S Ivanem Lefkovitsem o Ivanu Lefkovitsovi a Zdeňku Neubauerovi /Otázky kladl Ivan M. Havel/
Vesmír: Jste velmi známým odborníkem v molekulární biologii a imunologii, protože však již dlouho žijete v zahraničí, bylo by dobré, kdybyste čtenářům Vesmíru poněkud přiblížíl obor svého zájmu. Ivan Lefkovits: Nevím, zda se mi podaří odpovědět na tuto otázku, aniž bych začal velice zeširoka o tom, co je to imunitní systém, z jakých buněk se skládá a jak jsou tyto buňky stimulovány antigenem nebo mitogenem. Můj zájem se soustředil… V.: Nerad vás přerušuji, ale navrhuji, abyste zatím předpokládal, že čtenář už o imunitním systému něco ví. K našemu rozhovoru připojíme rámeček, v němž připomeneme některé základní pojmy. IL: Souhlasím, tak tedy znovu: Můj zájem se soustředil na otázku, zda imunokompetentní buňka je předurčena reagovat na jeden specifický antigen, nebo naopak je „univerzální“ a produkuje takovou protilátku, která je právě potřebná. Dnes jsou tyto otázky zodpovězeny jak na buněčné, tak na molekulární úrovni, ale tehdy, v roce 1969, když jsem vstupoval do imunologie, toto byl jeden z nejdůležitějších problémů. V.: Říkáte, že tehdy, v roce 1969, to byl jeden z nejdůležitějších problémů imunologie. Vidíte tuto důležitost až s odstupem těch 30 let, nebo se to takto bralo už tehdy? Jiný aspekt otázky je, zda si mladý vědecký pracovník – prakticky na začátku své kariéry – umí vybrat takovou otázku, kterou lze jednoznačně definovat jako „důležitou“. IL: Řeknu vám zcela bez zábran, že tuto otázku jsem sice formuloval sám, ale byl jsem k ní přiveden v rozhovoru s dánským vědcem Nielsem Jernem. Bylo to takto. V říjnu 1967 se konal ve Frankfurtu nad Mohanem mezinárodní kurz imunologie (kterého se mimo jiné zúčastnili čeští vědečtí pracovníci Ctirad John, Blanka Říhová a Tomáš Hraba). Po ukončení kurzu si mne Jerne zavolal do své pracovny a zeptal se, co si o kurzu myslím a co jsem si z něj odnesl. O imunologii jsem měl jen velice mlhavou představu a věděl jsem, že bych rozhovor jen zkomplikoval, kdybych nevyrukoval s pravdou ven. Přiznal jsem tedy, že převážné většině problematiky jsem neporozuměl a že z celého kurzu mne zaujalo jen to, že Richard Dutton z Kalifornie (jeden z přednášejících) dokázal a předvedl experimentálně, že v tkáňové kultuře lze indukovat imunitní odpověď. A dodal jsem, že vzhledem k tomu, že v úvahách o tomto pokusném uspořádání nemusím brát v úvahu ani slezinu, ani lymfatické uzliny, ani sérum, ani nic jiného, je to veliké zjednodušení celého myšlení o imunitním systému. Jerne se po chvíli ml-
452
VESMÍR 80, srpen 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
čení zeptal: „Chtěl byste tímto směrem – a za použití stejné metodiky – pracovat?“ Po této otázce jsem se trochu uvolnil, protože bylo zřejmé, že Jerne nepovažuje moje dosavadní vývody za zcela hloupé. Hned se však zeptal dál, jakou otázku bych použitím Duttonova systému in vitro chtěl řešit. U Jerneho nebyl žádný problém setrvat nějakou dobu v mlčení. Po chvíli – nekonečně dlouhé chvíli – jsem řekl: „Vzhledem k tomu, že vím, kolik buněk vkládám do kultury, a na konci analýzy zjišťuji s dostatečnou přesností, kolik buněk bylo indukováno k specifické tvorbě protilátek (tuto metodu vizualizace buněk syntetizujících protilátky vyvinul Jerne a stala se základním pilířem jeho budoucí slávy i Nobelovy ceny), rád bych věděl, kolik buněk schopných odpovědi bylo přítomno před stimulací a kolik buněk se zúčastnilo iniciální fáze imunitní odpovědi.“ Jerne chtěl samozřejmě vědět, jak bych tyto vztahy chtěl zjistit. Zde jsem už získal půdu pod nohama, intuitivně jsem viděl správnou cestu. Znal jsem práce slavného Maxe Delbrücka, který ve čtyřicátých letech popsal (spolu se Salvatorem Luriou) takzvaný fluktuační test pro zjištění přítomnosti mutovaných buněk v bakteriálních kulturách. Řekl jsem Jernemu, že podobně bych vyředil buňky (vytvořil mikrokultury) a přivodil situaci, kdy některé kultury dají imunitní odpověď a jiné zůstanou „negativní“. Pomocí Poissonovy distribuce bych se pokusil vyčíslit kvantitativní vztahy. Kdybych to prokázal pro řadu různých antigenů a zjistil, že buňky pro určitou specifitu jsou nezávisle na sobě vytříděny, prokázal bych, že buňky jsou předurčeny pro jedinou specifitu. Jerne řekl povzbudivé „go ahead“ a při odchodu z jeho pracovny jsem věděl, že mám postaráno o slušný projekt. V.: Co jste měl před chvílí na mysli, když jste řekl, že jste o imunologii měl jen „velice