Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv
9. Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv 9.1. Úvod Racionální použití léčiv a design efektivního dávkovacího režimu si usnadníme, pokud pochopíme ústřední paradigma klinické farmakologie, které je definováno vztahem mezi podávanou dávkou léku, jeho výslednou koncentrací v různých tělních tekutinách a tkáních a intenzitou farmakologických účinků vyvolaných těmito koncentracemi. Tento vztah dávka-expozice-odpověď a tedy dávka léku, která je nezbytná k dosažení určitého efektu, jsou určeny farmakokinetickými a farmakodynamickými vlastnostmi léku (obr. 9. 1).
Obr. 9. 1: Centrální paradigma klinické farmakologie: Dávka-Koncentrace-Účinek
účinek
koncentrace
dávka
toxicita
farmakokinetika
farmakodynamika
Farmakokinetika popisuje časový průběh koncentrace léku v tělních tekutinách, zejména v plasmě nebo krvi, která je výsledkem určitého režimu dávkování. Zahrnuje všechny procesy ovlivňující absorpci léku, jeho distribuci, metabolismus a exkreci. Zjednodušeně řečeno charakterizuje farmakokinetika, co dělá tělo s lékem. Naproti tomu farmakodynamika charakterizuje intenzitu léčebného účinku nebo toxicity, která vychází z určité koncentrace léku v tělních tekutinách, obvykle v předpokládaném místě účinku léku. Opět se dá zjednodušeně říci, co dělá lék v těle (obr. 9. 2).
1
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9. 2: Fyziologické schéma farmakokinetických a farmakodynamických procesů Protein váže lék
Tkáň váže lék distribuce
absorpce dávka
Koncentrace v plasmě
Koncentrace v tkáni
eliminace
Lék v efektorovém kompartmentu
Metabolismus Exkrece
Lék se váže k receptoru/ efektoru
Postreceptorové události
Biochemický efekt
Farmakologická odpověď
Porozumět vztahu mezi dávkou, koncentrací a léčebným účinkem je rozhodující pro aplikaci jakéhokoli léčiva, včetně peptidů a proteinů a je základem pro dávkování léku a racionální nastavení léčby. Obecné farmakokinetické a farmakodynamické principy týkající se tradičních léčiv o nízké molekulové hmotnosti jsou v podstatné míře aplikovatelné na peptidová a proteinová léčiva. Odchylky od těchto principů a nové výzvy jsou dány následujícími charakteristikami peptidových a proteinových léčiv: a) Jsou strukturálně podobné endogenním strukturním nebo funkčním proteinům a živinám b) Účastní se v tom nejtěsnějším slova smyslu fyziologických procesů na molekulární úrovni, často jsou zahrnuty v mechanismech zpětnovazebných smyček c) Je složité je identifikovat a kvantifikovat v prostředí nesčetného počtu podobných molekul d) Především pro proteiny platí, že jsou velmi hmotné a mají charakter makromolekul 2
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv
9.2. Farmakokinetika proteinových terapeutik In vivo dispozici peptidových a proteinových léčiv lze často předpovědět z jejich fyziologické funkce. Peptidy jsou často hormony, obvykle mají krátký poločas rozpadu, což je žádoucí vlastnost umožňující přesnou regulaci jejich endogenních hladin a také funkce. Inzulín je například eliminován v závislosti na dávce s poločasem 26 minut při dávce 0,1U/kg a 52 minut při 0,2U/kg. Naproti tomu proteiny, které musí být někam transportovány, např. albumin nebo imunoglobuliny, mají poločas několik dnů, což zase umožňuje, aby byly jejich hladiny kontinuálně udržovány na fyziologicky nezbytných hladinách.
9.2.1. Absorpce proteinových terapeutik Střevní podávání léčiva. Na rozdíl od konvenčních léčiv na bázi malých molekul nejsou peptidy a proteiny po orálním podání aktivní. Je to ze dvou důvodů: jednak kvůli vysoké aktivitě enzymů v gastrointestinálním traktu a jednak kvůli nízké permeabilitě střevní sliznice pro proteiny. Naopak peptidy a produkty metabolismu proteinů jsou díky značné aktivitě proteáz a peptidáz v gastrointestinálním traktu v tomto tělním kompartmentu nejlépe vstřebávány. Kromě toho představuje gastrointestinální sliznice hlavní absorpční bariéru pro ve vodě rozpustné makromolekuly. Takže ačkoli rychlost a rozsah absorpce orálně podaných proteinů mohou ovlivnit permeabilita, stabilita a doba transportu v gastrointestinálním traktu, je to právě molekulová hmotnost, co je považováno za konečnou překážku. Protože je orální podávání léků z mnoha důvodů preferovaným způsobem, vyvíjí se postupy, jejichž cílem je obejít výše zmíněné překážky pro tento způsob podávání proteinových přípravků. Používá se např. enkapsulace do mikro a nanočástic nebo chemické modifikace postranních skupin aminokyselin nebo konjugace s jinými chemikáliemi. Testuje se také současné podávání inhibitorů proteáz. Parenterální podávání léčiva. Hlavními způsoby podávání jsou intravenózně (IV), subkutánně (SC) a intramuskulárně (IM). Zkouší se i podávání cestou nasální, bukální, rektální, vaginální, transdermální, okulární a pulmonální. Při intravenózním podávání se obejde pre-systémová degradace a je možné dosáhnout té nejvyšší koncentrace léčiva v biologickém systému. K proteinovým terapeutikům, která jsou aplikována intravenózně, patří aktivátor tkáňového plasminogenu (t-PA), rekombinantní lidský erytropoetin α a kolonie granulocytů stimulující faktor filgrastim. Intravenózní podávání proteinu, ať už v pilulkách nebo jako infúze, nedokáže zajistit správnou koncentraci léčiva v čase, protože ta je ovlivněna biologickou aktivitou produktu. V takovém případě může být alternativou intramuskulární nebo subkutánní podávání. Např. luteinizační hormon uvolňující hormon (LH-RH) podávaný v dávkách stimuluje uvolňování folikuly stimulujícího hormonu (FSH) a luteinizačního hormonu (LH), kdežto kontinuální aplikace bazálního množství naopak suprimuje uvolňování těchto hormonů. V případě karcinomu prostaty a endometrióze, kdy se po intravenózní aplikaci vyskytují vysoké hladiny leuprorelinu (antagonista LH-RH), bylo schváleno používat dlouho působící měsíční dávky. Bylo také porovnáno subkutánní a intravenózní podávání epoetinu-α u pacientů po dialýze a ukázalo se, že subkutánní cesta udržuje hematokrit ve správných hodnotách, přičemž průměrné týdenní dávky mohly být nižší. 3
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Jedním z potenciálních omezení subkutánního a intramuskulárního podávání jsou pre-systémové degradační procesy, které snižují biodostupnost ve srovnání s intravenózní aplikací. Dalšími omezujícími faktory jsou lokální proudění krve, injekční trauma a omezení příjmu léčiva do systémové cirkulace v závislosti na velikosti pórů kapiláry a difúzi. Subkutánně jsou podávány např. anakinra, etanercept, inzulín a pegfilgrastim. Po subkutánní aplikaci mohou tyto peptidy a proteiny vstoupit do systémové cirkulace přes krevní kapiláry nebo lymfatické uzliny. Obecně platí, že makromolekuly větší než 16 kDa jsou absorbovány především lymfatickou cestou, kdežto molekuly menší než 1 kDa přes krevní cirkulaci. Existuje lineární vztah mezi molekulovou hmotností proteinu a podílem, který je absorbován lymfatickým systémem.
