5.3. BIOLÓGIAI ÉRTÉKMEGHATÁROZÁSOK ÉS VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEINEK STATISZTIKAI ANALÍZISE

07/2016:50300 5.3. BIOLÓGIAI ÉRTÉKMEGHATÁROZÁSOK ÉS VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEINEK STATISZTIKAI ANALÍZISE 1. BEVEZETÉS E fejezet az Európai Gyógyszerkönyvben előírt biológiai értékmeghatározások tervezéséhez és eredményeik értékeléséhez szolgál útmutatóul. Azok számára írták, akiknek elsődleges képzettsége és munkaterülete nem a statisztika, viszont munkájuk során ilyen típusú meghatározások eredményeinek értékelését végzik, gyakran statisztikus segítsége és tanácsa nélkül. Az e fejezetben leírt számítási módszerek nem kötelezőek az Európai Gyógyszerkönyv kötelező erejű részét képező biológiai értékmeghatározásokra. Alternatív módszerek is használhatók, melyeket az illetékes hatóság elfogadhat, feltéve ha azokat megfelelő adatok támasztják alá és a tartalmi meghatározás validálása során igazolást nyernek. A rendelkezésre álló eszközöktől és az analitikus szakértelmétől függően sokféle számítógépes szoftver program is hasznos segítséget nyújthat. Szakmai segítséget ajánlatos igénybe venni azokban az esetekben, ha átfogó igényű, új termékek kutatására vagy fejlesztésére alkalmas kísérlettervezésre és analízisre van szükség; ha az e fejezet kísérletterveiben szereplő megszorítások nem teljesülnek, például ha egyes laboratóriumok egyedi kísérleti elrendezések alkalmazására kényszerülnek, vagy nem lehet azonos mintaszámot alkalmazni az egymástól azonos távolságban lévő dózisokból; és ha széles tartományú nem lineáris dózis-hatás görbe analízisére van szükség, ami például az immunmeghatározások esetén fordulhat elő. Ennek ellenére, a 3.4. részben vázlatosan bemutatunk egy, a széles tartományú dózis-válasz görbék analízisére elterjedten alkalmazott modellt, és az 5.4. részben pedig egy egyszerű példát ismertetünk. 1.1. A TERVEZÉS ÉS PONTOSSÁG ÁLTALÁNOS SZEMPONTJAI Biológiai módszereket olyan anyagok és készítmények meghatározására írnak elő, melyeknek hatóértékéről kémiai és fizikai analízissel nem lehet kellőképpen meggyőződni. Az ilyen vizsgálatok esetében, ha lehetséges, a standard készítménnyel való összehasonlítás elvét alkalmazzuk, olymódon, hogy meghatározzuk, mennyi vizsgálandó anyag fejt ki ugyanolyan biológiai hatást, mint a standard készítmény Egységnek tekintett, adott mennyisége. Az ilyen típusú biológiai értékmeghatározási módszerek elengedhetetlen feltétele, hogy a vizsgálandó anyag és a standard készítmény vizsgálatát egyidejűleg és azonos körülmények között végezzük. Bizonyos meghatározásoknál (például vírus titer meghatározásnál) a vizsgált minta hatóértékét nem standard készítményre vonatkoztatva fejezzük ki. Az ilyen típusú meghatározásokkal a 4.5. rész foglalkozik. A biológiai értékmeghatározások alapján becsült hatóértékek, a biológiai válaszok természetéből adódó változékonyság miatt, véletlen hibával terheltek, és ezért – ha lehetséges – mindegyik értékmeghatározás eredményéből, még az előírt (hivatalos) módszer használata esetén is, hibaszámítást kell végezni. Az értékmeghatározások tervezéséhez szükséges módszereket és a hibaszámításokra vonatkozó eljárásokat az alábbiakban írjuk le. A statisztikai módszer alkalmazása előtt minden esetben megfelelő számú értékmeghatározással elővizsgálatot kell végezni, így bizonyosodva meg a módszer alkalmazhatóságáról. A hatóérték megbízhatósági tartománya (konfidenciaintervalluma) azt a pontosságot jelzi, amellyel a hatóértéket az értékmeghatározás során megállapították. E tartományt a kísérleti elrendezésnek és a mintaméretnek megfelelően számítjuk. A biológiai értékmeghatározásoknál általában a 95 %-os megbízhatósági tartományt választjuk. A megbízhatósági tartomány határainak kiszámítására matematikai statisztikai módszereket alkalmazunk, ezzel biztosítva, hogy a valódi hatóérték 95%-os valószínűséggel e határértékeken belül van. A vonatkozó készítmény cikkelyében megadott követelményektől függ, hogy az így kapott pontosság elfogadható-e az Európai Gyógyszerkönyv szempontjából.

Az „átlag” és „szórás” kifejezéseket úgy használjuk, ahogy a legtöbb forgalomban levő biometria tankönyvben használatos. A „deklarált” vagy „jelzett hatóérték”, a „hozzárendelt hatóérték”, a „feltételezett hatóérték”, a „hatóérték-arány” és a „becsült hatóérték” kifejezések e fejezetben az alábbi fogalmak megjelölésére szolgálnak: –

„deklarált hatóérték” vagy „jelzett hatóérték”: formulált termék esetében a névleges hatóérték, melyet az ömlesztett anyag hatóértékének ismeretében tüntetnek fel; ömlesztett anyag esetében a gyártó által megállapított hatóérték;

–

„hozzárendelt hatóérték”: a standard készítmény hatóértéke;

–

„feltételezett hatóérték”: a vizsgálandó készítmény előzetesen feltételezett hatóértéke, mely a standard készítmény dózisának hatásával megegyező hatású dózis számításának alapjául szolgál;

–

valamely ismeretlen készítmény „hatóérték-aránya”: az értékmeghatározás körülményei között a standard készítmény és az ismeretlen készítmény egyforma hatást eredményező dózisainak aránya;

–

„becsült vagy számított hatóérték”: az értékmeghatározás adataiból számított hatóérték.

Az e fejezetben használt legfontosabb jelöléseket a „Jelölések listája” című 9. rész sorolja fel. Ha a szöveg olyan jelölést használ mely ebben a részben nem található meg, vagy az ott megadott értelmezéstől eltérő értelemben használja, akkor a jelet az adott szövegrész definiálja. 2. RANDOMIZÁLÁS ÉS AZ EGYEDI KEZELÉSEK FÜGGETLENSÉGE A különböző kezeléseket a különböző kísérleti egységekhez (állatokhoz, csövekhez, stb.) szigorúan véletlenszerűen kell hozzárendelni. A kísérleti elrendezésben tudatosan figyelembe nem vett bármely más kísérleti körülményt szintén véletlenszerűen kell megválasztani. Ilyenre példa a ketrecek helyzetének kiválasztása a laboratóriumban és a kezelések alkalmazásának sorrendje. Különösen igaz ez abban az esetben, amikor az állatok egy csoportja valamely készítmény azonos dózisát kapja. Ezek az állatok nem kezelhetők együtt (ugyanabban az időben, vagy ugyanazon elhelyezésben) mindaddig, amíg nem válik egyértelművé, hogy a szóban forgó varianciaforrás (például az idők között, vagy a pozíciók között) elhanyagolható. Véletlenszerű hozzárendeléseket számítógépekkel is nyerhetünk, azok beépített véletlengenerátorát használva. Az analitikusnak ellenőriznie kell a véletlengenerálás egyes indításainál kapott számsorozatok különbözőségét. Az egyes kísérleti egységekhez rendelt készítményeknek olyan függetleneknek kell lenniük egymástól, amennyire csak lehetséges. Általában az egyes kísérleti csoportokon belül az egyes kezelésekhez rendelt hígítások nem ugyanannak a dózisnak az osztott részei, hanem egymástól függetlenül kell készülniük. Ezen óvintézkedés nélkül a készítményben rejlő változékonyság a kísérleti hiba szórásában nem jelenik meg teljesen. Az eredmény a maradék hiba alulbecslése lesz, ami oda vezet, hogy: 1) indokolatlanul megnő a varianciaanalízis próbáinak szigorúsága (3.2.3. és 3.2.4. rész) 2) a vizsgálat valódi megbízhatósági határait, melyeket a 3.2.5. részben leírtak szerint a becsült s2 – ből, azaz a maradék szórásnégyzetből számítunk, alulbecsüljük. 3. A KVANTITATÍV BIOLÓGIAI VÁLASZOKON ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSOK 3.1. STATISZTIKAI MODELLEK 3.1.1. ÁLTALÁNOS ALAPELVEK Az Európai Gyógyszerkönyvben lévő biológiai értékmeghatározások „hígításos meghatározások”, azaz feltételezzük, hogy a vizsgálandó ismeretlen készítmény ugyanazt a hatóanyagot tartalmazza, mint a standard készítmény, de különböző benne a hatóanyag és az inert komponensek aránya. Ilyen esetben az ismeretlen készítmény elméletileg a standard készítmény inert komponensekkel történő

hígításával nyerhető. Annak ellenőrzéséhez, hogy valamely adott meghatározás tekinthető-e hígításos meghatározásnak, a standard és az ismeretlen készítmény dózis-válasz összefüggésének összehasonlítására van szükség. Ha a dózis-válasz összefüggések szignifikánsan különböznek, akkor az elméleti hígításos meghatározás modell nem megfelelő. A standard és az ismeretlen készítmény dózis-válasz összefüggésének szignifikáns különbsége arra utal, hogy a készítmények egyike a hatóanyagon kívül olyan komponenseket is tartalmaz, melyek nem inertek, hanem hatással vannak a mért válaszra. Az elméleti modellben a hígítás hatása szemléletesebbé tehető, ha a dózis-válasz összefüggéseket a lehető legszélesebb dózis tartományban lineáris függvénnyé transzformáljuk. Az előírt biológiai értékmeghatározásokban két statisztikai modellnek van jelentősége: az egyik a párhuzamos egyenesek módszere, a másik az iránytangens-hányados módszer. Mindkettő alkalmazása az alábbi feltételek teljesülésétől függ: 1) a különböző kezelések hozzárendelése a kísérleti egységekhez véletlenszerű volt; 2) a válaszok mindegyik kezelés esetében normál eloszlást követnek; 3) a standard és az ismeretlen készítmény kezelési csoportjain belül a válaszok szórása nem különbözik szignifikánsan egymástól. Az értékmeghatározások kidolgozásakor az analitikusnak meg kell győződnie arról, hogy a számos meghatározásból begyűjtött adathalmaz megfelel-e ezen elméleti feltételeknek. –

Az 1. feltétel az e fejezet 2. részében leírtak szigorú alkalmazásával teljesíthető.

–

A 2. feltétel olyan feltételezés, mely a gyakorlatban többnyire mindig teljesül. Az e feltevéstől való kis eltérések általában nem okoznak komoly hibát az analízisben, egészen addig, míg a kezeléseket több párhuzamosban végezzük (ismétlések). Kétséges esetekben, a normalitástól való eltérésre vonatkozó vizsgálatok (pl. Shapiro-Wilk próba) végezhetők.

–

A 3. feltétel ellenőrizhető a varianciák homogenitásának vizsgálatával (pl. Bartlett próba, Cochran próba). E célra az adatok grafikus megjelenítése is nagyon tanulságos lehet (lásd a példákat az 5. részben)

Ha a 2. és/vagy a 3. feltétel nem teljesül, a válaszok transzformálása (például ln y, feltételek jobb teljesülését eredményezheti.

, y2) a

–

az y válasz ln y-ná történő transzformációja a varianciák nem megfelelő homogenitása esetén hasznos. E transzformáció a jobbra ferde eloszlások normalitását is javíthatja.

–

az y -ná történő transzformációja akkor hasznos, ha a megfigyelések Poisson eloszlást követnek, azaz ha az előfordulások számlálásával nyerték őket.

–

az y négyzetre emeléses transzformációja y2-té olyan esetekben lehet hasznos, ha például a dózis nagyobb valószínűséggel arányos egy inhibíciós zóna területével, mint annak átmérőjével.

Néhány mennyiségi választól függő meghatározásnál – mint például az immunmeghatározásoknál, vagy a sejtes in vitro meghatározásoknál – nagy számú dózist használunk. A dózisokra adott válaszok teljesen lefedik a lehetséges választartományt és így széles tartományú, nemlineáris dózis-válasz görbét eredményeznek. Az ilyen típusú görbék mindegyik biológiai értékmeghatározásra jellemzőek, de sok meghatározás esetében a nagy számú dózis alkalmazása vagy nem etikus (például in vivo vizsgálatok) vagy nem praktikus, és a meghatározás célja korlátozott számú dózissal is elérhető. Emiatt szokásos a dózisok számát a dózis-válasz görbe tartomány azon részére csökkenteni, mely alkalmas transzformációval lineárissá tehető, és amelyre így a 3.2. és a 3.3. rész módszerei alkalmazhatók. Ennek ellenére néhány esetben a széles tartományú, dózis-válasz görbék analízise a kívánatos. Egy ilyen analízisek esetében alkalmazható modell vázlatát a 3.4. részben, és egy egyszerű példát pedig az 5.4. részben mutatunk be. Az értékmeghatározásoknak egy másik típusában a válasz nem mérhető minden egyes kísérleti

egységben, hanem az egyes kezelésekre az egységeknek csak egy része válaszol és a válaszoló egységeket számlálhatjuk meg. E típussal a 4. részben foglalkozunk. 3.1.2. RUTIN MEGHATÁROZÁSOK Ha egy meghatározást rutinszerűen használnak, ritkán van lehetőség az 1. és a 3. feltétel szisztematikus ellenőrzésére, mivel a meghatározásonkénti korlátozott számú megfigyelés valószínűleg hatással van a statisztikai vizsgálat érzékenységére. Szerencsére statisztikailag bizonyított, hogy a szimmetrikusan kiegyensúlyozott meghatározásokban kis eltérés a variancia homogenitásától és a normalitástól nem befolyásolja komolyan a meghatározások eredményeit. A statisztikai modell alkalmazhatóságát csak akkor szükséges megkérdőjelezni, ha a meghatározások érvényessége (a validitás) sorozatban válik kétségessé. Ekkor szükség lehet a 3.1.1. részben leírtak szerint egy új elővizsgálat sorozat elvégzésére. További két szükséges feltétel az alkalmazott statisztikai modelltől függ. – A párhuzamos egyenesek módszere esetében: 4A) Az alkalmazott dózisok teljes tartományában a dózis logaritmusa és a válasz közötti összefüggés egyenessel írható le. 5A) A meghatározás során bármely ismeretlen készítményre kapott egyenes párhuzamos a standard készítményre kapott egyenessel. – Az iránytangens-hányados módszer esetében: 4B) Az alkalmazott dózisok teljes tartományában a dózis és a válasz közötti összefüggés minden készítmény esetében egyenessel írható le. 5B) A meghatározás során bármely ismeretlen készítményre kapott egyenes az y-tengelyt (nulla dózis) ugyanabban a pontban metszi, mint a standard készítmény esetében kapott egyenes (azaz a meghatározásban vizsgált minden készítmény válaszfüggvényének tengelymetszete megegyezik a standard készítmény függvényének tengelymetszetével). A 4A és a 4B feltételeket csak az olyan meghatározásokban lehet ellenőrizni, melyekben készítményenként legalább 3 hígítást vizsgáltak. A csak egy vagy két hígítást alkalmazó meghatározások használata azokban az esetekben fogadható el, ha kísérletekkel bizonyított, hogy a linearitás és a párhuzamosság vagy az azonos tengelymetszet rendszeresen teljesül. A 4A és az 5A (vagy a 4B és az 5B) feltételek teljesülésének ellenőrzésére a meghatározások eredményeiből a vizsgálati minták relatív hatóértékének számítása előtt varianciaanalízist kell végezni. Ehhez a teljes négyzetösszeget bizonyos számú, az egyes teljesítendő feltételeknek megfelelő négyzetösszegre kell felbontani. A maradékul kapott négyzetösszeg (pontosabban a maradék szórásnégyzet) adja meg a maradék kísérleti hibát. Ehhez viszonyítjuk F-arányok képzésével a releváns variancia-források meglétét vagy hiányát reprezentáló szórásnégyzeteket. Ha a meghatározás bizonyítottan érvényes (validitása igazolt), az egyes ismeretlenek standardra vonatkoztatott hatóértékei kiszámíthatók és vagy hatóérték-arányként adhatók meg, vagy a vizsgált készítménynek megfelelő egységgé – pl. Nemzetközi Egységgé – alakíthatók. Minden egyes meghatározási adatsorozatra a megbízhatósági határok is megbecsülhetők. A párhuzamos egyenesek módszerén alapuló meghatározásokat a 3.2. részben az iránytangenshányados módszeren alapuló meghatározásokat a 3.3. részben ismertetjük. Ha az öt feltétel (1, 2, 3, 4A, 5A vagy 1, 2, 3, 4B, 5B) bármelyike nem teljesül, az itt leírt számítási módszerek nem érvényesek, és a meghatározási eljárást ki kell vizsgálni. Az analitikus nem alkalmazhat másik transzformációt, hacsak be nem bizonyosodik, hogy a követelmények teljesülésének hiánya nem egyedi eset, hanem a kísérleti körülmények szisztematikus megváltozása miatt következett be. Ebben az esetben a 3.1.1. fejezetben leírt vizsgálatokat (próbákat) meg kell ismételni, mielőtt a rutin meghatározásokban az új transzformálást bevezetnénk.

Ha hasonló anyagokat összehasonlító rutin meghatározások esetén túlságosan nagy a párhuzamosságtól vagy a linearitástól való eltérés miatt érvénytelen meghatározások száma, ez valószínűleg arra utal, hogy a kísérleti elrendezésben nincs elegendő számú ismétlés. A feltételeknek való nem megfelelés általában abból ered, hogy a meghatározásra ható varianciaforrások nem teljesen ismertek, ami a maradék hiba (maradék szórásnégyzet) alulbecslését eredményezi és így nagy Farányokhoz vezethet. Egyetlen meghatározásban minden lehetséges varianciaforrás (pl. a napok közti eltérés) figyelembevétele nem mindig valósítható meg. Ilyen esetben ugyanannak a mintának az ismételt meghatározásaiból kapott megbízhatósági intervallumok átfedése nem biztos hogy kielégítő, és ezért az egyedi megbízhatósági tartományokat kellő óvatossággal kell értelmezni. A megbízhatósági intervallum valósághoz közelibb becslése érdekében több független meghatározás elvégzésére lehet szükség, és ekkor ezek egyesített eredményeiből számítjuk a hatóértéket és megbízhatósági tartományt (lásd 6. rész). A rutin meghatározások minőségellenőrzése érdekében az ellenörző lapokon ajánlatos feljegyzést vezetni a regressziós egyenesek meredekségéről és a maradék hiba becsült értékeiről. –

A különösen nagy maradék hiba valamilyen technikai problémát jelezhet. Ezt ki kell vizsgálni, és ha nyilvánvalóvá válik, hogy a meghatározás során valami elromlott, a meghatározást meg kell ismételni. A szokatlanul nagy maradék hiba egy véletlen kiugró eredményt vagy téves megfigyelést is jelezhet. Azt a választ, amelyről már a vizsgálat alatt kiderül, hogy bizonytalan, mivel hiba történt az eljárás során, el kell vetni. Ha már a válaszok regisztrálása után fedezünk fel abnormális értéket, de az a meghatározás szabálytalanságára vezethető vissza, indokolt lehet az érték figyelmen kívül hagyása. A látszólag hibás értékek önkényes elutasítása vagy visszatartása komoly hibaforrás lehet. Általában nem támogatható egy megfigyelés figyelmen kívül hagyása kizárólag csak azért, mert a kiugró adatokra vonatkozó vizsgálat szignifikáns volt.

