Hyaluronsav kifejeződése a vestibularis agytörzsi magokban csirke embryo fejlődése során Készítette: Hegedűs Viktória
Debrecen, 2013
1
Tartalomjegyzék Absztrakt………………………………………………………………………………………………………..3 Bevezetés……………………………………………………………………………………………………….4 Célkitűzések…………………………………………………………………………………………………..10 Anyagok és módszerek…………………………………………………………………………………..11 Eredmények…………………………………………………………………………………………………..14 Megbeszélés………………………………………………………………………………………………….19 Köszönetnyilvánítás………………………………………………………………………………………..22 Irodalomjegyzék…………………………………………………………………………………………….23 Függelék…………………………………………………………………………………………………………26 2
Rövidítések jegyzéke bHABP ‐ biotinilated hyaluronan binding protein, biotinilált Hyaluronsav Kötő Fehérje Bral ‐ brain link protein BSA ‐ Bovine Serum Albumin CRP ‐ komplement reguláló protein Crtl ‐ cartilage link protein CSPG ‐ chondroitin‐szulfát proteoglycan DAB ‐ diaminobenzidin ECM ‐ extracelluláris mátrix EGF ‐ epidermal growth factor E7 ‐ 7 napos fejlődési stádium GAG ‐ glükózaminoglycan HA ‐ hyaluronsav HAS ‐ hyaluronsav szintetáz HAPLN ‐ hyaluronan‐ and proteoglycan‐binding link protein gene family HH ‐ Hamburger‐Hamilton LYVE‐1 ‐ lymphatic endothelial hyaluronan receptor NVS ‐ nucleus vestibularis superior NVL ‐ nucleus vestibularis lateralis NVM ‐ nucleus vestibularis medialis NVD ‐ nucleus vestibularis descendens TN ‐ tenascin PBS ‐ foszfát puffer PG ‐ proteoglycan PNN ‐ perineuronális hálózat, net RHAMM ‐ receptor for hyaluronic acid mediated motility TN ‐ tenascin
3
Absztrakt A fészekhagyó madarakra jellemzően a fiatal csirke (Gallus domesticus L.) nem sokkal kelése után már lát, képes hangadásra, tud járni és táplálkozni. E viselkedési jelenségek az alapvető motoros és sensoros, illetve homeostaticus agyi területek megfelelő fejlettségét feltételezik már a kelés pillanatában. Korábbi vizsgálatok szerint a neuronokat körülvevő extracelluláris matrix (ECM) makromolekulái szoros kapcsolatban vannak az idegsejtek aktivitásával. Vizsgálataink célja ezért a hyaluronsav (HA) expressziójának immunhisztokémiai vizsgálata a csirke embryo idegrendszerében, az agytörzsi vestibularis magok területén. A csirke embryokat a keltetés megszakításával nyertük 7 fejlődési stádiumból, melyek 7 napos (E7), E9, E11, E13, E15, E18 és E20 stádiumok. Az embryoból, azok preparálása majd paraffinba ágyazása után, metszetek készültek a HA hisztokémiai kimutatására. A HA jelen volt a vestibularis magok mindegyikében a legkorábbi vizsgált stádiumban is. A nucleus vestibularis medialisban a neuropil jelölődése 15 napos stádiumig erősödött, E20‐ig pedig egy közepesen fejlett sejt körül ECM kondenzáció, perineuronális net (PNN) jelent meg a mag sejtjei körül. A nucleus vestibularis lateralisban a neuropil jelölődése E13 stádiumig erősödött, majd ettől a stádiumtól egy intenzíven jelölődő PNN alakult ki E20‐ig fokozatosan. A nucleus vestibularis superiorban a neuropil HA festődése E15 stádiumig emelkedett, E20‐ig pedig egy közepes PNN alakult ki a neuronok körül. A nucleus vestibularis descendensben 11 napos stádiumig tapasztaltunk gyorsan erősödő jelölődést, a PNN pedig E15‐től fokozatosan erősödve volt jelen. Ezen eredmények utalnak a HA neuronhálózatok kialakulásában betöltött jelentőségére. A vestibularis magokban kialakult erős PNN utal a neuronhálózatok korai fejlődésére, ezzel szoros kapcsolatban pedig a testtartásban, motoros és sensoros koordinációban betöltött szerepére.
4
Bevezetés Az extracelluláris mátrix (ECM) egy komplex molekuláris strukturális hálózat, amely dinamikus rendszerként működik. Változatos összetételű, a sejtek által termelt és lebontott elemek alkotják, ezért mennyisége, összetétele és szerkezete nagy eltéréseket mutat az egyes fajok között, vagy egy fajon belül is az egyedfejlődés során, sőt összetétele és felépítése jellemző az adott szervekben egyeden belül is. Extracelluláris mátrix legnagyobb mennyiségben a kötőszövetben (porc) található, jelenlétét a központi idegrendszer (KIR) extracelluláris terében csak az utóbbi időben igazolták (Margolis, 1975). Az ECM‐et különböző felépítésű és tulajdonságú makromolekulák építik fel. Fő komponensei a kollagén, elastin, hyaluronsav, proteoglycanok és a glycoproteinek (Szabó, 2004; Zimmermann, 2008; Dityatev, 2003). A kollagén molekula három polipeptid láncból áll, melyeket L‐láncnak nevezünk. Ezek egymással összetekeredve, egy tripla helixet képeznek, melyeket hidrogén‐kötések erősítenek. Mivel a láncok különbözőek lehetnek, mind méretüket tekintve, mind aminosav felépítésüket nézve, így ezek alapján több kollagén típust különíthetünk el. Mai ismereteink szerint 19 kollagén típust tudunk azonosítani, az L‐lánc aminósav összetétele alapján. Jellemzőek az egyes típusok előfordulási helyei: az I. típusú kollagén található a bőr kötőszövetében, csontban, ínakban, ízületi szalagokban, amely helyeken a különböző mechanikai erőkkel szembeni ellenállást biztosítja. II. típusú kollagén van jelen a porcban, itt is az előbb említett funkciót tölti be a molekula. III. típusú kollagén alkotja a szervek (máj, lép) kötőszövetét, ahol az erősítés mellett a rugalmasságot is biztosítja (Ross, 2007). Az elastin hidrofób fehérje, mely az ECM rugalmasságát biztosítja. Többféle sejt termeli (simaizom sejtek, rugalmas porc sejtjei, kötőszövet fibroblasztjai), majd több molekula között létrejövő keresztkötések következtében rostok, rácsok alakulnak ki, melyek között az említett keresztkötések felbomlanak a húzóerő hatására, de az erő megszűntével visszanyerik azokat, vagyis eredeti térszerkezetüket, és ezzel a tulajdonságával tudja a rugalmasságot biztosítani. Ezért nagy számban találhatóak artériák falában, bőrben, tüdőben (Szabó, 2004). Az idegrendszer extracelluláris terében nem mutatható ki. 5
