3D migratie van immuuncellen in vitro: invloed van intracellulaire en extracellulaire factoren

3D migratie van immuuncellen in vitro: invloed van intracellulaire en extracellulaire factoren

Jelle Libbrecht

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Christophe Ampe Begeleider: Dr. Marleen Van Troys Vakgroep Eiwitchemie Academiejaar 2012-2013


Jelle Libbrecht



“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student)

(Naam student)

(handtekening promotor)

(Naam promotor)

Voorwoord Ik wil van dit voorwoord gebruik maken om de mensen te bedanken zonder wie deze thesis niet was mogelijk geweest. Eerst en vooral wil ik Prof. Dr. Ampe bedanken zonder wie ik deze thesis niet had kunnen aanvangen. Ik heb veel geleerd van zijn ervaring in de academische wereld zowel op wetenschappelijk als politiek vlak. Ik wil ook Davy bedanken die mij in het laboratorium de kneepjes van het vak leerde kennen. Daarnaast wil ik ook Stefano, Davina en Karima bedanken. Ik kon ook bij hun steeds terecht met vragen. Ik wil ook zeker Prof Van Troys bedanken die mij gedurende mijn hele jaar heeft bijgestaan. Haar brede kennis en inzicht is van onmiskenbaar belang geweest voor dit project. Ze kon mij steeds opnieuw motiveren ook als de resultaten even uitbleven. De laatste weken gingen plots enorm snel voorbij en ik kan je niet genoeg bedanken voor de tijd die je voor mij opofferde! Daarnaast wil ook An Staes bedanken voor de hulp met de massaspectrometrie. Ik wil ook de mensen bedanken die mij buiten het lab hebben gesteund. De avondjes uit met mijn geweldige medestudenten en mijn vrienden thuis in Waregem waren soms een nodige ontsnapping aan het werk. Tenslotte wil ik mijn ouders, mijn zus en mijn vriendin bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun gedurende mijn hele opleiding.

Inhoudstafel Samenvatting .............................................................................................................................. 1 1

Inleiding ............................................................................................................................. 2 1.1

2

Types van celmigratie .................................................................................................. 2

1.1.1

Mesenchymale migratie in een 3D-matrix ........................................................... 3

1.1.2

Amoeboïdale migratie .......................................................................................... 4

1.2

De dynamica van actinefilamentenstructuren: essentieel in celmigratie ..................... 5

1.3

Extracellulaire factoren bepalen het migratietype ....................................................... 6

1.4

Intracellulaire factoren bepalen het migratietype: focus op Rho-GTPasen ................. 7

1.5

Immuuncelmigratie in vivo .......................................................................................... 9

1.6

In vitro celmigratietesten: state of the art .................................................................... 9

1.7

Modelsysteem: muis Ba/F3 B-cellen met expressie van Bcr-Abl chimeren ............. 11

1.8

Doelstelling ................................................................................................................ 12

Materialen en Methoden ................................................................................................... 14 2.1

Migratie-analyse in een 3D matrix ............................................................................ 14

2.1.2 Videomicroscopie en data-analyse .......................................................................... 14 2.2

ECM matrixbereiding ................................................................................................ 14

2.3

Celkweek en celmanipulaties .................................................................................... 15

2.3.1

Cellen: Opstarten van een celcultuur ................................................................. 15

2.3.2

Cellen tellen en oogsten ..................................................................................... 15

2.3.3

Invriezen van celstocks ...................................................................................... 16

2.3.4

Isotoopmerking voor massaspectrometrie .......................................................... 16

2.4

Kwantitatieve real time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)............................. 16

2.4.1

Primerdesign ....................................................................................................... 16

2.4.2

RNA isolatie en cDNA synthese uit Ba/F3 celpellets ........................................ 17

2.4.3

RT-qPCR meting ................................................................................................ 17

2.4.4

DNA-agarosegelelektroforese ............................................................................ 18

2.4.5

Selectie van huishoudgenen ............................................................................... 18

2.4.6

Bepaling van primerefficiënties ......................................................................... 18

2.4.7

Relatieve kwantificatie van transcriptieniveau .................................................. 18

2.5 3

Western Blotting ........................................................................................................ 19

Resultaten ......................................................................................................................... 20 3.1

Ontwikkeling van celmigratietest in 3D-matrix voor motiele leukocyten:

getransformeerde Ba/F3 cellen als modelsysteem ............................................................... 20 3.1.1

Aanpassing van de experimentele opstelling ..................................................... 21

3.1.2

Optimalisatie van instellingen bij automatische beeldverwerking: ‘cell-tracking’ 22

3.1.3

Invloed van verschillen in experimentele opstelling op migratiesnelheid ......... 24

3.1.4

Opschalen van experimentele opstelling van 96- naar 48-multiwell plaat ........ 26

3.1.5

Validatie van de geoptimaliseerde migratietest voor suspensiecellen ............... 27

3.1.5.1

Invloed van Rock inhibitie op migratiesnelheid ............................................. 28

3.1.5.2

Invloed van variatie in matrixdensiteit op migratiesnelheid........................... 29

3.1.5.3

Vergelijking van de Ba/F3 cellijnen ............................................................... 31

3.2

Intracellulaire signalisatie in Bcr-Abl Ba/F3-cellen: focus op regulatoren van

RhoGTPasen......................................................................................................................... 32 3.2.1

Geselecteerde doelwitgenen ............................................................................... 32

3.2.2

Kwantitatieve real time polymerase chain reactie (RT-qPCR) .......................... 33

3.2.2.1

Primersets van doelwitgenen voor RT-qPCR ................................................. 33

3.2.2.2

mRNA concentratie ........................................................................................ 33

3.2.2.3

Selectie van huishoudgenen............................................................................ 34

3.2.2.4

Bepalen van primerefficiënties ....................................................................... 34

3.2.2.5

Kwaliteitscontrole van RT-qPCR reacties ...................................................... 35

3.2.2.6

Bepalen van de transcriptniveaus van de doelgenen van interesse................. 36

