A biológiai óra hatása az arilalkilamin-n-acetiltranszferáz mrns cirkadián expressziójára csirke retinában és tobozmirigyben

A biológiai óra hatása az arilalkilamin-N-acetiltranszferáz mRNS cirkadián expressziójára csirke retinában és tobozmirigyben

Dr. Toller Gábor PhD értekezés

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Pécs 2007

A biológiai óra hatása az arilalkilamin-N-acetiltranszferáz mRNS cirkadián expressziójára csirke retinában és tobozmirigyben

PhD értekezés Írta: Dr. Toller Gábor

Dr. Szolcsányi János Elméleti Orvostudományok, Doktori Iskola vezetője Dr. Csernus Valér Neuroendokrinológia és neurohisztológia, Programvezető Dr. Rékási Zoltán Témavezető

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Pécs 2007

-1-

Tartalom 1. Bevezetés

4

1.1 A cirkadián ritmusok jellemzői

4

1.2. A madarak cirkadián rendszere

6

1.3. A biológiai óra molekuláris biológiai háttere

10

1.3.1. Az ecetmuslica szervezetében a biológiai óra magját két pozitív és két negatív elem alkotja

15

1.3.2. Az emlősök órája két, egymásba fonódó visszacsatolási körből áll

19

1.3.3. A madarak órája hasonló az emlős órához, de részleteiben kevésbé feltárt

21

1.4. A melatonin anyagcseréje és kapcsolata az endogén oszcillátorral

22

1.4.1. A melatonin anyagcseréje madarakban

22

1.4.2. A melatonin szintézis kapcsolata az endogén oszcillátorral

26

1.5. Antiszensz oligonukleotidok

30

2. Célkitűzések

36

3. Módszertan

37

3.1. Vegyszerek

37

3.2. LNS tartalmú AON-ok

37

3.3. Kísérleti állatok

38

3.4. Dinamikus tobozmirigy szövetkultúra

38

3.5. Transzfekció szuperfúziós rendszerben

39

3.6. mRNS szintek mennyiségi vizsgálata

40

3.7. Melatonin RIA

42

4. Eredmények

43

4.1. A cBmal1, cClock és cAa-nat gének expressziójának időbeli változása csirke ideghártyában és tobozmirigyben in vivo

43

4.2.Csirke ideghártya és tobozmirigy melatonin szekréciójának, valamint a cBmal1, cClock és cAa-nat gének expressziójának időbeli változása in vitro

45

4.3. Csirke tobozmirigy diurnális cBmal1, cAa-nat expressziójának és melatonin ritmusának meghatározása transzfekciós kísérletekhez

47

4.4. Disszociált csirke tobozmirigy melatonin szekréciója cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-kal történt transzfekció után

49

4.5. Disszociált csirke tobozmirigy cBmal1 és cAa-nat expressziója cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-kal történt transzfekció után

49

-2-

5. Az eredmények megvitatása

53

5.1. Csirke tobozmirigy és ideghártya cBmal1, cClock és cAa-nat mRNS expressziója in vivo

53

5.2. Diszpergált ideghártya és tobozmirigy sejtek ritmikus melatonin termelése és cBmal1, cClock és cAa-nat mRNS szintjeinek napi ritmusa

56

5.3. A cBmal1 mRNS-ről történő transzláció gátlásának hatása csirke tobozmirigy melatonin szekréciójára és cAa-nat mRNS szintjeire

59

6. Az eredmények összefoglalása

63

Irodalomjegyzék

65

A disszertációhoz kapcsolódó különlenyomatok jegyzéke

74

A disszertációhoz kapcsolódó konferenciai szereplések jegyzéke

75

A disszertációhoz nem kapcsolódó közlemények jegyzéke

76

Köszönetnyilvánítás

78

-3-

1. Bevezetés

1.1. A cirkadián ritmusok jellemzői Az egysejtűektől a legfejlettebb gerincesekig, illetve növényekig számos szervezet életjelenségei változnak ritmikusan ismétlődő módon. Egy-egy ciklus időbeni hossza, azaz periódusa, igen változó lehet, attól függően hogy éppen mely élőlény, mely biológiai folyamatát vizsgáljuk. Két végletként említhető meg a téli álmot alvó állatok évenkénti hibernációja, és egy emberi szívrevolució időtartama. Azon folyamatokat, amelyek közel 24 órás periódussal ismétlődnek, cirkadián ritmusnak nevezzük (Falcon, 1999). Néhány kivételtől eltekintve, az, hogy egyes életjelenségek napi ritmussal ismétlődnek, az összes eukarióta élőlény közös tulajdonsága (Dunlap, 1999). A cirkadián ritmusok további közös jellemzője, hogy az általuk szabályozott életjelenségek napszakos változása még akkor is megfigyelhető, ha a külső környezetből érkező ingerek az idő előrehaladtával nem változnak, a ritmus mintegy szabadon halad tovább. A napszaki ritmusok tehát nemcsak passzívan követik a környezet ritmikus változását, hanem áll mögöttük egy olyan belső, önmagát fenntartó biológiai mechanizmus, amit az angolszász terminológia pacemakerként definiál. A cirkadián ritmusok vonatkozásában az irodalom gyakran a pacemaker kifejezés szinonímájaként használja a belső óra, illetve az utóbbi évtized sejtbiológiai kutatások eredményeire utalva (ld.: 1.3. A biológiai óra molekuláris biológiai háttere) – a belső vagy endogén oszcillátor kifejezéseket. Gerincesekben a közel 24 órás periódussal váltakozó élettani funkciók közé tartozik az ébrenlét/alvás ciklusa, a testhőmérséklet, hormonok elválasztásának (Jozsa és mtsai, 2005) napszaki változásai. Kísérleteink leírásához szükséges, hogy ismerjük azt, hogy az éppen vizsgált szervezet belső órájának mutatója éppen hol áll. Ha a biológiai órát befolyásoló ingerek időben állandóak maradnak, akkor a belső óra egy-egy periódusának hossza csak megközelítőleg 24 óra. Mivel ennek a szubjektív napnak a hossza fajonként eltérő, ezért az egy, környezet által nem befolyásolt, szubjektív ciklus alatt történő események időbeni leírásához a cirkadián időt (az -4-

angol circadian time után: CT) használjuk. Megyegyezés szerint CT 0 a szubjektív hajnalnak, CT 12 pedig a szubjektív szürkületnek felel meg (Dunlap, 1999). Akárcsak a genetikai kutatásokban kedvelt muslicában, gerincesekben is számos szerv rendelkezik a cirkadián ritmus fenntartására alkalmas biológiai órával (Chong és mtsai, 2003; Herichova és mtsai, 2006; Poeggeler és mtsai 2005; Stebelova és mtsai, 2005). Az egyes szervek belső órái azonban nem feltételenül vannak azonos fázisban, egymáshoz képest siethetnek vagy késhetnek. A több órával rendelkező élőlényeknek ezért szükségük van az egyes órák egyfajta hierarchikus elrendezésére, azaz egy, vagy akár néhány belső órának karmesterként kell vezérleni az ezen hierarchikus rendszerben a szabályozásuk alá rendelt oszcillátorokat. Azon biológiai órával rendelkező szerveket, amelyek a külső környezet jeleinek hatására képesek pacemakerük ritmusát megváltoztatni, és a többi szerv óramechanizmusát koordinálni elsődleges oszcillátoroknak (master oscillator), míg az általuk irányított szerveket másodlagos oszcillátoroknak (slave oscillator) nevezzük (Panda és mtsai, 2002). A belső óra képes egy körülbelül 24 órás periódusú ciklust generálni és fenntartani, de ez nem jelenti azt, hogy a külső környezet változásai ne tudnák befolyásolni az egyed szubjektív napi ritmusát. Azokat a külső környezeti tényezőket, amelyek a ritmusok külső környezettel történő szinkronizálásáért felelősek Zeitgebereknek hívjuk. Ilyen inger lehet a megvilágítás, a külső környezet hőmérséklete, a külvilágból érkező zaj, a föld mágneses mezeje és a szociális kontaktusok (Barrett és Takahashi, 1995; Csernus és mtsai, 2005; Davidson és Menaker, 2003; Natesan és mtsai, 2002; Robertson és Takahashi, 1998a; Robertson és Takahashi, 1998b). Ha az óra és az óra által vezérelt fiziológiai változások követik egy adott Zeitgeber változásait, ilyenkor kísérleteink időbeli leírásához a CT helyett a Zeitgeber időt (Zeitgeber time, röv. ZT) használjuk. Amennyiben egy adott életjelenség Zeitgebere a nappalok és az éjszakák váltakozása, úgy az ilyen diurnálisnak is nevezett ritmus esetében, megegyezés szerint, ZT 0 óra a világos fázis kezdetének felel meg. A cirkadián ritmussal ismétlődő életjelenségek tehát két tényező befolyása alatt állnak: az -5-

organizmus saját belső órája által diktált ritmust a külső környezetből érkező ingerek összessége szinkronizálja az élettelen világ ritmikusan változó folyamataival. Az óra és a külső környezet közötti szinkronizáció úgy valósul meg, hogy az óra a kisebb időbeli eltolódással igyekszik a Zeitgeber ritmusához igazodni. Ha például a szinkronizációért felelős Zeitgeber a fény, akkor egy, a kora esti órákban adott rövid fényimpulzus az óra késését, a késő esti órákban adott impulzus pedig az óra sietését okozza. A cirkadián ritmusok biológiai hátterét egy három komponensből álló cirkadián rendszer adja. Ennek bemenetét egy olyan mechanizmus képezi, amelynek segítségével az óra a külvilág felől információt kap. A rendszer központi eleme a belső biológiai óra vagy endogén oszcillátor, a rendszer kimenő komponense pedig a hormonális vagy idegi jel, amely az élőlény napszaki életfunkcióit, viselkedését határozza meg (Bunger és mtsai, 2000; King és Takahashi, 2000). Egy, a gerincesek esetében érvényes általános modell példáján szemléltetve a cirkadián rendszert: a rendszer bemenete a szem ideghártyája, ami a környezet fényviszonyairól informálja az órát. Az oszcillátor alapját az óragénekről történő ritmikus génkifejeződés adja. Az elsődleges oszcillátor anatómiailag különböző központi idegrendszeri struktúrában foglalhat helyet. Az elsődleges

oszcillátorok

egymáshoz

viszonyított

dominanciája

gerinces

törzsenként és osztályonként változó. A rendszer kimenete gerincesek esetében döntően hormonális: a tobozmirigyből napi ritmussal történik a melatonin szekréciója. 1.2. A madarak cirkadián rendszere A madarak cirkadián rendszerének elsődleges oszcillátorai: a fényingereket felvevő ideghártya (retina), a hipotalamusz nucleus suprachiasmaticusa (SCN) és a tobozmirigy (corpus pineale, epiphysis cerebri) (Chong és mtsai, 2003; Natesan és mtsai, 2002; Yasuo és mtsai, 2003; 1. ábra A). Ezen alkotóelemek mindegyike rendelkezik egy saját, a többi alkotóelemtől függetlenül is működni képes belső órával (Steele és mtsai, 2006; Zimmerman és Menaker, 1979, Yasuo és mtsai, 2003, -6-

1. ábra. (A) Madarak és (B) emlősök cirkadián rendszerének összehasonlítása. Mindkét osztály esetében a rendszer fő elemeit az ideghártya (sárga), a nucl. suprachiasmaticus (SCN) és a tobozmirigy képezik. Szemben az emlősökkel, madarak esetében nemcsak az ideghártya érzékeli a környezet fényviszonyait (zöld nyilak), hanem a tobozmirigy is. Egyelőre még nem teljesen tisztázott a hipotalamusz környékén elhelyezekedő mély agyi fotoreceptoroknak (zöld kérdőjel) a melatonin termelés szabályozásában betöltött szerepe. Madarakban az ideghártya, az SCN és a tobozmirigy is rendelkezik saját belső órával (fekete órák). Emlősökben csak az SCN működik autonóm ritmusgenerátorként. Az emlősök tobozmirigye egy multiszinaptikus pályarendszeren át (piros nyilak) a SCN szabályozása alatt áll. A madarak tobozmirigyének elsődleges oszcillátorát a SCN-ból érkező idegi szabályozás mellett a környezet fényviszonyai a koponyán keresztül közvetlenül is befolyásolhatják. A madár tobozmirigy melatonin termelését tehát a tobozmirigy elsődleges oszcillátora és a környezeti fényviszonyok együtt szabályozzák. NA: noradrenalin. -7-

Yoshimura és mtsai, 2001). Eltérően az emlősöktől, madarakban így a tobozmirigy

nemcsak

melatonin

termelésre

képes,

hanem

saját

belső

óramechanizmussal és fotoreceptorokkal is rendelkezik, tehát önnálló cirkadián rendszerként működik. A retina szerepe is bonyolultabb madarakban, mint emlősökben. A madarak retinája amellett, hogy a cirkadián rendszer bemeneteként működik, a tobozmirigyhez hasonlóan saját endogén oszcillátorral rendelkező cirkadián rendszer (1. ábra A és B). A madarak elsődleges oszcillátorainak ritmusát időzítő legfontosabb környezeti tényező, azaz Zeitgeber,

a

fény

(Robertson

és

Takahashi,

1988a;

Robertson

és

Takahashi,1988b; Steele és mtsai, 2006; Yasuo és mtsai, 2003, Yoshimura és mtsai, 2001). A madarak cirkadián rendszerének egyes tagjai között direkt vagy indirekt összeköttetés áll fenn, az egyes elemek közötti visszacsatolás azonban nem minden esetben bizonyított. A retinális fotoreceptorok esetében lehetőség van arra, hogy a fény direkt jusson el ahhoz a sejthez, ami egy fő oszcillátort tartalmaz és egyben melatonin termelésére is képes (Chaurasia és mtsai, 2006; Iuvone, 2000). Az ideghártya belső órája által szabályozott melatonin termelés, egyrészt szabályozója a ritmikus retinális anyagcserének és parakrin neuromodulátor (Iuvone és mtsai, 2005), másrészről viszont a fotoreceptor sejtek melatonin termelése révén madárfajonként különböző mértékben járul hozzá a vérplazma melatonin tartalmához (Cogburn és mtsai, 1987; Natesan, 2002; Underwood és mtsai 1984). Az ideghártya azon ganglionsejtjei, melyek a környezet fényviszonyairól szerzett információt továbbítják a hipotalamuszban található belső órához, azaz a retinohipotalamikus pályát adják, pályatani kutatások alapján főleg az ideghártya dorsalis részében helyezkednek el. (Cantwell és Cassone, 2006). A retinohipotalamikus pálya rostjai, madarakban két morfológiailag egymástól jól elkülönülő magban, az úgynevezett vizuális és mediális SCN-ban (vSCN illetve mSCN), végződnek (Cantwell és Cassone, 2006; Cassone és Moore, 1987). E két mag közül a retinából érkező rostok túlnyomóan a vSCNban végződnek, míg léziós kísérletek és in situ hibridizációs vizsgálatok a mSCN-t jelölték meg a hipotalamikus oszcillátor székhelyeként (Yoshimura és mtsai, 2001). Részletes anterográd és retrográd jelölő anyagokkal végzett -8-

pályatani vizsgálatok kimutatták, hogy madárban a két SCN között kétirányú kapcsolat áll fenn, de több idegrost halad vSCN-ből az mSCN irányába, mint fordítva. Ezen adatok alapján egyrészt feltehető, hogy a retinából érkező információ a vSCN közvetítésével éri el a mSCN-ben kimutatott oszcillátort, másrészt pedig, figyelembe véve a két SCN különböző irányú efferentációját, lehetőség van arra, hogy a két mag más-más, napszaki ritmust mutató életjelenségeket szabályozzon (Cantwell és Cassone, 2006). Az SCN egy multiszinaptikus pályarendszeren keresztül idegzi be a ganglion cervicale superiust, ami noradrenerg rostokkal látja el a tobozmirigyet (Moore, 1978; Cassone és Menaker, 1983; Cassone és Moore, 1987). Csirkék esetében kevés irodalmi adat áll rendelkezésre erről a multiszinaptikus pályarendszerről, a ganglion cervicale superiust érintő léziós kísérletek azonban meggyőzően

bizonyítják

tobozmiriggyel.

A

a

madarak

ganglion

cervicale

pinealocitáin

a

superius

kapcsolatát

noradrenalin

a

α2-adrenerg

receptorokon hat, ezért madár pinealocitákon a ganglion cervicale superiusból származó noradrenalin gátló hatása érvényesül (Bylund és mtsai, 1988; Zawilska és Iuvone, 1990; 1. ábra A és B). A nappali vagy a szubjektív világos fázisokban tapasztalt alacsonyabb melatonin szintek tehát a noradrenalin hatásával magyarázhatóak (Cassone és Menaker, 1983). A madarak tobozmirigye egy follikuláris szerv, amely a koponyatető alatt helyezkedik el és egy nyél köti az epitalamuszhoz. A tobozmirigy melatonin termelésért a follikulusok hámját alkotó pinealociták felelősek. A fotoreceptorok morfológiai jellemzőit még őrző pinealociták mellett (Dryer és Henderson, 1991; Fejer és mtsai, 1997; Vígh és mtsai 1998) a tobozmirigyben idegsejteket és intersticiális glia sejteket is írtak le. A fenti adatok ismeretében nem meglepő, hogy sikerült kimutatni a madár tobozmirigy fényérzékenységét in vitro és in vivo is (Hasegawa és Ebihara, 1992; Nakahara és mtsai 1997; Robertson és Takahashi, 1988a; Robertson és Takahashi 1988b). A pinealociták által termelt melatonin a vérkeringés segítségével egyrészt a perifériás szerveken található specifikus receptorokhoz jut el (Lee és Pang, 1992; Murayama és mtsai, 1997; Song és mtsai, 1996), másrészt az agy különböző területein fejti ki hatását (Gahr és Kosar, 1996), melyek közül -9-

kiemelendő a hipotalamusz. A melatonin a SCN-ban expresszálódó melatonin receptorokon keresztül elsősorban a cirkadián fiziológiát befolyásolja, míg a pars tuberalisban található receptorok a szezonális ritmicitást vezérlik (Brandstatter, 2003; Reppert és mtsai, 1994). A hipotalamo-hipofizeális tengely működését ezen receptoron keresztül befolyásolva (Kameda és mtsai, 2002; Ubuka és mtsai, 2005) a melatonin elvileg közvetve minden endokrin szerv szabályozásában képes részt venni. A külső megvilágítási viszonyokon kívül a tobozmirigy melatonin szekréciója reagál a korábban már felsorolt egyéb Zeitgeberekre (külső környezeti hőmérséklet, és zaj, szociális kontaktus), továbbá irodalmi adatok utalnak arra is, hogy a Föld mágneses mezeje is befolyással bír a tobozmirigyre, így segítve a költöző madarak vándorlását (Csernus és mtsai, 2005). Nemcsak a közvetlenül a koponyatető alatt elhelyezkedő tobozmirgy reagál a koponya csontjain keresztül történő megvilágításra. A tobozmirigy mellett ismertek még más nem retinális, úgynevezett mély agyi fotoreceptorok is (Vígh és mtsai, 2003). Ezek az oldalkamrák és a septum pellucidum körül található liquor kontakt neuronok, melyek közvetlen vagy közvetett idegi kapcsolat révén befolyásolni tudják a nemi szervek fotoperiódus általi szabályozását (Kiyoshi és mtsai, 1998). Az ideghártya, a SCN és a tobozmirigy mind autonóm oszcillátorok madarakban, ám a cirkadián ritmusok szabályozásában betöltött szerepüket tekintve korántsem egyenértékűek minden madárfajban egymással. Veréb és csirke esetében a tobozmirigy a cirkadián ritmust mutató viselkedési mintázatok fő szabályozója (Ralph és mtsai, 1975; Zimmerman és Menaker, 1979), japán fürjben a szem a domináns (Steele és mtsai, 2002), míg galambban mind a szem, mind a tobozmirigy elsődleges oszcillátor (Ebihara és mtsai, 1997; Natesan, 2002). 1.3. A biológiai óra molekuláris biológiai háttere Azon szervek azonosítása után, amelyek gerincesekben biológiai óra székhelyéül szolgálnak, a kutatók érdeklődésének középpontjába a biológiai órát - 10 -