A hyaluronsav N‐acetil‐glükózaminból és glükuronsavból felépülő egység. Nagyobb mennyiségben az embrionális szövetekben, ízületi folyadékokban vagy az üvegtestben van jelen. Kiemelkedő tulajdonsága a vízkötő képessége, az ECM‐ban gél állapotban található, amely által akadályozza a makromolekulák transzportját az extracelluláris mátrixon keresztül (Szabó, 2004; Bignami, 1992). Szintézisét a HA szintetáz végzi, melynek több isoformáját is ismerjük: HAS‐1, HAS‐2, HAS‐3. Elhelyezkedésüket tekintve azonosak, mivel mind a plazma membránban találhatók, viszont különböznek abban, hogy eltérő hosszúságú HA láncokat termelnek, különböző gyorsasággal. Míg a legrövidebb HA láncot (lánc hosszúság: 100‐1000 monomer) a HAS‐3 termeli a leghosszabb idő alatt, addig a másik két isoforma tízszer gyorsabban teszi ezt, ahol a lánc hosszúsága 200‐2000 monomer egységig is terjedhet. Ezek molekula tömege 63‐65 kDa. Az eltérő termelési idő és lánc hosszúságok szerepet játszhatnak az ECM struktúrájában és annak mechanikai ellenálló képességében (Kwok, 2011). A proteoglycanok (PG) közül a központi idegrendszerben elsősorban az ún. chondroitin‐ szulfát proteoglycanok (CSPG‐ok) fordulnak elő (Zimmermann, 2008). A CSPG‐ok közé tartozik a lectikánok kitüntetett csoportja, amely olyan nagyméretű molekulákat jelent, melyekben egy tengelyfehérjéhez (core protein) glükózaminoglycán (GAG) oldalláncok kapcsolódnak kovalens kötéssel. Ez utóbbiak poliszacharidok, melyek ismétlődő diszacharidokból épülnek fel. Egy proteoglycan egységben változó számú GAG kötődik a tengely fehérjéhez, melynek egyik végén egy hyaluronsav–kötő régió található, ahol az ide kapcsolódó hyaluronsav–proteoglycan kapcsolatot egy kötő fehérje (link protein) is erősíti (1B. ábra) (Ross, 2007). A PG‐ok családjába tartozik az aggrecan, a versican, a neurocan és breivican. Felépítésüket tekintve három nagy domént különíthetünk el rajtuk, melyek közül a G1‐domén, amely egy immunglobulin‐szerű hurkot, illetve két proteoglycan ismétlődést tartalmaz, az N‐terminális végen található. A C‐terminális részen helyezkedik el a G3‐domén, mely egy EGF‐(epidermal growth factor) és egy komplement reguláló protein (CRP) domént foglal magába. Ezeken keresztül kötődnek a lectinek a különböző protein és szénhidrát ligandjaikhoz. Az N‐ és C‐terminális rész között egy központi domén helyezkedik el, melyben a GAG kötőhelyek találhatóak (Hardingham, 1973). Ide a versican esetében közel 17‐23 GAG 6
kapcsolódik, neurocan esetében 3 darab, míg a brevicanhoz 0‐5 darab. A kötődő GAG számától függően változik a molekulasúlyuk, aggrecan esetében ez 244kDa, melyet az idegsejtek termelnek. A versican molekulasúlya 371 kDa és szintén az idegsejtek termelik, egyes izotípusát, a V2‐t pedig az oligodendrocyták. A neurocan (141 kDa) szintézisének helye az astrocytákban található. A brevican 97 kDa (Zimmermann, 2008). Szövettanilag kimutatható mennyiségű brevicant és neurocant eddig csak az idegrendszerben találtak (Yamada és mtsai, 1994; Seidenbecher és mtsai, 1995; Jaworski és mtsai, 1995, 1996), azonban az NCBI UniGene EST adatbázisa szerint más szövetekben is találunk némi expressziót. A glycoproteinek olyan fehérjék, melyek többségének feladata, hogy ECM alkotókat kössön össze egymással, vagy a sejtmembránban található receptorokkal, így befolyásolják a mátrix szerveződését, szabályozzák a sejtek struktúrához való kötődését. Az idegrendszerben előforduló glycoproteinek a fibronektinek, lamininek, tenascinok, és az ún. link proteinek. (Szabó, 2004). A laminin egy kereszt alakú, 70nm hosszú fehérje, amely nagy affinitású kötőhelyekkel rendelkezik a lamina bazális egyéb komponensei számára, mivel a lamina bazális, amely az extracelluláris mátrix képződménye, egyik fő alkotója maga a laminin. A tenascinok (TN) ECM glycoproteinek, melyeket a központi idegrendszer sejtjei termelnek (Erickson, 1993; Joester 2011). Ebbe a családba tartozik a TN‐C, ‐R, ‐W, ‐X és –Y. Fontos szerepet játszanak az idegszövet fejlődésében, regenerációjában és sejt migrációban (Kwok, 2011). N‐terminális végükön különböző ismétlődéseket tartalmaznak, úgy mint EGF‐szerű, fibronektin‐szerű és cisztein heptád ismétlődések, melyek mind a multimerizációban vesznek részt. C‐terminális végükön a fibrinogén β‐ és γ‐láncával mutat homológiát (Weber, 1998; Chiquet‐Ehrismann, 1990). A link protein olyan fehérje család, melynek funkciója, hogy stabilizálja a HA és CSPG‐ok kapcsolatát. Négy tagja a HAPLN 1 (hyaluronan‐ and proteoglycan‐binding link protein gene family) vagy más néven Crtl‐1 (cartilage link protein), a HAPLN 2 vagy Bral‐1 (brain link protein), a HAPLN 3 és a HAPLN 4 vagy Bral‐2. Súlyuk közel 38‐43 kDa és felépítésüket 7
