A cirkadián óra génszintő vezérlése vizsgálatok csirke tobozmirigy modellen

A cirkadián óra génszintő vezérlése – vizsgálatok csirke tobozmirigy modellen Doktori (PhD) értekezés

Dr. Nagy András Dávid

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Anatómiai Intézet Témavezetı: Dr. Csernus Valér

Neuroendokrinológia és Neurohisztológia Doktori Program Programvezetı: Dr. Csernus Valér

Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Doktori Iskola vezetı: Dr. Lénárd László

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar

Pécs

2009.

TARTALOM

1. BEVEZETÉS

-4-

1.1.

Idıérzet és biológiai ritmus

-4-

1.2.

Cirkadián ritmusú biológiai jelenségek

-4-

1.3.

A cirkadián óra

-7-

1.3.1.

A cirkadián biológiai oszcillátor

-8-

1.3.2.

A cirkadián óra élettani szerepe

-11-

1.3.3.

A cirkadián óra szabályozása

-12-

1.4.

A madár tobozmirigy, mint a cirkadián óra modellje

-17-

1.5.

Célkitőzések

-20-

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

-23-

2.1.

Oligonukleotid PCR primerek

-23-

2.2.

Vegyszerek

-24-

2.3.

Kísérleti állatok

-24-

2.4.

Össz-RNS tisztítás csirke tobozmirigybıl

-25-

2.5.

mRNS-ek kimutatása RT-PCR módszerrel

-25-

2.6.

PCR termékek szekvenálása

-25-

2.7.

Szemikvantitatív RT-PCR módszer

-26-

2.8.

In vivo kísérletek

-30-

2.9.

In vitro kísérletek

-31-

2.10. Statisztikai módszerek

-32-

2

3. ÓRAGÉNEK AZONOSÍTÁSA CSIRKE TOBOZMIRIGYBEN

-34-

3.1.

Eredmények

-34-

3.2.

Megbeszélés

-36-

4. FÉNY HATÁSA AZ ÓRAGÉN MRNS-EXPRESSZIÓRA 4.1.

Eredmények

-37-37-

4.1.1.

Fény hatása az óragén-expresszióra in vivo

-37-

4.1.2.

Fény hatása az óragén-expresszióra in vitro

-42-

4.2.

Megbeszélés

-44-

5. A RITMUSOS ÓRAGÉN-EXPRESSZIÓS MINTÁZAT KIALAKULÁSA-505.1.

Eredmények

-50-

5.1.1.

Az óragén-expresszió 24 órás mintázatai in vivo

-50-

5.1.2.

Az óragén-expresszió 24 órás mintázatai in vitro

-55-

5.1.3.

PACAP hatása az óragén-expresszióra

-58-

5.2.

Megbeszélés

-59-

6.

A LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK

-65-

7.

PUBLIKÁCIÓK

-66-

8.

RÖVIDÍTÉSEK

-70-

9.

IRODALOMJEGYZÉK

-74-

3

1.

BEVEZETÉS

1.1.

IDİÉRZET ÉS BIOLÓGIAI RITMUS

Az idıt úgy fogjuk fel, mint a teret: a felosztás, mérés fogalmával kötjük össze. Bár az idıt nem lehet közvetlenül érzékszerveinkkel érzékelni, mérése alapvetı jelentıségő. A legtöbb kora-ókori kultúrában a mindennapi élet ritmusát az égitestek ciklusaihoz igazították. A napóránál és a vízóránál megbízhatóbb mechanikus órát jóval késıbb, a XIII. század vége felé találták fel, amit elıször kolostorokban használtak1. Az ipari korban már percekben, másodpercekben mérték az idıt, így lehetıvé vált a különféle tevékenységek hatékonyabb tervezése. A modern korban az emberi teljesítıképesség határait befolyásoló valódi biológiai sajátságok, így a belsı idızítı mechanizmusok ismerete iránt egyre nagyobb az igény. A biológiai ritmus egy nagyjából azonos periódusidıvel ismétlıdı, ritmikus biológiai jelenség. A fennmaradt leírások alapján biológiai ritmust már az ókorban2, középkorban3 megfigyeltek, de kiváltó oknak kizárólag a ritmikus természeti jelenségeket tartották. Darwin sokféle biológiai ritmust leírt: éves-, havi-, napi-, és napszakos periódusú ritmust4. A mai kronobiológusok (az élıvilág idıjelzı mechanizmusait kutatók) körében legáltalánosabban elfogadott nézet szerint a belsı ritmus elırejelzi a környezeti tényezık ismétlıdı változásait (napfény, hımérséklet, táplálék, stressz, etc.), melyekre az élı szervezet idıben felkészülhet5,6. 1.2.

CIRKADIÁN RITMUSÚ BIOLÓGIAI FOLYAMATOK

A cirkadián ritmusú biológiai folyamatok (latin circa- körülbelül, diem- 24 órás nap28) ritmikus mintázata a Föld tengelyforgása által kiváltott nappaléjszaka ciklushoz igazodik. Az egyik népszerő példa Linné virágórája7: a különféle növények az eltérı napi virágnyílási és záródási idıpontok alapján jelzik az idıt. A legrégebbrıl ismert megfigyelést Androszthenész írta le Alexandrosz ázsiai hadjáratakor: a tamarinduszfa levelei 24 h periódusú ritmusban nyílnak és záródnak2. A cirkadián ritmus hátterében rejlı biológiai folyamatokat a XVIII. században vizsgálták elıször kísérleti

4

körülmények között. A mimóza sötétkamrában is közel 24 h periódusú ritmusban nyitja-zárja leveleit8, vagyis a változást nem a fény-sötét ciklus váltja ki. A mimóza levélmozgásának cirkadián ritmusa még mindig észlelhetı, ha a fény mellett változatlan a környezeti hımérséklet9 és a páratartalom10. A periódusidı állandó fényben vagy sötétben nem pontosan 24 h10, vagyis a levélmozgás napi ritmusát egy belsı folyamat szabályozza, ami körülbelül 24 óránként ismétlıdik. A periódusidı nem rövidül jelentısen, ha az állandó környezeti hımérséklet magasabb9, vagyis a biológiai mechanizmus hımérséklet-kompenzált. A környezeti fény-sötét ciklus megfordítása után a levélmozgás ritmusa megfordul néhány nap alatt10, vagyis igazodik az új környezeti ciklushoz. Csak mintegy 200 évvel késıbb kezdték zoológusok vizsgálni a cirkadián ritmusú biológiai jelenségeket. A testhımérséklet és a lokomotoros aktivitás összehangolt

ritmusban változik11, mind diurnális (nappali),

mind

nokturnális (éjszakai) életmódú homeotherm állatokban12. Ezek a cirkadián ritmusú

jelenségek

is

megfigyelhetıek

állandó

megvilágítású

és

hımérséklető környezetben13-15. Patkányoknál az etetések elıtt jelentkezı spontán táplálékkeresı magatartás pontos ritmusban észlelhetı akkor is, ha a napi egyszeri etetés rendszeres idıpontja nem az állat életmódjának megfelelı éjszakai órákban történik16, tehát a belsı ritmus a fényen kívül táplálékkal is idızíthetı. Méheknél a nektárgyőjtés naponkénti idızítése állandó fény, hımérséklet és páratartalom mellett közel azonos idıpontban marad17, még ha a méheket több idızónán vitték is át18, vagyis az idızítésért nem a geofizikai környezet felel elsısorban, hanem egy biológiai mechanizmus. Szintén méheknél19 és költözı madaraknál20 írták le elıször, hogy az állatok a megfelelı repülési irányt a Nap aktuális helyzetébıl (napiránytő) egy belsı idıjelzı mechanizmus segítségével határozzák meg. Mindkét fajnál igazolták, hogy a tájékozódáshoz használt és a lokomotoros ritmust idızítı mechanizmusok azonosak21, 22. Cirkadián biológiai ritmust emberben elıször Sanctorius23 írt le a testsúly és a légzés táplálkozásfüggı változásainak 24 órás megfigyelésével (de Statica Medicina, 1614.). Az emberi élettani folyamatokhoz és betegségekhez

5

kapcsolódó 24 órás periódusban ismétlıdı jelenségekrıl, és azok feltételezett eredetérıl már 1814-ben készült doktori értekezés24, de a legismertebb emberi cirkadián ritmust, a testhımérséklet ritmusát csak késıbb írták le25. A testhı cirkadián ritmusa több napig közel 24 h maradt mesterséges, 28 órás fény-sötét ciklusú izolált környezetben26, vagyis a belsı idızítı mechanizmus, a biológiai oszcillátor periódusideje viszonylag állandó. Az alvás-ébrenlét ritmus periódusideje emberben 23,5-24,7 h27. A cirkadián ritmus fenomenológiai szemszögbıl az alábbi szabályszerőségeket mutatja29-38: (1) A cirkadián ritmus endogén jelenség: folyamatosan sötét (DD- constant darkness),

állandó

hımérséklető

és

páratartalmú

környezetben

szabadon fut, fajonként eltérı ideig (napok – évek). (2) Szabadon futó körülmények között a cirkadián ritmus periódusideje (τ, free-running period) csak körülbelül 24 h. A τ pontos értéke fajra jellemzı, állandó adat. (3) A cirkadián ritmus perióduson belüli aktuális lefutása (fázisa, φ) viszonylag könnyen megváltoztatható az arra alkalmas környezeti ingerrel (német Zeitgeber: idıt meghatározó). - A zeitgeber ingerek alapvetıen fény-, hımérséklet-, táplálék-, fizikai aktivitási, alvás-ébrenléti és szociális ingerek36. - A zeitgeber a szabadon futó periódus mintegy fele idıszakaszában hatástalan lehet (dead zone, ∆φ=0). - A zeitgeber a ritmus fázisát késlelteti (∆φ<0), vagy sietteti (∆φ>0), attól függıen, hogy a periódus arra érzékeny idıszakaszának elsı, vagy második felében alkalmazzuk azt (például megvilágítás este, vagy hajnalban). - Az egy cikluson belül kiváltható fázisváltozás szélsıértékei (∆φmin és

∆φmax) fajra jellemzı, állandó adatok (gerincesekben a fény a lokomotoros ritmusban többnyire +/- 1-4 óra/ciklus fázisváltozást okozhat, a határt egyetlen 40-60 perces expozícióval már el lehet érni).

6

(4)

A

cirkadián

ritmus

fázisban

igazodik

a

zeitgeber

ingerek

meghatározott periódusidejő (T) ciklusaihoz (rhythm entrainment, a francia entraîner- befolyásol, magával von, vezet igébıl). - A cirkadián ritmus alapvetıen a pontosan 24 órás (T=24 h) ciklusokat követi. Ilyenkor a cirkadián ritmus minden nap ∆φ=τ-24, azaz fajra jellemzı idıvel igazodik a természetes környezethez. - A cirkadián ritmus a nem 24 órás környezeti ciklusokat szők, a fajra jellemzı Tmin=τ+∆φmin és Tmax=τ+∆φmax határokon belül képes követni (például ecetmuslica, patkány, egér, embernél fény-sötét ciklusok esetén: Tmin=22 h, Tmax=28 h). - A cirkadián ritmus a Tmin - Tmax tartományon kívül esı periódusú környezeti ciklusokhoz általában nem igazodik. 1.3.

A CIRKADIÁN ÓRA

A cirkadián ritmus széleskörően elterjedt: megfigyelhetı baktériumokban39, egysejtő eukariótákban40, növényekben29, gombákban41, az állatvilág minden törzsénél42 és emberben43. Darwin a növények mozgásáról írt könyvében kijelenti, hogy a 24 h periódusú biológiai ritmus örökletes tulajdonság44. Állítását elıször babnövényen igazolták, ahol homozigóta mutáns (τ=20h) és vad (τ=24h) típusok keresztezésével az utódnövények levélmozgási ritmusa τ=22h lett45. Az elsı hasonló mutációt késıbb írták le ecetmuslicában (per- period46), penészgombában (frq- frequency47), aranyhörcsögben (tau48) és egérben (clock49). A cirkadián ritmust vezérlı biológiai mechanizmusokat az 1960-as években biológiai óráknak nevezték el31 („Biological Clocks” - a középkori latin clocca harangot, idıjelzıt jelent). A rendkívül csekély hibával mőködı cirkadián órák (egérben a τ szórásának átlaga mindössze néhány perc50) az elnevezés idején még sem molekuláris, sem anatómiai értelemben nem voltak ismertek. A ma használt „óra” kifejezés jelentéstartalma ebben a kontextusban így csupán annyi, hogy a cirkadián ritmus öröklött és nem szerzett jelleg, melynek alapvetı funkciója az idı mérése, jelzése.

7

1.3.1. A cirkadián biológiai oszcillátor Az élı szervezet ritmusos jelenségeit olyan fizikai-kémiai szabályozás okozza, ahol a szabályozóelemek interakciói ciklusról-ciklusra ugyanolyan sorrendben ismétlıdnek (biológiai oszcillátor). Az ismétlıdést gátló visszacsatolás biztosítja, a periódushosszhoz szükséges késleltetést az „alkatrészek” interakcióinak különféle kinetikai sajátosságai befolyásolják. A cirkadián biológiai oszcillátor minden összetevıje egyetlen sejtre lokalizálható, mert a ritmus sejtszinten is megfigyelhetı. A periódushossz alapján már feltételezni lehetett, hogy a 24 h periódusban ismétlıdı mintázatokért génaktivációs szintő kaszkád felelhet, melynek utolsó eleme a periódus végén az elsıt aktiválja51. Az 1990-es évek közepére világossá vált, hogy a visszacsatolási hurok csak két elembıl áll, az aktiváló- és a gátló óraproteinekbıl, melyeket az óragének kódolnak52. Az elsı óragént az ecetmuslica per mutánsból klónozták53. A PER protein funkciójának becslése késıbb, egy újabb gén szekvenálásával vált lehetıvé, mely transzkripciós faktort kódolt (sim54), és átfedést mutatott a per gén egy szakaszával. A molekuláris oszcillátor transzkripciót szabályozó szerepét az is sugallta, hogy in vitro konstans környezeti viszonyok mellet számos gén mRNS-ének mennyisége cirkadián ritmusban változott gombákban55. Maga a per gén transzkripciója is cirkadián ritmust mutat, melyet saját proteinterméke, a PER szabályoz, ugyanis mind a per mRNS-, mind a PER proteinszintek ritmusos expressziós mintázatai eltérnek per mutánsokban a vad típusok periódushosszától56. A PER a sejtmagban lokalizálható57, továbbá a késıbb róla elnevezett, számos transzkripciós faktorra jellemzı PAS domaint is tartalmazza58. A transzkripciós modell meggyızıbbé vált az egér clock mutánsból izolált clock óragén klónozásával59, majd a per gén megfelelıit azonosították egérben

60

(per1, per2, per3), a clock gént pedig ecetmuslicában61 (clk). A

CLOCK a PAS- mellett DNS kötésre jellemzı bHLH-62 és egy katalitikus HAT domaint63 is tartalmaz. A CLOCK fı dimerizációs partnerei a BMAL64 (bmal1 és bmal2) proteinek. A CLOCK/BMAL heterodimerek aktivált állapotban belépnek a sejtmagba, és ott hiszton-acetilációt és E-box

8

(3'-CACGTG-5') kötıdést követıen génexpressziót indukálnak65 (1. ábra, „AB” komplex). E-box elemet tartalmaz többek között a per66, és a PER dimerizációs partnerének, a CRY (cry1 és cry2) génjének promótere is67. A CLOCK/BMAL komplexek DNS-kötıdése tehát indukálja mind a per mind a cry gének kifejezıdését (1. ábra, „x”, „y”). A képzıdött PER/CRY heterodimerek a sejtmagba kerülnek, ahol interakcióba

lépnek

a

CLOCK/BMAL transzkripciós komplexekkel és gátolják azokat68 (1. ábra, „XY” komplex). A PER/CRY ezáltal saját génjeinek kifejezıdését szabályozza negatív visszacsatolásban. A PER és CRY proteintermékek degradációjával a gátlás megszőnik69. Az újabb ciklus elindításáért egy másodlagos feed-back hurok felel, ahol a bmal transzkripciót a REVERBα és RORα proteinek szabályozzák (1. ábra, „M” és „N” proteinek).

1. ábra. A cirkadián oszcillátor mőködésének alapját képezı molekuláris szabályozás sémás rajza.70 A molekuláris interakciók leírása a szövegben olvasható. Fıbb óragének az élıvilágban: Arabidopsis (növények): a: toc1, x: lhy, y: cca1, m: elf3, n: gi. Neurospora (gombák): a: wc-1, b: wc-2, x: frq, m: vvd. Drosophila (gerinctelenek): a: clk, b: cyc, x: per, y: tim, m: Pdp1ε, n: vri. Mus musculus (gerincesek): a: bmal, b: clock, x: per, y: cry, m: Rev-erbα, n: Rorα.

A cirkadián oszcillátorban több transzkripciós feedback-kör mőködik. Ezt az jelzi, hogy egérben egy óragén null mutációja nem jár együtt a cirkadián ritmus eltőnésével (csak a bmal1-/- a kivétel71). Az E-boxhoz más óraprote-

9

inek is kötıdnek (e.g. NPAS2), valamint a CLOCK/BMAL funkcióját más óraproteinek is gátolják (e.g. DEC1, DEC2)72. Az E-box mellett ismert más, szintén ritmusosan szabályozott promóter-elem is72: RRE és D-box. Egy óragén promótere többféle ilyen elemet tartalmazhat (e.g. cry1 E-box és RRE), ami a feedback körök összekapcsoltságát jelenti, ezzel biztosítva a ritmus megbízható kifejezıdését (a rendszer redundanciáját) és a robusztus amplitúdó-változást72. Egy adott óragén kifejezıdésének pontos idızítését végsı soron ezen promóter-elemek kombinációi befolyásolják, mivel azok perióduson belüli aktivációja általában idıben eltérı72. A ciklus egészének körülbelül 24 órányi periódusához átlagosan 12 órás késleltetésre van szükség a transzkripció aktivációja és gátlása között73, melyet jellemzı idıállandójú molekuláris események összehangolt sora biztosít. Általában 2-6 órás különbséggel követik egymást az adott óragén expressziós

ritmusára

jellemzı

mRNS-

és

proteinmennyiségi

maximumértékek74,75. A rendszer poszt-transzkripciós szintő szabályozóelemei közül a NOC76, LARK77, hnRNP Q78 és mTOR79 fehérjéket, valamint specifikus miRNS-eket80 sikerült azonosítani. Az óraproteinek interakcióit, transzlokációját, katalitikus aktivitását és eliminációját befolyásoló folyamatok néhány év óta intenzív kutatás tárgyai. A poszt-transzlációs szabályozási szint egyik elsıként karakterizált fehérjéje a CKIε81. A tau-mutáns hörcsögben azonosított CKIεtau a gátló óraproteinkomplexeket hiperfoszforilációval destabilizálja, így a PER proteinek idı elıtt eliminálódnak a sejtmagból specifikus ubikvitináció és proteaszómális degradáció során82. Az új ciklus elıbb kezdıdik, a periódusidı körülbelül 2 órával rövidül. A per2 óragén fenti folyamatban érintett régiójának polimorfizmusa áll a korai alvásfázissal járó emberi tünetegyüttes (FASPS) hátterében83. Egy, a periódushosszt növelı mutáció (ovtm, overtime - túlóra) a CRY óraproteinek specifikus ubikvitinációját befolyásolja84. Az ovtmmutáns egerekben a CRY óraproteinek nem eliminálódnak idıben a sejtmagból, így a ciklus késıbb kezdıdik és a periódusidı mintegy 2,5 órával hosszabb. Hasonló fenotípusú, késıi alvásfázissal járó tünetegyüttes emberben is ismert (DSPS85).

10

Az óragének, valamint az óraproteinek szabályozásában szerepet játszó eddig ismert gének szekvenciája állatokban filogenetikailag meglehetısen konzervált. A cirkadián óra gombákban és növényekben is a fentiekben leírt transzkripciós/poszt-transzlációs feedback elven mőködik52, de a résztvevı óraproteinek eltérnek az állatokban ismertekétıl (1. ábra, ábrafelirat). A baktériumok molekuláris órája alapvetıen nem transzkripciós, hanem poszttranszlációs visszacsatoláson alapul86. A cirkadián ritmus az idı mérésének képességét tehát különféle oszcillátor-mechanizmusokkal biztosítja az élıvilágban. A változatosság adaptációs elınyt igazol. 1.3.2. A cirkadián óra élettani szerepe A cirkadián óra perc pontossággal jelezheti elıre a napi rutin igénybevétel idejét50,

mely a

megfelelı

viselkedési

mintázat

és a szükséges

szervrendszer, szerv, szövet és sejttípusok optimális mőködésének tervezése szempontjából elınyös. A cirkadián biológiai oszcillátor idızítı funkcióját a homeosztatikus

szabályozórendszerek,

mint

az

alvás-ébrenlétet,

a

lokomóciót, a testhımérsékletet és a táplálékfelvételt irányító központok mellett

a

kardiovaszkuláris-,

az

endokrin-

és

az

immunrendszer

hasznosítja87. Így az élettani változók széles spektrumán követhetı nyomon az átlagosan 20-30%-os napi fluktuációként megjelenı cirkadián ritmus33. A különféle sejttípusok kifejezıdı génjeinek akár 90%-a mutathat 24 órás periódusú ritmikus expressziós mintázatot88. Nemcsak szövet-specifikus, hanem alapvetı sejtszintő folyamatok (sejtciklus, sejtanyagcsere) állnak a molekuláris oszcillátor szabályozása alatt89. Éppen az organizmuson belüli széleskörő elterjedtsége miatt a cirkadián óra egy általános, „housekeeping” rendszernek fogható fel90. Érintettsége igazolt számos, nem ritka kórfolyamat kialakulásában és lefolyásában91-117. 1.3.3. A cirkadián óra szabályozása A

cirkadián

ritmus

szabályozása

szempontjából

legnyilvánvalóbb

környezeti kulcsinger a fény/sötét ciklus váltakozása. Egysejtőektıl a gerinctelenekig számos élılény kültakarója fényáteresztı, és testi sejtjeinek

11

jelentıs része tartalmaz fotoenzimeket (fotoliázok, kriptokrómok). Ezek a fénymennyiség

mérésével

a

DNS-repair

mellett

számos

egyéb,

transzkripciós szintő folyamatokban játszhatnak szerepet. A CRY az ecetmuslica sejtjeiben például fény hatására destabilizálja a PER/TIM komplexet119. Emiatt a TIM óraprotein hamarabb eliminálódik a sejtmagból, és a transzkripció cirkadián ritmusának fázisa megváltozik119. A nem-emlıs gerincesekben számos diencephalicus eredető struktúra tartalmazhat a cirkadián ritmus szabályozása szempontjából releváns fényérzékeny összetevıket

(retina,

tobozmirigy,

parapineális

szerv,

parietális szem, mediobasalis hypothalamus), míg emlısökben kizárólag a látószervnek van hasonló kulcsszerepe120. A cirkadián ritmus fázisát a fény azonos mértékben befolyásolja rd (rod/cone degenerated) és vad genotípusú egerekben is121. Opn4-/- (melanopszin-/-) egerekben viszont a cirkadián ritmus csak korlátozott mértékben igazodik a megváltoztatott fény-sötét ciklushoz, vagyis a melanopszin kulcsfontosságú a ritmusszabályozásban122. Az Opn4 immunpozitív sejtek a retina ganglionsejt populációjának (RGCs – retinal ganglion cells) azon kisebb frakcióját teszik ki, melyek önmagukban fényérzékenyek (ipRGC – intrinsically photosensitive RGC)123. Ezek a ganglionsejtek a csapok és pálcikák sejthálózatából is kapnak afferentációt, és többnyire a non-vizuális fényinformációk feldolgozásában érintett agyterületekre vetülnek123. Az ipRGC perykaryonokban a melanopszin fotoizomerizációja G-protein függö cGMP-szint növekedést okoz, mely a fényintenzitással arányos akcióspotenciál gyakorisághoz, az axonterminálison pedig glutamát felszabadulásához vezet124. A

cirkadián

ritmus

szabályozásában

résztvevı

agyterületek

feltérképezéséhez is hasznosnak bizonyuló léziós kísérletek közül az elsıt a pécsi Anatómiai Intézetben végezték. Halász Béla és munkatársai az anterior és mediobasalis hypothalamicus magvak közötti összeköttetések átmetszése után számos neuroendokrin funkció ritmusos mintázatának eltőnését tapasztalták patkányban125. A retinából a hypothalamusba érkezı idegrostok azonosításával126 (tractus retinohypothalamicus, RHT) ismertté vált, hogy ezek a rostok a chiasma opticum fölött és a III. agykamra alatt

12

párosan elhelyezkedı, egyenként 300 µm átmérıjő, kompakt szerkezete miatt az anterior hypothalamicus áreában könnyen elkülöníthetı magon végzıdnek, mely megfelel a korábban már leírt nucleus suprachiasmaticusnak (SCN)

127.

