltése (sterilvezeték)

nyomószűrő

hűtőtartály hűtés (vízzel) sterilező gőz

termelő fermentor

termék

szivattyú

+ Gyártási célra csak a Penicillium Notatum újabban Penicillium Chrysogenum képes + A gyártási célra kiválasztott törzset liofilizálva szárítják és fagyasztva tárolják. + A tápoldat összetétele a gyártás során nemcsak a termelés mennyiségére van hatással, hanem többé kevésbé meghatározza azt is, hogy melyik penicillin keletkezik. + A gyakorlati szempontból legfontosabb G-penicillin (R=benzil) gyártásánál a tápoldatot az alábbiakból állítják össze: Laktóz (3-4%), kukoricalekvár (3-4%), glükóz (1%), kálium-dihidrogénfoszfát (kb. 0.4%) és kalcium-karbonát (kb. 1%). + A tápoldat pH értéke 5.5 – 6 között ingadozhat (ez a legkedvezőbb a penész szaporodásához). + A termelő fermentorba steril tiszta levegőt vezetnek be, az átlagos levegőszükséglet 0,5-1 liter levegő/liter tápoldat/perc.


27

+ A termelés hőfokoptimuma 25°C, ezt max. 2 fok eltéréssel tartani kell. + A fermentáció időtartama ~40óra, ebből a generációs idő ~6óra.(tipikus feed-batch eljárás). + A művelet kinetikája: sejtszaporodás kinetikája

termelés kinetikája

t

+ A fermentáció levezetése után a végterméket legtöbbször alacsony hőmérsékletű (bomlás visszaszorítása miatt) folyadék-folyadék extrakcióval szeparálják: A penicillint a vizes oldatból szerves fázisba viszik át. Ezután vizes pufferodattal újra szerves fázisba viszik. Alkalmazott oldószer leggyakrabban az amil-acetát. Ezt a folyamatot addig ismétlik amig a további feldolgozáshoz szükséges koncentrációt és a kívánt tisztaságot el nem érik. A nyersterméket többszöri átkristályosítással tisztítják. Vizes fázis Amil-acetát + savanyítás Extrakció Szerves fázis

lúgos kémhatású vizes puffer

Extrakció

•

Sajnos a természetes penicillinekkel szemen több olyan probléma merült fel, amely alkalmazási korlátokat szabott, azonban ezek a problémák vetették meg a félszintetikus penicillinek kifejlesztésének alapjait.

6.7.1 Félszintetikus penicillinek •

A természetes penicilliekkel gyógyászati alkalmazása során a következő problémák merültek fe: + Szük antibiotikus spektrum, csak Gram-pozitív sejtekre gyakorol hatást. + A G-penicillin alkáli sók savérzékenyek per os (szájon át) nem szedhetők. + Allergén hatások, melyeket antihisztaminokkal sem siekrült kiküszöbölni + A kórokózók penicillinekkel szemben kialakult rezisztenciája


28

•

A félszintetikus penicillinek azon antibiotikumok, melyek hatóanyagának előállításánál, az alapmolekulát (penicillin-nukleusz, vagy 6-APS: 6-aminopenicillánsav) mikroorganizmus állítja elő, azonban ehhez szintetikus úton olyan oldalláncot kapcsolnak, amelyekre fermentációs úton nem nincs lehetőség.

•

A 6-APS + Az APS felfedezése gyakorlati szempontból vetekszik a penicillin felfedezésével. 1950-ben SAKAGUCHI és MURAO közölte először, hogy a P. chysogenum micéliumában egy enzim, a penicillin-amidáz (gyakran penicillin-aciláznak is nevezik) a benzil-penicillinből 6-APS-t képez. + Az 1953-ban igazolt reakció: O

S

C C N H H2

penicillin-aciláz

N

O

+ H2O pH=7.5

C OH O

G-penicillin

O

S

H2N

+

N O

C C OH H2

C OH O

+ A 60-as években több ipari eljárás született a G-penicillin oldalláncának eltávolítására. A aciláz enzim termelésére számos mikroorganizmus (Escherichis, Bordatella…) képes, azonban a módszer hátránya, hogy 5% szubsztrátkoncentráció felett a aciláz enzim aktivitása jelentősen csökken továbbá más nemkívánatos enzimek jelenlétével is számolni kell. A tisztított enzim alkalmazása azonban irreálisan megnöveli az előállítási költségeket. Megoldás: Rögzített enzimek alkalmazása + A 6-amino-penicillánsav acilezése A félszintetikus antibiotikumok alőállítására olyan peptidkötés-kiépítési módszerek használhatók, melyek a penicillinmolekula sajátosságait is figyelembe veszik. Az egyik legegyszerűbb és legrégebbi eljárás a savkloriddal történő aciilezés: O