mlhavou představu“? IL: Studoval jsem na Vysoké škole chemicko-technologické; v prvních třech letech studia jsem získal vše, co jsem potřeboval z oboru chemie a fyzikální chemie, ale technologické předměty se mi zdály být ztrátou času. Začal jsem chodit na Stárkovy přednášky na Karlovu univerzitu. Pár měsíců před promocí na Vysoké škole chemicko-technologické jsem se přihlásil na konkurz do Mikrobiologického ústavu Akademie věd, byl jsem přijat, ale škola mne nedoporučila. Po promoci jsem nastoupil na umístěnku do Rájce nad Svitavou, absolvoval jsem vojnu. S velkým vděkem vzpomínám, jak mi z ústavu sdělili, že mi drží místo. V roce 1962 jsem do tohoto ústavu nastoupil a začal pracovat na regulaci syntézy beta-galaktosidázy. V té době byla československá imunologie zastoupena dvěma školami, jednou vedenou Milanem Haškem a druhou vedenou Jaroslavem Šterzlem. Nevyšel jsem (bohužel) ani z jedné, ani z druhé školy. Proto jsem v imunologii neměl žádné solidní základy. V.: Převážná část vaší vědecké kariéry se odehrála v cizině. Jak jste se tam dostal? Odešel jste legálně? IL: Roky 1965 ani 1966 nebyly obdobím, kdy se z Československa mohlo vycestovat volně, ale díky tehdejší politické konstelaci se komunistický systém začal chovat poněkud benevolentněji. Některé mezinárodní instituce jako UNESCO, EURATOM a také Mezinárodní organizace pro molekulární biologii (EMBO) měly v oficiálním Československu určitou prestiž. Prvé dvě instituce vypsaly spolu s italskou CNR řadu stipendií. Jedno z nich jsem obdržel já, v druhé várce pak Zdeněk Neubauer. A tak jsem v roce 1965 nastoupil do Mezinárodní laboratoře genetiky a biofyziky (LIGB) v Neapoli. O obtížích s povolením výjezdu pro manželku a dítě se ra-
CHARAKTERISTIKA SPECIFICKÉ IMUNITNÍ ODPOVĚDI (viz též Vesmír 78, 565, 1999/10 a tabulku na s. 570 tamtéž) n Imunitní systém lidského organizmu se skládá z 1012 lymfocytů, z nichž část cirkuluje v krevním oběhu a část zůstává v lymfatických uzlinách, slezině, slizniční tkáni, kostní dřeni, brzlíku. n Lymfocyty se skládají z řady kategorií, z nichž nejdůležitější jsou B-buňky a T-buňky; první z nich produkují protilátky, druhé dodávaji potvrzující signál k imunitní odpovědi, nebo naopak k tomu, aby jejímu vzniku zabránily. n B-buňka je schopna proliferace (zdvojení zhruba každých 12 hodin) s následnou tvorbou protilátek. Protilátky jsou bílkoviny skládající se ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců, jejich aminokyselinová sekvence má konstantní část (stejnou pro všechny protilátky určité třídy) a variabilní část (pro každou specifitu jinou). Každá B-buňka produkuje zhruba 2000 molekul protilátek za vteřinu, a to řadu dnů, snad i měsíců. Tyto molekuly „vystavuje“ na povrchu jako receptory pro antigen; receptorů (identických) je asi 100 000 na každé buňce. n Všechny molekuly živé hmoty (produkty bakterií, virů, parazitů i vyšších organizmů) i syntetické molekuly lze označit jako antigeny nebo antigenní epitopy. Z hlediska „rozpoznávacích schopností“ organizmu je lze rozdělit na „své“ a „cizí“, přičemž organizmus je tolerantní k „svým“ a reaktivní k „cizím“ antigenům. n Cizí antigen vniknuvší do organizmu je konfrontován s obrovskou různorodostí protilátek, váže se na ty, ke kterým má určitou afinitu (které mají komplementární tvar), a po určitém opracování je způsobilý stimulovat B-buňku, navést ji k rozmnožení, a potom k tvorbě protilátky. Setům rozmnožených buněk se říká „klony B-buněk“. Klonální rozmnožení nastane, když jsou určité peptidické složky antigenu „úspěšně“ vázány na speciální struktury T-buněk, které dodají systému svolení („razítko“) k imunitní odpovědi. n V genomu není uložena informace pro každou specifitu protilátek, ale pro strukturu jednotlivých „genových segmentů“, které pak rekombinací vytvářejí „gen pro protilátku“. Tato specifita vzniká až v somatické buňce, a lymfocyt je tímto mechanizmem k tvorbě příslušné specifity předurčen. Některé buňky zůstanou „popelkou“ sedící v koutě, jiné jsou antigenním stimulem vyzvány ke klonální proliferaci. n Počet, hojnost a jiné kvantitativní vztahy specifických B-buněk a T-buněk lze stanovit „limitním vyředěním buněk“, které je v tomto rozhovoru zmíněno. A právě tato analýza byla vypracována v laboratoři Ivana Lefkovitse. IL
