6. Fehérjeszintézis
Fehérjeszintézis I.
PROKARIÓTÁKBAN
A fehérjeszintézist 3 lépésre oszthatjuk: o o o
iniciáció – a riboszóma kapcsolódása a mRNS-hez, az első tRNS bekötődése elongáció – az aminosavak egyenkénti hozzáadása az épülő peptid lánchoz (lánchosszabbítás) termináció – a fehérje szintézis vége, a kész fehérje disszociációja a riboszómákról
A prokariótáknál az iniciációs faktorokat IF-eknek az elongációs faktorokat EF-eknek nevezzük, míg az eukariótáknál eIF és eEF az elnevezésük, ahol „e” az eukarióta szó rövidítése. A prokarióta és az eukarióta transzláció között a legtöbb különbség az iniciációban van. Egyébként, az élővilág e két divíziójában nagyon hasonlóan megy végbe ez a folyamat. Ezért, a prokarióták mechanizmusát mutatjuk be részletesen, s az eukariótáknál főként a különbségeket tárgyaljuk. 0. A tRNS-ek aminosavhoz kapcsolódása (töltés) A transzláció riboszómán zajló folyamatát megelőzi a tRNS-aminosav kapcsolódás. Ennek mechanizmusa a következő: 1. Az aminoacil transzferáz enzim megköti a megfelelő aminosavat, s közben aktiválja azáltal, hogy elbont egy ATP-t, s a keletkezett AMP molekulát az aminosavhoz köti (két foszfátból álló ún. pirofoszfát is felszabadul). Megjegyzés: minden aminosavat különböző enzim ismer fel. 2. Az aktivált aminosavat hordozó enzim felismeri a megfelelő tRNS-t, s hozzáköti az aminosavat. 3. A töltött tRNS a megfelelő aminosavat a riboszómához szállítja, ahol részt vesz a transzláció elongációs szakaszában I. Iniciáció Az iniciációs lépések célja a riboszómáknak a mRNS kezdőpontjához való verbuválása, és a kezdő aminosavat (formil-metionin) szállító tRNA bekötése. A kezdő fázis komponensei a követkők: a nagy (50S) és kis (30S) riboszóma alegység, a mRNS, az iniciátor tRNS-fMet (a formilmetionint hordozó tRNS) és a 3 iniciációs faktor: IF1, IF2, és IF3), valamint a GTP. Az iniciálás folyamata a következőképpen megy végbe: 1. Az IF1 és IF3 a szabad 30S riboszóma alegységhez kötődik azért, hogy mRNS hiányában megakadályozza a két alegység kapcsolódását. 2. Az IF2 kapcsolódik a GTP-vel, s ezt követően a 30S alegységhez kötődik. Ez a reakció a töltött iniciátor tRNS (formil-metionint hordozó tRNS) mRNS-hez való kötődésében segít. 3. A 30S alegység az mRNS riboszóma-kötőhelyéhez (Shine-Dalgarno szekvencia) helyéhez kapcsolódik. 4. Az iniciátor tRNS CAU antikodonával kapcsolódik a mRNS AUG kodonához. Ezt követően az IF3 kötődése a riboszómához megszűnik. Az így keletkezett komplex neve 30S iniciációs komplex. 5. Mivel az IF3 nem akadály többé, az 50S alegység kapcsolódik a 30S alegységgel, s közben az IF1 és IF2-GTP kis alegységhez való kötődése megszűnik, és a GTP GDP-vé alakul (ez szolgáltatja az energiát a folyamathoz). Az iniciációs fázis végén képződött komplex neve 70S inicációs komplex. Mint a dia mutatja, a kis alegységen két mRNS kötő hely van: A-hely és P-hely (A: aminosav; P: peptid). A belépő aminoacil-tRNS-ek az A-helyhez kötődnek, míg a P-hely a növekedő polipeptid kötőhelye. Az iniciátor tRNS az egyetlen kivétel, mert ez a molekula a P-helyhez kötődik. Az újabb kutatások szerint egy 3. az ún. E-hely is található a riboszómán, ide kapcsolódnak a riboszómáról leválni készülő tRNSek.