tekintve azonosnak mondhatjuk őket. Tartalmaznak egy N‐terminális szekvenciát, egy Ig domént és két egymást követő link modult, amelyeknek a HA kapcsolódásában van fontos szerepe. A HAPLN 3 kivételével mind a négy link protein megtalálható a központi idegrendszerben, ezt viszont csak a simaizom illetve a placenta termeli (Kwok, 2011; Galtrey 2008). Az ECM idegrendszerben betöltött funkciói között említhetjük a synapticus kapcsolatok stabilizálását, valamint az EC ion homeostasis fenntartását, emellett részt vesz a sejtek migrációjábán illetve fontos szerepe van a regenerációban és fejlődésben (Dityatev, 2003, 2006, 2010). Az ECM megjelenése az idegrendszerben Az ECM makromolekulái az idegsejtek közötti térben (neuropil) helyezkednek el, és alkotnak a neuron és gliasejtek felületére kihorgonyzott hálózatot. Összetétele, így szövettani megjelenése regionális elrendeződést mutat. Hatással van rá az övezett neuronok funkciója és aktivitása, illetve ez ellenkezőleg is igaz. Az ECM speciális kondenzációja egyes neuronok perikaryonja, dendritek proximális szakasza és az axon hillock körül az ún. perineuronális net (PNN) (1. ábra) (Dityatev, 2006). Ezen kívül megjelenik periszinaptikusan és a Ranvier féle befűződésekben is, melyek fontos funkcionális előfordulási helyei.
B
A
1. ábra. A, ECM struktúra sémás rajza. A HA a hálózat szervező lánca, ehhez kapcsolódnak a chondroitin‐szulfát proteoglycánok, számos GAG oldallánccal. Kapcsolataikat a tenascinok és a link proteinnek stabilizálják. B, HA a patkány nucleus vestibularis lateralisának neuronjait és nyúlványainak proximalis szakaszait hüvelyező PNN‐ben. HA a neuropilben is látható. 8
A madarak egyensúlyérző rendszere A madarak, igy a csirke nervus vestibulocochlearisa (VIII. agyideg) a belső fül érzékszervi ganglionjaiból eredő pars vestibularisból és pars cochlearisból alakul ki, és lép majd be az agytörzsbe a híd‐nyúltvelő határán. Az agytörzsbe belépve rostjaira válik, és végződik agyidegi magjaikban. Az egyensúlyérző rendszer agytörzsi magjai a híd tegmentumában helyezkednek el, illetve beterjednek a középső kisagy karba is kismértékben. A nucleus vestibularis superior (NVS) a híd tegmentumának dorsális részében helyezkedik el, a IV. agykamra lateralis nyilása magasságában. Lateral és medial felől fehérállomány, a középső és felső kisagy karok rostjai határolják. A magot kisméretű sejtek alakítják ki. A nucleus vestibularis lateralis (Deiters; NVL) az előbbitől ventralisan és caudalisan helyezkedik el hosszan, és az obex szintje felett végződik a nyúltvelőben. A magot nagy (magnocellularis) és óriás (gigantocellularis) neuronok alkotják. A nucleus vestibularis medialis (NVM) közvetlenül a negyedik agykamrát bélelő ependyma alatt helyezkedik el. Rostralisan a középvonaltól lateralisan, a sulcus terminalis vonalánál, caudalisan viszont egyre jobban a középvonal felé tart, majd végződik a nyúltvelő nyílt részében. Kis sejtek alkotják. A nucleus vestibularis descendens (NVD) az előbbivel párhuzamosan fut, hasonló rostro‐caudalis kiterjedésben, ám attól ventro‐ lateralisan. Leginkább közepes méretű sejtek alkotják. Ezeken kívül megkülönböztetnek (Wold, 1975) két sejtcsoportot, az ún. ’group A’‐t, illetve ’group B’‐t, melyek szintén a vestibularis adatfeldogozásban vesznek részt. A ganglion vestibulareból érkező rostok a nucleus vestibularis superiorban, nucl. vestib. lateralis ventralis részében, a nucl. vestib. medialisban és a nucl. vestib. descendensben végződnek. Ezen kívűl kap rostokat a ’group A’ és ’group B’ sejtcsoport is. A vestibularis magok sejtjei számos idegrendszeri kapcsolattal rendeleznek. A NVS, a NVL és a NVM felszálló rostokat küld a superior, lateralis és a medialis vestibularis mag a nucl. dorsolateralis posterioir thalamiba, illetve a fasciculus longitudinalis medialison keresztül a nucl. interstitialis (Cajal), nucl. pretectalis medialis, nucl. spiriformis medialis, nucl. intercollicularis és a szemmozgató agyidegi magvak felé. Leszálló rostjaik szintén a fasciculus longitudinalis medialisban, azonos és ellenoldalon haladnak a gerincvelő cervicalis és 9
thoracalis szakaszaihoz. Ezeken kívül számos commissuralis kapcsolattal is rendelkeznek. Számos rostot küldenek és fogadnak a kisagy felől is. A kisagyi IX.b és X. foliumok és a lobus auricularis, valamint a II‐IX.foliumok tartanak fenn közvetett és közvetlen kapcsolatot a vestibularis magokkal. A NVD elsősorban gerincvelői projekcióval rendelkezik (Lumsden, 1990, Nieuwenhuys, 1998, http://www.amsbio.com/datasheets/400762.pdf, http://www.rndsystems.com/pdf/AF3865.pdf,http://www.rndsystems.com/molecule_detail .aspx?m=2712).