–

Egyszer-egyszer előfordulnak különösen kicsi maradék hibaértékek és emiatt az F-arányok elérhetik a kritikus értéket. Ilyen esetekben elfogadható megoldás az adott meghatározás becsült maradék hibájának kicserélése egy olyan átlagos maradék hibára, melyet a vizsgálati lapokon feljegyzett korábbi adatok alapján számítottunk.

3.1.3. SZÁMÍTÁSOK ÉS MEGSZORÍTÁSOK A jó tervezés általános alapelvei szerint a következő három megszorítást általában beépítik a kísérleti elrendezésbe. Ezek mind a számítógépes feldolgozás, mind a pontosság szempontjából is előnyösek. a) A meghatározásban minden készítményt azonos számú hígításban kell vizsgálni; b) A párhuzamos egyenesek módszere esetén a szomszédos dózisok aránya a meghatározás összes kezelését tekintve állandó legyen; az iránytangens-hányados módszernél a szomszédos dózisok közötti különbségek a meghatározás összes kezelését tekintve állandóak legyenek; c) Kezelésenként azonosszámú kísérleti egység legyen. Ha a fenti megszorításoknak megfelelő tervet használunk, a számítások egyszerűek lesznek. A képleteket a 3.2 és a 3.3 részekben adjuk meg. Ajánlatos e speciális feladatra kifejlesztett programokat (szoftvereket) használni. Több olyan program is létezik, mely könnyen tudja kezelni a cikkelyekben előforduló meghatározási terveket. Nem minden program használja ugyanazokat az összefüggéseket és algoritmusokat, de mindegyiknek ugyanahhoz a végeredményhez kell vezetnie. Létezhetnek és helyesek is lehetnek a fenti megszorításokat nem teljesítő kísérleti elrendezések is, de a számításukhoz szükséges képletek olyan bonyolultak, hogy ebben a szövegben nem írjuk le őket. A számítási módszerek rövid leírása a 7.1. részben található. E módszerek a fenti megszorításokat figyelembe vevő elrendezésekre is alkalmazhatók, a képletek ebben az esetben az egyszerű képletekkel lesznek egyenértékűek. A megszorításoknak eleget tevő elrendezések e fejezetben megadott képletei például széleskörűen felhasználhatók helyi programok írásához. Az 5. részben bemutatott példák felhasználhatók a

statisztikai kiértékelés megértésére és annak ellenőrzésére is, hogy az általunk készített programok megfelelő eredményt adnak-e. 3.2. A PÁRHUZAMOS EGYENESEK MÓDSZERE 3.2.1. BEVEZETÉS A párhuzamos egyenesek módszerét a 3.2.1.-I. ábrán mutatjuk be. A vízszintes tengelyen a dózisok logaritmusa látható, a legkisebb koncentráció a bal, a legnagyobb a jobb oldalon van feltüntetve. A válaszokat a függőleges tengelyen ábrázoltuk. Minden egyes kezelés egyedi válaszát teli fekete kör jelzi. A két egyenes a standard és az ismeretlen készítmény esetében számított ln(dózis)-válasz összefüggés. Megjegyzés. E szövegben végig a természetes alapú logaritmust (ln vagy loge) használjuk. Az „antilogaritmus” kifejezésen az ex mennyiséget értjük. Mindezek ellenére a „szokásos” 10-es alapú logaritmus (lg, log vagy log10) is használható, az ennek megfelelő antilogaritmus a 10x. Kielégítő meghatározáshoz a vizsgált minta feltételezett hatóértékének közel kell lennie a valódi hatóértékéhez. A feltételezett hatóérték és a standard készítmény hozzárendelt hatóértéke alapján – amennyiben megvalósítható – azonos hatású hígításokat készítünk, azaz a standard és az ismeretlen készítmény megfelelő dózisaira ugyanazt a választ várjuk. Ha nincs információ a feltételezett hatóértékre, széles dózistartományban előkísérleteket kell végezni a dózis-hatás görbe lineáris tartományának meghatározására. Minél jobban megközelíti az ismeretlen készítmény feltételezett hatóértéke a valódi hatóértékét, annál közelebb lesz a két egyenes egymáshoz, mivel azonos dózisokra azonos válaszokat kell kapnunk. A két egyenes közötti vízszintes távolság az ismeretlen készítmény feltételezett hatóértékének és valódi hatóértékének viszonyát jelzi. Minél nagyobb a távolság a két egyenes között, annál kevésbé volt jó az ismeretlen készítmény feltételezett hatóértékére vonatkozó becslés. Ha az ismeretlen készítmény egyenese a standard egyenesétől jobbra helyezkedik el, a feltételezett hatóértéket túlbecsültük, és a számítások eredményeképpen a feltételezett hatóértéknél alacsonyabb becsült hatóértéket kapunk. Hasonlóan, ha az ismeretlen egyenese a standard egyenesétől balra található, a feltételezett hatóértéket alábecsültük, és a számítások a feltételezett hatóértéknél magasabb becsült hatóértéket fognak jelezni.

3.2.1.-I. ábra – Párhuzamos egyenesek módszere 3 + 3 meghatározás esetén 3.2.2. KÍSÉRLETI ELRENDEZÉSEK

A kísérleti elrendezések pontosságának optimalizálásához az alábbi megfontolásokat érdemes figyelembe venni: 1) A meredekség és a maradék hiba aránya olyan nagy legyen, amekkora csak lehet.

2) A dózistartomány a lehető legnagyobb legyen. 3) Az egyenesek olyan közel legyenek egymáshoz amennyire csak lehetséges, azaz a feltételezett hatóérték a valódi hatóérték jó becslése legyen. A kísérleti egységek (állatok, csövek stb.) hozzárendelése a különböző kezelésekhez többféleképpen is megvalósítható. 3.2.2.1. Teljesen randomizált elrendezések Ha a kísérleti egységek összessége jogosan homogénnek tekinthető, és semmi jel nem mutat arra, hogy felismerhetők bizonyos alcsoportok, melyekben a válaszok változékonysága kisebb, akkor az egységeknek a különböző kezelésekhez történő hozzárendelését véletlenszerűen kell elvégezni. Ha bizonyos alcsoportokban (mint például a fizikai helyzet, vagy a kísérlet napja) lévő egységek valószínűleg homogénebbek mint az egységek összessége, a meghatározás pontossága növelhető, ha egy vagy több megszorítást beépítünk az elrendezésbe. Az egységek e megszorításoknak megfelelő gondos elosztása lehetővé teszi a zavaró varianciaforrások kiküszöbölését. 3.2.2.2. Randomizált blokk elrendezések E kísérleti elrendezés lehetővé teszi, hogy egy varianciaforrást különválasszunk. Ilyen varianciaforrás lehet például a kísérleti állatok almai közti érzékenységkülönbség, vagy diffúziós mikrobiológiai meghatározásban a Petri csészék közti különbség. Az ilyen elrendezés mindegyik kezelést mindegyik blokkban (alomban vagy Petri csészében) azonos számban írja elő, és csak akkor alkalmazható, ha a blokk elég nagy ahhoz, hogy benne minden kezelés egyszer elvégezhető legyen. Erre az elrendezéstípusra az 5.1.3. részben mutatunk példát. Alkalmazhatunk ismétléseket is tartalmazó randomizált elrendezéseket is. Az egyes blokkokon belül a kezelések hozzárendelése véletlenszerű legyen. Véletlen permutációt generáló algoritmust a 8.5. részben mutatunk be. 3.2.2.3. Latin-négyzetes elrendezések Ez az elrendezés akkor alkalmazható, ha választ két különböző varianciaforrás is befolyásolja, és ezek mindegyikének k különböző szintjét vagy helyzetét feltételezhetjük. Például, egy antibiotikum lemezen történő értékmérésénél a kezelések egy nagyobb lemezen k k nagyságú mátrixban rendezhetők el úgy, hogy mindegyik kezelés minden sorban és minden oszlopban egyszer fordul elő. Ez az elrendezés akkor alkalmazható, ha a kezelések száma megegyezik a sorok és az oszlopok számával. A válaszokat négyzetes formában, úgynevezett Latin négyzetben regisztráljuk. A válaszoknak a k számú sor és k számú oszlop között mutatkozó különbözőségéből adódó variációja elkülöníthető, és így a hiba csökkenthető. Az 5.1.2. részben a Latin négyzetes elrendezésre mutatunk be példát. A 8.6. részben Latin-négyzetet generáló algoritmust adunk meg. Adott körülmények között összetettebb elrendezések is hasznosak lehetnek, melyek esetében a Latin-négyzetes elrendezésen belül egy vagy több kezelés ismétlődik. Az e fejezetben megadott formula ezen esetekre nem alkalmazható, ilyen esetben szakember tanácsát kell kérni. 3.2.2.4. Keresztezett elrendezések Ez az elrendezés olyan esetekben használatos, amikor a kísérlet blokkokra osztható és minden blokkban elegendő csak két kezelést alkalmaznunk. Lehet egy blokk például akár egyetlen egység is, melyet két alkalommal vizsgálunk. Ez az elrendezés a pontosság növelésére szolgál, azáltal, hogy kiküszöböli az egységek közötti különbségeket, miközben kiegyensúlyozza a két alkalom általános válaszszintje közötti különbségekből eredő hatást. Ha a standard és az ismeretlen készítmény két-két dózisát vizsgáljuk akkor ezt ikerkeresztezett módszernek nevezzük. A kísérletet két szakaszra osztjuk, melyeket megfelelő időköz választ el egymástól. a vizsgálat első szakaszában a négy csoportba osztott egységek minden egyes csoportja más-más kezelést kap a lehetséges négy közül. Azok az egységek, amelyek az első szakaszban az egyik készítményből kaptak, a második alkalommal a másik készítményből fognak kapni, és amelyik egység kis dózist kapott az első szakaszban, az nagy dózist kap a másodikban. A dózisok elrendezése a 3.2.2.-I táblázatban látható, és az 5.1.5. részben egy erre vonatkozó példát találhatunk.

3.2.2.-I. táblázat – A keresztezett eljárás dózisainak elrendezése csoportok

1. alkalom

2. alkalom

1

S1

T2

2

S2

T1

3

T1

S2

4

T2

S1

3.2.3. VARIANCIAANALÍZIS (SZÓRÁSELEMZÉS) Ebben az alfejezetben a varianciaanalízis elvégzéséhez szükséges képleteket adjuk meg. Az alfejezet megértését az 5.1. rész kidolgozott példái is segítik. A 9. részben pedig az alkalmazott jelölések listája található. A képletek olyan szimmetrikus meghatározások esetén alkalmazhatók, melyekben egy vagy több vizsgálandó készítményt (T, U, stb.) hasonlítunk össze egy standard készítménnyel (S). Hangsúlyozzuk, hogy a képletek csak akkor használhatók, ha a dózisok egymástól egyenlő távolságban vannak, ha készítményenként azonos számú kezelést végzünk és minden kezelést ugyanannyiszor alkalmazunk. Ettől eltérő esetekben a képleteket nem használhatjuk. A hiba kifejezések néhány módosításától eltekintve, a meghatározások adatainak analízise alapvetően azonos a teljesen randomizált, a randomizált blokk és a Latin-négyzetes elrendezések esetében. A keresztezett elrendezésekre vonatkozó képletek kissé különbözőek, ezeket az 5.1.5. példában mutatjuk be. Figyelembe véve a 3.1. részben tárgyaltakat, a válaszokat – szükség szerint transzformálás után – a 3.2.3.-I. táblázatban megadottak szerint mindegyik kezelésre és mindegyik készítményre átlagolni kell. Az ln(dózis)-válasz egyenesek meredekségével összefüggő lineáris kontrasztokat is ki kell számítani. Három további, a varianciaanalízis szerkesztéséhez szükséges képletet a 3.2.3.-II. táblázat mutat be. A válaszok különböző kezelések által okozott teljes varianciáját a 3.2.3.-III. táblázat szerint bontjuk fel; a négyzetösszegek a 3.2.3.-I. és a 3.2.3.-II. táblázat alapján számított értékekből származnak. A linearitástól való eltérés négyzetösszege csak abban az esetben számítható, ha a meghatározás során készítményenként legalább 3 dózist alkalmaztunk. A meghatározás maradék hibáját úgy kapjuk meg, hogy a válaszok teljes varianciájából kivonjuk az elrendezés által figyelembe vett megengedett varianciákat (3.2.3.-IV. táblázat). A táblázatban a meghatározásban gyűjtött összes válasz átlagát jelenti. Meg kell jegyeznünk, hogy a Latin-négyzetes elrendezésben az ismételt válaszok száma (n) megegyezik a sorok, oszlopok illetve kezelések számával (dh) (d = a dózisok száma, h = a készítmények száma). A varianciaanalízis elvégzéséhez mindegyik négyzetösszeget a vonatkozó szabadságfokkal elosztva kiszámítjuk az átlagos négyzetösszegeket (szórásnégyzeteket). Minden vizsgált változó átlagos négyzetösszegét elosztjuk a maradék hibával (maradék szórásnégyzet, s2), a kapott érték – azaz az Farány – szignifikanciáját a 8.1. táblázat vagy egy alkalmas algoritmus, illetve számítógépes program segítségével értékeljük. 3.2.3.-I. táblázat – Készítményenként d dózist alkalmazó, a párhuzamos egyenesek módszerén alapuló meghatározások képletei Standard (S)

1. vizsgált minta (T)

2. vizsgált minta (U)

a válaszok átlaga a legkisebb dózis esetén

S1

T1

U1

a válaszok átlaga a 2. dózis esetén

S2

T2

U2

…

…

…

…

A válaszok átlaga a legnagyobb dózis esetén

Sd

Td

Ud

Válaszösszeg a készítményre

PS = S 1 + S 2 + … + S d

PT = T 1 + T 2 + … + T d

PU = … stb.

Lineáris kontraszt

LS = 1S1 + 2S2 + … + dSd +

LT = 1T1 + 2T2 + … + dTd +

LU = … stb.

-

(d + 1)PS

-

(d + 1)PT

3.2.3.-II. táblázat – További képletek a varianciaanalízishez

3.2.3.-III. táblázat – A négyzetösszegek és a szabadságfokok számítására alkalmas képletek Variancia-forrás

Készítmények

Szabadság fokok (f) száma h–1

Lineáris regresszió

1

Párhuzamosságtól való eltérés

h–1

Linearitástól való eltérés*

h(d – 2)

Kezelések

Négyzetösszeg

hd – 1

* Két dózist alkalmazó meghatározásokban nem számítjuk

3.2.3.-IV. táblázat – A maradék hiba becslése Variancia-forrás

Szabadságfokok száma

Blokkok (sorok)*

n–1

Oszlopok**

n–1

Maradék hiba***

hd(n – 1) (hd – 1)(n – 1) (hd – 2)(n – 1)

Teljes

nhd – 1

E képletek Latin-négyzetes elrendezés esetén csak n = hd fennállása esetén alkalmazhatók. * teljesen randomizált elrendezések esetén nem számítjuk ** csak a Latin-négyzetes elrendezések esetében számítjuk

Négyzetösszeg

*** a kísérleti elrendezés típusától függ

3.2.4. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGÉNEK (A VALIDITÁSNAK), AZAZ A STATISZTIKAI ELŐFELTEVÉSEK TELJESÜLÉSÉNEK VIZSGÁLATA A meghatározás eredményét „statisztikailag érvényesnek” (validnak) mondjuk, ha a varianciaanalízis eredménye a következő: 1) a lineáris regresszióra kapott F-arány szignifikáns, azaz a számított valószínűség kisebb mint 0,05. Ha ez a kritérium nem teljesül, a 95 %-os megbízhatósági intervallumok nem számíthatók; 2) a párhuzamosságtól való eltérésre kapott F-arány nem szignifikáns, azaz a számított valószínűség 0,05-nél nem kisebb. Ez jelzi számunkra, hogy a 3.1. részben tárgyalt 5A feltétel teljesül; 3) a linearitástól való eltérésre kapott F-arány nem szignifikáns, azaz a számított valószínűség 0,05nél nem kisebb. Ez jelzi számunkra, hogy a 3.1. részben tárgyalt 4A feltétel teljesül. A párhuzamosságtól való szignifikáns eltérés több készítmény egyidejű meghatározása (ún. többszörös meghatározás) esetén abból adódhat, hogy a kísérleti tervbe bevont egyik készítmény ln(dózis)-válasz egyenesének meredeksége eltér a többi készítményétől. Az egész meghatározás érvénytelennek minősítése helyett úgy is eljárhatunk, hogy az erre a készítményre vonatkozó összes adatot elvetjük, és az elejétől kezdve újra elvégezzük a varianciaanalízist. Ha megállapítottuk hogy a meghatározás statisztikailag érvényes volt, a hatóértékeket és a megbízhatósági intervallumokat a következő részben leírtak szerint számíthatjuk. 3.2.5. A HATÓÉRTÉK ÉS A MEGBÍZHATÓSÁGI HATÁROK BECSLÉSE Ha I valamely készítmény esetében a szomszédos dózisok arányának természetes alapú logaritmusa, a készítményenként d dózist alkalmazó meghatározások közös meredeksége (b) a következőképpen számítható:

(3.2.5.-1.) és valamely készítmény, (például T) hatóérték-arányának logaritmusa az alábbiak szerint adható meg: Az így számított hatóérték minden egyes ismeretlen készítmény esetében a „valódi hatóérték” becslése. A megbízhatósági határokat a következő kifejezés antilogaritmusaként számíthatjuk:

(3.2.5.-3.) ahol és A 8.2. táblázatból nyerhetjük a p = 0,05 valószínűségi szinthez (szignifikancia-szinthez) és a maradék hiba szabadságfokával megegyező szabadságfokhoz tartozó t értéket. A becsült hatóértéket (RT) és a hozzá tartozó megbízhatósági határokat úgy kaphatjuk meg, hogy a fent kapott értékek antilogaritmusát vesszük, majd megszorozzuk AT-vel (azaz a vizsgált T minta feltételezett hatóértékével). Ha a feltételezett és a hozzárendelt hatóérték alapján készített alapoldatok hatásának nagysága nem teljesen azonos, korrekciós faktorok alkalmazására van szükség (lásd a példákat az 5.1.2. és az 5.1.3. részben). 3.2.6. HIÁNYZÓ ÉRTÉKEK Kiegyensúlyozott meghatározásokban az alkalmazott kezelésektől teljesen független esemény (például egy állat elhullása) egy vagy több válasz elvesztéséhez vezethet. Ha megállapítottuk, hogy ez az esemény semmilyen módon sem kapcsolatos a kezelésben alkalmazott készítmény összetételével, még mindig végezhetők egzakt számítások, de a képletek szükségszerűen bonyolultabbak és csak az általános lineáris modellek (lásd 7.1. rész) keretében adhatók meg. Létezik azonban egy közelítő

módszer, mely megőrzi a kiegyensúlyozott elrendezés egyszerűségét, úgy, hogy a hiányzó válaszokat számított értékekkel helyettesíti. Az információvesztést a teljes négyzetösszeg és a maradék hiba szabadságfokai számának a hiányzó értékek számával való csökkentésével vesszük figyelembe. A hiányzó érték számítására az alább megadott képletek egyikét használjuk. Nem szabad azonban elfelejteni, hogy ez csak egy közelítő módszer, és az egzakt módszert kell előnyben részesíteni. Egynél több hiányzó megfigyelés esetén is ugyanazt a képletet használhatjuk. Az eljárás a következő: egy kivételével az összes hiányzó értéket durván megbecsüljük, a maradék egy értéket a megfelelő képlet segítségével és az összes többi durván becsült érték felhasználásával számítjuk ki. Ezután kiszámítjuk az első, durva becsléssel megállapított értéket. Miután minden hiányzó értéket ily módon kiszámítottunk, az egész ciklust az elejétől kezdve megismételjük. A számítás során mindig a legújabb becsült vagy számított értékeket használjuk minden olyan válasz esetében, amelyre a képletet alkalmazzuk. Ezt addig kell folytatni, míg két egymást követő ciklus ugyanazokat az értékeket nem adja; a konvergencia általában gyors. Ha a cserélt értékek száma a teljes kísérlet megfigyeléseinek összes számához képest kevés (mondjuk kisebb, mint 5%), e cserében alkalmazott közelítés és a szabadságfokok számának a cserélt értékek számával való csökkentése általában teljesen kielégítő. Ennek ellenére az analízist nagy gondossággal kell értékelni, különösen akkor, ha a hiányzó értékek egy kezelésben vagy egy blokkban túlsúlyban vannak, és bármely szokatlan dolog esetén biometriával foglalkozó szakemberrel kell konzultálni. Az ismétléseket nem tartalmazó vizsgálatok hiányzó adatainak helyettesítése különösen kényes művelet. Teljesen randomizált elrendezés A hiányzó érték az ugyanarra a kezelésre kapott többi válasz számtani átlagával helyettesíthető. Randomizált blokk elrendezés A hiányzó értéket az alábbi összefüggés szerint kapjuk:

(3.2.6.-1.) ahol B / a hiányzó értéket tartalmazó blokkban a válaszok összege, T / a szóban forgó kezelésre kapott válaszok összege, G / a meghatározásban gyűjtött összes válasz összege. Latin-négyzetes elrendezés A hiányzó y’ értéket az alábbi összefüggésből nyerjük:

(3.2.6.-2.) ahol B / és C / a hiányzó értéket tartalmazó sorban és oszlopban lévő válaszok összege. Ebben az esetben k = n. Keresztezett elrendezések Értékvesztéssel járó baleset esetén, mivel a megfelelő képletek az adott kezeléskombinációktól függenek, azokat statisztikai könyvből (pl. D.J. Finney, lásd 10. rész) kell kikeresni. 3.3. IRÁNYTANGENS – HÁNYADOS MÓDSZER 3.3.1. BEVEZETÉS Ez a módszer például néhány mikrobiológiai értékmeghatározásokban alkalmazható, melyekben a független változó egy, a táptalajban az optimális koncentrációnál kisebb töménységben jelen lévő fontos növekedési faktor koncentrációja. Az iránytangens-hányados módszert a 3.3.1.-I. ábrán mutatjuk be.