A teljes mag ablációja emlısökben a fontosabb

élettani funkciók 24 órás periódusú ritmusos mintázatának megszőnéséhez vezetett128,129. Hasonló hatást más agyterületek sértésével nem sikerült elıidézni130. Újszülött patkányon végzett SCN abláció következményeként nemcsak a cirkadián ritmus, hanem a RHT sem volt azonosítható a kifejlett állatokban131. Újszülött állatból nyert SCN graft beültetésével a cirkadián viselkedési ritmus visszaállt, de nem igazodott a környezeti fény-sötét ciklushoz132.

SCN irtott felnıtt hörcsögben a tau mutáns újszülöttbıl

származó SCN graft a donorral egyezı ritmusos fenotípust hozott létre133 (τ = 20 h). Az SCN így nem csak egy egyszerő, a látóideghez köthetı reléállomás, hanem cirkadián ritmusgenerátorként mőködik. A kétoldali suprachiasmaticus magokat egérben körülbelül 8 - 8 000 darab kis sejttesttel rendelkezı GABA-erg neuron alkotja134. Állandó sötétben tartott állatokban az SCN neuronok hónapokig megfigyelhetı szinkronizált ritmust mutatnak az akcióspotenciál gyakoriság135, a metabolizmus136 és az óragén-kifejezıdés137 szintjein egyaránt. Ezek a sejtek in vitro cirkadián ritmusban mőködnek akár hetekig138. Míg diszpergált sejttenyészetben a

τ számottevı szórást mutat139 (SD = 1,4 h), addig organotypicus körülmények között a τ szórása egy nagyságrenddel kisebb33 (SD = 0,2 h). A neuron-populációk kölcsönhatásai ugyanis jelentısen befolyásolják a fázisgörbe aktuális lefutását. Az SCN ventrolateralis elhelyezkedéső „core” része (40%), és a nagyobb (60%) dorsomedialis „shell” része között többnyire egyirányú rostkapcsolat van (SCN-core: GABA, GRP; SCNshell: GABAAR, BB2R)140-143: az SCN-shell robosztus oszcillátorait az SCN-core

szinkronizálja.

Az

oszcillátor-egységek

(sejtek)

fázisban

egymáshoz igazodhatnak szinaptikus kapcsolattal (axon-kollaterálisaik zöme nem hagyja el a magot134); vagy a jelentıségében talán jóval fontosabb parakrin szabályozás útján (e.g. SCN-core: VIP neuroszekréció, az egész magban VPAC2R expresszió144); vagy közvetlen sejtkapcsolattal

13

(SCN-core dendritfák között gap-junction145). Emlısökben az SCN a legfıbb cirkadián ritmusgenerátor, mert egyéb sejtszintő oszcillátorral (e.g. fibroblast, hepatocya146) ellentétben az SCN neuronok zeitgeber hiányában sem deszinkronizálódnak a fejlett intercelluláris kommunikáció miatt147. Az SCN elektrofiziológiai sajátságainak cirkadián ritmusát a sejtfelszíni ionotróp receptorok (e.g. NMDA-R) és ioncsatornák (e.g. L-VGCC) érzékenységének szabályozása biztosítja148. A ritmusos receptorfoszforilációban az ERK/MAPK kaszkád kulcsfontosságú konvergencia-útvonalnak tekinthetı147-157: (1) fıszerephez jut a molekuláris oszcillátor szignalizációjában Ca

2+

i

(E-box – RyR –

– CaMKIV – b-Raf – MEK1 – ERK1; ill. E-box – Homer – mGluR5 – PKC - L-VGCC - Ca2+i– CaMK IV –

b-Raf – MEK1 – ERK1),

(2) mediálja a szinkronizáló parakrin hatásokat

(VIP - VPAC2R - Gβγ – PLC - IP3 – PKC

- Ca2+i - CaMK IV – b-Raf – MEK1 – ERK1 – MSK – CREB – CRE – per),

(3) és közvetíti az afferensek (i.e. zeitgeber) fázist befolyásoló hatásait

(e.g.

RHT: Glu – NMDA-R - Ca2+i ... ERK1– MSK – CREB – CRE – per, ill. PACAP – PAC1R - G βγ – PLC - IP3 – PKC - Ca2+i ... ERK1 – MSK – CREB - CRE – per).

A per nappal, míg a clock és bmal expressziója éjjel mutat csúcsértékeket az SCN-ben147. Az óragének expressziós fázisgörbéi az SCN-ben diurnális és nokturnális életmódú emlısökben azonosak, mert az SCN oszcillátorai elsısorban a fényviszonyokhoz igazodnak147. A fény a retinorecipiens SCNcore neuronokban éjjel a c-fos, c-jun158 és a per159 gének kifejezıdését indukálja. Ezzel nemcsak a per expressziós ritmus, hanem az SCN által szabályozott összes jelentıs cirkadián ritmusú folyamat fázisgörbéje megváltozik. A fény-, vagy glutamát expozíció csak éjjel vált ki MAPK/CREB mediált c-fos és per indukciót149. A hatás fázisfüggısége a membránpotenciál és a szignáltranszdukció szintjén szabályozott. A másodlagos hírvivık elérhetısége tekintetében például nemcsak nappal és éjszaka van eltérés, hanem már a kora-esti (fény-…-RYR – Ca2+i)152 és a hajnali sötét fázisok között is (fény-…-nNOS – cGMP)155. A szabályozásban fontos szerepe lehet egy GEF fehérjének (Dexras1), mely ritmusos expressziója miatt (E-box) a PAC1 és VPAC2 G-proteinhez kapcsolt receptorokat periodikusan modulálja (Gα /AC/PKA és Gβγ /PLC/IP3/PKC útvonalak)160. A

14

RHT-on felszabaduló, és mindkét receptorhoz kötıdı PACAP így különösen fontos neuromodulátor a fény által kiváltott ERK1 – MSK – CREB – CRE – PER

Glu – NMDA-R - Ca2+i ...

szignáltranszdukció szabályozásában161.

A fény/sötét ciklushoz igazított fázisjelet az SCN neuronok többnyire a környezı hypothalamicus magok felé továbbítják162. Az SCN-hez képest jelentıs késést mutathatnak a fázisgörbék a diurnális/nokturnális életmódtól jelentısen függı cirkadián oszcillációk esetén162-164: (1) homeosztátok: testhımérséklet (SCN – vSPVZ – MPOA), energiaháztartás (SCN – dSPVZ - DMH);

(2) aktív/inaktív viselkedési mintázatok: alvás/ébrenlét (SCN – dSPVZ – DMHorx-LC; SCN – MPOA – VTA); lokomotoros aktivitás/inaktivitás (SCN-PVTlimbikus kéreg; parakrin szabályozással: VP, PK2, TGFα);

(3) autonóm idegrendszer: szimpatikus (SCN – PVN – IMLN – truncus sympathicus) és paraszimpatikus (SCN – PVN – DNV – n. vagus);

(4) hypothalamo-hypophysealis rendszer (ACTH: SCNVP – DMHGABA - PVNCRH – ME, TSH: SCN - PVNTRH - ME, GH: SCN - PVNSS - ME, FSH/LH: SCNVP – MPOAGnRH – ME, PRL: SCN – MPOADA/PVNDA/ARCDA - ME).

Az SCN által szinkronizált oszcillátorok óragén-expressziós ritmusgörbéinek SCN-hez viszonyított, jellemzı fáziskésését az érintett receptorok és jelátviteli útvonalak faj- és szövet-specifikus eltérései okozzák. Diurnális és nokturnális állatokban például az ébredést megelızı órákban (embernél késı éjjel, patkánynál késı délután) jelentkezı testhı-emelkedést és cortisol-szekréció fokozódást ugyanazok a – fény/sötét fázisátmenetekhez igazított – SCN-kimeneti jelek váltják ki (e.g. VP, GABA)165. Egy adott élettani paraméter cirkadián fázisgörbéjének pontos lefutását végsı soron a perifériás oszcillátorhoz különbözı idıpontokban és útvonalakon érkezı, gyakran ellentétes elıjelő, de 24 óránként ugyanolyan mintázatban ismétlıdı SCN-függı hatások összessége biztosítja (e.g. a gonádok endokrin és autonóm szabályozása166). A tobozmirigy (glandula pinealis) az SCN által vezérelt endokrin szervek között kitüntetett szereppel bír a cirkadián ritmusú szabályozásában:

15

(1) Keringı metabolikus zeitgeber-t biztosít (melatonin, MEL). A szekréció mintázata a környezeti fény/sötét átmeneteket (este, reggel) valós idıben tükrözi („sötétséghormon”), mert minden gerinces fajban – a diurnális /nokturnális életmódtól függetlenül - azonos fáziskéséssel (12 h) igazodik az SCN ritmushoz (SCN – PVN – IMLN – SCG – corpus pineale - melatonin release)167. A MEL receptorok (MT1 és MT2) mőködése és kifejezıdésük szöveti mintázata - az SCN efferensekhez hasonlóan - fajfüggı változatosságot mutat167. (2) Kulcsszerepe van az évszakok változásaihoz alkalmazkodó biológiai szabályozásban (fotoperiodizmus), mert a MEL ritmus amplitúdója a napi sötétperiódus hosszával arányos. A hypothalamus pars tuberalisában a GPCR családba tartozó és dózisfüggıen mőködı MT1 emlısökben alkalmas a

gonadotropin

rendszer

és

az

anyagcsere

szezonális

ritmusú

szabályozására168. (3) Amikor megvilágítással nem lehet megfelelıen befolyásolni az SCN oszcillátorait (e.g. vakság, jet lag), azokat sikeresen szinkronizálhatja az éjszakai plazmamennyiséggel arányos dózisú MEL kezelés (=zeitgeber)169, mert az SCN-core neuronok MT1-t és MT2-t fejeznek ki. A hatás csak az éjszakai sötét fázis elıtt 1-2 órával történı alkalmazás esetén említésre méltó, mert a jelátviteli útvonalak SCN-re jellemzı, idıben kapuzott szabályozása miatt a MEL-receptorkötés az SCN-ben csak nappal okoz PKA-függı per2, c-fos és c-jun repressziót, fázis-változással156. (4) A MEL az alvás/ébrenléti- és a testhı ritmusát is részben az SCN fázismodulálásával (zeitgeber) befolyásolja. A MT1 és MT2 agonista ramelteon (Rozerem) elalvást segítı hatása többnyire az alvás-szabályozás cirkadián ritmusos komponensének fáziseltolásával magyarázható (fázissiettetés)170. Az éjszakai csúcsú profilnak megfelelı plazmaszinteket eredményezı, lassan felszabaduló MEL készítmény (Circadin) az idıskori primer insomnia rövidtávú kezelésében bizonyult hatásosnak171. (5) Major depressio betegségben nemcsak az alvászavarok, hanem a depresszív tünetek kezelésében is használhatónak bizonyult az agomelatin (Valdoxan), mely egy MT1 és MT2 agonista és 5-HT2C antagonista szer, az antidepresszánsokéhoz képest kevesebb mellékhatással172.

16

A tobozmirigy és az SCN ritmusok fázisgörbéi nemcsak emlısökben, hanem minden gerinces fajban szorosan követik a környezeti fény/sötét fázisokat (MEL release éjjel, SCN-tüzelés nappali csúcsértékekkel)147,167. A látópálya közelében elhelyezkedı ezen fı struktúrák biztosítják a környezethez szinkronizált idegi és humorális zeitgeber jelet a napi ritmusú folyamatokban érintett perifériás oszcillátorok naponkénti beállításához. 1.4. A

MADÁR

TOBOZMIRIGY,

MINT

A

CIRKADIÁN

BIOLÓGIAI ÓRA MODELLJE A

toboztest

(corpus

pineale)

alapvetıen

gerincesekre

jellemzı,

diencephalicus eredető struktúra. Bár a MEL szekréció cirkadián ritmusa filogenetikailag meglehetısen konzervált funkció, a szerv mégis jelentıs faj-specifikus morfológiai (homlok-szem, fejtetı-szem, paprapinealis szerv, pinealis szerv/tobozmirigy), és funkcionális különbségeket mutat173-176. A madár tobozmirigy különösen alkalmasnak bizonyul a cirkadián ritmussal kapcsolatos szabályozómechanizmusok modellezésére173-176: (1) A nem-emlıs gerincesekben a koponyatetı közvetlen közelségében elhelyezkedı tobozmirigy és a kültakaró között a csontszövet vékony, fényáteresztı, vagy éppen teljesen hiányozhat is. (2) Halakban és kétéltőekben a hólyagszerő toboztest lumenét gliasejtek mellett fotoreceptorok bélelik, melyek hasonlítanak a retinában található csapocskákhoz. Apicalis kültagjuk a lumenbe nyúlik, beltagjuk a basalisan ülı idegsejttel szinaptizál. Kígyókban és emlısıkben a parenchymás tobozmirigy compact szerkezető, a pinealocyták nem rendelkeznek a fotoreceptorokra jellemzı kül- és beltaggal, a szervben nincsenek idegsejtek sem, és gliaelemek (interstitialis sejtek) is kisebb arányban fordulnak elı. Gyíkokban és madarakban átmeneti szerkezet figyelhetı meg. A csapocskáknak megfelelı módosult fotoreceptor sejtek folliculusokba tömörülnek, ahol a kültagok rendezetlenül helyezkednek el177, a beltagok pedig

nem

állnak

szinaptikus

kapcsolatban

idegsejtekkel178.

A

perifollicularis térben az emlısökéhez hasonló, nyúlványok nélküli pinealocyták találhatók. A pinealocyták és a fotoreceptorok egyidejő jelenléte arra

17

utalhat, hogy a pinealis progenitor sejtek differenciálódási iránya az ontogenezis egy pontján megváltozik, melyben a szimpatikus idegrostok beáramlásának döntı szerepe lehet179,180,218. (3) A

toboztest

halakban

és

kétéltőekben

a

retinához

hasonló

fényérzékszerv, mely hasonló fotopigmentekkel (e.g. melanopszin), és a kapcsolódó jelátviteli útvonalak megfelelıivel (cGMP-PKG, MAPK, CaMK) gátolja a MEL szintézist a fényintenzitással egyenes arányban. A receptorés a ganglionsejt rétegek közt nincsenek szabályozó interneuronok, így a szerv alapvetıen a fénymennyiség mérésére alkalmas (luminancia detektor). Az idegi efferentáció (pinealofugalis rostok) jelenléte miatt ezekben a fajokban a toboz-szerv a MEL válaszhoz képest lényegesen gyorsabban képes élettani folyamatokat fényfüggıen szabályozni. Az emlıs tobozmirigyben nincs sem közvetlen fényérzékelés, sem idegi kimenet, mely a ritmusos szabályozásban lényeges szerepet játszhatna. A gyors, fényintenzitás-függı biológiai szabályozás így alapvetıen a retina fotoreceptoraiból kiinduló polysynapticus pályákon valósul meg (e.g. RHT, GHT). A fény a tobozmirigy számára is a retina által szinkronizált, SCNmediált vegetatív szignálok formájában jelent zeitgeber-t (e.g. SCN – PVN – IMLN – SCG – corpus pineale). A pinealocyták β1 és α1 adrenerg receptor-

aktivációja a MEL szintézist PKA és PLC/MAPK függı jelátviteli utakon irányítja: diurnális állatoknál gátol, nokturnális életmódúaknál serkent181. A madár tobozmirigy a gerincesek MEL-termelı rendszerei között különleges átmenetet képvisel, mert mindkét bemeneti út mőködik: in vitro a MEL release amplitúdóját a közvetlen megvilágítás és az adrenerg (α2) stimulus egyaránt befolyásolja182-185. (4) A MEL szintézis gerincesekben mindkét fényérzékeléshez köthetı fı szervben ritmusos. A retinában termelt MEL csak lokális hatással bír (fényadaptáció)186, a keringı hormon mennyiségének napi ritmusa döntıen a tobozmirigy mőködésétıl függ. Halaknál a toboz-szerv sejtjeinek molekuláris oszcillátorait a fény közvetlenül szabályozza a per expresszió indukciójával187. In vitro DD környezetben a szerv-szintő ritmus 2-3 ciklus alatt lecseng, mert a sejtszintő

18

oszcillátorok fázisban nem tudnak egymáshoz szinkronizálódni, a reszinkronizációhoz ugyanakkor egyetlen rövid fényimpulzus elég188. Az emlıs tobozmirigy is tartalmaz hasonló biológiai oszcillátort, ahol a per indukciót és a sejtek szinkronizációját in vitro az adrenerg stimulus váltja ki189. In vitro DD környezetben emlısöknél is lecseng 2-3 ciklus alatt a szerv-szintő ritmus190. Mindez arra utal, hogy a toboztest ezekben a gerinces fajokban tipikus perifériás oszcillátorként mőködik. Madaraknál a tobozmirigy in vitro DD környezetben az emlıs SCN-nel összemérhetı ideig (>5 ciklus) képes szinkronizált ritmusban mőködni182185,191-193

, mely sejt-sejt közötti szinkronizáltságot feltételez. A madár

pinealocytákban közvetlen sejtkapcsolatok (gap-junction)194 és parakrin szabályozás195 állhat a koherens mőködés háttérben. Gyíkokban és madarakban a pinealectomia számos alapvetı cirkadián ritmus eltőnéséhez vezethet196,197, míg emlısökben ez nem okoz lényeges változást198. Az elsı anatómiailag körülírható struktúra, amit sikerült gerincesekben cirkadián óra-modellként azonosítani, épp a madár tobozmirigy volt196. A ritmuskutatás egyik alapkérdése, hogy az oszcilláció szerv-szintő kifejezésének autonóm képességét milyen tényezık formálják. A kérdés vizsgálatára olyan modell alkalmas, mely eredeti szöveti szerkezet mellett a neuroendokrin környezetébıl kivett állapotában is tükrözi az in vivo mőködés fıbb jellemzıit. Az emlıs SCN-bıl organotypicus in vitro modellt a mag kicsi mérete miatt agyszelet formájában lehet készíteni, mely az anatómiai értelemben vett cirkadián oszcillátor mellett a szomszédos struktúrákat is magában foglalja. Az SCN neuronokat tartalmazó diszpergált sejtkultúra viszont nem tükrözi a szinkronizált ritmus fenntartásában kulcsfontosságú sejt-sejt közötti in vivo viszonyokat. Továbbá, míg emlısökben az anyai humorális környezet zeitgeber-ként szolgál a cirkadián oszcillátorok fejlıdésében199, addig a nem-emlısök ontogenezise során a sejtszintő cirkadián ritmus kifejezıdése és szinkronizációja kizárólag a fizikai környezet és a genetikai program kölcsönhatásától függ. A már az embriókból is izoláltan kivehetı és egészben in vitro rendszerbe helyezhetı csirke tobozmirigy alkalmas modell a biológiai oszcillátor vizsgálatára.

19

A Pécsi Orvostudományi Egyetem Anatómiai intézetében a tobozmirigy mőködésének kutatása már a kezdetektıl nemzetközileg elismert szinten folyt Mess Béla vezetésével, aki alapító tag az európai szakmai társaságban (1977 - European Pineal Study Group, ma European Biological Rhythms Society). A 90-es években Csernus Valér és Rékási Zoltán az intézetben folyó

neuroendokrin

kutatásokban

használt

perifúziós

rendszert

továbbfejlesztették, így az akkor ismert legnagyobb idıfelbontású in vitro bioassay-vel vált lehetıvé a patkány és a csirke tobozmirigy mőködésének 5-10 napos folyamatos nyomon követése200,201. A MEL szekréció vizsgálatával többek között azt igazolták, hogy in vitro az emlıs tobozmiriggyel ellentétben a csirke tobozmirigy oszcillátorának fázisa az emlıs SCN oszcillátorhoz nagyon hasonló dinamikával változik185. Az 1990-es évek második felére az emlıs SCN, mint gerinces óramodell a genetikai módszerek széles skálájával vizsgálhatóvá vált, így az óragénmőködés molekuláris alapjainak feltérképezéséhez az ígéretes gerinces modellt ez adta. Az elsı eredmények a Science magazin éves összesítésében 1997. és 1998-ban is a 2. legérdekesebb felfedezést jelentették202,203. A madár tobozmirigyrıl nyert adatok száma eközben a töredékére csökkent. 1999-ben, amikor a PTE ÁOK Anatómiai Intézetben tudományos diákkörösként kezdtem munkámat, még a madár óragének létezésérıl sem volt adat. Ennek ellenére tőztük ki azt célul, hogy az óragén-expresszió szintjén ellenırizzük a korábbi, morfológiai és funkcionális adatok alapján kialakított hipotézist, miszerint a csirke tobozmirigy az emlıs SCN-hez képest egyszerőbben és elınyösebben kihasználható modell a ritmusos folyamatok mechanizmusainak vizsgálatára. 1.5. CÉLKITŐZÉSEK (1)

A munkánk kezdetén nem volt adat arról, hogy a csirke tobozmirigy

modell cirkadián órája milyen molekuláris (óragén-) komponensekbıl áll. Feltételeztük, hogy az emlısökben már leírt óragén-expressziós szabályozás állhat az autonóm oszcilláció hátterében. Ennek igazolására a csirke óragének azonosítását tőztük ki célul.

20

(2)

Az óragén-expresszió a perifériás oszcillátorként mőködı emlıs

tobozmirigyre is jellemzı, melynek cirkadián ritmusa patkányban in vivo 8 h fáziskésést mutat az SCN-ben leírt mintázatokhoz képest189,204. A csirke tobozmirigy óragén-expressziós mintázatának meghatározására normál fény/sötét (LD) körülmények között tartott csirkék vizsgálatát terveztük. (3)

Felmerült, hogy a pinealis fotoreceptorok mőködése az óragén-

expressziót is befolyásolhatja, mert a csirke tobozmirigy MEL ritmusa a 180o-kal késleltetett fény/sötét ciklusokhoz (DL) in vitro környezetben is gyorsan igazodik182,183,185,193. In vivo és in vitro kísérleteket terveztünk, hogy a

különféle

megvilágítási

körülmények

között

győjtött

adatok

összehasonlításával következtethessünk a pineális fotoreceptoroknak az óragén-expressziós szabályozásban betöltött szerepére. (4)

A ritmusos szabályozás megértéséhez hasznos megközelítés a

cirkadián óra ontogenetikus vizsgálata. A MEL szintézis egyik kulcsenzime, az AANAT mRNS-expressziója csirke tobozmirigyben a szerv szintjén csak az E17 stádiumtól válik ritmusossá in vivo LD körülmények között205-208. Annek tisztázására, hogy az ontogenezis e stádiumától a transzkripciós szabályozás hátterében állhat-e már a molekuláris oszcillátor szinkronizált mőködése, az elızıleg LD körülmények között inkubált E17 stádiumú embriók és az elızıleg LD környezetben tartott 6 hetes állatok 24-órás óragén-expressziós mintázatainak összehasonlítását terveztük. (5)

A tobozmirigy MEL szekréciója csirke embriókban in vitro DD

környezetben is ritmusos, de csak ha a tojások LD környezetben inkubálódnak az explantációt megelızıleg legalább az E17 stádiumig208. Ha az in ovo fejlıdés végig DD környezetben történik, a MEL termelés in vivo ritmusos mintázatát kiválthatja egyetlen, közvetlenül a kikelést követıen alkalmazott LD ciklus209. Mindezek alapján a sejtszintő oszcillátorok már a kikelés elıtt mőködnek, de szinkronizációjukhoz alapvetıen szükség lehet környezeti impulzusra. Ennek óragén-expressziós szintő igazolására in vivo és in vitro kísérleteket terveztünk DD körülményekben inkubált embriókon. (6)

A tobozmirigy sejtjeinek differenciálódását döntıen befolyásolhatja

a perifériás idegrostok megjelenése180,218, így ez a folyamat fontos szerepet

21

játszhat a csirke pinealocyták oszcillátorainak elindításában is. Az emlıs SCN neuronok idegi szinkronizálásában a PACAP egy jól ismert neuromodulátor. Már korábban felmerült, hogy ezzel a peptiddel szinkronizálódhat a madár tobozmirigy óramodell is, mert PACAPimmunpozitív rostvégzıdéseket, PAC1 és VPAC1 receptorokat, valamint az SCN-ben leírtakhoz hasonló jelátviteli útvonalakat egyaránt magában foglal210-212. A csirke tobozmirigy MEL ritmusgörbéjének bármely pontján alkalmazott PACAP kezelés alatt és az azt követı 2 órában a hormontermelés intenzitása fokozódik, a ritmus lényegi változása nélkül (∆φ = 0)210,211. Az adatok arra utaltak, hogy a PAC1R/VPAC1R ligandkötés csirke pinealocytákban az oszcillátort nem, csak a MEL szintézist befolyásolja, ahogy a patkány tobozmirigyben is213,214 (PKA/PKC/MAPK – AANAT, ill. PKA/MAPK – MSK – CREB – CRE – aanat).