10
Célkitűzések Az ECM makromolekulák szerepe azért fontos, mert nem csak néma alkotói az extracelluláris mátrixnak az idegszövetben, hanem aktív résztvevői is. Ahhoz, hogy a tojásból kikelt csirke nem sokkal a kelést követően önálló táplálkozásra és koordinált mozgásra legyen képes, megfelelően fejlett idegrendszerre van szüksége már a kelés pillanatától. Vizsgálataink célja, hogy a csirke embryo fejlődése során nyomon kövessük a vestibularis rendszer agytörzsi magjaiban kialakuló extracellularis matrix molekuláinak térbeli elrendeződését és időbeli megjelenését. Vizsgálataink során a hyaluronsavat, mint az központi idegrendszeri ECM legfőbb szervező molekulájának időbeli változását követjük a csirke embryonális fejlődése során. Ezek térbeli eloszlását és időbeli megjelenését hisztokémiai módszerrel vizsgáltuk, a kijelölt 7‐9‐11‐13‐15‐18 és 20 napos kelés előtti stádiumokban a csirke agytörzsi vestibularis magjaiban; ezek a nucleus vestibularis medialis, lateralis, superior és descendens.
11
Anyagok és módszerek Vizsgálatainkat csirke embryokon végeztük, melyekből a hagyományos szövettani beágyazást követően metszetek készültek a hyaluronsav hisztokémiai kimutatása céljából, az alábbiak szerint: Szövet preparálás, metszet készítés Első lépésként a derecskei baromfikeltető üzemből vásárolt házityúk (Gallus domesticus L.) tojásokat keltetőgépbe helyeztük, majd előre kijelölt fejlődési stádiumokban megszakítottuk azok fejlődését. A kijelölt stádiumok pedig : 7, 9, 11, 13, 15, 18, 20 nap. Minden egyes stádiumból két embryoval dolgoztunk. A tojásból kivett embryokat 4% formalinban fixáltuk, amit a szerkezet megőrzésének céljából végzünk. A formalin a formaldehid vizes oldata, amely szobahőmérsékleten egy színtelen, erős szagú mérgező gáz, az oldatát szilárd állapotú para‐formaldehid desztillált vízben oldásával készítettük kevés 1N lúg hozzáadásával, kémhatását 0.2M foszfát pufferrel állítottuk be pH=7,4 értékre. Rögzítő hatását a fehérje molekulák között létrehozott keresztkötései révén biztosítja.
3. ábra A folyamat lépései képekben: 1,2: A tojáshéj feltörése, és eltávolítása; 3: Az embryo eltávolítása a tojásból; 4,5: Az embryo fixáló oldatba helyezése
12
Az embryok egy éjszakán át fixálódnak, majd a fölös fixálót vízben mossuk ki a mintákból. Következő lépésben víztelenítjük, mivel a beágyazó anyag (paraffin) hidrofób természetű. A dehidrálás etanolban történik, mely során a lemosott szövetdarabokat „felszálló” alkohol soron visszük 4. ábra Szilárduló paraffin az öntőformában keresztül, ami azt jelenti, hogy az egyes oldatok alkohol tartalma egyre nő: az első 50% majd 70%, 80%, 96% végül 100%. Ezután az anyagot xylolba merítjük, amely egyben a beágyazó anyagnak is oldószere, s segít a szövetmintába való bevitelében. A beágyazás során olvadt paraffint használunk, amely penetrálja a víztelenített, xylollal
átjárt
szövetdarabunkat,
majd
a
hőmérséklet
változtatásával a beágyazó anyag szilárd fázisúvá válik, úgynevezett „blokk” formában tartja. Az általunk használt formája a paraffin viasz, ami szobahőmérsékleten fehér szilárd anyag. Beágyazáskor 56⁰C‐on megolvasztott paraffint az öntőformában 5. ábra Paraffin blokk a lévő szövetmintára öntjük és így blokkfára erősítve szobahőmérsékleten, amíg megszilárdul.
hagyjuk
pihenni
A metszet készítésének célja, hogy a viasz blokkot a beágyazott szövettel blokkfára erősítjük, ezután befogható a mikrotomba. A szövetet megfelelő vastagságú szeletekre, esetünkben 8μm vastagságúra metsszük, hogy azok fénymikroszkóppal átvilágíthatóak legyenek. Mivel a metszetek színtelenek, így alkalmatlan natív állapotban fénymikroszkópos vizsgálatra, ezért megfestjük őket (Gomba, 2005). Hisztokémia Vizsgálatainkban az extracelluláris mátrix molekuláinak kimutatását hisztokémiai módszerrel végeztük. A hyaluronsavat, specifikusan ismeri fel a biotinilált Hyaluronsav Kötő Fehérje (bHABP: biotinilated hyaluronan binding protein), amely ízületi porc aggrecan tengelyfehérje izolált hyaluronsav kötő doménje. A metszetbe kötődött proteinhez ezután az ABC reakció
13
elv szerint ExtrAvidin Peroxidase‐t kapcsolunk, s végül DAB reakcióval tesszük láthatóvá. 6. ábra Borjú orrporc aggrecan core proteinjéből izolált hyaluronsav kötő régió, melyet a HA specifikus kimutatására használunk. HA és aggrecan kapcsolatát a link protein stabilizálja.