lem byl Adrian Buzzati-Traverso (bratr slavného spisovatele Dina Buzzatiho) spolu s genetikem L. L. Cavallim-Sforzou (později v Pavii, nyní ve Stanfordu). Stálými členy ústavu byli Enrico Calef, Pablo Amati, Mario DiGirolamo, Corrado Baglioni a další. Ústav, jak jsme ho poznali v roce našeho příjezdu, naprosto neodpovídal klišé o Itálii, a klišé o Neapoli už vůbec ne. Moderní ústav, prvotřídně vybavený nejnovějšími přístroji – nejlepšími typy ultracentrifug, inkubátorů, mikroskopů, nemluvě o pipetách, Petriho miskách, kultivačních půdách. Zatímco se v Československu na objednanou chemikálii čekalo léta, pro naši laboratoř byly chemikálie dodány tentýž den. Filiálka firmy Carla Erbyho si otevřela v blízkosti ústavu pobočku i sklad, a chemikálii – třeba jen jednu láhev – přivezli na kole. To vše třicet let před existencí FedEx nebo DHL. V.: Čím jste se hlavně zabývali v neapolské laboratoři? IL: Řeknu vám několika slovy nejprve o svém výzkumu, ale nerad bych to dělal na úkor Zdeňkovy práce, o níž bych v tomto rozhovoru chtěl mluvit především. V.: Jen mluvte, v případě potřeby to redakčně upravíme. IL: Vzhledem k tomu, že z mého skromného seznamu publikací bylo zřejmé, že v pražském Mikrobiologickém ústavu jsem pracoval na regulaci syntézy beta-galaktosidázy, bylo mi navrženo, abych se ve spolupráci s Mariem Di Girolamem věnoval regulaci syntézy ribozomálních proteinů. Tento projekt jsem s nadšením přijal, naučil jsem se spoustu nových metod a získal jsem solidní základy z molekulární biologie. Seznámil jsem se s řadou špičkových vědců, např. s již zmíněným Salvatorem Luriou (a později také s Maxem Delbrückem, ale to bylo v Basileji, asi v roce 1972). Experimentálně jsem izoloval jednotlivé komponenty těch bílkovin, které jsou strukturální součástí mašinérie syntetizující všechny ostatní buněčné bílkoviny. Moje Zleva: Zdeněk Neubauer a Ivan M. Havel, Litomyšl 1999, snímek © Magdalena Tichá
ději ani nebudu zmiňovat. Faktem zůstává, že se výjezd uskutečnil a že stipendisté z Akademie i z Univerzity byli v zmíněné laboratoři vítáni. V.: Zdeněk Neubauer nastoupil do téže laboratoře? IL: Ano, ale on tam přišel o dva roky později, na jaře roku 1967. Tehdy jsem se s ním setkal poprvé. Pamatuji se, že ještě než Zdeněk přijel, ukázal mi člen výběrové komise jeho životopis a zeptal se mne, zda je možné, že uchazeč ovládá řečtinu. Už si nevzpomínám, zda jsem Zdeňka vyzvedl na letišti nebo na nádraží, ale pamatuji si, že neapolské podmínky jízdy autem se mu příliš nezamlouvaly. Když jsem Zdeňkovi vysvětlil, že při nehodě je vinen ten, kdo má nabouraný předek, zeptal se jen pro jistotu (a ptal se na to pak pravidelně): „Máš dobré brzdy?“ Do laboratoře jsme chodili pěšky; jízda nebyla nikdy problémem, ale zaparkování ano. V.: Je známo, že Zdeněk rád jezdí a rychlosti se nebojí. Ale bez dobrých brzd to asi skutečně nešlo. Teď však k té laboratoři. Co to bylo za instituci? IL: Neapolská laboratoř byla tehdy jedním z nejpřednějších a nejprestižnějších pracovišť v oboru biologie a biofyziky v Evropě a začátkem šedesátých let byla hlavním centrem moderního biologického výzkumu. Činnost naší laboratoře byla úzce spjata a koordinována s Mezinárodní organizací pro molekulární biologii (jejíž heidelberská laboratoř byla založena později); byla financována řadou národních i mezinárodních institucí a byla rovněž známá intenzivní výměnou vědeckých pracovníků, stážemi a letními kurzy. Zakládajícím ředitehttp://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, srpen 2001
453
Zdeněk Neubauer, Špičák na Šumavě 2000, snímek © M. Tichá
publikace byla v počátcích často citována, ale pro mě měla „jen“ ten význam, že mi slavný Masayasu Nomura nabídl místo ve své laboratoři v Madisonu ve Wisconsinu. Mimochodem, smlouvu s Nomurou jsem nedodržel a nikdy k němu nenastoupil, protože Jerne mi nabídl stálé místo. S odstupem času vidím svou výzkumnou činnost v Neapoli jako průpravu pro skutečně samostatnou práci ve Frankfurtu a Basileji. A teď o Zdeňkovi. Stal se členem týmu Enrica Calefa, charizmatického vědce, který se do Itálie vrátil z emigrace v Americe. Sice přeskakuji chronologický sled, ale poznamenávám, že Enrico Calef přispěl do sborníku k Zdeňkovým padesátinám; několik let poté, tuším v roce 1996, zemřel. Od roku 1999 je udělována cena Enrika Calefa v oboru biologie. Calef pracoval na genetice bakteriofágu lambda. Bakteriofág je virus, který je schopen infikovat bakterii, uzurpuje celou mašinérii bakteriální buňky, dá příkaz vyprodukovat několik desítek identických dceřiných bakteriofágů, a posléze hostitelské bakteriální buňky zničí. V.: Přičemž uvolněné bakteriofágy