Azonban a PACAP kezelés dózisa, vagy

idızítése ezekben a kísérletekben nem volt összemérhetı az emlıs SCN-ben hatásos kezelés (∆φ > 0) körülményeivel, ahol az óragének expresszióját befolyásoló jelátviteli utak PACAP-érzékenysége lényeges dózis- és fázisfüggı különbségeket mutat215,216. Így a korábbi adatok valójában nem zárják ki annak a lehetıségét, hogy a csirke tobozmirigy oszcillátorai mégis rendelkezhetnek az emlıs SCN-hez hasonló PACAP érzékenységgel. Arra a kérdésre kerestük a választ, hogy az emlıs SCN-nél leírtakkal hasonló idıben, és a hatásosnak leírt dózisban alkalmazott PACAP kezelés befolyásolhatja-e az óragének 24 órás expressziós mintázatát a DD körülmények között inkubált csirke embriók tobozmirigyében.

22

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

2.1.

Oligonukleotid PCR primerek

Munkánk kezdetén, 1999-ben még nem volt madár óragén-szekvencia ismert, így az egérben már leírt szekvenciákat vettük kiindulási alapul. Mivel a madár tobozmirigy fényérzékeny, így figyelmünk elıször a szintén fényérzékeny tulajdonságú óraprotein, a CRY1 génjére irányult. Az egér cry1 mRNS szekvenciája (GenBank Access Number NM007771.3) alapján kerestünk

az

akkor

elérhetı

csirke

EST

adatbázisban

hasonló

fragmentumokat (http://www.chick.manchester.ac.uk). A 86%-os azonosságot mutató egyetlen találat a csirke bursa Fabricii-bıl nyert, még azonosítatlan cDNS-szakasz volt (GenBank Access Number AJ398747.1). Erre a szekvenciára terveztünk oligonukleotid PCR primereket

úgy, hogy a

megfelelıi az egér cry1 génben intront tartalmazó szakaszt fogjanak közre (Primer3; http://frodo.wi.mit.edu). További tervezési szempont volt, hogy az RT-PCR termék 100-500 bp nagyságú legyen, a genomikus PCR termék pedig legalább 100-500 bp-ral hosszabb. Késıbb már több adat állt rendelkezésre a madár óragénekrıl. A per1, per2, per3, cry2, clock, bmal1 és bmal2 óragének vizsgálatára a primer-tervezéshez templátként az adatbankban elérhetı szekvenciákat használtuk (1. táblázat). A primerpárokat ezúttal is exon-intron átmenetet magában foglaló génszakaszokra terveztük úgy, hogy az RNS mintán végzendı RTPCR 150-500 bp nagyságú terméket eredményezzen, és az intronhossz legalább 100 bp legyen. Szempont volt az is, hogy a különféle gének RTPCR termékei méretük alapján egymástól elkülöníthetıek legyenek. Szemikvantitatív vizsgálatokhoz a csirke β-aktin génre228,231 terveztünk primerpárt a fentiekhez hasonló elvek alapján, hogy 500 bp nagyságú mRNS, ill. 800 bp nagyságú genomikus DNS fragmentum legyen amplifikálható (5’ primer: GATGGACTCTGGTGATGGTG, 3’ primer:

23

AGGGCTGTGATCTCCTTCTG). Az oligonukleotidokat az Integrated DNA Technologies-zel (beszállító: Csertex Kft.) szintetizáltattuk.

1. táblázat: PCR primerek óragének mRNS- és genomikus DNS detektálására csirkében. Az adatbankban elérhetı szekvenciákból olyan primer-párokat választottunk, melyekkel a táblázatban feltüntetett mérető RNS és genomikus DNS szakaszok detektálhatók.

2.2.

Vegyszerek

A szövetminták RNS-extrakciójához TRI reagenst (Sigma T9424), az RNSoldatokhoz és a PCR primer-oldatokhoz ultraszőrt, DEPC- (Sigma D5758) kezelt vizet használtunk. Az RT reakcióhoz MuLV reverz-transzkriptázt (Applied Biosystems N8080018), oligo- (Applied Biosystems N8080127) és mononukleotid keveréket (Sigma D7295); a PCR reakcióhoz Taqpolimerázt (Sigma D4309) és gyári puffer-oldatát alkalmaztuk. Az elektroforézishez TAE puffert és agaróz (Sigma A9539) gélt készítettünk, a nukleinsav festéséhez ethidium-bromidot (Sigma E1385) használtunk.

2.3.

Kísérleti állatok, szövetminták

Csirke mRNS és genomikus DNS mintákat fehér Leghorn típusú csirkékbıl vett egész tobozmirigybıl (5-8 mg/db) készítettünk (Pécs-Reménypuszta Baromfifeldolgozó Üzem). Az állatok szenvedésének minimalizálására nagy gondot fektettünk. A csirkék dekapitálására közvetlenül a mintavétel elıtt került sor.

24

2.4. Csirke

Nukleinsav tisztítás tobozmirigy

DNS

és

RNS

preparátumot

guanidium-

izotiocianát/kloroformos extrakciós módszerrel készítettünk217. A gyártó utasításaitól annyiban tértünk el, hogy a mintákat 0,5 ml TRI reagensben homogenizáltuk, és a tisztított nukleinsav üledéket DEPC-kezelt ultraszőrt vízben oldottuk fel. Az extraktum nukleinsav-tartalmát a 260 nm-en mért abszorbancia alapján számítottuk (Ultrospec Pro2100, Biochrom).

2.5.

mRNS és genomikus DNS kimutatása RT-PCR módszerrel

Az RT reakciókban 1 µg RNS-bıl készítettünk cDNS preparátumokat a gyártó utasításai szerint (MuLV, Applied Biosystems). A PCR reakciót mind a cDNS, mind a DNS minták esetében 250 ng kiindulási templátmennyiséggel 25 µl reakció-térfogatokban futtattuk (GeneAmp 7200 Thermal Cycler, Applied Biosystems) a gyártó utasításai szerint (REDTaq, Sigma). Az amplifikáció az összes vizsgált gén esetében 30 ciklusban történt az alábbi paraméterek mellett: 94oC 30s, 55-60oC 30s, 72oC 60s, majd az utolsó ciklus után 72°C 7 min. A PCR termékekbıl mintánként 10-10 µl-t töltöttünk az ethidium-bromiddal elıfestett, 3 mm vastag, 2%-os agaróz gélre. Az elektroforézis 1% TAE puffer közegben 200V, 100 mA és 7W szélsıértékek mellett 45 percig futott, szobahımérsékleten. A fluoreszcens jelet UV gerjesztéssel nyertük, a gélfotót KODAK géldokumentációs rendszerrel készítettük.

2.6.

PCR termékek szekvenálása

A csirke tobozmirigy mRNS és DNS mintákból a cry1 specifikus primerekkel nyert RT-PCR termékeket 2001 májusában szekvenáltattuk a PTE ÁOK Patológiai Intézetben. Az eljárást Csernus Balázs végezte Matolcsy András molekuláris biológiai laboratóriumában. A cry2 és clock specifikus primerekkel nyert RT-PCR termékeket 2008 májusában

25

szekvenáltattuk a PTE ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézetben. Az eljárást Peti Attila végezte Miseta Attila molekuláris biológiai laboratóriumában.

2.7.

Szemikvantitatív RT-PCR

Az óragén-expresszió változásainak méréséhez szemikvantitatív RT-PCR módszert állítottunk be. Az RT reakció hatásfoka és a kiindulási RNS mennyiségek mintánkénti különbségeibıl adódó eltérések normalizálására belsı standardot alkalmaztunk. Erre a célra a csirke embriókon végzett összehasonlítás alapján alkalmasnak leírt β-aktint választottuk231. A β-aktinexpresszió nem mutat cirkadián ritmust csirke tobozmirigyben228. Az izolált tobozmirigy minták RNS extraktumainak vizsgálatára egylépéses RT-PCR eljárást dolgoztunk ki. Ehhez a fent leírt két enzimet (RT, Taq, 2.2. rész) használtuk egy csıben, tehát az RT reakcióban is génspecifikus PCR primerek szerepeltek. Az egylépéses protokollhoz optimalizált paraméterek a következık voltak: templát szintézis 42oC 15 min, denaturáció 94oC 5 min, amplifikáció 26 ciklusban (94oC 30 s, 60oC 30 s, 72oC 1 min), és végül 72oC 7 min. A protokollt a clock, cry1 és cry2 primereinkre sikerült beállítani, 1,5 mM Mg2+ koncentráció mellett. Az

RT-PCR

termékeket

a

reakcióelegy

5-5

µl-ének

agaróz-

gélelektroforézisével választottuk el. A fent leírt módszertıl (2.5. rész) annyiban tértünk el, hogy a gélt ethidium-bromid elıfestés helyett az elektroforézis után festettük SYBR Green I-gyel (Sigma S9430), majd a gélt kék fénnyel világítottuk át (Dark Reader, Clare Chemical, USA). A fluoreszcens jel detektálásához az általunk összeállított dokumentációs rendszert használtuk (sötétkamra, amber filter színszőrı - Clare Chemical, Canon A510 digitális fényképezıgép). A PCR termékek SYBR Green fluoreszcenciáját a gélfotókon látható DNS csíkok átlagos, háttérértékekkel korrigált pixel-intenzitásából határoztuk meg (Image-J, NIH; 2. ábra). Az óragén RT-PCR termékek fluoreszcenciáját a β-aktin fluoreszcenciájához normalizáltuk: az így nyert relatív fluoreszcencia értékeken végeztük a statisztikai próbákat.

26

Aktin

Cry1

Aktin

Cry1

Aktin Clock

Aktin Clock

2. ábra: Óragén RT-PCR termékek mennyiségi vizsgálata. Az ábrán a csirke tobozmirigyek 200 ng-nyi RNS extraktumaiból β-aktin és cry1, vagy β-aktin és clock primerekkel egylépéses RT-PCR-ban nyert termékek reprezentatív gélfotói láthatók. Az ImageJ programmal készített hisztogramok a fotón pontozott vonallal körülhatárolt gélsáv pixelintenzitását mutatják (y-tengely) az elektroforézis irányában (x-tengely).

Az

mRNS

készítettünk.

expresszió Elıször

mennyiségi homogén

vizsgálatához

RNS

mintát

standardgörbéket

készítettünk

csirke

tobozmirigyekbıl, melyen specifikus primerekkel RT-PCR reakciót futtattunk. Az RT-PCR termékeket extraháltuk a gélbıl (GenElute spin columns, Sigma 5-6501), és az eluátumok koncentrációját 260 nm-en mért abszorbanciájukból meghatároztuk. Az eluátumokat 2:1-es hígítási sorban PCRamplifikáltuk úgy, hogy minden csıbe azonos mennyiségő (100 pg) β-aktin

27

PCR terméket adtunk (3. ábra). A hígítási sorból nyert PCR termékek közötti

fluoreszcencia-különbségeket

statisztikailag

ellenıriztük.

A

standardgörbékhez meghatároztuk az egységnyi fluoreszcencia-változással járó kiindulási cDNS-mennyiség eltérést: a hígítási sorhoz tartozó fluoreszcencia-különbségekbıl extrapoláltunk, de csak az exponenciális tartományba esı fluoreszcencia adatokat vettük figyelembe.

3. ábra: Standard görbék óragén-cDNS PCR termékek mennyiségi vizsgálatához. A: 100 pg aktin cDNS mellett cry1 és clock cDNS-ek 2:1-es hígítási soraiból nyert PCR termékek reprezentatív gélfotója. B: A PCR termékek fluoreszcenciája (átlag +/- SEM, n=3) a kezdeti óragén cDNS mennyiség függvényében. cry1: teli négyzet, clock: teli kör, az aktin fluoreszcenciák szaggatott vonallal összekötve (cry1: üres négyzet, clock esetén: üres kör). C: Az egységnyi fluoreszcencia-változáshoz tartozó kezdeti cDNS-mennyiség változás standardgörbéi (cry1: teli négyzet, clock: üres kör).

A cry1 és clock DNS fragmensek 2:1-es hígítási soraiból nyert PCR termékek közötti fluoreszcencia-különbségek 26 ciklus mellett a 1.5–25 pg kezdeti DNS mennyiségeknél voltak mérhetıek (3. ábra). Módszerünkkel a PCR termékek 2-szeres relatív (β-aktinhoz viszonyított) fluoreszcencianövekedése legalább 1,4-szeres (clock) és 2,4-szeres (cry1) kezdeti cDNS mennyiség-különbségekkel korrelált.

28

Az egységnyi fluoreszcencia-változással járó kiindulási RNS-mennyiség eltérés meghatározásához homogén tobozmirigy-RNS mintából készítettünk 2:1-es hígítási sort, melyen RT-PCR reakciót futtattunk (4. ábra).

4. ábra: Standard görbék óragén-mRNS RT-PCR termékek mennyiségi vizsgálatához. A: Csirke tobozmirigy össz-RNS 2:1-es hígítási soraiból nyert RT-PCR termékek reprezentatív gélfotója. B: Az RT-PCR termékek fluoreszcenciája (átlag +/- SEM, n=3) a kezdeti RNS mennyiség függvényében. cry1: teli négyzet, clock: teli kör, az aktin fluoreszcenciák szaggatott vonallal összekötve (cry1 esetén: üres négyzet, clock esetén: üres kör). C: Az RT-PCR termékek aktinhoz viszonyított fluoreszcenciája (átlag +/- SEM, n=3) a kezdeti RNS mennyiség függvényében (cry1: teli négyzet, clock: üres kör). D: Az egységnyi fluoreszcencia-változáshoz tartozó kezdeti RNS-mennyiség változás standardgörbéi (cry1: teli négyzet, clock: üres kör).

Az RNS hígítási sorból nyert RT-PCR termékek közötti fluoreszcenciakülönbségeket statisztikailag ellenıriztük. A standardgörbékhez az RNS hígítási sorból nyert fluoreszcencia-különbségeket extrapoláltuk (itt is csak

29

az

exponenciális

tartományba

esı

fluoreszcencia

adatokat

vettük

figyelembe). A csirke tobozmirigy RNS extraktumok 2:1-es hígítási soraiból nyert RT-PCR termékek közötti fluoreszcencia-különbségek szintén 4 hígításban voltak mérhetıek (4. ábra A, B). Módszerünkkel az RT-PCR termékek 2-szeres, β-aktinhoz nem normalizált fluoreszcencia-növekedése legalább 2,2-szeres (clock) ill. 3-szoros (cry1) kezdeti RNS mennyiségkülönbségekkel korrelált (4. ábra, D). A β-aktinhoz viszonyítva az RT-PCR termékek 25–400 ng kezdeti RNS mennyiségek mellett nem mutattak fluoreszcencia-eltérést (4. ábra, C). Kísérleteinkben az RNS extrakciót 24, az RT-PCR-t 96, és az elektroforézist 32 mintás assay-ben végeztük. A tobozmirigy RNS mintákból egy RT-PCRhoz egységesen 200 ng-ot használtunk fel mintánként. Az egy kísérleti csoporthoz tartozó összes mintát triplikátumokban, kontrollal (+ és – templát) együtt egy RT-PCR assay-ben határoztuk meg. Az RT-PCR termékek mért, nyers, relatív SYBR Green fluoreszcencia értékeit a cDNS standardokhoz

viszonyítottuk,

méretkülönbségeivel

is

(1.

majd

táblázat)

azokat korrigáltuk.

a

transzkriptek Az

így

nyert,

transzformált, becsült mRNS mennyiségi adatokat grafikonon ábrázoltuk. A statisztikai próbákat a nyers adatokon, vagyis a β-aktinhoz normalizált fluoreszcencia értékeken végeztük.

2.8.

In vivo kísérletek

Fertilizált Leghorn csirketojásokat (Bólyi Keltetı Üzem) inkubáltunk a keltetésig LD (14h fény/10h sötét) vagy DD környezetben, állandó hımérsékleten (37,8oC), páratartalmon (55-70%), és gépi (2 óránkénti) tojásforgatás mellett (Hemel Brutmaschine A70). A kikelt csirkéket további 6 hétig tartottuk normál fény/sötét viszonyok közt, ahol víz és csirketáp szükség szerint volt elérhetı. A fényforrás minden esetben fehér fényő izzó volt, a tojásokat átlagosan 400 Lux, a csirkéket 600 Lux intenzitású fény érte. Az in vivo vizsgálatoknál a kísérlet napján kísérleti csoportonként 3-3 azonos fejlıdési stádiumú csirkét dekapitáltunk 2, vagy 4 óránként. A min-

30

ták győjtése 12, 24, vagy 36 órán át tartott. Az eltávolított tobozmirigyeket egészben, egyenként homogenizáltuk 0,5 ml TRI reagensben. A homogenizátumokat a meghatározásig -70oC-on tároltuk.

2.9.

In vitro kísérletek

Az in vitro vizsgálatoknál a csirkéket a kísérlet napján 12:00-kor dekapitáltuk. A 6 hetes csirkékbıl (n=6) eltávolított tobozmirigyeket egyenként 3-4 darabra vágtuk, és az így nyert szövetdarabok keverékét 6 csoportra osztottuk, majd ezeket perifúziós rendszer16 (5. ábra) 6 cellájába helyeztük. A csirke embriókból (n=18 db) eltávolított tobozmirigyeket egészben helyeztük a perifúziós rendszer 6 cellájába (cellánként n=3). A cellákon a szövettenyésztı médium (Sigma Medium 199) átáramlási sebessége 4 ml/h, hımérséklete 37,8oC volt, LD (14h 225 Lux, 10h sötét), vagy DD környezetben. A mintavételt a rendszer elindítása után 30 h-val kezdtük (másnap 18:00): minden 4. órában egy cella tartalmát győjtöttük. A felnıtt állatokból származó szövetmintákat cellánként egy adagban, az embriókból

nyert

szövetmintákat

cellánként

3

külön

adagban

homogenizáltuk, adagonként 0,5 ml TRI reagensben. A mintákat -70oC-on tároltuk a meghatározásig. A PACAP-expozíciós kísérletben a második mintavételt megelızı 1 órában (20:00-21:00) a 2-6. cellákon 10 nM PACAP-38 (Sigma A1439) kezelést alkalmaztunk. A peptidet elızıleg szövettenyésztı médiumban oldottuk fel, majd a szükséges hígítást közvetlenül a kezelés elıtt készítettük el a rendszerben használttal azonos hımérséklető, légzési gázokkal azonos mértékben telített médiummal. A kezeléshez a perifúziós rendszert nem kellett megállítani (csap, 5. ábra).

31

Termosztát

5% CO2 95% levegı

Csapok Vízfürdı Mintabeadó Cellák

Frakciókollektor

Perisztaltikus pumpa 5.

ábra.

Perifúziós

rendszer

többcsatornás állvánnyal (sémás rajz Termosztát

és fotó). A médium 1 mm belsı átmérıjő

tefloncsövön

áramlik

a

vízfürdıben tartott lombikból egy 4 állású csapon át a cellához (Ann

Vízfürdı

Arbor Plastics, Michigan, USA), majd a

perisztaltikus

pumpán

át

a

győjtıedénybe. Az elfolyó médium

Cellák

MEL meghatározását (RIA) nem Csapok

Perisztaltikus pumpa

minden esetben végeztük el, azok eredményeit

a

dolgozat

nem

tartalmazza. A rajzot Matkovits Attila készítette.

2.10. Statisztikai analízis A standardgörbék készítésekor a hígítási sorokból nyert (RT)-PCR termékek közötti

fluoreszcencia-különbségeket

homoszcedasztikus, egyvégő) ellenıriztük.

32

t-próbával

(egymintás,

Az in vivo kísérleteknél a különbözı idıpontokban győjtött minták közti különbségeket varianciaanalízissel (egy-utas ANOVA) és Tukey-féle post hoc teszttel határoztuk meg. A normál LD ciklustól eltérı megvilágítás hatásait az óragén-expresszió 24 órás mintázatára szintén varianciaanalízissel (két-utas ANOVA) és kétmintás t-próbával (kétmintás, kétvégő, egyenlıtlen varianciájú) vizsgáltuk. Az in vitro kísérleteknél a 6 hetes csirkékbıl származó, egy kísérleten belül különbözı idıpontokban győjtött minták közti különbségeket nonparamertikus módszerrel határoztuk meg. A különbözı idıpontokban győjtött minták közti különbségeket Wilcoxon-féle elıjeles rang próbával, a normál LD ciklustól eltérı megvilágítás hatásait az óragén-expresszió 24 órás mintázatára Mann-Whitney-féle u-teszttel vizsgáltuk. Az embriókból származó, egy in vitro kísérleten belül különbözı idıpontokban győjtött minták közti különbségeket varianciaanalízissel (egy-utas ANOVA) és Tukey-féle post hoc teszttel határoztuk meg. A PACAP-38 kezelés hatásait az óragén-expresszió 24 órás mintázatára szintén varianciaanalízissel (kétutas ANOVA) és kétmintás t-próbával (kétmintás, kétvégő, egyenlıtlen varianciájú) vizsgáltuk. Szignifikancia-határnak p=0,05-öt tekintettük minden statisztikai próbánál.

33

3. ÓRAGÉNEK AZONOSÍTÁSA CSIRKE TOBOZMIRIGYBEN

3.1.

EREDMÉNYEK

Az általunk tervezett oligonukleotid primerpárok közül mindegyikkel sikerült csirke tobozmirigy RNS preparátumból diszkrét nagyságú RT-PCR terméket nyerni (6. ábra). A reakciókban a tervezetthez (1. táblázat) nagyságban hasonló termékeket kaptunk.

6. ábra: Csirke tobozmirigy RNS-extraktum RT-PCR reakciótermékei agaróz gélen. Ethidium-bromid festés, UV. Reakció paraméterek: A: RT-ban random hexamer primerek, PCR-ban Ta=60oC, Mg2+=2,5 mM volt. A DNS marker melletti sáv templát nélküli kontrollt jelez. B: RT-ban specifikus primerek, PCR-ban Ta=55oC, Mg2+=1,5 mM volt.