9.2.2. Distribuce proteinových terapeutik Rychlost a velikost distribuce proteinů je určena jejich velikostí a molekulovou hmotností, fyzikálně-chemickými vlastnostmi (např. nábojem, lipofilicitou), vazbou na jiný protein a závislostí na procesech aktivního transportu. Protože jsou molekuly terapeutických proteinů zpravidla velmi velké, jsou distribuovány v malém objemu, který je omezen na extracelulární prostor. Je to dáno i jejich omezenou pohyblivostí spojenou s nemožností prostoupit skrz buněčné membrány. Objem distribučního prostoru lze zvýšit aktivním transportem do tkání a vazbou na intra a extravaskulární proteiny. Na rozdíl od malých molekul jsou proteiny transportovány z cévního systému do intersticiálního prostoru tkání konvekcí a nikoli difúzí. Poté následuje jednosměrný tok tekutiny z cévního prostoru přes paracelulární póry do intersticiálního prostoru tkání. Následné odstranění z tkání je provedeno lymfatickou drenáží zpět do systémové cirkulace. Lymfatický systém tedy hraje v distribuci terapeutických proteinů jedinečnou úlohu. Další, ale mnohem méně využívaným způsobem, je transcelulární migrace přes endocytózu. Kromě velikosti proteinu může hrát roli v jeho biodostupnosti také náboj. Pozitivně nabité poroteiny a negativně nabité membrány jsou přitahovány elektrostatickými silami, což rychlost distribuce proteinů zvyšuje. Po intravenózní aplikaci kopírují peptidy a proteiny tzv. dvojsložkový farmakokinetický model. K centrální složce tohoto systému patří vaskulární prostor a intersticiální prostor dobře perforovaného orgánu, jako jsou plíce nebo ledviny. Periferní složkou je intersticiální prostor pomalu ekvilibrovaných tkání. Centrální kompartment, ve kterém jsou proteiny nejprve distribuovány po intravenózní aplikaci, má typický distribuční objem rovný nebo mírně větší než objem plasmy, tj. 3 až 8 litru. Celkový objem často zahrnuje 14 až 20 litrů, tedy ne více než dvoj a trojnásobek počátečního objemu. Uvedené distribuční schéma bylo popsáno v případě analogu t-PA, proteinu označeného jako „tenecteplase“. Epoetin α má po intravenózní aplikaci zdravým dobrovolníkům distribuční objem objemu plasmy 0,056 l/kg. Pro mnoho proteinových terapeutik je výpočet farmakokinetických parametrů problematický. Svoji roli zde hrají také procesy eliminace proteinů z oběhu způsobené proteolýzou nebo eliminací přes receptory. Jsou-li proteiny eliminovány přes pomalu ekvilibrované tkáně rychlostí, která je větší než jejich distribuce, dochází k podstatným odchylkám v distribučním objemu. 4
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Studium distribuce proteinů je omezeno oproti stejným studiím na malých molekulách kvůli nutnosti využívat radioaktivní značky, což je problémem právě u dlouhodobě stabilních proteinů. Jestliže obsahuje protein vhodné aminokyseliny, např. tyrosin a lysin, mohou být označeny externí značkou, např. radioaktivním jódem 125I. Značení jódem je technicky jednoduché a výsledkem je vysoce specifický produkt, přesto je ale protein chemicky změněný. Proto je vhodnější metodou vnášet do struktury proteinů radioaktivní značky v průběhu jejich syntézy jako značky interní. Interní značení proteinů se provádí kultivací produkčních linií buněk v prostředí s radioaktivním 3H, 14C, 35S, apod. Tato metoda se ale rutinně neprovádí, protože je zakázáno kontaminovat radioaktivními látkami fermentační zařízení. Někdy je také použití vnitřního značení nevhodné proto, že na rozdíl od iodizace externím jódem, může být vnitřní značkou značený fragment aminokyselin znovu využit k syntéze jiných endogenních proteinů a buněčných struktur. Bez ohledu na způsob značení musí být zajištěno, že naměřená radioaktivita odpovídá intaktnímu značenému proteinu, respektive stanoveno, jaký podíl připadá na značené metabolity nebo uvolněnou značku. Odlišit intaktní protein od volné značky nebo nízkomolekulárních metabolitů lze precipitací trichloroctovou kyselinou. Při této metodě se po centrifugaci malé molekuly objeví v supernatantu. Proteiny s reutilizovanými značenými aminokyselinami a velké metabolity lze odlišit od původního značeného proteinu jen technikami jako je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu, vysokotlaká kapalinová chromatografie, specifické imunologické metody nebo bioeseje. S ohledem na výše zmíněné skutečnosti je třeba si uvědomit, že výsledky biodistribučních studií s využitím autoradiografie mohou být velmi matoucí. Bez specifických metod nelze výsledky autoradiografie brát za jednoznačně správné, protože nikdy nevíme, jestli je signál získaný z původně značeného produktu nebo jeho metabolitu. Proto jsou výsledky biodistribučních studií získané autoradiografií doplňovány např. odběrem tkáňových vzorků a specifickým změřením obsahu terapeutického proteinu v tkáňovém homogenátu. Dalším faktorem, který ovlivňuje distribuci terapeutických peptidů a proteinů je jejich vazba na endogenní proteinové struktury. Fyziologicky aktivní endogenní peptidy a proteiny často interagují se specifickými vazebnými proteiny, které se podílejí na jejich transportu a regulaci. Interakce s vazebnými proteiny může také umožnit nebo usnadnit procesy příjmu proteinu buňkou a ovlivnit tak farmakodynamiku léčiva. Toto vše platí jak pro proteiny obecně, tak i pro farmaceutické proteiny. Obecným farmakokinetickým principem, který platí také pro proteiny, je to, že jen volná, nevázaná frakce léčebné substance je dostupná pro procesy distribuce a eliminace, stejně tak jako pro procesy interakce s jejich cílovými strukturami v místě působení, např. na receptoru nebo iontovém kanálu. Vazba terapeutického proteinu na endogenní struktury tak může ovlivnit jak farmakodynamiku, tak i dispoziční vlastnosti proteinových terapeutik. Pro řadu proteinových léčiv, včetně těch rekombinantních, byly nalezeny vazebné proteiny. Popsáno to bylo např. u rekombinantní lidské DNázy užívané jako mukolytikum u cystické fibrózy, růstového hormonu a rekombinantního lidského vaskulárního endoteliálního růstového faktoru. Vazba proteinu na endogenní struktury ovlivňuje nejen nenavázanou frakci proteinového léčiva a tedy frakci léčiva dostupného k farmakologické aktivitě, ale mnohokrát také buďto prodlužuje dobu cirkulace proteinu (působí jako zásobárna proteinu) nebo zesiluje odklízení proteinu. Např. rekombinantní cytokiny se mohou po intravenózním podání vázat na různé cytokin-vázající proteiny, včetně rozpustných cytokinových receptorů a anti-cytokinových protilátek. Dalším příkladem je růstový hormon, který má v plasmě nejméně dva vazebné proteiny. Vazba na tyto proteiny významně 5
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv snižuje eliminaci růstového hormonu a to asi 10x ve srovnání s volně dostupným růstovým hormonem. Na druhou stranu ale snižuje aktivitu růstového hormonu, protože omezuje jeho interakci s příslušným buněčným receptorem. Vedle specifických vazeb se mohou terapeutické proteiny vázat nespecificky k jiným plasmatickým proteinům. Např. u metkephamidu, analoga metenkephalinu, bylo popsáno, že je ze 44% až 49% vázán k albuminu. Podobně octreotid, analog somatostatinu, se až ze 65% váže k lipoproteinům. Distribuce proteinových terapeutik, ale taky jejich eliminace a farmakodynamika mohou být, vedle fyzikálně-chemických vlastností a vazby na endogenní struktury, významně ovlivněny místněspecifickým příjmem přes receptory. Obecně nemusí být malý distribuční objem interpretován jako nízká penetrace do tkáně. Příjem přes specifické receptory je jednou z možností, jak zajistit terapeuticky efektivní koncentrace proteinu v cílovém orgánu bez ohledu na relativně malý distribuční objem. Např. nartograstim, rekombinantní derivát kolonie granulocytů stimulujícího faktoru (G-CSF) je charakteristický specifickým, na dávce závislým a saturovatelným příjmem do cílové kostní dřeně, především přes receptorem zprostředkovanou endocytózu.