jsou pak schopny infikovat další bakterie. IL: Ano, a po „dalším kole“ infekce je už zasažen stonásobný počet bakterií, a výsledně – po několika kolech fágové infekce – je takto zasažena celá bakteriální populace. Jednoznačným vítězem je zde bakteriofág. V dvacátých letech minulého století – dlouho před objevením antibiotik – lékaři i biologové doufali, že by bakteriofágy mohly sehrát úlohu při „likvidaci infekce“ v lidském organizmu. Pokusy tímto směrem neuspěly, ale ve čtyřicátých letech si Max Delbrück uvědomil, že by bakteriofágy mohly být nástrojem i předmětem zkoumání biologických a genetických mechanizmů. Českoslovenští vědci byli s těmito výzkumnými směry dobře obeznámeni, mnoho dobrých originálních prací pochází z pražských, brněnských i bratislavských laboratoří. Řekl jsem, že jednoznačným vítězem je bakteriofág. Jako u každé strategické hry v živé přírodě existuje
454
VESMÍR 80, srpen 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
i zde darwinistická odpověď. V určité části populace bakterií „umírněné“ fágy, z nichž lambda byl nejvíce studován, disponují alternativní strategií či „plánem“. Místo uzurpace hostitelské mašinérie se zabuduje genom fágu do genomu bakterie, a bakterie přežije. Vyplývá z povahy zabudovaného genomu, že každá dceřiná buňka bakterie dědí genom bakteriofága. Fág zabudovaný do bakteriálního genomu má název „profág“, buňce vybavené profágem se říká „lyzogenní“; nejzajímavější na lyzogenní buňce je, že určitými zásahy, například ozářením nebo zahřátím na určitou teplotu, lze profága „probudit“ k samostatnému životu tak, že se vystřihne a začne se množit, zničí hostitelskou buňku a fágy jsou připraveny zasáhnout další bakteriální buňky, a to takové, které nemají lyzogenní vlastnosti. Do této problematiky byl uveden Zdeněk po svém nástupu do Neapole. V.: V čem konkrétně spočívala další Zdeňkova práce? IL: Bylo to studium speciálních vlastností bakteriofágů a jejich schopnosti mutace. Vypracoval způsob měření a pozorování aktivity určitých genů „zakódovaných“ v bakteriofágu. Pokud si pamatuji, v době, kdy začal Zdeněk pracovat v Neapoli, Calef určil místo na genetické mapě, kam se s naprostou přesností „usadí“ fágový genom (a v důsledku toho se stává „profágem“). Tyto dva genetické lokusy (mezi něž se profág včleňuje) se jmenují „gal“ a „bio“. Zdeněk dělal krásnou práci – zabudovával a zase vystřihával profága z hostitelského genomu. Nemohu zde jít do dalších detailů, protože bych musel začít vysvětlovat, že určité zabudování či vystřihnutí vede k tvorbě defektního profága a že při těchto úkonech určité zbytky profága zůstávají v hostitelské sekvenci (dnes je naprosto přesně známa sekvence nukleotidů, které tam zůstávají, my zde však mluvíme o stavu objevů před třiceti lety). Zdeněk pracoval v prostředí, kde se jakýkoli nápad mohl ihned realizovat, schůdné i neschůdné cesty byly okamžitě zjistitelné a vpravo i vlevo byli lidé, se kterými stálo za to diskutovat. Zdeněk popsal dědičné změny nemutačního původu v lambda-bakteriofágu a výsledky publikoval jako hlavní autor v Journal of molecular biology, nejprestižnějším sborníku Cold Spring Harbor laboratory, a v časopise Nature. Když to shrnu do jedné věty, tak mohu s jistotou říct, že Zdeněk – Calefův žák – určil směr vývoje Calefovy laboratoře na mnoho let dopředu. V.: Ty publikované práce měly velký ohlas – jeho práce z roku 1970 byla citována ještě nedávno. Je vzrušující si tento příběh vyslechnout i po třiceti letech. Ale bylo to vše tak bezproblémové, jak to líčíte? IL: Pro takto vymezený rozsah rozhovoru ano. Pečlivě jsem vynechal ty aspekty, které by způsobily, že by náš rozhovor rozbředl. Musel bych vyložit, že existuje lytická a lyzogenní „pathway“, že rozhodování je sice stochastické, ale záleží na složení kultivačního média, například na přítomnosti maltózy, dostal bych se dokonce do obtíží v nomenklatuře, protože „zrádným způsobem“ používám běžnou nomenklaturu „cro a lambda represoru“, přičemž Zdeněk a Calef prioritně navrhli, pokud si pamatuji, označení „ai“. Musel bych vysvětlit, že lambda represor a CRO mají rozličné afinity na tři různé sekvence DNA (vazba pak rozhoduje, zda dojde k lytické, nebo k lyzogenní odpovědi). A musím se přiznat, že další detaily si už ani nepamatuji. V.: Jsem rád, že jste nám Zdeňkovu odbornou stránku takto přiblížil. Mladá generace jej totiž zná spíše jako filozofa než jako experimentujícího biologa. Můžete nám o něm ještě něco říct, něco, co by mohlo sloužit jako most z minulosti do přítomnosti? IL: Mohu snad jen dodat, že Zdeňkův pobyt v Neapoli přetrval můj odjezd (v roce 1967) i moji emigraci do Frankfurtu a Basileje (v říjnu téhož roku). Jeho stipen-