Az RT-PCR paraméterek kisebb változtatásai mellett minden alkalommal detektáltuk a bmal1, bmal2, per2, cry1 és cry2 gének mRNS-eit. Clock, per1 és per3 termékeket ugyanakkor csak eltérı PCR paraméterek mellett

34

sikerült kimutatni. A per1, per3 és cry1 esetében megjelenı másodlagos, halványabb csíkok közül a cry1 méretben megfelelt az intront is tartalmazó DNS szakasz várt méretével. A cry1 cDNS és genomiális DNS szakasz szekvenciáinak meghatározása alapján a homológia az emlıs és csirke cry1 gén között a vizsgált cDNS szakaszon 86%-os, a várt arányú volt (7. ábra). 5`GAATGCTGGAAGCTGGATGTGGCTATCCTGTAGTTCCTTCTTTCAGCA GTTTTTTCACTGCTGCTGTCCAGTGGGTTTTGGCAGAAGAACTGACCCAA ATGGAGATTACATCAGGTAATTCACAGTCCAGAATTCTCAGTAATTCACTGAC GTTGTCAACTAGCTCTATATTTAAAATGGATTGTTTTCTTTTCTTCAAAGACGTT ACTTGCCTGTACTTAGAGGTTTCCCTGCAAAATACATCTATGATCCTTGG AATGCCCCAGAGAGTGTCCAGAAGGC`3 7. ábra: A csirke cry1 PCR termék szekvenciája. A cry1 génre tervezett primerek félkövéren jelölve. A csirke tobozmirigy DNS és RNS mintákból amplifikált 300 bp ill. 200 bp termékek közötti szekvencia-különbség (intron) dılt betővel jelölve. A csirke és egér homológ génszakasz közti nukleotid-eltérések aláhúzva.

E18 stádiumú csirke embriókban a clock, bmal1, bmal2, per2, per3 és cry1, cry2; míg E15 embriók esetében a clock, bmal2, cry1 és cry2 óragének expresszióját sikerült kimutatni csirke tobozmirigyben (8. ábra). 8. ábra: Csirke embriókból nyert tobozmirigy RNS minták RT-PCR reakciótermékei, Ta=60oC, agaróz gél, ethidiumbromid festés. A:

E18

embriókból

nyert

termékek, reakciónként 1,5-22,5 mM Mg2+ koncentráció mellett. B:

E15

termékek,

embriókból templát

kontrollal (k).

35

nyert nélküli

3.2.

MEGBESZÉLÉS

A csirke tobozmirigybıl az általunk tervezett PCR primerrel azonosított cry1 génszakasz a tervezésnek megfelelı mértékben hasonlított az eredeti, csirke EST adatbázisban talált azonosítatlan fragmensre is és az egér cry1 génre is (7. ábra), így a primer-tervezést és a madár cry1 gén mRNS-ének azonosítását sikeresnek tekintettük. A genomikus DNS-bıl nyert PCRtermék intron-szakasznak megfelelı része 98%-ban megegyezett a 2001 novemberében más kutatócsoport által azonosított csirke cry1 génben megtalálható szakasszal220, mely az egér genomban nem fordul elı. A bmal1, bmal2, per1, per2, per3, clock és cry2 óragének expressziójának kimutatására tervezett primerjeinkkel a várt nagyságú PCR-termékeket nyertük (1. táblázat, 6., 8. ábra). A cry1 mellett a cry2 és a clock primerek mőködtek megbízhatóan az általunk késıbb standardizált egylépéses szemikvantitatív RT-PCR módszerben. A cry2 és clock PCR termékek szekvenciáját ekkor ellenıriztük, melyek 99%-ban azonosnak bizonyultak a tervezéshez használt templátokkal. A többi génével ellentétben per1 expressziót nem sikerült reprodukálható módon kimutatnunk, és továbbra sincs irodalmi adat a madár per1 gén létezésérıl. Eredményeink

számos

más,

idıközben

megjelent

közleménnyel

összhangban alátámasztják, hogy a madár tobozmirigyben az emlıs óragének homológjai kifejezıdnek219-230. Némelyikükben igazolták a csirke CLOCK/BMAL óraprotein-komplex in vitro körülmények közötti E-box kötıdését, transzkripciós aktiváló szerepét, és ennek gátlását csirke CRY1 proteinek ko-expressziója esetén 220,221,225,230. Mindezen adatok arra utalnak, hogy a csirke tobozmirigy autonóm oszcillációja hátterében az emlısökben már leírt óragén-expressziós feed-back szabályozás állhat.

36

4. FÉNY HATÁSA AZ ÓRAGÉN MRNS-EXPRESSZIÓRA

4.1.

EREDMÉNYEK

4.1.1. Fény hatása az óragén expresszióra in vivo (1) A cry1 mRNS expresszió 24 órás mintázata in vivo LD ciklusban. 6 hetes csirkéket (n=21) tartottunk elızıleg normál 14/10 órás LD körülmények között, majd a kísérlet napján a mintavételt 9:00-kor, a sötét periódus után 3 órával kezdtük. A cry1 expresszió 24 órás mintázata csirke tobozmirigyben kétfázisúnak bizonyult: maximumot 17:00-kor, minimumot 12 órával késıbb, 5:00-kor mértünk (9. ábra).

9. ábra: cry1 mRNS szintek változása csirke tobozmirigyben in vivo LD viszonyok között. A reprezentatív gélfotón idıpontonként 2-2 minta RT-PCR termékei láthatóak. A 300 bp nagyságú termék cry1 genomikus DNS kontaminációt és az utolsó sávban cry1 DNS kontrollt jelez. Az üres/teli vízszintes sáv a környezeti fényviszonyokat jelzi. A görbe minden idıpontban a cry1 mRNS-expresszió átlagát (n=3) ábrázolja.

37

(2) A cry1 expresszió változása in vivo éjszakai megvilágítás hatására. Elızıleg LD körülmények között tartott, 6 hetes csirkék (n=36) egyik csoportját („exponált” csoport, n=18) a kísérlet napján a sötét fázis kezdetén (20:00) további 10 óráig megvilágítottuk, mialatt a kontroll csoport („kontroll”, n=18) sötétben volt. A tobozmirigy mintákat 20:00 és 6:00 között győjtöttük. A cry1 expresszió a kontroll csoportban fokozatosan csökkent (10. ábra). Minimumot, 70%-os mRNS szinteket 2:00-tól mértünk. Az exponált csoportban elıször 50%-kal alacsonyabban (22:00), majd 6 óra múlva (4:00) ismét az eredeti tartományban mértük a cry1 mRNS szinteket. A kontrollhoz viszonyítva 22:00 órára csökkent (50%), 4:00 és 6:00 órára növekedett (140%) a cry1 expresszió.

10. ábra: Éjszakai megvilágítás hatása csirke tobozmirigy cry1 mRNSexpressziójára in vivo. A vízszintes sávok a környezeti fényviszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). A görbe minden idıpontban a cry1 mRNS-expresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolja az „exponált” (teli négyzet) és a „kontroll” (üres négyzet) csoportban. A két csoport között mért szignifikáns különbségeket * jelzi.

38

(3) A cry1 és clock expresszió változása in vivo éjszakai megvilágítás hatására. 6 hetes csirkéket (n=18) tartottunk elızıleg LD körülmények között. A kísérlet napján az egyik csoportot („exponált” csoport, n=9) a sötét fázis kezdetén (20:00) további 6 óráig megvilágítottuk, míg a másik csoport („kontroll” csoport, n=9) sötétben volt ez idı alatt (20:00-tól). A tobozmirigy mintákat 18:00 és 2:00 között győjtöttük. Az exponált csoportban a cry1

expresszió

22:00-kor lényegesen

alacsonyabb (20%), a clock pedig valamivel magasabb volt (115%) a kontrollhoz képest (11. ábra).

11. ábra: Éjszakai megvilágítás hatása csirke tobozmirigy cry1 (A) és clock (B) mRNSexpressziójára in vivo. A vízszintes sávok a környezeti fény-viszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). Az oszlopok minden idıpontban a relatív mRNS expresszió átlagát + SEM (n=3) ábrázolják az exponált (teli) és a kontroll (üres) csoportban. A két csoport között mért szignifikáns különbségeket * jelzi.

39

(4) A cry1 mRNS-expresszió 24 órás mintázata in vivo fordított megvilágításban. Elızıleg LD körülmények között tartott, 6 hetes csirkék (n=36) egyik csoportját a kísérlet napján a sötét fázis kezdetén (20:00) további 14 órára megvilágítottuk, majd a csirkék 10:00-tól 20:00 óráig sötétben, végül 20:00-tól a kísérlet végéig ismét világosban voltak (DL, „fordított” csoport, n=18). A „kontroll” csoport (n=18) ez idı alatt normál LD körülmények között volt. A tobozmirigy mintákat a kísérlet második napján 6:00-tól győjtöttük. A cry1 expresszió a kontroll csoportban 18:00-ig növekedett, majd ezután 2:00-kor érte el a minimumot (12. ábra). A fordított csoportban a cry1 mRNS szint 14:00-ig folyamatosan csökkent, majd ezután 2:00-kor érte el a maximumot. A kontrollhoz viszonyítva 6:00 órára növekedett (140%), 14:00 órára csökkent (30%), majd 2:00 órára ismét növekedett (200%) a cry1 expresszió.

12. ábra. Fordított fény/sötét ciklus (DL) hatása csirke tobozmirigy cry1 mRNS-expressziójára in vivo. A vízszintes sávok a környezeti fényviszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). A görbe minden idıpontban a cry1 mRNSexpresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolja a „fordított” (teli négyzet) és a „kontroll” (üres négyzet) csoportban. A két csoport között mért szignifikáns különbségeket * jelzi.

40

(5) A cry2 mRNS-expresszió 24 órás mintázata in vivo fordított megvilágításban. Elızıleg LD körülmények között tartott, 6 hetes csirkék (n=36) egyik csoportját (DL, „fordított” csoport, n=18) a kísérlet napján a sötét fázis kezdetén (20:00) további 14 órára megvilágítottuk, majd a csirkék 10:00-tól 20:00 óráig sötétben, végül 20:00-tól a kísérlet végéig ismét világosban voltak. A „kontroll” csoport (n=18) ez idı alatt normál LD körülmények között volt. A tobozmirigy mintákat a kísérlet második napján 6:00-tól győjtöttük. A cry2 expresszió a kontroll csoportban 18:00-ig növekedett, majd ezután 2:00-kor érte el a minimumot (13. ábra). A fordított csoportban a cry2 mRNS szint 6:00-22:00 között lényegében nem változott, 18:00-2:00 között 70%-ára csökkent. A kontrollhoz viszonyítva 14:00-18:00 között mértünk csökkent cry2 mRNS mennyiségeket (70% és 50%).

13. ábra. Fordított fény/sötét ciklus (DL) hatása csirke tobozmirigy cry2 mRNSexpressziójára in vivo. A vízszintes sávok a környezeti fényviszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). A görbe minden idıpontban a cry2 mRNS-expresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolja a „fordított” (teli kör) és a „kontroll” (üres kör) csoportban. A két csoport között mért szignifikáns különbségeket * jelzi.

41

4.2.1. Fény hatása az óragén expresszióra in vitro (1) A cry1 és clock expresszió változása in vitro éjszakai megvilágítás hatására. Az elızıleg LD körülmények között tartott 6 hetes csirkékbıl (n=9) perifúziós rendszerbe helyezett tobozmirigyek (cellánként 3db) az elsı napon LD környezetben voltak. A kísérlet második napján a perifúziós rendszert 20:00-kor további 6 óráig megvilágítottuk („exponált” kísérlet). Egy másik in vitro kísérlet végig az eredeti LD ciklusokban futott („kontroll” kísérlet). A tobozmirigy mintákat mindkét kísérletben 18:00 és 2:00 között győjtöttük. Az in vitro exponált és az in vitro normál LD környezetben győjtött adatok között sem a cry1, sem a clock esetében nem találtunk szignifikáns eltérést (14. ábra). 14. ábra: A fény hatása csirke tobozmirigy cry1 (A) és clock

(B)

szintjeinek sára

mRNS változá-

in

vitro.

A

sávok

a

vízszintes

környezeti fényviszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). Az oszlopok minden idıpontban

a

relatív

mRNS expresszió átlagát (n=3) ábrázolják az exponált (teli) és a kontroll (üres) csoportban.

42

(2) A cry2 expresszió 24 órás mintázata in vitro fordított megvilágításban. Az elızıleg LD körülmények között tartott 6 hetes csirkékbıl (n=18) perifúziós rendszerbe helyezett tobozmirigyek (cellánként 3 db) az elsı napon LD környezetben voltak. A kísérlet második napján a perifúziós rendszert 20:00-kor további 14 óráig megvilágítottuk, majd 10:00-tól 20:00 óráig sötét, végül 20:00-tól a kísérlet végéig ismét világos volt (DL, „fordított” kísérlet). Egy másik in vitro kísérlet végig az eredeti LD ciklusokban futott („kontroll” kísérlet). A tobozmirigy mintákat mindkét kísérletben a kísérlet második napján 18:00-tól győjtöttük 4 óránként. A cry2 expresszió a kontroll csoportban 6:00-ig növekedett (sötétben), majd ezután csökkent (15. ábra). A fordított csoportban a cry2 mRNS szint a vizsgálat ideje alatt folyamatosan csökkent (50%-ára). A kontrollhoz viszonyítva 2:00-14:00 között mértünk csökkent cry2 mRNS mennyiségeket (40%-70%).

15. ábra. Fordított fény/sötét ciklus (DL) hatása csirke tobozmirigy cry2 mRNSexpressziójára in vitro. A vízszintes sávok a környezeti fényviszonyokat jelzik (üres: fény, teli: sötét). A görbe minden idıpontban a cry2 mRNS-expresszió átlagát (n=3) ábrázolja a „fordított” (teli kör) és a „kontroll” (üres kör) csoportban. A két csoport között mért szignifikáns különbségeket * jelzi.

43

4.3.

MEGBESZÉLÉS

(1) Az óragén-expresszió 24 órás mintázata in vivo LD környezetben. A cry1 expressziós mintázata csirke tobozmirigyben napi ritmust mutat (9., 10., 12. ábra), mely eredményünk összhangban áll a vizsgálataink ideje alatt megjelent közleményekkel is220,223,224,228. Mindezen eredmények alapján maximális mRNS szintek a koraesti-esti órákban mérhetık, az alkalmazott megvilágítási ciklusoktól függıen (12h/12h, 14h/10h, vagy 16h/8h LD), az mRNS detektálási módszertıl függetlenül. A cry1 expressziós mintázata csirke tobozmirigyben nem az emlıs tobozmirigyhez hasonló (ott hajnalban van maximuma232), hanem az emlıs SCN-éhez (itt is este van maximuma233,234). Eredményeink alapján a cry2 expressziós mintázata ritmusos in vivo csirke tobozmirigyben (13. ábra). Maximális cry2 mRNS szintek a cry1 mintázatához hasonlóan a koraesti-esti órákban mérhetık. Adataink összhangban vannak az irodalomban korábban leírtak többségével224,227. Egy további

munkacsoportnak

nem sikerült

cry2

mRNS

ritmust

detektálni223, míg egy másik a cry1 mintázatától 180o-ban eltérı cry2 expressziós fázisgörbét írt le madár tobozmirigyben in vivo228. A különbséget részben az alkalmazott detektálási módszer223, részben az eltérı madárfaj magyarázhatja228. Adataink szerint a cry2 24 órás expressziós mintázata csirke tobozmirigyben szintén nem az emlıs tobozmirigyéhez hasonló (ott hajnalban van maximuma232), hanem az emlıs SCN-éhez (itt is este van maximuma233,234). A per gének expressziós fázisgörbéje a cry génekéhez képest 180o-ban eltérı fázisgörbét mutat (1. ábra ábrafelirata) csirke tobozmirigyben és az emlıs SCN-ben egyaránt, reggeli maximumértékekkel219,224,227,228,234. Egérben csak a per1 és per2 ritmusos, madárban nincs per1, de a per3 is ritmusos, így a fázisgörbék alapján a madár per2 az emlıs per2, míg a madár per3 az emlıs per1 gén szabályozásával állítható párhuzamba219,227,235. A bmal és a clock gének expressziós ritmusa este-éjszaka mutat maximumértékeket csirke tobozmirigyben219,224,225,227,230 és az emlıs SCN-

44

ben is236,237. A clock gén expressziós ritmusa mindkét modellben lényegesen kisebb amplitúdójú, olyannyira, hogy bizonyos közleményekben nem mutattak ki mRNS–szintő oszcillációt222,230,238. Mindezek arra utalnak, hogy a csirke tobozmirigy óramodell az in vivo óragén-expressziós fázisgörbéi alapján nem az emlıs tobozmirigyhez, hanem az emlıs SCN oszcillátoraihoz hasonlítható. (2) Az óragén-expresszió 24 órás mintázata in vitro LD környezetben. A csirke tobozmirigy cry1expresszió in vivo (9., 10., 12. ábra és 220,239

in vitro

223,224,228

) és

mintázatainak összehasonlításakor eltérés mutatkozik (60-90o,

módszer és megvilágítási ciklusoktól függıen): in vitro az mRNSmennyiség maximuma a déli-délutáni napszakra esik. Mivel a cry1 fázisgörbe maximumértékei a nappali megvilágítási szakasz közepére (in vitro) vagy végére (in vivo) esnek, így feltételezhetı, hogy az eltérı útvonalakon

érkezı

fényinformációk

(retina

vs.

tobozmirigy

saját

fotopigmentjei) a cry1 kifejezıdését alapvetıen serkentik, vagy legalábbis nem gátolják. Az in vivo mintázat késése arra utalhat, hogy a tobozmirigy oszcillátorát a neurohumorális környezet modulálja, késlelteti. A cry2 esetében az in vivo (13. ábra és 223,224,228) és in vitro (15. ábra és 220) adatok között 180o eltérés mutatkozott: in vitro a cry2 mRNS-mennyiség maximuma a hajnali-reggeli napszakra esett. A különbség mind a statikus diszpergált-220, mind a dinamikus organotypicus (15. ábra) in vitro rendszerben megfigyelhetı volt. Ez arra utalhat, hogy in vivo nappali megvilágításkor az eltérı útvonalakon érkezı fázisinformációk (retina és SCN vs. tobozmirigy saját oszcillátora és fotopigmentjei) a cry2 expresszióját különbözı jelátviteli folyamatokkal befolyásolják. A csirke tobozmirigy cry2 ritmusának a cry1-éhez hasonló in vivo lefutását a retinából érkezı neurohumorális szabályozás vezérli, melynek hiányában (in vitro) a 180oban késleltetett cry2 fázisgörbe kizárólag a tobozmirigy saját oszcillátora és fotopigmenjtéhez kapcsolódó, eltérı jelátviteli folyamatokat tükrözi. Adataink összhangban állnak azokkal az emlısökben is leírt adatokkal, hogy a cry1 és cry2 gének kifejezıdését szabályozó jelátviteli mechanizmu-

45

sok alapvetıen különböznek204,233. A csirke tobozmirigyben a cry1 és cry2 gének fényfüggı vizsgálata azt a lehetıséget rejti, hogy hasonló funkciójú óraprotein-paralógok eltérı transzkripciós szabályozását tisztázhassuk. (3) Éjszakai megvilágítás hatása az óragén-expresszióra in vivo. Az éjszakai megvilágítás csirke tobozmirigyben 2 órán belül átmeneti cry1 mRNSszint csökkenést okozott in vivo (10., 11. ábra). A rendszeres nappali megvilágítás (LD) nem vezetett cry1 mRNS-szint csökkenéshez sem in vivo (9. 10. 12. ábra) sem in vitro220,239. A fény idıfüggı hatását a különbözı jelátviteli hírvivık elérhetıségének ritmusos szabályozása magyarázhatja. Ez az emlıs SCN oszcillátorára is jellemzı, ahol a különbözı idıpontokban alkalmazott hasonló ingerlés egymással ellentétes hatású jelátviteli folyamatokat aktiválhat160. Az in vivo éjszakai megvilágítás ugyanis az emlıs SCN-ben is csökkenti az elsı 2 órában a cry1 mRNS-szintet, annak ellenére, hogy LD körülmények között a cry1 expresszió nappal itt is fokozottabb, mint éjjel233,234. Bár korábban feltételezték, hogy az emlıs SCN modellel ellentétben csirke tobozmirigyben a fény közvetlenül fokozza a cry1 expresszióját220,228, adataink ezt nem erısítik meg. A cry1 gén fény általi indukciója eredményeink szerint a csirke tobozmirigyben is az emlıs SCN modellhez hasonlóan kizárólag közvetett lehet. Fénnyel közvetlenül indukálható óragének mindkét modellben a per gének (10-30 percen belül159,227). A clock gén 24 órás expressziós mintázata hasonlít a cry1-ére in vivo LD körülmények között csirke tobozmirigyben is224. Az éjszakai megvilágítás elsı 2 órájában a clock mRNS-szint is megváltozott, de a cry1-gyel ellentétben a clock valamelyest emelkedett (11. ábra). A két gén promóterei emlısökben hasonló (e.g. RRE) és eltérı (e.g. E-box – cry1) elemeket is tartalmaznak72.

Az

in

vivo

váratlan

idıben

jelentkezı

(éjszakai)

megvilágítás egyszerre több génszabályozási út azonnali aktiválásával különbözı óragén-expressziós válaszokat okozhat csirke tobozmirigyben is. (4) Éjszakai megvilágítás hatása az óragén-expresszióra in vitro. Bár in vivo az éjszakai megvilágítás 2 órán belül óragén mRNS-szint csökkenést

46

(cry1) vagy növekedést (clock) okozott csirke tobozmirigyben (10., 11. ábra), in vitro körülmények között alkalmazott hasonló fényexpozíció nem befolyásolta azt (14. ábra). Adataink közvetlenül igazolják a korábbi feltételezést, hogy in vitro csirke tobozmirigyben a fotoreceptor-aktiváció gyorsan fellépı, MEL-szintézist gátló hatása nem jár együtt azonnal az óramőködés transzkripciós szintő megváltozásával205. A fény indukálta jelátviteli

folyamatok

csirke

tobozmirigyben

in

vitro

közvetlenül

239

, de a cry1 és

befolyásolják a MEL szintézis kulcsgénjeit (TrH és Hiomt)

clock gén transzkripciós szabályozását nem (14. ábra). Adataink arra utalnak, hogy a cry1 és clock génexpresszió a környezeti fényviszonyok váratlan változásaihoz csak a retinából jövı fényinformáció hatására alkalmazkodhat gyorsan. A cry2 - a cry1 és clock expressziós mintázatokkal ellentétben - már az in vitro éjszakai megvilágítás 6. órájában szignifikáns eltérést mutatott a kontrollhoz viszonyítva (15. ábra). Ez arra utalhat, hogy a tobozmirigy fotoreceptorai által aktivált jelátviteli kaszkád, ha nem is közvetlenül, de befolyásolja az óragének expresszióját is. Mivel a cry2-vel ellentétben a cry1 expresszió nem változott az in vitro éjszakai megvilágítás elsı 6 órájában (14. ábra), így az in vivo azonos expressziós fázisgörbét mutató cry1 és cry2 óragéneket a pineális fotoreceptorok valóban eltérı útvonalon befolyásolhatják. (5) Fordított megvilágítási ciklus (DL) hatása az óragén-expresszióra. Csirke tobozmirigyben a DL ciklus in vivo 24 órán belül megfordítja a cry1 expresszió ritmusát (10., 12. ábra). Mind a kontroll (LD), mind a DL csoportban a megvilágítás ideje alatt magasabb cry1 mRNS-szinteket mértünk. Adataink arra utalnak, hogy a cry1 expressziójának szabályozását érintı jelátviteli folyamatok in vivo 24 órán belül alkalmazkodhatnak a megváltozott fényviszonyokhoz úgy, hogy a magasabb cry1 mRNS szint a megvilágítási szakaszt reprezentálja. A fény in vivo cry1 expressziót fokozó hatása azonban nem közvetlen. A cry1 mRNS mennyiség az elsı éjszakai megvilágítás elején átmenetileg csökkent (22:00, 10. ábra), a második éjszakai megvilágítás elıtti sötét szakasz végén pedig növekedett (18:00, 12.