9.2.3. Eliminace proteinových terapeutik Terapeutické proteiny procházejí stejnými rozkladnými procesy jako endogenní nebo dietetické proteiny. Konečné produkty, aminokyseliny, se pak stávají výchozími stavebními bloky nově syntetizovaných proteinů. Množství proteinů, které je vylučováno renálně nebo žlučí je zanedbatelné. A i ty proteiny, které se objeví ve žluči, jsou následně degradovány v trávicím traktu. Rychlost degradace proteinu metabolickými procesy roste se snižující se molekulovou hmotností (Tabulka 9. 1), ale závisí také na dalších faktorech, velikosti, náboji, lipofilicitě, funkčních skupinách, glykosylaci, sekundární a terciární struktuře. Proteolýza. Clearance peptidů a proteinů je nevratné odstranění aktivní substance z vaskulárního prostoru a zahrnuje kromě metabolických procesů také příjem buňkami. K degradaci proteázami může dojít nespecificky téměř kdekoli v těle nebo je omezena na specifický orgán nebo tkáň. Kvůli této nespecifické proteolýze některých proteinů už v krvi spolu s aktivním příjmem proteinu buňkami dosahuje clearance více než 5l/min., pro plasmu pak více než 3l/min. O tom, kde a jakým způsobem degradace proteinu proběhne, rozhoduje především jeho molekulová hmotnost. Proteázy a peptidázy se vyskytují v celém těle. Proteiny jsou rozkládány nejen v játrech, ledvinách a gastrointestinálním traktu, ale také v krvi a cévním endotheliu a v dalších orgánech a tkáních. Proteázy a peptidázy se vyskytují také uvnitř buněk, proto má příjem do buňky větší eliminační efekt než samotný distribuční proces. Peptidázy a proteázy v gastrointestinálním traktu a v lysozymech jsou víceméně nespecifické, kdežto rozpustné peptidázy v intersticiálním prostoru a exopeptidázy na buněčném povrchu jsou selektivnější. Gastrointestinální trakt je hlavním místem metabolismu proteinů, ve kterém se uplatňují vysoce proteolytické enzymy, které „přirozeně“ štěpí dietetické proteiny. Metabolismus gastrointestinálního traktu je tedy jedním z hlavních faktorů omezujících systémovou biodostupnost orálně aplikovaných proteinových léčiv. Parenterálně podávané peptidy a proteiny mohou být metabolizovány také v intestinální mukóze. Bylo popsáno, že v gastrointestinálním traktu je odbouráváno alespoň 20% 6
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv endogenního albuminu.
Tabulka 9. 1: Molekulární hmotnost jako hlavní faktor eliminace peptidů a proteinů. Molekulová hmotnost < 500
500 až 1 000
Místo eliminace
Krev, játra
Játra
Převažující mechanismus eliminace
Hlavní determinanta
Extracelulární hydrolýza
Struktura
Pasívní lipoidní difúze
Lipofilicita
Přes nosiče
Struktura
Pasívní lipoidní difúze
Lipofilicita
1 000 až 50 000
Ledviny
Filtrace v glomerulech a následné degradační procesy (obr. 9. 4)
Molekulová hmotnost
50 000 až 200 000
Ledviny, játra
Receptory vyvolaná endocytóza
Cukr, náboj
200 000 až 400 000
Opsonizace
α2-makroglobulin, IgG
> 400 000
Fagocytóza
Agregace částic
Metabolismus a exkrece proteinů v ledvinách. Hlavním místem metabolismu malých proteinů jsou ledviny. Probíhá zde tzv. „glomerulární filtrace“, která je dostupná pro proteiny do molekulové hmotnosti 60 kDa. Nejefektivnější je ale pro proteiny menší než 30 kDa. Peptidy a malé proteiny menší než 5 kDa jsou filtrovány velmi efektivně, rychlostí asi 120 ml/min. (u člověka). Rychlost filtrace pak prudce klesá pro proteiny nad 30 kDa. Proces je ale závislý také na náboji, negativně nabité makromolekuly prostupují stěnami kapilár méně efektivně než makromolekuly bez náboje; nejsnadněji putují kladně nabité makromolekuly. Význam ledvin, jako místa eliminace proteinů byl popsán u interleukinu-2, kolonie makrofágů stimulujícího faktoru (M-CSF) a interferonu α. Relativní příspěvky renální a hepacytární clearance k celkové plasmatické clearance pro několik proteinů jsou znázorněny na obr. 9. 3. Renální metabolismus peptidů a malých proteinů se uskutečňuje třemi vysoce efektivními procesy (obr. 9. 4). Výsledkem těchto procesů je přítomnost jen velmi malých množství intaktních proteinů v moči. První z těchto mechanismů je glomerulární filtrace velkých, složitých peptidů a proteinů. Po glomerulární filtraci následuje reabsorpce do endocytózních vezikul v proximálním tubulu a hydrolýza na malé fragmenty peptidů a aminokyselin. Tento mechanismus byl popsán pro interleukin IL-2, IL-11, růstový hormon a inzulín.
7
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9.3: Hepacytární a renální clearance proteinů na myším modelu. LYZ = lysozym, STI = inhibitor trypsinu ze sóje, NCS = neocarzinostatin, IgG = imunoglobulin G, BSA = bovinní sérový albumin, rhIL11 = rekombinantní lidský interleukin 11.
Rychlost toku hepatické plasmy
rhIL-11
10 000
LYZ
1 000 STI
Urikáza 100 IgG 10
BSA
A Rychlost endocytózy fluidní fáze jater
10
100
1 000
SOD
NCS
10 000
Rychlost glomerulární filtrace
Hepacytární clearance (μl/hod.)
100 000
100 000
Součet renální a urinální clearance (μl/hod.)