alkotó molekuláris mechanizmusok feltárása került. Ezek a tanulmányok az óraművet szabályozó biológiai folyamat háttereként, serkentő és gátló hatású transzkripciós faktorokat kódoló géneket, az óragéneket és fehérje termékeiket tárták fel. A felhasznált vizsgáló módszerek elsősorban az óragének vagy az általuk kódolt mRNS-ek kimutatására fókuszáltak, így számos esetben az óra alkotásában részt vevő fehérje komponensek létezésére, csak a kimutatott gén, vagy mRNS megléte alapján következtethetünk. A legegyszerűbb modellek szerint a génátírást fokozó, az óra pozitív alkotóelemeiként

működő

transzkripciós

faktorok

serkentik

a

negatív

alkotóelemeket kódoló óragénekről történő mRNS átírását, és az így frissen szintetizált mRNS a citoplazmába transzportálódik. A citoplazmában a hosszabb időn át folyamatosan szintetizált fehérjék poszttranszlációs módosításon esnek át, ez leggyakrabban az adott fehérje foszforilációját jelenti, ami egyrészt a fehérjék citoplazma szintjeit szabályozza, másrészt lehetővé teszi heterodimerizációjukat és ezáltal a sejtmagba történő transzportjukat. A magban az óra negatív alkotóelemeiként működő transzkripciós faktorok gátolják az óra pozitív alkotóelemeinek génexpressziót serkentő hatását (Dunlap, 1999; Loudon és mtsai, 2000; King és Takahashi 2000). Amikor a gátló hatású óragének által kódolt fehérjék szintje leesik, feltehetőleg ezen gátló hatású fehérjék szabályozott lebomlása miatt, a serkentőleg ható transzkripciós faktorként ható fehérjék szintje ismét emelkedni kezd és ezzel visszacsatolási kör bezárul (2. ábra). A negatív alkotóelemek fehérjéinek lebontását valószínű, hogy a fehérjék ubiquinitinhez kötése indukálja, amely proteoszómális degradációjukhoz vezet. Fontos kitétel, hogy a visszacsatolás némi késéssel valósuljon meg, mert így dinamikus egyensúly helyett, a különböző faktorok szintjeinek napszaki ritmussal ingadozó, oszcilláló változása alakul ki. (Dunlap, 1999; King és Takahashi, 2000). Az óragének és az általuk kódolt fehérjék alkotta visszacsatolási kör legalapvetőbb elemei már megtalálhatóak bizonyos baktériumokban is (1. táblázat). Jelen dolgozatban, a szakirodalomban elfogadott konvenciót követve a nukleinsavak nevének első betűjét dőlt nagybetű, a többit dőlt kisbetű, a fehérjék nevét pedig csupa egyenes nagybetű jelöli. Arra, hogy az adott molekula mely fajból származik, a nukleinsav vagy a fehérje neve elé tett kisbetű utal, amely a faj - 11 -

2. ábra. A cirkadián oszcillátor általános modellje. A serkentő fehérjéket világos- és sötétzöld ellipszisek, szintézisüket pedig zöld nyilak jelölik. A gátló alkotóelemeket és a szintézisükkel kapcsolatos anyagcsere utakat a piros szín és árnyalatai jelölik. A sejtmagot hosszú, a durvafelszínű endoplazmás retikulumot rövid szaggatott vonalak, a sejtmembránt pedig pontokkal megszakított vonalak jelképezik. A génátírást sárga nyilak jelzik. A nyilak melletti számok az alábbi folyamatokat jelölik: (1) az oszcillátor serkentő hatású alkotóelemeit kódoló génekről átírt mRNS transzportja a durvafelszínű endoplazmás retikulumba. (2) Az mRNS-ről szintetizált fehérjelánc kijut a citoplazmába. (3) A pozitív reguláló fehérjék poszttranszlációs módosítása, amely elősegíti (4) dimerizációjukat és (5) sejtmagba jutásukat. (6) A gátló alkotóelemek génjeinek átírását szabályozó DNS szekvenciákhoz kötődő pozitív szabályozó fehérjék, serkentik a gátló alkotóelemek és az óra által közvetlenül kontrollált gének (Ókg) mRNS-einek szintézisét. Az oszcillátor gátló komponenseit kódoló génekről átírt mRNS (7) bejut a durvafelszínű endoplazmás retikulumba. Az óra gátló fehérjéi (8) a citoplazmába transzportálódnak és (9) poszttranszlációs módosításon esnek át. Az oszcillátor gátló fehérjéi is (10) heterodiméreket alkotnak, majd a (11) sejtmagba jutnak. (12) A sejtmagban az óra pozitív alkotóelemeivel lépnek interakcióba, ily módon gátolva a saját és az Ókg-ekről történő mRNS szintézist. - 12 -

1. táblázat. A biológiai órák kutatása során leggyakrabban vizsgált organizmusok cirkadián oszcillátorainak központi alkotóelemei (Dunlap, 1999 alapján). Faj

Gén

Szerepe az órában

A gén által kódolt fehérje struktúrája

Synechococcus elongatus

KaiA

pozitív elem

nem ismert struktúrális motívum

KaiB

ismeretlen

nem ismert struktúrális motívum

KaiC

negatív elem

ATP és GTP kötőhelyek

Frq

negatív elem

Wc-1

Per

pozitív elem, szükséges a frq-ről történő transzkripció aktivációjához pozitív elem, szükséges a frq-ről történő transzkripció aktivációjához negatív elem

Tim

negatív elem

Dbt

facilitáló elem

Clk

pozitív elem

Cyc

pozitív elem

Vri

pozitív elem

két fehérje transzlálódik egy ORF-ről; az, hogy melyik az hőmérséklet által szabályozott transzkripciós faktor az alábbi doménekkel: - DNS kötő Zn finger domén, - PAS domén a wc-2-vel történő heterodimerizációhoz - Gln-ban gazdag aktivációs domén transzkripciós faktor az alábbi doménekkel: - DNS kötő Zn finger domén, - PAS domén wc-1-gyel történő proteinprotein interakcióhoz - savas karakterű aktivációs domén PAS domén mediálja a TIM-mel történő interakciót, ritmikusan foszforilált fehérje nincs PAS doménje, de interakcióba lép a PER-rel; foszforilált a kazein kináz 1ε homológja; szükséges a fejlődéshez, a PER akkumulációját szabályozza Transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CYC-kal; - Gln-ban gazdag aktivációs domén. Megfeleltethető az emlős CLOCK-nak Transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CYC-kal; - Gln-ban gazdag aktivációs doménnel. - Megfeleltethető az emlős BMAL1/MOP3nak - bázikus leucin zippzár doménnel

Pdp1ε

pozitív elem

- bázikus leucin zippzár doménnel

Per1

(feltételezett) negatív elem

PAS domént tartalmaz, amely révén más PER proteinekkel lép interakcióba. A TIMmel történő interakciója még nem egyértelmű. A rovarok PER proteinjének analógja

Neurospora crassa

Wc-2

Drosophila melanogaster

Mus musculus

- 13 -

Mus musculus

Gallus domesticus

Per2

(feltételezett) negatív elem

Per3

(feltételezett) negatív elem

Tim Clock

facilitáló (negatív?) elem pozitív elem

Bmal1/Mop3

pozitív elem

Cry1

negatív elem

Cry2

negatív elem

Cry3

negatív elem

Per2

negatív elem

Cry1

negatív elem

Cry2

negatív elem

Cry3

negatív elem

Cry4

negatív elem

Clock

pozitív elem

Bmal1(Mop3)

pozitív elem

Bmal2

pozitív elem

Mop4

pozitív elem

PAS domént tartalmaz, amely révén más PER proteinekkel lép interakcióba. A TIMmel történő interakciója még nem egyértelmű. A rovarok PER proteinjének analógja PAS domént tartalmaz, amely révén más PER proteinekkel lép interakcióba. A TIMmel történő interakciója még nem egyértelmű. A rovarok PER proteinjének analógja, szekvenciája homológ a rovar TIM-mel. szekvenciája nagyfokban homológ a rovar TIM-mel. transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a BMAL1/MOP3-mal; - Gln-ban gazdag aktivációs doménnal. - Megfeleltethető a Drosophila CLK-nak - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CLOCK-kal; - Gln-ban gazdag aktivációs doménnal. - Megfeleltethető a rovarok CYC-jának. - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - PAS domént tartalmaz - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; - FAD kötő domén; - DNS fotoliáz domén; transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a BMAL1/MOP3-mal; - Gln-ban gazdag aktivációs doménnal. transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CLOCK-kal; transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CLOCK-kal; transzkripciós faktor: - bHLH DNS kötő doménnel; - PAS domén mediálja az interakciót a CLOCK-kal

- 14 -

angol vagy latin nevének első betűje. Például a cBmal1 és cBMAL1 a csirke bmal1 gént vagy mRNS-t, illetve BMAL1 fehérjét jelölik. Az Eubacteriumokban már jelen van egy transzkripciós-transzlációs visszacsatolási kör, ám az eukariótákkal szemben a napi ritmus kialakulásában a transzkripció szabályozásánál hangsúlyosabb szerepet kap az óra magját alkotó fehérjék ritmikus poszttranszlációs módosítása (Ishiura és mtsai, 1998; Miyosh és mtsai, 2007; Nakajima és mtsai, 2005; Tomita és mtsai, 2005). A gombák közül a Neurospora crassa biólógiai órájának negatív alkotóeleme egyetlen gén-mRNS-fehérje láncolatból álló visszacsatolási hurok, a pozítív alkotóeleme PAS doméneket tartalmazó fehérjékből álló heterodimér komplex (1. táblázat). Mivel a pozitív elemek nem mutatnak kifejezett napszaki ingadozást, ezért szerepük a magasabbrendű élőlényekben megtalálható összetettebb biológiai órák pozitív elemeinél passzívabbnak tekinthető (Vitalini és mtsai, 2006). A legfejlettebb gerincesek, mint az emlősök és a madarak biológiai órájának egyszerűbb formája már megtalálható rovarokban is, ezért a továbbiakat először a Drosophila melanogaster biológiai órájának leírásával folytatom. 1.3.1. Az ecetmuslica szervezetében a biológiai óra magját két pozitív és két negatív elem alkotja A szövetszintű organizációval rendelkező élőlények közül az ecetmuslica (Drosphila melanogaster) órájának szerveződéséről rendelkezünk a legbővebb információkkal (Dunlap, 1999; Hardin, 2005; 3. ábra). Az óragének kifejeződésének helyét kutató vizsgálatok a muslica napszaki ritmussal ismétlődő viselkedési mintázatainak hátterében az agy lateralis neuronjainak két csoportját írták le. További kutatási eredmények azonban az agyban felfedezetthez hasonló biokémiai alapon nyugvó óramechanizmust írtak le az egyes szervek sejteinek szintjén az ecetmuslica majd minden testrészében. Drosophila sejtjeiben az óra központjában a dPeriod(dPer), dTimless(dTim), dCycle(dCyc) és dClock(dClk) óragének által kódolt alkotóelemek állnak (Helfrich-Fröster, 2005). Hasonlóan a Neurospora nWC-1 és nWC-2 fehérjékhez az ecetmuslica óragénjei is

- 15 -

tartalmaznak PAS doméneket. Az nWC fehérjékkel ellentétben azonban a dCYC és dCLK fehérjék DNS-kötő doménje már nem „cink-ujj” fehérje, hanem bázikus hélix-hurok-hélix (bHLH) domén (Helfrich-Fröster, 2005; 1. táblázat). A dPer és dTim mRNS-ek szintézise indul meg a legelőször a szubjektív világos periódus végén a dCYC és dCLK fehérjék által alkotott heterodimér indukáló hatására. A többi napi ritmust mutató óragén termékek csúcsai pedig, legyen szó akár mRNS-ről, akár fehérjéről, jellemzően a sötét fázisban jelentkeznek. Az óra fő gátló hatású komponenseként működő dPER-hez a citoplazmában kötődik a dTIM fehérje és a dDBT kináz (Double time). A dDBT a dPER-hez történő kötés után rögtön foszforilálja a dPER molekulát. A foszforiláció azon dPER molekulák lebomlásához vezet, amelyeknek a dPER/dTIM/dDBT komplex képzéséhez

nem

jutott

partnerként

dTIM.

A

következő

lépésben

a

dPER/dTIM/dDBT komplexből a dTIM-et foszforilálja a dSgg gén által kódolt fehérje. A foszforilált dPER/dTIM/dDBT visszajutva a sejtmagba gátolja a dCLK/CYC heterodimér interakcióját a dPer és dTIM gének E-boxaival. A dDBT ekkor a dCLK és a dPER további foszorlilálásával a komplex szétesését és az egyes fehérjék lebontását indukálja. Az elmondottak alapján, a dPER és dTIM fehérjék egy negatív visszacsatolással a saját génjeikről történő expressziót gátolják. Az ecetmuslica órájának központi, génátírást serkentő komponensei közül csak a dClk mRNS és dCLK fehérje szintek mutatnak ritmikus napi változást. Az dClk és dCLK kettős csúccsal jelentkeznek a szubjektív sötét fázis végén és a szubjektív világos fázis elején. A dCyc esetében nem sikerült napszaki ritmust kimutatni. A dCLK/dCYC heterodimér, a dPer és a dTim mRNS-ek mellett, a dPdp1ε és dVri mRNS-ek szintézisét is serkenti. Ezen mRNS-ekről szintetizált fehérjék egymással ellentétes hatásúak: míg dPDP1ε serkenti addig a dVRI gátolja a dClk génről történő átírást. Az ecetmuslica óra génexpressziót indukáló alkotóelemeinek esetében tehát két visszacsatolási kör jön létre: az egyik serkenti, a másik gátolja az dClk mRNS szintézisét (Hardin, 2005; 3. ábra). Az időtartam ami ahhoz szükséges, hogy a dPER citoplazmatikus koncentrációjának csúcsát elérje, döntő jelentőségű az óra adott periódusának hossza szempontjából. A heterodimerizáció másik fontos aspektusa, hogy a - 16 -

dTIM/dPER dimér képes lesz belépni a sejtmagba. Az óra negatív alkotóelemét jelentő dPER és dTIM fehérjék szintéziséhez képest 4-6 órás késéssel éri el csúcsát a dClk mRNS és a dCLK fehérje mennyisége. A dCLK heterodimér párja a dCYC azonban nem mutat napi ingadozást, sem mRNS sem fehérje szinjén vizsgálva. A dCLK és dCYC heterodimerizációja PAS doménjeik kötődése révén valósul meg. A dCLK/dCYC dimér a sejtmagba jut, ahol bHLH doménjeikkel pedig a dPer és dTim gének promoteréhez kötve, az óra gátló komponenseinek átírását serkentik. Feltehetőleg a magba bejutó dPER/dTIM a dCLK/dCYC heterodimérrel kölcsönhatásba lépve gátolja a saját génjeiről történő átírást. Érdekes megfigyelés hogy a magban, az általában gátló hatású dPER/dTIM serkenti a dClk történő expressziót (Dunlap, 1999). Rövid fényimpulzusok a fényérzékeny dCRY fehérjék által, feltehetőleg a dCRY-nak a dTIM/dPER heterodimérrel történő interakciója révén befolyásolják az óra működését (Hardin, 2005). Ez lehetőséget ad arra, hogy a megvilágítással történő szinkronizáció a Drosophila egyes sejtjeinek szintjén történjék meg. A Drosophila órájának magját két negatív és két pozitív komponens alkotja, az utóbbiak immár bHLH DNS-kötő doméneket tartalmaznak.

- 17 -

3. ábra. Az ecetmuslica cirkadián oszcillátorának középpontjában két pozitív és két negatív alkotóelemből áll. A dCyc és dClk (Cyc és Clk) óragének által kódolt fehérjék (kék CYC és kék CLK) E-box elemekhez kötődve serkentik a dPer és dTim génekről (Per és Tim) történő átírást. A dPER és a dTIM fehérjék (piros PER és TIM) komplexet képezve bejutnak a sejtmagba és gátolják a dCLK és a dCYC transzkripciót serkentő hatását. A dPER-dTIM komplex sejtmagba jutását a dDBT és dSGG kinázok szabályozzák (zölddel jelölt DBT illetőleg SGG). A dDBT a dPER-dTIM-hez kötődve foszforilálja a komplexet és azokkal együtt jut be a sejtmagba. A dClk gén működését gátolja a dVRI (lila VRI) és serkenti a dPDP1ε. A dVri-ről (Vri) és a dPDP1ε-ról (PDP1ε) történő transzkripciót a dCLK-dCYC serkenti. A dCLK-dCYC komplex felelős továbbá az óra által közvetlenül kontrollált gének (Ókg) aktivációjáért is. A maghártyát sötétszürke keret, a magplazmát a világosszürke háttér jelöli (Hardin, 2005 alapján).