A reakció pontos leírása: először a kiválasztott metszeteket xylolban deparaffináljuk, amivel célunk a paraffin kioldása, hogy ne tartalmazzon a metszet hidrofób anyagot. A második lépésben az anyagot a rehidráljuk, ekkor leszálló alkohol soron keresztül a szövetminta végül desztillált vízbe kerül. Ezután 3%‐os H2O2 oldatban tartjuk a metszeteket néhány percig az endogén peroxidázok gátlása miatt, mely egyúttal elszínteleníti a vörösvértesteket is. Újabb desztillált vizes mosás után az aspecifikus kötőhelyek „blokkolását” végezzük, sós foszfát pufferben (PBS) oldott 2% Bovine Serum Albumin‐nal (BSA). Erre azért van szükség, mert az antitestek nem csak az általunk kimutatni kívánt antigénekhez kapcsolódnak, hanem egyéb fehérjékhez is kapcsolódhatnak és ezáltal álpozitivitást adhatnak. A blokkolás után a primer jelölőmolekulát tartalmazó PBS oldatban inkubáljuk a metszeteket egy éjszakán át 4oC‐on (Seikagaku, 1:50); majd a feleslegben jelen lévő primer jelölőanyag PBS‐ben történő lemosása után a hyaluronsav próba biotinjához specifikusan kötődő, PBS‐ben oldott ExtrAvidin Peroxidase‐ban inkubálunk egy órán keresztül (1:200). Ez utóbbi a peroxidáz enzim, H2O2 jelenlétében a DAB‐ot (diaminobenzidin, Fluka, Sigma Aldrich) barna színű csapadékká alakítja, ezzel teszi számunkra láthatóvá a kívánt antigént (60 ml TRIS puffer, pH=7,4, 30 mg DAB, 20 µl H2O2). Utolsó lépésben felszálló alkoholsorban dehidráljuk a metszeteinket, és DPX fedő médiummal vonjuk be, majd rájuk fedőlemezt helyezünk. A reakció specificitását két módon ellenőriztük. Az egyik csoportban, a metszeteket a bHABP nélkül inkubáltuk. Pozitív kontrol a metszetben mindig megtalálható, a koponyához tartozó HA‐ban gazdag hyalinporc volt. A mikroszkópos felvételeket Nikon Eclipse E800 mikroszkóppal készítettük. 14
Eredmények A csirke idegrendszerének fejlődése 23‐25 órával a keltetés megkezdésétől már felismerhető, akkor jelenik meg a velőlemez a csírakorong közepén, a szikhártyához rögzítve. Körülbelül a 23. órában már a velőbarázda is felismerhető, s 27 óra elteltével megindul a velőcső záródása is, amely néhány óra alatt lezajlik (Hamburger and Hamilton, 1951). Ezt követően a velőcsőben minőségi és mennyiségi változások mennek végbe. A velőcső rostralis fele Hamburger‐Hamilton (HH) szerinti 9‐10 stádiumban (22‐33 óra) megnagyobbodik és két hólyagot, majd további hólyagokat alakít ki. Ezek lesznek az archencephalon, a későbbi telencephalonok hólyagjai, és a deuterencephalon, a későbbi mesencephalon és rhombencephalon telepei. Vizsgálatainkat a rhombencephalon hólyagból kifejlődő hídban és nyúltvelőben végeztük. A rhombencephalon már elkülönülésének stádiumában szegmentumokra oszlik, melyek az ún. rhombomerek. Csirkében 8 rhombomert különítettek el, amelyekből kifejlődnek az agytörzsi autonóm és szomatikus sensoros‐ és motoneuronok, köztük a vestibularis magok sejtjei is. A rhombomer határok a HH24 stádiumtól kezdenek eltűnni, majd a HH27‐ban már nem ismerhetők fel; ez 5‐5 és fél napos állapotnak felel meg, a keltetés kezdetétől számítva. Az agytörzsi magkomplexumokat csak a rhombomer határok eltűnése után vizsgálhatjuk. Előzetes vizsgálataink alapján az agytörzs későbbi rendezettségére emlékeztető legkorábbi ideje körülbelül a 7. napra tehető, ezért az embryok gyűjtését és a HA kimutatását is ettől a stádiumtól kezdtük meg. 7 napos stádium Ebben a korai stádiumban az egyes vestibularis magok csak hozzávetőleg különíthetők el egymástól a cytoarchitectonikai kép alapján, de már felismerhetők bizonyos regionális különbségek a HA eloszlásában a vestibularis magkomplex területén (7. ábra). A sejttestek közötti térben, a neuropilben a HA reakció pozitív, ugyanakkor a perineuronalis net (PNN) még nem látható a vestibularis magok egyikében sem. A legerősebb reakció a NVM‐ban és NVS‐ban látható. Ezt követi a NVL, majd pedig a NVD.
15
7. ábra. HA reakció a NVM, NVL, NVS és a NVD területén. 7 napos stádium. Lépték 25 μm valamennyi mikroszkópos felvételen. A felvételek 40X objektívvel készültek. 9 napos stádium A HA intenzitása az EC térben hasonló az előző stádiumhoz képest a NVM, NVL és a NVS területén, ugyanakkor jelentősen erősödött a NVD‐ben (8. ábra). PNN még egyik magban sem alakult ki.
PCM
8. ábra. HA reakció a NVM, NVL, NVS és a NVD területén. 9 napos stádium. (PCM ‐ pedunculus cerebellaris medius) A felvételek a 9 napos, illetve a további stádiumokban, 20X objektívvel készültek. 11 napos stádium A NVM‐ban a neuropil HA jelölődése intenzívebb volt az előző stádiumhoz képest, és a sejtek körül elkezdődött egy vékony PNN kondenzációja is (9. ábra). A NVL‐ban és a NVS‐ban a HA reakció erőssége hasonló volt az előző stádiummal összehasonlítva a neuropilben, és a PNN még nem különül el. A NVD sejtközötti terében nagymértékben nőtt a HA reakció intenzitása, viszont PNN itt sem különíthető el a neuropiltől.
16
9. ábra. HA reakció a NVM, NVL, NVS és a NVD területén. 11 napos stádium. 13 napos stádium A NVM‐ban enyhe erősödést mutatott a HA jelölés az előző stádiumhoz képest, de PNN megjelenése a szerveződés előző állapotához képest nem változott (10. ábra). Az erős jelölés egyenletes eloszlásúnak tűnt a neuropilban. A NVL‐ban a neuropil erős jelölődést mutatott, és a maghoz tartozó nagyméretű neuronok egy része körül gyenge PNN kezdett megjelenni, a kisméretű sejtek körül nem jelent meg PNN. A NVS‐ban erősödött a jelölés, de a PNN nem kondenzálódott a sejtek körül. A NVD‐ben nem látható a jelölés erősödése, és PNN sem jelent meg a korábbi stádium óta.