Druhým mechanismem je glomerulární filtrace, po které následuje intraluminální metabolismus; ke slovu se dostávají exopeptidázy membrán buněk řasinkového epitelu proximálního tubulu. Výsledné fragmenty peptidů a aminokyseliny jsou zde reabsorbovány do systémové cirkulace. Tento mechanismus platí pro malé lineární peptidy, např. glukagon a LH-RH. Příjmu malých peptidů a peptidům podobných léčiv z glomerulárních filtrátů se účastní protonovou pumpou řízené peptidové transportéry PEPT1 a PEPT2. Tyto vysoce afinitní transportní proteiny přijímají především dipeptidy a tripeptidy a zřejmě se podílejí na udržování renální homeostázy aminokyselin. V obou popsaných mechanismech má dominantní úlohu glomerulární filtrace. Je to rychlost limitující fáze, následné degradační procesy nejsou za fyziologických podmínek saturovány. Kvůli tomuto omezení je příspěvek renální eliminace na celkové eliminaci závislý na proteolytické aktivitě těchto proteinů v jiných částech těla. Je-li v jiných částech metabolická aktivita těchto proteinů vyšší, je renální příspěvek nízký a stává se zanedbatelným v přítomnosti nespecifické degradace v těle. Je-li v jiných tkáních metabolická aktivita nízká nebo je-li její distribuce do extravaskulárního prostoru omezena, pak může příspěvek renální clearance dosáhnout až 100%. To bylo popsáno např. u rekombinantního lidského interleukinu 10 (rhIL-10), kde clearance dosahuje hodnot rychlosti glomerulární filtrace a u pacientů s poškozenými renálními funkcemi musí být správně nastavovány léčebné dávky. Třetím mechanismem renálního metabolismu je peritubulární extrakce peptidů a proteinů z post-glomerulárních kapilár, po které následuje intracelulární metabolické odbourání. Tento 8
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv mechanismus byl potvrzen na studiích s rekombinantním růstovým hormonem. K peritubulárnímu transportu proteinů a peptidů může docházet i v bazolaterální membráně, jak bylo potvrzeno u inzulínu.
Obr. 9. 4: Dráhy renálního metabolismu peptidů a proteinů. Po globulární filtraci následuje a) intraluminální metabolismus nebo b) tubulární reabsorpce s intracelulárním metabolismem v lysozómech a c) peritubulární extrakce s intracelulárním metabolismem v lysozómech
glomerulus
proximální tubulus
filtrát
distální tubulus
lineární peptidy lumen proteiny (p)
p
P
P
receptor
lysozóm
přenos bez receptoru aminokyseliny
Metabolismus jaterních proteinů. V metabolismu terapeutických proteinů může hrát roli kromě metabolismu renálního a gastrointestinálního také činnost jater. V tomto orgánu dochází k proteolýze endogenních i exogenních proteinů na dipeptidy a aminokyseliny, kteréžto stavební kameny jsou zpětně využity k syntéze endogenních proteinů. Proteolýza většinou začíná endopeptidázami, které štěpí molekuly proteinů uvnitř na menší kousky a po nich následují exopeptidázy, které dílo dokončí. Rychlost metabolismu v játrech velmi závisí na specifické sekvenci aminokyselin v proteinu. Nutnou podmínkou pro zahájení degradace proteinů je jejich transport do hepatocytů. Malé peptidy, pokud jsou dostatečně hydrofobní, mohou projít membránou jednoduše pasívní difúzí. K takovým peptidům patří cyklosporiny. Další cyklické nebo lineární peptidy malé velikosti (< 1,4 kDa) a hydrofobní povahy (takové, které obsahují aromatické aminokyseliny) jako je např. cholecystokinin-8 (CCK-8, složený z 8 aminokyselin) jsou pohlcovány hepatocyty prostřednictvím specifických nosičů; v případě CCK-8 je to transportní polypeptid OATP-8 (organic anion transporting polypeptide). Po internalizaci do cytosolu jsou tyto peptidy zpravidla metabolizovány mikrozomálními enzymy 9
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv (cytochrom P-450 pro cyklosporin A) nebo cytosolickými peptidázami (CCK-8). Substance, které vstoupí do jater prostřednictvím nosiče, jsou typicky secernovány do žluče aktivními exportními transportéry. Tento způsob clearance v játrech je totožný s dráhou, kterou je eliminována většina malých organických hydrofobních léčiv. Příjem větších peptidů a proteinů je usnadněn procesy, které využívají různé přenašeče a vyžadují energii. Jednou z možností je receptory zprostředkovaná endocytóza; platí pro inzulín a epidermální růstový faktor. Při tomto způsobu jsou cirkulující proteiny rozpoznány specifickými receptory hepatocytů. Tyto receptory patří k integrálním membránovým glykoproteinům, které mají vazebnou doménu exponovanou na extracelulární straně buněčné membrány. Po navázání cirkulujícího proteinu na receptor dojde k invaginaci membrány a vytvoří se vezikul, který obsahuje receptor a jeho internalizovaný ligand. Obal vezikulu sestává z proteinů (clathrin, adaptin, aj.), které jsou pak odstraněny po působení ATPázy. Receptor a ligand disociují a jsou transportovány do různých buněčných kompartmentů. Některé receptory, LDL, asialoglykoprotein a transferinové receptory, jsou recirkulovány. Receptor může být recirkulován až několiksetkrát, mají tedy velkou kapacitu. Jiné receptory, např. receptor pro interferon, jsou degradovány. Degradace vede ke snížení koncentrace receptorů na povrchu buněk. Jiné, např. receptor pro inzulín, jsou jak recyklovány, tak i degradovány. V případě glykoproteinů, jestliže dojde k překročení kritického množství cukerných zbytků, pak dochází k jejich efektivnímu příjmu do hepatocytů prostřednictvím receptorů rozpoznávajících cukry. K receptorům uhlovodíků patří asialoglykoproteinový receptor v hepatocytech a manózový receptor v Kupferových buňkách a buňkách jaterního endotelu. Do rodiny receptorů LDL patří LRP (low density lipoprotein receptor-related protein), který zodpovídá za endocytózu několika důležitých lipoproteinů, proteáz a proteáza-inhibičních komplexů v játrech a dalších tkáních. Po příjmu proteinů do jater následuje jejich transport do intracelulárního kompartmentu, kde probíhá metabolické zpracování. Proteiny, které jsou internalizovány do vezikulů jsou transportovány do lysozómů nacházejících se v blízkosti středu buněk. Zde vezikula fúzují s lysozómy, specializovanými organelami s kyselým pH, které obsahují různé hydrolázy degradující biologické makromolekuly. Proteolýza je zahájena endopeptidázami (většinou kathepsinem D), který štěpí molekuly proteinů uvnitř. Oligopeptidy, produkt prvního štěpení, jsou dále degradovány exopeptidázami. Výsledné produkty degradace, aminokyseliny a dipeptidy znovu vstupují do metabolické zásoby buněk. Metabolismus glykoproteinů probíhá v játrech mnohem pomaleji než odbourávání „nahých“ proteinů, protože musí být nejprve odstraněny ochranné oligosacharidové řetězce. Proteiny a peptidy, které jsou odbourány v lysozómech hepatocytů, hepatických sinusoidálních buněk a buněk Kupferových, mohou být nakonec uvolněny do krevního oběhu. Degradované proteiny v lysozomech hepatocytů mohou být ale taky předány do žlučových kanálků a secernovány exocytózou. Druhou intracelulární drahou pro proteiny je přímá trans-cytotoxická dráha. V tomto případě prostupují endocytotoxické vezikuly vytvořené na povrchu buněk skrz tyto buňky do peribiliárního prostoru, kde fúzují s membránou žlučových kanálků a uvolňují svůj obsah do žluče exocytózou. Tato metabolická dráha byla popsána u polymerního imunoglobulinu A; ten prochází lysozomálním kompartmentem kompletně. Receptorem zprostředkovaný metabolismus proteinů. Tento způsob je často zásadní eliminační drahou pro taková proteinová terapeutika, která se s vysokou afinitou váží k membránovým receptorům na buněčném povrchu. Interakce proteinového terapeutika s membránovým receptorem 10