- 18 -

1.3.2. Az emlősök órája két, egymásba fonódó visszacsatolási körből áll A madarak és az emlősök belső óráját (4. ábra A. és B.) felépítő molekulák és szabályozó mechanizmusok megértésének alapját az egyszerűbb élőlényeken - mint a Drosophilan – elvégzett vizsgálatok teremtették meg. Az emlős óráról szerzett ismereteink elsősorban egereken (Mus musculus) és patkányokon (Rattus norvegicus) végzett tanulmányokból származnak. Az utóbbi három évtized molekuláris genetikai vizsgálatai mutattak rá arra, hogy a biológiai órát alkotó és szabályozó molekuláris elemek kivételesen konzerváltak maradtak az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) és a legfejlettebb gerincesek megjelenése közötti 500 millió éves evolúciós időtartam alatt (Loudon és mtsai, 2000). A 4. ábrán bemutatott modellek elsősorban a tobozmirigyet kutató vizsgálatok eredményein alapulnak. Egerekben a biológiai óra pozitív elemei az mBMAL1 és az mCLOCK proteinek, amelyek a bHLH-PAS doméneket tartalmazó fehérjék családjába tartoznak. Patkányok esetében heterodimér párból az rBMAL1 és az azt kódoló mRNS mutat jelentős napszaki ingadozást. Az rCLOCK esetében nem sikerült jelentős napszaki ingadozás kimutatni, a fehérje C-termiális régiója azon glutaminban gazdag doménnel rendelkezik, amely lehetővé teszi, hogy a mCLOCK a transzkripciós iniciációs komplexet aktiválja (King és Takahashi, 2000; Larkin és mtsai, 1999). Az mCLOCK/mBMAL1 heterodimér egyrészt serkenti a mREV-ERBα fehérjék szintézisét, másrészt az óra negatív komponenseinek génjeiről és az óra által szabályozott génekről történő génátírást serkenti. A mREV-ERBα pozitív visszacsatolással serkenti a mBmal1 génről történő mBMAL1 szintézist és az E4Bp4 génről történő átírást. Emlősökben a cirkadián oszcillátor gátló komponensei a Per, Cry és Tim gének. Az mPER és mCRY fehérjéknek több izoformája is ismert (1. táblázat). Az mTIM – ellentétben a dTIM-mel - nem mutat kifejezett napi ritmicitást, szerepe valószínűleg a foszforilált mPER stabilizálása. Az alacsonyabb rendűekben fotoszenzitív, mCry gének által kódolt kriptokróm fehérjék az mPER fehérjékkel komplexet képezve képesek a cBMAL1/CLOCK fehérjék transzkripciót aktiváló

- 19 -

4. ábra. Az emlős (A) és a madár (B) cirkadián oszcillátora. Az emlősök órájában két transzkripciós-transzlációs feed-back hat egymásra. Az mBMAL1 (BMAL1, kékkel jelölve) és mCLOCK (CLOCK, kékkel jelölve) fehérjék E-box elemekhez kötődve serkentik az óra negatív komponenseinek szintézisét, továbbá a mRev-erbα (Rev-erbα) génekről történő mREV-ERBα (REV-ERBα, lila) fehérje szintézisét. A mREV-ERBα pozitív visszacsatolással serkenti a mBmal1 (Bmal1) génről történő átírást. A REV-ERBα serkenti az mE4Bp4 (E4Bp4, lila) szintézisét. A mE4Bp4 a mDBP transzkripciós faktort (DBP, piros) kötő DNS elemhez (DBP-kh) kapcsolódva gátolja az óra fő negatív komponensének számító mPer (Per) génről az átírást. A mE4Bp4 kompetícióban van az mDBPvel a DBP-kötőhelyért. A mDBP a BMAL1-CLOCK heterodimér szabályozása alatt áll. Az óra negatív visszacsatolási körében a mPER (piros), mCRY (piros) fehérjék a mTIM fehérjével (piros) komplexet alkotva gátolják a mBMAL1-mCLOCK serkentő hatását. Az óragének fehérjéinek stabilitását kinázok (zöld) szabályozzák. MAPK: emlős mitogén-aktivált protein kináz; CK1ε: emlős kazein kináz 1 ε. Az óra által kontrollált génekről (Ókg) történő expressziót, mint például az Aa-nat gén expresszióját, a mBMAL1-mCLOCK heterodimér szabályozza. A madarak órájának magját az emlősökéhez hasonló elemek alkotják, de az emlősöknél leírt kapcsolatok közül némelyik még nem igazolt madarak esetében. Nem ismert a mTIM madár ortológja sem. Az ábra B részében bemutatott madár nukleinsavak és fehérjék jelölése megfelelel az ábra A részében ismertetett emlős ortológok jelölésének. A maghártyát sötétszürke keret, a magplazmát a világosszürke háttér jelöli. Az ábra egyszerűsítése végett az mClock és cClock expresszióját nem tüntettem fel (Hirota és Fukada, 2004 alapján). - 20 -

hatását gátolni. A biológiai óra magját a cBmal1 és a cClock és az ezekről szintetizált proteinek képezik, ismertek azonban még egyéb transzkripciós faktorok is, mint a egér D-site binding protein (mDBP) az mE4BP4, amelyek az mPer gén aktivátorai illetve represszorai lehetnek (Hirota és Fukada, 2004). Az emlősök biológiai órája tehát egy pozitív: BMAL1/CLOCK/REVERBα és egy negatív PER/CRY/TIM visszacsatolási körből áll, melyek között a kapocs a BMAL1 protein. 1.3.3. A madarak órája hasonló az emlős órához, de részleteiben kevésbé feltárt Az madarak órája (4. ábra B) felépítését tekintve nagyon hasonlít az emlősöknél leírt rendszerre, azonban van néhány részlet ami különböző.

A

biológiai óra pozitív elemei a csirkében is a cBMAL1 és a cCLOCK proteinek, melyek felépítésüket és szerepüket tekintve megfelelnek az emlős ortológjaiknak. A cCLOCK számára alternatív heterodimerizációs partner a cBMAL2, de érdekesképp a cBMAL2 nagyobb koncentrációi már gátolják a cCLOCK transzkripciót serkentő hatását, ha egyidejűleg a cBMAL1 is jelen van (Okano és mtsai, 2001). Bár madarakban is ismert a Rev-erbα mRNS expressziója, a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok alapján, még nem történt arra irányuló kísérlet, amely során bárki is összefüggést keressen a cBmal1 génexpresszió és a Rev-erbα között. Szemben emlősökkel, a madarak biológiai órájának nem része a Tim és ezideig csak a Per2 madár ortológját sikerült azonosítani. Madarakban a cBMAL1/cCLOCK mellett a cMOP4/cBMAL1 heterodimer is serkenti, míg az E4BP4 homodimerje gátolja a cPer2 expresszióját (Chong és mtsai 2000, Doi és mtsai, 2001). A CRY-ok közül ismert mind a három izoforma, sőt az egyik legfrissebben felfedezett madár óragén a cCry4, de ennek pontos szerpét további vizsgálatoknak kell majd tisztázni (Yamamoto és mtsai, 2001; Kubo és mtsai, 2006). Mind emlősök, mind madarak esetében várat magára annak vizsgálata, hogy a PER és CRY proteinek fiziológiás körülmények között képesek-e egymással diméreket képezni. Amennyiben igen, akkor ezen kapcsolat még

- 21 -

magyarázatra szorul, mert a partnerek közül csak a PER rendelkezik a kötődéshez szükséges PAS doménnel. A biológiai óráról elmondottakat figyelembe véve megállapíthatjuk, hogy a madarak biológiai órája jó modellje lehet a gerincesek cirkadián oszcillátorainak. Madarakban tobozmirigy és a retina sejtjei elsődleges cirkadián oszcillátorként működnek, ezért választottuk ezen szerveket modellként a biológiai órát vizsgáló kísérleteinkhez. A madarakon kapott eredmények értékelésekor azonban figyelembe kell venni azt a tényt, hogy a melatonin szintézis szabályozása bizonyos eltéréseket mutat madarak és emlősök között.

1.4. A melatonin anyagcseréje és kapcsolata az endogén oszcillátorral A melatonin egy indolamin hormon, melynek szintézisét a belső, cirkadián óra irányítja, úgy, hogy a sötét fázisban magas, míg a világos fázisban alacsony melatonin szintek detektálhatóak. Csirkében a melatonin szintéziséért a tobozmirigy pinealocitái felelősek, bár egyes madárfajok esetében a szem is jelentős mértékben hozzájárulhat a vér melatonin tartalmához. (ld.: A madarak cirkadián rendszere fejezetet) 1.4.1. A melatonin anyagcseréje madarakban Az indolaminok metabolizmusa (Klein, 1981; 5. ábra) alapvetően két nagyobb területre osztható. Az első a szerotonin szintézise triptofánból, a második a szerotonin átalakítása melatoninná és deaminált termékekké. A szerotonin szintézise során a triptofán-hidroxiláz (TPOH) a triptofánt 5hidroxi-triptofánná alakítja, melyből az aromás-L-aminosav dekarboxiláz (AAAD) segítségével szerotonin képződik. A TPOH és az AAAD sokféle szövetben előfordul, de a TPOH-nak, amely a szerotonin szintézis sebességmeghatározó enzime, kimondottan magas aktivitása mérhető a tobozmirigyben és a raphe magvakban (Lovenberg és mtsai, 1967). Az enzimek intracelluláris

- 22 -

5. ábra. Az indol anyagcsere vázlatos bemutatása madár pinealocitában. A melatonin szintéziséhez vezető reakciólépéseket folyamatos nyilak jelölik. A szerotoninból képződő egyéb indolszármazékok szintézisét szaggatott nyilak mutatják. Az egyes reakciólépésekhez szükséges kofaktorokat dőlt szürke betűk jelölik. A mitokondrium szürke, a kinocílium maradványa zöld színű. Az enzimek és kofaktorok rövidítései: TPOH: triptofán-hidroxiláz; BH4: tetrahidrobiopterin; BH2: dihidrobiopterin; AAAD: aromás aminosav dekarboxiláz; AA-NAT: arilaminacetiltranszferáz; AcCoA: acetil-koenzim A; CoA: koenzim A; HIOMT: hidroxiindolO-metiltranszferáz; SAdM: S-adenozil-metionin; SAdH: S-adenozil-homocisztein; MAO: monoamin-oxidáz; AldDH: aldehid dehidrogenáz; NAD: nikotinsavamid-adenindinukleotid; NADP: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát (Falcon, 1999 alapján).

- 23 -

lokalizációját illetőleg a TPOH a mitokondriumban, míg az AAAD a citoszólban található meg. A szerotonin metabolizmusának két további útvonala lehetséges. Az egyik lehetőség az, hogy a monoamin-oxidáz (MAO) a szerotoninról egy amino csoportot eltávolít és a szerotonint hidroxiindolacetaldehiddé alakítja. Pinealocitákban megtalálható mind a MAO A, mind a MAO B izoforma, míg a tobozmirigyben végződő idegrostokban csak a MAO A enzim található meg. A MAO elsősorban a mitokondriumokban van jelen. A hidroxiindolacetaldehidből az alkohol dehidrogenáz és aldehid dehidrogenáz enzimek redukált illetőleg oxidált termékeket hoznak létre. A hidroxiindolacetaldehidből keletkező termékek O-metilációjával 5-metoxitriptofol és 5-metoxiindolecetsav képződik. Az O-metilációért felelős hidroxiindol-O-metiltranszferáz (HIOMT) egyben a melatonin szintézis folyamatának utolsó enzime. A szerotoninból kiinduló második lehetséges reakciósorozat végterméke a melatonin. A szerotonint először az arilalkilamin N-acetiltranszferáz (AA-NAT) alakítja N-acetilszerotoninná majd az N-acetilszerotonint a HIOMT alakítja melatoninná. Mindkét reakció a citoplazmában zajlik le. Számos szövetben kimutatott az aminok N-acetilációja, de a HIOMT csak a tobozmirigyben, a retinában és a belekben fordul elő, így a melatonin szintézise jelen ismereteink alapján ezekre a szervekre korlátozódik. (ld.: A madarak cirkadián rendszere fejezetet). A vérplazmába szekretált melatonin jelentős részét a máj katabolizálja. A májban képződő 6-hidroximelatonin szulfatált és glukuronidált termékekké alakul. A melatonin lebontására az agyban is sor kerülhet. A melatonin a központi

idegrendszerben

több

reakciólépésen

keresztül

N-acetil-

metoxikinurenaminná konvertálódik. A melatonint termelő szervekben és a vérplazmában a melatonin koncentrációja napszaki ritmussal változik (Rekasi és mtsai, 1991; Zawilska és mtsai, 2006), ezért a ritmus kialakulásának okait kutatva logikus volt megvizsgálni azt, hogy a szintézisben részt vevő enzimek között van-e olyan, amelynek koncentrációja vagy aktivitása napszaki változást mutat. Csirke retinában és tobozmirigyben kimutatott, hogy a melatonin bioszintézis enzimei közül a cTPOH-t és a cAA-NAT-t kódoló mRNS szintek - 24 -

napszaki ritmussal változnak a sötét fázisban jelentkező csúccsal. A cHiomt mRNS szintén mutat cirkadián ritmust, de az korántsem olyan kifejezett, mint a cAa-nat esetében. A cHiomt mRNS szintek csúcsa a retinában éjjel, a tobozmirigyben pedig nappal van, továbbá a cHiomt mRNA nem mutat ritmikus változást folyamatos sötétben (Bernard és mtsai, 1999). Az AA-NAT és a TPOH esetében az enzimaktivitás változásai jól követik az mRNS szintek változásait természetes megvilágítási viszonyoknak megfelelő környezetben, vagy ha a környezet fényviszonyai tartósan megváltoznak. Az elmúlt évtizedek során a kutatók figyelme az AA-NAT-ra fókuszált, mivel a napszaktól függő aktivitásváltozást

mutató

AA-NAT

bizonyult

a

melatonin

szintézis

kulcsenzimének emlősökben (Coon és mtsai, 1995; Rekasi és Czömpöly, 2002). A melatonin szinteket a többi melatonin szintézisében részt vevő enzim is befolyásolhatja. A világos fázisban, amikor az AA-NAT enzim aktivitása alacsony, ekkor a melatonin szintézis sebesség-meghatározó enzime az AANAT. Ezzel szemben a sötét fázisban a magas aktivitású AA-NAT nem szab gátat a melatonin termelésének, ekkor a termelt melatonin mennyisége a rendelkezésre álló HIOMT függvénye (Klein, 1981). A melatonin szintek AA-NAT szintektől való függése felveti annak a lehetőségét, hogy a biológiai óra a cirkadián rendszer kimenetét jelentő melatonin termelését az AA-NAT enzimen keresztül befolyásolja. Az elsődleges cirkadián oszcillátor emlősök esetében az SCN-ban helyezkedik el és csak közvetve, a tobozmirigyet beidegző noradrenerg rostok révén befolyásolja az AA-NAT aktivitását (Moore, 1996). Madarak tobozmirigy sejtjei azonban rendelkeznek elsődleges cirkadián oszcillátorral, amely madarak esetében így közvetlenül befolyásolhatja az AA-NAT fehérje aktivitását. Mivel a cirkadián oszcillátor alkotóelemei transzkripciós faktorok, ezért lehetőség lenne arra is, hogy az Aa-nat génről történő átírást az óra közvetlenül szabályozza. Ez egyben azt is jelentené, hogy az Aa-nat gén, egy az óra által közvetlenül kontrollált gén (Ókg).

- 25 -

1.4.2. A melatonin szintézis kapcsolata az endogén oszcillátorral A fentiek szerint a fény a retinából kiinduló idegpályák által befolyásolja a tobozmirigy melatonin termelését. Madarak esetében lehetséges, hogy a fény esetleg közvetlenül is hatással lehet a koponya alatt elhelyezkedő tobozmirigyre (6. ábra). Az AA-NAT aktivitása és a melatonin termelése gátolható a sötét fázisban adott rövid fényimpulzusokkal (Bernard és mtsai, 1997a). Kimutatott, hogy a tobozmirigyet beidegző rostokban megtalálható noradrenalin madár pinealocitákban a cAMP szintek csökkentése révén gátolja a melatonin szintézist a világos fázisban (Bernard és mtsai, 1997b; Cassone és Menaker, 1983). A cAMP szintekkel csak a cAA-NAT enzimaktivitása változik párhuzamosan a cAa-nat mRNS szintek változása nélkül, ugyanis kimutatott, hogy pinealocita kultúrák cAMP-vel történő inkubálása csak a cAA-NAT enzimaktivitás fokozódásával jár, de a cAa-nat mRNS szinteket nem befolyásolja (Bernard és mtsai, 1997a). Ez arra enged következtetni, hogy a környezet fényviszonyainak, átmeneti, akut változása, a cAA-NAT fehérje poszttranszlációs módosításán, feltehetőleg a fehérje foszforilációjának változásán keresztül vezet a melatonin szintek eséséhez. A foszforilált AA-NAT enzimaktivitásának szabályozásában újabban az AA-NAT 14-3-3 chaperon fehérjékkel való interakciója is lehetséges tényezőként merült fel (Ganguly és mtsai, 2005). Az elmúlt évek kutatásai mutattak rá arra, hogy az emlős Aa-nat gén promoter régiója, E-box elemek mellett egy CRE-hez hasonló szekvenciát is tartalmaz. A cAMP a protein kináz A-CREB jelátviteli úton keresztül a fényviszonyok akut változásainak mediátora, a cAMP így befolyásolhatja egyrészt a fehérjék szintjén az AA-NAT foszforilációját, másrészt a nukleinsavak szintjén az Aa-nat génről történő mRNS szintézist. A csirke cAa-nat promoterében azonban CRE-re emlékeztető szekvenciákat eddig még nem írtak le (Foulkes és mtsai, 1997; Chong és mtsai, 2000; 7. ábra). A fényviszonyok akut megváltozásához képest más a helyzet, ha a kísérleti állatokat vagy tobozmirigy sejteket folyamatos sötétben vagy állandó megvilágítás alatt tartjuk. Az AA-NAT napi ritmusa ugyanis tartós sötétben vagy

- 26 -

6. ábra. A ritmikus melatonin szintézist befolyásoló tényezők csirkében. A melatonin ritmikus szintéziséért a cAA-NAT enzim aktivitásának robosztus cirkadián változása felelős. A cAA-NAT enzimaktivitás napi változása mögött az endogén óra befolyása alatt álló cAa-nat génről történő ritmikus mRNS szintézis áll. Ha az endogén óra által diktált szubjektív sötét-világos fázisok nincsenek szinkronban a külső környezet sötétvilágos fázisaival, akkor a fényt érzékelő fotoreceptorok egy cAMP-mediálta mechanizmussal, feltehetőleg fehérjefoszforiláció révén befolyásolják a cAA-NAT enzim aktivitását.

- 27 -

7. ábra A cAa-nat gén promoter régiója. A cAa-nat gén 5’ régiójának részleges restrikciós térképén a restrikciós enzimek hasítási helyeit vonalak jelzik. A kockák a -1633 és -1 pozíciók közötti szabályozó elemeket ábrázolják. A szabályozó elemekhez feltételezetten kötődő transzkripciós faktorokat a kockákra mutató nyilak felett jelöltük TSP: transzkripció start pont (Chong és mtsai, 2000).

folyamatos megvilágításban is megmarad (Deguchi, 1979), utalva arra, hogy az AA-NAT fehérje ritmikus aktivitásáért és az Aa-nat mRNS szintek ritmikus változásáért egy endogén mechanizmus felelős. Ha a sötét-világos fázisokat mesterséges körülmények között felcseréljük, akkor a tobozmirigy melatonin szekréció csúcsa idővel követi az eltolódott sötét periódust. Ezen megfigyelések hívták fel a figyelmet az endogén oszcillátor és az AA-NAT közötti kapcsolatra. A transzkripciót gátló aktinomycin D effektíven gátolja a cAa-nat mRNS szintek éjjeli emelkedését madár pinealocita sejtkultúrában, így a cAa-nat mRNS szintek szabályozásában a génátírás szabályozása tűnik a döntő mechanizmusnak (Bernard és mtsai, 1997a). A cAa-nat gén promoter régiójában a génátírás szabályozásáért

felelős

szekvenciák

között

E-box

elemeket

tartalmazó

szekvenciákat is azonosítottak, amelyekről ismert, hogy képesek megkötni az bHLH doméneket tartalmazó fehérjéket (Chong és mtsai, 2000; 7. ábra). A bHLH doméneket tartalmazó óragének és az E-box között fennálló funkcionális kapcsolatot kettős hibrid rendszeren végzett vizsgálatokkal igazolták. Ezen kísérletek

során

COS-7

sejteket

ko-transzfektáltak

egyrészről

olyan

plazmidokkal, amelyekről csirke cBMAL1-et, cCLOCK vagy MOP4 fehérjék

- 28 -

expresszálódtak, másrészről E-box-ot tartalmazó luciferáz reporter plazmiddal. Az eredmények igazolták, hogy a biológiai óra közzéppontjában álló cBMAL1 és a cCLOCK által alkotott heterodimérek képesek E-box révén a génexpresszió serkentésére (Chong és mtsai, 2000). Mivel a cBMAL1 és cCLOCK fehérjék a bHLH-PAS proteinek családjába tartoznak, ezért feltételezhető, hogy a cAa-nat mRNS szintjeinek szabályozásában a cAa-nat gén promoter régiójában található E-box elemekkel való interakció révén vesznek részt. Az eddig elmondottakat összegezve tehát a ritmikus melatonin szekréció kettős szabályozás alatt áll: egyrészt a megvilágítás akut változása a cAMP által mediált jelátviteli úton befolyásolja az AA-NAT enzimaktivitását, másrészt környezet fényviszonyaiban bekövetkező hosszú távú változásokhoz először az endogén oszcillátor alkalmazkodik, és csak ezt követi az óragének által kontrollált változás cAa-nat mRNS expresszió szintjeiben (6. ábra). Az a megfigyelés, hogy a biológiai óra változásait követik a cAa-nat mRNS szintek változásai megerősíti azt a feltevést, hogy a cAa-nat gén egy Ókg. Ami a madarak órájának komponenseit illeti számos kettős hibrid rendszeren végzett kísérlet igazolja, hogy a transzkripciós faktorként működő óragének hogyan befolyásolhatják egy adott gén kifejeződését. Kevés adat van azonban madarak esetében arról, hogy mi történik akkor, ha egyes óragének működése vagy fehérje termékeik szintézise gátolt. A transzkripció vagy a transzláció blokkolására kíváló megoldás az antiszensz oligonukleotid technika. Mivel az alább bemutatásra kerülő munkánk lényegi részét képezi az antiszensz technika,

ezért

célszerű

áttekintetni

az

antiszensz

oligonukleotidokkal

kapcsolatos alapvető ismereteket.