3.2.3

Kwantificatie op eiwitniveau: Western Blotting ................................................ 38

3.3 4

Proteoomanalyse van de Ba/F3 cellijnen ................................................................... 38

Bespreking ........................................................................................................................ 42 4.1

Ontwikkeling van celmigratietest voor niet-adherent cellen in 3D-matrix ............... 42

4.1.1

Doorgevoerde aanpassingen in experimentele opstelling .................................. 42

4.1.2

Validatie van de ontwikkelde migratietest ......................................................... 43

4.1.3

Status en perspectieven ...................................................................................... 44

4.2

Inzicht in de moleculaire basis van de fenotypes van de bcr-abl getransformeerde

Ba/F3 cellen .......................................................................................................................... 45 4.2.1

Kwantificatie van transcriptniveaus van Rho-GTPase regulatoren ................... 45

4.2.2

Differentiële proteoomanalyse van de bcr-abl Ba/F3 cellijnen .......................... 46

5

Referenties ........................................................................................................................ 48

6

Addenda .............................................................................................................................. I 6.1

Addendum 1 ................................................................................................................. I

6.2

Addendum 2 ............................................................................................................... V

6.3

Addendum 3 .............................................................................................................. VI

6.4

Addendum 4 .............................................................................................................VII

6.5

Addendum 5 ................................................................................................................. i

6.6

Cd-rom: ....................................................................................................................... xi

Samenvatting Celmigratie is een essentieel proces voor talrijke functies in het menselijke lichaam. In ons afweersysteem is celmigratie nodig voor de maturatie, activatie en effectorfunctie van immuuncellen. Ontspoorde regulatie van dit proces kan in leukemie leiden tot metastase en een slechte prognose. Het is daarom interessant te beschikken over een platform dat de in vivo situatie zo goed mogelijk benaderd waarmee factoren die een rol spelen in migratie kunnen geïdentificeerd en functioneel onderzocht worden. Voor minder-adherente cellijnen ontbreekt een in vitro migratietest waarmee simultaan meerdere condities kunnen worden vergeleken, grote celpopulaties kunnen gevolgd worden en tegelijk ook kinetische info over migratie wordt verkregen. Een eerste doel in deze thesis was de ontwikkeling van een dergelijk systeem. Het resultaat is een prototype migratietest waarbij geopteerd werd om de suspensiecellen in een dunne matrix (collageen of Matrigel) in te bedden tussen een bodem- en toplaag van dezelfde matrix. Cellen in 18 verschillende condities worden simultaan getest in deze opstelling. Via ‘time-lapse’ microscopie wordt celmigratie in de 3D-matrix gevolgd. Optimalisatie van automatische beeldverwerking met CELLMIA software levert de celcoördinaten in functie van de tijd, waaruit migratiesnelheden worden berekend. Binnen dit werk werd aangetoond dat gerapporteerde effecten op migratie door wijziging van de matrixeigenschappen of een beïnvloeden van intracellulaire signalisatie, met deze test gedetecteerd worden. Dit bewijst de bruikbaarheid van de test, zeker na de geplande verdere standaardisatie van het protocol. De migratietest werd ontwikkeld met bcr-abl getransformeerde Ba/F3 cellen, van oorsprong muis B-cellen. Door bcr-abl expressie vertonen de cellen spontane motiliteit. We maakten gebruik van drie varianten: p190bcr-abl (en de controlecellijn p210mbcr-abl) en p210bcr-abl expresserende Ba/F3 cellen die verschillende migratietypes vertonen: ze migreren respectievelijk mesenchymaal en amoeboïdaal. Er is weinig gekend over de intracellulaire signalisatie die aanleiding geeft tot deze twee migratietypes. Parallel met de technologieontwikkeling werden voor eiwitten, geselecteerd op basis van micro-array data en een literatuurstudie, de transcriptieniveaus gekwantificeerd met RT-qPCR. De Rac1 regulatoren Tiam1 en Arhgap31 vertoonden verschillende expressieniveaus tussen de Ba/F3 cellijnen: deze zijn potentieel belangrijk in determinatie van de migratietypes. Ten slotte werd ook een proteoomanalyse uitgevoerd van de Ba/F3 cellijnen om meer informatie te verzamelen over moleculaire basis van hun verschillende eigenschappen. Er is voornamelijk significante verandering in expressie van eiwitten betrokken in celgroei en proliferatie, en celdood en overleving in p190 en p210m. Opregulatie is het meest uitgesproken voor het protease granzyme B. Dit eiwit speelt mogelijk een rol in matrixdegradatie, een functie typisch voor mesenchymaal migrerende cellen. Hiermee is een interessant doelwitgen geïdentificeerd voor verder onderzoek. De massaspectrometrie data leveren interessante eiwitten voor verdere studie.