dium bylo prodlouženo a obnoveno i po sovětské okupaci. Dlouho jsem přemýšlel, kdy nastal přerod Neubauera-přírodovědce v Neubauera-filozofa. A neměl bych se vyhnout ani otázce, kdy u něj nastal odklon od racionální přírodovědy k jeho pluralitnímu multisvětu. V.: Nejsem si jist, zda bude nadšen slovem „přerod“. O filozofii se zajímal již dřív, své studium na Filozofické fakultě vlastně dočasně přerušil kvůli Itálii – i tam se vedle práce v laboratoři zabýval filozofií a teologií. O tom, jak jeho filozofické myšlení souvisí s jeho biologickou minulostí, bychom si ho někdy měli vyzpovídat samostatně. Teď bych raději znal váš pohled z perspektivy vědce. IL: Zdeňkovy jazykové znalosti, klasické vzdělání, rychlé porozumění odborným souvislostem mu umožnily, že se stal ihned užitečným a funkčním vědeckým pracovníkem. Zdeněk tvrdí, že jsem mu do jisté míry urovnával cestu, ale to se zdálo jen z jeho pohledu, a to proto, že já jsem tam byl už rok a vše jsem důvěrně znal – v laboratoři i v Neapoli samé. Zdeňkova metamorfóza (tak se aspoň mně, z dnešní perspektivy, jeví jeho vývoj) začala – jako každá metamorfóza – latentně. Když mi Zdeněk vyprávěl o pokusech a jejich interpretaci, počkal chvíli, zda souhlasím, a když jsem přikývl, tak zamyšleně dodal: „Ale to nemůže být celé vysvětlení“ nebo „Je tam ještě něco, do čeho nevidíme“. Pochod či mechanizmus, který se mi zdál jasný, se jemu zdál popsán neúplně, něco scházelo. Často jsme končili diskusi tak, že jsem si uvědomil, že máme rozličné názory. Čím to? Došel jsem k závěru už tehdy a myslím si to i dnes, že Zdeněk viděl dál než já. Já jsem snadno přijímal nové, zatímco Zdeněk to nové reflektoval něčím uvnitř své osobnosti a přetvářel to. Na jednom výletě mi bylo obzvláště jasné, že jeho pohled je v tomto smyslu reflektivní. Obdivoval jsem se panoramatu palem a Zdeněk kontroval poznámkou: „To se přece nedá srovnat s lesy kolem Středozemního moře, vidíš jen kontury palem, ale ty keře pod nimi jsou spálené sluncem.“ Po tolika letech to už nemohu říct s jistotou, ale řekl bych, že jsem sice o jeho studiu filozofie věděl, jeho filozofickou erudici jsem však nebral příliš vážně. Snad už proto, že pro mne jeho přínosem pro vědu bylo něco hmatatelného. Možná, že měl „už“ duši filozofa, ale já jsem se o duši moc nezajímal. V.: Váš výklad je velice zajímavý jako příběh úspěšného vědce s duší filozofa. Umožňuje nám to nahlédnout do dob, kdy ten příběh začal. IL: Řeknu vám myšlenkovou paralelu: V roce 1986 jsem navštívil v Madridu velkou retrospektivní výstavu Salvadora Dalího. Výstava byla velice úspěšná, ale obecenstvo obdivovalo ten styl Dalího-surealisty, který nyní všichni známe jako Dalího styl a který ho (právem) proslavil. O čtrnáct let dříve jsem viděl jeho výstavu v Baden-Badenu, kde jsem se mohl seznámit s Dalího talentem z počátku jeho kariéry. Jeho obrazy z roku 1921 (kdy studoval Art School of Madrid), jeho první samostatná výstava v Dalmauově galerii v Barceloně roku 1925, potom jeho zájem o kubizmus a impresionizmus a pozdější tradiční klasický styl z roku 1937, to vše tam bylo zastoupeno. Pohled na Dalího začátky mi ukázal nejen to, že Dalí zvládl naprosto kompletní paletu malování, ale také že jeho styl je výsledkem dlouhého hledání a předběžného hloubání. V.: Takže tento rozhovor o Zdeňkovi vám připadá jako vzpomínka na výstavu z Baden-Badenu? IL: Rád bych, kdyby tomu tak bylo, ale navodit atmosféru Neapole z roku 1967 se nám nepodaří. Často mi činí potíže vcítit se do tehdejší doby. Těch třicet let je přece jen trochu dlouhá doba. Je jasné, že Zdeněk je příliš svérázná osobnost, než aby mohl vysvětlit nám, čím byl on. Při vší nedokonalosti je moje svě-