47

ábra). A két kísérlet adatait együtt értékelve (10., 12. ábrák) elmondható, hogy átmeneti repressziót követıen a cry1 óragén mRNS-kifejezıdése 180oban elırehozott fázisgörbéjő ritmust mutat már az elsı fordított megvilágítási ciklus után. Ez arra utalhat, hogy az in vivo váratlan idıben (éjjel) érkezı fényinformáció olyan jelátviteli útvonalakat befolyásol, melyek hatására nemcsak a cry1 expresszió, hanem maga a molekuláris oszcillátor fázisgörbéje is 24 órán belül megváltozik csirke tobozmirigyben. A cry2 esetében is eltérés mutatkozott a DL és az LD adatok között (13., 15. ábrák). In vivo (13. ábra) ugyanabban az idıszakaszban (14:00-18:00) alacsonyabb mRNS-szinteket mértünk sötétben (DL), mint megvilágítás alatt (LD), mely a cry2 esetében is a fény in vivo expresszió-fokozó hatását jelentheti. Az in vitro vizsgálatunkban is eltérés mutatkozott a cry2expresszió DL és LD mintázatai között (15. ábra). Ugyanabban az idıpontban

(22:00-6:00)

alacsonyabb

mRNS-szinteket

mértünk

megvilágítás alatt (DL), mint sötétben (LD), mely az in vivo adatokhoz képest éppen ellenkezı fényfüggı változást sugall (gátlás). Az in vivo és in vitro óragén-expressziós mintázatok között tapasztalható jelentıs különbség a cry2 esetében ismét arra utalhat, hogy a lokális fotoreceptorok és a neuroendokrin stimulusok lényegesen eltérı jelátviteli mechanizmusokkal szabályozhatják a cry2 óragén mRNS-mennyiségét. A cry1-gyel ellentétben a cry2 génexpresszió ritmusa az elsı 24 órán belül nem fordult meg in vivo DL körülmények között. Alacsony cry2 mRNSszinteket mértünk mindkét csoportban (DL vs. LD) ugyanabban az idıpontban (2:00, 13. ábra), a megvilágítástól függetlenül (fény vs. sötét). Az in vivo váratlan idıben (éjjel) érkezı megvilágítás a hatásokat tekintve ellentétes jelátviteli útvonalakat is befolyásolhat, mert 2:00-kor a DL csoportban a megvilágítás, az LD csoportban annak hiánya idején volt alacsonyabb a cry2 mRNS-szint. Az aktiváló hatás a fény által kiváltott neuroendokrin (in vivo) stimulusokhoz (13. ábra), a gátlás a lokális fotoreceptorokhoz (in vitro) köthetı (15. ábra). Ezek in vivo interakciói elfedhetik a 180o-ban megváltozott fázisgörbéjő oszcillátor szabályozó hatásának érvényesülését az elsı fordított fény/sötét ciklusban, azaz

48

megakadályozzák a cry1-éhez hasonló gyors fázis-adaptációt. Az in vitro adataink igazolják ezt a késleltetést, mert a cry2 expresszió az elsı fordított megvilágítási ciklus (DL) teljes ideje alatt alacsonyabb volt az LD csoport értékeihez képest (15. ábra). Ez egyben azt jelenti, hogy csirke tobozmirigy óramodellben in vivo a pinealocyták fotoreceptorai által váratlanul kiváltott intracelluláris hatásokat a cry2 transzkripciós változásai tükrözhetik jobban, míg a retina felıl érkezı váratlan neuroendokrin stimulusokat a cry1 és a clock. (6)

Összefoglalás. Eredményeink közvetlen bizonyítékul szolgálnak

amellett, hogy a pinealis fotoreceptorok az óragén-expressziót (cry2) is befolyásolhatják. In vitro körülmények között a 180o-kal késleltetett fény/sötét ciklusokhoz gyorsabban igazodik a MEL termelés ritmusa, mint az óragén-expresszió szabályozása, mert a TrH és Hiomt géneket a fény közvetlenül239, míg az óragéneket csak közvetetten befolyásolja (14. ábra). Míg az emlıs tobozmirigyben több nap szükséges ahhoz, hogy a cry expresszió ritmusa igazodjon a megfordított fény/sötét környezethez232,243, addig az emlıs SCN-ben található oszcillátorok átállásához elég 24 óra234. Eredményeink alapján a csirke tobozmirigyben mőködı oszcillátor neurohumorális szabályozása alapvetıen az emlıs SCN-ben található cirkadián óráéval mérhetı össze, mert in vivo mindkét modell hasonlóan gyors ütemben alkalmazkodik a környezeti fényviszonyok változásaihoz. Csirke tobozmirigyben az általunk vizsgált óragének közül a cry1 és a clock expressziós változásai tükrözik leginkább a neurohumorális szabályozás hatásait.

49

5. AZ ÓRAGÉN-EXPRESSZIÓS RITMUS KIALAKULÁSA

5.1.

EREDMÉNYEK

5.1.1. Az óragén-expresszió 24 órás mintázata fejlıdı csirkékben in vivo (1) A cry1 expresszió mintázata LD környezetben inkubált csirke embriókban in vivo. Fertilizált csirketojásokat (n=30) inkubáltunk LD körülmények között, majd a mintavételt a 18. embrionális napon (E18) kezdtük a sötét szakasz vége után 2 órával (8:00, n=3 minden idıpontban). Kontroll mintákat 6 hetes csirkékbıl győjtöttünk (n=30), melyeket hasonló LD környezetben tartottunk. A cry1 expresszió 24 órás mintázata csirke embrionális tobozmirigyben kétfázisúnak bizonyult: maximumot 20:00-kor, minimumot 12 órával késıbb, 8:00-kor mértünk (16. ábra). A 6 hetes csirkéknél hasonló volt a mintázat: maximumot 16:00-kor, minimumot 12 órával késıbb (4:00) mértünk.

16. ábra: A cry1 mRNS- szintek változásai in vivo LD körülmények között inkubált E18-19 csirke embriók tobozmirigyében. A vízszintes sáv a környezeti fényviszonyokat jelzi. A görbék minden idıpontban a cry1 mRNS-expresszió átlagát + vagy - SEM (n=3) ábrázolják az E18 embriók (üres kör) és a 6 hetes csirkék (üres négyzet) csoportjaiban.

50

(2) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E13-15 embriókban in vivo. Fertilizált csirketojásokat (n=33) állandó sötétben inkubáltunk, és a mintavételt a 13. napon (E13) kezdtük 18:00-kor (n=3 minden idıpontban). A cry1 expresszió a kísérlet alatt folyamatos csökkenést mutatott (80%-ra, 17. ábra), míg clock mRNS-t módszerünkkel csak az E14 stádiumtól tudtunk mérni. E13

E14

E15

17. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek in vivo változásai

DD

körülmények

között inkubált csirke embriók tobozmirigyében

az

E13-15

fejlıdési stádiumban. A

vízszintes

embrionális jelzik

sávok

fejlıdés

(E13-15).

A

az

napjait

E14

görbék

minden idıpontban az mRNSexpresszió átlagát +/- SEM (n=3)

ábrázolják.

mintavételi nyított

Az

értékhez

szignifikáns

elsı viszo-

különb-

ségeket * jelzi.

51

E15

(3) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E15-17 embriókban in vivo. Fertilizált csirketojásokat (n=39) állandó sötétben inkubáltunk, a mintavételt a 15. napon (E15) 10:00-kor kezdtük (n=3 minden idıpontban). A cry1 és clock expresszió továbbra is csak enyhe, de folyamatos változást mutatott az E16 végéig (18. ábra). A cry1 mRNS-szint az E17 stádiumban viszont emelkedett (125%-ra).

E15

E16

E17

18. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek in vivo változásai DD körülmények között inkubált csirke embriók tobozmirigyében az E15-17 fejlıdési stádiumban. A vízszintes sávok az embrionális fejlıdés napjait jelzik (E15-17). A görbék minden idıpontban az mRNS-expresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. Az elsı mintavételi értékhez viszonyított szignifikáns különbségeket * jelzi.

52

(4) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E17-18 embriókban in vivo. Fertilizált csirketojásokat (n=24) állandó sötétben inkubáltunk, és a mintavételt a 17. napon (E17) kezdtük 10:00-kor (n=3 minden idıpontban). A 18. nap elejére (6:00) mind a cry1, mind a clock expresszió csökkent (25% és 10%-kal, 19. ábra), majd ismét növekedett.

E17

E18

19. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek in vivo változásai DD körülmények között inkubált csirke embriók tobozmirigyében az E17-18 fejlıdési stádiumban. A

vízszintes

embrionális jelzik

sávok

fejlıdés

(E17-18).

A

az napjait

görbék

minden idıpontban az mRNSexpresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. Az elsı mintavételi értékhez viszonyított szignifikáns különbségeket * jelzi. E17

53

E18

(5) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E18-19 embriókban in vivo. Fertilizált csirketojásokat (n=21) állandó sötétben inkubáltunk, és a mintavételt a 18. napon (E18) kezdtük 14:00-kor (n=3 minden idıpontban). A 19. nap elejére (6:00) a cry1 expresszió csökkent (10%-kal, 20. ábra), majd ismét emelkedett. Az eltérés a clock esetében nem volt szignifikáns.

E18

E19

20. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek in vivo változásai DD körülmények között inkubált csirke embriók tobozmirigyében az E18-19 fejlıdési stádiumban. A vízszintes sávok az embrionális fejlıdés napjait jelzik (E18-19). A görbék minden idıpontban az mRNSexpresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. Az elsı mintavételi érték-

E18

hez viszonyított szignifikáns különbségeket * jelzi.

54

E19

5.1.2.

Az óragén-expresszió 24 órás mintázatai fejlıdı csirkékben in

vitro (1) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E14-15 embriókban in vitro. Fertilizált csirketojásokat (n=18) inkubáltunk állandó sötétben, majd a 13. napon az izolált tobozmirigyeket in vitro perifúziós rendszerbe, állandó sötétbe helyeztük. A mintavételt a 14. napon, 18:00-kor kezdtük (n=3 minden idıpontban). A cry1 expresszió a 15. nap elején, 6:00-kor mutatott maximumot (160%, 21. ábra), majd a kezdeti értékek alá csökkent. A clock mRNS-szint a 15. nap 10:00-kor érte el csúcsértékét (160%). E14

E15

21. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek változásai az elızıleg DD körülmények között inkubált E13 fejlıdési stádiumú csirke embriókból származó tobozmirigyekben az E1415 napokon in vitro DD környezetben. A vízszintes sávok az embrionális fejlıdés napjait jelzik (E14-15). A görbék

minden

idıpontban

az

mRNS-expresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. Az elsı mintavételi értékhez

viszonyított

szignifikáns

különbségeket * jelzi. E14

55

E15

(2) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E15-16 embriókban in vitro. Fertilizált csirketojásokat (n=18) inkubáltunk állandó sötétben, majd a 14. napon az izolált tobozmirigyeket in vitro perifúziós rendszerbe, állandó sötétbe helyeztük. A mintavételt a 15. napon, 18:00-kor kezdtük (n=3 minden idıpontban). A cry1 expresszió a 15. nap végén, 22:00-kor mutatott minimumot (75%, 22. ábra), majd folyamatosan a kezdeti értékekre emelkedett. A clock mRNS-szint a vizsgálat végéig (ED16, 14:00) enyhén emelkedett (10%). E15

E16

E15

E16

22. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek

változásai

az

elızıleg

DD

körülmények között inkubált E14 fejlıdési stádiumú csirke embriókból származó tobozmirigyekben az E15-16 napokon in vitro DD környezetben. A vízszintes sávok az embrionális fejlıdés napjait jelzik (E15-16). A görbék minden idıpontban az mRNS-expresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. Az elsı mintavételi értékhez viszonyított szignifikáns különbségeket * jelzi.

56

(3) A cry1 és clock expresszió mintázata DD környezetben, E18-19 embriókban in vitro. Fertilizált csirketojásokat (n=18) inkubáltunk állandó sötétben, majd a 17. napon az izolált tobozmirigyeket in vitro perifúziós rendszerbe, állandó sötétbe helyeztük. A mintavételt a 18. napon, 18:00-kor kezdtük (n=3 minden idıpontban). Mind a cry1, mind a clock expresszió 22:00-kor maximumot mutatott (E18), majd 6:00 és 10:00 között (E19) minimumértékre csökkent (50%-ra és 80%ra, 23. ábra). 14:00-ra a cry1 ismét emelkedett. E18

E19

E18

E19

23. ábra: A cry1 (A) és clock (B) mRNS szintek változásai az elızıleg DD körülmények között inkubált, E17 fejlıdési stádiumú csirke embriókból származó tobozmirigyekben az E18-19 napokon in vitro DD környezetben. A vízszintes sávok az embrionális fejlıdés napjait jelzik (E18-19). A görbék minden idıpontban az mRNSexpresszió átlagát +/- SEM (n=3) ábrázolják. értékhez

Az

elsı

viszonyított

mintavételi szignifikáns

különbségeket * jelzi.

57

PACAP-38 hatása a cry1 és clock expresszió 24 órás

5.1.3.

mintázatára csirke tobozmirigyben Fertilizált csirketojásokat (n=18) inkubáltunk állandó sötétben, majd a 17. napon az izolált tobozmirigyeket in vitro perifúziós rendszerbe, állandó sötétbe

helyeztük.

10nM

PACAP-38

kezelést

alkalmaztunk

a

szövetmintákon a 18. napon 20:00-kor 1 órán át. A mintavételt a kezelés elıtt, 18:00-kor kezdtük (n=3 minden idıpontban). A kezelést követı 2. órában mind a cry1, mind a clock expresszió alacsonyabb volt a kontrollhoz képest (60%, ill. 75%, 24. ábra). Késıbb, 6:00-tól a cry1 expresszió a kontroll értékek tartományában változott, a clock mRNS-szintek meg is haladták azokat (150%).

24.

ábra:

hatása

in

körülmények

PACAP-38 vitro

DD

között

az

óragén-expresszió 24 órás mintázatára az elızıleg szintén DD környezetben inkubált E18-19 stádiumú csirke

embriók

toboz-

mirigyében. A

fekete

expozíció

négyzet

az

idıtartamát

mutatja. A görbe minden idıpontban a relatív cry1 (A) vagy clock (B) mRNS mennyiségek átlagát +/SEM (n=3) ábrázolja az „exponált”

(teli)

és

a

„kontroll” (üres) csoportokban. A két csoport között mért szignifikáns különbséget * jelzi.

58

5.2.

MEGBESZÉLÉS

(1) Az óragén-expressziós ritmus kialakulása in vivo LD körülmények között. 15 napos embriókból (E15) nyert tobozmirigyekbıl a clock, bmal2, per2, cry1 és cry2 expressziót sikerült kimutatni (4. ábra). 18 napos stádiumban (E18) clock, bmal1, bmal2, per2, per3 és cry2 mRNS-t detektáltuk (4. ábra). A csirke tobozmirigyben fénnyel indukálható per2 expresszió az E18 stádiumban in vivo LD körülmények között ritmusos226. Adataink szerint a fénnyel közvetlenül nem indukálható cry1 óragén expressziója is ritmusos a hasonló körülmények között inkubált E17-18 stádiumú embriók tobozmirigyében (16. ábra). A cry1 fázisgörbe közel megegyezett az elızıleg LD környezetben tartott 6 hetes csirkék tobozmirigyében mérttel, mind a maximumértékek ideje (embrió 20:00-kor és felnıtt 16:00-kor), mind az amplitúdó tekintetében (mindkét csoportban 200%). Mindez arra utalhat, hogy ebben a stádiumban (E17) már mőködik a környezeti ingerekhez szinkronizált molekuláris oszcillátor. Ez egyben azt jelentheti, hogy csirke tobozmirigyben az aanat mRNS-expresszió E17 stádiumban elıször megjelenı szerv-szintő ritmusos mintázatáért felelıs lehet az in vivo LD körülmények között ekkor már mőködı cirkadián oszcillátor207. (2) Az óragén-expressziós ritmus kialakulása in vivo DD körülmények között. A tobozmirigy neuroendokrin szabályozásának szerepét az oszcillátor elindításában DD körülmények között inkubált csirke embriókon vizsgáltuk. A tobozmirigy cry1 expressziója in vivo E13-16 között folyamatosan csökkent, míg a clock mRNS-szint ez idı alatt enyhén, fokozatosan növekedett (17., 18 ábrák). Cirkadián ritmust egyik esetben sem mértünk a szerv szintjén, mely a sejtek közötti szinkronizáció hiányára, vagy a sejtszintő oszcillátor mőködésének hiányára egyaránt utalhat. Az ellentétes irányú mRNS-szint változás ebben a stádiumban a cry1 és clock gének eltérı transzkripciós szabályozására is utalhat. A cry1 expresszió a 16. nap végétıl fokozódott (E16/22:00 - E17/6:00, 18. ábra), majd a 18. nap elejére az eredeti tartományba csökkent (E18/6:00, 19. ábra).

A clock mRNS-szint a 16. nap közepétıl egészen az E17

59

stádium elejéig enyhén csökkenı tendenciát mutatott, a 17. napon némileg emelkedett, majd a 18. nap elsı felében a cry1 expressziós mintázatához hasonlóan az eredeti tartományba csökkent (18., 19. ábrák). A 17-19. napokon a cry1 expresszió napi ritmusú mintázatot mutatott: 18:00-kor 40%-kal magasabb mRNS-szintet mértünk, mint 6:00-kor (18., 19., 20. ábrák). A clock esetében hasonló tendenciát figyeltünk meg, de a 24-órán belüli különbségek csak a 18. napon voltak szignifikánsak. Az E16-19 fejlıdési szakaszban mindkét vizsgált óragén szerv-szintő expressziós mintázata megváltozott, mert a korábbi (E13-16), viszonylag állandó értékeket 24 órán belül jelentkezı epizodikus mRNS-szint növekedés és csökkenés váltotta fel. További eltérés, hogy a 17-19. napokon a clock mRNS-expressziós görbe már nem fordított, hanem hasonló lefutást mutatott a cry1-hez viszonyítva, ahogy az a kikelt csirkékben is tapasztalható (4. fejezet). Mindezek arra utalhatnak, hogy a molekuláris oszcillátor elindításához, vagy a már mőködı oszcillátor-egységek (sejtek) szinkronizálásához szükséges transzkripciós változások in vivo a 16. naptól jelentkeznek, periodikus környezeti inger hiányában is. A csirke tobozmirigy mőködésében a 16. embrionális napon bekövetkezı változást tehát nem környezeti, hanem neuroendokrin és/vagy parakrin hatások okozhatják. Adataink ellentétben állnak azzal a korábbi feltételezéssel, hogy a csirke tobozmirigy cirkadián oszcillátorának elindításához alapvetıen szükséges volna a fizikai környezet periodikus változása208,226. A tobozmirigy MEL szekréciója csirke embriókban in vitro DD környezetben csak akkor ritmusos, ha a tojások az explantációt megelızıleg legalább az E17 stádiumig LD környezetben inkubálódnak208. Viszont ha az in ovo fejlıdés végig DD környezetben történik, a MEL termelés in vivo ritmusos mintázatát kiválthatja egyetlen, közvetlenül a kikelést követıen alkalmazott LD ciklus209. Ezek az adatok együttvéve nem zárják ki azt a lehetıséget, hogy maga a molekuláris oszcillátor DD környezetben inkubált embriókban is mőködhet, de az E16 stádium után alkalmazott LD ciklusra szükség van a MEL szintézis és a szinkronizált oszcillátorok összekapcsolásához.

60

Feltételezésünkkel látszólagos ellentétben állnak az irodalomban elızıleg közölt óragén-expressziós vizsgálatok is. A fénnyel közvetlenül indukálható per2 expresszió in vivo DD környezetben nem mutatott eltérést226. A per2 ritmus megjelenésének eshetısége DD körülmények között mégsem zárható ki, mert a 24-órás fázisgörbe meghatározásához mintát győjteni nem elegendı csak 12 óránként226, hanem legalább 4 óránként szükséges. A per2226 és a cry1 vagy clock (18., 19., 20. ábrák) expressziós ritmus megjelenése közötti különbséget a per gének közvetlen fényfüggı transzkripciós szabályozása is magyarázhatja159,227. Adataink szerint mindkét vizsgált gén (cry1, clock) esetében a 17-19. napon DD körülmények között megjelenı napi ritmus lényegesen alacsonyabb amplitúdó mellett volt megfigyelhetı, mint 6 hetes (kikelt) csirkékben, vagy az azonos fejlıdési stádiumú, LD körülmények között keltetett csirke embriókban (16. ábra). Az amplitúdó-különbséget az okozhatja, hogy LD környezetben a fotoreceptor sejtek és a pinealocyták feltételezhetıen nagyobb hányada tud egymáshoz szinkronizálódni. A csirke tobozmirigy modellben a jelátviteli útvonalak periodikus környezeti ingerek általi in vivo aktiválása tehát nem a molekuláris oszcillátor elindításához szükséges, hanem elısegíti az in vivo nagyobb amplitúdójú ritmus kifejezıdéséhez az intercelluláris szinkronizációt. Hasonló összefüggés figyelhetı meg az emlıs SCN mőködésének postnatalis fejlıdésében is, ahol in vivo a periodikus megvilágítás nagyobb arányú szinkronizációt okoz a neuronok között, mint az a DD környezetben tapasztalható240,241. Zebradánió tobozmirigy modellen azonban szükséges legalább egyetlen fényimpulzus az in vivo szinkronizált óramőködés kialakításához242. Mindez megerısíti a korábbi feltételezést, hogy a madár tobozmirigy a hal tobozmirigyhez és az emlıs SCN-hez viszonyítva különösen alkalmas modell a cirkadián ritmus kialakításáért felelıs neuroendokrin és parakrin szabályozások vizsgálatára, mert a környezeti megvilágítás- vagy az anyai zeitgeber hiányában is elindul a sejtszintő oszcilláció, és a szerv szintjén a sejtek egymáshoz szinkronizálódhatnak.

61

(3) Az óragén-expressziós ritmus kialakulása in vitro DD körülmények között.

Az

állandó

sötétben

inkubált

csirke

embriókból

nyert

tobozmirigyekben az óragén-expresszió 24 órás mintázata az in vivo adatokkal ellentétben (17-20. ábrák) szignifikáns változásokat mutatott in vitro mindegyik vizsgált stádiumban (21-23. ábrák). Az in vivo és in vitro DD környezetben mérhetı különbségek lokális (parakrin) és neuroendokrin stimulusok

interakcióira

utalnak:

elıbbi

szinkronizáló-

(nagyobb

amplitúdó), utóbbi deszinkronizáló (kisebb amplitúdó) hatással bírhat adataink alapján a fejlıdı csirke tobozmirigyében a sejtszintő oszcillátorok mőködésére. Nem zárható ki, hogy az explantáció során jelentkezı szöveti stressz olyan jelátviteli változásokat indukál in vitro, melyek a fejlıdı tobozmirigy oszcillátorainak szinkronizálásához is szükségesek. Ez azonban nem okoz döntı változást az adott óragén transzkripciós programjában, mert mindhárom vizsgált stádiumban egymástól eltérı 24 órás mRNSmintázatokat tapasztaltunk (21-23. ábrák). Az E13 stádiumú embriókból származó tobozmirigyekben a cry1 mRNSszint a 15. nap elején 2:00-6:00 között átmenetileg növekedett, majd az eredeti tartomány alá süllyedve (21. ábra) követte az in vivo megfigyelhetı tendenciát (17., 18. ábrák). Az E14 embriókból nyert tobozmirigyekben a 15. napon 18:00-22:00 közötti jelentıs cry1 mRNS-szint csökkenést folyamatos növekedés követte a 16. napon 14:00-ig (22. ábra), mely az in vivo mintázathoz képest (18. ábra) ellentétes irányú változást (génaktiváció) jelent. Az E17 tobozmirigyekben a cry1 expresszió (23. ábra) fázisban azonos mintázatot mutatott az in vivo ebben a stádiumban (18-19. nap) már megfigyelhetı

24-órás

ritmussal

(20.