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv je často součástí jeho farmakologického účinku; receptor je v tomto případě cílovou strukturou. Po vazbě proteinu na receptor dochází k endocytóze a intracelulárnímu odbourání proteinu v lysozómech. Příjem proteinu receptorem není omezen na nějaký specifický orgán nebo tkáň. Jakákoliv tkáň, která daný receptor exprimuje se na tomto mechanismu odbourání proteinu může podílet. Protože je počet receptorů pro proteinová léčiva zpravidla omezen, je receptorem zprostředkovaný metabolismus proteinů obvykle saturován při relativně nízkých molárních poměrech mezi proteinovým léčivem a jeho receptorem. V důsledku toho není clearance těchto proteinových léčiv konstantní, ale závislá na dávce; a se zvyšující se dávkou klesá. Znamená to, že receptorem zprostředkovaná eliminace je hlavním zdrojem nelineární farmakokinetiky řady terapeutických proteinů a peptidů. Jinými slovy, systémová expozice léčivem se s jeho rostoucí dávkou zvyšuje více než proporcionálně. Jako příklad můžeme zvolit rekombinantní lidský M-CSF, který vedle lineární renální eliminace vstupuje do nelineární eliminační dráhy probíhající podle Michaelis-Mentenové kinetiky, která je propojena s receptorem zprostředkovaným příjmem do makrofágů. Při nízkých koncentracích následuje M-CSF lineární farmakokinetiku, zatímco při vysokých koncentracích jsou ne-renální eliminační dráhy saturovány a můžeme pozorovat nelineární farmakokinetiku.
9.2.4. Dispozice léčiva podle cíle Řada proteinových terapeutik je charakteristická dispozicí v závislosti na cíli. To platí tehdy, když vazba farmakodynamické cílové struktury ovlivňuje farmakokinetiku komponent léčiva a vyúsťuje v saturované procesy s omezenou kapacitou. Důsledkem těchto procesů vyvolaných omezenou dostupností enzymů, receptorů nebo dalších proteinových struktur, se kterými léčivo interaguje, je nelineární farmakokinetika, tj. koncentrace v plasmě se se zvyšující dávkou mění disproporcionálně. V případě léčiv na bázi malých molekul je vazba na receptor obvykle zanedbatelná, pokud to srovnáme s celkovým množstvím léčiva v těle. Proto je vliv vazby na receptor na farmakokinetický profil takového léčiva málokdy zaznamenatelný. Naproti tomu se ke svým cílovým strukturám (např. receptorům) může vázat podstatná část terapeutických proteinů. Dispozice léčiva podle cíle může ovlivnit jeho distribuci stejně tak jako eliminační proces. Nelinearita farmakokinetiky založená na tomto principu byla popsána u několika monoklonálních protilátek, např. trastuzumabu. Trastuzumab je používán pro kombinovanou léčbu proteinu HER2, který je nadprodukován v metastazujícím prsním karcinomu. S rostoucí dávkou se střední poločas rozpadu trastuzumabu zvyšuje a clearance snižuje, což vede k nad-proporcionálnímu zvýšení systémové expozice s rostoucí dávkou. Protože je po vazbě na HER2 trastuzumab rychle internalizován receptorem zprostředkovanou endocytózou, je saturace této eliminační dráhy pravděpodobně příčinou pozorované kinetiky, která je závislá na dávce.
9.2.5. Imunogennost a farmakokinetika proteinu Antigenní potenciál proteinových terapeutik může vyvolat tvorbu protilátek proti nim, zvláště při dlouhodobé terapii. To se často stává, když jsou v klinických studiích u lidí podávány terapeutické proteiny produkované ve zvířatech. Ale platí to i naopak, při podávání lidských rekombinantních 11
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv proteinů zvířatům. Tvorba komplexů protein-protilátka může nejen modulovat nebo taky vyhladit biologickou aktivitu proteinového léčiva, ale může taky ovlivnit jeho farmakokinetický profil. Eliminační clearance proteinových léčiv může být například tvorbou protilátek a vazbou k nim zvýšena nebo i snížena (obr. 9. 5).
Obr. 9.5: Vliv tvorby protilátek na farmakokinetiku a farmakodynamiku proteinových léčiv
Neutralizující protilátky
Imunogenní reakce
Aktivita Komplex proteinprotilátka CL Aktivita
CL
Zvýšenou clearance lze pozorovat, když je komplex protein-protilátka eliminován mnohem rychleji než nenavázaný protein. K takovému zvýšení může docházet tehdy, když komplex proteinprotilátka stimuluje svou clearance retikuloendoteliálním systémem. V ostatních situacích se mohou koncentrace proteinu v séru zvyšovat, když se vazbou k protilátce snižuje rychlost clearance proteinu v důsledku toho, že je komplex protein-protilátka eliminován pomaleji než nenavázaný protein. V tomto případě může komplex protein-protilátka působit jako zásobárna proteinu a nejedná-li se navíc o protilátku neutralizující, může dojít k prodloužení farmakologického účinku proteinu. Kvůli protilátkové odpovědi např. dochází ke zvýšené clearance rekombinantního rIFNα2a u pacientů s nádorem. Naproti tomu koncentrace IFNβ lidských leukocytů se u krys v přítomnosti cirkulujících protilátek snížila 15x. Ke zvýšení i snížení clearance může docházet u téhož proteinu, a to v závislosti na podané dávce. Při nízkých dávkách komplexů protein-protilátka se jejich clearance zpožďuje, protože je jejich eliminace snížena oproti nenavázanému proteinu. Naproti tomu při vysokých dávkách komplexů protein-protilátka dochází k tvorbě agregátů, které jsou odstraněny mnohem rychleji než nenavázaný protein. U chorob spojených s cytokiny, např. násobném myelomu, lymfomu B buněk a revmatoidní 12
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv artritidě byla jako terapeutický přístup doporučena zesílená clearance IL-6 podávaného v koktailech tří anti-IL-6 monoklonálních protilátek. Autoři tohoto doporučení totiž mohli prokázat, že zatímco vazba jedné nebo dvou protilátek k cytokinu vede k jeho stabilizaci, pak simultánní vazba tří anti-IL-6 protilátek ke třem různým epitopům navodila rychlý příjem komplexu do jater a vyvolala tak rychlé odstranění IL-6 z centrálního kompartmentu. Imunogennost proteinových terapeutik závisí také na způsobu podávání, jak bude popsáno v kapitole 10.