1

1

Inleiding

Celmigratie is een essentieel proces doorheen het leven van de mens en andere organismen. Reeds bij embryogenese is het gecoördineerd bewegen van cellen essentieel voor de gastrulatie en uiteindelijk voor de vorming van gespecialiseerde weefsels (1). Na de geboorte blijven migrerende cellen van groot belang voor processen als wondheling en de werking van het immuunsysteem (2, 3). Celmigratie en chemotaxis, migratie geïnitieerd door een chemische gradiënt, zijn strikt gereguleerde processen en wanneer deze regulatie faalt kan dit nefaste gevolgen hebben. Celmigratie is pathologisch het meest significant in kanker waar cellen de mogelijkheid kunnen verkrijgen om ongecontroleerd te migreren en andere weefsels te invaderen. Het begrijpen en onderdrukken van deze metastaserende kankercellen is de drijfveer voor intensief onderzoek naar de mechanismen van celmigratie (4). Er werden verschillende testen ontwikkeld om celmigratie te bestuderen en doorgaans werden hierbij cellen uitgezaaid op een 2D substraat. Hoewel dit fundamentele inzichten in de (moleculaire) mechanismen van cellulaire motiliteit opleverde, zijn testen in een 2D omgeving een beperkte nabootsing van de in vivo situatie waar cellen meestal ingebed zijn in de extracellulaire matrix (ECM). Om deze complexe migratieprocessen te bestuderen, werden testen ontwikkeld waar cellen in contact zijn met een artificiële 3D matrix. Deze thesis is opgebouwd rond migratie van een immuuncelmodel. Door een inherent lage substraatadhesie gekoppeld aan een hoge migratiesnelheid, hebben studies met leukocyten een pioniersrol vervuld in de ontwikkeling van 3D-migratietesten (o.a. de ‘Boyden Chamber’ en andere ‘chemotaxis chambers’, methodes voor softwarematig volgen, ‘tracking’, van celtrajecten in 3D) (5-8). De meest recent ontwikkelde technieken (twee- en multifotonmicroscopie) laten toe in vivo immuuncelmigratie in beeld te brengen op verschillende locaties in modelorganismen (thymus, lymfeknopen) (9), maar dit valt buiten het bestek van deze thesis. In deze inleiding worden eerst algemene mechanismen van celmigratie in een 3D-omgeving en cellulaire en extracellulaire factoren die deze beïnvloeden besproken. Daarna wordt, gezien de focus van deze thesis, migratie bij leukocyten kort besproken en worden vaak gebruikte migratietesten beschreven. Tenslotte worden de migratie-eigenschappen van het leukemie-Bcell modelsysteem dat bestudeerd werd in deze thesis, ingeleid.

1.1 Types van celmigratie Celmigratie is een complex proces waarbij een verscheidenheid aan factoren mee bepalen op welke manier en met welke efficiëntie cellen zich verplaatsen. We focussen hier op de beweging van individuele cellen in een 3D-matrix, waarbij verschillende types van 2

celmigratie kunnen worden onderscheiden. 3D-mesenchymale en amoeboïdale migratie worden doorgaans gezien als twee extremen in dit migratiespectrum. Ze verschillen voornamelijk in cel-matrixadhesie, krachtgeneratie en cytoskeletdynamiek (figuur 1) (10). Het type migratie dat een cel vertoont wordt bepaald door de inherente eigenschappen van de cel en door de omgeving en is vaak heterogeen: het kan eigenschappen van zowel mesenchymale als amoeboïdale migratie bevatten. Bovendien is voor sommige (kanker)cellen aangetoond dat ze door wijzigingen in de omgeving kunnen overgaan van het ene naar het andere migratietype (bijv. mesenchymale-amoeboïdale transitie, MAT) (7, 8). Beide migratietypes vertonen dezelfde onderliggende fasen. Eerst is er polarisatie van de cel waarbij bepaald wordt in welke richting de cel zal migreren. Daarna ontstaat er (een) protrusie(s) van de celmembraan aan de voorkant van de cel, pseudopodia of ‘blebs’ afhankelijk van het type migratie. Dergelijke celprotrusies ontstaan door wijzigingen in het microfilamentcytoskelet dat bestaat uit actinefilamenten (zie § 1.2). Om het cellichaam in de richting van de protrusie te bewegen moet kracht worden gegenereerd (zie lager). Tenslotte wordt de achterzijde van de cel bijgetrokken (10, 11). Dit wordt voor mesenchymale en voor amoeboidale migratie verder in detail besproken.

Figuur 1: De twee extreme migratietypes van individuele cellen in een 3D matrix: (blebbing) amoeboïdale (a) vs mesenchymale (b) migratie. Toelichting zie 1.1.1 en 1.1.2, Figuur aangepast van Friedl, 2004 (10)

1.1.1 Mesenchymale migratie in een 3D-matrix Mesenchymaal migrerende cellen zijn in nauw contact met de ECM en zijn hierdoor uitgespreid of geëlongeerd. De cel-matrixcontacten ontstaan door clustering van integrines en vorming van multimoleculaire complexen, focale adhesies genaamd. Integrines zijn transmembranaire receptoren die enerzijds ECM-moleculen binden en anderzijds signaleren naar het cytoplasma. Na polarisatie van de cel door bijvoorbeeld een gradiënt van een chemokine wordt een pseudopodium gevormd, dat - door het netwerk en de dynamica van de erin aanwezige actinefilamenten (zie § 1.2) - uitstulpt en nieuwe cel-matrixadhesies vormt met de omgeving. Matrix metalloproteïnases worden naar deze adhesies gerekruteerd en daar geactiveerd om lokaal de ECM af te breken en een migratiepad vrij te maken. Door de 3

adhesies kan het cellichaam zich verplaatsen naar de pseudopodia (zoals protrusieve actinefilamentrijke bredere membraanuitstulpingen algemeen in 3D migratie worden genoemd) door contracties van intracellulaire contractiele structuren of ‘stress fibres’. Deze structuren zijn opgebouwd uit actine- en myosinefilamenten die verankerd zijn in de celsubstraatcontacten (bijv. focale adhesies (zie § 1.2)). De achterzijde van de cel wordt vervolgens bijgetrokken in de richting van beweging door afbraak van resterende adhesies en opnieuw contractie. De meest kenmerkende eigenschappen van mesenchymale migratie in 3D is de aanwezigheid van sterkere substraatcontacten en proteolyse van de ECM. Indien er geïnterfereerd wordt met deze processen is er een afname van migratiesnelheid en soms zelfs overgang naar amoeboïdale migratie. De migratiesnelheid wordt beperkt door de substraatadhesies en kan 0.1–2 µm/min bedragen in vitro. De term mesenchymale migratie werd oorspronkelijk beschreven voor migratie van adherente cellen op een rigide 2Dsubstraat: deze vertoont een groter aantal en meer mature focale adhesies en meer prominent aanwezige ‘stress fibers’, die vaak het volledige cellichaam overspannen. Mesenchymale migratie in 2D is bijgevolg ook trager dan in 3D (10, 12, 13).