- 29 -

1.5. Antiszensz oligonukleotidok Az antiszensz oligonukleotidok felhasználásának első gondolata terápiás potenciáljuk kapcsán vetődött fel majd harminc évvel ezelőtt (Stephenson és Zamecnik, 1978). Az antiszensz oligonukleotidok (AON-ok), olyan rövid, 15-25 bázispár (bp) hosszúságú szintetikus nukleinsavak, amelyek a Watson-Crick bázispárok képzése révén specifikusan kötődnek komplementer nukleinsavakhoz. Gátló hatásukat akár a transzkripció, akár a transzláció szintjén kifejthetik (Dias és Stein, 2002). Az AON-ok első támadási pontja a transzkripció gátlása lehet, ami legalább háromféle módon valósulhat meg: kötődhetnek az AON-ok a DNS kis hasadékához, alkothatnak triplexet a DNS nagy hasadékába illeszkedve, továbbá a DNS egyik szálához kötődve, bizonyos szakaszon kiszoríthatják a komplementer szálat (Dagle és Weeks, 2001; 8. ábra B). A második lehetőség szerint az AON a pre-mRNS érését hivatott megakadályozni az intron excízió gátlásával (8. ábra C). Az mRNS-ről történő fehérje transzláció is lehet az AON-ok támadáspontja. Ez történhet úgy, hogy az AON-dal a gátolni kívánt RNS-nek olyan szakaszát célozzuk meg, amely a riboszóma alegységek mRNS-hez történő kötődését térben gátolja (8. ábra D). Ilyen régió az mRNS „cap” régiója. Tervezhetjük az AON-kat úgy is, hogy a transzláció továbbhaladását gátolják, ilyenkor legcélszerűbb az AON-t az AUG iniciációs kodon közelébe tervezni (8. ábra E). A gátolni kívánt fehérje szintézisének közel száz százalékos, irreverzibilis gálásához vezet, ha az AON-okat úgy tervezzük meg, hogy a kialakult AONRNS komplex az RNáz H enzim szubsztrátja legyen (Walder és Walder, 1998). Az RNáz H a DNS replikáció során az Okazaki fragmentumok lebontásában játszik szerepet, általánosabb funkciója a DNS-hez vagy nukleinsav analógokhoz kötött RNS láncok hasítása. Szemben a transzláció gátlását okozó AON-okkal, az RNáz H dependens AON-okat az RNS bármely szakaszára tervezve hatékony gátlás jön létre (8. ábra F).

- 30 -

8. ábra. Az antiszensz oligonukleotidok (piros vonalak) lehetséges támadáspontjai. (A) A genetika centrális dogmájának vázlatos ábrázolása. A fekete vonalak a nukleinsavakat, a piros körök a riboszómát, a lila vonal egy fehérjét szimbolizálnak. (B) A kettősláncú DNS molekulához kötődő AON-ok vagy a DNS-sel triplexet alkotva, vagy DNS kis hasadékába illeszkedve, vagy a kettős DNS lánc kialakulásának akadályozásával gátolhatják az egy adott génről történő mRNS szintézist. (C) Megfelelően tervezett AON-ok a még éretlen mRNS-hez kötődve tudják az mRNS érését gátolni. Az AON-ok az érett mRNS-hez kötődve (D) egyrészt az mRNS- riboszóma komplex kialakulását tudják gátolni, (E) másrészt az mRNS-hez kötődött riboszóma továbbhaladását gátolhatják. (F) Az mRNSAON kopmlex szubsztrátja lehet az RNáz H enzimnek (sárga kör), amely a komplex mRNS komponensét hasítja. - 31 -

Az, hogy az AON-k milyen úton fejtik ki gátló hatásukat, nemcsak a megcélzott szekvencia, hanem az alkalmazott kémiai módosítások függvénye is. A kémiai módosítás történhet mesterséges bázisok vagy módosított poliszaharid származékok beépítésével a nukleotidokba. A nukleinsavak kémiai szerkezetének megváltoztatása lehetséges a molekula cukor-foszfát gerincének módosításával is (Kurreck, 2003). Az első generációs AON-k olyan módosított nukleinsav származékok melyek esetében a foszfátcsoport egy olyan „szabad” oxigén atomját cserélik le, amelyik nem kötődik a molekula cukor komponenséhez (Kurreck, 2003; 9. ábra A). Az oxigén szubsztitúciójára legalkalmasabbnak a kén bizonyult, és azóta a foszforotioát-oligodezoxinukleotidok már a klinikai felhasználás területére is betörtek. Ezen vegyületek előnye a hosszú féléletidő a szérumban, jó oldhatóságuk, nukleázok elleni stabilitásuk, egyszerű szintézisük, és a tény, hogy alkalmazhatóak RNáz H aktivációjára. Hátrányuk, hogy nem specifikusan kötődnek fehérjékhez, gátolják a véralvadási kaszkádot, aktiválják a komplement rendszert és súlyos hipotenziót okozhatnak. Az első generációs AON-ok további hátránya a később kifejlesztett AON-okkal szemben a még viszonylag alacsonyabb affinitásuk az RNS molekulához. A ribóz 2’-hidroxi csoportjának hidrogén atomját alkil csoportra cserélve, olyan második generációs AON-okat lehetett szintetizálni (Kurreck, 2003; 9. ábra

B),

melyeknek

esetében

alacsony

toxikus

mellékhatás

mellett

megnövekedett az AON-RNS komplex stabilitása. Hátrányuk azonban, hogy nem alkalmazhatóak RNáz H aktivációján alapuló antiszensz technikákban. A második generációs AON-ok előnyös tulajdonságait és az RNáz H aktivációján alapuló technika hatékony gátlását ötvözik az olyan kiméra oligonukleotidok, melyek szekvenciájában keverve fordulnak elő természetes és mesterséges nukleotidok. A gapmer oligonukleotidok 5’ és 3’ végeiken a nukleázok elleni védelemhez elegendő számú módosított nukleotidot tartalmaznak. A gapmer oligonukleotid közepén dezoxiribonukleotidok találhatóak, amelyek RNS-hez kötődve az RNáz H szubsztrátjai lehetnek. A tisztán módosított nukleinsavakból álló oligonukleotidokénál kedvezőbb antiszensz aktivitású, farmakokinetikájú és

- 32 -

9. ábra. Az antiszensz oligonukleotidok szintéziséhez felhasznált módosított nukleotidok néhány a gyakorlatban is eredményesen használt képviselője. A nukleotidok szerkezeti képletében a B a szerves bázist jelöli. (A) Az első generációs oligonukleotidokat alkotó nukleotid analógokat a cukorkomponenshez kötődő foszfát csoport módosításával állították elő. (B) A második generációs AON-ok olyan nukleotidokat tartalmaznak, amelyekben kémiai módosítás a cukorkomponens 2’ oxigénjét érinti. (C) A harmadik generációs AON-okban a mesterséges nukleotidok ribózgyűrűjének a megváltoztatása felelős a molekula antiszensz hatásáért (Kurreck, 2003 alapján). - 33 -

stabilabb oligonukleotidok állíthatóak elő úgy is, hogy mixmer (Jepsen és mtsai, 2004) oligonukleotidokat hozunk létre, azaz, minden kémialag módosított nukleotidot egy természetes nukleotid követ. Kiméra AON-ok előállításhoz napjainkban a második és harmadik generációs AON-okat használják. A nukleotidok furanózgyűrűjének módosításával vagy teljes átalakításával a harmadik generációs AON-ok állíthatóak elő (Kurreck, 2003). A 9. ábra C részében bemutatott vegyületek közül a peptid nukleinsavakat (PNS-kat), a locked

nukleinsavakat

(LNS-kat)

és

a

foszforoamidát

morfolino

oligonukleotidokat (FMO) terjedtek el leginkább AON technikával foglalkozó laboratóriumokban. Az FMO-k szerkezetének érdekessége, hogy a ribózt hatszénatomos morfolin gyűrű helyettesíti, a másik jellegzetes tulajdonsága pedig az, hogy a negatív töltésű foszfodiészter híd helyett egy semleges foszforodiamidát híd köti össze a nukleotidokat (Summerton és Weller, 1997). Az FMO-ok szerkezetének gyakorlati előnye az, hogy a molekula semleges gerince miatt nukleinsav kötő fehérjéknek nem szubsztrátjai az FMO-ok, így a nemkívánt vagy nem várt mellékhatások valószínűsége jelentősen csökken. Az FMO-ok felhasználását egyben korlátozza is ez a tény, hiszen a leghatásosabb antiszensz gátlásért felelős RNáz H is egy nukleinsav kötő fehérje (Hudziak és mtsai, 2000). A PNS foszfodiészter-cukor gerincét N-(2’-aminoetil) glicinből álló ismétlődő egységek helyettesítik, amelyekhez metil-karbonil csoport révén kötődik a szerves bázis (Nielsen és mtsai, 1991). A PNS gerincében az egyes módosított nukleotidokat peptid kötések kapcsolják egymáshoz. A peptid kötés révén a PNS-t nemcsak más PNS molekulákhoz, de fehérjékhez is könnyen hozzá lehet kötni. A PNS-ból álló AON-ok stabil duplexet és triplexet képeznek, nukleinsavakkal, de a tisztán PNS-ból álló AON nem szubsztrátja az RNáz Hnak. Az LNS ribózgyűrűjének 2’ oxigénjét egy metilhíd köti össze az 5’ szénatommal (Petersen és mtsai, 2002). Az LNS tartalmú AON-ok kiemelkednek a többi AON közül, mivel igen nagy affinitással kötődnek a komplementer szekvenciákhoz, jól ellenállnak RNázoknak, és nincs akut toxikus mellékhatásuk (Braasch és mtsai, 2002). Transzfekciós kísérleteinkhez LNS tartalmú AON-okat - 34 -

használtunk, mivel hatékonyságuknál fogva felveszik a versenyt az RNS interferencián alapuló technikákkal (Jepsen és Wengel, 2004). Az AON-ok nukleinsav szekvenciájuk és az alkalmazott kémiai módosítások függvényében képesek a centrális dogma majd minden pontján kifejteni hatásukat. Az AON-k jövőbeli klinikai felhasználása, vírusfertőzések és tumorok kezelése során, bíztató perspektíva a módszer specificitása és a súlyos mellékhatások alacsony valószínűsége miatt.

- 35 -

2. Célkitűzések: 1. Korábbi, emlősökön elvégzett kísérletek már igazolták, hogy a Bmal1 és Clock gének fontos szerepet játszanak az AA-NAT aktivitás éjszakai növekedésében,

de

kevés

adat

áll

rendelkezésre

ezen

gének

expressziójának mintázatáról normál külső megvilágítási viszonyok között madarakban. Ezért jelen munkánkban először ezen gének ciklikus cirkadián aktivitását vizsgáltuk az eddig leírtaknál precízebb, két óránkénti felbontásban. 2. Kísérleteink tisztázni kívánták továbbá, hogy van-e különbség a cBmal1, cClock és cAa-nat gének expressziójának napszaki változásában ugyanazon állat tobozmirigyében és retinájában a környezetével megegyező megvilágítási viszonyok között. 3. Az in vivo vizsgálatok eredményétől függően in vitro rendszerben szerettük volna bizonyítani a cirkadián expressziót mutató gének szerepét a melatonin szintézisében. Ehhez először egy szuperfúziós rendszert fejlesztettünk ki, amelyben az óragének kiiktatásával a cAa-nat génnek mint a melatonin szintézis kulcsenzimének és egyben feltételezett Ókgnek az expressziójában és a következményes melatonin szekrécióban bekövetkezett változásokat vizsgáltuk. Az óragének szerepének kiiktatását LNS tartalmú AON-okkal kívántuk elérni.

- 36 -

3. Módszertan 3.1. Vegyszerek A kísérleteinkhez szükséges vegyszereket, hacsak azt másképp nem jelöltük, a Sigma-Aldrich Kft.-től szereztük be. 3.2. LNS tartalmú AON-ok Kétfajta, a cBmal1 transzlációs start kodonját is magába foglaló, a cBmal1 mRNS 5’-végéhez közeli fragmentumával komplementer LNS tartalmú AON-ot terveztünk, majd szintetizáltattunk a Proligoval (Boulder, CO), amelyek egyike RNáz H-t indukáló hatású (LNS/DNS/LNS gapmer), míg a másik a transzlációs komplex kialakulását blokkolja (LNS/DNS mixmer). Kontrollként inverz LNS tartalmú AON-okat használtunk. A kísérletek során felhasznált AON-k szekvenciáit az 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat. A kísérletek során felhasznált LNS tartalmú AON-ok szekvenciái. Megcélzott mRNS szekvencia cBmal1

mRNS szint gátlásának mechanizmusa

Szekvencia 5’→3’

RNázH-indukció

+T+G+T +CCA TCC TTT GGT CTG +C+C+A +T

cBmal1

Transzlációs mechanizmus blokkolása

C+AT +CC+T T+TG +GT+C T+GC +CA+T

Kontroll

RNázH-indukció

+T+A+C+CGT CTG GTT TCC TAC+C+T+G+T

Kontroll

Transzlációs mechanizmus blokkolása

+TA+CC+GT+CT+GG+TT+TC+C T+AC

A cBmal1 mRNS-ről történő fehérjeszintézis gátlásához RNáz H-t indukáló gapmer és a transzláció térbeli gátlásáért felelős mixmer LNS tartalmú AON-okat terveztünk. A szekvenciák 5’→3’ irányban vannak megadva. A nukleotidok rövidítése: A: adenin, C: citozin, G: guanin, T: timin. A nukleotid rövidítése előtti „+” jel az LNS-vá módosított dezoxiribonukleotidot jelöli.

- 37 -

3.3. Kísérleti állatok Három hetes csirkéket (Gallus domesticus) egy helyi csirkefarmról (Reménypuszta) szereztük be, amelyeket aztán legalább két hétig, az évszaknak megfelelő napi 14 órán át világosban és 10 órán át sötétben tartottuk (LD 14/10, ahol a világos periódus ZT 0-tól ZT 14-ig tartott). In vivo kísérleteink során a második hét utáni első napon két óránkét 3-3 csirkéből kivettük a retinát és a tobozmirigyet, amelyeket rögtön homogenizáltuk jégen tárolt Tri Reagent-ben. A mintákat ezt követően -70 °C-on tároltuk további feldolgozásukig. Az in vitro szuperfúziós kísérletekhez négy állatból eltávolított ideghártyákat vagy tobozmirigyeket használtunk. Állatkísérleteinket a megfelelő nemzetközi irányelvek figyelembe vételével végeztük. (European Communities Council Directive of 24 november 1986 (86/609/EEC)). 3.4. Dinamikus tobozmirigy szövetkultúra Disszociált tobozmirigy sejtek szuperfúziójához egy korábban már részletesen leírt szuperfúziós rendszert használtunk néhány módosítással (Rekasi és mtsai, 1991). Röviden: szuperfúziós oszloponként két tobozmirigyet emésztettünk 0,75%-os IV-es típusú kollagenázzal 20 percig. Az inkubációs idő lejárta után az emésztett tobozmirigy szövetet mechanikus diszperzióval körülbelül 5-40 sejtből álló fragmensekre bontottuk, majd a szuperfúziós oszlopba töltöttük, ahol az 0,8 ml Sephadex-G-vel egyidejűleg szedimentálódott. Szövettenyésztő médiumként 95% levegő és 5% CO2 elegyéből álló gázkeverékkel ekvilibrált és CaCl2-dal (100 mg/L), penicillin G-vel (50mg/L), gentamicin szulfáttal (85mg/L, Sigma), marha szérum albuminnal (0,1 g/L) kiegészített OPTI-MEM I „Reduced Serum Mediumot” használtunk. ZT 6-kor kezdtük el 60 perces frakciók gyűjtését. A médiumot 0,1 mL/min átfolyási sebességgel pumpáltuk és a gyűjtött frakciókat -20 °C-on tároltuk melatonin radioimmunesszé (RIA) elvégzéséig.

- 38 -

3.5. Transzfekció szuperfúziós rendszerben Huszonnégy órás nyugalmi periódust követően ZT 6-kor 60 percre a tenyésztő médiumot marha szérum albumint és antibiotikumokat nem tartalmazó OPTI-MEM I-re cseréltük, majd a tobozmirigy sejteket négy órán át ZT 7 és ZT 10 között a gyártó utasításainak megfelelően Oligofectamine-nal (Invitrogen) transzfektáltuk. Minden egyes reakció 25 mL teljes térfogata 200 nM LNS-t tartalmazó AON-ból, és 75 µL antibiotikumot és marha szérumot nem tartalmazó OPTI-MEM I-gyel kiegészített Oligofectamine-ból állt. Kontrollként a cBmal1gyel nem komplementer, inverz LNS-t is tartalmazó AON-ok keverékét és MQ vizet használtunk. Az oligonukleotidokat és a transzfekciós reagenseket különkülön hígítottuk egyenlő térfogatra OPTI-MEM mediummal, 1-1 mL-re mindegyiket. A négy órás transzfekciót követően, az antibiotikumokat és marha szérumot nem tartalmazó OPTI-MEM I médiumot további egy óráig áramoltattuk a rendszeren át, mielőtt az oszlopokat ismét az antibiotikumokkal és marha

szérummal

kiegészített

médiummal

perfundáltuk.

A

dinamikus

sejtkultúrákat napi LD 14/10 megvilágításban tartottuk, amikor is a megvilágítás kezdete ZT 0-ra esett, és ezen fényviszonyokat a transzfekciós kísérletek végéig nem változtattuk meg. Az irradiáció az oszlopok szintjében 20-40 µW/cm2 tartományban volt. Az oszlopban található sejteket 1 mL TRI Reagent infúziójával lizáltuk a korábban már kidolgozott módszer szerint (Rekasi és Czompoly, 2002) a második LD ciklus minden 4. órájában vagy a transzfekciós kísérlet végén, azaz a negyedik LD ciklus ZT 17. órájában. A lizált sejteket steril Eppendorf csövekbe gyűjtöttük és -70 °C-on tároltuk teljes RNS tartalmuk későbbi extrakciójáig. Minden egyes kísérleti protokollt három szuperfúziós kísérletben ismételtünk meg. A transzfekciós reagensek lehetséges nemspecifikus citotoxikus hatását a sérült sejtek citoszóljából felszabaduló laktátdehidrogenáz enzim aktivitásának mérésével végeztük az e célra kifejlesztett „Cytotoxicity Detection Kit” (Roche, Mannheim, Németország) segítségével a gyártó utasításai szerint.

