A basidiomycota élesztőgomba, a Filobasidium capsuligenum IFM 40078 törzse egy olyan fehérjét (FC-1 killer toxint) választ ki a tápközegbe, amely elpusztítja az opportunista patogén Cryptococcus neoformans-t. Pályázatunkban ezen killer toxin genetikai determinánsát derítettük fel, a toxin fehérje izolálását, jellemzését valósítottuk meg, ill. a toxin hatásmechanizmusát tártuk fel.
A toxin hatásspektrumának meghatározása Kísérleteinkhez mintegy 70, különböző élő- és földrajzi helyről származó C. neoformans törzset használtunk. Egy kivételével az összes izolátum érzékeny volt a toxinnal szemben, ami arra utal, hogy a toxinnak a cryptococcosis megbetegedés megelőzésében, ill. a gyógyításban gyakorlati szerepe lehet. Az érzékenység mértéke eltérő volt az egyes izolátumok között, ezért a további vizsgálatokhoz a legérzékenyebbet, a C. neoformans var. neoformans IFM 5844 törzset választottuk ki. A toxin hatása rendkívül specifikus volt: más Cryptococcus-ra és a megvizsgált 80 egyéb génuszhoz tartozó élesztőgombára nem volt hatása.
A killer toxin hatásmódjának, a szenzitív sejtek növekedési kinetikájának vizsgálata Annak bizonyítására, hogy a toxin elöli a sejteket (citocidikus hatás) és nem csupán csak megállítja növekedésüket (citosztatikus hatás), time-killing kísérleteket végeztünk: 5 x 105 toxinnal kezelt sejt közül egy sem maradt életképes 24 órás kezelés után. A pusztítás kinetikáját mikroszkópos, „FITC exclusion” módszerrel határoztuk meg: a sejteknek kb. 50%-a pusztult el 12 óra alatt, 100%-uk 20 órás kezelés után lett életképtelen.
A toxin fermentálásának optimális paraméterei
A toxin nagy hatású, de rendkívül alacsony koncentrációban szekretálódik a táptalajba. Ahhoz, hogy jellemezhessük és izolálhassuk, nagyobb mennyiségben kellett előállítanunk. Kerestük a termeltetés optimális körülményeit: 12-féle táptalajt, 3-féle tenyésztési hőmérsékleten, két különböző pH tartományban próbáltunk ki. Optimálisnak az 1% éleszőkivonat + 1,5 % malátakivonat pH: 4,0 (0,1 M McIlvain pufferben) (YM4) és a 24 °Cos hőmérséklet bizonyult. A sejteket legalább a 107 ml-1 sejtszámig kellett feltenyészteni. A részlegesen tisztított un. „nyers toxinnal” végeztük kísérleteinket: a fermentlevet lecentrifugáltuk, sterilre szűrtük, majd az így nyert anyagot 72 órán át dializáltuk 0,05 M citrát-foszfát pufferrel (pH: 4,0) szemben. Szükség esetén liofilezéssel, etanolos vagy ammónium szulfátos kicsapással koncentráltuk.
A nyers toxinfehérje jellemzése Az FC-1 toxin fehérje természetét a következőkkel bizonyítottuk: - 5 perces forralással a killer aktivitást eliminálni tudtuk a mintából, - pepszin és papain részleges inaktiválást eredményezett, - a toxin hatása pH függő volt: csak pH 4,0 és 6,0 között bizonyult aktívnak. A felsorolt folyamatok a toxin irreverzibilis megváltozását okozták.