EXTRA KÖVETELMÉNY
3. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
1
6. Fehérjeszintézis II. Elongáció A 70S iniciációs komplex képződésével megkezdődik az elongációs ciklus, melyet 3 lépésre lehet bontani: 1. Aminoacil-tRNS szállítás Az EF-TuGTP elongációs faktor az aminoacil-tRNS-ek A-helyre való szállítását végzi. A tRNS-ekhez való kötődés energiaigényes folyamat, melyet a GTP GDP-vé való hidrolízise biztosít. A levált EF-TuGDP komplex regenerációját az EF-T faktorok végzik. Az EF-T faktorok eltávolítják a GDP-t, s a helyére GTP-t tesznek. Az így keletkezett EF-TuGTP komplex készen áll egy újabb aminoacil-tRNS megkötésére, s riboszómára való szállítására. Az iniciátor tRNS-t leszámítva, minden aminoacil-tRNS képes az EF-TuGTP-vel komplexet alkotni. Megjegyzés: számos más molekuláris folyamatra is jellemző, hogy a GDP egy külön reakcióban alakul vissza GTP-vé, nem pedig a GTP-vel komplexet alkotó molekulán. 2. Peptidkötés kialakulása Az aminoacil-tRNS A-helyhez való kötődése után, mind az A-, mind a P-helyen 1-1 aminoacil-tRNS tartózkodik (az A-helyen az újonnan jövő tRNS egy aminosavval, a P-helyen a peptideket kötő tRNS). A két egymáshoz közel került aminosav között az 50S riboszóma (RNS-ek ribozim aktivitással) kialakítja a peptidkötést, melyhez nem kell újabb energiát befektetni, mert a reakciót az előzetesen ATP-által aktivált aminosav biztosítja. A peptidek tehát átkerülnek a később jövő tRNS-re 3. Transzlokáció Az EF-G (transzlokáz) és a GTP által alkotott komplex a riboszómához kötődik, inaktiválja a tRNS-t, amely így leválik a P-helyről, s helyét az A-helyen tartózkodó peptideket kötő peptidil-tRNS veszi át. A riboszóma mozgása következtében a peptidil-tRNS az A-helyről a P-helyre kerül, s így az A-helyen az mRNS következő kodonja jelenik meg. Megjegyzés: a legújabb eredmények szerint, az EF-GGTPR által inaktivált tRNS-ek nem azonnal válnak le a riboszómáról, hanem az ún. E-helyre (E: exit) helyre kerülnek, s csak akkor válnak le a riboszómáról, amikor beköt az újabb aminoacil-tRNS. E kétlépéses tRNS leválás valószínű oka az, hogy így a riboszóma egyszerre 6 bázispárral kapcsolódik a mRNS-hez, s ezért csökken a kereteltolódásos leolvasás esélye. III. Termináció Az elongációs ciklus egészen addig folytatódik, amíg a 3 stop kodon valamelyike meg nem jelenik az A-helyen. Nincs olyan tRNS, amely a stop kodont ismerné fel. Ehelyett ún. elbocsátó (release) faktorok ismerik fel a stop kodonokat, majd végzik el a kész fehérje disszociációját. Az RF1 ismeri fel az UAA és UGA, az RF2 pedig az UAA és UAG stop kodonokat. Az RF3 segíti az RF1-t és RF2-t ebben a folyamatban. A RF-ok a peptidil-transzferázra vannak hatással, melynek következtében az nem egy aminoacil-tRNS-hez (nincs is jelen) kötik a polipeptidet, hanem a citoplazmába bocsátják. A mRNS és a töltetlen tRNS P-helyről való leválását és a riboszóma alegységek disszociációját az EF-G végzi. Ezt követően, az IF3 a kis alegységhez kötődik, s egy új fehérje szintéziséig megakadályozza a két alegység kapcsolódását. A poliszóma egy mRNS és az ahhoz kapcsolódó riboszómák összessége. A baktériumok transzlációjának jellemzője, hogy egy mRNS-en párhuzamosan folyik a fehérjék szintézise. Egy prokarióta mRNS rendszerint több gént tartalmaz (operon), s mindegyik gén riboszóma felismerő helyéhez (Shine-Dalgarno szekvencia) önállóan kapcsolódhat a riboszóma. Másrészt, a transzláció során egy génen belül is követik egymást a riboszómák.
EXTRA KÖVETELMÉNY
3. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
2
6. Fehérjeszintézis II.
EUKARIÓTÁKBAN
Az eukarióta sejtekben a fehérjeszintézis részletei több ponton is eltérnek a prokariótáknál leírtaktól (a mitokondriumban és a kloroplasztiszban a fehérjeszintézis hasonló a prokariótákéhoz – endoszimbionta elmélet). A legtöbb eltérés a transzláció iniciációs fázisnál van, amelyben a prokariótákétól nagyobb számú eIF (e: eukarióta) vesz részt. Az eukariótákban nincs Shine-Dalgarno szekvencia, riboszóma a mRNS cap-helyéhez kapcsolódik, tehát távol a transzlációt kezdő kodontól (AUG). Kozák hipotézise szerint a riboszóma egy ún. szkennelő mechanizmussal találja meg a megfelelő start szekvenciát, ami nem feltétlenül a cap után következő első AUG triplet. Az elképzelés szerint a kis riboszóma alegység (40S) már megkötve az iniciációs tRNA-Met molekulát a mRNS 5’ végétől indulva végig szkenneli az RNS molekulát, amíg egy AUG kodont magában foglaló konszenzus szekvenciát (5’GCCRCCAUGG-3’; Kozak szekvencia) nem talál. Az eukariótáknál szintén metionin a kezdő aminosav, de nincs formilálva. Az eukarióta transzláció lépései: I. Iniciáció 4 lépést foglal magában: 1. 2. 3. 4.