- 39 -

3.6. mRNS szintek mennyiségi vizsgálata Diszpergált pinealociták és az in vivo kísérletekből származó szövetek teljes RNS tartalmát TRI Reagent-tel extraháltuk, majd azt a „GeneAmp RNA Core Kittel” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) cDNS-sé írtuk át és amplifikáltuk polimeráz láncreakcióval (PCR). A reverz transzkripciós reakció termékének egy ötödét használtuk minden egyes multiplex PCR-on alapuló analízisben. Először meghatároztuk azt az optimális PCR ciklus számot minden primer pár esetében, amelynél saját kísérleti körülményeink között lineáris összefüggést kapunk az eredeti cDNS mennyisége és az amplifikált PCR termék mennyisége közt. A β-aktin cDNS-re specifikus primereinkkel 557 bázispár hosszú termékeket amplifikáltunk, amellyel azonos reakcióban a cBmal1-re, a cClockra vagy a cAa-natra specifikus primerekkel 452, 454 illetőleg 455 bázispár hosszú PCR termékeket szintetizáltunk. A primerek szekvenciáját és a multiplex PCR-ok során használt optimális ciklusszámokat a 3. táblázat mutatja be. A transzfekció hatékonyságának ellenőrzésére egy másik cBmal1-re specifikus primer párt is használtunk, amely úgy volt megtervezve, hogy magába foglalja az LNS/DNS/LNS gapmer által aktivált RNáz H feltételezett hasítási helyét is (2. táblázat). Ezzel a cBmal1 specifikus primerpárral 457 bázispár hosszúságú PCR terméket amplifikáltunk. A multiplex PCR-okat egy „GeneAmp PCR System 2400” (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) készülékkel végeztük el, cDNS, 1x PCR master mix és a 150 nM gén specifikus primer felhasználásával reakciónként 25 µl teljes térfogatban. A PCR elegyeket 105 másodpercig 95 °Con inkubáltuk, amit változó számú (3. táblázat) 15 másodperces 95 °C-os denaturációs és 30 másodperces 60 °C-os „annealing/extension” lépések követtek. A „final extension” lépés 7 percig tartott 72 °C-on. A PCR termékeket 1,5%-os agaróz gélelektroforézissel választottuk el egymástól, majd ethidium bromiddal

megfestettük,

és

ultraviola

fényel

végzett

megvilágításban

dokumentáltuk. A dokumentálást és az intenzitásmérést a „Kodak Digital Science Electrophoresis Documentation and Analysis System 120” szoftverrel (Eastmann Kodak, Rochester, NY, USA) végeztük. Az mRNS szintek változásának analizálásához az intenzitásmérést követően ugyanazon multiplex PCR-ban - 40 -

képződött cBmal1, cClock vagy cAa-nat PCR termékek „Net Intensity” értékeinek a ß-aktin PCR temékek „Net Intensity” értékeire vonatkoztatott hányadosát határoztuk meg. 3. táblázat. A reverz transzkripciós PCR-ok során felhasznált primerek szekvenciája. mRNS

forward primer 5’→3’

reverse primer 5’→3’

PCR termék hossza (bp)

cBmal1 CTATGTTCTGGAGCA AGGCG

TGACATTCTGCAAGG TGTCC

452

cBmal1 ATGGCAGACCAAAG GATGG

CGTCATCTGACAGA AAAGC

457

TTGATACCAGCCCCA CTGAAGTTTAGTCCA CAC GAAGTTGA

454

cAanat

GAGGGAAGCCTTCA TCTCCG

TCCTGCGCATGAAG GCATGG

455

ß-aktin

GAAGTACCCCATTG AACACG

CATTGCCAATGGTGA TGACC

557

cClock

Ciklus szám: in vivo in vitro 30 35 35 30 35 25 30 24 28

A PCR termékek hossza bázispárban (bp) megadva, és az az optimális ciklus szám, amelynél a templát cDNS mennyisége és PCR termék mennyisége között még lineáris összefüggés áll fenn. A ciklusszámok közül az adott sorban felül az in vivo kísérletekből nyert minták RNS szintjeinek meghatározásához használt PCR-ok ciklusszámait, alul az in vitro kísérletek mintáiból történő RNS szint meghatározásához használt PCR-ok ciklusszámait tüntettük fel. A cBmal1 cDNS-ről a 452 bázispár hosszúságú terméket adó primerek az RNáz H feltételezett hasítási helyét nem foglalják magukba, a 457 bázispár hosszúságú terméket adó primerek közül azonban a forward primer átéri a start kodont és az RNáz H feltételezett hasítási helyét. A szekvenciák 5’→3’ irányban vannak megadva. A nukleotidok rövidítése: A: adenin, C: citozin, G: guanin, T: timin.

- 41 -

3.7. Melatonin RIA A szuperfúzió során gyűjtött minták melatonin tartalmát az intézetünkben korábban kifejlesztett melatonin RIA-vel mértük (minta méret: 200µL) (Rekasi és mtsai, 1991). Röviden, minden esszécsőbe (duplikátumban végeztük) 20µL mintát, az intézetünkben korábban kifejlesztett ellenanyagot (melatonin-3/6, 7nL/cső, 1/100000 végső higításnál) és 10000 cpm (125 fmol) tracert ([O-metil3

H]melatonin, Amersham, TRK 298, specifikus aktivitása: 70-85 Ci/mmol)

tettünk, melyhez a teljes térfogatot 700 µL-re kiegészítve esszé puffert (1g/L nátrium-azid és 1g/L zselatin 0.5 M PBS-ben) adtunk. A standard görbe meghatározásához (15 fmol – 4pmol/cső) a jelöletlen melatonin kilenc lépésben történő 1:2 higítását végeztük el három párhuzamos sorozatban, mely során a csövekhez a mintának megfelelően 100 µL médiumot adtunk. Az éjszakai 4 °Con történő inkubációt követően, a csövekhez dextránnal bevont szenet adtunk (0.625 mg/mL dextrán és 6.25 mg/mL szén esszé pufferben). Alapos összerázás után húsz perccel a csöveket 20 percen át 3000 x g-vel 4 °C-on centrifugáltuk, és a felülúszót áttöltöttük szcintillációs üvegbe, melyhez 2 mL dioxánt, valamint 8 mL szcintillációs koktélt (4.2 g PPO és 42 mg POPOP 1 L toluolban) öntöttünk, majd a rádioaktivitást egy béta sugárzást mérő számlálóval (Beckmann, LS100C) 10 percig mértük. A számításokat a standard görbe logit-log transzformációjával nyertük. Az esszé szenzitivitása 80 pmol/L volt, az intra és interesszé koefficiensek 5-6% illetőleg 7-8% között voltak.

- 42 -

4. Eredmények 4.1. A cBmal1, cClock és a cAa-nat gének expressziójának időbeli változása csirke ideghártyában és tobozmirigyben in vivo Csirke ideghártya és tobozmirigy cBmal1, cClock és a cAa-nat mRNS-ek szintjét RT-PCR analízissel vizsgáltuk a kísérleti állatok két hétig történő, külső megvilágítási viszonyoknak (LD14/10) megfelelő tartása után. A vizsgált ideghártyákat és a tobozmirigyeket ugyanazon állatokból nyertük (10. ábra). Mindkét szövetben, mindhárom géntermék mutatott többé-kevésbé detektálható napi fluktuációt. cBmal1 mRNS csúcsértékei ZT 8 és ZT 10 között voltak a tobozmirigyben (10. ábra, C és D) illetve az ideghártyában (10. ábra, A és B) megelőzve ezzel a cAa-nat, mindkét szövetben ZT 16-kor jelentkező csúcsát. A tobozmirigy cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek körülbelül 11-szer illetve 19-szer nagyobb amplitúdóval ciklizáltak, mint ugyanabban az állatban a retinális megfelelőjük. A cBmal1 mRNS-ének cirkadián ritmicitása a retinában a tobozmirigyétől némileg eltérő időbeni profillal jelentkezett, ugyanis a retinális cBmal1 csúcsértékei gyorsabban lecsengtek. A fentiekkel szemben az ideghártya (10. ábra, A és B) és a tobozmirigy (10. ábra, C és D) cClock expressziók nem mutattak kifejezett ciklusos változást. Mindössze egy alacsony napi ingadozás volt észlelhető ZT 8 és ZT 10 között, továbbá ZT 16 és 18 között jelentkező csúcsokkal, amely csúcsok egybe estek a cBmal1 illetőleg a cAa-nat csúcsával mind a tobozmirigyben, mind az ideghártyában (Toller és mtsai, 2006).

- 43 -

10. ábra. Csirke ideghártya és tobozmirigy cAa-nat, cBmal1 és cClock mRNS-ek expressziójának időbeli változása in vivo LD 14/10 megvilágítás mellett. Az állatokat a kísérlet előtt két hétig LD 14/10 fényviszonyok között tartottuk. A világos periódus kezdete Zeitgeber idő (Zeitgber time, ZT) 0, ettől kezdve két óránként történt 3-3 állatból a mintavétel. Csirke (A) ideghártyából és (C) tobozmirigyből nyert multiplex RT-PCR termékek szeparációja agaróz gél elektroforézissel. L: 100-bp létra. Csirke (B) retinából és (D) tobozmirigyből származó cAa-nat, cBmal1 és cClock transzkriptumok relatív kvantitatív analízise. A vizsgált mRNS-ek szintjét az adott minta β-aktin mRNS szintjéhez normalizáltuk minden mintában. Az adott időpontokhoz tartozó relatív mRNS szintek átlagait ± SEM három kísérleti állatból határoztuk meg, három egymástól független esszében. A ZT 24-hez tartozó érték a ZT 0-hoz tartozó eredmény ismételt bemutatása. A fekete és fehér csíkok a görbék alatt a sötét illetve a világos fázisokat szimbolizálják.

- 44 -

4.2. Csirke ideghártya és tobozmirigy melatonin szekréciójának, valamint a cBmal1, cClock és cAa-nat gének expressziójának időbeli változása in vitro Csirke tobozmirigy vagy ideghártya szövetet 4 napig LD 14/10 megvilágítási viszonyok között tartottunk fenn szuperfúziós rendszerben. A gyűjtött médiumból a távozó melatonin koncentrációját RIA-vel mértük. Diszpergált ideghártya sejtek szuperfúzióinak esetében a RIA módszer érzékenysége nem bizonyult megfelelőnek a melatonin koncentráció mérésére. Tobozmirigy sejtek szuperfúziói során a melatonin szint napi fluktuációja érzékelhető volt már az első (LD) ciklus alatt, azonban ennek amplitúdója alacsonyabb volt és fázisa megkésett a későbbi LD ciklusok idején detektált csúcsokhoz képest. A melatonin szekréció csúcsa a negyedik LD ciklus idejére igazodott teljesen a sötét periódushoz. Hogy eredményeink összehasonlíthatóak legyenek az in vivo eredményekkel, mindkét szövetből a harmadik LD ciklus után izoláltunk RNS-t RT-PCR analízisekhez (11. ábra, A). Retinában és tobozmirigyben mind a cBmal1, mind a cAa-nat mRNS szintek kifejeztett diurnális ritmust mutattak (11. ábra, B és C). Mindkét szövetben a cBmal1 szintek csúcsértékei körülbelül ZT 9-re estek, megelőzve a cAa-nat csúcsát ZT 17-kor. A cBmal1 mRNS szintek amplitúdója 1,7 és 3,4-szeres volt az ideghártyában illetve a tobozmirigyben, míg a cAa-nat mRNA ritmus amplitúdója 2,4 és 4,6-szoros volt. Sem a retinában sem a tobozmirigyben nem detektáltuk a cClock mRNS ritmikus változását. Azonban a cClock ciklusos expresszióját nem zárhatjuk ki teljesen, mert egy alacsony amplitudójú mRNS szint változás, körülbelül 35 % és 44% kimutatható volt ZT 9 körüli csúcsértékekkel (Toller és mtsai, 2006).

- 45 -

11. ábra. (A) Disszociált csirke tobozmirigy melatonin szekréciós profilja. A kísérlet folyamán a pinealocitákat négy napig LD 14/10 megvilágításban tartottuk fenn a szuperfúziós rendszerben, ahol Zeitgeber idő (Zeitgeber time, ZT) 0 a világos fázis kezdetének felel meg. A sötét oszlopok a sötét fázist jelölik. Disszociált ideghártyából hasonló kísérletek folyamán nem sikerült detektálható mennyiségű melatonint nyerni. Disszociált csirke (B) ideghártya sejtek és (C) tobozmirigy sejtek cAa-nat, cBmal1 és cClock mRNS expressziójának időbeli változása in vitro. Az ideghártya és a tobozmirigy sejtek teljes RNS tartalmának extrakciójára a negyedik LD ciklusban négy óránként került sor az ábra A részében bemutatotthoz hasonló kísérletek során. A cAanat, cBmal1 és cClock mRNS szinteket a β-aktin mRNS szintekhez normalizáltuk. A sötét és világos fázisokat a görbék alatti sötét és világos csíkok jelölik. Hasonló eredményeket kaptunk két további kísérlet során.

- 46 -

4.3. Csirke tobozmirigy diurnális cBmal1, cAa-nat expressziójának és melatonin ritmusának meghatározása transzfekciós kísérletekhez Ezen kísérletek során a csirke tobozmirigy szuperfúziója hasonlóképpen zajlott, mint az in vitro cBmal1, cAa-nat, cClock génexpressziók és melatonin szekréciót vizsgáló kísérletek során (ld. fent). A melatonin szekréció megegyezően a korábbi kísérletekkel alacsonyabb amplitúdóval és fázis késéssel jelentkezett az első LD ciklusban. Az LNS tartalmú AON-ok optimális beadási idejének meghatározásához a cBmal1 és cAa-nat génexpressziókat a második LD ciklusban ZT 2 és 22 között négy óránként határoztuk meg (12. ábra, A). A cBmal1 és a cAa-nat mRNS szintek - ZT 14-nél és ZT 18-nál jelentkező csúcsértékekkel - kifejezett ritmicitást mutattak a második LD ciklus alatt is. A ritmusok amplitúdója 14,6-szoros volt a cBmal1 és 2,9-szeres a cAa-nat esetében (12. ábra, B és C). Ezért a transzfekciós kísérletek során a cBmal1 mRNS szintek csúcsértékei előtt, ZT 7 és ZT 10 között transzfektáltuk a pinealocitákat LNS tartalmú AON-kal. A sejteket végezetül „Tri Reagent”-tel lízáltuk, 55 órával a kísérlet megkezdése után a negyedik LD ciklusban ZT 17-kor, amikor is a megelőző kísérletekben (ld. fent) mindkét vizsgált mRNS szintje elég magas volt (Rekasi és mtsai, 2006).

- 47 -

12. ábra. cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek expressziójának meghatározása a szuperfúziós rendszerben a második LD ciklus alatt. (A) Disszociált csirke tobozmirigy sejtek jellemző melatonin szekréciós mintázata a szuperfúziós rendszerben. A kísérlet folyamán a pinealocitákat négy napig LD 14/10 megvilágításban tartottuk fenn a szuperfúziós rendszerben, ahol Zeitgeber idő (Zeitgber time, ZT) 0 a világos fázis kezdetének felel meg. A sötét oszlopok a sötét fázist jelölik. A nyilak a sejtek „TRI Reagent”-tel történő lízisét jelölik különböző kísérletekben. (B) cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek reprezentatív RT-PCR analízise a szuperfúziós kísérlet második LD ciklusa alatt ZT2 és ZT22 nyert mintákból. L: 100-bp létra. (C) cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek βaktinhoz normalizált szintje a szuperfúziós kísérlet második LD ciklusában. A harmadik LD ciklus ZT2-höz tartozó értéke a második LD ciklus ZT2 értékének ismételt ábrázolása. Hasonló eredményeket kaptunk két további kísérletben. A sötét csík az LD ciklus sötét fázisát jelöli.

- 48 -

4.4. Disszociált csirke tobozmirigy melatonin szekréciója cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-kal történt transzfekció után Csirke pinealocitákat a második LD ciklusban ZT 7 és ZT 10 között transzfektáltuk RNáz H-t aktiváló (LNS/DNS/LNS gapmer) vagy a transzlációs mechanizmust blokkoló (LNS/DNS mixmer) AON-okkal (13. ábra). Az LNS tartalmú AON-ok gátló hatása csak a harmadik LD ciklus sötét fázisában jelentkezett, ekkor mind az LNS/DNS/LNS gapmer, mind az LNS/DNS mixmer majdnem teljesen megszüntette a melatonin szekréciót. Ez a szignifikáns gátló hatás egészen a kísérletek végéig megmaradt, a negyedik LD ciklus ZT 17. órájáig (13. ábra, A és B). Ezzel szemben az LNS kontrolljaként szolgáló, nem kopmlementer szekvenciákat tartalmazó inverz LNS-nek, vagy az oldószerként használt MQ víznek csak elhanyagolható hatása volt (Rekasi és mtsai, 2006; 13. ábra, C és D). A szuperfúziós kísérletek során gyűjtött frakciókból készült laktátdehidrogenáz (LDH) aktivitást mérő tesztek a kísérletek első 20 órája után már nem utaltak jelentős sejtpusztulásra (14. ábra). 4.5. Disszociált csirke tobozmirigy cBmal1 és cAa-nat expressziója cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-kal történt transzfekció után

Mind az LNS/DNS/LNS gapmer, mind az LNS/DNS mixmer jelentősen csökkentette a cAa-nat gén expresszióját 70 % illetve 80 %-kal, míg a kontroll LNS vagy a MQ víz hatástalannak bizonyult (15. ábra). A cBmal1-re tervezett LNS tartalmú AON-ok cBmal1 mRNS szintekre kifejtett hatását olyan RT-PCRral vizsgáltuk, amelyben a forward és a reverse primerek közrelfogták az RNáz H feltételezett hasítási helyét is. A cBmal1 mRNS szintet csak az LNS/DNS/LNS gapmerrel történő transzfekció csökkentette 44%-kal, míg az LNS/DNS mixmernek vagy a kontroll LNS-nek nem volt szignifikáns hatása (Rekasi és mtsai, 2006; 15. ábra).

- 49 -

13. ábra. cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON hatása disszociált csirke tobozmirigy sejteken. A pinealocitákat négy napon át tartottuk fenn a szuperfúziós rendszerben LD 14/10 megvilágításban, ahol Zeitgeber idő (Zeitgeber time, ZT) 0 a világos fázis kezdete. A sötét oszlopok a sötét fázist jelölik. A sejteken átáramló mediumot a második LD ciklusban ZT6 és ZT11 között BSA és antibiotikumok nélküli OPTI-MEM I-re cseréltük (O). A sejteket a második LD ciklusban ZT7 és ZT10 között 200 nM LNS tartalmú AON-kal áramoltattuk át. Az LNS tartalmú AON-ok úgy voltak megtervezve, hogy a (A) transzlációt gátolják (LNS/DNS mixmer), vagy (B) RNáz H-t indukáljanak (LNS/DNS/LNS gapmer). A kontroll kísérletekben vagy (C) cBmal1-gyel nem-komplementer inverz LNS tartalmú AON-t (Kontroll LNS), vagy (D) MQ vizet használtunk. Teljes RNS izolálására a negyedik LD ciklusban a nyillal jelzett időpontban „TRI Reagent” felhasználásával került sor. - 50 -

14. ábra. A szuperfúziós kísérletek során a transzfekciós reagensek lehetséges nemspecifikus citotoxikus hatását a sérült sejtek citoszóljából felszabaduló laktátdehidrogenáz enzim aktivitásának mérésével végeztük. Az ábra két reprezentatív szuperfúziós kísérletet mutat be, melyek során vagy az LNS/DNS mixmerrel (A) vagy az LNS/DNS/LNS gapmerrel (B) inkubáltunk tobozmirigy sejteket. A minták abszorbanciáját 492 nm-en mértük, a referencia hullámhossz 620 nm volt.