9.2.6. Druhová specifičnost a alometrické normování Peptidy a proteiny často vykazují druhovou specifičnost s ohledem na strukturu a aktivitu. Peptidy a proteiny s fyziologicky identickými funkcemi mohou mít u různých druhů odlišné sekvence aminokyselin a nemusí mít u jiných druhů aktivitu žádnou nebo být velmi imunogenní. Dalším druhově specifickým faktorem může být rozsah glykosylace a nebo sialyzace. Nejkřiklavějšími příklady jsou interferon-α nebo erytropoetin, u kterých může být změněna nejen účinnost a imunogennost, ale i clearance. Takové posttranslační modifikace eukaryotických proteinů tak mohou způsobit nefunkčnost rekombinantních produktů exprimovaných v bakteriálních buňkách. Alometrie je metodický přístup, který spojuje podobnou morfologii a funkci proteinu v těle s velikostí organismu. Alometrické normování je empirická technika, která předpovídá tělesné funkce na základě tělních rozměrů. Při vývoji léčiv je to technika často využívaná, zvláště pro předpovědi farmakokinetických parametrů u lidí podle parametrů několika živočišných druhů a stanovení rozdílů v tělesných rozměrech těchto druhů a člověka. Nejčastěji se pro vyjádření tohoto vztahu uvádí rovnice
P = a . Wb
Kde P je normovaný farmakokinetický parametr, W je tělní hmotnost v kg, a je alometrický koeficient, b je alometrický exponent. Parametry a a b jsou specifické konstanty pro každou komponentu. Obecná tendence vede u alometrického exponentu k hodnotě 0,75 pro rychlostní konstanty (např. clearance, eliminační rychlostní konstanta) k hodnotě 1 pro distribuční objem a hodnotě 0,25 pro poločas rozpadu. Pro většinu nízkomolekulárních léčiv je alometrické normování často nepřesné, zvláště je-li hlavní eliminační drahou jaterní metabolismus anebo, jsou-li v metabolismu mezidruhové rozdíly. Pro peptidy a proteiny je však alometrické normování mnohem přesnější. Možná proto, že mají všichni savci velmi podobný metabolismus proteinů. Tyto podobnosti umožňují relativně přesně kvantifikovat předpovědi farmakokinetických parametrů u lidí na základě pre-klinických experimentů na zvířatech. Nejvíce se používají predikce clearance a distribučního objemu podle parametrů získaných na myších, krysách, opicích a prasatech. Výhodou metody alometrického normování je rychlejší nalezení vhodné dávky léčiva, protože to základní množství se dá předem vypočítat.
13
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv 9.2.7. Chemické modifikace za účelem optimalizace farmakokinetiky proteinových terapeutik Chemické modifikace molekulárních struktur terapeutických proteinů ovlivňují imunogennost, farmakokinetiku a farmakodynamiku těchto proteinů. Jedná se o adice, delece nebo výměny aminokyselin v sekvenci polypeptidových řetězců. Jsou syntetizovány zkrácené verze proteinů, struktury jsou glykosylovány nebo deglykosylovány a taky kovalentně vázány k polymerům (např. vazba k monomethoxy polyethylen glykolu procesem označovaným jako PEGylace). Konjugace vysokomolekulárních látek k proteinovým léčivům má za primární cíl ochranu proteinu před rozpoznáním imunitním systémem, ale taky snížení jejich eliminace glomerulární filtrací nebo proteolytickými enzymy. Tyto procesy mají častokrát vést k prodloužení relativně krátkého poločasu eliminace endogenních proteinů. Pegylace proteinových léčiv zvyšuje jejich molekulovou hmotnost, ale mnohem více zvyšuje jejich hydrodynamický objem, protože PEG má silnou vazbu k molekulám vody. Zvýšení hydrodynamického objemu má za následek snížení renální clearance a omezení distribučního objemu. Pegylace také chrání povrchové antigenní determinanty před detekcí imunitním systémem prostřednictvím sterické zábrany. Podobně takto může být ochráněna proteolyticky senzitivní sekvence aminokyselin před působením proteáz. Přidáním velké hydrofilní molekuly k proteinu může pegylace zvýšit rozpustnost léčiva. Pegylace bylo využito ke zlepšení terapeutických vlastností u řady proteinů, např. interferonu α, asparaginázy a filgrastimu. Zatímco normální L-asparagináza měla silně imunogenní účinky u 33% až 75% pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií, pegylovaná forma, tzv. pegaspargáza, vyvolala klinicky viditelnou alergickou reakci jen u 3-10% pacientů. Pegylací filgrastimu, který se používá k omezení chemoterapií indukované neutropenie, na tzv. pegfilgrastim došlo k minimalizaci jeho renální clearance glomerulární filtrací. Hlavní cesta clearance pak vedla přes neutrofily. Pegylace filgrastimu je příkladem tzv. „samoregulující se farmakokinetiky“, protože pegfilgrastim je odstraňován pomaleji, má delší poločas a má lepší vliv na neutropenii ve srovnání s normálními pacienty, protože je k jeho odstraňování k dispozici méně neutrofilů. Hematopoetický růstový hormon darbepoetin α je příkladem chemicky modifikovaného endogenního proteinu se změněným glykosylačním vzorcem. Jedná se o glykosylovaný analog lidského erytropoetinu se dvěma dodatečnými N-oligosacharidovými řetězci. Dodatečná místa pro N-glykosylaci byla vytvořena přidáním 5 aminokyselin do základní peptidové kostry erytropoetinu; došlo tak ke zvýšení molekulové hmotnosti z 30 na 37 kDa. Darbepoetin α má významně změněný farmakokinetický profil ve srovnání s erytropoetinem; má 3x delší poločas, což umožňuje snížit léčebnou dávku.
14
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv
9.3. Farmakodynamika proteinových terapeutik Proteinová terapeutika jsou většinou vysoce potentní látky s efekty, které jsou vysoce závislé na dávce, protože jsou to cílená terapeutika účinkující na specifické, dobře popsané farmakologické struktuře nebo přesně definovaným mechanismem. Je tedy žádoucí u nich dobře charakterizovat vztah koncentrace-účinek, tedy farmakodynamiku. V kombinaci s farmakokinetikou lze vytvořit tzv. integrovaný model farmakokinetika-farmakodynamika (PK/PD), který přidává další vrstvu do složité závislosti popisující komplexní vztah dávka-expozice-účinek, který vede k charakterizaci časového průběhu intenzity účinku léku vycházejícímu ze způsobu aplikace a dávkování (obr. 9.6).
Obr. 9.6: Obecný model PK/PD. Tento model kombinuje farmakokinetiku, která popisuje časový průběh léčiva v plasmě a farmakodynamiku, která vztahuje koncentraci léku v plasmě k léčebnému účinku. Výsledkem je popis časového průběhu síly účinku vycházející ze způsobu aplikace a dávky.
Farmakodynamika Koncentrace účinek
Účinek
Koncentrace
Farmakokinetika Dávka koncentrace x čas
Čas
Koncentrace (log.)