3.3.1.-I. ábra. – Az iránytangens-hányados módszer 23+1 típusú meghatározás esetén A dózist a vízszintes tengelyen ábrázoltuk, a nulla koncentráció az ábra bal, a legnagyobb koncentráció a jobb oldalán van. A válaszokat a függőleges tengelyen jelöltük. Minden egyes kezelés egyedi válaszait fekete telt körök jelzik. A két egyenes a számított dózis-válasz összefüggés a standard és az ismeretlen készítmény esetében, és feltételezzük, hogy a nulla dózisnál metszik egymást az egyenesek. A párhuzamos egyenesek módszerével ellentétben, itt nem végezzük el a logaritmikus transzformációt. Csakúgy, mint a párhuzamos egyenesek módszerén alapuló meghatározások esetében, ebben az esetben is fontos, hogy a feltételezett hatóérték közel legyen a valódi hatóértékhez, és ha kivitelezhető, a vizsgálandó és a standard készítményből azonos hatáserősségű hígításokat készítsünk. Minél jobb a feltételezett hatóérték előzetes becslése, annál inkább egybeesik a két egyenes. Az iránytangensek hányadosa az ismeretlen készítmény „valódi” hatóértékének és a feltételezett hatóértékének arányát mutatja. Ha az ismeretlen készítmény egyenese meredekebb (iránytangense nagyobb) mint a standardé, a hatóértéket alábecsültük, és a számítások a feltételezett hatóértéknél nagyobb becsült hatóértéket fognak eredményezni. Hasonlóan, ha az ismeretlen egyenese a standardéhoz képest kevésbé meredek, a hatóértéket túlbecsültük, és a számítások a feltételezett hatóértéknél kisebb becsült hatóértéket fognak adni. A kísérlet beállításánál minden választ meg kell vizsgálni, hogy teljesülnek-e a 3.1. részben leírt 1. 2. és 3. feltételek. A rutinszerűen elvégzendő variancianalízist a 3.3.3. részben mutatjuk be, ezzel a 3.1. részben leírt 4B és az 5B feltételeknek való megfelelés ellenőrizhető. 3.3.2. KÍSÉRLETI ELRENDEZÉSEK Az alábbiakban bemutatandó statisztikai analízis alkalmazásakor a meghatározásokra az alábbi megszorításokat kell tennünk: a) A standardot és a vizsgálandó készítményeket ugyanolyan számú hígításban kell vizsgálni, és a hígításokat úgy kell megválasztani, hogy a szomszédos dózisok közötti különbség azonos legyen; b) Egy további, kezelést nem kapó csoportot (kontroll, üres/vak minta) is vizsgálunk; c) Minden kezeléshez azonos számú kísérleti egységet kell rendelni. Ahogy azt már a 3.1.3. részben is megjegyeztük, olyan kísérleti elrendezések is alkalmazhatók és megfelelőek lehetnek, melyek a fenti megszorításoknak nem felelnek meg, de ez esetben az itt leírt egyszerű statisztikai analízis nem alkalmazható, és vagy szakértő tanácsát kell figyelembe venni, vagy alkalmas szoftvert kell használni. Általában előnyben részesítjük a készítményenként két dózist és egy kontrollt alkalmazó „közös nulla (2h + 1)” típusú elrendezést, mivel ekkor kapjuk a legnagyobb pontosságot és ugyanakkor –

amennyiben a fenti megszorítások is teljesülnek – a vizsgálat validitása is ellenőrizhető. Igaz viszont, hogy a nulla dózis közelében nem mindig feltételezhetünk lineáris összefüggést. Ekkor bár a pontosság kissé csökken, kontrollt nem alkalmazó terveket használhatunk. Ebben az esetben a készítményenként három dózist alkalmazó „közös nulla (3h)” típusú elrendezést részesítjük előnyben a készítményenként két dózist alkalmazóval szemben. A dózisokat az alábbiak szerint választjuk meg: 1) A standard legnagyobb dózisát úgy választjuk meg, hogy azt a legnagyobb dózist, amelyre a kapott válaszok átlaga még a dózis-hatás görbe lineáris szakaszára esik, megközelítse, de ne érje el. 2) A másik két dózist egyenlően osztjuk el a legnagyobb dózis és a nulla dózis között. 3) A vizsgálati készítmények dózisait a készítmények feltételezett hatóértéke alapján a standardnak megfelelően állapítjuk meg. A 3.2.2. részben leírt teljesen randomizált, randomizált blokk vagy Latin-négyzetes elrendezések is használhatók. Bármelyik fenti elrendezés alkalmazásakor a hiba négyzetösszegeket a párhuzamos egyenesek módszerénél leírtakhoz képest módosítani kell. Az alábbiakban egy olyan meghatározás analízisét mutatjuk be, melyben egy vagy több vizsgálati készítményt standarddal szemben vizsgálunk. 3.3.3. VARIANCIAANALÍZIS 3.3.3.1. (hd + 1)-elrendezések A válaszokat a 3.1. részben leírtak szerint vizsgáljuk, és ha szükséges transzformáljuk. Ezt követően az egyes készítményekre és kezelésekre kapott válaszokat a 3.3.3.1.-I. táblázatnak megfelelően átlagoljuk. Ezen kívül a kontroll csoport által adott válaszok átlagát (B) is kiszámítjuk. A négyzetösszegeket a varianciaanalízis során a 3.3.3.1.-I. – 3.3.3.1.-III. táblázatok szerint számítjuk. A linearitástól való eltérésből eredő négyzetösszeget csak akkor lehet számítani, ha a kísérleti elrendezésben készítményenként legalább három dózist alkalmaztunk. A maradék hibát úgy kapjuk meg, hogy az adott kísérleti elrendezésre megengedett varianciákat kivonjuk a válaszok teljes varianciájából (3.3.3.1.-IV. táblázat).

3.3.3.1.-I. táblázat – Készítményenként d dózist és egy kontroll csoportot alkalmazó, az iránytangens-hányados módszeren alapuló meghatározások képletei Standard (S)

1. vizsgált minta (T)

2. vizsgált minta (U)

a válaszok átlaga a legkisebb dózis esetén

S1

T1

U1

a válaszok átlaga a 2. dózis esetén

S2

T2

U2

…

…

…

…

A válaszok átlaga a legnagyobb dózis esetén

Sd

Td

Ud

PS = S1 + S2 + … + Sd

PT = T1 + T2 + … + Td

LS = 1S1 + 2S2 + … + dSd

LT = 1T1 + 2T2 + … + dTd

Válaszösszeg a készítményre

Szorzatösszeg

LU = …

Tengelymetszet

aU = …

Iránytangens

bU = …

Kezelés

GU = …

Linearitástól való eltérés*

JU = …

* Két dózist alkalmazó meghatározásokban nem számítjuk

3.3.3.1.-II. táblázat – További képletek a varianciaanalízishez

3.3.3.1.-III. táblázat – A négyzetösszegek és a szabadságfokok számítására alkalmas képletek Variancia-forrás

Szabadságfokok (f) száma

Regresszió

h

Kontrollok

1

Tengelymetszet

Linearitástól való eltérés* Kezelések

Négyzetösszeg

h–1

h(d – 2)

hd

* Két dózist alkalmazó meghatározásokban nem számítjuk

3.3.3.1.-IV. táblázat – A maradék hiba becslése Szabadságfokok száma

A variancia forrása Blokkok (sorok)*

n–1

Oszlopok**

n–1 teljesen randomizált

Maradék hiba***

randomizált blokk Latin-négyzet

Teljes

Négyzetösszeg

(hd + 1)(n – 1) hd(n – 1) (hd – 1)(n – 1) nhd + n – 1

E képletek Latin-négyzetes elrendezés esetén csak n = hd fennállása esetén alkalmazhatók. * teljesen randomizált kísérleti elrendezések esetén nem számítjuk ** csak a Latin-négyzetes elrendezések esetében számítjuk *** a kísérleti elrendezés típusától függ

A varianciaanalízis befejezéseképpen az átlagos négyzetösszegek kiszámítása érdekében, mindegyik négyzetösszeget elosztjuk a megfelelő szabadságfokkal. Minden vizsgált változó átlagos négyzetösszegét elosztjuk a maradék hibával (maradék szórásnégyzettel, s2). A kapott érték – azaz az

F-arány – szignifikanciáját a 8.1. táblázat vagy egy alkalmas algoritmus illetve számítógépes program segítségével állapítjuk meg. 3.3.3.2. (hd)-elrendezések A képletek alapvetően megegyeznek a (hd + 1)-elrendezés képleteivel, a különbségek a következők: –

mindegyik képletből hiányzik a B.

–

SSblank nem szerepel a varianciaanalízisben.

–

a kezeléseknél a szabadságfokok száma hd – 1.

–

A maradék hiba és a teljes variancia szabadságfokainak számát a párhuzamos egyenesek módszerében leírtak szerint (lásd 3.2.3.-IV. táblázat) számítjuk.

A meghatározás érvényességének (validitásának) vizsgálata, a hatóérték és a megbízhatósági intervallum megállapítása a 3.3.4. és a 3.3.5. részben leírtak szerint történik. 3.3.4. AZ ÉRVÉNYESSÉG (VALIDITÁS) VIZSGÁLATA A meghatározás eredményeit statisztikailag érvényesnek mondjuk, ha a varianciaanalízis eredménye azt mutatja hogy: 1) a (hd + 1) elrendezés esetén a kontrollok („vak” minták) okozta variancia nem szignifikáns, azaz a számított valószínűség nem kisebb mint 0,05. Ez jelzi számunkra, hogy a kontrollokra kapott válaszok nem különböznek szignifikánsan a közös tengelymetszettől és a lineáris összefüggés egészen a nulla koncentrációig érvényes; 2) a tengelymetszet varianciája nem szignifikáns, azaz a számított valószínűség nem kisebb mint 0,05. Ez jelzi számunkra a 3.1. rész 5B feltételének teljesülését; 3) készítményenként legalább három dózist alkalmazó meghatározásoknál a linearitástól való eltérésből eredő variancia nem szignifikáns, azaz a számított valószínűség nem kisebb mint 0,05. Ez jelzi számunkra, hogy teljesül a 3.1. rész 4B feltétele. Ha a kontrollok varianciája szignifikáns, a feltevés, miszerint a linearitás a nulla dózis közelében is teljesül, nem érvényes. Ha úgy tűnik, hogy ez a szignifikancia inkább szisztematikus, mintsem egyedi eset, e meghatározástípus esetében a (hd)-elrendezések megfelelőbbek. Ekkor az értékelésnél a kontrollok által adott válaszokat figyelmen kívül kell hagyni. Ha a vizsgálatok azt jelzik, hogy a meghatározás érvényes, a hatóértéket és a megbízhatóságiintervallumot a 3.3.5. részben leírtak szerint számítjuk. 3.3.5. A HATÓÉRTÉK ÉS A MEGBÍZHATÓSÁGI HATÁROK BECSLÉSE 3.3.5.1. A (hd + 1)-elrendezés A készítmények közös tengelymetszete (a /) az alábbi képlet alapján számítható:

(3.3.5.1.-1.) A standard meredeksége – és ehhez hasonlóan a többi készítményé – az alábbiak szerint számítható:

(3.3.5.1.-2.) Az egyes vizsgált készítmények a hatóérték-arányát a következő összefüggés szerint kapjuk:

(3.3.5.1.-3.) A hatóértékarányt AT-vel, azaz a vizsgált készítmény feltételezett hatóértékével megszorozva kapjuk meg a becsült RT hatóértéket. Ha a szomszédos dózisok közti különbség nem volt egyforma a standard és a vizsgált készítmény esetében, a hatóértéket IS / IT-vel meg kell szorozni. Megjegyezzük, hogy itt, a párhuzamos egyenesek módszerével ellentétben, nem kell az értékek antilogaritmusát venni. A megbízhatósági határ (konfidencia intervallum) RT/-re:

(3.3.5.1.-4.) ahol

és

V1 és V2 az RT/ számlálójának és nevezőjének varianciájával és kovarianciájával rokon mennyiségek, melyek az alábbi képletekkel nyerhetők:

(3.3.5.1.-5.) (3.3.5.1.-6.) A megbízhatósági határokat AT-vel és szükség esetén IS / IT-vel is megszorozzuk. 3.3.5.2. (hd)-elrendezések

A képletek ugyanazok, mint a (hd + 1)-elrendezés esetében, a következő módosításokkal: a/ = a (3.3.5.2.-1.) (3.3.5.2.-2.) (3.3.5.2.-3.) 3.4. SZÉLES TARTOMÁNYÚ, SZIGMOID ALAKÚ, DÓZIS-HATÁS GÖRBÉK Ez a modell alkalmazható például néhány immunmeghatározás esetében, ahol széles tartományú, szigmoid alakú dózis-válasz görbék analízisére van szükség. A modellt a 3.4.-I. ábrán mutatjuk be.

3.4.-I. ábra – A négy-paraméteres logisztikus görbe modell A dózisok logaritmusát a vízszintes tengelyen ábrázoltuk, a legalacsonyabb koncentráció a bal, a legmagasabb a jobb oldalon van feltüntetve. A válaszokat a függőleges tengelyen ábrázoltuk. Minden egyes kezelés egyedi válaszát teli fekete kör jelzi. A két görbe a standard és a vizsgálati készítmény esetében számított ln(dózis)-válasz összefüggés. A görbék általános alakja rendszerint egy logisztikus függvénnyel leírható, de ettől eltérő görbealakok is lehetségesek. Minden görbét 4 paraméterrel jellemezhetünk: a felső aszimptotával (), az alsó aszimptotával (), a meredekség-faktorral (), és a vízszintes helyzettel (). Emiatt ezt a módszert gyakran négy-paraméteres modellnek is nevezik. Az ln(dózis)-válasz görbe matematikai leírása a következő:

Az érvényes meghatározáshoz az szükséges, hogy a standard és a vizsgálati készítmény görbéje ugyanazzal a meredekség-faktorral rendelkezzen és a szélsőséges értékeknél a maximum és minimum válasz-szintek megegyezzenek. Csak a görbe vízszintes helyzete () lehet különböző. A görbék közti vízszintes távolság az ismeretlen készítmény „valódi” hatóértékétől függ. Ha a meghatározást rutinszerűen használják, elegendő lehet a felső és az alsó válasz-szintek azonosságának feltételét a módszer kidolgozása során ellenőrizni, majd e feltételeket csak alkalmas időközönként, illetve az anyagok és a meghatározás körülményeinek változása esetén közvetlen méréssel újra ellenőrizni. A paraméterek és a megbízhatósági határok legnagyobb valószínűség (maximum-likelihood) becslése alkalmas számítógépes programokkal nyerhető. E programok tartalmazhatnak néhány, a meghatározás érvényességét tükröző statisztikai vizsgálatot is. Például, ha a legnagyobb valószínűség becslés a feltételek – miszerint a felső és alsó aszimptoták, illetve a meredekségek egyenlőek – esetén szignifikáns eltérést mutat az illesztett modelltől, e feltételek egyike, vagy mindegyike feltehetően nem teljesül. A logisztikus modell sok statisztikai problémát vet fel, melyek a különböző típusú meghatározásokban különböző megoldásokat tesznek szükségessé, és így egyszerű összefoglalás nem adható. A lehetséges megközelítések széles választékát írták le az idevonatkozó irodalomban. Emiatt az ilyen típusú meghatározásoknál szakmai segítség igénybevételét ajánljuk. Ennek ellenére az 5.4. részben közlünk egy egyszerű példát, mely a megadott adatok értékelésének egy „lehetséges” módját mutatja be. Az alternatív megközelítések és más statisztikai megfontolások rövid ismertetését a 7.5. részben tesszük meg. Ha szakmai segítség vagy alkalmas szoftver nem áll rendelkezésre, alternatív megközelítések is lehetségesek: 1) Ha a felső határ () és az alsó határ () ésszerű becslése rendelkezésünkre áll, mindegyik készítmény

esetében kiválasztjuk azokat a dózisokat, amelyekre a kapott válaszok (u) átlagai a határok kb. 20 és 80 %-a közé esnek, majd a kiválasztott dózisokra kapott válaszokat az

egyenlet szerint transzformáljuk, és végül a párhuzamos egyenesek módszerét (lásd. 3.2. rész) alkalmazzuk; 2) Kiválasztjuk a dózisok azon tarományát, melyekre a válaszok (u), vagy az alkalmasan transzformált válaszok, pl. ln(u) az ln(dózis) függvényében vizsgálva körülbelül lineárisak; ezután a párhuzamos egyenesek módszerével (lásd 3.2. rész) az analízis elvégezhető. 4. A „MINDEN VAGY SEMMI” TÍPUSÚ (KVANTÁLIS) VÁLASZOKON ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSOK 4.1. BEVEZETÉS Bizonyos meghatározásokban lehetetlen vagy nagyon munkaigényes mindegyik kísérleti egység válaszának mennyiségi skálán történő mérése. Ehelyett azt vizsgáljuk, hogy egy megfigyelt jelenség, mint amilyen az elhullás, vagy a hipoglikémiás tünetek, fellép-e vagy sem az egyes kísérleti egységekben, az eredmény pedig azoknak az egységeknek a számától függ, melyekben a jelenség fellépett. Az ilyen meghatározásokat „minden vagy semmi” típusú vagy kvantális vizsgálatoknak nevezzük. A helyzet nagyon hasonló ahhoz, mint amit a mennyiségi analízis esetében a 3.1. részben leírtunk, de mindegyik kezelés n különálló válasza helyére egyetlen értéket írunk, azaz a válasz minden egyes kezelt csoportban a jelenséget mutató egységek száma. Ezt a számot a dózis logaritmusának függvényében ábrázolva lineáris összefüggés helyett inkább szigmoid jellegű (S-alakú) görbét kapunk. Az e szigmoid görbét leíró matematikai függvényeket használjuk a dózis-válasz görbe becslésére. A legtöbbször alkalmazott függvény a normális eloszlás eloszlásfüggvénye. E függvény elméletileg is megfelelő, és feltehetőleg ez a legjobb választás azokban az esetekben, amikor a válasz az egységek toleranciáját tükrözi. Ha valószínűbb, hogy a válasz valamilyen növekedési folyamattól függ, a logisztikus eloszlásmodellt részesítjük előnyben, habár a két modellel számított eredmények között rendszerint nagyon kicsi a különbség. A görbe meredekségének és helyzetének legnagyobb valószínűség (maximum likelihood) becslése csak iterációs eljárással oldható meg. Sok, ugyanarra az eredményre vezető módszer létezik, melyek azonban hatékonyságukban – amit a konvergálás sebességével jellemezhetünk – különböznek egymástól. Egyike a leggyorsabb módszereknek a legnagyobb valószínűség függvény közvetlen optimalizálása (lásd 7.1. rész), mely a feladatra alkalmas beépített eljárásokkal rendelkező számítógépekkel könnyen végrehajtható. Sajnos e módszerek többsége nem adja meg a megbízhatósági-intervallumot, és az a technika, mellyel ezt megkaphatjuk, túlságosan bonyolult ahhoz, hogy itt leírjuk. Az itt megadott módszer nem a leggyorsabb, viszont a többivel összehasonlítva egyszerűbb. Olyan meghatározásokban alkalmazható, ahol egy vagy több vizsgálati készítményt hasonlítunk egy standardhoz. Ezen kívül a következő feltételeket kell kielégíteni: 1) A dózis logaritmusa és a válasz közti összefüggés a normál eloszlás eloszlásfüggvényével jellemezhető legyen. 2) A standardra és a vizsgálati készítményre kapott görbék párhuzamosak, azaz azonos alakúak legyenek és csak a vízszintes helyzetükben különbözzenek egymástól. 3) Elméletileg az extrém kis dózisoknál nincs természetes pozitív válasz, és az extrém nagy dózisoknál nincs természetes nem-válasz. 4.2. A PROBIT MÓDSZER