A 43S pre-iniciációs komplex összeállása egy multifaktoriális komplex (MFC) segítségével. A 43S pre-iniciációs komplex mRNS általi verbuválása az 5’ végen Szkennelés az iniciációs kodon megtalálására A 60S alegység verbuválása a 80S iniciációs komplex létrehozására
Legalább 12 iniciációs faktor (eIF) vesz részt a transzláció első lépésének kivitelezésében, néhányuk a 3 bakteriális IF-al analóg funkciót végez. Csoportosításuk aszerint, hogy melyik lépésben vesznek részt: o a 43S pre-iniciációs komplex összeszerelésében résztvevők, eIF1, eIF1A, eIF3, és eIF5 o amelyek a mRNS cap régiójához kapcsolódnak, s megszüntetik az RNS molekula másodlagos szerkezetét: eIF4B és eIF4F. o amelyek a 60S alegység kapcsolódását segítik azáltal, hogy a gátló faktorokat eltávolítják, pl. eIF5B faktor, amely öt gátló faktort távolít el. (1) Első lépésben egy három tagból álló komplex képződik, melynek komponensei az iniciátor tRNS, az eIF2 és a GTP. Az összeállást követően, ez a hármas komplex tovább bonyolódik, s egy multifaktoros komplex (MFC) jön létre a következő alkotókból: eIF1, eIF2-GTP, tRNS, eIF3 és eIF5. Az MFC 40S alegységhez való kapcsolódása eIF1A faktor közreműködésével megy végbe. Az így keletkező komplex neve 43S pre-iniciációs komplex. Vegyük észre az összeszerelődés különbözőségét az eukariótákban: a riboszóma kis alegysége az iniciátor tRNS-hez hamarabb kapcsolódik, mint a mRNShez. A nagy alegység mRNS-hez való kapcsolódását megelőzően, az utóbbinak kölcsönhatásba kell lépnie az eIF4b és az eIF4F (ez ismeri fel az 5’-cap-et az eIF4E által) faktorokkal, mely ATP igényes. Az eIF4A feladata az mRNS másodlagos szerkezeteinek az eltávolítása. (2) A második fő lépés akkor történik, amikor a 43S pre-iniciációs komplex a mRNS-hez kötődik az eIF4G és eIF3 faktorokkal való kölcsönhatás által. (3) A harmadik lépésben, az mRNS szkennelése történik a megfelelő AUG kodon detektálására. (4) A negyedik lépésben a 60S alegység kötődéséhez az eIF5B faktor eltávolítja az eIF1, eIF2, eIF3, eIF5 faktorokat. Az eIF1A és eIF5B eltávolítódik amikor a 60S alegység bekötődik, s így létrejön a 80S iniciációs komplex. A levált eIF2GDP komplex reciklizációját az eIF2B irányítja, s a reciklizáció sorsa (s így a fehérjeszintézis sebesség) az eIF2 -alegységének foszforilációjától függ. Bizonyos események, pl. vírusfertőzés, és az ezt követő megemelkedett interferon szint azáltal gátolja a fehérjeszintézist, hogy elősegíti az eIF2 foszforilációját. II. Elongáció Ez a fázis nagyon hasonló a baktériumok és az eukarióták esetében. Három faktorra van szükség a folyamat lebonyolításához: eEF1, eEF1 és eEF2, melyek ugyanazokat a feladatokat látják el, mint a prokarióta EF-Tu, EF-Ts és EF-G. III. Termináció Az eukariótákban egyetlen release faktor (eRF) mindhárom stop kodont felismeri, s ugyanazt a szerepet tölti be, mint a prokariótáknál az RF1, RF2 és RF3. Az eRF GTP igényű, de a pontos hatásmechanizmusa még nem ismert.