PK/PD Dávka účinek x čas
CV Účinek
CV
Čas Model PK/PD je technika, která kombinuje dvě klasické farmakologické disciplíny, farmakokinetiku a farmakodynamiku. Integruje jejich jednotlivé složky do matematického vyjádření, které umožňuje popsat z časového hlediska průběh účinku s ohledem na způsob podání léčiva. Tento integrovaný model umožňuje charakterizovat vztah dávka-koncentrace-účinek pro určité léčivo na základě měření koncentrace a účinku. Vedle toho umožňuje simulovat časový průběh účinku podle 15
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv dávkového režimu léku mimo rozsah skutečně naměřených hodnot. Po přidání statistických složek popisujících individuální variace a rozdíly mezi individui je možné u modelů PK/PD rozšířit časový průběh účinku nejen na jednotlivé subjekty, ale na celé populace jedinců. Integrované PK/PD modely byly aplikovány na řadu proteinových terapeutik. Vztah mezi expozicí a odpovědí může být jednoduchý nebo složitý a tudíž zjevný nebo skrytý. Aplikace modelů PK/PD je přínosná ve všech fázích preklinického i klinického vývoje léčiv. Existuje 5 základních PK/PD modelů, které budou podrobněji popsány dále v textu s ohledem na jejich aplikace na peptidy a proteiny: 1) 2) 3) 4) 5)
Přímé PK/PD modely Nepřímé PK/PD modely PK/PD modely nepřímé odpovědi Buněčné modely Modely komplexní odpovědi
Nutno ale poznamenat, že PK/PD modely pro proteinová terapeutika nejsou omezeny jen na kontinuální odpovědi, ale používají se také na tzv. binární nebo graduální odpovědi. Binární odpovědi jsou takové odpovědi na léčbu, které mají jen dva výstupy – podmínka je splněna nebo ne, např. přežije nebo zemře. Graduální odpovědi mají řadu pre-definovaných výstupních hladin, kterých může nebo nemusí být dosaženo. Označují se termíny mírný, střední nebo, vážný, podle stádia nemoci.
9.3.1. Přímé farmakokinetické a farmakodynamické modely Koncentrace terapeutického proteinu se měří zpravidla jen v plasmě, séru a krvi, ačkoli je intenzita odpovědi určena koncentrací proteinového léčiva v jeho efektorovém místě, tedy v místě působení v cílové tkáni. Změřit koncentraci proteinového terapeutika v cílovém místě ale často není možné a koncentrace v plasmě, séru nebo krvi se tak využívají jako náhradní řešení. Vztah mezi koncentrací léčiva v plasmě a místě účinku může být konstantní nebo se může časem měnit. Je-li mezi oběma koncentracemi rychle dosaženo ekvilibria nebo je-li místem účinku přímo plasma, sérum nebo krev, pak je vztah mezi oběma koncentracemi prakticky neměnný a mezi plasmou a cílovým místem nedochází k žádnému zpoždění. V takovém případě může naměřená koncentrace proteinu v plasmě přímo sloužit jako vstupní hodnota pro farmakodynamický model (obr. 9. 7). Pro tuto situaci nejčastěji používaný, tzv. sigmoidální Emax model, lze vyjádřit vztahem:
𝐸=
𝐸𝑚𝑎𝑥 . 𝐶 𝑛 𝑛 𝐸𝐶50 + 𝐶𝑛
Kde Emax je maximální dosažitelný efekt, C je koncentrace léčiva v plasmě a EC50 je koncentrace léčiva, která vyvolá poloviční léčebný účinek; n je tzv. Hillův koeficient.
16
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9.7: Schéma přímého PK/PD modelu. PK model je typický dvousložkový model lineární eliminační clearance z centrálního kompartmentu (CL) a distribuční clearance (Q). C1 a C2 jsou koncentrace v centrálním a periferním kompartmentu, V1 a V2 distribuční objemy v těchto kompartmentech. Účinek (E) je přímo spojen s koncentrací léčiva v centrálním kompartmentu C1 a to vztahem vyjádřeným v sigmoidálním Emax modelu.
Farmakokinetika
Farmakodynamika
D
CL C1, V1
Sigmoidální Emax model
Účinek (E)
Emax, EC50, n
Q C2, V2
Přímý PK/PD model byl aplikován při studiu vztahu koncentrace protilátky proti lidskému IgE a léčby sezónní alergické rhinitidy. Rovněž tak byl použit při studiu vlivu rekombinantního IL-10 na (v podmínkách ex vivo) uvolňování prozánětlivého cytokinu TNFα a interleukinu-1β u leukocytů stimulovaných lipopolysacharidem.
9.3.2. Nepřímé farmakokinetické a farmakodynamické modely Tyto modely se používají tam, kde dochází k časovému zpoždění mezi koncentrací léčiva v plasmě a účinkem. V těchto situacích předchází maximální hladina proteinu v plasmě maximálnímu účinku v cílovém místě, účinek se může zvyšovat i poté, co už hladina terapeutika v plasmě dosáhla maxima a může přetrvávat, i když už je protein v plasmě nedetekovatelný. Vztah mezi naměřenými koncentracemi lze popsat tzv. hysterezní smyčkou. Ta může být vyvolána buďto nepřímou odpovědí na podnět nebo zpožděním v distribuci mezi koncentrací léčiva v plasmě a místě účinku. Hypotetický model, popisující zpoždění v distribuci, je zachycen na obr. 9. 8. Vliv účinku kompartmentu na farmakokinetický model nepočítá s hmotnostní rovnováhou, tj. do farmakokinetické části PK/PD modelu není započítán žádný skutečný přenos hmoty. Namísto toho je přenos léčiva definován s ohledem na účinek kompartmentu časovým průběhem samotného účinku. Z pohledu účinku kompartmentu je místo účinku vnímáno jako malá část farmakokinetického kompartmentu neodlišitelná od jiných tkání uvnitř tohoto kompartmentu. Koncentrace v efektorovém kompartmentu odpovídá koncentraci aktivního léčiva v místě působení, které je pomalu ekvilibrováno na hladinu v plasmě a je obvykle spojeno s modelem Emax. 17
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9.8: Schéma typického nepřímého PK/PD modelu. Hypotetický efekt kompartmentu je propojen k centrálnímu kompartmentu dvousložkového farmakokinetického modelu. Koncentrace v efektorovém kompartmentu (Ce) řídí intenzitu farmakodynamického účinku (E) prostřednictvím vztahu Emax. CL1E je clearance transferu z centrálního do efektorového kompartmentu. CLe0 je clearance ekvilibria pro efektorový kompartment. Ostatní označení jsou stejná jako na obr. 9. 7.
Farmakokinetika
Farmakodynamika
D CLe0 CL1e
CL C1, V1
Ce, V1
Sigmoidální Emax model
Účinek (E)
Emax, EC50
Q C2, V2
Místo účinku
Tímto modelem byl studován např. hypoglykemický efekt inzulínu.