A szigmoid görbe lineárissá tehető, ha minden választ – azaz a jelenséget mutatók csoportonkénti arányát – helyettesítjük a standard normál eloszlás eloszlásfüggvényének megfelelő értékével. Ezt az értéket gyakran nevezzük „normit”-nak, értéke -től -ig változhat. Régebbi javaslat szerint minden normithoz 5-öt adva kapjuk meg az ú.n. „probit”-ot. Ez a módosítás a negatív értékek elkerülése miatt megkönnyítette a manuális számítást. A számítógépek megjelenésével már nincs szükség az 5 hozzáadására. Ezért a „normit módszer” elnevezés megfelelőbb lenne az alább leírt módszerre, mivel azonban a „probit módszer” elnevezés széles körben elterjedt, a kifejezést történelmi okok miatt megtartjuk ebben a szövegben. A válaszok linearizálása után lehetővé válik a párhuzamos egyenesek módszerének alkalmazása a 3.2. részben leírtak szerint. Sajnos azonban a varianciák összes dózisra vonatkozó homogenitásának érvényességi feltétele nem teljesül. A variancia normit = 0 értéknél minimumot mutat, és a normit pozitív vagy negatív értékeinél egyaránt növekszik. Ezért a görbe középső részét nagyobb súllyal vesszük figyelembe, mint a széli részeket. A továbbiakban a módszert, a varianciaanalízist, és a hatóérték és a megbízhatósági intervallum számítását mutatjuk be. 4.2.1. AZ EREDMÉNYEK TÁBLÁZATOS KEZELÉSE Az adatokat 4.2.1.-I. táblázat számokkal jelzett oszlopaiba írjuk be: (1) A standard vagy a vizsgált készítmény dózisa (2) A kezelésbe bevont egységek száma (n) (3) A pozitív választ adó egységek száma ( r ) (4) Az x dózis logaritmusa (5) Csoportonként a pozitív választ adók aránya (p = r / n) Innen kezdődik az első ciklus. (6) Az Y oszlopot az első iterációban nullával töltjük ki (7) A standard normál eloszlás eloszlásfüggvényének vonatkozó értéke [ táblázatot is)

] (lásd a 8.4.

A (8), (9) és (10) oszlopokat az alábbi képletek szerint számítjuk.

(8)

(4.2.1.-1.)

(9)

(4.2.1.-2.)

(10)

(4.2.1.-3.)

A (11)-től (15)-ig az oszlopok értékeit (sorrendben, mint x, y, x2, y2 és xy) könnyen kiszámíthatjuk a (4), (9) és (10) oszlopok értékei alapján, és (10)-től (15)-ig mindegyik oszlopban készítményenként külön, az összeg értékeket is kiszámítjuk. A 4.2.1.-I. táblázatban kiszámított összegeket a 4.2.1.-II. táblázat (1)-től (6)-ig oszlopaiba írjuk át, és a további 6 oszlopot (7-12) az alábbiak szerint számítjuk:

(7)

(4.2.1.-4.)

(8)

(4.2.1.-5.)

(9)

(4.2.1.-6.)

(10)

(4.2.1.-7.)

(11)

(4.2.1.-8.)

A közös b meredekség számítása:

(4.2.1.-9.) Az a tengelymetszet a standard – és hasonlóképpen a vizsgált készítmények – esetében a következőképpen nyerhető: (12)

(4.2.1.-10.)

Az első táblázat (6) oszlopába most már beírhatjuk az Y = a + bx értékét, majd a ciklust addig ismételjük, míg két ciklus közötti különbség kellően kicsi nem lesz (például két egymást követő ciklus Y értékei között a maximális különbség kisebb, mint 10-8).

4.2.1.-I. – Első munkatáblázat

S

T

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

dózis

n

r

x

p

Y

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

(7)

(8)

(9)

Z

y

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

x

y

x2

y2

xy

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

stb.

4.2.1.-II. – Második munkatáblázat (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

x

y

x2

y2

xy

Sxx

Sxy

Syy

(10)

(11)

(12) a

S

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

T

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

stb.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

4.2.2. AZ ÉRVÉNYESSÉG (VALIDITÁS) VIZSGÁLATA A hatóértékek és a megbízhatósági intervallumok kiszámítása előtt a meghatározás érvényességét kell megállapítani. Ha készítményenként legalább három dózis van, a linearitástól való eltérés a következőképpen mérhető: A 4.2.1.-II. táblázatot kiegészítjük egy 13. oszloppal, ennek értékeit az alábbiak szerint számítjuk:

(4.2.2.-1.) Az oszlop elemeinek összege a linearitástól való eltérést méri és közelítőleg eloszlású N – 2h számú szabadságfokkal. Ezen érték szignifikanciája a 8.3. táblázat segítségével vagy alkalmas algoritmust alkalmazó számítógépes programmal állapítható meg. Ha az érték 0,05 valószínűségi szinten szignifikáns, a meghatározást valószínűleg el kell vetni (lásd 4.2.4. részt). Ha a fenti vizsgálat nem jelzi a lineáris regressziótól való eltérés szignifikanciáját, megvizsgáljuk a párhuzamosságtól való eltérést 0,05 szignifikancia szinten:

(4.2.2.-2.) h – 1 számú szabadságfokkal. 4.2.3. A HATÓÉRTÉK ÉS A MEGBÍZHATÓSÁGI HATÁROK BECSLÉSE Ha sem a párhuzamosságtól, sem a linearitástól való eltérés nem szignifikáns, a hatóérték logaritmusát M/T az alábbiak szerint számítjuk:

(4.2.3.-1.) majd a kapott érték antilogaritmusát vesszük. Legyen t = 1,96 és s = 1. A megbízhatósági határokat a következő összefüggés antilogaritmusaként számítjuk ki:

(4.2.3.-2.)

ahol

és

4.2.4. ÉRVÉNYTELEN MEGHATÁROZÁSOK Ha a 4.2.2. részben leírt linearitástól való eltérés szignifikáns, a meghatározást általában el kell vetni. Ha van ok a meghatározás megtartására, a képleteket kissé meg kell változtatnunk. A t helyére a p = 0,05-ös valószínűség és a linearitás ellenőrzésekor alkalmazott szabadságfokkal megegyező szabadságfokhoz tartozó t-értéket, s2 helyére pedig a hányadosát írjuk (mely általában 1-nél nagyobb).

érték és a megegyező szabadságfok

A párhuzamosságtól való eltérés vizsgálata is módosul kissé. A párhuzamosságtól való eltérés értékét elosztjuk a hozzá tartozó szabadságfokkal. A kapott értéket a fent kiszámított s2-tel osztva kapjuk meg az F-arányt h – 1 és N – 2h szabadságfokokkal, melyet 0,05 szignifikancia szinten a szokásos módon értékelünk. 4.3. A LOGIT MÓDSZER Mint ahogy azt a 4.1. részben is említettük, néha a logit módszer használata a megfelelőbb. A módszer neve a logit-függvényből származik, mely a logisztikus eloszlás inverze. Az eljárás hasonló ahhoz, melyet a probit módszer esetén leírtunk, az alábbi módosításokkal:

(4.3.-1.) (4.3.-2.) 4.4. ELTÉRŐ ALAKÚ GÖRBÉK A probit és a logit módszer többnyire mindig megfelelő az Európai Gyógyszerkönyvben előírt, „minden vagy semmi” típusú (kvantális) válaszokon alapuló vizsgálatok analízisére. Az olyan esetekben, mikor egyértelmű, hogy az ln(dózis)-válasz görbe alakja eltér a fent leírt két görbétől, egy más típusú görbe is alkalmazható. Ekkor Z a görbe első deriváltja. Például: Ha bizonyított, hogy a görbe nem szimmetrikus, a Gompertz eloszlás lehet a megfelelő (gompit módszer), mely esetben

és

.

4.5. A KÖZEPES HATÉKONY DÓZIS (MEDIÁN EFFEKTÍV DÓZIS, ED50) A meghatározások néhány típusánál szükség van a közepes hatékony dózis (ED50) meghatározására. Ez az a dózis, mely az egységek 50 %-nál vált ki választ. A probit módszer felhasználható a medián effektív dózis (ED50) meghatározására, mivel azonban a dózis standardra vonatkoztatott kifejezésére nincs szükség, a képletek kissé különböznek. Megjegyzés: A vizsgálatba tetszés szerint standard is bevonható a meghatározás validálása érdekében. A meghatározást általában akkor tekintjük érvényesnek, ha a standardra számított ED50 elegendően közel van a hozzárendelt ED50 értékhez. Az, hogy az „elegendően közel” kifejezés mit jelent, a cikkelyben előírt követelményektől függ. A vizsgált minták, és az esetlegesen alkalmazott standard válaszainak táblázatos kezelése a 4.2.1. részben leírtak szerint történik. A linearitás vizsgálatát a 4.2.2. részben tárgyaltak szerint végezzük. Az ilyen típusú meghatározásoknál a párhuzamosság vizsgálatára nincs szükség. A T vizsgálati minta ED50-értékét – és hasonlóan a többi vizsgált mintáét is – a 4.2.3. részben leírtak szerint nyerjük, ha a 4.2.3.-1. és a 4.2.3.-2. képleteket az alábbiak szerint módosítjuk.

(4.5.-1.) (4.5.-2.)

ahol

és C változatlan marad.

5. PÉLDÁK Ez a rész a képletek alkalmazását illusztráló kidolgozott példákat tartalmazza. E példákat elsősorban a statisztikai számítási módszerek bemutatására választottuk. Azokban az esetekben, amikor a cikkely több lehetőséget is megenged, nem a legalkalmasabb módszerek bemutatása volt a célunk. A programok ellenőrzésének megkönnyítésére, a példákban az általában szükségesnél több tizedesjegyet adtunk meg. Azt is meg kell jegyeznünk, hogy léteznek más, ugyanakkor ekvivalens számítások is. Ezeknek a módszereknek pontosan ugyanahhoz az eredményhez kell vezetniük, mint a példákban megadottaknak. 5.1. A PÁRHUZAMOS EGYENESEK MÓDSZERE 5.1.1. KÉTDÓZISOS TÖBBSZÖRÖS MEGHATÁROZÁS TELJESEN RANDOMIZÁLT ELRENDEZÉS ESETÉN Kortikotropin értékmeghatározása patkányokba történő szubkután injekcióval A standard készítményt 0,25 és 1,0 egység/100g testtömeg dózisban alkalmaztuk. Mindkét vizsgált készítmény feltételezett hatóértéke 1 egység/mg volt, és a standarddal megegyező mennyiségben kerültek alkalmazásra. Az 5.1.1.-I. táblázatban az egyedi válaszokat adjuk meg. A grafikus ábrázolás (5.1.1.-I. ábra) nem hagy kétséget a variancia homogenitásáról és az adatok normál eloszlásáról, ugyanakkor a párhuzamosság feltétele az U készítmény esetében nem teljesül.

5.1.1.-I. táblázat – A biológiai válasz (y) – aszkorbinsav mennyiség(mg)/100 g mellékvese T készítmény

S standard

U készítmény

S1

S2

T1

T2

U1

U2

300

289

310

230

250

236

310

221

290

210

268

213

330

267

360

280

273

283

290

236

341

261

240

269

364

250

321

241

307

251

328

231

370

290

270

294

390

229

303

223

317

223

360

269

334

254

312

250

342

233

295

216

320

216

átlag

306

259

315

235

265

265

332,0

248,4

323,9

244,0

282,2

250,0

5.1.1.-I. ábra A 3.2.3.-I. és 3.2.3.-II. táblázat képletei alapján: PS = 580,4 LS = -41,8 PT = 567,9 LT = -39,95 PU = 532,2 LU = -16,1 HP =

=5

HL =

= 20

A varianciaanalízist a 3.2.3.-III. és a 3.2.3.-IV. táblázat képleteivel végezhetjük el, az eredményeket az 5.1.1.-II. táblázatban mutatjuk be. 5.1.1.-II. táblázat – Varianciaanalízis Varianciaforrás

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

Készítmények

2

6256,6

3128,3

Lineáris regresszió

1

63830,8

Párhuzamosságtól való eltérés

2

8218,2

Kezelések

5

78305,7

Maradék hiba

54

41340,9

Teljes

59

119646,6

F-arány

Valószínűség

63830,8

83,38

0,000

4109,1

5,37

0,007

765,57

Az analízis az erősen szignifikáns lineáris regressziót erősítette meg. A párhuzamosságtól való eltérés szintén szignifikáns (p = 0,0075). Ez a grafikus ábrázolás alapján is várható volt, hiszen az U készítmény egyenese nem párhuzamos a standardéval. Ezért ezt a készítményt elutasítva, az analízist csak a T készítményt és a standardot figyelembe véve ismételjük meg.

5.1.1.-III. táblázat – Varianciaanalízis az U készítmény nélkül Varianciaforrás

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

Készítmények

1

390,6

390,6

Lineáris regresszió

1

66830,6

Parhuzamosságtól való eltérés

1

34,2

Kezelések

3

67255,5

Maradék hiba

36

26587,3

Teljes

39

93842,8

F-arány

Valószínűség

66830,6

90,5

0,000

34,2

0,05

0,831

738,54

Az U készítmény nélkül végzett varianciaanalízis mind a regresszióra, mind a párhuzamosságra vonatkozó követelményeknek eleget tesz, így a hatóérték számítható. A 3.2.5. rész képletei alapján,

a közös meredekség: a hatóérték-arány logaritmusa:

a megbízhatósági határértékek logaritmusa: Az értékek antilogaritmusait véve a hatóérték-arányt 1,11-nek találtuk; 95 %-os megbízhatósággal 0,82 és 1,51 között. A hatóérték-arányt megszorozva a T készítmény feltételezett hatóértékével a hatóérték 1,11 egység/mg-nak adódik; a 95 %-os megbízhatósági határok 0,82 és 1,51 egység/mg. 5.1.2. HÁROMDÓZISOS LATIN-NÉGYZETES ELRENDEZÉS Antibiotikum négyszögletes lemezen végzett agar diffúziós meghatározása A standard hozzárendelt hatóértéke 4855 NE/mg, a vizsgált készítmény feltételezett hatóértéke 5600 NE/mg volt. Az alapoldathoz 25,2 mg standardot 24,5 ml oldószerben, illetve 21,4 mg vizsgálati készítményt 23,95 ml oldószerben oldottuk. A végső oldatok készítéséhez először mindkét oldatot 1/20 arányban hígítjuk, majd a továbbiakban 1,5-es hígítási arányt használunk. A Latin-négyzetet a 8.6. részben leírt módszerrel generáljuk (lásd 5.1.2.-I. táblázat). A meghatározásban kapott válaszokat az 5.1.2.-II. táblázat mutatja (inhibíciós zóna mérete mm-ben, szorozva 10-zel). Az egyes kezelésekre kapott válaszok átlag értékeit az 5.1.2.-III. táblázat tartalmazza. Az adatok grafikus ábrázolása (5.1.2.-I. ábra) alapján biztosak lehetünk a normalitásban és a variancia homogenitásában.

5.1.2.-I. táblázat – A kezelések elosztása a lemezen 1

2

3

4

5

6

1

S1

T1

T2

S3

S2

T3

2

T1

T3

S1

S2

T2

S3

3

T2

S3

S2

S1

T3

T1

4

S3

S2

T3

T1

S1

T2

5

S2

T2

S3

T3

T1

S1

6

T3

S1

T1

T2

S3

S2

5.1.2.-II. táblázat – A mért inhibíciós zónák méretének tízszerese (mm-ben) 1

2

3

4

5

6

Átlag

(Sor)

1

161

160

178

187

171

194

175,2

= R1

2

151

192

150

172

170

192

171,2

= R2

3

162

195

174

161

193

151

172,7

= R3

4

194

184

199

160

163

171

178,5

= R4

5

176

181

201

202

154

151

177,5

= R5

6

193

166

161

186

198

182

181,0

= R6

Átlag

172,8

179,7

177,2

178,0

174,8

173,5

(Oszlop)

= C1

= C2

= C3

= C4

= C5

= C6

5.1.2.-III. táblázat A kezelések átlaga T készítmény

S standard S1 Átlag

158,67

S2 176,50

S3 194,50

T1 156,17

T2 174,67

T3 195,50

5.1.2.-I. ábra A 3.2.3.-I. és 3.2.3.-II. táblázat képletei alapján:

PS = 529,667 PT = 526,333

LS = 35,833 LT = 39,333

HP =

HL =

=2

=3

A varianciaanalízis a 3.2.3.-III. és a 3.2.3.-IV. táblázat képletei segítségével végezhető el. Az eredményeket az 5.1.2.-IV. táblázatban mutatjuk be. 5.1.2.-IV. táblázat – Varianciaanalízis Varianciaforrás

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

Készítmények

1

11,1111

11,1111

Lineáris regresszió

1

8475,0417

Párhuzamosságtól való eltérés

1

Linearitástól való eltérés

F-arány

Valószínűség

8475,0417

408,1

0,000

18,3750

18,3750

0,885

0,358

2

5,4722

2,7361

0,132

0,877

Kezelések

5

8510

Sorok

5

412

82,40

3,968

0,012

Oszlopok

5

218,6667

43,73

2,106

0,107

Maradék hiba

20

415,3333

20,7667

Teljes

35

9556

Az analízis a sorok között szignifikáns különbséget mutat. Ez jelzi, hogy a Latin-négyzetes elrendezés alkalmazásával nagyobb pontosság érhető el, mintha teljesen randomizált elrendezést használtunk volna. A lineáris regresszió erős szignifikanciája és az egyedi regressziós egyenesek párhuzamosságtól és linearitástól való eltéréseinek nem szignifikáns volta megerősíti, hogy a meghatározás megfelelő a hatóérték számításához.