- 51 -

15. ábra. A cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-k hatása disszociált csirke tobozmirigy sejtek cAa-nat és cBmal1 mRNS szintjeire. A tobozmirigy sejteket négy napon át tartottuk fenn a szuperfúziós rendszerben LD 14/10 megvilágításban (ahol ZT 0 a világos fázis kezdete). A sejteket a második LD ciklusban ZT7 és ZT10 között 200 nM LNS tartalmú AON-kal inkubáltuk, majd a negyedik LD ciklusban ZT17-kor, 55 órával a transzfekció után a sejteket TRI Reagent-tel lizáltuk. Az LNS tartalmú AON-ok úgy voltak megtervezve, hogy a transzlációt gátolják (LNS/DNS mixmer), vagy RNáz H-t indukáljanak (LNS/DNS/LNS gapmer). A kontroll kísérletekben cBmal1-gyel nemkomplementer inverz LNS tartalmú AON-t vagy MQ vizet használtunk mintabeadáskor. (A és C) cAa-nat és cBmal1 mRNS-ek reprezentatív RT-PCR analízise. L: 100-bp létra. (B és D) Csirke tobozmirigy sejtek cAa-nat és cBmal1 β-aktinhoz normalizált mRNS szintjei. Hasonló eredményeket kaptunk két további kísérletben.

- 52 -

5. Az eredmények megvitatása 5.1. Csirke tobozmirigy és ideghártya cBmal1, cClock és cAa-nat mRNS expressziója in vivo A

cirkadián

ritmussal

ismétlődő

életjelenségeket

szabályozó

mechanizmusok biológiai hátterét vizsgálva a kutatóknak azt a kérdést kellett először tisztázni, hogy azon anyagok közül, amelyek intracelluláris szintje napszaki változásokat mutat, melyek azok, amelyek valóban egy belső óra részei, és melyek azok a jelátviteli molekulák, amelyek szintje csak azért mutat napszaki ingadozást, mert közvetve, vagy közvetlen az óra szabályozása alatt állnak. Az első lehetséges jelöltek között olyan általános jelátviteli anyagok szerepe merült fel, mint a cAMP, a cGMP, vagy a kálcium, a jelenleg elfogadott modell szerint egy transzkripciós-transzlációs visszacsatolási kör képezi a biológiai óra alapját. A legegyszerűbb modellek szerint egy vagy két transzkripciós faktorként működő fehérje serkenti további egy vagy két transzkripciós faktor szintezisét, amelyek viszont a pozitív szabályózó faktorokat gátolják. Ez az elv általánosnak látszik az élővilágban. Jelen munkánk során a madarak biológiai órájának magját alkotó mechanizmusra fókuszáltunk. A madarak retinája és a tobozmirigye cirkadián rendszerként működik nemcsak in vivo, de in vitro is, így kíváló kísérleti modellek a cirkadián oszcillátor tanulmányozásához. A madarak cirkadián oszcillátora nagyon hasonló az emlős óra mögött álló mechanizmusokhoz, ezért a madár modelleken végzett vizsgálatok információval szolgálhatnak az emlős óráról is. A biológiai órák pozitív szabályozó elemeként működő transzkripciós faktorok közül a cBmal1 és a cClock gének expresszióját vizsgáltuk. Vizsgáltainkat kiterjesztettük továbbá arra is, hogy ezen gének expressziójában beálló változások mennyiben befolyásolják a cAa-nat mRNS szinteket és a cirkadián

rendszer

kimenetének

számító

melatonin

napi

szekrécióját.

Amennyiben az óragének expressziójának változásait követik a cAa-nat mRNS szintekben beálló változások, úgy a cAa-nat egy Ókg lehet és a melatonin

- 53 -

ritmikus napszaki szekréciójának hátterében az óragének ritmikus expressziója áll. Madarak cirkadián rendszerének elsődleges oszcillátorai az ideghártya, az SCN és a tobozmirigy. Technikailag könnyebb elérhetőségük és későbbi in vitro vizsgálatok során történő problémamentes felhasználhatóságuk miatt, a fent leírt vizsgálatok során a retinában és a tobozmirigyben működő oszcillátorokra fókuszáltunk. Eredményeink igazolták, hogy a belső óra pozitív regulátor elemei közül a cBmal1 mRNS szintézise mind a retinában, mind a tobozmirigyben jelentős napi ingadozást mutat (Toller és mtsai, 2006; 13. és 15. ábrák). Saját kutatásainkkal párhuzamosan más kutatók is hasonló eredményekre jutottak, a cBmal1 génexpressziójának változását különböző módszerekkel nyomonkövetve. Az mRNS szintek napszaki különbségének konkrét értékeit figyelembe véve, azonban jelentős eltérés mutatkozik az egyes kutatócsoportok között, ami az ideghártya esetében 2-10x tartományba (Bailey és mtsai, 2004; Chong és mtsai, 2003), a tobozmirigy esetében pedig 2-40x tartományba esik (Bailey és mtsai, 2003; Chong és mtsai, 2003; Yasuo és mtsai, 2003). Ennek magyarázata feltehetőleg az egyes kutatócsoportok által használt eltérő metodikákban rejlik, ami a reverz transzkripciós PCR-t, a Northern-blotot és a microarray technikákat is

felöleli.

Az

egyes

laborok

eredményei

azonban,

beleértve

saját

megfigyeléseinket is (13. és 15. ábrák), megegyeznek abban, hogy a cBmal1 mRNS szintek napi ritmusának amplitúdója lényegesen alacsonyabb az ideghártyában. Nemcsak a ritmus amplitúdója, de a cBmal1 gén kifejeződésének napi mintázata is kissé eltérő volt a tobozmirigyben és az ideghártyában. Az ideghártya cBmal1 expressziójának mértéke ellentétben a tobozmirigyben tapasztalt expressziós mintázattal lassabb emelkedést mutatott a reggeli órákban, amelyet csúcs elérése után egy gyors mRNS szint csökkenés követett (10 .ábra). A cBmal1 gén expressziós mintázatában erre a különbségre, a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok alapján más még nem mutatott rá, talán azért mert két óránkénti felbontásban mások még nem vizsgálták a tobozmirigy és az ideghártya cBmal1 génexpresszióját. Az ideghártya órájának ritmusa ellentétben a központi idegrendszeren kívül elhelyezkedő másodlagos oszcillátorok ritmusával, nem mutat fázis eltolódást a tobozmirigyben található ritmushoz képest (Chong és - 54 -

mtsai, 2003, Toller és mtsai 2006). A tobozmirigy és az ideghártya megközelítőleg cBmal1 expressziójának közös nadírja és zenitje közvetve utal arra, hogy ezek a szervek egy közös cirkadián rendszer részeként vesznek részt a madarak ritmus életjelenségeinek szabályozásában. A

cBmal1

génexpressziójával

ellentétben

cClock

nem

mutatott

szignifikáns napszaki ingadozást. Szintézise ennek ellenére nem volt teljesen egyenletes a nap folyamán: mind a retinában, mind a tobozmirigyben megfigyelhető volt két kisebb csúcs, amelyek a cBmal1 és a cAa-nat expressziók maximumaival estek egybe (Toller és mtsai, 2006). Ezek a csúcsok ugyan nem emelkedtek ki szignifikánsan a többi érték közül, érdemes megemlíteni, hogy más szerzők is prezentálnak hasonló napi ingadozást mutató expressziós mintázatot a cClock mRNS-ének esetében mind az ideghártya (Larkin és mtsai, 1999), mind tobozmirigy sejtekből készült sejtkultúrában (Okano és mtsai, 2001). Azon időpontok, amikor az emelkedettebb cClock mRNS szintek jelentkeznek, megegyeznek a saját vizsgálataink során kapott ZT 8-10 és ZT 16-18 időpontokkal. Hasonló cClock-ra vonatkozó eredményeket kaptak Bailey és mtsai (2004) is az ideghártya esetében, de a tobozmirigyben ZT 14-re eső egyértelmű cClock mRNS csúcsot írtak le (Bailey és mtsai, 2003). Mivel a cCLOCK a cBMAL1-gyel alkot heterodimért és szabályozza az óra negatív elemeit továbbá az Ókg-eket is, ezért nem meglepő, hogy a két gén expressziójának csúcsai egybe esnek. Az, hogy a cAa-nat génről történő expresszió csúcsa egybe esik a cClock második, kisebb csúcsával, felveti annak lehetőségét, hogy a két gén kifejeződését egymással összefüggő - hacsak nem azonos – mechanizmusok szabályozzák, mint például egy közös enhancer elem a gének promoter régióiban, bár ennek bizonyítása további kísérleteket kíván. A cAa-nat gén ritmikus expressziója a a cBmal1-ével összemérhető amplitúdójú cAa-nat mRNS fluktuációt mutatott a tobozmirigyben, míg az ideghártyában a cAa-nat mRNS a cBmal1-hez képest alacsonyabb szinteken maradt (Toller és mtsai, 2006; 13. és 15. ábrák). Az ideghártyában a cAa-nat cBmal1-hez viszonyított kisebb amplitúdójú napszaki változása megfelel az ideghártya, más kutatók által is kimutatott alacsonyabb melatonin tartalmával és a retinális melatonin szintek alacsonyabb amplitúdójú változásával (Zawilska és - 55 -

mtsai, 2006). Sőt, az in vivo vizsgálataink során használthoz nagyon hasonló kísérleti elrendezéssel Zawilska és mtsai (2006) igazolták, hogy az cAA-NAT enzimaktivitása mind az ideghártyában, mind a tobozmirigyben az általunk cAanat mRNS szintekhez hasonló napszaki ingadozást mutat. Ezen megfigyelés igazolni látszik azt a feltételezést, hogy a cAa-nat mRNS szintekben tapasztalt változások együtt járnak a cAA-NAT protein napszaki szintjeinek változásaival, legalábbis a környezetével megegyező megvilágítási viszonyok között. Csirkében a tobozmirigy adja a vér melatonin szintjének jelentős részét (Cogburn és mtsai, 1987), így ez a tény magyarázná a jelentősebb napi ingadozás a tobozmirigyben. Az ideghártyában termelt melatonin szerepe sem elhanyagolható: kimutatott, hogy a retinában parakrin úton számos metabolikus működést befolyásol (Iuvone és mtsai, 2005). A cAa-nat mRNS szintek csúcsát úgy a tobozmirigyben, mint az ideghártyában megelőzte a cBmal1 gén kifejeződésének csúcsa. A hat-nyolc óra időtartam cBmal1 és a cAa-nat csúcsai között elegendő lehet a cBMAL1 fehérje szintézisére, posztranszlációs módosítására és nuklearis transzportjára. A cAa-nat gén promotere tartalmaz olyan E-box elemeket, amelyekhez a bHLH doméneket tartalmazó fehérjék (Chong és mtsai, 2000), mint a cBMAL1 protein, kötődhetnek. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy a cBMAL1 részt vesz a cAa-nat génről történő átírás szabályozásában és ezért végeztük a transzfekciós kísérleteket a cBmal1 mRNS kiiktatására. 5.2. Diszpergált ideghártya és tobozmirigy sejtek ritmikus melatonin termelése és cBmal1, cClock és cAa-nat mRNS szintjeinek napi ritmusa Az már korábban is ismert volt, hogy dinamikus túlélő tenyészetben, azaz szuperfúziós rendszerben fenntartott tobozmirigy melatonin szekrécióját hogyan befolyásolják a környezet fényviszonyai (Csernus és mtsai, 2005; Robertson és Takahashi, 1988a; Robertson és Takahashi, 1988b), és több kutatócsoport vizsgálta már azt is, hogy biológiailag aktív anyagok, hogyan befolyásolják diszpergált tobozmirigy sejtek melatonin elválasztását (Faluhelyi és mtsai, 2006; Puy és mtsai, 1996; Rekasi és mtsai, 1991; Simonneaux és mtsai, 1990). Kevés

- 56 -

szuperfúziós kísérlet irányult közvetlenül azonban az óragének expressziójának vizsgálatára (Rekasi és mtsai, 2006; Toller és mtsai, 2006). In vitro vizsgálataink során először azt határoztuk meg, hogyan változik meg a szuperfúziós rendszerben fenntartott ideghártya és a tobozmirigy metabolizmusa, melatonin szekréciója, vagy a cClock, cBmal1 és cAa-nat gének expressziója. Diszpergált ideghártya és tobozmirigy szöveteket négy LD cikluson át fenntartva, azok LDH szekréciója az első sötét fázis után már nem változott jelentősen, utalva arra, hogy a túlélő sejtek alkalmazkodtak az in vitro körülményekhez és a továbbiakban már stabil anyagcserét tartanak fenn (Rekasi és mtsai, 2006). A sejtek in vitro körülmények között megváltozott metabolizmusának lehet a következménye a ritmikus melatonin szekréció fáziseltolódása is (ld. alább). Mivel a sejtek metabolizmusa csak a második világos fázistól normalizálódott, ezért az RT-PCR analízisek számára, csak második LD ciklus kezdete után gyűjtöttünk mintákat. A melatonin szekréció változásait csak a tobozmirigyben tudtuk követni, az ideghártya által a szuperfúziós rendszerben termelt melatonin mennyiségének detektálásához az általunk használt RIA valószínűleg nem volt elég érzékeny. Steele és munkatársainak (2006) legfrissebb eredményei mutattak rá arra, hogy az általunk használt szuperfúziós rendszerhez hasonló flow-through rendszerben fenntartott

madár

ideghártya

szövet

robosztus

és

ritmikus

melatonin

szekréciójának biztosításához a szövetkultúrás médiumot szerotoninnal kell kiegészíteni. Sajnos ez az információ kísérleteink elvégzése idején még nem állt rendelkezésünkre, de remélhetőleg a jövőben a szövetkultúrás médium szerotoninnal történő kiegészítése olyan mértékben fokozza majd az ideghártya szövet melatonin szekrécióját, hogy azt RIA-vel detektálni tudjuk. A diszpergált tobozmirigy melatonin szekréciója csak mérsékelt emelkedést mutatott az első LD ciklus végén jelentős fázis eltolódással a következő világos fázis irányába. Az innervációjától megfosztott csirke tobozmirigy sejtek ritmikus in vitro melatonin szintézise arra utal, hogy a madár pinealocitákban működik egy belső óra. A következő LD ciklusban mind a melatonin szekréció mértéke, mind a fázisa rendeződött, ami időben egyezik az LDH szekréciós értékek normalizálódásával - 57 -

(Rekasi és mtsai, 2006). A tobozmirigy melatonin szekréciójának a külső környezet LD ciklusaival történő szinkronizációja utal arra, hogy a madarak tobozmirigye fényérzékeny receptorokat is tartalmaz a belső óra mellett. Az első, túlélő, egész tobozmirigyeket vizsgáló kísérletek is rámutattak már arra, hogy a diszpergált szövetdarabkákat használó szervkultúrák melatonin szekréciós mintázata különbözik a túlélő tobozmirigy által mutatott melatonin szekréciótól (Deguchi,1979). Figyelembe véve azonban, hogy a kísérleteink során később használt transzfekció sikeresebb lehet, ha szövetdarabkák vagy egész szervek helyett sejteket transzfektálunk, mindenképpen célszerűnek látszott diszpergált sejteket használni. Azon publikációk (Mess és mtsai, 1996; Robertson és Takahashi, 1988a; Robertson és Takahashi, 1988b), amelyek szintén dinamikus csirke tobozmirigy szövetkultúra melatonin szekrécióját vizsgálják, nem említenek hasonló jelenséget, igaz ezen vizsgálatok során a kutatók, az eltávolított tobozmirigyből előbb primér szövetkultúrát nyertek és csak pár nap tenyésztés után helyezték át a tobozmirigy sejteket egy dinamikus, flow-through rendszerbe. Ezen adatok alapján feltételezhetjük, hogy az első LD ciklusban megfigyelt az in vivo és a további LD ciklusok in vitro adatoktól eltérő melatonin szekréció, azon, valószínű mechanikai trauma eredménye, amelyet a szervek in vitro körümények közé helyezése okozott, és amit a sejtekből felszabaduló nagyobb mennyiségű LDH is indikált (ld. fentebb). Mivel arra vonatkozólag, hogy madár tobozmirigyben vagy ideghártyában az óragének és az Aa-nat mRNS szintjei hogyan változnak egy in vitro rendszerben, legyen az akár statikus, akár dinamikus, kevés irodalmi adat áll rendelkezésre (Bernard és mtsai, 1997a; Okano és mtsai, 2001), ezért ezen gének expressziós mintázatát is megvizsgáltuk a szuperfúziós kísérletek végén a negyedik LD ciklusban négy óránkénti felbontásban. A tobozmirigyben kapott eredményeink jó átfedést mutattak az in vivo kísérletek során mért adatokkal. A retinában azonban az in vivo kísérletektől eltérően, a cAa-nat mRNS szintek változásának amplitúdója meghaladta a cBmal1-ét (Toller és mtsai, 2006). Figyelemre méltó, hogy retinából az in vitro kísérletek folyamán nem történt mérhető melatonin elválasztás, de ugyanakkor a melatonin szintézisért felelős

- 58 -

enzim mRNS-ének ritmusa nagyobb amplitúdóval jelentkezett in vitro mint in vivo. 5.3. A cBmal1 mRNS-ről történő transzláció gátlásának hatása csirke tobozmirigy melatonin szekréciójára és cAa-nat mRNS szintjeire Mind az in vivo és az in vitro kísérleteink eredménye arra utal, hogy a cBmal1 mRNS szintek napszaki ritmusa szerepet játszhat a cAa-nat gén expressziójának változásában, mivel kifejezett cirkadián ritmicitást csak a cBmal1 mRNS esetében figyeltünk meg (Toller és mtsai, 2006). Amennyiben a cBmal1 mRNS szintek napi ritmusát követik a cBMAL1 fehérje szintjei, úgy a cBmal1 mRNS-ről történő transzláció gátlása, a cBMAL1 által regulált folyamatokat is érinteni fogja. További kísérleteinkben így azt vizsgáltuk, hogy milyen hatással van a tobozmirigy cAa-nat gén expressziójára és a melatonin szekréciójára, ha LNS tartalmú AON-okkal célzottan gátoljuk a cBMAL1 fehérje szintézisét a transzláció szintjén. A cBMAL1 fehérjét specifikusan felismerő antitest nem áll rendelkezésre, ezért a cBmal1 mRNS kiiktatását RT-PCR-ral ellenőriztük. Egy adott, vizsgálni kívánt mRNS-ről történő fehérje szintézisének gátlására, specifikus és olcsó módszer az AON-ok használatán alapuló technika. Az AON-oknak széles repertoárja áll a kutatók rendelkezésére. A LNS-t tartalmazó AON-ok jellemzője, hogy a többi harmadik generációs AON-hoz képest igen nagy affinitással kötődnek a komplementer szekvenciákhoz, jól ellenállnak RNázoknak, és nincs toxikus mellékhatásuk. Továbbá az LNS tartalmú AON-okkal végzett antiszensz technika hatékonyságban felveszi a versenyt az RNS interferenciával (Jepsen és Wengel, 2004). Az LNS-t természetes nukleotidokkal kombinálva gapmer (LNS/DNS/LNS) és mixmer (LNS/DNS) LNS tartalmú AON-ok állíthatóak elő (Braasch és mtsai, 2001). Az AON-ok gátló hatásának mértéke a megcélzott nukleinsav szekvencia függvénye is. Amennyiben az LNS tartalmú AON-ok gapmer szerkezetűek, azaz két rövid LNS farokkal rendelkeznek, míg középen legalább hét dezoxinukleotidot tartalmaznak RNáz H aktivációt idéznek elő a sejteken belül (Jepsen és Wengel, - 59 -