1.1.2 Amoeboïdale migratie Amoeboïdale migratie is vernoemd naar de beweging van amoebes, zoals Dictyostelium discoideum, een eencellig organisme dat op gelijkaardige manier beweegt. Algemeen wordt aangenomen dat amoeboïdaal bewegende cellen geen focale adhesies vormen met de matrix door afwezigheid van integrine clustering. Er worden weinig en slechts transiente cel-matrix adhesies gevormd waardoor de cellen rond van vorm zijn en snelheden tot 10 µm/min kunnen bereiken (14). Amoeboïdale migratie kan worden opgedeeld in ‘blebby’ of pseudopodale amoeboïdale migratie. Beide worden geïnitieerd door polarisatie waarna er bij ‘blebby’ migratie ‘blebbing’ ontstaat aan de voorkant van de cel. Hierbij is de celmembraan losgekoppeld van het onderliggend cytoskelet en ontstaat uitpuiling van de membraan door hydrostatische druk gegenereerd door contracties van de perifere actinecortex (zie § 1.2). Bij pseudopodale

migratie

ontstaan

pseudopodia

zoals

bij

mesenchymale

migratie,

membraanuitstulpingen die – in tegenstelling tot’ blebs’ – gevuld zijn met actinefilamenten die op een karakteristieke wijze georganiseerd zijn (zie §1.2). Bij pseudopodale amoeboïde migratie vormen deze protrusies slechts zwakke cel-matrix contacten die niet evolueren tot focale adhesies. Hierdoor worden geen ‘stress fibers’ gevormd (zie § 1.2). Enkel het corticale actinenetwerk aan de binnenkant van de celmembraan zorgt hier voor de krachtgeneratie, trekt het cellichaam samen en stuwt de celinhoud naar de protrusies. In tegenstelling tot 4

mesenchymale migratie, waar ‘stress fibres’ enkel kracht bundelen in het voorste en achterste uiteinde van de spoelvormige cel, wordt door de actinecortex de vorm van de hele cel gecontroleerd. Zo gebeurt migratie hier onafhankelijk van proteolyse van de ECM en past de cel zich aan de beschikbare ruimte aan (10, 11, 15).

1.2 De dynamica van actinefilamentenstructuren: essentieel in celmigratie Net als de mens beschikt ook de cel over een structuur voor ondersteuning en beweging van het cellichaam. Dit cytoskelet is opgebouwd uit drie soorten elementen: microtubuli, intermediaire filamenten en microfilamenten. Het zijn dynamische structuren die zich door continue afbraak en opbouw aanpassen aan veranderende omstandigheden. Microfilamenten, die een hoofdrol spelen in celmigratie, zijn opgebouwd uit actinemonomeren en worden ook filamenteus actine (F-actine) genoemd. Actinefilamenten zijn gepolariseerd en hebben een snelgroeiend en traaggroeiend eind. Bij de in de cel beschikbare actinemonomeerconcentraties, zullen actinemonomeren eerder aan het snelgroeiend eind binden terwijl aan het traaggroeiend eind vooral dissociatie gebeurt. Afhankelijk van interacties met actinebindende eiwitten, die deze dynamiek beïnvloeden, worden verschillende structuren gevormd en specifiek gelokaliseerd in de cel (16). Verschillen in actinecytoskeletorganisatie en -regulatie door actinebindende eiwitten liggen aan de basis van de mesenchymale en amoeboïdale migratie. Voor mesenchymale migratie zijn bijvoorbeeld pseudopodia, filopodia en stressvezels vereist (figuur 2).

Figuur 2: Cellulaire organisatie van actinefilamenten (dubbelhelices) en actinebindende eiwitten. A: pseudopodia (lamellipodia in cellen op 2D) bevatten een vertakt actinefilamentnetwerk met ARP2/3 complex dat vertakkingen initieert (blauw). B: filopodia bevatten actinefilamenten gebundeld door onder andere fascine (groen). C: De actinecortex bestaat uit een niet-gealigneerd netwerk met onder meer de filament-crosslinker filamine. D: Stressvezels zijn contractiele actinefilamentbundels door interactie met myosine II. Pijlen geven de richting van de weerstand aan die filamenten ondervinden (17).

Filopodia (figuur 2b) zijn fijne membraanuitstulpingen die de omgeving van de cel aftasten en een belangrijke rol spelen in chemotaxis en adhesie (18). Pseudopodia (figuur 2a), staan in voor de propulsie van de celmembraan en bepalen mee de richting en snelheid van migratie. Beide structuren ontstaan door elongatie van actinefilamenten georganiseerd met het 5

snelgroeiend eind naar de membraan toe (19). Stressvezels (figuur 2d) zijn associaties van actine- en myosinefilamenten in niet-spiercellen. Ze staan in voor celadhesie waarbij ze continu contraheren en ze trekken de cel ook vooruit tijdens migratie. Hiervoor zijn focale adhesies nodig en een matrix met voldoende rigiditeit. Stressvezels zijn essentieel voor mesenchymale migratie als verankeringspunten waaraan de cel zich vooruit trekt (20). Zoals hoger vermeld zijn bij amoeboïdale migratie geen focale adhesies en stressvezels aanwezig. ‘Blebs’ en de actinecortex zijn hier de belangrijkste spelers voor migratie. De cel kan zich niet vooruit trekken en beweegt zich voort door contractie van de actinecortex (figuur 2c), een netwerk van niet-gealigneerde actinefilamenten dat vastgehecht is aan de binnenkant van de celmembraan. Deze contractie stuwt de celinhoud in de richting van de ‘blebs’. Er worden ook contractieringen gevormd wanneer de cel zich door openingen moet wringen met een diameter kleiner dan die van de cel (21). Voor mesenchymale migratie en lokaal in pseudopodale amoeboïde cellen wordt de actinecortex omgevormd tot een protrusief netwerk door vorming van filopodia en pseudopodia.