A 3.2.5. rész képletei alapján: a közös meredekség:

a hatóérték-arány logaritmusa:

a megbízhatósági határok logaritmusa:

Az értékek antilogaritmusait véve a hatóérték-arányt 0,9763-nak találtuk; a 95 %-os megbízhatósági határok 0,9112 és 1,0456. Mivel a feltételezett hatóérték alapján számított hígítások nem voltak teljesen azonos hatáserősségűek, korrekciós faktor alkalmazására van szükség:

A korrekciós faktorral és a készítmény feltételezett hatóértékével (5600 NE/mg) történő szorzás után a hatóérték 5456 NE/mg; a 95%-os megbízhatósági határok 5092 – 5843 NE/mg. 5.1.3. NÉGYDÓZISOS RANDOMIZÁLT BLOKK ELRENDEZÉS Antibiotikum turbidimetriás meghatározása E meghatározás arra szolgál, hogy meghatározzuk a készítmény nemzetközi egységekben kifejezett hatóértékét injekciós üvegenként. A standard hozzárendelt hatóértéke 670 NE/mg. A vizsgálati készítmény feltételezett hatóértéke 20000 NE/injekciós üveg. Az információk alapján az alapoldatokat készítése a következő: 16,7 mg standardot 25 ml oldószerben, és a készítmény egy üvegének tartalmát 40 ml oldószerben oldjuk. A végső oldatok készítéséhez ezeket először 1/40 arányban majd azután 1,5es hígítási arányt alkalmazva hígítjuk. A kémcsöveket randomizált blokk elrendezésben helyezzük a vízfürdőre (lásd 8.5. rész). A válaszokat az 5.1.3.-I. táblázatban foglaltuk össze. 5.1.3.-I. táblázat – A szuszpenziók abszorbanciájának 1000-szerese T készítmény

S standard Blokk

S1

S2

S3

S4

T1

T2

T3

T4

Átlag

1

252

207

168

113

242

206

146

115

181,1

2

149

201

187

107

236

197

153

102

179,0

3

247

193

162

111

246

197

148

104

176,0

4

250

207

155

108

231

191

159

106

175,0

5

235

207

140

98

232

186

146

95

167,4

Átlag

246,6

203,0

162,4

107,4

237,4

195,4

150,4

104,4

5.1.3.-I. ábra Megvizsgálva az 5.1.3.-I. ábrát, a normalitás és a variancia homogenitása kétséget kizáróan fennáll. Az S3 szórása kissé nagy, de nem ad aggodalomra okot. A 3.2.3.-I. és 3.2.3.-II. táblázat képletei alapján:

PS = 719,4 PT = 687,6

LS = -229,1 LT = -222

HP =

HL =

= 1,25

=1

A varianciaanalízist a 3.2.3.-III. és a 3.2.3.-IV. táblázat képletei alapján hajtottuk végre, az eredmények az 5.1.3.-II. táblázatban láthatók. 5.1.3.-II. táblázat – Varianciaanalízis Varianciaforrás

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

Készítmények

1

632,025

632,025

Lineáris regresszió

1

101745,6

Párhuzamosságtól való eltérés

1

Linearitástól való eltérés

F-arány

Valószínűség

101745,6

1887,1

0,000

25,205

25,205

0,467

0,500

4

259,14

64,785

1,202

0,332

Kezelések

7

102662

Blokkok

4

876,75

219,188

4,065

0,010

Maradék hiba

28

1509,65

53,916

Teljes

39

105048,4

Az analízis szignifikáns különbséget mutat a blokkok között. Ez jelzi, hogy a randomizált blokk elrendezés használatával nagyobb pontosságot érünk el. A lineáris regresszió erős szignifikanciája és

az egyedi regressziós egyenesek nem szignifikáns eltérése a párhuzamosságtól és a linearitástól megerősíti, hogy a meghatározás a hatóérték számításához megfelelő. A 3.2.5. rész képletei alapján a közös meredekség:

a hatóérték-arány logaritmusa:

a megbízhatósági határok logaritmusa: Az értékek antilogaritmusát véve a hatóérték-arányt 1,0741-nek találtuk; a 95 %-os megbízhatósági határok 1,0291 és 1,1214. Mivel a feltételezett hatóérték alapján számított hígítások nem voltak teljesen azonos hatáserősségűek, korrekciós faktorra van szükség.

A korrekciós faktorral és a készítmény feltételezett hatóértékével (20000 NE/üveg) történő szorzás után a hatóérték 19228 NE/üveg; a 95 %-os megbízhatósági határok 18423 és 20075 NE/üveg. 5.1.4. ÖTDÓZISOS TÖBBSZÖRÖS ELRENDEZÉS ESETÉN

MEGHATÁROZÁS

TELJESEN

RANDOMIZÁLT

Három hepatitisz B vakcina in vitro meghatározása standard alkalmazásával. Mindegyik vakcinából három-három független, 5 tagból álló hígítási sorozatot készítettünk felező hígítással. A meghatározási eljárás néhány további lépése után az abszorbanciákat mértük, és az eredményeket az 5.1.4.-I. táblázat foglalja össze. 5.1.4.-I. táblázat – Optikai sűrűségek (Abszorbanciák) Hígítás

T készítmény

S standard

U készítmény

V készítmény

1:16000

0,043

0,045

0,051

0,097

0,097

0,094

0,086

0,071

0,073

0,082

0,082

0,086

1:8000

0,093

0,099

0,082

0,167

0,157

0,178

0,127

0,146

0,133

0,145

0,144

0,173

1:4000

0,159

0,154

0,166

0,327

0,355

0,345

0,277

0,268

0,269

0,318

0,306

0,316

1:2000

0,283

0,295

0,362

0,501

0,665

0,576

0,586

0,489

0,546

0,552

0,551

0,624

1:1000

0,514

0,531

0,545

1,140

1,386

1,051

0,957

0,866

1,045

1,037

1,039

1,068

Ismert, hogy az optikai sűrűség logaritmusa lineáris összefüggésben van a dózisok logaritmusával. A logaritmikusan transzformált optikai sűrűségek átlagait (a válaszokat) az 5.1.4.-II. táblázatban tüntettük fel. Az adatok grafikus ábrázolásakor (5.1.4.-I. ábra) rendellenes viselkedést nem fedeztünk fel.

5.1.4.-II. táblázat – A logaritmikusan transzformált abszorbanciák átlagai S1

-3,075

T1

-2,344

U1

-2,572

V1

-2,485

S2

-2,396

T2

-1,789

U2

-2,002

V2

-1,874

S3

-1,835

T3

-1,073

U3

-1,305

V3

-1,161

S4

-1,166

T4

-0,550

U4

-0,618

V4

-0,554

S5

-0,635

T5

0,1691

U5

-0,048

V5

0,047

5.1.4.-I. ábra A 3.2.3.-I. és 3.2.3.-II. táblázat képletei alapján:

PS = -9,108 PT = -5,586 PU = -6,544 PV = -6,027

LS = 6,109 LT = 6,264 LU = 6,431 LV = 6,384

HP =

HL =

= 0,6

= 0,3

A varianciaanalízis a 3.2.3.-III. és a 3.2.3.-IV. táblázat képletei segítségével végezhető el, az eredményeket az 5.1.4.-III. táblázatban mutatjuk be. 5.1.4.-III. táblázat – Varianciaanalízis Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

Készítmények

3

4,475

1,492

Lineáris regresszió

1

47,58

Páehuzamosságtól való eltérés

3

Linearitástól való eltérés Kezelések

Varianciaforrás

F-arány

Valószínűség

47,58

7126

0,000

0,0187

0,006

0,933

0,434

12

0,0742

0,006

0,926

0,531

19

52,152

Maradék hiba

40

0,267

Teljes

59

52,42

0,0067

A lineáris regresszió nagy szignifikanciája és az egyedi regressziós egyenesek nem szignifikáns eltérése a párhuzamosságtól és a linearitástól megerősíti, hogy a meghatározás megfelelő a hatóérték számításához. A 3.2.5. rész képletei alapján

a közös meredekség:

a hatóérték-arány logaritmusa a T készítmény esetében:

a megbízhatósági határok logaritmusa a T készítmény esetében:

Az értékek antilogaritmusát véve a hatóérték-arányt 2,171-nek találtuk, 2,027 – 2,327 közötti 95 %-os megbízhatósági határokkal. Mindegyik minta feltételezett hatóértéke 20 µg fehérje/ml, így a T készítményre 43,4 µg fehérje/ml adódott; a 95 %-os megbízhatósági határok 40,5 és 46.5 µg fehérje/ml. Hasonló eljárással a többi készítmény hatóértéke és megbízhatósági intervalluma is becsülhető. Az eredményeket az 5.1.4.-IV. táblázat mutatja. 5.1.4.-IV. táblázat – A végső becsült hatóértékek és a 95 %-os konfidencia határok a vizsgált vakcinák esetében (µg fehérje/ml-ben)

Alsó határ

Becsült hatóérték

Felső határ

T vakcína

40,5

43,4

46,5

U vakcína

32,9

35,2

37,6

V vakcína

36,8

39,4

42,2

5.1.5. IKERKERESZTEZETT ELRENDEZÉS Inzulin meghatározása nyulakba történő szubkután injektálással A standard készítményt 1 és 2 egység/ml dózisban alkalmaztuk. Az ismeretlen készítményt ekvivalens mennyiségben használtuk, melyet 40 egység/ml-es feltételezett hatóértéke alapján számítottunk ki. A nyulak a megfelelő oldatból 0,5 ml-t kaptak szubkután az 5.1.5.-I. táblázat szerint. A kapott válaszokat az 5.1.5.-II. táblázat mutatja. A nagy variancia értékek nagy nyulak közti különbségeket mutatnak és

jelzik a keresztezett elrendezés alkalmazásának szükségességét. 5.1.5.-I. táblázat – A kezelések elrendezése Nyúlcsoportok

1

2

3

4

1. nap

S1

S2

T1

T2

2. nap

T2

T1

S2

S1

5.1.5.-II. táblázat – y válasz: az 1 és 2,5 óra elteltével mért vérglükózszintek összege mg/100 ml-ben kifejezve 1. csoport

Átlag

2. csoport S2

3. csoport

S1

T2

T1

T1

112

104

65

72

105

126

112

116

160

62

58

73

86

63

52

4. csoport S2

T2

S1

91

118

144

83

67

119

149

72

125

67

42

51

47

93

56

45

64

107

53

88

113

92

84

93

117

110

113

63

71

101

56

73

128

116

91

50

65

66

55

39

87

101

68

55

100

91

68

31

71

95,6

82,8

69,6

93,3

89,9

66,6

72,4

106,8

5.1.5.-I. ábra E meghatározás esetén a varianciaanalízis sokkal bonyolultabb, mint a többi elrendezés esetében, mivel a párhuzamosságtól való eltérésből eredő négyzetösszeg komponens nem független a nyulak közti különbségből adódó komponenstől. A regressziós egyenesek párhuzamosságának vizsgálatába egy második átlagos négyzetösszeget is be kell vonnunk, melyet úgy kapunk meg, hogy a nyulak különbségéből adódó komponensből kivonjuk a párhuzamosságtól való eltérés komponenst és két ún. „kölcsönhatás” komponenst. A csoportonkénti ismétlések miatt három kölcsönhatás komponens van jelen a varaianciaanalízisben: napok készítmény; napok regresszió; napok párhuzamosság. E kifejezések az egyes komponensek (készítmények, regresszió és párhuzamosság) napok közti változékonyságát jelzik. A megfelelő F-arányokkal a meghatározás e szempontok szerinti érvényessége ellenőrizhető. Ha a kapott F értékek szignifikánsan magasak, vigyázni kell a meghatározás adatainak értékelésekor, és ha lehetséges, a meghatározást meg kell ismételni. A varianciaanalízist a 3.2.3.-1. – 3.2.3.-3. táblázatok alapján végezzük el külön mindkét napra és az összesített adatokra. A 3.2.3.-1. és a 3.2.3.-2. táblázatok képletei alapján: 1. nap:

2. nap:

Összesített:

PS = 165,25

LS = -13

PT = 162,25

LT = -8,75

HP =

HL =

=4

= 16

PS = 173,38

LS = -20,06

PT = 176,00

LT = -5,25

HP =

HL =

=4

= 16

PS = 169,31

LS = -16,53

PT = 169,13

LT = -7,00

HP =

HL =

=8

= 32

A 3.2.3.-3. táblázat adatai alapján: 1. nap

Összesített

2. nap SSprep = 18,000

SSprep = 13,781

SSprep = 0,141

SSreg = 3784,5

SSreg = 5125,8

SSreg = 8859,5

SSpar = 144,5

SSpar = 1755,3

SSpar = 1453,5

A kölcsönhatásokat úgy kapjuk meg, hogy az 1. és a 2. napra kapott négyzetösszegek összegéből kivonjuk az összesítésben kapott négyzetösszeget (1. nap + 2. nap – Összesített): SSnapok

prep

= 31,64

SSnapok

reg

= 50,77

SSnapok

par

= 446,27

Ezen kívül kiszámítjuk a napok közti változás négyzetösszegét:

és a blokkok szerinti (a nyulak közti különbségekből fakadó) négyzetösszeget is:

ahol Bi nyulanként a válaszok átlaga. Ezután az 5.1.5.-III. táblázat szerint elvégezhető a varianciaanalízis. 5.1.5.-III. táblázat – Varianciaanalízis

Varianciaforrá s

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

F-arány

Valószínűség

Párhuzamosságtól való eltérés

1

1453,5

1453,5

1,064

0,311

Napok készítmény

1

31,6

31,6

0,023

0,880

Napok regr.

1

50,8

50,8

0,037

0,849

Maradék hiba (nyulak közötti)

28

38258,8

1366,4

Nyulak

31

39794,7

1283,7

Készítmények

1

0,14

0,14

0,001

0,975

Lineáris regresszió

1

8859,5

8859,5

64,532

0,000

Napok

1

478,5

478,5

3,485

0,072

Napok párhuzamosságtól való eltérés

1

446,3

446,3

3,251

0,082

Maradék hiba (nyulakon belüli)

28

3844,1

137,3

Teljes

63

53423,2

A varianciaanalízis megerősítette, hogy az adatok a kielégítő meghatározáshoz szükséges követelményeket teljesítik, a lineáris regresszió szignifikanciája nagy, a párhuzamosságtól való eltérés és a három kölcsönhatás-komponens nem szignifikáns. A 3.2.5. rész képletei alapján a közös meredekség:

a hatóérték-arány logaritmusa:

a megbízhatósági határok logaritmusa:

Az értékek antilogaritmusait véve a hatóérték-arányt 1,003-nek találtuk, 0,835 – 1,204 közötti 95 %-os megbízhatósági határokkal. Az AT = 40-nel történő szorzás után a hatóérték 40,1 egység/ml; a 95 %-os megbízhatósági határok 33,4 és 48,2 egység/ml. 5.2. IRÁNYTANGENS-HÁNYADOS MÓDSZER 5.2.1. TELJESEN RANDOMIZÁLT (0,3,3) TÍPUSÚ ELRENDEZÉS A VIII faktor meghatározása Egy laboratórium koncentrátumok VIII. faktor aktivitásának színképzésen alapuló meghatározását végezte el. A laboratóriumnak nem volt tapasztalata az ilyen típusú meghatározások terén, ennek ellenére megpróbálták bevezetni az eljárást. Mind a standard mind a vizsgálati készítményből 3 – 3 ekvivalens hígítás készült. Ezen kívül egy kontrollt („vak” mintát) is készítettek, annak ellenére, hogy kis dózisoknál nem várható lineáris dózis-hatás összefüggés. Minden hígításból nyolc párhuzamos mérést végeztek, ami több, mint amennyi egy rutin módszerhez szükséges (5.2.1.-I. táblázat). 5.2.1.-I. táblázat – Abszorbanciák

Konc.

Átlag

T készítmény (NE/ml)

Vak

S standard (NE/ml)

B

S1

S2

S3

T1

T2

T3

0,01

0,02

0,03

0,01

0,02

0,03

0,022

0,133

0,215

0,299

0,120

0,188

0,254

0,024

0,133

0,215

0,299

0,119

0,188

0,253

0,024

0,131

0,216

0,299

0,118

0,190

0,255

0,026

0,136

0,218

0,297

0,120

0,190

0,258

0,023

0,137

0,220

0,297

0,120

0,190

0,257

0,022

0,136

0,220

0,305

0,121

0,191

0,257

0,022

0,138

0,219

0,299

0,121

0,191

0,255

0,023

0,137

0,218

0,302

0,121

0,190

0,254

0,0235

0,1351

0,2176

0,2996

0,1200

0,1898

0,2554

5.2.1.-I. ábra Az adatok grafikus ábrázolása (5.2.1.-I. ábra) világosan mutatja, hogy a dózis-válasz összefüggés kis dózisoknál nem lineáris. Emiatt a kontrollokra („vak” mintákra) kapott válaszokat nem használjuk a számításokban (természetesen e döntés igazolására további vizsgálatokra van szükség). A 3.3.3.1.-I. és a 3.3.3.1.-II. táblázatok képletei alapján: PS = 0,6524

PT = 0,5651

LS = 1,4693

LT = 1,2656

aS = 0,318

aT = 0,318

bS = 0,329

bT = 0,271

GS = 0,1554

GT = 0,1156

JS = 4,1710-8

JT = 1,8410-6

És Hl = 0,09524

a / = 0,05298

K = 1,9764

A varianciaanalízis a 3.3.3.1.-III. és a 3.3.3.1.-IV. táblázatok képleteivel végezhető el (5.2.1.-II. táblázat). 5.2.1.-II. táblázat – Varianciaanalízis

Varianciaforrá s

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

F-arány

Valószínűség

Lineáris regresszió

2

0,1917

0,0958

24850

0,000

Tengelymetszet

1

3 10-9

3 10-9

7 10-4

0,978

Linearitástól való eltérés

2

2 10-5

1 10-5

2,984

0,061

Kezelések

5

0,1917

Maradék hiba

42

1,62 10-4

Teljes

47

0,1919

3,86 10-6

A lineáris regresszió erős szignifikanciája, a linearitástól való eltérés és a tengelymetszetek különbözőségének nem szignifikáns volta jelzi a hatóérték számíthatóságát. a standard készítményre kapott egyenes meredeksége:

a vizsgált készítményre kapott egyenes meredeksége:

a 3.3.5.1.-3 képlet alapján:

a 95 %-os megbízhatósági határok:

Ezek alapján a hatóérték-arányt 0,823-nak találtuk; a 95 %-os megbízhatósági határok 0,817 és 0,829. 5.2.2. TELJESEN RANDOMIZÁLT (0,4,4,4) TÍPUSÚ ELRENDEZÉS Influenza vakcina in vitro meghatározása Két influenza vakcina hemagglutinin antigén (HA) tartalmát egyetlen radiális immundiffúziós vizsgálatban határoztuk meg. Mindegyik készítmény jelzett hatóértéke 15 µg HA/dózis volt, ami 30 µg HA/ml-rel egyenértékű. A standard hozzárendelt hatóértéke 39 µg HA/ml volt. A standard és a vizsgálati vakcinák négy-négy koncentrációját két párhuzamosban vizsgáltuk. A koncentrációkat a hozzárendelt és a jelzett hatóértékek alapján számítottuk ki. A külső és a belső reaktáns közti egyensúly beállása után a körkörös precipitációs zónák területét mértük. Az eredményeket az 5.2.2.-I. táblázat mutatja. 5.2.2.-I. táblázat – A precipitációs zónák területei (mm2) T készítmény

U készítmény

II

I

II

I

II

18,0

18,0

15,1

16,8

15,4

15,7

15,0

22,8

24,5

23,1

24,2

20,2

18,6

22,5

30,4

30,4

28,9

27,4

24,2

23,1

30,0

35,7

36,6

34,4

37,8

27,4

27,0

Konc.