2004; Jepsen és mtsai, 2004). Ezzel szemben a felváltva LNS/DNS-t tartalmazó mixmerek a transzláció gátlására alkalmasak azáltal, hogy a target mRNS-hez kapcsolódva interferálnak a riboszóma kötődéssel vagy az elongációval (Jepsen és Wengel, 2004; Jepsen és mtsai, 2004). Ígéretes eredményekkel kecsegtet az LNS tartalmú oligonukleotidok felhasználása az RNS interferencián alapuló technikák számára is (Elmen és mtsai, 2005). Ismeretes, hogy a transzlációs start kódon szekvenciához kötődő AON-ok igen effektíven gátolják a transzlációt (Braasch és mtsai, 2002, Doyle és mtsai, 2001, Wahlstedt és mtsai, 2000). A szuperfúziós kísérletekben ezért LNS tartalmú AON-kal perfundáltuk a tobozmirigy sejteket a második LD ciklus világos fázisában, így két további LD cikluson át tudtuk még megfigyelni a cBmal1 gátlása által okozott változásokat. Az előzetes vizsgálataink során a szuperfúziós rendszerből izolált mRNS szintek meghatározása igazolta, hogy a második LD ciklus során a cBmal1 és a cAa-nat expressziója hasonló a negyedik LD ciklusban mért értékekhez, így feltételezhettük, hogy a cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek változatlan ritmussal ciklizálnak a második és negyedik LD ciklus között (Rekasi és mtsai, 2006). Ezen tapasztalataink alapján az LNS tartalmú AON-ok adását igyekeztünk úgy időzíteni, hogy a beadás kissé megelőzze és átfedje a második LD ciklusban a legmagasabb cBmal1 mRNS szintet (vö. 11. és 12. ábrákat). A szuperfúziós kísérletek második LD ciklusának világos fázisában adott cBmal1 ellen tervezett LNS tartalmú AON-ok második LD ciklust követően hatékonyan gátolták a tobozmirigy sejtek melatonin szintézisét a szuperfúziós kísérlet végéig (Rekasi és mtsai, 2006). Mivel az LNS tartalmú AON-ok beadása a cBmal1 szinteknek csak a csúcsát fedte le, de az azt megelőző emelkedő fázist nem, ezért a még emelkedettebb cBmal1 mRNS koncentráció annyi cBMAL1 fehérje szintézisére még elegendő lehetett, hogy az a cAa-nat szintézisét indukálja és a második LD ciklus sötét fázisában még látható melatonin csúcsot okozza. Az LNS/DNS mixmer oligonukleotidok hatása elméletileg reverzibilis, ám hasonlóan az LNS/DNS/LNS gapmerhez a melatonin szintek mindkét LNS tartalmú AON adása után a harmadik LD ciklus világos fázisának közepétől a kísérlet végéig, az általunk vizsgált mintegy harminc órán át alacsonyak maradtak. Hasonló LNS tartalmú AON-k féléletideje humán szérumban elérheti - 60 -

akár 28 órát is (Kurreck és mtsai, 2002). Bár az LNS tartalmú AON-jaink féléletideje rövidebb szérumban, mint a kísérletek során megfigyelt gátlás időtartama, eredményeink arra utalnak, hogy szövetkultúrás szérummentes médiumban az LNS tartalmú AON-ok féléletideje akár 58 óránál is hosszabb lehet. Az LNS tartalmú AON-ok gátló hatását a szuperfúziók végén a diszpergált tobozmirigy

sejtekből

izolált

mRNS

szintek

mérésével

igazoltuk.

A

szemikvantitatív relatív RT-PCR-okból kapott adataink alátámasztották, hogy mind az LNS/DNS mixmer, mind az LNS/DNS/LNS gapmer AON-k jelentősen csökkentették az ideghártya és a tobozmirigy cAa-nat mRNS szintjét, amely igazoltan a szuperfúziós eluátum melatonin szintjének csökkenéséhez vezetett. A szuperfúziós kísérletek végén nyert mintákban csak akkor találtunk csökkent cBmal1 mRNS szinteket, ha az LNS/DNS/LNS gapmer AON-t használtuk (Rekasi és mtsai, 2006). Szemben az LNS/DNS mixmerekkel ez a szekvencia elrendezés képes olyan mRNS-AON duplexet képezni, amely mRNS komponensét az RNáz H enzim hasítja. Mivel a cBmal1 forward primer szekvenciája az RNáz H feltételezett hasítási helyét is magába foglalta, logikusnak tűnik, hogy csak az RNáz H aktivitást indukáló LNS/DNS/LNS gapmer volt képes csökkenteni a cBmal1 mRNS szintjét, míg a transzlációs masinériát blokkoló LNS/DNS mixmer hatástalan volt az mRNS szintre (2. és 3. táblázatok). Az LNS tartalmú inverz AON illetve az MQ víz nem volt hatással a melatonin szekrécióra sem pedig a vizsgált mRNS expressziójára, ami arra utal, hogy a transzfektáló reakció reagenseinek (mint például az Oligofectamin) esetleges nem specifikus hatása nem vett részt a melatonin szekréció és az mRNS szintek jelentős csökkenésében. Mindezt alátámasztja a negatív eredményt hozó LDH teszt is, amelyet a sejtek sérülésének és pusztulásának kimutatására alkalmaztunk (14. ábra). Ehhez hozzájárult, hogy a transzfektáló reagensek maradék része szuperfúziós rendszerünkből feltehetően eltávolítható volt a folyamatosan átáramló médium segítségével. In vitro kísérleteink során nyert eredményeink igazolják, hogy a diszpergált tobozmirigy sejtek cBmal1 mRNS-ének kiiktatása a cAa-nat mRNS szintek tartós csökkenését okozza. Ez azt látszik igazolni, hogy a cAa-nat gén - 61 -

expressziója a cBmal1 szabályozása alatt áll. Ezt a feltételezést erősítik meg azok a hibrid rendszerekkel kapott eredmények, melyek során a cBMAL1 és cCLOCK fehérjék ko-expressziója COS-7 fibroblaszt sejtekben serkentette olyan reporter gének átírását, amelyek tartalmazták a cAa-nat gén promoter régióját (Chong és mtsai, 2000). Az általunk használt in vitro kísérleti rendszer előnye a kotranszfekciós kísérletekkel szemben az, hogy a cBmal1 és cAa-nat gének egymásrahatását közvetlenül a tobozmirigy sejtekben vizsgálja. A biológiai óra és a melatonin szintézis közötti kapcsolatot eddig más kutatók a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok alapján még nem vizsgálták. Arra vonatkozólag, hogy diszpergált ideghártya óramechanizmusának LNS tartalmú AON-kal történő gátlása milyen hatással van a sejtek melatonin termelésére jelen vizsgálatainkban az alacsony melatonin szintek miatt nem sikerült adatot gyűjtenünk, ezért a probléma megoldásáig várunk az ideghártyában a cBmal1 gátlását célzó kísérleteinkkel. Az alacsonyabb retinális melatonin koncentrációk problémájának megoldása a jövőben lehetséges, ha a szövetkultúrás médiumot szerotoninnal egészítjük ki (ld. fent). Eredményeink a rendelkezésünkre álló irodalmi adatokkal együtt arra utalnak, hogy

a

madarak

belső

biológiai

óráját

alkotó

transzkripciós-transzlációs

visszacsatolási kör pozitív szabályozó alkotóeleme az, ami a tobozmirigy melatonin szekréciójának napszaki változását, a cAa-nat mRNS szintek szabályozásával közvetett úton befolyásolja. Az LNS tartalmú AON-ok toxikus hatására utaló jelet a szuperfúziós rendszerben végzett transzfekció során nem tapasztaltunk. A szuperfúziós rendszerben történő transzfekció így alkalmas lehet más endokrin szövetek vizsgálatára is.

- 62 -

6. Az eredmények összefoglalása: 1. Kísérleteink igazolták, összhangban más kutatók irodalmi adataival, hogy a csirke tobozmirigyben és retinában mind in vitro és in vivo a cBmal1 és cAa-nat gének expressziója napszaki ritmussal változik a külső környezetének megfelelő megvilágítási viszonyok között. A cBmal1 mRNS szintek napi maximuma a környezetének megfelelő megvilágítási viszonyok közt megelőzi a cAa-nat mRNS szintek napi csúcsát. A cClock mRNS szintek jelentős diurnális ritmust nem mutattak. 2. Vizsgálataink igazolták, hogy a tobozmirigy és az ideghártya esetében a cBmal1 mRNS szintek zenitje és nadírja a két szervben megközelítőleg egy időpontra esik. A legmagasabb és a legalacsonyabb cAa-nat mRNS szintek ideje szintén megegyeznek a tobozmirigyben és az ideghártyában. 3. Csirke tobozmirigy sejtek a szuperfúziós rendszerben megtartják azon képességüket, hogy napi ritmussal szekretálnak melatonint, ami arra utal, hogy a csirke tobozmirigy melatonin termelését egy endogén oszcillátor tartja fenn a szerv denervációja után is. A ritmikus melatonin szekréció hátterében feltehetőleg a cBmal1 és cAa-nat mRNS-ek szintén megtartott ritmikus expressziója áll. A génexpressziók dinamikája arra utal, hogy a cBmal1 mRNS szerepet játszhat a cAa-nat expressziójában. 4. Az in vitro melatonin elválasztás fokozatos szinkronizációja a környezeti fényviszonyokhoz igazolja, hogy a csirke tobozmirigy még rendelkezik funkcionális fotoreceptorokkal. 5. A tobozmirigy sejtek cBmal1 mRNS-ről történő transzlációjának gátlása a cAa-nat mRNS és a melatonin szintek következményes csökkenésével járt in vitro. Ez a megfigyelés kiegészítve azokkal az eredményeinkkel, melyek szerint magasabb cBmal1 mRNS szintek időben megelőzik a cAa-nat mRNS szintek emelkedésének kezdetét, azt sugallja, hogy a cAa-nat mRNS szintek a cBmal1 mRNS-ről transzlálódó fehérje szabályozása alatt állnak. Ennek értelmében a cAa-nat gén egy Ókg és a cirkadián melatonin termelésért a biológiai óra felelős. 6. Elsőként végeztünk transzfekciót szuperfúziós rendszerben. Tapasztalataink szerint az LNS tartalmú AON-kal történő transzfekció nem toxikus a - 63 -

szuperfúziós rendszerben fenntartott szövetekre. Megfigyeléseink alapján az LNS tartalmú AON-okkal történő transzfekció alkalmas lehet más endokrin szervek szuperfúziós rendszerben történő vizsgálatára.

- 64 -

Irodalomjegyzék Bailey, M.J., Beremand, P.D., Hammer, R., Bell-Pedersen, D., Thomas, T.L., és Cassone, V.M. (2003) Transcriptional profiling of the chick pineal gland, a photoreceptive circadian oscillator and pacemaker Molecular Endocrinology 17: 2084-2095. Bailey, M.J., Beremand, P.D., Hammer, R., Reidel, E., Thomas, T.L., és Cassone, V.M. (2004) Transcriptional profiling of circadian patterns of mRNA expression in the chick retina Journal of Biological Chemistry 273: 5224752254. Barret, R.K. és Takahashi, J.S. (1995) Temperature compensation and temperature entrainment of the chick pineal cell circadian clock The Journal of Neuroscience 15: 5681-5692. Bernard, M., Iuvone, M.P., Cassone, V.M., Roseboom, P.H., Coon, S.L., és Klein, D.C. (1997a) Avian melatonin synthesis: photic and circadian regulation of serotonin N-Acetyltransferase mRNA in the chicken pineal gland and retina Journal of Neurochemistry 68: 213-214. Bernard, M., Klein, D.C., és Zatz, M. (1997b) Chick pineal clock regulates serotonin N-acetyltransferase mRNA rhythm in culture Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 94: 304-309. Bernard, M., Guerlotte, J., Greve, P., Grechez-Cassiau, A., Iuvone, M.P., Zatz, M., Chong, N.W., Klein, D.C., és Voisin, P. (1999) Melatonin synthesis pathway: circadian regulation of the genes encoding the key enzymes in the chicken pineal gland and retina Reproduction Nutrition Development 39: 325-34. Braasch, A.D., Liu, Y., és Corey, D.R. (2002) Antisense inhibition of gene expression in cells by oligonucleotides incorporating locked nucleic acids: effect of mRNA target sequence and chimera design Nucleic Acid Research 30: 51605167. Braasch, D.A. és Corey, D.R. (2001) Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA Chemistry and Biology 8: 1-7. Brandstätter, R. (2003) Encoding time of day and time of year by the avian circadian system Journal of Neuroendocrinology 15: 398-404. Bunger, M.K., Wilsbacher, L.D., Moran, S.M., Clendenin, C., Radcliffe, L.A., Hogenesch, J.B., Simon, C.M., Takahashi, J.S., és Bradfield, C.A. (2000) Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals Cell 103: 1003-1017.

- 65 -

Bylund, D.B., Rudeen, P.K., Petterborg, L.J., és Ray-Prenger, C. (1988) Identification of alpha 2-adrenergic receptors in chicken pineal gland using [3H]rauwolscine Journal of Neurochemsitry 51 : 81-86. Cantwell, E.L. és Cassone, V.M. (2006) Chicken suprachiasmatic nuclei: I. efferent and afferent connections Journal of Comparative Neurology 496: 97120. Cassone, V.M. és Menaker, M. (1983) Sympathetic regulation of the chicken pineal rhythms Brain Research 272: 311-317. Cassone, V.M. és Moore, R.Y. (1987) Retinohypothalamic projection and suprachiasmatic nucleus of the house sparrow, Passer domesticus Journal of Comparative Neurology 266: 171-182. Chaurasia, S.S., Pozdeyev, N., Haque, R., Visser, A., Ivanova, T.N., és Iuvone, M.P. (2006) Circadian clockwork machinery in neural retina: Evidence for the prescence of functional clock components in photoreceptor-enriched chick retinal cell cultures Molecular Vision 12: 215-223. Chong, N.W., Bernard, M., és Klein, D.C. (2000) Characterization of the chicken serotonin N-acetyltransferase gene Journal of Biological Chemistry 275: 3299132998. Chong, N.W., Chaurasia, S.S., Haque, R., Klein, D.C., és Iuvone, P.M. (2003) Temporal-spatial characterization of chicken clock genes: circadian expression in retina, pineal gland, and peripheral tissues Journal of Neurochemistry 85: 851860. Cogburn, L.A., Wilson-Placentra, S., és Letcher, L.R. (1987) Influence of pinealectomy on plasma and extrapineal melatonin rhythms in young chickens (Gallus domesticus) General and Comparative Endocrinology 68: 343-356. Coon, S.L., Roseboom, P.H., Baler, R., Weller, J.L., Namboodiri, M.A.A., Koonin, E.V., és Klein, D.C. (1995) Pineal serotonin N-acetyltransferase: expression cloning and molecular analysis Science 270: 1681-1683 . Csernus, V., Faluhelyi, N., és Nagy, A. (2005) Features of the circadian clock in the avian pineal gland Annals of the New York Academy of Sciences 1040: 281287. Dagle, J.M. és Weeks, D.L. (2001) Oligonucleotide-based strategies to reduce gene expression Differentiation 69: 75-82. Davidson, A.J. és Menaker, M. (2003) Birds of a feather clock togethersometimes: social synchronization of circadian rhythms Current Opinion in Neurobiology 13: 765-763. Deguchi, T. (1979) A circadian oscillator in cultured cells of chicken pineal gland Nature 282: 94-96. - 66 -

Dias, N. és Stein, C.A. (2002) Antisense Oligonucleotides: Basic Concepts and Mechanisms Molecular Cancer Therapeutics 1: 347-355. Doi, M., Nakajima, Y., Okano, T., és Fukada, Y. (2001) Light-induced phasedelay of the chicken pineal circadian clock is associated with the induction of cE4bp4, a potential transcriptional repressor of cPer2 gene Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 98: 80898094. Doyle, D.F., Braasch, A.D., Simmons, C.G., Janowski, B.A., és Corey, D.R. (2001) Inhibition of gene expression inside cells by peptide nucleic acids: Effect of mRNA target sequence, mismatched bases, and PNA length Biochemistry 40: 53 -64. Dryer, S.E. és Henderson, D. (1991) A cyclic GMP-activated channel in dissociated cells of the chick pineal gland Nature 353: 756-758. Dunlap, J.C. (1999) Molecular bases for circadian clocks Cell 96: 271-290. Ebihara, S., Adachi, A., Hasegawa, M., Nogi, T., Yoshimura, T., és Hirunagi, K. (1997) In vivo microdialysis studies of the pineal and ocular melatonin rhythms in birds Biological Signals and Receptors 6: 233-240. Elmen, J., Thonberg, H., Ljungberg, K., Frieden, M., Westergaard, M., Xu, Y., Wahren, B., Liang, Z., Řrum, H., Koch, T., és Wahlestedt, C. (2005) Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality Nucleic Acids Research 33: 439-447. Falcón, J. (1999) Cellular circadian clocks in the pineal Progress in Neurobiology 58: 121-162. Faluhelyi, N., Reglodi, D., és Csernus, V. (2006) The effects of PACAP and VIP on the in vitro melatonin secretion from the embryonic chicken pineal gland Annals of the New York Academy of Sciences 1070: 271-275. Fejer, Z., Szel, A., Rohlich, P., Gorcs, T., Manzano, e.S.M.J., és Vigh, B. (1997) Immunoreactive pinopsin in pineal and retinal photoreceptors of various vertebrates Acta Biologica Hungarica 48: 463-471. Foulkes, N.S., Whitmore, D., és Sassone-Corsi, P. (1997) Rhythmic transcription: the molecular basis of circadian melatonin synthesis Biology of the Cell 89: 487-494. Gahr, M. és Kosar, E. (1996) Identification, distribution, and developmental changes of a melatonin binding site in the song control system of the zebra finch Journal of Comparative Neurology 367: 308-318. Ganguly, S., Weller, J.L., Ho, A., Chemineau, P., Malpaux, B., és Klein, D.C. (2005) Melatonin synthesis: 14-3-3-dependent activation and inhibition of arylalkylamine N-acetyltransferase mediated by phosphoserine-205 Proceedings - 67 -