EXTRA KÖVETELMÉNY
3. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
6. Fehérjeszintézis III. A TRANSZLÁCIÓ SZABÁLYOZÁSA A transzláció leállítása hiányzó, vagy túl korai stop kodon esetén Az eukarióta sejtekben vannak ellenőrző mechanizmusok, amelyek a megállt riboszómák leválását, ill. a hibás mRNS-ek degradációját idézik elő. (1) Nonstop-mediált lebontás leválasztja a megállt riboszómát, amely stop kodont nem tartalmazó mRNS-t olvasott le (mediált = közvetített). A transzlációs produktum hibás lesz, mivel a C- terminálisán poli-lizint tartalmaz, amely a poliA szekvenciák leolvasásából keletkezik (normálisan nem olvasódik le ez a szekvencia). Egy ski7 nevű fehérje faktor segít a riboszómák disszociációjában és az exonukleázok verbuválásában, amelyek lebontják a hibás RNS-t. (2) A nonszensz-mediált mRNS lebontás Azok a mRNS-ek, amelyek mutáció révén egy a kódoló szakaszon belül stop kodont tartalmaznak degradálódnak. E mechanizmus végrehajtói speciális fehérje komplexek, amelyek az exon-exon határon dokkolnak. A normális mRNS-ekről az első riboszómák eltávolítják ezeket fehérjéket. A defektív mRNS-ekben az abnormális helyen lévő stop kodont hamarabb eléri a riboszóma, mint ahogy az összes fehérje komplexet elmozdítaná, s ez a cap eltávolítását eredményező folyamatot indít el; a cap nélküli mRNS-t pedig az exonukleázok megemésztik. A transzláció szabályozása eukariótáknál A fehérjék mennyiségét egy sejtben az eukarióták leggyakrabban a transzkripció szabályozásával határozzák meg. A szintén sejtmagban történő RNS érési folyamatok is fontos szabályozási pontok. Néhány szabályozási mechanizmus azonban a citoplazmában történik. Ezek a következők: (1) A több kópiában jelenlévő 5’-AUUU-3’ szekvenciák a mRNS gyors degradációját jelzik, tehát az ilyen RNS-ek nem állnak sokáig a fehérjeszintézis rendelkezésére. (2) Bizonyos fehérjék közvetlenül a mRNS-hez kapcsolódnak, megakadályozván azok leolvasását. Ezek a maszkírozott RNS-ek, melyekről a fehérjéket el kell távolítani ahhoz, hogy transzláció folyhasson a sejtben. (3) Egy speciális transzlációt szabályozó mechanizmus a vason alapul. A vas néhány fehérje működéséhez alapvetően fontos. A vas a transzferrin receptorok által jut be a sejtbe (internalizáció), ahol a ferritin nevű proteinhez kapcsolódva tárolódik. A vas által szabályozott fehérjék mRNS-einek nem-kódoló szakaszaikban egy konszenzus szekvencia (IRE; iron response element; vasra-reagáló elem) található, amely egy hurokszerű másodlagos szerkezetet alakít ki; s ehhez speciális fehérjék (ISP; iron sensing proteins; vas-érzékelő fehérjék) kapcsolódhatnak. Azonban, az IRE helyzete és a kötődő fehérjék hatása génenként más és más. A transzferrin receptor mRNS-en az IRE a 3’ nem-kódoló régióban (UTR) található. Az ISP kötődése az IRE elemhez stabilizáló hatást fejt ki a mRNS-re, ami ezáltal több fehérje molekula leolvasását teszi lehetővé. Az ISP vashiányban kötődik a transzferrin receptor mRNS-hez, aminek a nyilvánvaló oka az, hogy a kismennyiségben jelenlévő vasat hatékonyabban fel tudja venni a sejt. Magas vas szint esetén az ISP ledisszociál az IRE szekvenciáról, amely így elvesztvén a maszkírozó fehérjét, a nukleázok célpontja lesz, s a receptor mRNS-ek degradálódnak. Ezzel a mechanizmussal párhuzamosan egy másik folyamat is zajlik a sejtben. Nevezetesen, magas vas tartalom esetén, a ferritin tároló-fehérje mRNS-ének mennyisége növekszik. Ennek oka az, hogy alacsony vas szint esetén az IRE (a mRNS 5’ UTR-ében található) megköti az ISP-t, ami gátolja a riboszómákat, s így a ferritin mRNS transzlációját. A vas szint emelkedésének hatására az ISP ledisszociál az IRE szekvenciáról, ami magas szintű transzlációt eredményez, mivel a riboszómák haladása most már nem gátolt. Ez a transzlációs szabályozási mechanizmus az intracelluláris vas szintet határozza meg (ld dia). Más, egyéb példák is vannak arra mechanizmusra, amely azon alapul, hogy fehérjék kapcsolódnak a mRNS-ek destabilizáló szekvenciáihoz, és gátolják azok endonuklázok általi felismerését. (4) Az miRNS-ek szintén a transzlációt szabályozzák a mRNS gátlásán vagy degradációján keresztül. (5) Az eIF4E gátló proteinek megakadályozzák a cap-függő transzláció iniciációt. (6) A tiamin (B1 vitamin) és egyéb kis molekulák a bakteriális mRNS-ek Shine-Dalgarno szekvenciáihoz kapcsolódnak, s így gátolják a transzlációt.
EXTRA KÖVETELMÉNY
3. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
4
6. Fehérjeszintézis JEGYZETEIM:
5
EXTRA KÖVETELMÉNY
3. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