1.3 Extracellulaire factoren bepalen het migratietype Zoals reeds eerder werd aangegeven kunnen cellen afhankelijk van hun inherente eigenschappen en door stimuli uit de omgeving hun migratietype aanpassen. Dit samenspel tussen intracellulaire en extracellulaire determinanten werd door Friedl et al samengebracht in een geïntegreerd model, het ‘multi-scaling’ model (11). Hieruit wordt duidelijk welke combinatie van determinanten resulteren in de verschillende migratietypes van enerzijds individuele cellen (zie § 1.1) en anderzijds celpopulaties (collectieve migratie) (10). We bespreken kort deze extracellulaire (§1.3) en intracellulaire determinanten (zie § 1.4). De extracellulaire factoren omvatten voornamelijk de eigenschappen van de ECM. Cellen verzamelen informatie over de matrix via cel-matrixadhesiecomplexen (CMAC). Deze bestaan uit receptoren als integrines die, via adaptorproteïnen, celmigratie en andere cellulaire functies beïnvloeden. De voornaamste eigenschappen van de matrix die de wijze en efficiëntie van celmigratie reguleren zijn dimensie, densiteit, rigiditeit en matrixvezeloriëntatie (11). Dimensie: in vivo zijn cellen meestal omgeven door ECM en moeten ze dus in 3D migreren. In bepaalde omstandigheden gebeurt migratie in vivo in 2D, bijvoorbeeld epitheelcellen bij wondheling (22). De cellen zijn dan uitgespreid over de matrix en bewegen zich voort zonder veel hinder van de matrix te ondervinden. Bij 3D migratie, de focus van deze thesis, vormt de ECM wel een fysische barrière en dienen cellen hierdoor te migreren door de matrix te degraderen met behulp van proteolytische structuren (zie § 1.1.1) (23) of door de vorm van 6

hun cellichaam aan te passen aan de beschikbare ruimte in de matrix en zich door reeds bestaande openingen te verplaatsen (zie § 1.1.2). Welk type migratie (matrixproteolyseafhankelijk of -onafhankelijk) het meest efficiënt is hangt af van de andere eigenschappen van de matrix. Densiteit: de densiteit en de hieraan gekoppelde poriegrootte in de matrix is zeer variabel in onze weefsels (24). Wanneer de diameter van de poriën even groot of een beetje kleiner is dan de diameter van de cellen blijkt migratie optimaal door te gaan. Lage densiteit leidt tot ronding van het cellichaam en uiteindelijk tot eendimensionale migratie omdat de cellen zich enkel langs de matrixvezels kunnen verplaatsen. Bij stijgende densiteit nemen cellen door interactie met omgevende matrixvezels een meer uitgespreide morfologie aan. Wanneer dit echter in sterke mate doorgaat, kunnen ze uiteindelijk niet efficiënt verder migreren (11, 25). Dit laatste kan verholpen worden door matrixreorganisatie indien de cel beschikt over proteolytische activiteit om de matrix af te breken, maar ook door cellulaire contracties (26). Rigiditeit: een rigide matrix zal meer en sterkere cel-matrixadhesies induceren. Dit wordt geïnitieerd door zijwaartse uitstulpingen die zich vasthechten aan de matrix. Deze cellen migreren met een uitgespreide morfologie die berust op trekkracht aan deze cel-matrixadhesies. In een elastische matrix worden minder en zwakkere celmatrixadhesies gevormd en zijn de cellen rond. Deze cellen migreren door middel van voortstuwende kracht (27). Oriëntatie: ten slotte hebben motiele cellen ook de neiging te migreren langs geordende structuren zoals parallel georiënteerde matrixvezels (28). Migrerende cellen kunnen deze oriëntatie induceren door reorganisatie van de matrix. Deze vier parameters zullen via de CMAC’s signalen in de cel induceren. Afhankelijk van de cel-specifieke eigenschappen kan dit aanleiding geven tot verschillende manieren van celmigratie.

1.4 Intracellulaire factoren bepalen het migratietype: focus op Rho-GTPasen Een grote verscheidenheid aan eiwitten die een rol spelen in het overdragen van signalen uit de omgeving naar het cytoskelet, om hier structurele veranderingen te induceren, zijn geïdentificeerd. Een volledige bespreking van deze factoren is niet mogelijk binnen het bestek van deze thesis, dus wordt gefocust op Figuur 3: Rho GTPase cyclus. Rho GTPasen alterneren tussen inactieve GDP-gebonden staat en actieve GTPgebonden staat. Dit wordt gereguleerd door GAPs, GEFs en GDIs (zie tekst)(25).

de Rho GTPasen, een familie van eiwitten die een determinerende rol spelen in het 7