dectví míněno jako vstupní portál k Zdeňkovu současnému myšlení. V.: Jak skončil váš pobyt a jak Zdeňkův pobyt v Neapoli? Co se stalo s tamější mezinárodní laboratoří? IL: Ta skončila neslavně. První příznaky jsem pocítil ještě já a po mém odchodu v roce 1967 asi do jisté míry i Zdeněk. Několik dnů po šestidenní válce v Izraeli (1966) za mnou přišel jeden vědecký pracovník a zeptal se mne, na čí straně jsem – zda na izraelské, nebo na arabské. Když jsem řekl, že na straně Izraele, tak mi opovržlivě sdělil, že jsem fašista, a jak to, že jsem na straně Izraele, když moje země – Československo – je na straně Arabů. Nastaly politické neshody, které vyústily ve vytvoření revolučních výborů, obsazení ústavů a do dalších aktivit, nad nimiž se dnes jen usmíváme. Enrico Calef, Pablo Amati, Mario Di Girolamo a mnoho jiných opustili Neapol a byli s otevřenou náručí přijati v Římě (i jinde). V.: A vy jste se stal emigrantem. IL: Z Neapole jsem odešel, v kapse smlouvu k Nomurovi do Wisconsinu. Měl jsem rovněž v pasu novou výjezdní doložku vystavenou československým vyslanectvím v Římě, a tak jsem mohl bez nebezpečí vjet do Československa, a několik týdnů poté vyjet do definitivní emigrace. Ve Frankfurtu jsem měl v úmyslu vyčkat na imigrační vízum do USA a místo v tamním Ústavu Paula Ehrlicha jsem považoval jen za dočasné řešení. A tu mi Jerne, který se rozhodl založit nový ústav v Basileji, nabídl místo vedoucího laboratoře. To už nastalo kratičké pražské jaro, a pak sovětská okupace. Moji rodiče emigrovali, a tak mě Jerneho nabídka zbavila všech starostí o budoucnost. Emigrace pro nás rozhodně nebyla obtížná, ale byla spojena s těžkými obdobími, například když manželčina matka ležela smrtelně nemocná v pražské nemocnici. Manželka byla ochotna postoupit riziko a jet do Československa (1981), ale nepustili ji tam. Tak jsme Československo odepsali a snažili se oprostit od vzpomínek. Těch několika přátel, kteří se k nám hlásili – mezi nimi byl i Zdeněk – jsme si nesmírně cenili. V.: Takže s profesorem Neubauerem jste byli ve styku i během vaší emigrace? IL: Zdeněk ukončil pobyt v Neapoli, jeho kontakt s Enrikem Calefem přetrval, kontakt se mnou udržoval Zdeněk po celá desetiletí mé emigrace a několik jeho dopisů psaných na stroji s červenou páskou na průklepovém papíru mám schovaných dodnes. Zůstaly vzpomínky na zašlé časy, vzpomínky, jež nám trochu přiblíží našeho oslavence v prostředí, které bylo svědkem našich začátků. V.: Zdeňku Neubauerovi bude letos udělena cena Nadace VIZE 97. Byl jste požádán, abyste se zúčastnil slavnostního předání ceny, takže budete mít příležitost se s ním osobně setkat. O čem byste s ním hovořil nejraději? IL: Chci se Zdeňkem probrat svou domněnku (na kterou neexistuje objektivní odpověď, takže se musím spolehnout jen na to, co mi Zdeněk řekne), že kdyby Zdeněk byl emigroval a přešel s Calefem do Říma, zůstal by u bakteriofágů, represorů, permisivních teplot, regulačních genů, že by totiž (používám Zdeňkův jazyk) k bifurkační alternativě vůbec nedošlo a jeho filozofické nadání by zůstalo tak trochu reprimované. O dalších diskusních tématech vám neřeknu, protože Zdeněk bude jistě tenhle rozhovor číst, a tím by pak naše „hádání“ (ať už o mystice a symbolech, nebo o alchymii a indiánských motivech vetkaných do koberců) nebylo spontánní. V.: Dobrá, počkáme. Pak budeme, doufám, v tomto rozhovoru pokračovat. Mockrát za něj jménem čtenářů Vesmíru děkuji. ¨ http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, srpen 2001
455
O nepsaných pravidlech, (epigenetické) paměti a (lidském) zapomínání
a
Zdeňkovi Neubauerovi FATIMA CVRČKOVÁ
Molekulární genetika je, jako experimentální obory vědy vůbec, naukou o obecném, reprodukovatelném a spolehlivém. Veškerá osobitost, proměnlivost, rozmanitost a libovůle, k níž mají živí tvorové přirozený sklon prostě proto, že jsou živí, je vnímána jako faktor v lepším případě zanedbatelný, v horším přímo rušivý. Výzkum se soustřeďuje především na pečlivě vybrané modelové organizmy, vyšlechtěné k tomu, aby se chovaly za stejných podmínek všechny stejně, standardně a reprodukovatelně. Opatrnost pak diktuje jedno z nepsaných základních pravidel experimentální genetické práce: chová-li se část zkoumaného systému v každém pokusu jinak, je lépe jej zahodit než se s ním zahazovat. Ne že by takový systém nemohl být zcela legitimním předmětem zkoumání – prostě s sebou nese zvýšené riziko, že se nedostaví výsledky a nebudou publikace, což může být pro vědcovu kariéru osudné. S nestabilním systémem ale snadno zahodíme i šanci objevit ve zdánlivé nepravidelnosti pořádek, který stojí za další zkoumání a který může vypovídat o něčem důležitém, co by se jinak dalo sotva tušit. Nedbat nepsaných pravidel je však nebezpečné. Badatel, který rozhoduje mezi „zahozením“ a „zahazováním se“, volí zároveň mezi jistotou zavedené univerzitní existence a dobrodružstvím setkávání s neznámem. Útěchu snad lze nalézt ve skutečnosti, že rozhodování, ve kterém jsou v sázce jen budoucí publikace, je