n lam
10. ábra. HA reakció a NVM, NVL, NVS és a NVD területén. 11 napos stádium. (IV. – ventriculus quartus; n lam ‐ nucleus laminaris). Nyílhegy: PNN egy nagyméretű neuron körül, nyíl: kisméretű neuronok PNN nélkül. A kinagyított kép a nagyméretű neuront mutatja. 17
15 napos stádium Általánosságban elmondható, hogy a neuropilben nem növekedett láthatóan a HA reakció intenzitása, viszont több helyen megkezdődött a perineuronalis net kialakulása (11. ábra). A NVM‐ban a neuropil bár erősen jelölődött, a jelölés intenzitása nem emelkedett a korábbi stádiumhoz képest a PNN további kondenzációja nem figyelhető meg. A NVL‐ban intenzívebb lett a PNN festődése a nagy sejtek egy része körül (11. ábra, második kép nyíl). A NVS‐ban az előző stádiumhoz képest nem látható a jelölődés intenzitásának növekedése, illetve PNN sem kondenzálódik neuronok körül. A NVD, ebben a stádiumban jól kivehetően, kis‐ és nagy méretű neuronokat tartalmaz. A nagyméretű neuronok körül erős PNN alakult ki, míg a kisméretű neuronok körül és a neuropilben egyenletes HA jel volt látható.
11. ábra. HA reakció a NVM, NVL (nyíl: intenzíven festődő PNN), NVS és a NVD területén. 15 napos stádium. 18 napos stádium A neuropilben a HA jelölődés nem mutatkozott intenzívebbnek a 15 napos stádiumhoz képest, viszont egyes területeken megindult perineuronalis hálót kialakító HA reakció intenzitásának erősödése (12. ábra). A NVM‐ban már a sejtek nagy része körül felismerhető egy igen gyenge perineuronalis háló, de a sejtek többségét homogén megjelenésű, HA‐ban gazdag neuropil határolja. A NVL‐ban igen intenzív HA jelölődést mutatott a PNN a nagyméretű neuronok sejttestje körül (12. ábra, második kép nyíl). A PNN jól felismerhető a dendritek metszetbe eső proximalis 18
szakaszai körül is. A NVS‐ban gyengülés tapasztalható a neuropilben a 15 napos stádiumhoz képest, és PNN sem ismerhető fel. A NVD‐ben a neuropilben a HA reakció intenzitása kismértékben csökkenni látszik, és PNN is ugyan jelen van a nagyméretű perikaryonok körül, de csökkent intenzitással, a 15 napos stádiumhoz képest.
12. ábra. HA reakció a NVM, NVL (nyílhegy: erősen festődő PNN), NVS és a NVD területén. 18 napos stádium. 20 napos stádium A neuropilben általánosan nem emelkedett a HA reakció intenzitása, de a magokban a PNN majdnem mindenhol megjelent közepes vagy erős festődést mutatva (13. ábra). A NVM‐ban a neuropil HA festődése hasonló erősségű volt, mint az előző stádiumban, és egy gyenge PNN kondenzáció volt kivehető az idegsejtek nagy része körül. A NVL‐ban egy hyaluronsavban igen gazdag neuropil és PNN mutatkozott. A négy vestibularis mag közül itt alakult ki a legerősebb perineuronalis háló. A NVS‐ban a sejtek egy része körül megjelent egy gyenge PNN, viszont a neuropil jelölődése nem erősödött. A NVD‐ben folyamatosan jelen van a HA‐ban gazdag neuropil és közepesen festődő PNN jelenik meg a nagyméretű sejtek körül.
13. ábra. HA reakció a NVM, NVL, NVS és a NVD területén. 20 napos stádium. 19
Megbeszélés Kísérleteinkben vizsgáltuk a HA reakció kifejeződését csirke embryo fejlődése során az agytörzsi vestibularis magkomplex területén. Vizsgálataink azt mutatták, hogy az egyedi vestibularis magok között különbség van a HA megoszlásában, emellett az életkor előrehaladtával változik mind a HA reakció intenzitása, mind annak lokalizációja. A kezdeti stádiumokban csak a neuropil területén figyelhető meg a reakció, a neuronok körüli PNN csak a későbbiekben lakul ki. A HA fontos szerepet játszik a fejlődés során a sejtproliferációs, sejtadhéziós és a sejtvándorlási folyamatokban (Lee and Spicer, 2000; Toole, 2001). Feltételezik, hogy a HA a neuronok differenciálódásához szükséges faktor, ennek pontos mechanizmusa azonban nem ismert. Valószínűnek látszik az, hogy a HA egy erősen hidratált környezetet hoz létre a sejtek körül, elősegítve ezzel migrációjukat. Ezt az elméletet alátámasztani látszik az az adat, amelyben az egér fejlődő cerebellumában a HA jelenlétét írták le migráló neuronok útvonalán (Baier és mtsai 2007). Ezen kívül, a sejtfelszín receptoraihoz, mint a CD44, RHAMM (receptor for hyaluronic acid mediated motility) és a LYVE‐1 (lymphatic endothelial hyaluronan receptor) kötődve a HA részt vesz különböző szignál transzdukciós útvonalakban (Lee and Spicer, 2000; Toole, 2001; Turley et al., 2002). Irodalmi adatok szerint a HA expresszió már a neuruláció kezdetén megjelenik a formálódó velőcső falában (Bakers és mtsai 2004). Arra vonatkozóan azonban nincsenek irodalmi adatok, hogy a fejlődő agytörzsben, és ezen