of the National Academy of the Sciences of the United States of America 102: 1222-1227. Hardin, P.E. (2005) The circadian timekeeping system of Drosophila Current Biology 15 : R714-R722. Hasegawa, M. és Ebihara, S. (1992) Circadian rhythms of pineal melatonin release in the pigeon measured by in vivo microdialysis Neuroscience Letters 148: 89-92. Helfrich-Förster, C. (2005) Organization of endogenous clocks in insects Biochemical Society Transactions 33: 957-961. Herichova, I., Mravec, B., Stebelova, K., Krizanova, O., Jurkovicova, D., Kvetnansky, R., és Zeman, M. (2006) Rhythmic clock gene expression in heart, kidney andsome brain nuclei involved in blood pressure control in hypertensive TGR(mREN-2)27 rats Molecular and Cellular Biochemistry 296: 25-34. Hirota, T. és Fukada, Y. (2004) Resetting mechanism of central and peripheral circadian clocks in mammals Zoological Science 21: 359-368. Hudziak, R.M., Summerton, J., Weller, D.D., és Iversen, P.L. (2000) Antiproliferative effects of steric blocking phosphorodiamidate morpholino antisense agents directed against c-myc Antisense and Nucleic Acid Drug Development 10: 163-176. Ishiura, M., Kutsuna, S., Aoki, S., Iwasaki, H., Andersson, C.R., Tanabe, A., Golden, S.S., Johnson, T., és Kondo, T. (1998) Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria Science 281: 15191523. Iuvone, M.P., Chong, N.W., Bernard, M., Brown, A.D., Thomas, K.B., és Klein, D.C. Melatonin biosynthesis in chicken retina, in: Melatonin after four decades (2000) ed.by: Olcese,J. Kluwer Academic/Plenum Publisher, New York Iuvone, M.P., Tosini, G., Pozdeyev, N., Haque, R., Klein, D.C., és Chaurasia, S.S. (2005) Circadian clocks, clock networks, arylalkylamine Nacetyltransferase, and melatonin in the retina Progress in Retinal and Eye Research 24: 433-456. Jepsen, J.S. és Wengel, J. (2004) LNA-Antisense rivals siRNA for gene silencing Current Opinion in Drug Discovery and Development 7: 188-194. Jepsen, J.S., Sorensen, M.D., és Wengel, J. (2004) Locked nucleic acid: A potent nucleic acid analog in therapeutics and biotechnology Oligonucleotides 14: 130146. Jozsa, R., Olah, A., Cornélissen, G., Csernus, V., Otsuka, K., Zeman, M., Nagy, G., Kaszaki, J., Stebelova, K., Csokas, N., Pan, W., Herold, M., Bakken, E.E., és Halberg, F. (2005) Circadian and extracircadian exploration during daytime - 68 -

hours of circulating corticosterone and other endocrine chronomes Biomedicine and Pharmacotherapy 59: S109-S116. Kameda, Y., Miura, M., és Maruyama, S. (2002) Effect of pinealectomy on the photoperiod-dependent changes of the specific secretory cells and α-subunit mRNA level in the chicken pars tuberalis Cell and Tissue Research 308: 121130. King, D.P. és Takahashi, J.S. (2000) Molecular genetics of circadian rhythms in mammals Annual Review of Neuroscience 23: 713-742. Kiyoshi, K., Kondoh, M., Hirunagi, K., és Korf, H.-W. (1998) Confocal laser scanning and electron-microscopic analyses of the relationship between VIP-like and GnRH-like-immunoreactive neurons in the lateral septal-preoptic area of the pigeon. Cell and Tissue Research 293: 39-46. Klein, D.C., Auerbach, D.A., Namboodiri, M.A.A., és Wheler, G.H.T. Indole metabolism in the mammalian pineal gland, in: The pineal gland (1981) ed.by: Reiter,R.J. CRC Press, Boca Raton Kubo, Y., Akiyama, M., Fukada, Y., és Okano, T. (2006) Molecular cloning, mRNA expression, and immunocytochemical localization of a putative blue-light photoreceptor CRY4 in the chicken pineal gland Journal of Neurochemistry 97: 1155-1165. Kurreck, J., Wyszko, E., Gillen, C., és Erdmann, V.A. (2002) Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids Nucleic Acid Research 30: 1911-1918. Kurreck, J. (2003) Antisense technologies: Improvement through novel chemical modifications European Journal of Biochemistry 270: 1628-1644. Larkin, P., Baehr, W., és Semple-Rowland, S.L. (1999) Circadian regulation of iodopsin and clock is altered in the retinal degeneration chicken retina Molecular Brain Research 70: 253-263. Lee, P.P. és Pang, S.F. (1992) Identification and characterization of melatonin binding sites in the gastrointestinal tract of ducks Life Sciences 50: 117-125. Loudon, A.S.I., Semikhodskii, A.G., és Crosthwaite, S.K. (2000) A brief history of circadian time Trends in Genetics 16: 477-481. Lovenberg, W., Jequier, E., és Sjoerdsma, A. (1967) Tryptophan hydroxylation: measurement in pineal gland, brainstem, and carcinoid tumor Science 155: 217219. Mess, B., Rekasi, Z., Gosh, M., és Csernus, V. (1996) Regulation of pineal melatonin secretion: Comparison between mammals and birds Acta Biologica Hungarica 47: 313-322.

- 69 -

Miyoshi, F., Nakayama, Y., Kaizu, K., Iwasaki, H., és Tomita, M. (2007) A mathematical model for the Kai-protein–based chemical oscillator and clock gene expression rhythms in Cyanobacteria Journal of Biological Rhytms 22: 6980. Moore, R.Y. (1978) Neural control of pineal function in mammals and birds Journal of Neural Transmission-Supplement 13: 47-58. Moore, R.Y. (1996) Neural control of the pineal gland Behavioural Brain Research 73: 125-130. Murayama, T., Kawashima, M., Takahashi, T., Yasuoka, T., Kuwayama, T., és Tanaka, K. (1997) Direct action of melatonin on hen ovarian granulosa cells to lower responsivness to luteinizing hormone Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 215: 386-392. Nakahara, K., Murakami, N., Nasu, T., Kuroda, H., és Murakami, T. (1997) Individual pineal cells in chick possess photoreceptive, circadian clock and melatonin-synthesizing capacities in vitro Brain Research 774: 242-245. Nakajima, M., Imai, K., Ito, H., Nishiwaki, T., Murayama, T., Iwasaki, H., Oyama, T., és Kondo, T. (2005) Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro Science 308: 414-415. Natesan, A., Greetha, L., és Zatz, M. (2002) Rhythm and soul in the avian pineal Cell and Tissue Research 309: 35-45. Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., és Buchardt, O. (1991) Sequenceselective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide Science 254: 1497-1500. Okano, T., Yamamoto, K., Okano, K., Hirota, T., Kasahara, T., Sasaki, M., Takanaka, Y., és Fukada, Y. (2001) Chicken pineal clock genes: implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation Genes to Cells 6: 825-836. Panda, S., Antoch, M.P., Miller, B.H., Su, A.I., Schook, A.B., Straume, M., Schultz, P.G., Kay, S.A., Takahashi, J.S., és Hogenesch, J.B. (2002) Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock Cell 109: 307320. Petersen, M., Bondensgaard, K., Wengel, J., és Jacobsen, J.P. (2002) Locked Nucleic Acid (LNA) Recognition of RNA: NMR Solution Structures of LNA:RNA Hybrids Journal of the American Chemical Society 124: 5974-5982. Poeggeler, B., Cornélissen, G., Huether, G., Hardeland, R., Jozsa, R., Zeman, M., Stebelova, K., Olah, A., Bubenik, G., Pan, W., Otsuka, K., Schwartzkopff, O., Bakken, E.E., és Halberg, F. (2005) Chronomics affirm extending scope of lead

- 70 -

in phase of duodenal vs. pineal circadian melatonin rhythms Biomedicine and Pharmacotherapy 59: S220-S224. Puy, H., Deybach, J.-C., Bogdan, A., Callebert, J., Baumgartner, M., Voisin, P., Nordmann, Y., és Touitou, Y. (1996) Increased δ-aminolevulinic acid and decreased pineal melatonin production Journal of Clinical Investigation 97: 104110. Ralph, C.L., Binkley, S., MacBride, S.E., és Klein, D.C. (1975) Regulation of pineal rhythms in chicken: effects of blinding, constant light, constant dark, and superior cervical ganglionectomy Endocrinology 97: 1373-1378. Rekasi, Z., Csernus, V., Horvath, J., Vigh, S., és Mess, B. (1991) Long-term dynamic in vitro system for investigating rat pineal melatonin secretion Journal of Neuroendocrinology 3: 563-568. Rekasi, Z. és Czompoly, T. (2002) Accumulation of rat pineal serotonin Nacetyltransferase mRNA induced by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and vasoactive intestinal peptide in vitro Journal of Molecular Endocrinology 28: 19-31. Rekasi, Z., Horvath, R.A., Klausz, B., Nagy, E., és Toller, G.L. (2006) Suppression of serotonin N-acetyltransferase transcription and melatonin secretion from chicken pinealocytes transfected with Bmal1 antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid in superfusion system Molecular and Cellular Endocrinology 249: 84-91. Reppert, S.M., Weaver, D.R., és Ebisawa, T. (1994) Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reproductive and circadian responses Neuron 13: 1177-1185. Robertson, L.M. és Takahashi, J.S. (1988a) Circadian clock in cell culture: I. Oscillation of melatonin release from dissociated chick pineal cells in flowthrough microcarrier culture Journal of Neuroscience 8: 12-21. Robertson, L.M. és Takahashi, J.S. (1988b) Circadian clock in cell culture: II. In vitro photic entrainment of melatonin oscillation from dissociated pineal cells Journal of Neuroscience 8: 22-30. Simonneaux, V., Ouichou, A., Burbach, J.P.H., és Pevet, P. (1990) Vasopressin and oxytocin modulation of melatonin secretion from rat pineal gland Peptides 11: 1075-1079. Song, Y., Pang, C.S., Ayre, E.A., Brown, G.M., és Pang, S.F. (1996) Melatonin receptors in the chicken kidney are up-regulated by pinealectomy and linked to adenylate cyclase European Journal of Endocrinology 135: 128-133. Stebelova, K., Zeman, M., Cornélissen, G., Bubenik, G., Jozsa, R., Hardeland, R., Poeggeler, B., Huether, G., Olah, A., Nagy, G., Csernus, V., Kazsaki, J., Pan,

- 71 -

W., Otsuka, K., Bakken, E.E., és Halberg, F. (2005) Chronomics reveal and quantify circadian rhythmic melatonin in duodenum of rats Biomedicine and Pharmacotherapy 59: S209-S212. Steele, C.T., Zivkovic, B.D., Siopes, T., és Underwood, H. (2002) Ocular clocks are tightly coupled and act as pacemakers in the circadian system of Japanese quail American Journal of Regulatory - Integrative and Comparative Physiology 284: R208-R218. Steele, C.T., Tosini, G., Siopes, T., és Underwood, H. (2006) Time keeping by the quail's eye: Circadian regulation of melatonin production General and Comparative Endocrinology 145: 232-236. Stephenson, M.L. és Zamecnik, P.C. (1978) Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 75: 285-288. Summerton, J. és Weller, D. (1997) Morpholino antisense oligomers: Design, preparartion, and properties Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7: 187-195. Toller, G.L., Nagy, E., Horvath, R.A., Klausz, B., és Rekasi, Z. (2006) Circadian expression of Bmal1 and serotonin-N-acetyltransferase mRNAs in chicken retina cells and pinealocytes in vivo and in vitro Journal of Molecular Neuroscience 28: 143-150. Tomita, J., Nakajima, M., Kondo, T., és Iwasaki, H. (2005) No transcriptiontranslation feedback in circadian rhythm of KaiC phosphorylation Science 307: 251-254. Ubuka, T., Bentley, G.E., Ukena, K., Wingfield, J.C., és Tsutsui, K. (2005) Melatonin induces the expression of gonadotropin-inhibitory hormone in the avian brain Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 102: 3052-3057. Underwood, H., Binkley, S., Siopes, T., és Mosher, K. (1984) Melatonin rhythms in the eyes, pineal bodies, and blood of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) General and Comparative Endocrinology 56: 70-81. Vigh, B., Rohlich, P., Gorcs, T., Manzano, e.S.M.J., Szel, A., Fejer, Z., és VighTeichmann, I. (1998) The pineal organ as a folded retina: immunocytochemical localization of opsins Biology of the Cell 90: 653-659. Vigh, B., Manzano, M.J., Frank, C.L., David, C., Lukáts, Á., és Szél, Á. Change in the control of the biological circadian rhythms during the evolution. The role of the deep brain photoreceptors, pineal organs and retina, in: Rhythmic biological processes (2003) ed.by: Csernus,V. és Mess,B. Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs

- 72 -

Vitalini, M.V., de Paula, R.M., Park, W.D., és Bell-Pedersen, D. (2006) The Rhythms of Life:Circadian Output Pathways in Neurospora Journal of Biological Rhytms 21: 432-445. Wahlestedt, C., Salmi, P., Good, L., Kela, J., Johnsson, T., Hökfelt, T., Broberger, C., Porreca, F., Lai, J., Ren, K., Ossipov, M., Koshkin, A., Jakobsen, N., Skouv, J., Oerum, H., Jacobsen, M.H., és Wengel, J. (2000) Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 97: 5633-5638. Walder, R.Y. és Walder, J.A. (1988) Role of RNase H in hybrid-arrested translation by antisense oligonucleotides Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 85: 5011-5015. Yamamoto, K., Okano, T., és Fukada, Y. (2001) Chicken pineal Cry genes: lightdependent up-regulation of cCry1 and cCry2 transcripts Neuroscience Letters 313: 13-16. Yasuo, S., Watanabe, M., Okabayashi, N., Ebihara, S., és Yoshimura, T. (2003) Circadian clock genes and photoperiodism: comprehensive analysis of clock gene expression in the mediobasal hypothalamus, the suprachiasmatic nucleus and the pineal gland of the japanese quail under various light schedules Endocrinology 144: 3742-3748. Yoshimura, T., Yasuo, S., Suzuki, Y., Makino, E., Yokota, Y., és Ebihara, S. (2001) Identification of the suprachiasmatic nucleus in birds American Journal of Regulatory - Integrative and Comparative Physiology 280: R1185-R1189. Zawilska, J.B. és Iuvone, M.P. (1990) Alpha-2 adrenergic activity of bromocriptine and quinpirole in chicken pineal gland. Effects on melatonin synthesis and [3H] rawolscine binding. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 255: 1047-1052. Zawilska, J.B., Lorenc, A., Berezinska, M., Vivien-Roels, B., Pévet, P., és Skene, D.J. (2006) Diurnal and circadian rhythms in melatonin synthesis in the turkey pineal gland and retina General and Comparative Endocrinology 145: 162-168. Zimmerman, N.H. és Menaker, M. (1979) The pineal gland: A pacemaker within the circadian system of the house sparrow Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 76: 999-1003.

- 73 -

A disszertációhoz kapcsolódó különlenyomatok jegyzéke Rekasi Z., Horvath R.A., Klausz B., Nagy E., Toller G.L. (2006) Suppression of serotonin N-acetyltransferase transcription and melatonin secretion from chicken pinealocytes transfected with Bmal1 antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid in superfusion system Molecular and Cellular Endocrinology 249: 84-91. IF.: 2,918

Toller G.L., Nagy E., Horvath R.A., Klausz B., Rekasi Z. (2006) Circadian expression of Bmal1 and serotonin-N-acetyltransferase mRNAs in chicken retina cells and pinealocytes in vivo and in vitro Journal of Molecular Neuroscience 28:143-50. IF.: 2,965

- 74 -

A disszertációhoz kapcsolódó konferenciai szereplések jegyzéke Rekasi Z., Toller G. (2002) A környezeti fényviszonyok hatása a Bmal1, Clock és serotonin N-acetiltranszferáz génexpresszió circadian ritmusára csirke retinában és tobozmirigyben Orvosi Hetilap 143. Suppl. 1: 992-993. Rekasi Z., Toller G. (2003) Circadian expression of Bmal1-Clock and serotonin N-acetyltransferase transcripts in chicken retina cells and pinealocytes Clinical Neuroscience 56. Suppl. 2. 75. Rekasi Z., Toller G., Nagy E., Horvath R. (2004) A fényviszonyok hatása a cirkadián órára csirke tobozmirigyben Orvosi Hetilap 145. Suppl. 3: 1102-1103. Rekasi Z., Horvath R., Kosi L., Klausz B., Nagy E., Toller G. (2005) Transfection experiments using antisense locked nucleic acids to study the effect of Bmal1 clock gene on melatonin secretion in superfusion system. Clinical Neuroscience 58 Suppl 1: 80. Rekasi, Z., Horvath, R., Klausz, B., Kosi, L., Nagy, E., Toller, G. Transfection experiments using antisense locked nucleic acids to study the effect of Bmal1 clock gene on melatonin secretion in superfusion system. - X. Congress of European Pineal and Biological Rhytms Society, Frankfurt/Main, Germany, September 01-05, 2005. Toller G., Rekasi Z. Circadian expression of Bmal1-Clock and serotonin Nacetyltransferase transcripts in chicken retina cells and pinealocytes. IBRO International Workshop on Signalling Mechanisms in the Central and Peripheral Nervous System, Debrecen, Hungary, January 24-26, 2002. Toller G., Rekasi Z. Effect of constant light and darkness on the expression of cBmal1-Clock and serotonin N-acetyltransferase transcripts in chicken retina cells and pinealocytes. IXth Symposium of the European Pineal and Biological Rhythms Society, Aberdeen, Scotland, July18-22, 2002.

- 75 -

A disszertációhoz nem kapcsolódó közlemények jegyzéke Engel J. B., Keller G., Schally A.V., Toller G.L., Groot K., Havt A., Armatis P., Zarandi M., Varga J.L., Halmos G. (2005) Inhibition of growth of experimental human endometrial cancer by an antagonist of growth hormone-releasing hormone. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 90: 3614-3621. IF: 6,020

Havt A., Schally A.V., Halmos G., Varga J.L., Toller G.L., Horvath J.E., Szepeshazi K., Koster F., Kovitz K., Groot K., Zarandi M., Kanashiro C.A. (2005) The expression of the pituitary growth hormone-releasing hormone receptor and its splice variants in normal and neoplastic human tissues. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 102: 17424-17429. IF.: 10,231

Horvath J. E., Toller G.L., Schally A.V., Bajo A.-M., Groot K.(2004) Effect of long-term treatment with low doses of the LHRH antagonist Cetrorelix on pituitary receptors for LHRH and gonadal axis in male and female rats Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 101: 4996-5001. IF.: 10,452

Keller G., Schally A.V., Groot K., Toller G.L., Havt A., Koster F., Armatis P., Halmos G., Zarandi M., Varga J.L., Engel J.B. (2005) Effective treatment of experimental human non-Hodgkin's lymphomas with antagonists of growth hormone-releasing hormone. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 102: 10628-10633. IF.: 10,231

Toller G. L., Horvath J.E., Schally A.V., Halmos G., Varga J.L., Groot K., Chism D., Zarandi M. (2004) Development of a new polyclonal antiserum for the detection of the isoforms of the receptors for human growth hormone-releasing hormone on tumors. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 101: 15160-15165. IF.: 10,452

Varga J. L., Schally A.V., Horvath J.E., Kovacs M., Halmos G., Groot K., Toller G.L., Rekasi Z., Zarandi M. (2004) Increased activity of antagonists of growth hormone-releasing hormone substituted at positions 8,9, and 10 Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 101: 17081713. IF.: 10,452

Zarandi M., Varga J.L., Schally A.V., Horvath J.E., Toller G.L., Kovacs M., Letsch M., Groot K., Armatis P., Halmos G. (2006) Lipopeptide antagonists of growth hormone-releasing hormone with improved antitumor activities

- 76 -

Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America 103: 4610-4615. IF.: 9,643

- 77 -

Köszönetnyilvánítás Kutatásaim szakmai irányításáért és ezen dolgozat elkészítéséhez nyújtott segítségért ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Rékási Zoltánnak. Dr. Sétáló György és Dr. Csernus Valér a Neuroendokrinológia és neurohisztológia Doktori Program vezetőiként, valamint az Anatómia Intézet vezetőiként támogatták kutatói munkámat. Köszönet illeti Nagy Enikőt a PCRok és a szuperfúziók, Mercz Tündét és Végi Gabriellát pedig a melatonin RIA-k kivitelezésében nyújtott segítségükért. Köszönöm továbbá Horváth Réka és Klausz Barbara Tudományos Diákkörös Hallgatók az ebben a dolgozatban leírt tudományos munkához nyújtott lelkes segítségét.

- 78 -