ábra),

18:00-22:00

közötti

csúcsértékekkel. Mindez azt jelenti, hogy a fényexpozíció hiányában is jelentkezı parakrin és neuroendokrin hatások a fejlıdés során eltérıen befolyásolják a cry1 expressziót csirke tobozmirigyben. Az E13-14 stádiumú tobozmirigyekben epizodikusan fellépı intra- vagy intercelluláris szignálok serkentı hatását (in vitro E15 2:00-6:00, E16 2:00-14:00; (21., 23. ábrák) a neuroendokrin stimulusok gátolhatják (17., 18. ábrák). Az E17 stádiumban azonban már csak az amplitúdóban mutatkozott eltérés az in

62

vivo és in vitro fázisgörbék között, vagyis ekkorra már nincs szükség neurohumorális szabályozásra a cry1 expresszió in vivo 24 órás mintázata kifejezıdéséhez. Az E13 stádiumú embriókból származó tobozmirigyekben a clock mRNSszint folyamatosan növekedett a 15. napon 10:00-ig (21. ábra), követve az in vivo megfigyelhetı tendenciát (17., 18. ábrák). Az E14 embriókból nyert tobozmirigyekben szintén folyamatosan növekedett a clock mRNSexpresszió a vizsgált idıszakaszban (16. napon 14:00-ig, 22. ábra), mely ugyancsak hasonlított az in vivo mintázatra (18. ábra).

Az E17

tobozmirigyekben a clock expresszió (23. ábra) fázisban azonos mintázatot mutatott az in vivo ebben a stádiumban (18-19. nap) már megfigyelhetı 24órás ritmussal (20. ábra), 18:00-22:00 közötti csúcsértékekkel. A csirke tobozmirigy fejlıdése során DD körülmények között a clock expressziós fázisgörbék in vivo és in vitro 24 órás mintázatai alapvetıen hasonlóak. Ez arra utal, hogy a cry1-gyel ellentétben a clock transzkripciós szabályozása in vivo már az E17 stádium elıtt sem a neuroendokrin környezettıl, hanem az in vitro körülmények között is mőködı intra- és intercelluláris folyamatok változásaitól függ. Az in vitro kísérleteinkben újabb bizonyítékot találtunk amellett, hogy a csirke tobozmirigy ontogenezise során a 14-17. napok között lényeges változás történik a transzkripció szabályozásában, periodikus környezeti inger hiányában is. Az E13-14 stádiumokkal ellentétben az E17 tobozmirigyekben DD környezetben mind a cry1, mind a clock expressziója hasonló 24-órás mintázatot mutatott 22:00-kor mérhetı maximumértékkel (E18, 23. ábra). Egymáshoz hasonlóak a cry1 és a clock mRNS-expressziós fázisgörbék

az

LD

környezethez

szinkronizált

kikelt

csirkék

tobozmirigyében is in vitro DD környezetben239. A cirkadián molekuláris oszcillátorok már az E17 stádiumtól ugyanígy, egymáshoz szinkronizáltan mőködhetnek in vitro, periodikus fizikai vagy neuroendokrin inger hiányában is. Ez azt jelentheti, hogy nem a neuroendokrin környezet hajtja az in vivo ugyanebben a stádiumban jelentkezı óragén-expressziós ritmust.

63

Az azonban adataink alapján nem zárható ki, hogy neurohumorális stimulusra szükség lehet az oszcillátor elindításához. (4) PACAP hatása az óragén-expresszióra in vitro DD körülmények között. Az állandó sötétben inkubált csirke embriók (E17) tobozmirigyében az emlıs SCN-ben hatásosnak leírt216 10 nM dózisú, és hasonló idıben alkalmazott PACAP-38 kezelés mind a cry1, mind a clock mRNS szinteket csökkentette a kezelést követı 2 órán belül (24. ábra). Késıbb a cry1 expresszió a kontroll értékek tartományában változott, a clock mRNSszintek meg is haladták azokat. Bár más dózisú és idızítéső kezelés hatásait nem vizsgáltuk, kísérletünk eredménye alapján csirke tobozmirigyben fontos

szerepe

lehet

a

PACAP-nak

a

molekuláris

oszcillátorok

szinkronizációjában, mert mindkét, ellentétes funkciójú óraprotein 24-órás génexpressziós rostvégzıdések

mintázata (ggl.

megváltozott.

trigeminale-ból

PACAP-immunpozitív

érkeznek),

PAC1 és

VPAC1

receptorok, és az emlıs SCN-ben leírtakhoz hasonló jelátviteli útvonalak jelenléte ugyancsak erre utalhat210-212. (5) Összefoglalás. A csirke embriókon végzett in vivo és in vitro kísérleteink alapján a csirke tobozmirigy cirkadián óramőködése periodikus környezeti inger hiányában is kialakul az E17 stádiumra. Az intracelluláris cirkadián oszcilláció röviddel e stádiumot megelızıen indulhat el (E16-17). A sejtszintő oszcillátorok az E17 napra már egymással szinkronban mőködnek. A periodikus környezeti inger hiányában is jelentkezı szinkronizációban elsısorban intercelluláris (e.g. parakrin) szabályozás játszik kulcsszerepet, de az E17 stádium elıtt jelentkezı, a környezeti megvilágítástól független neuroendokrin stimulusok szerepe sem zárható ki (e.g. PACAP).

64

6. A LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK

(1)

In vivo csirke tobozmirigy modellben a pineális fotorecepció által

váratlanul kiváltott intracelluláris hatásokat a cry2, míg a retina felıl érkezı váratlan neuroendokrin stimulusokat a cry1 és a clock transzkripciós változásai tükrözik. (2)

A cry1 és clock génexpresszió szabályozása csirke tobozmirigyben a

retina felıl érkezı váratlan neuroendokrin stimulusok hatására gyorsan (2 órán belül) alkalmazkodhat. A cry1 és cry2 óragének fény általi indukciója a period génekével ellentétben közvetett. (3)

A molekuláris oszcillátor elindításához szükséges, a fejlıdı csirke

tobozmirigyében in vivo a 16. embrionális naptól jelentkezı transzkripciós változásokat olyan neuroendokrin és/vagy parakrin hatások okozzák, melyek a fizikai környezet (fény, hımérséklet) periodikus változásaitól függetlenek. (4)

A cirkadián oszcillátorok szinkronizációjában fontos szerepe lehet a

PACAP-nak a csirke tobozmirigy óramodellben is.

65

7.

PUBLIKÁCIÓK

Az értekezés alapjául szolgáló folyóiratcikkek (1) Csernus Valér, Faluhelyi Nándor és Nagy András Dávid: Features of the circadian clock in the avian pineals. - Annals N. Y. Acad. Sci. 1040. 281287. 2005. (2) Csernus Valér, Nagy András Dávid és Faluhelyi Nándor: Development of the rhythmic melatonin secretion in the embryonic chicken pineal gland. – Gen. Comp. Endocrinol. 152: 144-147. 2007. (3) Nagy András Dávid és Csernus Valér: Cry1 expression in the chicken pineal gland: effects of changes in the light/dark conditions. - Gen. Comp. Endocrinol. 152: 148-153. 2007. (4) Nagy András Dávid és Csernus Valér: The role of PACAP in the circadian regulation of clock gene expression in the chicken pineal gland. - Peptides 28: 1767-1774. 2007. (5) Nagy András Dávid, Kommedal Siri, Seomangal Karishma és Csernus Valér: Circadian Expresion of clock genes Clock and Cry1 in the embryonic chicken pineal gland. - Annals N. Y. Acad. Sci. 1163: 484487. 2009. (6) Nagy András Dávid, Seomangal Karishma, Kommedal Siri és Csernus Valér: Expression of Cry2 in the chicken pineal gland: effects of changes in the light/dark conditions. - Annals N. Y. Acad. Sci. 1163: 488-490. 2009. Egyéb folyóiratcikkek (1) Rácz Boglárka, Horváth Gabriella, Faluhelyi Nándor, Nagy András Dávid, Tamás Andrea, Kiss Péter, Gaszner Balázs, Gallyas Ferenc, Tóth Gábor, Csernus Valér és Reglıdi Dóra: Effects of PACAP on the circadian changes of signaling pathways in chicken pinealocytes. – J Mol Neurosci 36: 220-6. 2008.

66

Idézhetı kongresszusi összefoglalók (1) Csernus V., Faluhelyi N., Nagy A.D.: Features of the circadian clock in the avian pineals. Upsala J. Med. Sci. S56. 28. 2004. (2) Nagy A. D., Csernus V.: Expression profiles of mammalian clock gene homologs in the chicken pineal gland. - Clin Neurosci/Ideggy Szle 57 (S1). 89. 2004. (3) Nagy A. D., Csernus V.: Detection of the mammalian clock gene homolog of Per1 in the chicken pineal gland. - Clin Neurosci/Ideggy Szle 58 (S1). 69. 2005. (4) Nagy A. D., Csernus V.: The effects of acute inversion in the environmental light-dark cycle on Cry1 clock gene expression in the chicken pineal gland. - Clin Neurosci/Ideggy Szle 59 (S1). 48. 2006. (5) Nagy A. D., Kommedal S., Csernus V.: Effects of PACAP exposure on the pineal clock gene expression in birds. - Clin Neurosci/Ideggy Szle 60 (S1). 47. 2007. Könyvfejezetek (1) Csernus V., Nagy A. D., Faluhelyi N.: The control of MT release from mammalian and avian pineal glands. - In: Melatonin: from Molecules to Therapy. S. R. Pandi-Perumal, D.P. Cardinali (eds.). Nova Science Publishers Inc., New York (2006). Tudományos elıadások nemzetközi kongresszusokon (1) Csernus V., Nagy A.D., Faluhelyi N.: Mechanisms of the circadian clock in the chicken pineal gland. - 21st Conference of European Comparative Endocrinologists, Bonn, August 26-30, 2002. (2) Csernus VJ, Nagy AD., Józsa R, Sétáló G. Jr.: Molecular control of the rhytmic melatonin secretion from chicken pineal. - IXth Symposium of the European Pineal and Biological Rhythms Society, Aberdeen, Scotland, July 18-22. 2002. (3) Nagy A. D., Csernus V.: Expression profiles of mammalian clock gene homologs in the chicken pineal gland. - IBRO 2004 International Workshop on Neuronal Circuits: From Elementary to Complex Functions, Budapest, January 29-31. 2004. (4) Csernus V., Faluhelyi N., Nagy A.D.: Features of the circadian clock in the avian pineals. 22nd Conference of the European Comparative Endocrinologists, Uppsala, Sweden, August 24-28, 2004. (5) Nagy A. D., Csernus V.: The effects of acute inversion in the environmental light-dark cycle on Cry1 clock gene expression in the chicken pineal gland. -IBRO 2006 International Workshop on Neuronal Circuits: Regulatory mechanisms of synaptic transmission, Budapest, Jan 29-31. 2006.

67

(6) Nagy A.D., Csernus V.: Expression of Cry1 in the chicken pineal gland is not only induced, but also downregulated by light in a time-dependent manner. - 23rd Conference of the European Comparative Endocrinologists, Manchester, UK, Aug 28 - Sept 2. 2006. (7) Csernus V., Faluhelyi N., Nagy A.D.: Development of the rhythmic melatonin secretion in the embryonic chicken pineal gland. - 23rd Conference of the European Comparative Endocrinologists, Manchester, UK, Aug 28 - Sept 2. 2006. (8) Racz B, Horvath G, Faluhelyi N, Nagy A.D., Gallyas F Jr, Tamas A, Kiss P, Csernus V, Reglodi D. Different effects of pitutiary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) against oxidative stress induced cell death during light and dark phases of chicken pineal cell culture. 8th Symposium on VIP, PACAP, and Related Peptides, Manchester and Burlington, Vermont, USA, Sept 3-8, 2007. (9) Horvath G.*, Racz B., Faluhelyi N., Nagy A.D., Gallyas Jr. F., Tamas A., Kiss P., Reglodi D., Csernus V.: Effects of PACAP on the circadian rhythm of MAP kinases in chicken pineal cells - Apoptosis World Congress, Luxembourg, Luxemburg, Jan 23-26. 2008. (10) Nagy A.D., Kommedal S., Seomangal K., Matkovits A., Csernus V.: Expression of clock genes in the embryonic chicken pineal gland. – Biennial Meeting of the Society for Research on Biological Rhythms, Sandestin, Florida, US. May 17-22. 2008. (11) Nagy A.D., Kommedal S., Seomangal K., Matkovits A., Csernus V.: Expression of clock genes in the embryonic chicken pineal gland. – 24th Conference of the European Comparative Endocrinologists, Genoa, Italy, Sept 1-6. 2008. (12) Kommedal S., Seomangal K., Nagy A.D., Csernus V.: Expression of Cry2 in the chicken pineal gland: Effects of changes in the light/dark conditions. – 24th Conference of the European Comparative Endocrinologists, Genoa, Italy, Sept 1-6. 2008. (13) Nagy A.D., Kommedal S., Butenschön V., Bódis G., Csernus V.: The pineal oscillators in chicken embryos need no LD cycles to start. – XIth Conference of the European Biological Rhythms Society, Strasbourg, France, Aug 22-28. 2009. Tudományos elıadások hazai kongresszusokon (1) Nagy A. D., Csernus V.: A CRY1 óragén expressziója a csirke cirkadián ritmusgenerátorban. - Magyar Anatómus Társaság XII. Kongresszusa, Budapest, 2003. június 19-21. (2) Nagy A.D., Csernus V.: Óragén homológok expressziója csirke tobozmirigyben. - XII. Sejtés Fejlıdésbiológiai Napok, Pécs, 2004. április 16-18. (3) Nagy A.D., Csernus V.: Óragén homológok expresszíója csirke tobozmirigyben. - Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XIX. Kongresszusa, Szolnok, 2004. május 20-22.

68

(4) Nagy A. D., Csernus V.: Detection of the mammalian clock gene homolog of Per1 in the chicken pineal gland. - Magyar Idegtudományi Társaság 11. Kongresszusa, Pécs, 2005 január 26-29. (5) Nagy A. D., Csernus V.: Az óragének és a napi ritmusok. - Magyar Biológiai Társaság Pécsi Csoportja Szakülései, Pécs, 2005. február 22. (6) Nagy A.D., Csernus V.: A Cry1 óragén-expresszió cirkadián ritmusának változása éjszakai megvilágitás hatására csirke tobozmirigyben. - Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XX. Kongresszusa, Debrecen, 2006. május 18-20. (7) Nagy A.D., Kommedal S., Csernus V.: PACAP hatása az óragén-expresszió cirkadián ritmusára csirke tobozmirigyben. - Magyar Idegtudományi Társaság 12. Kongresszusa, Szeged, 2007. január 26-29. (8) Nagy A.D., Kommedal S., Seomangal K., Csernus V.: Az óragén expresszió cirkadián ritmusának kialakulása csirke tobozmirigyben. - XIV. Sejt- és Fejlıdésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007. április 15-17. (9) Kommedal S., Seomangal K., Nagy A.D., Csernus V.: A Cry1 és Clock génexpresszió cirkadián ritmusának kialakulása csirke tobozmirigyben. - Magyar Élettani Társaság Vándorgyőlése, Pécs, 2007. június 8-11. (10) Seomangal K., Kommedal S., Nagy A.D., Csernus V.: A Cry1 és Cry2 génexpresszió változásai fordított fény/sötét viszonyok között csirke tobozmirigyben. - Magyar Élettani Társaság Vándorgyőlése, Pécs, 2007. június 8-11. (11) Nagy András Dávid: Cirkadián biológiai ritmusok szabályozása: Óragén-expresszió vizsgálata csirke tobozmirigy modellen - Neurobiológus Doktoranduszok Fóruma - Pécs, 2007. november 16. II. Díj. (12) Nagy András Dávid: Egy régi-új óramodell: a madár tobozmirigy. –Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest, 2009. március 30-31. (13) Nagy András Dávid: Egy régi-új óramodell: a madár tobozmirigy. -XV. Sejt- és Fejlıdésbiológiai Napok, Nyíregyháza, 2009. április 16-19. (14) Nagy András Dávid: Egy régi-új óramodell: a madár tobozmirigy. - Magyar Anatómus Társaság XV. Kongresszusa, Budapest, 2009. június 11-13. Magyar nyelvő, kötetben megjelent elıadás-kivonatok: (1) Nagy A.D., Csernus V.: Óragén homológok expressziója csirke tobozmirigyben. - Orvosi Hetilap 145. 1099. 2004. (2) Nagy A.D., Csernus V.: A Cry1 óragén-expresszió cirkadián ritmusának változása éjszakai megvilágítás hatására csirke tobozmirigyben. - Orvosi Hetilap 147. 2006.

69

Szemináriumok, workshopok, kongresszus-szervezés: (1) Csernus V., Faluhelyi N., Nagy A.D: Biológiai ritmusok, óragének-workshop. XII. Sejt- és Fejlıdésbiológiai Napok, Pécs, 2004. április 16-18. (2) Magyar Idegtudományi Társaság X. Kongresszusa (szervezıbizottsági tag). Pécs, 2005. január 26-29. (3) Magyar Anatómus Társaság XIII. Kongresszusa (szervezıbizottsági tag). Pécs, 2005. június 16-18. (4) Trainee Professional Development Day at the 2008 meeting of the Society for Research on Biological Rhythms. Sandestin, Florida, 2008. május 17. (5) 25th Conference of the European Comparative Endocrinologists (helyi szervezıbizottság titkára), Pécs, 2010. augusztus 31. – szeptember 4.

8. RÖVIDÍTÉSEK AANAT– arylalkylamine N-acetyltransferase AC

– adenylyl cyclase

ACTH – adrenocorticotroph hormone ARCDA – nucleus arcuatus dopaminerg neuronjai ARNT – aryl-hydrocarbon-receptor-nuclear-translocator protein BB2R

– bombesin receptor 2, GRP receptor

BMAL – brain and muscle ARNT-like protein bHLH – basic helix-loop-helix domain bp

– base pair

b-Raf

– v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog b1

bZIP

− basic leucine zipper domain

CaMKIV− calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV cAMP − cyclic adenosine monophosphate cGMP − cyclic guanosine monophosphate cca1

– circadian clock associated 1 gén, arabidopsis óragén

c-fos

– celluláris proto-onkogén, immediate early transzkripciós faktor

c-jun

– celluláris proto-onkogén, immediate early transzkripciós faktor

CKIε

– casein kinase Iε

clk

– clock gén, drosophila óragén

CLOCK – circadian locomotor output cycles kaput protein CRE

– cAMP responsive element

70

CREB – CRE binding protein CRY

– cryptochrome, kék-fény fotoreceptor, gerincesekben óragén

cyc

– cycle gén, drosophila óragén

D-box

− DBP / E4BP4 binding element

DBP

– D site of albumin promoter-binding protein, PAR / bZIP transzkripciós faktor

DD

− constant darkness, folyamatos sötétség

DEC

− deduced 412-amino acid protein containing a bHLH domain

DEPC − diethyl-pyrocarbonate Dexras − Dexamethasone-induced Ras-related protein DL

− dark/light, fordított fény/sötét ciklus

DMH

− dorso-medial hypothalamus

DMHorx − DMH orexinerg neuronjai DMHGABA− DMH GABA-erg neuronjai DNV

− dorsal motor nucleus of the vagus nerve

DSPS

− delayed sleep-phase syndrome

dSPVZ − dorsal sub-paraventricular zone

∆φ

− fázis-változás, két periódus ugyanazon pillanatához tartozó értékek eltérése

E4BP4 − E4 promoter-binding protein 4 / IL-3-regulated nuclear factor, E-box

− CACGTG szekvenciájú promóter-elem

EDTA − ethylenediamine-tetraacetic acid elf3

− early flowering 3 gén, arabidopsis óragén

ERK

− extracellular signal-regulated kinase

EST

− expressed sequence tag

φ

− fázis, a perióduson belül adott pillanathoz tartozó érték a ritmusgörbén

FASPS − familial advanced sleep-phase syndrome frq

− frequency gén, neurospora óragén

FSH

− follicle-stimulating hormone

GABA − γ−aminobutyric acid GABAAR − GABA A receptor Gβγ

− guanine nucleotide binding protein, βγ alegység

GEF

− guanine nucleotide exchange factor

GH

− growth hormone

GHT

− geniculohypothalamic tract

gi

− gigantea gén, arabidopsis óragén

Glu

− glutamát

GPCR − G protein-coupled receptor GRP

− gastrin releasing peptide

71

HAT

− histon-acetyl-transferase

HLF

− hepatic leukemia factor, PAR / bZIP transzkripciós faktor

Homer − immediate early regulator of mGluR5 hnRNPQ − heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q IMLN − intermediolateral nucleus, gerincvelı IP3

− inositol trisphosphate

ipRGC – intrinsically photosensitive retinal ganglion cell LARK − RBM4, RNA-binding motif protein 4 LC

− locus coeruleus

LD

− light/dark, fény/sötét ciklus

LH

− luteinizing hormone

lhy

− late elongated hypocotyl gén, arabidopsis óragén

LL

− constant light, folyamatos megvilágítás

L-VGCC − L-type voltage-gated calcium channel MAPK − mitogen-activated protein kinase ME

− median eminence

MEK1 − MAP/ERK kinase-1 MEL

− melatonin

mGluR5 − metabotropic glutamate receptor type 5 MPOA − medial prae-optic area MPOADA− MPOA dopaminerg neuronjai MPOAGnRH– MPOA gonadotrophin releasing hormon immunpozitív neuronjai miRNS − 20-24 bp mérető, mRNS-sel komplementer mikro RNS mRNS − messenger / hírvívı RNS MSK

− mitogen-and stress-activated protein kinase

MT

− melatonin receptor

mTOR − mammalian target of rapamycin, riboszóma biogenezist szabályozó kináz NOC

− nocturnin, CCRN4L - Carbon Catabolite Repression 4-Like, deadeniláz

NMDA-R− N-methyl D-aspartate receptor, ionotróp glutamát receptor nNOS

− neuronal nitric oxide synthase

NPAS2 − neuronal PAS domain-containing protein 2 Opn4

− melanopsin

PACAP − pituitary adenylate cyclase-activating peptide PAC1

− PACAP receptor 1

PAR/bZIP − proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper domain PAS

– PER, ARNT, SIM proteinekben azonosított, közös domain

PCR

– polymerase chain reaction

72

Pdp1ε – PAR-domain protein 1ε gén, drosophila óragén per

– period gén, drosophila óragén

PKA

– protein kinase A

PKC

– protein kinase C

PKG

– protein kinase G

PK2

– prokineticin 2

PLC

– phospholipase C

PRL

– prolactin

PVN

– paraventricular nucleus

PVNCRH – PVN corticotrophin releasing hormon immunpozitív neuronjai PVNDA – PVN dopaminerg neuronjai PVNSS – PVN szomatosztatinerg neuronjai PVNTRH – PVN thyrotrophin releasing hormon immunpozitív neuronjai PVT

–paraventricular thalamic nucleus

Rev-erbα – Orphan nuclear receptor NR1D1, rat homolog of the viral oncogene v-erbA RGC

– retinal ganglion cell

RHT

– retinohypothalamic tract

ROR

– Orphan nuclear receptor NR1F1, retinoid acid receptor-related orphan receptor

RRE

– REV-ERBα / ROR binding element

RT-PCR – reverse transcription-PCR RyR

– ryanodine receptor

SCN

– suprachiasmatic nucleus

SCNVP

– SCN vazopresszinerg neuronjai

SCG

– superior cervical ganglion

SD

– standard deviation

sim

– single minded gén, drosophila neurogenezisben érintett transzkripciós faktor

SIRT1 − sirtuin-1, silent mating type information regulation 2 homolog

τ

− free-running period / DD környezetben mért periódushossz

T

− a zeitgeber inger ciklusos változásának periódusdhossza

TAE

− TRIS-acetic acid-EDTA buffer

TEF

− thyrotroph embryonic factor, PAR / bZIP transzkripciós faktor

TGFα

− transforming growth factor α

tim

− timeless gén, drosophila óragén

toc1

− timing of cab expression 1 gén, arabidopsis óragén

TRIS

− tris(hydroxymethyl)-aminomethane

TSH

− thyroid-stimulating hormone

VIP

− vasoactive intestinal peptide

73

VP

− vasopressin

VPAC2R − VIP/PACAP receptor 2 vSPVZ − ventral sub-paraventricular zone VTA

− ventral tegmental area

vvd

− vivid gén, neurospora óragén

vri

− vrille gén , drosophila óragén

wc-1

− white collar-1 gén, neurospora óragén

5HT2C − 5-hydroxytryptamine (szerotonin) receptor 2C

9.