belül a vestibularis magokban milyen a HA időbeli és térbeli megjelenése. Intézetünkben végzett vizsgálatok szerint csirke embryo gerincvelőben a neuruláció lezajlása után a HA egyre nagyobb mennyiségben jelenik meg és a HH23 (3 és fél nap) stádiumban körülveszi a canalis centralis körül levő proliferáló sejteket (Mészár és mtsai 2008). Ezen sejtpopulációtól laterális irányban már a differenciálódó sejteket találjuk, így a két sejtcsoport HA‐ban gazdag ECM‐al van elválasztva egymástól. A HA reakció ekkor még diffúz megjelenést mutat, PNN még nem látható. Mivel a vestibularis magok területén is élénk sejtproliferáció és differenciálódás figyelhető meg a fejlődés korai stádiumában, a HA szerepe a gerincvelőhöz és más agyterületekhez hasonlóan itt is valószínűsíthető. A gerincvelő területén a fejlődés előrehaladtával jelentősen csökkent a HA reakció intenzitása. Ezzel szemben, a NVD‐ben jelentősen erősödött a reakció intenzitása a neuropilben, de a többi magban is intenzívebbé vált, és a későbbiekben sem csökkent. Ez az ellentétes 20
tendencia valószínűleg azzal van összefüggésben, hogy a vestibularis magokban a sejtproliferáció a postembryonalis életkorban is folytatódik ellentétben más idegrendszeri területekkel és a sejtproliferációnak kedvez a HA –ban gazdag környezet (Dutheil, 2009). A sejtproliferáció fennmaradására azért van szükség, mert a vestibularis rendszer a postnatalis életben is nagyfokú plaszticitással rendelkezik (Dieringer, 1995; Aryn H. Gittis and Sascha du Lac, 2006). A rendszer sérülését követően kialakulnak a jellegzetes vestibularis tünetek: testtartási, szemmozgási és vegetatív zavarok. Az un. vestibularis kompenzáció folyamat során, amely fajonként eltérő időbeli lefolyást mutat, a tünetek fokozatosan enyhülnek és a korábbi működés helyreállása következik be. A kompenzáció hátterében álló egyik mechanizmus a fentiekben említett sejtproliferáció. Saját kísérleteinkben a vestibularis magkomplex területén a PNN elsőször a 11. napon jelent meg. Ebben a stádiumban még csak a NVM egyes neuronjai körül alakult ki a HA kondenzációja, ezt követte időrendi sorrendben a NVL, NVD és a NVS. A fejlődő gerincvelőben a PNN a HH 29. stádiumban jelenik meg, ami a hatodik embryonalis napot jelenti (Mészáros és mtsai, 2008). Ez a lelet egybeesik azokkal az irodalmi adatokkal, amelyek szerint a PNN kialakulásában van egy caudorostralis gradiens, azaz a gerincvelő felől haladva egyre rostralisabb területeken alakul ki az ECM kondenzációja (Zimmermann, 2008). A synaptogenesis kritikus periódusának vége egybeesik a formálódó perineuronalis háló kialakulásával (Pizzorusso és mtsai 2002). A PNN kialakulását patkányban általában a postnatalis életkorokra teszik, ezek a vizsgálatok azonban olyan agyterületeken történtek, amelyeknek funkciója csak a postnatalis élet során alakul ki teljes egészében (Celio és Blümcke 1994; Bandtlow és Zimmermann 2000; Brückner és mtsai 2000; Carulli és mtsai 2007). Ezzel szemben a csirke embryo vestibularis magjaiban és a gerincvelőben már az embryonalis élet végén igen fejlett perineuronalis hálót találunk. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a csirke már a kikelés pillanatában képes a lépőmozgásokra, a táplálék csipegetésére, ami egy nagyon fejlett mozgáskoordinációt igényel. Ennek idegrendszeri hátterét biztosítja a sensorimotoros rendszer tagjainak, így a látó‐ , egyensúlyozó rendszer, valamint az agytörzsi és a gerincvelői motoneuronok összehangolt működése. Fiziológiai vizsgálatok az mutatják, hogy a synaptogenesis kritikus periódusa a csirke gerincvelőben az embryonalis életre tehető (Hanson és mtsai 2008). Ehhez hasonlóan, a vestibuloocularis és a vestibulospinalis kapcsolatok is működőképesek a korai embryonális időszakban, ami a 11. 21
embryonalis napra tehető (Glover, 2003; Glover and Petrursdottir, 1988). Mivel a vestibulospinalis és a vestibuloocularis pályák egyik eredő magja a NVM, az először itt megjelenő PNN a synapsisok stabilizálódására utalhat. Arra a kérdésre, hogy az egyéb ECM molekulák milyen időbeli sorrendben jelennek meg a fejlődő vestibularis magkomplex területén, folyamatban lévő vizsgálataink adhatnak választ. Mint ahogy azt a kérdést is ezek a vizsgálatok fogják eldönteni, hogy a PNN kialakításában részt vevő ECM molekulák közül a HA jelenik‐e meg elsőként a neuronok körül. Kwok és mtsai, 2010 in vitro vizsgálatai szerint a sejtek körül először a HA kondenzáció figyelhető meg, és csak ezután expresszálódik és vesz részt a PNN kialakításában a többi ECM molekula.