pouhou malicherností ve srovnání se situacemi, v nichž jde doslova o život. Ne, nehodlám zde moralizovat a připomínat drastické příběhy z dějin či současnosti lidstva. Životně důležitá rozhodnutí totiž nečiníme jen my: není snad každé zapnutí či vypnutí genu, na jehož činnosti závisí budoucí osud buňky, také svého druhu volbou, která může mít dalekosáhlé důsledky? To, jak důležitá rozhodnutí se mohou odehrávat na úrovni řízení aktivity genů, lze ilustrovat klasickým učebnicovým příkladem, jehož „hrdinkou“ je ochočená střevní bakterie Escherichia coli a virus, který na ní parazituje. Dnes se s E. coli můžeme setkat na pracovním stole kteréhokoli molekulárního biologa, jenž se zabývá genovým inženýrstvím a buňky této bakterie používá jako nenáročné a poměrně spolehlivé „živé zkumavky“ k uchovávání a pomnožování kousků DNA či k přípravě proteinů. Pověstná spolehlivost E. coli je ale výsledkem dlouholeté usilovné selekce kmenů a optimalizace pod-
456
VESMÍR 80, srpen 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
b
DNA bakterie DNA fága 1. Lytická (a) a lyzogenní (b) infekce bakteriofágem l. Zatímco při lytické infekci je aktivována většina fágových genů odpovědných za replikaci genomu fága a tvorbu proteinového obalu fágových částic, v lyzogenně infikované buňce se exprimuje pouze jediný gen, kódující fágový represor CI.
mínek. Za jiných okolností a v jiném experimentálním uspořádání se naše bakterie chová jako plnohodnotný živý tvor se vším všudy – včetně toho, že může „onemocnět“, tedy být parazitována viry, které se označují jako bakteriofágy či prostě fágy. Napadení bakteriální kultury fágem se v nejjednodušším případě projevuje tak, že infikované bakterie zahynou a rozpadnou se za současného uvolnění velkého počtu nových fágových částic, které infikují další bakterie (obr. 1). Protože postižené bakterie hynou a rozpadají se (lyzují), hovoříme o lytické infekci fágem. Některé fágy, například bakteriofág lambda (l), však hostitelské bakterie zabíjejí jen někdy. Kromě lytické infekce mohou totiž vyvolat i infekci lyzogenní – místo toho, aby se fág pomnožil a zároveň zničil hostitele, zabuduje svůj genom do hostitelského a tiše přetrvává v latentním stavu jako profág. Může se přitom „probudit“ zpět do lytického stavu. To se stává zejména v případě, že hostitelská bakterie byla nějak poškozena, třeba ozářením ultrafialovým světlem (lze snadno nahlédnout, že probuzení profága v poškozené a možná umírající bakterii je záležitostí veskrze adaptivní). Z hlediska fága je lyzogenní stav docela dobrým prostředkem jak si zajistit přetrvání a pomnožení téměř bez námahy s vyráběním fágových proteinů. Z celého profága l
je aktivní pouze jediný gen, jehož proteinový produkt – represor CI – aktivuje svůj vlastní gen a současně udržuje všechny ostatní fágové geny ve „vypnutém“ stavu. I pro bakterii je výhodné vydržovat si profága – poměrně malá zátěž plynoucí z produkce jednoho fágového proteinu je více než kompenzována tím, že lyzogenní bakterie je imunní vůči lytické infekci stejným fágem. Fág, jenž právě infikoval „čistou“ buňku E. coli, se tedy rozhoduje mezi dvěma životními strategiemi, které se vzájemně vylučují: buď zapne gen pro represor CI a stane se profágem v lyzogenní buňce, anebo zapne gen pro antirepresor kódovaný genem ai/cro, který zabrání aktivaci genu CI a umožní spuštění kaskády genů potřebných pro úspěšný průběh lytického životního cyklu, zabití hostitele a pomnožení fága (obr. 2).*) Klíčovou roli v tomto rozhodování hraje specifická sekvence DNA, která je schopna vázat jak represor, tak antirepresor. Podle toho, který z proteinů obsadí toto regulační místo, zapne se buď CI (bakterie se stane lyzogenní), nebo ai/cro (fág se pomnoží a bakterie zahyne). Do poměru koncentrací CI a ai/cro se promítá řada faktorů – například fyziologické nastavení hostitelských buněk a jejich zdravotní stav či počet fágových částic, které bakterii infikovaly. Tento „genetický přepínač“ s dvěma regulačními stavy se stal přímo prototypem buněčného rozhodovacího mechanizmu schopného integrovat a vyhodnocovat řadu různorodých vstupů; v nějaké podobě na něj narazíme téměř v každé učebnici molekulární genetiky. Méně často však už se učebnice zabývají tím, jak se na celou záležitost přišlo. Je to škoda – nejen pro ty z nás, kteří mají v lásce a úctě Zdeňka Neubauera, jehož práce z přelomu 60. a 70. let byly zcela zásadní pro identifikaci antirepresoru a pochopení funkce „genetického