IRODALOMJEGYZÉK

1.

Usher A. P.: A History of Mechanical Invention. McGraw-Hill, New York, 1929.

2.

Bretzl H.: Botanische Forschungen des Alexanderzuges. Teubner, Leipzig, 1903.

3.

Albertus Magnus: De animalibus. Libri XXVI. nach der Kölner Urschrift. Hermann Stadler (szerk.): Beitrage zur Geschichte der Philosophie des Mittelalters, Münster, 1916.

4.

Dawin C.: The Descent of Man and Selection in relation to sex. Murray, London, 1871.

5.

Pittendrigh C. S., Minis D. H.: Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1537–1539. 1972.

6.

Daan S., Aschoff J.: Circadian contributions to survival. Aschoff J., Daan S. and Groos G. (szerk.): Vertebrate Circadian Systems, Springer Verlag, Berlin, 1982.

7.

Carolus Linnaeus: Philosophia Botanica. Stockholm, 1751.

8.

de Mairan J.J.O.: Observation Botanique, Histoire de l'Academie Royale des Sciences, Párizs, 1729.

9.

Duhamel du Monceau H.L.: La Physique des Arbres. Guerin & Delatour, Párizs, 1758.

10.

de Candolle A.P.: Physiologie Vegetale. Bechet jeune, Párizs, 1832.

11.

Welsh J. H.: Diurnal rhythms. Quart. Rev. Biol. 13: 123-139. 1938.

12.

Simpson S., Galbraith J.J.: Observations on the normal temperatures of the monkey and its diurnal variation, and on the effects of changes in the daily routine on this variation. Transactions of the Royal Society of Edinburgh. 45: 65-104. 1905.

13.

Simpson S., Galbraith J.J.: An investigation into the diurnal variation of the body temperature of nocturnal and other birds, and a few mammals. J Physiol. 33: 225-238. 1905.

14.

Szymanski J.: Die Verteilung der Buhe- und Aktivitätsperioden bei weissen Ratten und Tanzmäusen. Pflügers Arch Eur J Physiol. 171: 324-347. 1918.

15.

Johnson M.S.: Activity and distribution of certain wild mice in relation to biotic communities. J Mamm. 7: 245-277. 1926.

16.

Richter C.P.: A behavioristic study of the activity of the rat. Comp Psychol Monogr 1: 1-55. 1922.

17.

Beling I.: Über das Zeitgedächtnis der Bienen. Z. Vgl. Physiol. 9: 259–388. 1929.

74

18.

Renner M.: Über ein weiters Versetzungsexperiment zur Analyse des Zeitsinnes und der Sonnenorientierung der Honigbiene. Z. Vgl. Physiol. 42: 449-483. 1959.

19.

von Frisch K.: Die Sonne als Kompass im Leben der Beinen. Experientia 6: 210–221. 1950.

20.

Kramer G.: Experiments on bird orientation. Ibis. 94: 265–285. 1952.

21.

Hoffmann K.: Experimental manipulation of the orientational clock in birds. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 25: 379–387. 1960.

22.

Beier W., Lindauer M.: Der Sonnenstand als Zeitgeber für die Biene. Apidologie. 1: 5–28. 1970.

23.

Major R. H.: Santorio Santorio. Hoeber, New York, 1938.

24.

Reinberg A. E., Lewy H., Smolensky M.: The birth of chronobiology: Julien Joseph Virey 1814. Chronobiol. Int. 18: 173-186. 2001.

25.

Ogle W.: On the diurnal variations in the temperature of the human body in health. St George’s Hospital Reports. 1:221-245. 1866.

26.

Kleitman N.: Sleep and wakefulness. University of Chicago Press, Chicago, Illinois. 1939.

27.

Czeisler C.A., Duffy J.F., Shanahan T.L., Brown E.N., Mitchell J.F., Rimmer D.W., Ronda J.M., Silva E.J., Allan J.S., Emens J.S., Dijk D.J., Kronauer R.E.: Stability, precision, and near-24-hour period of the human circadian pacemaker. Science. 284: 2177-2181. 1999.

28.

Halberg F.: Physiologic 24-hour periodicity. General and procedural considerations with reference to the adrenal cycle. Z Vitam Horm Fermentforsch. 10:225-296. 1959.

29.

Bünning E.: Die physiologische Uhr. Springer Verlag, Berlin. 1958.

30.

de Coursey P.J.: Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 131: 33-35. 1960.

31.

Pittendrigh, C.S.: Circadian rhythms and the circadian organization of living systems. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 25: 159-184. 1960.

32.

Aschoff J.: Circadian timing. Ann N Y Acad Sci. 423: 442-468. 1984.

33.

Refinetti R.: Circadian physiology. CRC Press, Boca Raton, Florida, 2006.

34.

Pittendrigh C.S.: On temperature independence in the clock system controllin emergence time in drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 40: 1018–1029. 1954.

35.

Aschoff J.: Tierische Periodik unter dem Einfluss von Zeitgebern. Z. Tierpsychol. 15: 1–30. 1958.

36.

Mrosovsky N., Reebs S.G., Honrado G.I., Salmon P.A.: Behavioural entrainment of circadian rhythms. Experientia. 45: 696-702. 1989.

37.

Nelson D.E., Takahashi J.S.: Sensitivity and integration in a visual pathway for circadian entrainment in the hamster (Mesocricetus auratus). J Physiol. 439: 115-45. 1991.

38.

Winfree A.T.: Integrated view of resetting a circadian clock. J Theor Biol. 28: 327-374. 1970.

39.

Mitsui A., Kumazawa S., Takahashi A., Ikemoto H., Cao S., Arai T.: Strategy by which nitrogen-fixing unicellular cyanobacteria grow photoautotrophically. Nature. 323: 720– 722. 1986.

40.

Sweeney B.M., Hastings J.W.: Characteristics of the diurnal rhythm of luminescence in Gonyaulax polyedra. J. Gen. Physiol. 43: 285–299. 1957.

41.

Pittendrigh C.S., Bruce V.G., Rosenzweig N.S., Rubin M.L.: A biological clock in Neurospora. Nature. 184: 169-170. 1959.

42.

Harker, J. E.: Diurnal rhythms in the animal kingdom. Biol. Reviews. 33: 1-52. 1958.

75

43.

Aschoff J.: Spontanperiodik des Menschen Naturwissenschaften. 49: 337–342. 1962.

44.

Darwin C.: The power of movement in plants. Murray, London. 1880.

45.

Bünning E.: Über die Erblichkeit der Tagesperiodizität bei den Phaseolus-Blättern. Jb. wiss. Bot. 77: 293-320. 1932.

46.

Konopka R.J., Benzer S.: Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68: 2112-2116. 1971.

47.

Feldman J.F., Hoyle M.N.: Isolation of circadian clock mutants of Neurospora crassa. Genetics. 75: 605–613. 1973.

48.

Ralph M.R., Menaker M.: A mutation of the circadian system in golden hamsters. Science. 241: 1225-1227. 1988.

49.

Vitaterna M.H., King D.P., Chang A.M., Kornhauser J.M., Lowrey P.L., McDonald J.D., Dove W.F., Pinto L.H., Turek F.W., Takahashi J.S.: Mutagenesis and mapping of a mouse gene, Clock, essential for circadian behavior. Science. 264: 719-725. 1994.

50.

Pittendrigh C.S.: Temporal organization: reflections of a Darwinian clock-watcher. Annu. Rev. Physiol. 55: 16-54. 1993.

51.

Ehret C.F.: The sense of time: evidence for its molecular basis in the eukaryotic gene-action system. Adv. Biol. Med. Phys. (0):47-77. 1974.

52.

Dunlap J.C.: Molecular bases for circadian clocks. Cell. 96: 271-290. 1999.

53.

Reddy P., Zehring W.A., Wheeler D.A., Pirrotta V., Hadfield C., Hall J.C., Rosbash M.: Molecular analysis of the period locus in Drosophila melanogaster and identification of a transcript involved in biological rhythms. Cell. 38: 701-710. 1984.

54.

Crews S.T., Thomas J.B., Goodman C.S.: The Drosophila single-minded gene encodes a nuclear protein with sequence similarity to the per gene product. Cell. 52: 143-151. 1988.

55.

Loros J.J., Denome S.A., Dunlap J.C.: Molecular cloning of genes under control of the circadian clock in Neurospora. Science. 243: 385-388. 1989.

56.

Hardin P.E., Hall J.C., Rosbash M.: Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343: 536-540. 1990.

57.

Liu X., Zwiebel L.J., Hinton D., Benzer S., Hall J.C., Rosbash M.: The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. J Neurosci. 12: 2735-2744. 1992.

58.

Huang Z.J., Edery I., Rosbash M.: PAS is a dimerization domain common to Drosophila period and several transcription factors. Nature. 364: 259-262. 1993.

59.

King D.P., Zhao Y., Sangoram A.M., Wilsbacher L.D., Tanaka M., Antoch M.P., Steeves T.D., Vitaterna M.H., Kornhauser J.M., Lowrey P.L., Turek F.W., Takahashi J.S.: Positional cloning of the mouse circadian clock gene. Cell. 89: 641-653. 1997.

60.

Sun Z.S., Albrecht U., Zhuchenko O., Bailey J., Eichele G., Lee C.C.: RIGUI, a putative mammalian ortholog of the Drosophila period gene. Cell. 90: 1003-1011. 1997.

61.

Allada R., White N.E., So W.V., Hall J.C., Rosbash M.: A mutant Drosophila homolog of mammalian Clock disrupts circadian rhythms and transcription of period and timeless. Cell. 93: 791-804. 1998.

62.

Antoch M.P., Song E.J., Chang A.M., Vitaterna M.H., Zhao Y., Wilsbacher L.D., Sangoram A.M., King D.P., Pinto L.H., Takahashi J.S.: Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89: 655-667. 1997.

63.

Doi M., Hirayama J., Sassone-Corsi P.: Circadian regulator CLOCK is a histone acetyltransferase. Cell. 125: 497-508. 2006.

76

bei

Ausschluss

aller

Zeitgeber.

64.

Hogenesch J.B., Gu Y.Z., Jain S., Bradfield C.A.: The basic-helix-loop-helix-PAS orphan MOP3 forms transcriptionally active complexes with circadian and hypoxia factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 5474-5479. 1998.

65.

Gekakis N., Staknis D., Nguyen H.B., Davis F.C., Wilsbacher L.D., King D.P., Takahashi J.S., Weitz C.J.: Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280: 1564-1569. 1998.

66.

Darlington T.K., Wager-Smith K., Ceriani M.F., Staknis D., Gekakis N., Steeves T.D., Weitz C.J., Takahashi J.S., Kay S.A.: Closing the circadian loop: CLOCK-induced transcription of its own inhibitors per and tim. Science. 280: 1599-1603. 1998.

67.

Kume K., Zylka M.J., Sriram S., Shearman L.P., Weaver D.R., Jin X., Maywood E.S., Hastings M.H., Reppert S.M.: mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98: 193-205. 1999.

68.

Griffin E.A. Jr., Staknis D., Weitz C.J.: Light-independent role of CRY1 and CRY2 in the mammalian circadian clock. Science. 286: 768-771. 1999.

69.

Yagita K., Tamanini F., Yasuda M., Hoeijmakers J.H., van der Horst G.T., Okamura H.: Nucleocytoplasmic shuttling and mCRY-dependent inhibition of ubiquitylation of the mPER2 clock protein. EMBO J. 21: 1301-1314. 2002.

70.

Mackey S.R.: Biological Rhythms Workshop IA: Molecular Basis of Rhythms Generation. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 72: 7-19. 2007.

71.

Bunger M.K., Wilsbacher L.D., Moran S.M., Clendenin C., Radcliffe L.A., Hogenesch J.B., Simon M.C., Takahashi J.S., Bradfield C.A.: Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals. Cell. 103: 1009-1017. 2000.

72.

Ueda H.R.: Systems biology of mammalian circadian clocks. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 72: 365-380. 2007.

73.

Goodwin B.: Temporal Organization in Cells. Academic Press, London, 1963.

74.

Hastings M.H., Field M.D., Maywood E.S., Weaver D.R., Reppert S.M.: Differential regulation of mPER1 and mTIM proteins in the mouse suprachiasmatic nuclei: new insights into a core clock mechanism. J. Neurosci. 19: 1-7. 1999.

75.

Maywood E.S., O'Neill J.S., Reddy A.B., Chesham J.E., Prosser H.M., Kyriacou C.P., Godinho S.I.H., Nolan P.M., Hastings M.H.: Genetic and Molecular Analysis of the Central and Peripheral Circadian Clockwork of Mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 72: 85-94. 2007.

76.

Baggs J., Green C.B.: Nocturnin, a deadenylase in Xenopus laevis retina: a mechanism for posttranscriptional control of circadian-related mRNA. Curr. Biol., 13: 189-198. 2003.

77.

Newby L.M., Jackson F.R.: Regulation of a specific circadian clock output pathway by LARK, a putative RNA-binding protein with repressor activity. J. Neurobiol. 31: 117-128. 1996.

78.

Kim T.D., Woo K.C., Cho S., Ha D.C., Jang S.K., Kim K.T.: Rhythmic control of AANAT translation by hnRNP Q in circadian melatonin production. Genes. Dev. 21: 797-810. 2007.

79.

Cao R., Lee B., Cho H.Y., Saklayen S., Obrietan K.: Photic regulation of the mTOR signaling pathway in the suprachiasmatic circadian clock. Mol. Cell. Neurosci. 38: 312-24. 2008.

80.

Cheng H.Y., Papp J.W., Varlamova O., Dziema H., Russell B., Curfman J.P., Nakazawa T., Shimizu K., Okamura H., Impey S., Obrietan K.: microRNA modulation of circadian-clock period and entrainment. Neuron. 54: 813-29. 2007.

81.

Lowrey P.L., Shimomura K., Antoch M.P., Yamazaki S., Zemenides P.D., Ralph M.R., Menaker M., Takahashi J.S.: Positional syntenic cloning and functional characterization of the mammalian circadian mutation tau. Science. 288: 483-492. 2000.

77

82.

Virshup D.M., Eide E.J., Forger D.B., Gallego M., Harnish E.V.: Reversible protein phosphorylation regulates circadian rhythms. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 72: 413-420. 2007.

83.

Toh K.L., Jones C.R., He Y., Eide E.J., Hinz W.A., Virshup D.M., Ptácek L.J., Fu Y.H.: An hPer2 phosphorylation site mutation in Familial Advanced Sleep Phase Syndrome. Science. 291: 1040-1043. 2001.

84.

Siepka S.M., Yoo S.H., Park J., Lee C., Takahashi J.S.: Genetics and neurobiology of circadian clocks in mammals. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.72: 251-259. 2007.

85.

Archer S.N., Robilliard D.L., Skene D.J., Smits M., Williams A., Arendt J., von Schantz M.: A length polymorphism in the circadian clock gene per3 is linked to Delayed Sleep Phase Syndrome and extreme diurnal preference. Sleep. 26: 413-415. 2003.

86.

Kondo T.: A cyanobacterial circadian clock based on the KAI oscillator. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.72: 47-56. 2007.

87.

Hastings M.H., Maywood E.S., Reddy A.B.: Two decades of circadian time. J. Neuroendocrinol. 20: 812-9. 2008.

88.

Ptitsyn A.A., Zvonic S., Gimble J.M.: Digital signal processing reveals circadian baseline oscillation in majority of mammalian genes. PLoS Comput. Biol. 3: e120. 2007.

89.

Sahar S., Sassone-Corsi P.: Metabolism and cancer: the circadian clock connection. Nat. Rev. Cancer. 9: 886-896. 2009.

90.

Takahashi J.S., Hong H.K., Ko C.H., McDearmon E.L.: The genetics of mammalian circadian order and disorder: implications for physiology and disease. Nat. Rev. Genet. 9: 764-775. 2008.

91.

McClung C.A.: Circadian genes, rhythms and the biology of mood disorders. Pharmacol. Ther. 114:222-232. 2007.

92.

Yin L., Wang J., Klein P.S., Lazar M.A.: Nuclear receptor Rev-erbalpha is a critical lithium-sensitive component of the circadian clock. Science.311: 1002-1005. 2006.

93.

Ehlen J.C., Grossman G.H., Glass J.D.: In vivo resetting of the hamster circadian clock by 5-HT7 receptors in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 21: 5351-5357. 2001.

94.

Mansour H.A., Wood J., Logue T., Chowdari K.V., Dayal M., Kupfer D.J., Monk T.H., Devlin B., Nimgaonkar V.L.: Association study of eight circadian genes with bipolar I disorder, schizoaffective disorder and schizophrenia. Genes. Brain. Behav. 5: 150-157. 2006.

95.

Wirz-Justice A., Van den Hoofdakker R.H.: Sleep deprivation in depression: what do we know, where do we go? Biol. Psychiatry. 46: 445-453. 1999.

96.

Terman M.: Evolving applications of light therapy. Sleep Med. Rev.11:497-507. 2007.

97.

Zupancic M., Guilleminault C.: Agomelatine: a preliminary review of a new antidepressant. CNS Drugs. 20: 981-992. 2006.

98.

Deurveilher S., Semba K.: Indirect projections from the suprachiasmatic nucleus to major arousal-promoting cell groups in rat: implications for the circadian control of behavioural state. Neuroscience. 130: 165-183. 2005.

99.

Hirsch-Rodriguez E., Imbesi M., Manev R., Uz T., Manev H.: The pattern of melatonin receptor expression in the brain may influence antidepressant treatment. Med. Hypotheses. 69: 120-124. 2007.

100.

Kreier F., Yilmaz A., Kalsbeek A., Romijn J.A., Sauerwein H.P., Fliers E., Buijs R.M.: Hypothesis: shifting the equilibrium from activity to food leads to autonomic unbalance and the metabolic syndrome. Diabetes. 52: 2652-2656. 2003.

101.

Schibler U., Ripperger J., Brown S.A.: Peripheral circadian oscillators in mammals: time and food. J. Biol. Rhythms. 18: 250-260. 2003.

78

102.

Kohsaka A., Bass J.: A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol. Metab. 18: 4-11. 2007.

103.

Kim S.P., Catalano K.J., Hsu I.R., Chiu J.D., Richey J.M., Bergman R.N.: Nocturnal free fatty acids are uniquely elevated in the longitudinal development of diet-induced insulin resistance and hyperinsulinemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292: 1590-1598. 2007.

104.

Allison K.C., Crow S.J., Reeves R.R., West D.S., Foreyt J.P., Dilillo V.G., Wadden T.A., Jeffery R.W., Van Dorsten B., Stunkard A.J.: Binge eating disorder and night eating syndrome in adults with type 2 diabetes. Obesity (Silver Spring). 15: 1287-1293. 2007.

105.

Yannielli P.C., Molyneux P.C., Harrington M.E., Golombek D.A.: Ghrelin effects on the circadian system of mice. J. Neurosci. 27: 2890-2895. 2007.

106.

Um J.H., Yang S., Yamazaki S., Kang H., Viollet B., Foretz M., Chung J.H.: Activation of 5'-AMP-activated kinase with diabetes drug metformin induces casein kinase I epsilon (CKIepsilon)-dependent degradation of clock protein mPer2. J. Biol. Chem. 282: 2079420798. 2007.

107.

Liu C., Li S., Liu T., Borjigin J., Lin J.D.: Transcriptional coactivator PGC-1alpha integrates the mammalian clock and energy metabolism. Nature. 447: 477-481. 2007.

108.

Rutter J., Reick M., Wu L.C., McKnight S.L.: Regulation of clock and NPAS2 DNA binding by the redox state of NAD cofactors. Science. 293: 510-514. 2001.

109.

Karlsson B., Knutsson A., Lindahl B.: Is there an association between shift work and having a metabolic syndrome? Results from a population based study of 27,485 people. Occup. Environ. Med. 58: 747-752. 2001.

110.

Scheer F.A., Hilton M.F., Mantzoros C.S., Shea S.A.: Adverse metabolic and cardiovascular consequence of circadian misalignment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106: 4453-4458. 2009.

111.

Turek F.W., Joshu C., Kohsaka A., Lin E., Ivanova G., McDearmon E., Laposky A., LoseeOlson S., Easton A., Jensen D.R., Eckel R.H., Takahashi J.S., Bass J.: Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice. Science. 308: 1043-1045. 2005.

112.

Kalra S.P., Dube M.G., Pu S., Xu B., Horvath T.L., Kalra P.S.: Interacting appetiteregulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight. Endocr. Rev. 20: 68100. 1999.

113.

Panda S., Antoch M.P., Miller B.H., Su A.I., Schook A.B., Straume M., Schultz P.G., Kay S.A., Takahashi J.S., Hogenesch J.B.: Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109: 307-320. 2002.

114.

McCarthy J.J., Andrews J.L., McDearmon E.L., Campbell K.S., Barber B.K., Miller B.H., Walker J.R., Hogenesch J.B., Takahashi J.S., Esser K.A.: Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol. Genomics. 31: 86-95. 2007.

115.

Otway D.T., Frost G., Johnston J.D.: Circadian rhythmicity in murine pre-adipocyte and adipocyte cells. Chronobiol. Int. 26: 1340-1354. 2009.

116.

Yang X., Downes M., Yu R.T., Bookout A.L., He W., Straume M., Mangelsdorf D.J., Evans R.M.: Nuclear receptor expression links the circadian clock to metabolism. Cell. 126: 801-810. 2006.

117.

Preitner N., Damiola F., Lopez-Molina L., Zakany J., Duboule D., Albrecht U., Schibler U.: The orphan nuclear receptor REV-ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian oscillator. Cell. 110: 251-260. 2002.

118.

Kornmann B., Schaad O., Bujard H., Takahashi J.S., Schibler U.: System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5: e34. 2007.

79

119.

Ceriani M.F., Darlington T.K., Staknis D., Más P., Petti A.A., Weitz C.J., Kay S.A.: Lightdependent sequestration of TIMELESS by CRYPTOCHROME. Science. 285: 553-556. 1999.

120.

Foster R.G., Soni B.G.: Extraretinal photoreceptors and their regulation of temporal physiology. Rev. Reprod. 3: 145-150. 1998.

121.

Foster R.G., Provencio I., Hudson D., Fiske S., De Grip W., Menaker M.: Circadian photoreception in the retinally degenerate mouse (rd/rd). J. Comp. Physiol. A. 169: 39-50. 1991.

122.

Panda S., Sato T.K., Castrucci A.M., Rollag M.D., DeGrip W.J., Hogenesch J.B., Provencio I., Kay S.A.: Melanopsin (Opn4) requirement for normal light-induced circadian phase shifting. Science. 298: 2213-2216. 2002.

123.

Hattar S., Liao H.W., Takao M., Berson D.M., Yau K.W.: Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295: 10651070. 2002.

124.

Berson D.M.: Strange vision: ganglion cells as circadian photoreceptors. Trends Neurosci. 26: 314-320. 2003.

125.

Halász B.: The endocrine effects of isolation of the hypothalamus from the rest of the brain. –Ganong W.F., Martini L. (szerk): Frontiers in Neuroendocrinology. Oxford Univ. Press, New York, 1969.

126.

Moore R.Y., Karapas F., Lenn N.J.: A retinohypothalamic projection in the rat. Anat. Rec. 169: 382-382. 1971.

127.

Gurdjian E.S.: The diencephalon of the albino rat. J. Comp. Neurol. 43: 1–114. 1927.

128.

Stephan F.K., Zucker I.: Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1583-1586. 1972.

129.

Moore R.Y., Eichler V.B.: Loss of a circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res. 42: 201-206. 1972.

130.

Meijer J.H., Rietveld W.J.: Neurophysiology of the suprachiasmatic circadian pacemaker in rodents. Physiol. Rev. 69:671–707. 1989.

131.