S standard

(µg/ml)

I

7,5

5.2.2.-I. ábra Az adatok a grafikus ábrázolás alapján (5.2.2.-I. ábra) nem mutatnak rendellenes viselkedést. A 3.3.3.1.-1. és a 3.3.3.1.-2. táblázatok képletei alapján: PS = 108,2

PT = 103,85

PU = 85,8

LS = 301,1

LT = 292,1

LU = 234,1

aS = 141,0

aT = 116,7

aU = 139,8

bS = 61,2

bT = 64,95

bU = 39,2

GS = 3114,3

GT = 2909,4

GU = 1017,3

JS = 0,223

JT = 2,227

JU = 0,083

és Hl = 0,0093

a / = 11,04

K = 14785,8

A varianciaanalízis, melyet az 5.2.1.-II. táblázatban mutatunk be, a 3.3.3.1.-III. és a 3.3.3.1.-IV. táblázatok képleteivel végezhető el. 5.2.2.-II. táblázat – Varianciaanalízis

Varianciaforrá s

Szabadságfokok

Négyzetösszegek

Átlagos négyzetösszegek

F-arány

Valószínűség

Lineáris regresszió

3

1087,7

362,6

399,5

0,000

Tengelymetszet

2

3,474

1,737

1,626

0,237

Linearitástól való eltérés

6

5,066

0,844

0,791

0,594

Kezelések

11

1096,2

Maradék hiba

12

12,815

Teljes

23

1109,0

1,068

A lineáris regresszió erős szignifikanciája illetve a linearitástól való eltérés és a tengelymetszetek különbözőségének nem szignifikáns volta jelzi a hatóérték számíthatóságát.

a standardra kapott egyenes meredeksége:

a T készítményre kapott egyenes meredeksége:

az U készítményre kapott egyenes meredeksége:

Ezek alapján a hatóérték-arány a T vakcina esetében 6,056/6,356 = 0,953, az U vakcina esetében 4,123/6,356 = 0,649.

A megbízhatósági határok a 3.3.5.1.-4. képlet alapján a T vakcina esetében:

az U vakcina esetében:

A dózisonkénti HA tartalmat mikrogrammokban úgy kapjuk meg, hogy a hatóérték-arányokat és a megbízhatósági határokat a 15 µg/dózis feltételezett hatóértékkel megszorozzuk. Az eredményeket az 5.2.2.-III. táblázat mutatja. 5.2.2.-III. táblázat – A HA tartalom becsült értékei (g/dózis) Alsó határ

Becsült hatóérték

Felső határ

T vakcina

13,4

14,3

15,3

U vakcina

8,9

9,7

10,6

5.3. „MINDEN VAGY SEMMI” TÍPUSÚ (KVANTÁLIS) VÁLASZOK 5.3.1. VIZSGÁLATI KÉSZÍTMÉNY STANDARDDAL SZEMBEN VÉGZETT MEGHATÁROZÁSÁNAK PROBIT ANALÍZISE Diftéria vakcina in-vivo meghatározása Diftéria vakcinát (feltételezett hatóértéke 140 NE/üveg) határoztunk meg standarddal (hozzárendelt hatóértéke 132 NE/üveg) szemben. Az információk alapján készített ekvivalens dózisokat véletlenszerűen rendeltük a tengeri malac csoportokhoz. Adott idő eltelte után, az állatokat diftéria toxinnal felülfertőztük és feljegyeztük a túlélő állatok számát (lásd 5.3.1.-I. táblázat).

5.3.1.-I. táblázat – A tengeri malacokban végzett diftéria meghatározás nyers adatai S standard

Vizsgált készítmény (T)

Hozzárendelt hatóérték 132 NE/üveg

Feltételezett hatóérték 140 NE/üveg

dózis (NE/ml)

toxinnak kitett állatok száma

védettséget szerzettek száma

dózis (NE/ml)

toxinnak kitett állatok száma

védettséget szerzettek száma

1,0

12

0

1,0

11

0

1,6

12

3

1,6

12

4

2,5

12

6

2,5

11

8

4,0

11

10

4,0

11

10

A megfigyeléseket (lásd még 5.3.1.-I. ábra) az első munkatáblázatban foglaltuk össze, a további oszlopokat a 4.2.1. részben leírtak szerint számítottuk. Az 5.3.1.-II. táblázat az eljárás első ciklusát mutatja.

5.3.1.-I. ábra 5.3.1.-II. táblázat – Első munkatáblázat az első ciklusban Vakcina

S

T

dózis

n

r

x

p

Y

1,0

12

0

0,000

0,000

0

1,6

12

3

0,470

0,250

2,5

12

6

0,916

4,0

11

10

1,0

11

1,6

2,5

x

y

x2

y2

xy

7,64

0,00

-9,57

0,00

12,00

0,00

-0,627

7364

3,59

-4,79

1,69

3,00

-2,25

0,399

0,000

7,64

7,00

0,00

6,41

0,00

0,00

0,5

0,399

1,025

7,00

9,71

7,18

13,46

7,36

9,95

0

0,5

0,399

-1,253

7,00

0,00

-8,78

0,00

11,00

0,00

0,333

0

0,5

0,399

-0,418

7,64

3,59

-3,19

1,69

1,33

-1,50

0,727

0

0,5

0,399

0,570

7,00

6,42

3,99

5,88

2,27

3,66

Z

y

0,5

0,399

-1,253

0

0,5

0,399

0,500

0

0,5

1,386

0,909

0

0

0,000

0,000

12

4

0,470

11

8

0,916

4,0

11

10

1,386

0,909

0

0,5

0,399

1,025

7,00

9,71

7,18

13,46

7,36

9,95

Az utolsó hat oszlop készítményenkénti összegeit a második munkatáblázatba írtuk át (lásd 5.3.1.-III. táblázat). A további oszlopok adatait a 4.2.1.-4. – 4.2.1.-10. képletek segítségével számítottuk ki. A közös b meredekségre eredményül 1,655-t kaptunk. 5.3.1.-III. táblázat – Második munkatáblázat az első ciklusban Vakcina

x

y

x2

y2

xy

Sxx

Sxy

Syy

a

S

29,92

20,30

-7,18

21,56

22,36

7,70

7,79

12,58

20,64

0,68

-0,24

-1,36

T

28,65

19,72

-0,80

21,03

21,97

12,11

7,46

12,66

21,95

0,69

-0,03

-1,17

Ezek után az első munkatáblázat Y értékei az a + bx kifejezés értékére cserélhetők, és elvégezhető a második ciklus is (lásd 5.3.1.-IV. táblázat).

5.3.1.-IV. táblázat – Első munkatáblázat a második ciklusban Vakcina

S

T

dózis

n

r

x

p

Y

1,0

12

0

0,000

0,000

-1,36

1,6

12

3

0,470

0,250

2,5

12

6

0,916

4,0

11

10

1,0

11

1,6

x

y

x2

y2

xy

3,77

0,00

-7,21

0,00

13,79

0,00

-0,672

6,74

3,17

-4,53

1,49

3,04

-2,13

0,394

-0,001

7,57

6,94

-0,01

6,36

0,00

-0,01

0,824

0,258

1,260

5,07

7,03

6,39

9,75

8,05

8,86

-1,17

0,122

0,202

-1,769

4,20

0,00

-7,43

0,00

13,14

0,00

0,333

-0,39

0,349

0,370

-0,430

7,23

3,40

-3,11

1,60

1,34

-1,46

0,916

0,727

0,35

0,637

0,375

0,591

6,70

6,14

3,96

5,62

2,34

3,63

1,386

0,909

1,13

0,870

0,211

1,311

4,35

6,03

5,70

8,36

7,48

7,90

Z

y

0,086

0,158

-1,911

-0,58

0,279

0,336

0,500

0,15

0,561

1,386

0,909

0,93

0

0,000

0,000

12

4

0,470

2,5

11

8

4,0

11

10

A ciklust addig kell ismételni, míg két egymást követő ciklus közti különbség kellően kicsi nem lesz. A második munkatáblázatnak ekkor az 5.3.1.-V. táblázat adatait kell tartalmaznia.

5.3.1.-V. táblázat – Második munkatáblázat elegendő számú ciklus után Vakcina

x

y

x2

y2

xy

Sxx

Sxy

Syy

a

S

18,37

14,80

-2,14

14,85

17,81

5,28

2,93

7,00

17,56

0,81

-0,12

-2,05

T

17,96

12,64

-0,55

11,86

18,35

6,76

2,96

7,15

18,34

0,70

-0,03

-1,72

A 4.2.2. részben leírtak szerint ellenőriztük a linearitást. A értékére 0,851 + 1,070 = 1,921-et kaptunk, 4 szabadságfok esetén ez p = 0,750 -et jelent, azaz nem szignifikáns. Mivel a linearitástól való eltérés nem szignifikáns, az ugyanebben a részben leírtak szerint elvégezhetjük a párhuzamosság vizsgálatát.

A

értéke:

a szabadságfok 1, ami p = 0,974 -et jelent, azaz nem szignifikáns. A 4.2.3. részben leírtak szerint most már kiszámítható a hatóérték-arány logaritmusa.

majd

A megbízhatósági határok logaritmusa:

A hatóértéket és a megbízhatósági határokat kiszámíthatjuk, ha a kapott értékek antilogaritmusát vesszük, majd ezeket megszorozzuk a feltételezett hatóértékkel, azaz 140 NE/üveg értékkel. Az eredmény szerint a becsült hatóérték 160,6 NE/üveg; a 95 %-os konfidencia intevallum 121,0 – 215,2 NE/üveg. 5.3.2. VIZSGÁLT KÉSZÍTMÉNY STANDARDDAL SZEMBEN VÉGZETT MEGHATÁROZÁSÁNAK LOGIT ÉS MÁS TÍPUSÚ ANALÍZISE Az 5.3.1. részben bemutatott adatokra alkalmaztuk a logit, és más, ugyanehhez a típushoz tartozó „klasszikus”, módszereket is. Az eredményeket az 5.3.2.-I. táblázatban adjuk meg. E példákat ebben az esetben ne a probit módszer alternatíváiként, hanem inkább gyakorló példaként fogjuk fel. Más alakú görbe akkor fogadható el, ha ezt a kísérleti vagy elméleti bizonyítékok egyértelműen alátámasztják. 5.3.2.-I. táblázat – Alternatív görbék használatával kapott eredmények Logit

Gompit

Angle*

4,101

2,590

1,717

2,15

3,56

1,50

0,0066

0,168

0,0010

Hatóérték

162,9

158,3

155,8

Alsó határ

121,1

118,7

122,6

Z b meredekség

lin.

par.

221,1

Felső határ

5.3.3. EGY ANYAG ALKALMAZÁSÁVAL

ED50

213,3

ÉRTÉKÉNEK

200,7

MEGHATÁROZÁSA

PROBIT

MÓDSZER

Orális poliomielitisz vakcina in-vitro meghatározása Az orális poliomielitisz vakcina ED50 értékének meghatározásakor a vakcina 10 különböző hígításának 50 µl-ét 8 – 8 párhuzamosban Elisa lemezen vizsgáltuk, melynek során az 5.3.3.-I. táblázatban összefoglalt eredményeket kaptuk. 5.3.3.-I. táblázat – Hígítások (10x µl a hígítatlan vakcinából) -3,5

-4,0

-4,5

-5,0

-5,5

-6,0

-6,5

-7,0

-7,5

-8,0

+

+

+

+

–

–

–

–

–

–

+

+

+

+

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

–

–

–

–

–

+

+

+

+

–

–

–

–

–

–

+

+

+

–

–

–

–

–

–

–

+

+

+

+

+

–

–

–

–

–

+

+

+

+

+

–

+

–

–

–

+

+

+

+

–

+

–

–

–

–

A megfigyeléseket (lásd még 5.3.3.-I. ábra) az első munkatáblázatba írtuk, és a további oszlopokat a 4.2.1. részben leírtak szerint számítottuk. Az 5.3.1.-II. táblázat az eljárás első ciklusát mutatja.

5.3.3.-I. ábra

5.3.3.-II. táblázat – Első munkatáblázat az első ciklusban Vakcina

T

dózis

n

r

x

p

Y

10-3,5

8

0

-8,06

0,000

0,00

10-4,0

8

0

-9,21

0,000

10-4,5

8

1

-10,36

10-5,0

8

2

10-5,5

8

10-6,0

x

y

x2

y2

xy

5,09

-41,04

-6,38

330,8

8,00

51,4

-1,253

5,09

-46,91

-6,38

432,0

8,00

58,8

0,399

-0,940

5,09

-52,77

-4,79

546,8

4,50

49,6

0,5

0,399

-0,627

5,09

-58,63

-3,19

675,1

2,00

36,7

0,00

0,5

0,399

0,627

5,09

-64,50

3,19

816,8

2,00

-40,4

0,875

0,00

0,5

0,399

0,940

5,09

-70,36

4,79

972,1

4,50

-66,1

-14,97

0,875

0,00

0,5

0,399

0,940

5,09

-76,23

4,79

1140,8

4,50

-71,7

8

-16,12

1,000

0,00

0,5

0,399

1,253

5,09

-82,09

6,38

1323,1

8,00

-102,9

8

8

-17,27

1,000

0,00

0,5

0,399

1,253

5,09

-87,95

6,38

1518,9

8,00

-110,2

8

8

-18,42

1,000

0,00

0,5

0,399

1,253

5,09

-93,82

6,38

1728,2

8,00

-117,6

Z

y

0,5

0,399

-1,253

0,00

0,5

0,399

0,125

0,00

0,5

-11,51

0,250

0,00

6

-12,66

0,750

8

7

-13,82

10-6,5

8

7

10-7,0

8

10-7,5

10-8,0

Az utolsó hat oszlop összegeit a második munkatáblázatba vittük (lásd 5.3.3.-III. táblázat). A többi oszlop adatait a 4.2.1.-4. – 4.2.1.-10. képletek segítségével számítottuk, a közös b meredekségre eredményül –0,295-öt kaptunk. 5.3.3.-III. táblázat – Második munkatáblázat az első ciklusban Vakc. T

50,93

x

y

x2

y2

xy

Sxx

Sxy

Syy

-674,3

11,17

9484,6

57,50

-312,32

556,92

-164,43

55,05

a -13,24

0,219

-3,690

Ezek után az első munkatáblázat Y értékeit az a + bx kifejezés értékére cseréltük, és elvégeztük a második ciklust. A ciklust addig kell ismételni, míg két egymást követő ciklus közti különbség kicsi nem lesz. A második munkatáblázatnak ekkor az 5.3.3.-IV. táblázat adatait kell tartalmaznia. 5.3.3.-IV. táblázat – Második munkatáblázat elegendő számú ciklus után Vakc. T

19,39

x

y

x2

y2

xy

Sxx

Sxy

Syy

-238,2

0,11

2981,1

26,05

-37,45

55,88

-36,11

26,05

A 4.2.2. részben leírtak szerint ellenőriztük a linearitást. A 0,951 -et jelent, azaz nem szignifikáns.

-12,28

0,006

-7,931

érték 2,711, a szabadságfok 8, mely p =

Most már a 4.5. részben leírtak szerint kiszámítható a hatóérték-arány:

majd

a

A megbízhatósági határok logaritmusa:

E becslést még mindig a hígítás logaritmusában adtuk meg. Ahhoz hogy a becslést ln(ED50)/ml-ben fejezzük ki, az értékeket

-né kell transzformálni.

Mivel általánossá vált hogy az e típusú vakcináknál a hatóértéket

-ben fejezik ki, az

eredményeket ln(10)-zel osztani kell. Így a becsült hatóérték 6,63 konfidencia intevallum 6,30 – 6,96 5.4.

;

a 95 %-os

.

SZÉLES TARTOMÁNYÚ, SZIGMOID ALAKÚ DZIS-VÁLASZ GÖRBÉK

5.4.1. NÉGY-PARAMÉTERES LOGISZTIKUS GÖRBE ANALÍZIS Tetanusz szérum szerológiai meghatározása Mint ahogy azt a 3.4. részben már megjegyeztük, e példában a megadott adatok analízisének egy „lehetséges” módját mutatjuk be, de nem feltétlenül ez az „egyedüli” vagy a „legalkalmasabb” módszer. Az irodalomban sokféle ettől eltérő megközelítés is található, de a legtöbb esetben ezek nem vezethetnek jelentősen eltérő eredményre. Az alternatív megközelítések rövid leírása és más statisztikai megfontolások a 7.5. részben találhatók. Enzim-kapcsolt immunszorpciós technikával (ELISA) tengerimalac antiszérumot határoztak meg standard szérummal (0,4 NE/ml) szemben. Egy 96 mélyedést tartalmazó ELISA lemezre mindegyik szérum 10 db kétszeres hígítását vitték. Minden hígítást kétszer vizsgáltak. Az 5.4.1.-I. táblázatban a megfigyelt válaszok láthatók. 5.4.1.-I táblázat – A megfigyelt válaszok T vizsgált készítmény

S standard Hígítás

1.

2.

Hígítás

1.

2.

1/10

2,912

2,917

1/10

3,017

2,987

1/20

2,579

2,654

1/20

2,801

2,808

1/40

2,130

2,212

1/40

2,401

2,450

1/80

1,651

1,638

1/80

1,918

1,963

1/160

1,073

0,973

1/160

1,364

1,299

1/320

0,585

0,666

1/320

0,861

0,854

1/640

0,463

0,356

1/640

0,497

0,496

1/1280

0,266

0,234

1/1280

0,340

0,344

1/2560

0,228

0,197

1/2560

0,242

0,217

1/5120

0,176

0,215

1/5120

0,178

0,125

E példában feltételezzük, hogy a laboratórium a vizsgálatot rutin módszerré fejlesztése előtt ellenőrizte a 3.1.1. részben szereplő 1. és 3. feltétel ek teljesülését. Ezen kívül a laboratórium ellenőrizte, hogy a minták felső és alsó határa egyenlőnek tekinthető-e. Az adatok grafikai megjelenítésekor szokatlan viselkedés nem tapasztalható. A logisztikus függvény paramétereinek illesztéséhez egy alkalmas számítógépes program legkisebb négyzetes módszerét alkalmaztuk, ehhez feltételeztük, hogy a maradék hibák független és normális eloszlású valószínűségi változók. Ebben az esetben 3 paraméter (, és ) szükséges ahhoz, hogy leírja a közös meredekségfaktort és a közös alsó és felső aszimptotákat. Két további paraméter (S és T) szükséges a két görbe vízszintes helyzetének megadásához. A program a paraméterek következő becslését adta: = 3,19 S = –4,307 = 1,125

T

= –4,684

= 0,145 Ezen kívül megkaptuk a becsült maradék szórásnégyzetet (s2), mely 0,001429, és a szabadságfokok számát, mely 20 (kezeléseken belüli variáció). Hogy megkapjuk a megbízhatósági határokat, és hogy ellenőrizzük a párhuzamosságot és a linearitást, a megfigyelt válaszokat (u) linearizáltuk, és a program segítségével súlyozott párhuzamos egyenesek módszerével vizsgáltuk. Ez az eljárás nagyon hasonló a 4.2. részben leírt probit analízishez a következő módosításokkal:

Az y transzformált válaszok w súlyok alkalmazásával nyert súlyozott varianciaanalízisének eredménye az 5.4.1.-II. táblázatban látható. 5.4.1.-II. táblázat – Súlyozott varianciaanalízis Varianciaforrás