gebruikte modelsysteem (zie § 1.7). Rho GTPasen, Ras homologe guanine trifosfatasen, behoren tot de Ras superfamilie. Ze spelen een rol in cellulaire processen als celdifferentiatie, apoptose en celmigratie. Rho GTPasen zijn moleculaire ‘switches’ die alterneren tussen een GTP-gebonden actieve staat en een GDP-gebonden inactieve staat. De activiteit wordt geregeld door GTPase activerende eiwitten (GAPs), guanine uitwisselings-factoren (GEFs) en guanine nucleotide dissociatie-inhibitoren (GDIs) (figuur 3). GAPs activeren de nucleotidefosfatase-activiteit van het eiwit waardoor het overgaat naar zijn GDP-gebonden staat. GEFs induceren de uitwisseling tussen GDP en GTP zodat het eiwit terug actief wordt. GDIs leggen deze cyclus stil door de dissociatie van GDP te inhiberen waardoor eiwitten in hun inactieve staat blijven (29). De Rho GTPasen omvatten drie subfamilies met als meest bestudeerde isovormen: RhoA, CDC42 en Rac1. Deze eiwitten spelen een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen maar worden het meest gekoppeld aan celmigratiewijzigingen en aan een verschillend effect op actineorganisatie. RhoA reguleert de opbouw van contractiele actinemyosinefilamenten terwijl CDC42 en Rac1 voor polymerisatie van actinefilamenten zorgen aan de voorkant van de cel om respectievelijk filopodia en pseudopodia te vormen. Er zijn verschillende signaalwegen vanaf actieve Rho-GTPasen, die regulatie van actinebindende eiwitten beïnvloeden, resulterend in actinecelskeletreorganisatie. Contracties in de cel hangen af van het myosine II motor complex. Fosforylering van de myosine lichte keten (MLC) leidt tot interactie van myosine II met F-actine. Deze interactie activeert het myosine ATPase wat leidt tot contractie. RhoA beïnvloedt dit proces via zijn effector: Rho geassocieerd kinase (Rock) dat MLC fosforyleert en ook defosforylering door MLC fosfatase inhibeert. Rac1 zal via zijn effectoren Pak1 en Wave2 net MLC fosforylering tegenwerken. CDC42 kan, afhankelijk van de geactiveerde effector, MLC fosforylering zowel induceren als inhiberen. De totale balans van factoren in de cel en hun subcellulaire locatie bepaalt de uitkomst (30, 31). Actinepolymerisatie voor celprotrusies kan zowel door Rac1 als CDC42 geïnitieerd worden. Dit gebeurt respectievelijk via adaptoreiwitten en rechtstreeks door activatie van eiwitten uit de WASp/SCAR/WAVE familie. Rac1 activeert Scar/WAVE en CDC42 rechtstreeks WASp en N-WASp. Deze eiwitten zijn elk in staat het Arp2/3 complex te activeren om actinevezels de novo te polymeriseren, of polymerisatie verder te zetten van de snelgroeiende eindes van bestaande filamenten. Het Arp2/3-complex kan ook vertakkingen in actinefilamenten initiëren wat belangrijk is in pseudopodia (10, 29). Door (onder andere) deze onderscheiden signalisatie van RhoA en Rac1/CDC42 GTPases wordt Rac1/PAK activiteit gekoppeld aan mesenchymale migratie, terwijl RhoA/ROCK signalisatie vereist is voor amoeboïdale migratie (zie ook § 1.7). 8

1.5 Immuuncelmigratie in vivo Immuuncellen staan in voor de verdediging van het lichaam tegen infectieuze ziekten en lichaamsvreemde stoffen. Ze worden opgedeeld in twee grote groepen, de myeloïde cellen: neutrofielen, basofielen, eosinofielen en monocyten en de lymphoïde cellen: B-, T- en NKcellen (32). Deze cellen dienen op specifieke plaatsen in het lichaam te zijn voor hun maturatie en activering en voor het uitoefenen van hun functie. Hiervoor zijn migratie, adhesie en intercellulaire signalisatie essentieel en hun actieve migratie is zowel willekeurig (‘random, surveillance’ functie) als directioneel (chemotaxis) (33). Zo migreren T-cellen naar lymfoïd weefsel waar ze interageren met antigeen presenterende cellen (APC) voor activatie bij infectie. Daarna keren ze terug naar de bloedsomloop en migreren naar de plaats van infectie. Deze migratie is gericht zoals in vivo kan worden aangetoond met ‘two-photon microscopy’ (34). Ook B-cellen circuleren tussen de bloedsomloop en lymfoïde weefsels voor activering. Ze migreren naar follikels in de lymfeknopen voor interactie met APCs, vervolgens interageren ze met T-cellen aan de grens van de B-cel/T-cel-zone zodat de Tcelafhankelijke respons geïnitieerd wordt, waarna ze migreren naar het germinaal centrum of naar de plaats van infectie (35). Migratie van dendritische cellen (DCs) naar lymfoïde weefsels, waar ze de rol van APC uitvoeren na herkenning van een antigen, is ook essentieel. Doorgaans wordt aangenomen dat immuuncellen voornamelijk amoeboïdaal migreren. Echter, het migratietype van DCs en macrofagen die matrixdegraderende protrusies (podosomen genaamd) vormen, wordt meer recent als mesenchymaal beschouwd (36, 37). De moleculaire basis van de verschillende types migratie van immuuncellen is nog niet in detail gekend en zowel in vivo als in vitro 3D- migratietesten kunnen hiertoe bijdragen.

1.6 In vitro celmigratietesten: state of the art Er bestaan verschillende in vitro testen om celmigratie te bestuderen. Deze worden opgedeeld in 2D en 3D migratietesten. Afhankelijk van de setup kan men parameters als de migratiesnelheid, totaal afgelegde afstand of directionaliteit bestuderen. De meest gebruikte testen worden in deze sectie kort beschreven; ter volledigheid (en in functie van het technologisch deel van dit werk) bespreek ik zowel 2D- als 3D-migratietesten. De oudste techniek, die werd beschreven in 1962, is de ‘Boyden Chamber’ of ‘Transwell’ migratietest. Deze werd oorspronkelijk gebruikt om de responsiviteit van leukocyten op chemokines te bestuderen. De setup bestaat uit twee met medium gevulde compartimenten met ertussen een membraan met poriën die een kleinere diameter (3 µm voor leukocyten) hebben dan de bestudeerde cellen zodat cellen niet passief door de poriën kunnen. De cellen worden in het 9