22
Irodalomjegyzék
Aryn H. Gittis, S. du Lac (2006) Intrinsic and synaptic plasticity in the vestibular system. Curr Opin Neurobiol. 16:385–390 Baier C., Baader S.L., Jankowski J., Gieselmann V., Schilling K., Rauch U., Kappler J. (2007) Hyaluronan is organized into fiber‐like structures along migratory pathways in the developing mouse cerebellum. Matrix Biol. 5:348‐358 Bakers J., Kramer C., Pothof J., Quaedvlieg N.E., Spaink H.P., Hammerschmidt M. (2004) Has2 is required upstream of Rac1 to govern dorsal migration of lateral cells during zebrafish gastrulation. Development. 131(3):525‐37 Bandtlow C.E., Zimmermann D.R. (2000) Proteoglycans in the developing brain: new conceptual insights for old proteins. Physiol Rev. 4:1267‐90 Bignami A., Asher R., Perides G. (1992) The extracellular matrix of rat spinal cord: a comparative study on the localization of hyaluronic acid, glial hyaluronate‐binding protein, and chondroitin sulfate proteoglycan. Exp Neurol. 117:90‐93 Brückner G., Grosche J., Schmidt S., Härtig W., Margolis R.U., Delpech B., Seidenbecher C.I., Czaniera R., Schachner M. (2000) Postnatal development of perineuronal nets in wildtype mice and in a mutant deficient in tenascin-R. J Comp Neurol. 428(4):616-29 Carulli D., Rhodes K.E., Fawcett J.W. (2007) Upregulation of aggrecan, link protein 1, and hyaluronan synthases during formation of perineuronal nets in the rat cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 501(1)83‐94 Celio M.R., Blümcke I. (1994) Perineuronal nets‐‐a specialized form of extracellular matrix in the adult nervous system. Brain Res Rev. 19 (1):128‐45 Chiquet‐Ehrismann R. (1990) What distinguishes tenascin from fibronectin? Faseb J. 4:2598‐ 2604 Dieringer N: 'Vestibular compensation': Neural plasticity and its relations to functional recovery after labyrinthine lesions in frogs and other vertebrates. Progress Neurobiol. (1995) 129: 46 97 Dityatev A., Schachner M. (2003) Extracellular matrix molecules and synaptic plasticity. Nat Rev Neurosci. 4:456‐468
23
Dityatev A., Schachner M. (2006) The extracellular matrix and synapses. Cell Tissue Res. 326:647‐654 Dityatev A., Schachner M., Sonderegger P. (2010) The dual role of the extracellular matrix in synaptic plasticity and homeostasis. Nat Rev Neurosci. 11:735‐746 Dutheil S., Brezun J.M., Leonard J., Lacour M. and Tighilet B. (2009) Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neurosci. 164 1444‐1456 Erickson H.P. (1993) Tenascin‐C, Tenascin‐R and tenascin‐X: a family of talented proteins in search of functions. Curr Opin Cell Biol. 5:869‐876 Galtrey C.M., Kwok J.C.F., Carulli D., Rhodes K.E., Fawcett J.W. (2008) Distribution and synthesis of extracellular matrix proteoglycans, hyaluronan, link proteins and tenascin‐R in the rat spinal cord. Eur J Neurosci. 27:1373‐1390 Glover J.C. (2003) The development of vestibulo‐ocular circuitry in the chicken embryo. J Physiol. 97(1):17‐25 Glover J.C., Petursdottir G. (1988) Pathway specificity of reticulospinal and vestibulospinal projections in the 11‐day chicken embryo. J Comp Neurol. 270(1):25‐38, 60‐1 Gomba Szabolcs: Hisztokémia, 2005, Debreceni Egyetem Egészségügyi Főiskolai Kari jegyzet Hamburger V., Hamilton H.L. (1951) A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195(4):231-72 Hanson M.G., Milner L.D., Landmesser L.T. (2008) Spontaneous rhythmic activity in early chick spinal cord influences distinct motor axon pathfinding decisions. Brain Res Rev.57(1):77-85 Hardingham T.E., Muir H. (1973) Binding of oligosaccharides of hyaluronic acid to proteoglycans. Biochem J. 135:905‐908 Yamada H., Watanabe K., Shimonaka M., Yamaguchi Y. (1994) Molecular cloning of brevican, a novel brain proteoglycan of the aggrecan/versican family. J Biol Chem. 269(13):10119-26 Jaworski D.M., Kelly G.M., Hockfield S. (1995) The CNS-specific hyaluronan-binding protein BEHAB is expressed in ventricular zones coincident with gliogenesis. J Neurosci. 15 (2):1352-62 Jaworski D.M., Kelly G.M., Piepmeier J.M., Hockfield S. (1996) BEHAB (brain enriched hyaluronan binding) is expressed in surgical samples of glioma and in intracranial grafts of invasive glioma cell lines. Cancer Res. 56 (10):2293-8 24
Joester A., Faissner A. (2011) The structure and function of tenascins in the nervous system. Matrix Biol. 20:13‐22 Kwok J.C.F., Dick G.,Wang D., Fawcett J.W. (2011) Extracellular matrix and perineuronal nets in CNS repair. Developmental Neurobiol. 1073‐1089 Lee J.Y., SpicerA.P. (2000) Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule. Curr Oppin Cell Biol. 12(5):581‐6 Lumsden A. (1990) The cellular basis of segmantetion int he developing hindbrain. Trends Neurosci. 13:329‐335
Margolis R.U., Margolis R.K., Chang L.B., Preti C. (1975) Glycosaminoglycans of brain during development. Biochemistry. 14(1):85-8 Mészár Z., Felszeghy S., Veress G., Matesz K., Székely G., Módis L. (2008) Hyaluronan accumulates around differentiating neurons in spinal cord of chicken embryos. Brain Res Bull. 75(2‐4):414‐8 Nieuwenhuys R., Donkelaar H.J., Nicholson C.(1998) The Central Nervous System of Vertebrates, volume 3. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg. 1534‐1535, 1559 Pizzorusso T., Medini P., Berardi N., Chierzi S., Fawcett J.W., Maffei L. (2002) Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual cortex. Science. 298(5596):1248-51 Ross M.H., Kaye G.I., Wojciech Pawlina: Szövettan kézikönyv és atlasz, 2007, 132, 140 Seidenbecher C.I., Richter K., Rauch U., Fässler R., Garner C.C., Gundelfinger E.D. (1995) Brevican, a chondroitin sulfate proteoglycan of rat brain, occurs as secreted and cell surface glycosylphosphatidylinositol-anchored isoforms. J Biol Chem. 270(45):27206-12 Szabó Gábor: Sejtbiológia, Medicina Könyvkiadó, 2004, Módis László: Az extracelluláris mátrix. 472‐480 Toole B.P. (2011) Hyaluronan in morphogenesis. Semin Cell Dev. 12:79‐87 Toole B.P., Wight TN, Tammi M.I. (2002) Hyaluronan‐cell interactions in cancer and vascular disease. J Biol Chem. 277(7):4593‐6 Turley E.A., Noble P.W., Bourguignon L.Y. (2002) Signaling properties of hyaluronan receptors. J Biol Chem. 277(7):4589‐92 25
Zimmermann D.R., Dours‐Zimmermann M.T. (2008) Extracellular matrix of the central nervous system: from neglect to challenge. Histochem Cell Biol. 130:635‐653 Weber P., Montag D., Schachner M., Bernhardt R.R. (1998) Zebrafish tenascin‐W, a new member of the tenascin family. J Neurobiol. 35:1‐16 Wold J.E. (1976) The vestibular nuclei in the domestic hen (gallus domesticus). I. Normal Anatomy. Anat Embryol. 149:29‐46 http://www.amsbio.com/datasheets/400762.pdf http://www.rndsystems.com/pdf/AF3865.pdf http://www.rndsystems.com/molecule_detail.aspx?m=2712
26