Szabadságfokok

2

Valószínűség

Készítmények

1

0,529653

0,467

Lineáris regresszió

1

6599,51

0,000

Párhuzamosságtól való eltérés

1

0,0458738

0,830

Linearitástól való eltérés

16

8,89337

0,918

Kezelések

19

6608,98

0,000

Maradék hiba

20

20,0000

Teljes

39

6628,98

A párhuzamosságtól és a linearitástól való eltérés nem szignifikáns, így a meghatározás megfelelő a hatóérték számításához. Ha a felső és az alsó aszimptoták egyenlőségének feltétele nem teljesül, nagy valószínűséggel fellép a linearitástól és/vagy a párhuzamosságtól való eltérés, mivel a linearitás és a párhuzamosság vizsgálata a teljes négy-paraméteres modell illeszkedésének jóságát tükrözi. A varianciaanalízis maradék hibája a transzformáció eredményeképp mindig 1-gyel egyenlő, azonban heterogenitás faktor (analóg a probit modellben alkalmazottal) is számítható. A vizsgálati készítmény relatív hatóértékét a S – T különbség antilogaritmusaként kapjuk meg. Ezt az értéket a standard hozzárendelt hatóértékével megszorozva eredményül 1,459 0,4 = 0,584 NE/ml-t kapunk. A 4.2.3.-2. képlet szerint a 95 %-os megbizhatósági intervallum 0,557 – 0,612 NE/ml. 6. MEGHATÁROZÁSOK EREDMÉNYEINEK EGYESÍTÉSE 6.1. BEVEZETÉS Az Európai Gyógyszerkönyv követelményeinek teljesítéséhez gyakran van szükség a független vizsgálatok ismétlésére és eredményeik egyesítésére. Ekkor felmerül az a kérdés, hogy helyes-e az ilyen vizsgálatok eredményeinek egyesítése, és ha igen, milyen módon végezhető el. Két meghatározást akkor tekintünk kölcsönösen függetlennek, ha bármelyikük végrehajtása nem befolyásolja a másik lehetséges kimeneteleinek valószínűségét. Ez magában foglalja azt is, hogy az eredményre ható összes lényeges tényező (például a standard és a vizsgálandó készítmény hígításai, a biológiai indikátor érzékenysége) véletlen hibájának egyik meghatározásban függetlennek kell lennie a másik meghatározás megfelelő véletlen hibájától. Emiatt azok a meghatározások, melyek egymást követő napokon a standard eredeti és megmaradt hígítását alkalmazzák, nem független meghatározások. A független meghatározások összesítésére többféle módszer létezik. Az elméletileg legelfogadhatóbb módszer egyben a legnehezebben alkalmazható. A továbbiakban három egyszerű, közelítő módszert írunk le; ha a feltételek teljesülése biztosított más módszerek is használhatók. Mielőtt a párhuzamos egyenesek módszerén vagy a probit módszeren alapuló meghatározásokkal nyert hatóértékeket egyesítenénk, logaritmusukat kell képezni. Az iránytangens-hányados módszerrel kapott eredményeket változtatás nélkül használjuk. Mivel az előbbi módszerek elterjedtebbek, mint az iránytangens-hányados módszeren alapulók, ebben a részben az M jel a képletekben az ln(hatóértéket) jelöli. M helyére R (iránytangens-hányados)-t helyettesítve, ugyanazt a képletet használhatjuk az iránytangens-hányados módszerrel kapott hatóértékekre is. Minden becsült hatóértéket az egyesítés előtt a hozzárendelt hatóértékkel korrigálni kell minden vizsgálandó készítmény esetében. 6.2. A MEGHATÁROZÁSOK EREDMÉNYEINEK SÚLYOZOTT EGYESÍTÉSE E módszer az alábbi feltételek teljesülése esetén használható: 1) a becsült hatóértékek független meghatározásokból származnak; 2) mindegyik vizsgálatban C közel van az 1-hez (mondjuk kisebb mint 1,1) 3) az egyes maradék hibák szabadságfokai nem kisebbek, mint 6, de inkább nagyobbak, mint 15; 4) az egyedi becsült hatóértékek homogén mintát képeznek (lásd 6.2.2. rész). Ha ezek a feltételek nem teljesülnek, a módszer nem alkalmazható. Ekkor a 6.3. részben leírt módszer alkalmazható a hatóértékátlag legjobb becslésének számítására, melyet a későbbi vizsgálatokban feltételezett hatóértékként használhatunk. 6.2.1. A SÚLYOZÓ EGYÜTTHATÓK SZÁMÍTÁSA Abból indulunk ki, hogy az n / számú meghatározás mindegyikéből kiszámítottuk az M-értékeket és a hozzájuk tartozó megbízhatósági határokat. Az egyes meghatározásokban a megbízhatósági intervallum logaritmusát (L) úgy kapjuk meg, hogy a felső határból kivonjuk az alsó határt. A W súlyozó együtthatót mindegyik M értékre a 6.2.1.-1. képlet alapján számítjuk ki, ahol t ugyanaz az

érték, amit a konfidencia határok számításánál használtunk.

(6.2.1.-1.) 6.2.2. A BECSÜLT HATÓÉRTÉKEK HOMOGENITÁSA Az egyes M értékek súlyozott átlagtól (

) való eltérését négyzetre emelve és a megfelelő súlyozó

együtthatóval (W) megszorozva, majd az összes meghatározásra összegezve, közelítőleg eloszlást mutató statisztikai jellemzőhöz juthatunk (lásd 8.3 táblázat), mely felhasználható a becsült hatóértékek logaritmusának homogenitás-vizsgálatára: (6.2.2.-1.) ahol

Ha a számított érték kisebb, mint a táblázatban szereplő és (n / - 1) szabadsági fokhoz tartozó érték, a hatóértékek homogének és a 6.2.3. rész szerint számított átlagos hatóérték és konfidencia határok értelmes végeredménynek tekinthetők. Ha a számított érték nagyobb, mint a táblázatban szereplő érték, a hatóértékek heterogének. Ez azt jelenti, hogy az M egyedi becslései közti szórás nagyobb, mint ahogy az a megbízhatósági intervallumok alapján várható lenne, azaz szignifikáns az eltérés a meghatározások között. Ekkor a 4. feltétel nem teljesül és a 6.2.3. rész egyenletei nem alkalmazhatók. Ehelyett a 6.2.4. rész képletei használhatók. 6.2.3. A SÚLYOZOTT ÁTLAG ÉS A MEGBÍZHATÓSÁGI INTERVALLUMOK SZÁMÍTÁSA Mindegyik vizsgálatra képezzük a WM szorzatot és ezek összegét elosztjuk a meghatározások súlyozó együtthatóinak összegével, így kapjuk meg a logaritmikus súlyozott hatóértékátlagot.

(6.2.3.-1.) Az ln(átlagos hatóérték) standard hibája (az átlag szórása) a súlyozó együtthatók összegének reciprokából vont négyzetgyök.

(6.2.3.-2.) A közelítő megbízhatósági határokat az alábbi érték antilogaritmusát véve kapjuk meg: (6.2.3.-3.) ahol t szabadságfokainak számát úgy kapjuk meg, hogy az egyedi meghatározások maradék szórásnégyzeteinek szabadságfokait összegezzük. 6.2.4. A MEGHATÁROZÁSOKON BELÜLI ÉS MEGHATÁROZÁSOK KÖZÖTTI VARIANCIÁK ALAPJÁN SZÁMÍTOTT SÚLYOZOTT ÁTLAG ÉS MEGBÍZHATÓSÁGI HATÁROK Több megismételt meghatározás eredményeinek egyesítése esetén a úgy tekintjük, hogy a megfigyelt variációnak két komponense van: –

meghatározáson belüli variancia

érték szignifikáns lehet. Ekkor

–

meghatározások közötti variancia

ahol a nem súlyozott átlag. Az első variancia meghatározásonként különböző, de a második az összes M-re nézve közös. Az egyes M- ekhez tartozó súlyozó együtthatókat (W) a 6.2.3. részben bemutatottak helyett az alábbiak szerint számítjuk:

ahol t megközelítőleg 2. 6.3. A meghatározások eredményeinek nem súlyozott Egyesítése

M n / számú meghatározásából kapott n / számú becslésének legegyszerűbb egyesítése, ha kiszámítjuk az átlagot és az alábbi számítással becsüljük a szórást: (6.3.-1.) A megbízhatósági határok: (6.3.-2.) ahol t szabadságfoka (n – 1). Rendszerint M becsléseinek száma kicsi (n /) és így t értéke egészen nagy. /

6.4. PÉLDA SÚLYOZOTT HATÓÉRTÉKÁTLAG ÉS MEGBÍZHATÓSÁGI HATÁRAI SZÁMÍTÁSÁRA A 6.4.-I. táblázat ugyanannak a készítménynek hat független becsült hatóértékét tartalmazza a 95 %-os megbízhatósági határokkal és a maradék hiba szórásnégyzetek szabadságfokával. A 6.2. rész 1., 2. és 3. feltétele teljesül. A hatóérték logaritmusát és a súlyozást a 6.2. részben leírtak szerint számítottuk. 6.4.-I. táblázat – Hat független meghatározás becsült hatóértékei és megbízhatósági intervallumai Becsült hatóérték

Alsó határ

Felső határ

NE/üvegcse

NE/üvegcse

NE/üvegcse

18367

17755

19002

18003

17415

18064

Szabadságfok

ln(Hatóérték)

Súly

M

W

20

9,8183

3777,7

18610

20

9,7983

3951,5

17319

18838

20

9,8017

2462,5

17832

17253

18429

20

9,7887

40003,0

18635

17959

19339

20

9,8328

3175,6

18269

17722

18834

20

9,8130

4699,5

A 6.2.2.-1. képlet alapján megállapítottuk a becsült hatóértékek homogenitását, értékére 4,42 adódott a szabadságfokok száma 5. Mivel a kapott érték nem szignifikáns (p = 0,49), így minden feltétel teljesül. A 6.2.3.-1. képlettel számított súlyozott átlag hatóérték 9,8085. A 6.2.3.-2. képlet alapján a szórás 0,00673; a 95 %-os megbízhatósági intervallumok a 6.2.3.-3. képlet

alapján megközelítőleg 9,7951 és 9,8218 ahol t szabadságfoka 120. Az értékek antilogaritmusait véve, a becsült hatóérték 18187 NE/üveg; a 95 %-os megbízhatósági határok 17946 és 18431 NE/üveg. 7. E FEJEZET KIEGÉSZÍTÉSE Egy gyógyszerkönyvi fejezeten belül lehetetlen átfogóan ismertetni valamennyi statisztikai módszert. Ennek ellenére az itt leírt módszerek a legtöbb gyógyszerkönyvi feladat esetében megfelelőek. E részben, az eddigieknél kevésbé konkrétan, a kifejlesztett alternatív vagy általánosabb érvényű módszerekről próbálunk meg áttekintését adni. Az érdeklődő olvasót arra biztatjuk, hogy fedezze fel e terület már meglévő irodalmát. A még specializáltabb statisztikai módszerek használatát minden esetben engedjük át képzett szakembereknek. 7.1. ÁLTALÁNOS LINEÁRIS MODELLEK Az e részben megadott módszerek az általános lineáris modellek (vagy ún. általánosított lineáris modellek, hogyha belefoglaljuk a probit és a logit módszert is) kifejezéseinek segítségével írhatók le. Az alapelv szerint meghatározzuk a modellmátrixot, vagy más néven a változók incidenciamátrixát (X). A mátrixban minden sor egy megfigyelést és minden oszlop egy lineáris hatást (készítmény, blokk, oszlop, dózis) jelent. Ez például az 5.1.2. példa Latin-négyzetes elrendezésénél 36 sort és 13 oszlopot (egy-egy oszlop a készítményeknek, egy oszlop a dózisoknak, öt oszlop a blokkoknak (kivéve az elsőt) és öt oszlop a soroknak (kivéve az elsőt)) tartalmazó mátrixot jelent. A dózis oszlopa kivételével mindegyik oszlopot 0-val vagy 1-gyel töltjük ki, attól függően, hogy a megfigyelés összefügg-e a hatással. Egy Y vektort a (transzformált) megfigyelésekkel töltünk meg. A hatásokat a (XtX)-1XtY képlettel becsülhetjük, melyből a becsült hatóérték (m) a releváns hatások arányaként könnyen származtatható. A megbízhatósági intervallumok Fieller képlete alapján számíthatók.

ahol A v11 és v22 a számláló és a nevező variancia szorzói, v12 a számláló és a nevező kovariancia szorzója. Ezeket nyerhetjük közvetlenül, a (XtX)-1-ből, vagy közvetetten is, figyelembe véve, hogy Var(a1 – a2) = Var(a1) + Var(a2) – 2Cov(a1,a2) és Cov(a1 – a2,b) = Cov(a1,b) – Cov(a2,b). A teljes varianciaanalízis, melyben minden komponenst részekre bontunk, kissé bonyolultabb, mivel az X-et több oszloppal újra kell definiálni, azért, hogy eltekinthessünk a párhuzamosság és a linearitás feltételezésétől, és ezután történhet a linearitás vizsgálata. A „minden vagy semmi” típusú (kvantális) válaszoktól függő meghatározásoknál a lineáris hatásokat (tengelymetszetek stb. és a közös b meredekség) úgy találjuk meg, hogy megkeressük az nln(ai + bx) + (n – r)ln[1 – (ai + bx)] kifejezés kezelésenkénti összegének maximumát, ahol x az ln(dózis), az eloszlás alakja és

.

7.2. A VARIANCIA HETEROGENITÁSA A variancia heterogenitása nem mindig szüntethető meg pusztán a válaszok egyszerű transzformálásával. A probléma kezelésének egy lehetséges módja, hogy súlyozott lineáris regressziót hajtunk végre. Azért hogy szisztematikus hibától mentes becslést kapjunk, a megfigyelések súlyát arányosnak vesszük a hiba varianciájának reciprokával. Mivel az igazi hiba variancia nem mindig

ismert, iterációs újrasúlyozásos lineáris eljárás végezhető, ilyenkor azonban a megbízhatósági intervallum kiszámítása új problémákat vet fel. 7.3. KIUGRÓ EREDMÉNYEK ÉS ROBUSZTUS MÓDSZEREK Az ebben a fejezetben leírt legkisebb négyzetes módszer hátránya, hogy a kiugró adatokra nagyon érzékeny. Egy jelentősen kiugró adat teljesen elronthatja a számításokat. E problémát sokszor úgy orvosolják, hogy a kiugró adatot kiejtik az adathalmazból. Ez a politika az adatok önkényes elutasításához vezethet, ami veszélyeket hordozhat magában. Mivel nem könnyű általános útmutatót adni annak eldöntéséhez, hogy egy egyedi megfigyelés kiugró adat-e vagy sem, ezért több ún. „robusztus módszert” is kifejlesztettek. A robusztus módszerek kevésbé érzékenyek a kiugró adatokra, mert az előre jelzett értéktől távol eső megfigyeléseknek kisebb súlyt adnak. Új probléma keletkezik rendszerint a megbízhatósági intervallumok számításában vagy a megfelelő minimalizálandó függvény definiálásában. 7.4. EGYMÁSSAL ÖSSZEFÜGGŐ (KORRELÁLÓ) HIBÁK A teljes randomizálás nem mindig kivitelezhető, vagy néha gyakorlati szempontból nem kívánatos. így az egy hígítási sorban egymást követő dózisok gyakran korreláló hibákat tartalmaznak, melyek túl szűk megbízhatósági határokhoz vezetnek. Kifejlesztettek azonban néhány módszert, mely figyelembe veszi ezt az autokorrelációs hatást. 7.5.

SZÉLES TARTOMÁNYÚ, NEMLINEÁRIS DÓZIS-VÁLASZ GÖRBÉK

A széles tartományú, nemlineáris dózis-válasz görbék analízise számos megfontolandó statisztikai problémát vet fel, melyekhez szakmai segítség igénybevételét ajánljuk. A problémák közül néhányat az alábbiakban jelzünk. 1) Bemutattunk egy példát, mely a négy-paraméteres logisztikus függvényt alkalmazza, azonban olyan függvényeken alapuló modellek is használhatók, melyek más szigmoid görbéket írnak le. Javasoljuk azokat a modelleket, melyek további aszimetria paramétereket is tartalmaznak. 2) Ha a válaszok széles tartományt fognak át, a variancia heterogenitása általános jelenség. Ha az analízis elhanyagolja a heterogenitást, az eredmények értelmezése nem biztos hogy megfelelő, és hamis becsléseket kaphatunk. Súlyként a hiba varianciák reciprokát használva, korlátozott számú párhuzamos esetén, nem valószínű, hogy megbízható eredményt kapunk. Megfelelőbb lehet egy olyan függvény becslése, mely a válaszok átlagának függvényében adja meg a varianciát. 3) A statisztikai görbeillesztő eljárások a variancia homogenitásától és az alkalmazott válaszok tartományától függően különböző becsléseket adhatnak. 4) Alapvetően a meghatározásba bevont különböző készítmények felső és alsó válasz-határainak egyenlősége minden meghatározásban közvetlenül is ellenőrizhető. Viszont ezen vizsgálatok eredményeinek értelmezése nem mindig kézenfekvő. A linearitás és a párhuzamosság vizsgálata, melyet az egyszerűsített analízis módszerben mutattunk be (5.4.1. példa) közvetve tartalmazza a felső és alsó határok egyenlőségének és pontosságának vizsgálatát. 5) Sok meghatározás tartalmaz „kontrollokat”, melyek arra szolgálnak, hogy azonosítsák a felső és/vagy az alsó válasz-határokat. Azonban ezek az értékek nem biztos hogy megegyeznek a széles tartományú dózis-válasz görbe alapján statisztikai módszerekkel illesztett felső és alsó válaszhatárokkal. 6) Az 5.4.1. példában megadott egyszerűsített analízis módszer csak hozzávetőleges megbízhatósági tartományokat szolgáltat. Más módszerek is használhatók, például a teljesen meghatározott modell „lack-of-fit” elemzésén alapuló tartomány meghatározás. Szokásos vizsgálati adatok esetében, melyeknél a válasz minden vizsgált készítmény esetében lefedi a teljes tartományt, mindegyik módszer hasonló eredményt ad. 7.6. NEMLINEÁRIS DÓZIS-VÁLASZ GÖRBÉK LINEARITÁSTÓL VALÓ ELTÉRÉSE A dózis-válasz görbék hasonlósága alapvető feltétele annak, hogy egy meghatározás hígításos meghatározásnak tekinthető-e, és így a relatív hatóérték becslése érvényes (lásd 3.1.1). E

követelménynek való megfeleléshez gyakran elegendő annak bizonyítása, hogy a standard és a minta dózis-válasz görbéi nem térnek el szignifikánsan a párhuzamosságtól. A maradék hiba alulbecslése a párhuzamosságtól/linearitástól való szignifikáns eltérésnek köszönhetően a meghatározások túlzott mértékű elvetését eredményezheti. Ez gyakran a nem megfelelő meghatározás-, vagy analízis-tervezés eredménye. A meghatározás tervében történő kismértékű módosítás a legtöbb esetben alapvetően növelheti a maradék hiba becslését. A helyzetet javíthatja az analízis ismétlésszámának növelése, pl. ugyanazon hígítás többszöri felhasználása, vagy hígítási sorok hibáinak korrelációja. Ha a maradék hiba becslése nem lehetséges egy adott meghatározás esetében, például amikor párhuzamos mérések nem végezhetők el, vagy nem készíthetők független bemérések, a maradék hiba jobb becslése adható meg a validálási eljárás során. Ilyen esetben indokolt lehet az egyes meghatározásokból becsült maradék hiba helyettesítése átlag (összesített) maradék hibával, amennyiben azt a validálási eljárás során maghatározzuk és az illetékes hatóság jóváhagyja. Amennyiben nincs megadva görbehasonlóság vizsgálatára vonatkozó eljárás, a “vizsgálatok egyenértékűsége” módszer alkalmazható, mely szerint a validálás során meghatározzuk a görbehasonlóságot leíró paraméterek (pl. meredekségek) közötti eltérések megengedhető mértékét, amely tartomány megadja két görbe hasonlóságának elfogadási kritériumát. Amennyiben megfelelő dokumentációval van alátámasztva és az illetékes hatóság is jóváhagyta, a görbék hasonlóságának elfogadási kritériumait használhatjuk a görbék hasonlósági követelményének való megfelelés céljára. Lehetnek olyan esetek is, amikor a meghatározás megfelelően pontos a valódi párhuzamosságtól való eltérés kimutatására. Amennyiben valódi párhuzamosságtól való eltérés áll fenn, azt fel kell ismerni és megfelelő megoldást kell alkalmazni annak megszüntetésére. A megoldás például egy olyan standard használatát is magába foglalhatja, mely hasonló összetételű, mint a minta, így avval párhuzamos eredményt szolgáltathat. Amennyiben a meghatározási eljárás válaszjele nem spcifikus a standard, vagy a minta összetevőire, akkor olyan specifikus eljárás alkalmazása jelenti a megoldást, amely az irreleváns komponensekre nem érzékeny. Ezen alapvető problémák lekűzdésére nem létezik egyszerű, általánosan alkalmazható statisztikai módszer. Az eljárási mód esetfüggő és statisztikában járatos szakember tanácsát igényli. 8. TÁBLÁZATOK ÉS A TÁBLÁZATOK ÉRTÉKEIT ELŐÁLLÍTÓ ALGORITMUSOK Ennek a résznek a táblázatai a leggyakrabban előforduló szabadsági fokokhoz tartozó kritikus értékeket tartalmazzák. Ha egy kritikus érték nem szerepel a táblázatban, részletesebb táblázatokat kell használnunk. Sok számítógépes program tartalmaz statisztikai függvényeket, és a táblázatok helyett inkább ezek használatát javasoljuk. Alternatívaként minden táblázat alatt megadjuk az előállító algoritmusokat, melyekkel az adott statisztikai jellemzőhöz és szabadságfokhoz tartozó valószínűség kiszámítható. 8.1. AZ F-ELOSZLÁS Ha a megfigyelt érték nagyobb, mint a 8.1.-I. táblázatban lévő érték, akkor szignifikánsnak (felső sor, p = 0,05) és erősen szignifikánsnak (alsó sor, p = 0,01) kell tekinteni. df1 a számláló, df2 a nevező szabadságfokainak a száma. 8.1.-I. táblázat – Az F-eloszlás kritikus értékei df1