A toxin azonosítása a F. capsuligenum fermentlevének poliakrilamid gélelektroforézises elemzésével Feltételeztük, hogy a fermentlébe szekretált toxint gélelektroforézissel kimutathatjuk, ha összehasonlítjuk a toxin termelődését biztosító, ill. a toxin termelődését nem biztosító táptalajokban tenyésztett gomba fermentlevének gélelektroferogramját. A fenti követelményeknek megfelelőek a komplett (YM4, YPD) ill. a különböző összetételű minimál táptalajok (VMM, YNB). A komplett táptalajon kapunk toxin aktivitást, míg a
minimálban nem. Az YPD-ben előtenyésztett mintákat mintegy 80 szorosára töményítettük Microcon szűrőn és 4-12% NuPAGE Bis-Tris gélen MOPS-SDS puffer rendszerben analizáltuk pH 7,0-n (MW 19-191 kDa, festés Coomassie-R 250-nel) (1. ábra). Az elválasztás után a fehérjéket PVDF membránra blottoltuk BisTris pH 7,2 transzfer pufferben. A membránról három - a biológiai tesztek alapján várható molekulatömegű - fehérje Nterminális szekvenciáját határoztuk meg (1. ábra). Mivel minden esetben kevert szekvenciákat kaptunk és a szekvenciákban, beleértve a blott hátteréből vett mintákat is, legnagyobb mennyiségben a kollagén fehérje töredék szekvenciája volt felismerhető, valószínűleg az YPD tápoldat peptonjában lévő kollagén együtt vándorolt az általunk vizsgált fehérjékkel, függetlenül azok méretétől. Ezért a következő lépésben az YM4 táptalajban felnevelt élesztő fehérje mintázatát elemeztük: a futtatások során a 10 000 - 90 000 Da közötti méret tartományban 8-12 fehérje sávot kaptunk, amelyeket összehasonlítottunk a minimál táptalaj mintázatával. A kétféle táptalajon tenyésztett élesztő fermentlevének fehérjemintázatában túl sok eltérést találtunk ahhoz, hogy a toxint azonosítani lehessen (2, 3. ábra). A továbbiakban a F. capsuligenum egy olyan izolátumának (VKM 1513) fehérje képét hasonlítottuk össze a toxint termelővel, amelyben genetikailag nem kódolt a toxin, toxint nem tud termelni.
Úgy gondoltuk, hogy a nem termelő törzs mintázatából hiányzó, de a
termelőben meglévő sávot valószínűleg a toxin molekula adja. A gélelektroforetikus mintázatok összehasonlításakor azonban több eltérést is megfigyeltünk. Ennek oka az lehet, hogy a két törzs eltérő extracelluláris enzimeket, izoenzimeket bocsát ki a fermentlébe még akkor is, ha azonos körülmények között tenyészik. Újabb megközelítésben magából a killer toxint termelő törzsből készítettünk toxint nem termelő mutánsokat: mivel a toxin kódja a kromoszómához lokalizálható (lásd később), a mutagén kezelést UV besugárzással végeztük. Mintegy 10 ezer mutagén kezelt telep
átvizsgálásával 43 killer mínusz fenotípusú izolátumot nyertünk. A mutánsok többsége instabil volt: néhány passzázs után visszanyerték toxintermelő képességüket. Mind a termelő, mind a stabilabbnak bizonyuló mutáns törzsek fermentlevét elemeztük. Meglepő módon azonban a stabil nem killer törzsek fehérje mintázata is jelentősen eltért mind a termelő, vad törzs mintázatától, mind pedig egymástól, vagyis így sem lehetett a toxint egyértelműen azonosítani (2. ábra). A killer toxin az érzékeny sejtek sejtfalában előforduló β-1, 6-glükán-hoz kapcsolódva indítja el toxikus hatását (lásd később). Ezt a specifikus kötődést használtuk fel arra, hogy a toxin tisztítását, izolálását affinitás kromatográfiával kíséreljük meg. Epoxi-aktivált Sepharose 6B gyantához kötöttünk pusztulánt, az így nyert affinitás szorbenst 0,1 M citrát-foszfát pufferrel (pH 4,0) egyensúlyba hoztuk. Az affinitás oszlopra nyers toxin fermentlevet vittünk fel, a nem kötődött fehérjéket 0,1 M citrát-foszfát (pH 4,0) pufferrel mostuk a töltetről, majd a pusztulán által megkötött toxint 10 mM-os citrát-foszfát pufferrel (pH 6,0) 1,5 M NaCl jelenlétében eluáltuk. Frakciókat gyűjtöttünk és
biológiai aktivitásukat vizsgáltuk. A
legaktívabb frakciókat - töményítés után - szintén SDS gélelektroforézissel választottuk el. Ekkor már csak néhány fehérjét találtunk a 19 – 51 kDa tartományban. A legvalószínűbbnek tűnő kb. 47 kDa méretű fehérjét választottuk ki szekvenálásra (4. ábra). A kapott szekvencia (XVNVNGVFPI) az adatbázisokban a Debaryomyces killer élesztőgomba „unnamed” proteinjével mutatott némi homológiát. Nagyobb szekvenciarészlet megismerésére folynak a további kísérletek.