bovenste compartiment aangebracht en binden eventueel het membraan, waarna migratie doorgaat naar een chemoattractant in het onderste compartiment Een variant op de Boyden Chamber is de ‘transwell’ invasietest waarbij een laag matrix op het membraan wordt aangebracht. Enkel cellen in staat tot 3D migratie worden dan gemeten (5, 8). De meting gebeurt na een incubatieperiode door visualisering van de cellen aan de onderzijde van het membraan of in het onderste compartiment (figuur 4). Deze ‘end point’ test geeft een notie van migratie geïnduceerd door het chemoattractant maar geeft geen informatie over de manier waarop cellen migreren (migratiewijze) of de kinetiek van migratie. Om hier een beter inzicht te verkrijgen, dienen de cellen microscopisch gevolgd te worden. Daarvoor werden ‘Bridgegap’ testen als de ‘Dunn Chamber’ ontwikkeld. Hierbij zijn de twee compartimenten (waarvan een met chemotactisch agens) verbonden door een dunne spleet (boven een brug) waardoor de cellen migreren. Chemotaxis snelheid en directionaliteit worden hier gevisualiseerd door ‘time-lapse’ microscopie (6, 38). De ‘scratch’ test (figuur 5 links) en celexclusie test zijn de norm voor 2D migratie van adherente cellen. Hierbij wordt een celvrije zone gecreëerd door respectievelijk te krassen in een confluente cellaag (bijv. met een pipettip) of door een zone af te dekken met bijv. een siliconen stopper vooraleer de cellen uit te zaaien. Celmigratie in de kras of celvrije zone wordt gemeten ofwel door foto’s te nemen voor en na migratie ofwel continu met ‘time-lapse’ videomicroscopie. Hierbij worden met ingestelde intervallen (afhankelijk van migratiesnelheid) beelden genomen. Celmigratie kan berekend worden aan de hand van de afname van de celvrije zone.

Figuur 4: Boyden Chamber. Het bovenste compartiment bevat groeimedium het onderste groeimedium met chemoattractant. De compartimenten zijn gescheiden door poreus membraan. Aanpassing Kramer N. et al, 2013 (8).

Met een variant op de celexclusietest kan ook in 3D-gewerkt worden met een experimentele opstelling bij start zoals getoond in figuur 5 rechts. In de groep werd een migratieplatform ontwikkeld en gevalideerd waarin de celexclusietest uitgevoerd wordt voor adherente cellen (Huyck et al. in voorbereiding, (addendum 5), Masuzzo et al., submitted). Dit platform laat toe aan relatief hoge doorvoer (96-well plaat) de kinetiek van migratie van ongemerkte cellen te

meten

(fasecontrastvideomicroscopie)

en

omvat

methodes

voor

automatische

beeldverwerking (in de groep ontwikkelde software CELLMIA) en dataverwerking (deels 10

A

s t o p p e r

geautomatiseerd) (Huyck et al. Addendum 5, Masuzzo et al., submitted). Bovendien is het mogelijk om indien gewenst 2D-en 3D-migratie in parallel te meten. Collageen coating

s t o p p e r

Cellen geadhereerd

B medium

matrix

Figuur 5: (links) 2D scratch test. Een kras wordt aangebracht in een cellaag. Cellen zullen in de beschadigde zone migreren zoals bij wondheling. Aangepast uit Kramer N. et al, 2013 (8). (rechts) Startopstelling bij 3D-variant van de celexclusietest.

Tot op heden dienen bij dit type test de cellen adherent te zijn waardoor deze testen niet met leukocyten kunnen worden uitgevoerd (8). Voor suspensiecellen, zoals leukocyten, worden cellen doorgaans met de matrix gemengd voor polymerisatie. Om hun migratie doorheen de matrix te meten, kunnen ‘time-lapse’ beelden gemaakt worden op verschillende hoogten door variatie volgens de z-as. Deze beelden worden dan samen gevoegd om een 3D-beeld te vormen van de migratie. Een probleem met deze techniek is dat slechts een klein aantal cellen kan gevolgd worden (er zijn er weinig in focus in de gekozen z-laag), dat er steeds interferentie is van cellen op andere z-hoogtes in de matrix en dat de tijd vereist voor zopnames een beperkende factor is om verschillende condities naast elkaar te meten (39). Een deel van deze thesis kadert in een adaptatie van het migratieplatform van de groep in functie van het verhelpen van deze beperkingen.

1.7 Modelsysteem: muis Ba/F3 B-cellen met expressie van Bcr-Abl chimeren In deze thesis werd gewerkt met getransformeerde B-cellijnen die bcr-abl fusieproteïnen stabiel expresseren. Deze cellijnen vormen de basis van een lopend onderzoek in de onderzoeksgroep in samenwerking met de groep van Prof. Bourmeyster en Prof. Constantin, Universiteit Poitiers, Frankrijk. Bcr-abl is een oncogen dat ontstaat door fusie van de 5’ regio van het bcr gen en de 3’ regio van het abl gen. Bij de mens gebeurt deze fusie door een translocatie tussen chromosoom 9 en 22. De functie van het bcr (breakpoint cluster region)gen is onduidelijk (humaan refseq NM_004327.2). Dit eiwit heeft serine/threonine activiteit en is een GTPase activerend eiwit (GAP, zie § 1.4) voor p21rac. Abl is een proto-oncogen met tyrosine kinase-activiteit dat in verband werd gebracht met onder andere celdeling, celdifferentiatie en celadhesie (NM_005157.4). Er bestaan verschillende vormen van het Bcrabl oncogen, waaronder p210bcr-abl en p190bcr-abl (40). Vorming van p190bcr-abl leidt tot acute lymphoblastische leukemie (41), p210bcr-abl leidt tot chronische myeloïde leukemie 11

(42). Het structurele verschil tussen beide is dat in p210bcr-abl een extra ‘guanine exchange factor’ (GEF, zie 1.4) domein en een pleckstrin homologiedomein aanwezig zijn, die p190bcrabl niet bezit (zie figuur 6).

Figuur 6: Bcr-abl fusie. De domeinstructuur van de Bcr en Abl eiwitten zijn getoond (boven). Verschillende breekpunten van de p190 en p210 fusie zijn aangegeven op het bcr gen. De resulterende fusie-eiwitten met moleculair massa 190 en 210 kD zijn onderaan getoond. De breuk t.h. van M-bcr geeft aanleiding tot het extra GEF-domein voor Rho (lichtblauw) in de p210 fusie. (figuur aangepast uit Kurzrock et al, 2003 (43)

Getransformeerde muis Ba/F3 B-cellen die de bcr-abl fusieproteïnen stabiel tot expressie brengen vertonen een verhoogde motiliteit (44). Opvallend is het verschillende migratietype afhankelijk van het geëxpressseerd Bcr-Abl. De moleculaire basis hiervan werd gedeeltelijk opgehelderd. P190bcr-abl expressie leidt tot activatie van de Rac1 signaalweg waardoor de cellen een motiliteitstype vertonen dat als ‘rolling’ werd omschreven (45). Hoewel vrij rond van vorm, worden door deze cellen transient filopodia en pseudopodia-achtige structuren gevormd

(42).