Mosko S., Moore R.Y.: Retinohypothalamic tract development: alteration suprachiasmatic lesions in the neonatal rat. Brain Res. 164: 1-15. 1979.

132.

Lehman M.N., Silver R., Gladstone W.R., Kahn R.M., Gibson M., Bittman E.L.: Circadian rhythmicity restored by neural transplant. Immunocytochemical characterization of the graft and its integration with the host brain. J. Neurosci. 7: 1626-1638. 1987.

133.

Ralph M.R., Foster R.G., Davis F.C., Menaker M.: Transplanted suprachiasmatic nucleus determines circadian period. Science. 247: 975-978. 1990.

134.

van den Pol A.N.: The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J. Comp. Neurol. Jun 191: 661-702. 1980.

135.

Inouye S.T., Kawamura H.: Persistence of circadian rhythmicity in a mammalian hypothalamic "island" containing the suprachiasmatic nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 5962-5966. 1979.

136.

Schwartz W.J., Gainer H.: Suprachiasmatic nucleus: use of 14C-labeled deoxyglucose uptake as a functional marker. Science. 197: 1089-1091. 1977.

137.

Shearman L.P., Zylka M.J., Weaver D.R., Kolakowski L.F. Jr, Reppert S.M.: Two period homologs: circadian expression and photic regulation in the suprachiasmatic nuclei. Neuron. 19: 1261-1269. 1997.

138.

Green D.J, Gillette R.: Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245: 198-200. 1982.

80

by

139.

Welsh D.K., Logothetis D.E., Meister M., Reppert S.M.: Individual neurons dissociated from rat suprachiasmatic nucleus express independently phased circadian firing rhythms. Neuron. 14: 697-706. 1995.

140.

van den Pol A.N., Dudek F.E.: Cellular communication in the circadian clock, the suprachiasmatic nucleus. Neuroscience. 56: 793-811. 1993.

141.

Ladenheim E.E., Jensen R.T., Mantey S.A., Moran T.H.: Distinct distributions of two bombesin receptor subtypes in the rat central nervous system. Brain Res. 593: 168-178. 1992.

142.

Liu C., Reppert S.M.: GABA synchronizes clock cells within the suprachiasmatic circadian clock. Neuron. 25: 123-128. 2000.

143.

Maywood E.S., Reddy A.B., Wong G.K., O'Neill J.S., O'Brien J.A., McMahon D.G., Harmar A.J., Okamura H., Hastings M.H.: Synchronization and maintenance of timekeeping in suprachiasmatic circadian clock cells by neuropeptidergic signaling. Curr. Biol. 16: 599-605. 2006.

144.

Cutler D.J., Haraura M., Reed H.E., Shen S., Sheward W.J., Morrison C.F., Marston H.M., Harmar A.J., Piggins H.D.: The mouse VPAC2 receptor confers suprachiasmatic nuclei cellular rhythmicity and responsiveness to vasoactive intestinal polypeptide in vitro. Eur. J. Neurosci. 17: 197-204. 2003.

145.

Colwell C.S.: Rhythmic coupling among cells in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurobiol. 43: 379-388. 2000.

146.

Balsalobre A., Damiola F., Schibler U.: A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93: 929-937. 1998.

147.

Maywood E.S., O'Neill J.S., Chesham J.E., Hastings M.H.: Minireview: The circadian clockwork of the suprachiasmatic nuclei - analysis of a cellular oscillator that drives endocrine rhythms. Endocrinology. 148: 5624-5634. 2007.

148.

Haak L.L.: Metabotropic glutamate receptor modulation of glutamate responses in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurophysiol. 81: 1308-1317. 1999.

149.

Coogan A.N., Piggins H.D.: MAP kinases in the mammalian circadian system - key regulators of clock function. J. Neurochem. 90: 769-775. 2004.

150.

Akashi M., Hayasaka N., Yamazaki S., Node K.: Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28: 4619-4623. 2008.

151.

Dziema H., Oatis B., Butcher G.Q., Yates R., Hoyt K.R., Obrietan K.: The ERK/MAP kinase pathway couples light to immediate-early gene expression in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17: 1617–1627. 2003.

152.

Pfeffer M., Müller C.M., Mordel J., Meissl H., Ansari N., Deller T., Korf H.W., von Gall C.: The mammalian molecular clockwork controls rhythmic expression of its own input pathway components. J. Neurosci. 29: 6114-6123. 2009.

153.

Kako K., Ishida N.: The role of transcription factors in circadian gene expression. Neurosci. Res. 31: 257–264. 1998.

154.

Nielsen H.S., Georg B., Hannibal J., Fahrenkrug J.: Homer-1 mRNA in the rat suprachiasmatic nucleus is regulated differentially by the retinohypothalamic tract transmitters pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and glutamate at time points where light phase-shifts the endogenous rhythm. Brain Res. Mol. Brain. Res. 105: 79-85. 2002.

155.

Golombek D.A., Agostino P.V., Plano S.A., Ferreyra G.A.: Signaling in the mammalian circadian clock: the NO/cGMP pathway. Neurochem. Int. 45: 929-936. 2004.

156.

von Gall C., Duffield G.E., Hastings M.H., Kopp M.D., Dehghani F., Korf H.W., Stehle J.H.: CREB in the mouse SCN: a molecular interface coding the phase-adjusting stimuli

81

light, glutamate, PACAP, and melatonin for clockwork access. J. Neurosci. 18: 1038910397. 1998. 157.

Butcher G.Q., Lee B., Cheng H.Y., Obrietan K.: Light stimulates MSK1 activation in the suprachiasmatic nucleus via a PACAP-ERK/MAP kinase-dependent mechanism. J. Neurosci. 25: 5305-5313. 2005.

158.

Kornhauser J.M., Nelson D.E., Mayo K.E., Takahashi J.S.: Photic and circadian regulation of c-fos gene expression in the hamster suprachiasmatic nucleus. Neuron. 5: 127-134. 1990.

159.

Shigeyoshi Y., Taguchi K., Yamamoto S., Takekida S., Yan L., Tei H., Moriya T., Shibata S., Loros J.J., Dunlap J.C., Okamura H.: Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91: 1043-1053. 1997.

160.

Cheng H.Y., Dziema H., Papp J., Mathur D.P., Koletar M., Ralph M.R., Penninger J.M., Obrietan K.: The molecular gatekeeper Dexras1 sculpts the photic responsiveness of the mammalian circadian clock. J. Neurosci. 26: 12984-12995. 2006.

161.

Hannibal J.: Roles of PACAP-containing retinal ganglion cells in circadian timing. Int. Rev. Cytol. 251: 1-39. 2006.

162.

Abrahamson E.E., Moore R.Y.: Suprachiasmatic nucleus in the mouse: retinal innervation, intrinsic organization and efferent projections. Brain Res. 916: 172-191. 2001.

163.

Perreau-Lenz S., Pévet P., Buijs R.M., Kalsbeek A.: The biological clock: the bodyguard of temporal homeostasis. Chronobiol. Int. 21: 1-25. 2004.

164.

LeSauter J., Silver R.: Output signals of the SCN. Chronobiol. Int. 15: 535-550. 1998.

165.

Kalsbeek A., Verhagen L.A., Schalij I., Foppen E., Saboureau M., Bothorel B., Buijs R.M., Pévet P.: Opposite actions of hypothalamic vasopressin on circadian corticosterone rhythm in nocturnal versus diurnal species. Eur. J. Neurosci. 27: 818-827. 2008.

166.

Gerendai I., Halász B.: Central nervous system structures connected with the endocrine glands. findings obtained with the viral transneuronal tracing technique. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 108: 389-395. 2000.

167.

Zawilska J.B., Skene D.J., Arendt J.: Physiology and pharmacology of melatonin in relation to biological rhythms. Pharmacol. Rep. 61: 383-410. 2009.

168.

Yasuo S., Yoshimura T., Ebihara S., Korf H.W.: Melatonin transmits photoperiodic signals through the MT1 melatonin receptor. J. Neurosci. 29: 2885-2889. 2009.

169.

Skene D.J., Arendt J.: Circadian rhythm sleep disorders in the blind and their treatment with melatonin. Sleep Med 8: 651-655. 2007.

170.

Roth T., Seiden D., Sainati S., Wang-Weigand S., Zhang J., Zee P.: Effects of ramelteon on patient-reported sleep latency in older adults with chronic insomnia. Sleep Med. 7: 312-318. 2006.

171.

Lemoine P., Nir T., Laudon M., Zisapel N.: Prolonged-release melatonin improves sleep quality and morning alertness in insomnia patients aged 55 years and older and has no withdrawal effects. J. Sleep Res. 16: 372-380. 2007.

172.

Olié J.P., Kasper S.: Efficacy of agomelatine, a MT1/MT2 receptor agonist with 5-HT2C antagonistic properties, in major depressive disorder. Int. J. Neuropsychopharmacol. 10: 661-673. 2007.

173.

Korf H.W.: The pineal organ as a component of the biological clock. Phylogenetic and ontogenetic considerations. Ann. N. Y. Acad. Sci. 719: 13-42. 1994.

174.

Vigh B., Manzano M.J., Zádori A., Frank C.L., Lukáts A., Röhlich P., Szél A., Dávid C.: Nonvisual photoreceptors of the deep brain, pineal organs and retina. Histol. Histopathol. 17: 555-590. 2002.

175.

Klein D.C.: Evolution of the vertebrate pineal gland: the AANAT hypothesis. Chronobiol. Int. 23: 5-20. 2006.

82

176.

Falcón J., Besseau L., Fuentès M., Sauzet S., Magnanou E., Boeuf G.: Structural and functional evolution of the pineal melatonin system in vertebrates. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1163: 101-111. 2009.

177.

Collin J.P., Oksche A.: Structural and functional relationships in the nonmammalian pineal gland. - Reiter R.J. (szerk.): The Pineal Gland, Vol. I, Anatomy and Biochemistry. CRC Press, Boca Raton, Florida. 1981.

178.

Ralph C.L., Dawson D.C.: Failure of the pineal body of 2 species of birds (Coturnix coturnix japonica and Passer domesticus) to show electrical responses to illumination. Experientia. 24: 147-148. 1968.

179.

Ekström P., Meissl H.: Evolution of photosensory pineal organs in new light: the fate of neuroendocrine photoreceptors. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358: 1679-1700. 2003.

180.

Tosini G., Doyle S., Geusz M., Menaker M.: Induction of photosensitivity in neonatal rat pineal gland. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 11540-11544. 2000.

181.

Maronde E., Stehle J.H.: The mammalian pineal gland: known facts, unknown facets. Trends Endocrinol. Metab. 18: 142-149. 2007.

182.

Takahashi J.S., Hamm H., Menaker M.: Circadian rhythms of melatonin release from individual superfused chicken pineal glands in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.77: 23192322. 1980.

183.

Zatz M., Mullen D.A., Moskal J.R.: Photoendocrine transduction in cultured chick pineal cells: effects of light, dark, and potassium on the melatonin rhythm. Brain Res. 438: 199215. 1988.

184.

Bernard M., Guerlotté J., Grève P., Gréchez-Cassiau A., Iuvone M.P., Zatz M., Chong N.W., Klein D.C., Voisin P.: Melatonin synthesis pathway: circadian regulation of the genes encoding the key enzymes in the chicken pineal gland and retina. Reprod. Nutr. Dev. 39: 325-334. 1999.

185.

Csernus V., Ghosh M., Mess B.: Development and control of the circadian pacemaker for melatonin release in the chicken pineal gland. Gen. Comp. Endocrinol. Apr;110(1):19-28. 1998.

186.

Tosini G., Fukuhara C.: Photic and circadian regulation of retinal melatonin in mammals. J. Neuroendocrinol. 15: 364-369. 2003.

187.

Ziv L., Gothilf Y.: Period2 expression pattern and its role in the development of the pineal circadian clock in zebrafish. Chronobiol. Int. 23: 101-112. 2006.

188.

Kaneko M., Hernandez-Borsetti N., Cahill G.M.: Diversity of zebrafish peripheral oscillators revealed by luciferase reporting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 1461414619. 2006.

189.

Takekida S., Yan L., Maywood E.S., Hastings M.H., Okamura H.: Differential adrenergic regulation of the circadian expression of the clock genes Period1 and Period2 in the rat pineal gland. Eur. J. Neurosci. 12: 4557-4561. 2000.

190.

Abe M., Herzog E.D., Yamazaki S., Straume M., Tei H., Sakaki Y., Menaker M., Block G.D.: Circadian rhythms in isolated brain regions. J. Neurosci. 22: 350-356. 2002.

191.

Deguchi T.: A circadian oscillator in cultured cells of chicken pineal gland. Nature. 282: 94-96. 1979.

192.

Deguchi T.: Circadian rhythm of serotonin N-acetyltransferase activity in organ culture of chicken pineal gland. Science. 203: 1245-1247. 1979.

193.

Robertson L.M., Takahashi J.S.: Circadian clock in cell culture: I. Oscillation of melatonin release from dissociated chick pineal cells in flow-through microcarrier culture. J. Neurosci. 8: 12-21. 1988.

83

194.

Berthoud V.M., Hall D.H., Strahsburger E., Beyer E.C., Sáez J.C.: Gap junctions in the chicken pineal gland. Brain Res. 861: 257-270. 2000.

195.

Falcón J., Van Camp G., Collin J.P.: Adenosine A2 receptor-mediated stimulation of cyclic AMP in cultured chicken pineal cells. J. Pineal Res. 19: 72-78. 1995.

196.

Gaston S., Menaker M.: Pineal function: the biological clock in the sparrow? Science. 160: 1125-1127. 1968.

197.

Binkley S., Kluth E., Menaker M.: Pineal function in sparrows: circadian rhythms and body temperature. Science. 174: 311-314. 1971.

198.

Armstrong S.M.: Melatonin and circadian control in mammals. Experientia. 45: 932-938. 1989.

199.

Deguchi T.: Ontogenesis of a biological clock for serotonin:acetyl coenzyme A Nacetyltransferase in pineal gland of rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:2814-2818. 1975.

200.

Csernus V.J., Schally A.V.: The dispersed cell superfusion system. - Greenstein B.D. (szerk.): Neuroendocrine Research Methods. Harwood Academic Publishers, London, 1991.

201.

Rékási Z., Csernus V., Horváth J., Vígh S., Mess B.: Long-Term Dynamic in vitro System for Investigating Rat Pineal Melatonin Secretion. J. Neuroendocrinol. 3: 563-568. 1991.

202.

BREAKTHROUGH OF THE YEAR: The Runners-Up. Science. 278: 2039-2042. 1997.

203.

BREAKTHROUGH OF THE YEAR: The Runners-Up. Science. 282: 2157-2161. 1998.

204.

Simonneaux V., Poirel V.J., Garidou M.L., Nguyen D., Diaz-Rodriguez E., Pévet P.: Daily rhythm and regulation of clock gene expression in the rat pineal gland. Brain Res. Mol. Brain Res. 120: 164-172. 2004.

205.

Fraser I.H., Wainwright S.D.: The influence of lighting conditions upon the level and course of increase in specific activity of serotonin N-acetyltransferase in the developing chick pineal gland. Can. J. Biochem. 54: 103-109. 1976.

206.

Akasaka K., Nasu T., Katayama T., Murakami N.: Development of regulation of melatonin release in pineal cells in chick embryo. Brain Res. 692: 283-286. 1995.

207.

Herichová I., Zeman M., Macková M., Griac P.: Rhythms of the pineal Nacetyltransferase mRNA and melatonin concentrations during development inchicken. Neurosci Lett. 298: 123-126. 2001.

208.

Faluhelyi N., Csernus V.: The effects of environmental illumination on the in vitro melatonin secretion from the embryonic and adult chicken pineal gland. Gen. Comp. Endocrinol. 152: 154-158. 2007.

209.

Zeman M., Gwinner E., Herichová I., Lamosová D., Kost'ál L.: Perinatal development of circadian melatonin production in domestic chicks. J. Pineal Res. 26: 28-34. 1999.

210.

Nakahara K., Abe Y., Murakami T., Shiota K., Murakami N.: Pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide (PACAP) is involved in melatonin release via the specific receptor PACAP-r1, but not in the circadian oscillator, in chick pineal cells. Brain Res.939: 19–25. 2002.

211.

Csernus V., Jozsa R., Reglodi D., Hollosy T., Somogyvari-Vigh A., Arimura A.: The effect of PACAP on rhythmic melatonin release of avian pineals. Gen. Comp. Endocrinol.135: 62–69. 2004.

212.

Józsa R., Somogyvári-Vigh A., Reglödi D., Hollósy T., Arimura A.: Distribution and daily variations of PACAP in the chicken brain. Peptides. 22: 1371-1377. 2001.

213.

Schomerus C., Laedtke E., Korf H.W.: Analyses of signal transduction cascades in rat pinealocytes reveal a switch in cholinergic signaling during postnatal development. Brain Res. 833: 39-50. 1999.

84

214.

Møller M., Baeres F.M.: PACAP-containing intrapineal nerve fibers originate predominantly in the trigeminal ganglion: a combined retrograde tracing- and immunohistochemical study of the rat. Brain Res. 984: 160-169. 2003.

215.

Harrington M.E., Hoque S., Hall A., Golombek D., Biello S.: Pituitary adenylate cyclase activating peptide phase shifts circadian rhythms in a manner similar to light. J. Neurosci. 19: 6637-6642. 1999.

216.

Nielsen H.S., Hannibal J., Knudsen S.M., Fahrenkrug J.: Pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide induces period1 and period2 gene expression in the rat suprachiasmatic nucleus during late night. Neuroscience. 103: 433-441. 2001.

217.

Chomczynski P., Sacchi N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159. 1987.

218.

Calvo J., Boya J.: Development of the innervation in the chicken pineal gland (Gallus gallus). Acta Anat. (Basel).103: 212-225. 1979.

219.

Yoshimura T., Suzuki Y., Makino E., Suzuki T., Kuroiwa A., Matsuda Y., Namikawa T., Ebihara S.: Molecular analysis of avian circadian clock genes. Mol. Brain Res. 78: 207-215. 2000.

220.

Yamamoto K., Okano T., Fukada Y.: Chicken pineal Cry genes: light-dependent upregulation of cCry1 and cCry2 transcripts. Neurosci. Lett. 313: 13-16. 2001.

221.

Okano T., Yamamoto K., Okano K., Hirota T., Kasahara T., Sasaki M., Takanaka Y., Fukada Y.: Chicken pineal clock genes: implication of BMAL2 as a bidirectional regulator in circadian clock oscillation. Genes Cells 6: 825-836. 2001.

222.

Bailey M.J., Chong N.W., Xiong J., Cassone V.M.: Chickens' Cry2: molecular analysis of an avian cryptochrome in retinal and pineal photoreceptors. FEBS Lett. 513: 169-174. 2002.

223.

Fu Z., Inaba M., Noguchi T., Kato H.: Molecular cloning and circadian regulation of cryptochrome genes in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). J. Biol. Rhythms 17: 14-27. 2002.

224.

Bailey M.J., Beremand P.D., Hammer R., Bell-Pedersen D., Thomas T.L., Cassone V. M.: Transcriptional profiling of the chick pineal gland, a photoreceptive circadian oscillator and pacemaker. Mol. Endocrinol. 17: 2084-2095. 2003.

225.

Chong N.W., Chaurasia S.S., Haque R., Klein D.C., Iuvone P.M.: Temporal-spatial characterization of chicken clock genes: circadian expression in retina, pineal gland, and peripheral tissues. J. Neurochem. 85: 851-860. 2003.

226.

Okabayashi N., Yasuo S., Watanabe M., Namikawa T., Ebihara S., Yoshimura T.: Ontogeny of circadian clock gene expression in the pineal and the suprachiasmatic nucleus of chick embryo. Brain Res. 990: 231-234. 2003.

227.

Yasuo S., Watanabe M., Okabayashi N., Ebihara S., Yoshimura T.: Circadian clock genes and photoperiodism: Comprehensive analysis of clock gene expression in the mediobasal hypothalamus, the suprachiasmatic nucleus, and the pineal gland of Japanese Quail under various light schedules. Endocrinology 144: 3742-3748. 2003.

228.

Helfer G., Fidler A.E., Vallone D., Foulkes N.S., Brandstaetter R.: Molecular analysis of clock gene expression in the avian brain. Chronobiol. Int. 23: 113-127. 2006.

229.

Toller G.L., Nagy E., Horvath R.A., Klausz B., Rekasi Z.: Circadian expression of Bmal1 and serotonin-N-acetyltransferase mRNAs in chicken retina cells and pinealocytes in vivo and in vitro. J. Mol. Neurosci. 28: 143-150. 2006.

230.

Rekasi Z., Horvath R.A., Klausz B., Nagy E., Toller G.L.: Suppression of serotonin Nacetyltransferase transcription and melatonin secretion from chicken pinealocytes transfected with Bmal1 antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid in superfusion system. Mol. Cell. Endocrinol. 249: 84-91. 2006.

85

231.

Li Y.P., Bang D.D., Handberg K.J., Jorgensen P.H., Zhang M.F.: Evaluation of the suitability of six host genes as internal control in real-time RT-PCR assays in chicken embryo cell cultures infected with infectious bursal disease virus. Vet. Microbiol. 110: 155-165. 2005.

232.

Nakamura T.J., Shinohara K., Funabashi T., Mitsushima D., Kimura F.: Circadian and photic regulation of cryptochrome mRNAs in the rat pineal gland. Neurosci. Res. 41: 2532. 2001.

233.

Miyamoto Y., Sancar A.: Circadian regulation of cryptochrome genes in the mouse. Brain Res. Mol. Brain Res. 71: 238 -243. 1999.

234.

Reddy A.B., Field M.D., Maywood E.S., Hastings M.H.: Differential resynchronisation of circadian clock gene expression within the suprachiasmatic nuclei of mice subjected to experimental jet lag. J. Neurosci. 22:7326-7330. 2002.

235.

Bae K., Jin X., Maywood E. S., Hastings M. H., Reppert S. M. and Weaver D. R.: Differential functions of mPer1, mPer2, and mPer3 in the SCN circadian clock. 2001. Neuron 30:525-536.

236.

Lincoln G., Messager S., Andersson H., Hazlerigg D.: Temporal expression of seven clock genes in the suprachiasmatic nucleus and the pars tuberalis of the sheep: evidence for an internal coincidence timer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 13890-13895. 2002.

237.

Tournier B.B., Menet J.S., Dardente H., Poirel V.J., Malan A., Masson-Pévet M., Pévet P., Vuillez P.: Photoperiod differentially regulates clock genes' expression in the suprachiasmatic nucleus of Syrian hamster. Neuroscience. 118: 317-322. 2003.

238.

Maywood E.S., O'Brien J.A., Hastings M.H.: Expression of mCLOCK and other circadian clock-relevant proteins in the mouse suprachiasmatic nuclei. J. Neuroendocrinol. 15: 329334. 2003.

239.

Karaganis S.P., Bartell P.A., Shende V.R., Moore A.F., Cassone V.M.: Modulation of metabolic and clock gene mRNA rhythms by pineal and retinal circadian oscillators. Gen. Comp. Endocrinol. 161: 179-192. 2009.

240.

Ikeda T., Iijima N., Munekawa K., Ishihara A., Ibata Y., Tanaka M.: Functional retinal input stimulates expression of astroglial elements in the suprachiasmatic nucleus of postnatal developing rat. Neurosci. Res. 47: 39-45. 2003.

241.

Sládek M., Sumová A., Kováciková Z., Bendová Z., Laurinová K., Illnerová H.: Insight into molecular core clock mechanism of embryonic and early postnatal rat suprachiasmatic nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 6231-6236. 2004.

242.

Ziv L., Levkovitz S., Toyama R., Falcon J., Gothilf Y.: Functional development of the zebrafish pineal gland: light-induced expression of period2 is required for onset of the circadian clock. J. Neuroendocrinol. 17: 314-320. 2005.

243.

Okamura H., Miyake S., Sumi Y., Yamaguchi S., Yasui A., Muijtjens M., Hoeijmakers J.H., van der Horst G.T.: Photic induction of mPer1 and mPer2 in cry-deficient mice lacking a biological clock. Science. 286: 2531-2534. 1999.

86