S

H2N

+

N O

C OH O

O R

- 5°C CL Cl

--HCL HCl

R C N H O

S N C OH O

Másik széles körben alkalmazott acilezési módszer a vegyeskarbonsavanhidrides eljárás. Ezt az uat követték a D-a-amino-benzil-penicillin (Ampicillin) szintézisénél, melyet nálunk Semicillin néven forgalmaznak. •

A félszintetikus készítmények részben orvosolták a Gram-negatív sejtek problémáját, azonban az allergén tünetek kizárása a mai napig megoldatlan.


•

29

További fontos félszintetikus penicillinszármazékok: + Penicillin-észterek pl.: G-penicillin-acetoxi-metilészter (Maripen) O S

C C N H H2

N

O

C O C O COCH3 H2

O

+ 6-a-szusztituált származékok pl.: Temocillin O CH3

C ONa O C N H O O

S

S N C O Na O

6.8 Cefalosporinok • A penicillinhez hasonló vegyületek • Az alapvegyület:

R3 H

R1 CONH

N

O

S R2 COOH

7-ACA: (7-amino-cefalosporánsav) •

A legfonotsabb származékok: R1

R2

R3

CH 2OAc

H

cefalotin

már nincs

CH 3

H

cefalexin

Pyassan

H

cefazolin

külföldön

H

cefamandol

H

cefuroxim

név

készítmény

1. CH 2

S

CH NH 2 N N N CH 2 N

N N CH H2 S

2. CH OH

CH H2 S

CH 3

S N N N N CH 3

CH CH 2 O CO NH 2 NH OCH 3 CH 2

S 3.

NH 2 S

N CH NH OCH 3 CH NH O H 3 C C CH 3 COOH

Mandokef

Zinacef

CH 2 O CO NH 2

H 3 cefoxitin O CH

Mefoxin

CH 2 O CO NH 2

H

cefotaxim

Claforan

H

ceftriaxon

Rocephin

H

ceftazidim

Fortum

H3 C CH H2 S

N N OH N O

CH H2 N


•

30

Pennicillinérzékenység esetén: + Eritomicin: O H3C HO

CH 3

HO H3C H2C H3C

OH CH 3

HO O

O

CH 3 O

CH 3 O

O

N( CH 3 ) 2 CH 3 CH 3

OH CH 3 OCH 3

+ Streptomicin (csak életveszélyes helyzetekben adják a hatékony és a toxikus koncentráció között kicsi a különbség): H2 N

C NH

HN O

HO H 2 N C HN NH

OH OH

str eptidin

CH CH OH O C CHO CH CH 3 streptóz

O CH H 3 C HN CH H C OH O HO C H C H CH 2 OH L - glukózamin

6.9 Aminosavak •

Az aminosavak erjesztés útján történő előállítása az ipari mikroiológia legfiatalabb és legjobban fejlődő területe. Ezidáig jól bevált ipari eljárásokat dolgoztak ki: L-lizin, L-glutaminsav előállítására Az irodalmi adatok alapján biztató eredményeket értek el: + L-valin, + L-aszparaginsav, + L-riptofán előállításának területén. + +

•

• •

A műveletek legfőbb problémája: Igaz, hogy aminosavakat valamennyi mikroorganizmus termel, de azokat azonnal felhasználja fehérjeszintézisre. Megfigyelték ugyan, hogy egyes mikrorganizmusok a környezet felé is kiválasztanak aminosavakat, de sajnos jelentéktelen mennyiségben. Megoldás: Mesterséges mutánsok alkalmazása, de ez is csak adott aminosavszintézisre hasznosítható. A bioszintézis rendkívüli előnye, hogy optikailag tiszta aminosav keletkezik. Az L-glutaminsav előállítása: + Micrococcus glutamicus baktérium segítségével, + Tápoldat: glükóztartalmú oldatok, + Nitrogénforrás: karbamid, + „Szabályozó”: Megfelelő mennyiségben adagolt biotin. Szükséges a baktérium fejlődéséhez, de nagy mennyiségben sok baktérium fejlődik, ami hátráltatja a savtermelést, + Rekaciókürölmények: 30°C, 8-as pH érték, + Az átalakulás maximálsi mértéke: ~50%, + A maximálisan elérhető glutaminsav koncentráció: 3g/100ml.

A BIOTECHNOLÓGIA ALAPJAI ÉS EGYES TERMÉKEI

Recommend Documents