1

2

3

4

5

6

8

10

12

15

20

4,965

4,103

3,708

3,478

3,326

3,217

3,072

2,978

2,913

2,845

2,774

2,538

10,044

7,559

6,552

5,994

5,636

5,386

5,057

4,849

4,706

4,558

4,405

3,909

df2 10

12

15

20

25

30

50

4,747

3,885

3,490

3,259

3,106

2,996

2,849

2,753

2,687

2,617

2,544

2,296

9,330

6,927

5,953

5,412

5,064

4,821

4,499

4,296

4,155

4,010

3,858

3,361

4,543

3,682

3,287

3,056

2,901

2,790

2,641

2,544

2,475

2,403

2,328

2,066

8,683

6,359

5,417

4,893

4,556

4,318

4,004

3,805

3,666

3,522

3,372

2,868

4,351

3,493

3,098

2,866

2,711

2,599

2,447

2,348

2,278

2,203

2,124

1,843

8,096

5,849

4,938

4,431

4,103

3,871

3,564

3,368

3,231

3,088

2,938

2,421

4,242

3,385

2,991

2,759

2,603

2,490

2,337

2,236

2,165

2,089

2,007

1,711

7,770

5,568

4,675

4,177

3,855

3,627

3,324

3,129

2,993

2,850

2,699

2,169

4,171

3,316

2,922

2,690

2,534

2,421

2,266

2,165

2,092

2,015

1,932

1,622

7,562

5,390

4,510

4,018

3,699

3,473

3,173

2,979

2,843

2,700

2,549

2,006

4,034

3,183

2,790

2,557

2,400

2,286

2,130

2,026

1,952

1,871

1,784

1,438

7,171

5,057

4,199

3,720

3,408

3,186

2,890

2,698

2,563

2,419

2,265

1,683

3,841

2,996

2,605

2,372

2,214

2,099

1,938

1,831

1,752

1,666

1,571

1,000

6,635

4,605

3,782

3,319

3,017

2,802

2,511

2,321

2,185

2,039

1,878

1,000

Numerikus algoritmus: Legyen F az F-arány, df1 és df2, mint ahogy a fentiekben definiáltuk. Legyen pi = . Ekkor a 8.1.-II. táblázatban bemutatott program generálja p értékét.

8.1.-II. táblázat – Az F-eloszlást generáló numerikus algoritmus Ha df1 páros

Ha df1 páratlan és df2 páros

Ha df1 és df2 páratlan

x=df1/(df1+df2/F)

x=df2/(df2+df1*F)

x=atn(sqr(df1*F/df2))

s=1

s=1

cs=cos(x)

t=1

t=1

sn=sin(x)

for i=2 to (df1-2) step 2

for i=2 to (df2-2) step 2

x=x/2

t=t*x*(df2+i-2)/i

t=t*x*(df1+i-2)/i

s=0

s=s+t

s=s+t

t=sn*cs/2

next i

next i

v=0

p=s*(1-x)^(df2/2)

p=1-s*(1-x)^(df1/2)

w=1 for i=2 to (df2-1) step 2 s=s+t t=t*i/(i+1)*cs*cs next i for i=1 to (df1-2) step 2 v=v+w w=w*(df2+i)/(i+2)*sn*sn next i p=1+(t*df2*v-x-s)/pi*4

8.2. A T-ELOSZLÁS Ha a megfigyelt érték nagyobb, mint a 8.2.-I. táblázatban lévő érték, akkor szignifikánsnak (p = 0,05) illetve erősen szignifikánsnak (p = 0,01) kell tekinteni. 8.2.-I. táblázat – A t-eloszlás kritikus értékei df

p = 0,05

p = 0,01

df

p = 0,05

p = 0,01

1

12,706

63,656

22

2,074

2,819

2

4,303

9,925

24

2,064

2,797

3

3,182

5,841

26

2,056

2,779

4

2,776

4,604

28

2,048

2,763

5

2,571

4,032

30

2,042

2,750

6

2,447

3,707

35

2,030

2,724

7

2,365

3,499

40

2,021

2,704

8

2,306

3,355

45

2,014

2,690

9

2,262

3,250

50

2,009

2,678

10

2,228

3,169

60

2,000

2,660

12

2,179

3,055

70

1,994

2,648

14

2,145

2,977

80

1,990

2,639

16

2,120

2,921

90

1,987

2,632

18

2,101

2,878

100

1,984

2,626

20

2,086

2,845

1,960

2,576

Numerikus algoritmus: Adott t-hez és df szabadságfokhoz tartozó p-érték a 8.1. részben leírt eljárással számítható, ahol F = t2, df1 = 1, és df2 = df. A t értéke (p = 0,05) adott df szabadságfok esetén 6 tizedesjegy pontossággal a 8.2.-II. táblázatban látható eljárással kapható meg.

8.2.-II. táblázat – A t-eloszlást generáló numerikus algoritmus t =

1.959964 + 2.37228/df+ 2.82202/df^2+ 2.56449/df^3+ 1.51956/df^4+ 1.02579/df^5+ 0.44210/df^7

8.3. A -ELOSZLÁS Ha a megfigyelt érték nagyobb, mint a 8.3.-I. táblázatban lévő érték, akkor szignifikánsnak (p = 0,05) illetve erősen szignifikánsnak (p = 0,01) kell tekinteni.

8.3.-I. táblázat – A -eloszlás kritikus értékei df

p = 0,05

p = 0,01

df

p = 0,05

p = 0,01

1

3,841

6,635

11

19,675

24,725

2

5,991

9,210

12

21,026

26,217

3

7,815

11,345

13

22,362

27,688

4

9,488

13,277

14

23,685

29,141

5

11,070

15,086

15

24,996

30,578

6

12,592

16,812

16

26,296

32,000

7

14,067

18,475

20

31,410

37,566

8

15,507

20,090

25

37,652

44,314

9

16,919

21,666

30

43,773

50,892

10

18,307

23,209

40

55,758

63,691

Numerikus algoritmus: Legyen x2 a érték és df ahogy fentebb definiáltuk. Ekkor a 8.3.-II. táblázatban látható eljárás p értékét fogja generálni.

8.3.-II. táblázat – A -eloszlást generáló numerikus algoritmus Ha df páros

Ha df páratlan

s=0

x=sqr(x2)

t=exp(-x2/2)

s=0

for i=2 to df step 2

t=x*exp(-x2/2)/sqr(pi/2)

s=s+t

for i=3 to df step 2

t=t*x2/i

s=s+t

next i

t=t*x2/i

p=1-s

next i p=1-s-2*phi(x)

Ebben az eljárásban phi a standard normál eloszlás eloszlásfüggvénye (lásd 8.4. rész). 8.4. A -ELOSZLÁS (A STANDARD NORMÁL ELOSZLÁS ELOSZLÁSFÜGGVÉNYE) 8.4.-I. táblázat – A Ф-eloszlás értékei x

x

x

0,00

0,500

1,00

0,841

2,00

0,977

0,05

0,520

1,05

0,853

2,05

0,980

0,10

0,540

1,10

0,864

2,10

0,982

0,15

0,560

1,15

0,875

2,15

0,984

0,20

0,579

1,20

0,885

2,20

0,986

0,25

0,599

1,25

0,894

2,25

0,988

0,30

0,618

1,30

0,903

2,30

0,989

0,35

0,37

1,35

0,911

2,35

0,991

0,40

0,655

1,40

0,919

2,40

0,992

0,45

0,74

1,45

0,926

2,45

0,993

0,50

0,691

1,50

0,933

2,50

0,994

0,55

0,709

1,55

0,939

2,55

0,995

0,60

0,726

1,60

0,945

2,60

0,995

0,65

0,742

1,65

0,951

2,65

0,996

0,70

0,758

1,70

0,955

2,70

0,997

0,75

0,773

1,75

0,960

2,75

0,997

0,80

0,788

1,80

0,964

2,80

0,997

0,85

0,802

1,85

0,968

2,85

0,998

0,90

0,816

1,90

0,971

2,90

0,998

0,95

0,829

1,95

0,974

2,95

0,998

A negatív x értékek értékét a 8.4.-I. táblázatban 1 – (-x)-ként találjuk meg. Numerikus algoritmus: Legyen x az x-érték. Ha 0 x 8,15, a 8.4.-II. táblázatban található eljárás fogja a megfelelő értéket generálni. Ha x nagyobb mint 8,15, a értéket 1-nek vehetjük. Ha x negatív, a fent megadott képletet lehet használni. Ez az eljárás azon feltételezésen alapul, hogy a számítógép kb. 15 tizedesjegyig tud számítani. Ha kevesebb, vagy több tizedesjeggyel számol, az eljárásban néhány egyszerű módosítást kell tenni. 8.4.-II. táblázat – A -eloszlást generáló numerikus algoritmus s=0 t=x i=1 repeat s=s+t i=i+2 t=t*x*x/i until t<1E-16 phi=0.5+s*exp(-x*x/2)/sqr(2*pi)

8.5. VÉLETLEN PERMUTÁCIÓK A véletlen permutációkra a randomizált blokk elrendezéseknél van szükség. A következő algoritmus azt mutatja meg, hogy hogyan hozható létre N számú kezelés véletlen permutációja a számítógép beépített véletlenszám-generátora segítségével. 1. lépés Az N lehetséges kezelést egy sorban leírjuk 2. lépés

Generáljunk egy véletlen egész számot (r) úgy, hogy 1 r N

3. lépés

Az r-edik kezelést cseréljük ki a sorban az N-edik kezeléssel

4. lépés

Legyen N = N – 1, majd ismételjük meg a 2. – 4. lépést egészen addig, míg N = 1 Az algoritmust hat kezelés esetén mutatjuk be. 1.

N=6

S1

S2

S3

T1

T2

T3

2.

r=2

3. 4.

N=5

2.

r=4

3. 4.

N=4

2.

r=4

3. 4.

N=3

2.

r=1

3. 4.

N=2

2.

r=1

3. 4.

S1

T3

S3

T1

T2

S2

S1

T3

S3

T2

T1

S2

S1

T3

S3

T2

T1

S2

S3

T3

S1

T2

T1

S2

T3

S3

S1

T2

T1

S2

N=1

8.6. LATIN-NÉGYZETEK A következő példa azt mutatja meg, hogy három független permutáció segítségével hogyan állítható elő egy Latin-négyzet. 1.

Generáljuk az N lehetséges kezelés véletlen permutációját (lásd 8.5. rész) T3

S3

S1

T2

T1

S2

2. Egyszerű Latin-négyzetet állíthatunk elő e permutáció jobbra csúsztatásával. Ezt a következőképpen lehet megtenni: az első lépésben kapott permutációt az első sorba írjuk; a második sor ugyanezt a permutációt tartalmazza, de mindegyik kezelés jobbra tolódik, a jobb szélen levő kezelés kerül a bal oldalon üresen maradó cellába; az eljárást addig ismételjük minden sorban, míg minden kezelés legalább egyszer előfordul egy oszlopban.

3.

T3

S3

S1

T2

T1

S2

S2

T3

S3

S1

T2

T1

T1

S2

T3

S3

S1

T2

T2

T1

S2

T3

S3

S1

S1

T2

T1

S2

T3

S3

S3

S1

T2

T1

S2

T3

Generáljunk két független véletlen permutációt 1-től N-ig:

Egyet a soroknak: 2

3

6

1

4

5

3

4

6

2

5

1

és egyet az oszlopoknak:

4. A Latin-négyzetet úgy kapjuk meg, hogy az egyszerű Latin-négyzet sorait és oszlopait a sorokra és az oszlopokra kapott permutáció alapján sorba rendezzük: 3

4

6

2

5

1

2

T3

S3

S1

T2

T1

S2

3

S2

T3

S3

S1

T2

T1

6

T1

S2

T3

S3

S1

T2

1

T2

T1

S2

T3

S3

S1

4

S1

T2

T1

S2

T3

S3

5

S3

S1

T2

T1

S2

T3

1

2

3

4

5

6

1

S1

T3

T2

T1

S3

S2

2

S2

T2

T3

S3

T1

S1

3

T1

S1

S2

T3

T2

S3

4

S3

S2

S1

T2

T3

T1

5

T3

T1

S3

S1

S2

T2

6

T2

S3

T1

S2

S1

T3

9. JELÖLÉSEK LISTÁJA Jelölés

Meghatározás

a

a dózis-hatás illetve az ln(dózis-hatás) összefüggések lineáris regresszióval számított tengelymetszete

B

a dózis-hatás illetve az ln(dózis-hatás) összefüggések lineáris regresszióval számított meredeksége

D

a készítményenkénti dózisszintek száma (az iránytangens-hányados módszernél a kontroll nélkül)

e

a természetes logaritmus alapja (= 2,71828182845905…)

g

a Fieller képletben alkalmazott statisztika g = (C – 1)/C

h

egy meghatározásban a készítmények száma a standardot is beleértve

m

az általános lineáris modellekben a hatások arányaként kapott becsült hatóérték

n

a kezelésenkénti ismétlések (párhuzamosok) száma

p

az a valószínűség, melynél az adott statisztikai jellemző értéke nagyobb, mint a megfigyelt érték. A probit analízisben az r/n arány jelölésére is használjuk

r

a

kvantális

válaszokon

alapuló

meghatározásokban

a

kezelt

csoportonként válaszoló egységek száma s

a becsült szórás (=

)

s2

a varianciaanalízisben a maradék hiba átlagos négyzetösszegével megadott maradék variancia becsült értéke

t

Student-féle t statisztika (8.2. táblázat)

u

a megfigyelt válasz a négy-paraméteres analízisben

v11, v22, v12 a Fieller képletben szereplő m arány számlálójának és nevezőjének (ko)variancia szorzói súlyozó együttható x

a dózis logaritmusa (ln dózis)

y

egyedi válasz vagy egyedi transzformált válasz

A

a vizsgálati számításához

Jelölés

Meghatározás

B

az iránytangens-hányados típusú meghatározásokban a kontrollok válaszainak átlaga

C

a megbízhatósági intervallum számítására alkalmazott statisztika C = 1/(1 – g)

C1, … Cn

a Latin-négyzet típusú elrendezésben az egyes oszlopokban szereplő válaszok átlaga

D1, D2

az ikerkeresztezett elrendezésben az első és a második szakasz válaszainak átlaga

F

két független variancia becsült értékének aránya, mely F eloszlást követ

GS, GT

„kezelés” értékek varianciaanalízise során

HP, HL

a párhuzamos egyenesek módszerén varianciaanalízisében alkalmazott szorzók

alapuló

meghatározások

HB, HI

az iránytangens-hányados módszeren varianciaanalízisében alkalmazott szorzók

alapuló

meghatározások

I

a párhuzamos egyenesek módszerében a szomszédos dózisok arányának logaritmusa; az iránytangens-hányados módszerben a szomszédos dózisok közötti különbség

JS, JT

az iránytangens-hányados módszeren alapuló meghatározások varianciaanalízisében a linearitástól való eltérésre kapott érték

K

a varianciaanalízisben a négyzetösszegek számításában alkalmazott korrekciós kifejezés

L

a megbízhatósági tartomány szélessége logaritmusban

LS, LT

a standard és a vizsgálati készítmény lineáris kontrasztja

M/

adott vizsgálati készítmény hatóérték-arányának logaritmusa

készítmények

az

feltételezett

hatóértéke

a

iránytangens-hányados

dózisok

módszer

N

a kezelések összes száma a meghatározás során (= dh)

PS, PT

a standard és a vizsgálati készítményekre kapott válaszok összege

R

adott vizsgálati készítmény becsült (számított) hatóértéke

R/

adott vizsgálati készítmény hatóérték-aránya

R1, …, Rn

a Latin-négyzetes elrendezésben az 1-től n-ig terjedő sorok válaszainak átlaga, a randomizált blokk elrendezésben az egyes blokkok válaszainak átlaga

S

standard készítmény

S1, …, Sd

az S standard készítmény legkisebb dózisától (1) a legnagyobb dózisáig (d) a válaszok átlaga

SS

adott variancia-forrás négyzetösszege

T, U, V, … a vizsgálati készítmények T1, …, Td

a T vizsgálati készítmény legkisebb dózisától (1) a legnagyobb dózisáig (d) a válaszok átlaga

V

variancia-kifejezés a megbízhatósági tartomány számításában

W

a meghatározások eredményeinek egyesítésekor alkalmazott súlyozó együttható

Jelölés

Meghatározás

X

az általános lineáris modellekben alkalmazott modellmátrix vagy másnéven a változók incidencia-mátrixa

Y, Y/

az általános lineáris modellekben a (transzformált) válaszokat reprezentáló vektor

Z

első deriváltja az ln(dózis)-válasz görbe felső aszimptotája a négy-paraméteres analízisben az ln(dózis)-válasz görbe meredekség-faktora a négy-paraméteres analízisben az 50 %-os válaszhoz tartozó ln(dózis) érték a négy-paraméteres analízisben az ln(dózis)-válasz görbe alsó aszimptotája a négy-paraméteres analízisben 3,141592653589793238… a standard normál eloszlás eloszlásfüggvénye (8.4 táblázat)

2

Khi-négyzet statisztika (8.3 táblázat)

10. IRODALOM Ebben a részben néhány, a további tanulmányokhoz ajánlott szakirodalmi forrást sorolunk fel. Finney, DJ. (1971). Probit Analaysis, 3rd Ed. Cambridge University Press, Cambridge. Nelder, J.A. Wedderburn, R.W.M. (1972). Generalized linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series A 135, 370-384.

DeLean, A., Munson, P.J., and Rodbard, D. (1978). Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: Application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves, Am. J. Physiol. 235(2): E97-E102. Finney, DJ. (1978). Statistical Method in Biological Assay, 3rd Ed. Griffin, London. Sokal R.R. Rohlf, F.R. (1981). Biometry: Principles and Practice of Statistics in Biological Research, 2nd Ed. W.H. Freemann CO, New York. Peace, K.E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel. Bowerman, B.L. O’Connel, R.T. (1990). Linear statistical Models an Applied Approach, 2nd Ed. PWS-KENT Publishing Company, Boston. Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay, 2nd revised and enlarged edition, Karger, New York.