A toxint kódoló genetikai determináns meghatározása: Totál nukleinsav preparátumot (minilizátum) készítettünk a toxint termelő törzsből. A DNS agaróz gélelektroforetikus vizsgálatával DNS vagy RNS plazmidok jelenlétét kerestük (az eddig ismert killer toxintermelő élesztőgombák általában extrakromoszómálisan kódoltak).
Sem dsRNS, sem lineáris DNS plazmidok jelenléte nem volt kimutatható. A F. capsuligenum sejtek pulse-field gel electrophoresises (OFAGE) vizsgálata is csak kromoszómális DNS jelenlétét bizonyította, tehát a toxint a kromoszómális DNS kódolja. A toxint kódoló gén klónozása Adatbázisokból begyűjtöttük az eddig ismert élesztőgomba killer toxinok (Pichia farinosa, Williopsis saturnus, W. mrakkii, S. cereviasiae M2, M1, K-28, Kluyveromyces lactis, Hansenula sp., stb) nukleotid vagy/és aminosav szekvenciáit. Homológ szakaszokat kerestünk, feltételezve, hogy ha vannak ilyen szekvenciák, akkor ennek alapján elkezdhetjük a F capsuligenum toxin génjének megismerését és izolálását.
Homológ szekvenciákat
azonban nem találtunk. Miután a fehérje oldaláról is nehezen volt megközelíthető a toxin gén azonosítása, a továbbiakban a termelő IFM 40078 és a nem termelő VKM 1513 törzs mRNSeinek összehasonlító elemzésével kerestük a fehérjét kódoló gént: erre a célra a szubtraktív hibridizáció módszerét alkalmaztuk. A szubtraktív klónozáshoz a BD PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit-et használtuk. A törzseket YM4 táptalajban tenyésztettük, RNS kivonást követően a mRNS populációt izoláltuk, a mRNS-ről cDNS-t (teszter és driver) készítettünk. A cDNS-eket hibridizáltuk, és a nem hibridizálódott cDNS–t, amely azokat a géneket reprezentálja, amelyek a teszterben jelen vannak (többek között a toxin termelés génje), de hiányoznak a driver-ből, amplifikáltuk. Jelenleg a szubtrakció során nyert PCR termékeket klónozzuk. Azonosításukhoz felhasználjuk a fehérje elemzése során kapott szekvenciákat.
A killer toxin receptor helyeinek meghatározása az érzékeny sejtek sejtfalán Egy toxinnal szembeni érzékenységet két lényeges tényező határoz meg: van-e receptor hely az érzékeny sejtek falában ill. hogy milyen a toxin hatásának mechanizmusa? Mind a sejtfalban, mid a sejtmembránban lehetnek receptorok. Hogy meghatározzuk, hogy melyik sejtfal komponens lehet a receptor, kompetíciós kísérleteket végeztünk. A C.
neoformans sejtfal fő komponensei az α-D-glükánok (főleg α-1,3 és kevés α-1,4), β-Dglükánok (főként β-1,6 és kevés β-1,3), kitin, mannán és galaktomannán. Az alábbi kereskedelmi forgalomban kapható sejtfal komponensek hatását vizsgáltuk: laminarin (β-1,3glükán), pusztulán (β-1,6-glükán), mannán és kitin oligo-szacharid (5-6 oligo). A felsorolt sejtfal komponensek közül csak a pusztulán (β-1,6-glükán) - 10 mg ml-1 koncentrációnál tudta megóvni a sejteket a pusztulástól (kivédeni a toxin hatását), így valószínűleg a toxin receptorként ismerte fel.