přepínače“ (viz zejména Neubauer, Nature 213, 1263, 1967; Calef a Neubauer, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 23, 765, 1968; Oppenheim, Neubauer a Calef, Nature 226, 31, 1970; Neubauer a Calef, J. Mol. Biol. 51, 1, 1970, Hampacherová, Koutecká a Neubauer, Genetics 120, 133, 1973). V učebnicích totiž bývají klasické experimenty popisovány většinou jen tehdy, když jsou jednoduché, dají se shrnout na půl stránky a jeden obrázek ...a neuvádějí v pochybnost nepsaná pravidla řemesla. Ani jedno z toho naneštěstí o dotyčných pokusech neplatí, a proto se čtenáři učebnic musí spokojit se suchým shrnutím výsledků. Zůstanou sice ušetřeni metodických detailů a komplikované terminologie fágových mutantů, ale také úžasu, který se zmocňuje autorky těchto řádků při zjištění, jak to vlastně bylo. Na začátku byla příprava speciálního kmene lyzogenních bakterií s poškozeným represorem CI, který ve zvýšené teplotě přestává fungovat. Profág by tedy měl přejít do lytické fáze životního cyklu a zahubit hostitelské buňky za současného pomnožení fága. Dodatečnou mutací fágového genu nutného pro první kroky lytické fáze však lze množení fága a lyzi buněk zabránit. Bakterie pak přežívají pobyt ve vysoké teplotě, který by indukoval lytické množení fága – a můžeme na nich studovat otázku, která by za normálních okolností neměla smysl: jsou buňky po neúspěšné indukci lytické fáze imunní vůči další infekci? Odpověď se ukázala být přímo šokující: záleží na okolnostech. Po několika generacích bez funkčního represoru buňky ztrácejí imunitu, a dokonce získávají jistou predispozici k lytickému průběhu infekce – a neimunní stav se může dlouhodobě (dědičně) udržovat. Dnes víme, že je to pro-
imunita
2. Úloha genů CI a ai/cro v rozhodování mezi lytickým a lyzogenním cyklem
CI
Cro
lytické funkce
to, že si bakterie stačily vytvořit antirepresor, a ten obsadil vazebná místa pro represor. V populaci neimunních bakterií se však záhy spontánně objevuje několikaprocentní frakce buněk s obnovenou imunitou. Nejsou to mutanti: při dlouhodobém udržování v kultuře produkují tyto imunní klony naopak malou frakci buněk neimunních, a podobně jako výchozí kulturu je můžeme zbavit imunity vystavením zvýšené teplotě. (Při současných znalostech je pozoruhodná nestabilita defektních lyzogenů pochopitelná – stačí si uvědomit, že o osudu buňky rozhoduje doslova několik molekul, a tudíž se občas stává, že některá buňka při dělení podědí příliš málo represoru či antirepresoru). Celý postup lze po libosti opakovat, bakteriální kultura jako by procházela jakýmsi fázovým přeskokem mezi dvěma regulačními stavy. Právě objev dvou stabilních regulačních stavů jistých mutantů fága l byl jedním z prvních kroků k popisu „genového přepínače“ CI – ai/cro. Zároveň však jde o zjištění podstatně obecnějšího a velice zásadního dopadu: totiž o to, že dědičná paměť organizmu může být „zapsána“ i epigeneticky – to jest jinde než v posloupnosti nukleotidů DNA. Regulační stavy genů se mohou dědit přes mnoho generací stejně jako geny samy. Jde však o zásadně, kvalitativně jiný druh paměti, plastičtější, než je „tvrdá“ paměť zapsaná v sekvencích DNA. Proto se to také tak těžko studuje: není snad lepší příklad systému, který je radno zahodit, abychom se s ním nezahazovali, než populace bakterií, která neustále odštěpuje buňky odlišných vlastností! Nechce se mi věřit, že by na přelomu let šedesátých a sedmdesátých, kdy Zdeněk Neubauer v Calefově laboratoři v Neapoli, a posléze na katedře genetiky a mikrobiologie pražské Přírodovědecké fakulty studoval fágy, býval vědecký svět nějak zásadně jiný než ten náš dnešní. Volba mezi „zahozením“ a „zahazováním se“ byla zajisté už tehdy rozhodováním mezi snad trochu nudnou, ale bezpečnou jistotou na jedné straně – a nádherným, byť i riskantním dobrodružstvím poznání na straně druhé. Jak Zdeňka znám, jistě dlouho neváhal. Koneckonců i jeho pozdější rozhodnutí věnovat se naplno filozofii bylo podobným krokem do temného neznáma, kde ani největší optimista tehdy nemohl tušit budoucí profesuru. Samozřejmě mohlo být i jinak. Ale to by vlastně nebylo proč psát... ¨ *) V současné literatuře se používá převážně označení cro, zavedené M. Ptashnem v souvislosti s klonováním příslušného genu. Funkce antirepresoru však byla objevena již dříve Z. Neubauerem a E. Calefem, kteří pro příslušný gen navrhli označení ai (antiimmunity).
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, srpen 2001
457