9.3.3. Farmakokinetické a farmakodynamické modely nepřímé odpovědi Vliv většiny proteinových terapeutik však není vyvolán přímou interakcí mezi koncentrací léčiva v místě účinku a příslušnými systémy odpovědi, ale zahrnuje často několik transdukčních procesů, ke kterým patří rychlost limitující kroky stimulace nebo inhibice fyziologických procesů, např. syntézu nebo degradaci mediátorů molekulární odpovědi jako jsou hormony nebo cytokiny. V takových případech jsou časový průběh koncentrace v plasmě a následný účinek disociovány a výsledkem je hystereze vztahu koncentrace-účinek; základní příčinou ale není zpoždění distribuce, jako tomu bylo u nepřímých modelů, ale čas spotřebovávající mechanismy nepřímé odpovědi. Schematicky jsou modely nepřímé odpovědi znázorněny na obr. 9. 9. Tyto modely obecně popisují účinek přes dynamické ekvilibrium mezi zvýšením neboli syntézou (probíhá kinetikou nultého řádu) a snížením neboli degradací (probíhá kinetikou prvního řádu). Samotná odpověď může být modulována jednou ze čtyř základních variant modelu. Ve všech modelech jsou procesy syntézy a degradace buďto stimulovány nebo inhibovány v reakci na koncentraci léčiva v místě účinku. Modely tohoto typu byly využity při studiu kinetiky humanizované monoklonální protilátky proti IL-5, označované jako SB-240563. Jinými příklady použití jsou vliv růstového hormonu na koncentraci endogenního IGF-1 nebo vliv epoetinu α na dva parametry, a to koncentraci volného feritinu a koncentraci rozpustného receptoru transferinu nebo vztah koncentrace humanizované protilátky proti anti faktoru IX a aktivity faktoru IX. 18
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9.9: Schéma typického PK/PD modelu nepřímé odpovědi. Účinek (E) je udržován dynamickým ekvilibriem mezi syntetickými a degradačními procesy. ki je rychlostní konstanta pro syntetické procesy, probíhající kinetikou nultého řádu, kout je rychlostní konstanta pro degradační procesy probíhající kinetikou prvního řádu. Rychlost změny účinku (dE/dt) lze vyjádřit jako rozdíl mezi rychlostí syntézy (kin) a degradace (kout). Koncentrace léčiva C1 může stimulovat nebo inhibovat syntetické nebo degradační procesy účinku (E) přes Emax jedním ze 4 submodelů. Ostatní popisky jsou v souladu s obr. 9. 7.
Farmakokinetika
Farmakodynamika
Zvýšení nebo syntéza
D
kin CL C1, V1 Účinek (E) Q
C2, V2
Existují modely 4 subtypů s různou kinetikou
kout Snížení nebo degradace
9.3.4. Buněčné modely Značný počet proteinových terapeutik uplatňuje svůj farmakologický efekt přímou nebo nepřímou modulací buněk krevního a imunitního systému. Pro tyto případy se používají buněčné modely, které umožňují předpovídat účinek léčiva. Tyto modely jsou založeny na mechanismu účinku, na fyziologii. Vycházejí ze skutečnosti, že buňky postupně maturují a sledují kinetiku účinku léčiva po celou dobu života buněk a jejich prekurzorových buněk. Modely se používají na hematopoetické růstové faktory. Hlavním důvodem zpoždění odpovědi na léčivo je fixní fyziologická doba maturace prekurzorových buněk. Odpověď se měří jako změna počtu zralých buněk v periferní krvi. Modely byly použity na popis vlivu násobných dávek rekombinantního lidského erytropoetinu. Proces zrání erytrocytů a buněčný model jsou znázorněny na obr. 9. 10 a 9. 11.
19
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9.10: Maturace erytrocytů. Erytropoetin stimuluje proliferaci a diferenciaci progenitorových buněk erytrocytů (BFU, explodující kolonie tvořící jednotky červené krevní řady, CFUe, kolonie tvořící jednotky červené krevní řady) a erytroblastů kostní dřeně. τ = délka života, RBC = erytrocyty, P1 = erythroidní progenitorová buňka, P2 = erytroblast Kostní dřeň Délka života Pluripotentní kmenové buňky
Leukocyty Krevní destičky
BFU, nezralé BFU, zralé Erytrocytické progenitory
P1
3-4 dny
P2
11-48 hodin
R
3-4 dny
RBC
120 dnů
CFUe
Erytrocytické prekurzory Erytroblasty Retikulocyt, nezralý
Retikulocyt, zralý
Erytrocyt Krev
20
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv Obr. 9. 11: PK/PD model popisující dispozici rekombinantního lidského erytropoetinu a její vliv na počet retikulocytů, erytrocytů a koncentraci hemoglobinu. PK model je jednosložkový model s kinetikou eliminace z centrálního kompartmentu podle Michaelis-Mentenové (km, Vmax). PD model je buněčný model se čtyřmi sekvenčními buněčnými kompartmenty reprezentujícími erytroidní progenitorové buňky (P1), erytroblasty (P2), retikulocyty (R) a erytrocyty (RBC). τP1, τP2, τR a τRBC jsou odpovídající délky života, kin je rychlost transferu mezi kompartmenty řídící se kinetikou nultého řádu. Cílový parametr pro hemoglobin (Hb) je vypočten z počtu retikulocytů a erytrocytů a obsahu hemoglobinu na buňku. Účinek erytropoetinu je modelován jako stimulace tvorby populací obou typů prekurzorových buněk (P1 a P2) v kostní dřeni podle stimulační funkce S (t). Emax je maximální možná stimulace produkce retikulocytů erytropoetinem. EC50 je taková koncentrace erytropoetinu v plasmě, která má na stimulaci 50% účinek. Zpětnovazebná smyčka odpovídá inhibici vlastní produkce retikulocyty tím, že je jimi inhibována produkční rychlost buněk v kompartmentu P1 přes inhibiční funkci l(t). IC50 je množství retikulocytů, které vede k poloviční hodnotě inhibice.
S(t)
kin
kin
Zpětnovazebná regulační smyčka
Vmax, km
τP1
P1
C1, V1
l(t)
S(t) τP2
P2 D kin S(t) = 1
R
Emax .C1 + EC50+C1
τR kin
C1
l(t) = 1 - IC50+C1
τRBC
RBC Hb
kin
21
Farmakokinetika a farmakodynamika peptidů a proteinových léčiv
9.3.5. Modely komplexní odpovědi Protože je vliv většiny proteinových terapeutik zprostředkován přes komplexní regulační fyziologické procesy včetně mechanismů zpětnovazebných smyček anebo fenomén tolerance, jsou PK/PD modely, které byly výše popsány pro proteinová léčiva mnohem sofistikovanější. Jedním z příkladů, pro který byl komplexní model vytvořen je cetrorelix, antagonista LH-RH. Cetrorelix se používá k prevenci předčasné ovulace u žen, které podstoupily kontrolovanou stimulaci ovarií při fertilizaci in vitro. Model je stručně znázorněn na obr. 9. 12.
Obr. 9.12: PK/PD model pro kombinovaný účinek antagonisty LH-RH, cetrorelixu. Jedná se o dvousložkový model identický tomu, který byl popsán na obr. 9. 7. PD model sestává ze dvou komponent: z modelu nepřímé odpovědi subtypu I pro supresi LH cetrorelixem a nepřímého propojeného modelu pro sledování zpoždění hladiny LH jako funkce koncentrace cetrorelixu v hypotetickém efektorovém kompartmentu. Obě komponenty jsou kombinovány.
CL
D IC50
Q C1, V1
C2, V2
k0
(-)
Suprese LH
ke
CL1e CLe0
Emax, EC50 Ce, V1
(+)
zpoždění LH
Efektorový kompartment
Jiným příkladem aplikovaných komplexních modelů je model popisující účinek pegfilgrastimu na počet granulocytů v periferní krvi, respektive vliv koncentrace pegfilgrastimu v plasmě na zrání neutrofilů. Model popisuje jednotlivá stádia maturace neutrofilů ve třech přechodných kompartmentech.
22