Az FC-1 toxin hatásmechanizmusának megállapítása Az élesztőkben eddig ismeretes hatásmechanizmusokat vizsgáltuk a F. capsuligenum toxinja esetében is: a citoplazmamembrán funkciójának megzavarása; a magi DNS szintézisnek, a sejtciklus S-fázisának gátlása; ill. a sejtfal bioszintézisének blokkolása. A sejtciklus elemzéséhez, az egyedi sejtek DNS tartalmának megállapításához az FC-1 toxinnal kezelt Cryptococcus neoformans sejtekben FACS analízissel mértük a DNS tartalmat toxinnal kezelt és kezeletlen esetben. Az analízis eredménye azt bizonyította, hogy a toxin nem gátolja a DNS szintézist, és nincs hatása a sejtciklusra sem. A toxin membrán károsító hatásának vizsgálata fluoreszcens festéssel (FITC festés) történt. Megállapítottuk, hogy a toxinnal kezelt sejtekben a védőburok (sejtfal, sejtmembrán) integritása megszűnt a méreg hatására, a sejtek belsejébe hatoló festék intenzíven fluoreszkált. A sejtfal mikroszkóposan látható károsodását nem tapasztaltuk, a sejtek nem élték túl a toxin kezelést izoozmotikus közegben sem. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a toxin sem a DNS szintézist, sem a sejtfal bioszintézisét nem károsítja, valószínűleg sejtmembrán permeabilitását károsító hatású ioncsatornákat képez a C. neoformans érzékeny sejtjeiben.
MW kDa 191
*
97 64 51
1
2
39 28 19
3
YD
YPD
YM4
1. ábra: Komplett tápoldatban (YD, YPD, YM4) előtenyésztett F. capsuligenum fermentlevének elektroferogramja: a 1, 2, 3 a fehérjéket, * a háttéret jelöli, amelyekbe beleszekvenáltunk;
191kDa
97kDa
64kDa
51kDa
39kDa
MW
YD
YPD
MY4
K- 20
K- 31
K- 32
K- 33
K-34
2. ábra Különböző komplett táptalajokban (YD,YPD, MY4 ) tenyésztett F. capsuligenum fermentlevének fehérje mintázata, ill. néhány killer mínusz ((K- ) fenotípusú mutáns (K- 20 , K- 31, K- 32, K- 33, K- 34) fermentlevének SDS-gélelektroforetikus képe. MW: molekulasúly marker.
MW
YM4 VMM
YNB
3. ábra: Minimál táptalajokban előtenyésztett F. capsuligenum fermentlevének SDS-gél képe. MW: molekulasúly marker, YM4 Komplett táptalaj, VMMM (Wickerham-féle minimál), YNB (Yeast Nitrogen Base táptalaj).
1
2
3
4
5
MW
4. ábra: Biológiailag aktív toxint tartalmazó YM4 fermentlé SDS géljéről készült blott. 1-5: mindenütt ugyanaz a minta található; a piros nyíl jelzi azt a fehéréjt, amelyet szekvenálunk. MW: molekulasúly marker.
A toxin hatásspektrumára, hatásmódjára, termeltetésre vonatkozó eredményeinket a következő folyóiratban közöltük (közlésre elfogadva, megjelenés alatt): A. Keszthelyi1, M. Ohkusu2, K. Takeo2, I. Pfeiffer1, J. Litter1 and J. Kucsera1 (2006) Characterization of the anti-cryptococcal effect of the FC-1 toxin produced by Filobasidium capsuligenum. Mycoses 49/3:
A pályázati munka további eredményeit a következő 2 éven belül tervezzük megjelentetni, ezért kérjük, hogy a pályázat minősítését az OTKA kiegészítő eljárásban később módosítsa. .