Deze

cellen

vormen

bovendien

F-actinerijke

structuren

met

matrixdegraderende capaciteit (46). Dit en hun afhankelijkheid van Rac1-activiteit voor migratie, suggereert verwantschap met een mesenchymaal migratie-type (47). Indien echter p210bcr-abl tot expressie wordt gebracht wordt naast Rac1 ook de RhoA/Rock1 signaalweg geactiveerd door het GEF domein en vertonen de cellen een duidelijk amoeboïd migratietype (45). In de groep werd aangetoond dat de RhoA/ROCK1 signalisatie naar actinereorganisatie afhankelijk is van de rekrutering van ADF/destrine-isovorm van de ADF/cofilinefamilie van actinebindende eiwitten (46). Een Ba/F3 cellijn die een mutant p210bcr-abl expresseert met puntmutatie S509A in het GEF domein waardoor RhoA niet langer gerecruteerd wordt, verliest de amoeboeïdale migratie en beweegt analoog aan p190bcr-abl-cellen.

1.8 Doelstelling In deze thesis worden twee parallel lopende projecten aangevat. 12

Enerzijds wordt een 3D migratietest op punt gesteld om de migratie van Bcr-Abl-Ba/F3 cellen in vitro te bestuderen. Dit vormt een eerste stap in het uitbreiden van de mogelijkheden van het migratieplatform gebruikt in de groep naar het testen van leukocytmigratie. Als startbasis bij de ontwikkeling van de techniek, wordt vertrokken van de experimentele opzet van de celexclusie-invasietest voor adherente cellen die in de groep gebruikt wordt. Een eerste uitdaging zal liggen in het aanpassen van de condities aan niet-adherente (suspensie) cellen waarbij gestreefd wordt om bij start alle cellen in een dunne laag matrix te hebben. Verdere optimalisatie ligt in het aanpassen van de ‘time-lapse’ parameters aan de hogere migratiesnelheid van immuuncellen. Finaal, dient ook te worden nagegaan of de gebruikte automatische beeldverwerkingssoftware (CELLMIA) toelaat de migratie met voldoende kwaliteit te volgen. Dit houdt optimalisatie in voor achtergrondcorrectie, maximale celherkenning en bijgevolg voor het correct afleiden van de migratietrajecten, zodat data bekomen wordt die geschikt is voor statistische analyse. Ook belangrijk voor deze laatste stap is het vinden van een geschikte celdensiteit. Voldoende cellen of celtrajecten zijn nodig voor robuste statistische analyse, maar een te hoge celdensiteit verstoort correcte segmentatie van de cellen door CELLMIA. Het tweede luik kadert in het uitbreiden van het inzicht in de moleculaire basis van de verschillende eigenschappen van de p190 en p210 Bcr-Abl-Ba/F3 cellijnen, die als model voor verschillende leukemietypes gebruikt worden en reeds geruime tijd in de groep onderzocht worden (samenwerking Universiteit Poitiers, Fr.). Dit wordt hier op twee complementaire manieren verdergezet. Enerzijds wordt via gerichte transcriptomics m.b.v. RT-qPCR gezocht naar mogelijke verschillen in expressie van moleculen die bij de Ba/F3 cellijnen een rol spelen in de bepaling van het migratietype. Er wordt specifiek gefocust op proteïnen die een rol spelen in de Rac1 en RhoA/Rock signaalwegen (GAPs, GDIs, GEFs etc.). De keuze van de doelgenen is deels gebaseerd op micro-array data van onafhankelijke gegenereerde cellijnen met expressie van de chimere Bcr-Abl-eiwitten met vergelijkbare fenotypes, aangevuld met een literatuurstudie. Anderzijds, worden de proteomen van de p190 en p210S509A-Bcr-Abl cellen vergeleken met dit van de p210-Bcr-Abl cellijn via massaspectrometrie. Daar deze technologie voornamelijk informatie levert over de meer abundante subset van het cellulaire proteoom, verwachten we dat dit mogelijk inzicht zal leveren in verschillen in het celskelet van de onderzochte cellijnen.

13

2

Materialen en Methoden

2.1 Migratie-analyse in een 3D matrix 2.1.2 Basisprotocol voor adherente cellen Het standaardprotocol van de in het lab gevalideerde 3D migratietest voor adherente cellen (hier Oris® protocol genoemd) wordt hier beschreven. Met deze 3D ‘wound-healing assay’, gebaseerd op de Oris® test van Platypus Technologies, wordt invasie van cellen in een collageen matrix (bijv. 2 mg/ml, collageen type 1, rattenstaart, BD Biosciences) bestudeerd in 96-well platen (96-well plaat, Nunc® cat: 167008). In het Oris® protocol wordt na coating van de wells met een dunne collageenmatrixlaag (30 min. polymerisatie bij 37°C), 100 µl celsuspensie (~40-50000 cellen) toegevoegd rond de Oris® stoppers. De cellen adhereren als een perifere confluente laag op de matrix (minstens 2 uur incubatie 37°C of overnacht). Het medium wordt afgenomen en een tweede laag collageen wordt op de cellen aangebracht (30 min. polymerisatie bij 37°C). Op deze manier bevinden de cellen zich in één vlakke laag in de 3D collageenmatrix met centraal een celvrije zone (zie figuur 7). Deze startsituatie moet benaderd worden met de Ba/F3 cellen die niet adherent zijn (zie resultaten). Figuur 7: Experimentele opstelling van de celexclusie Oris® invasietest. De well is gecoat met 3D-matrix waarop cellen adhereren rond een siliconen stopper. Een bovenlaag matrix wordt toegevoegd zodat cellen volledig omgeven zijn met matrix. Figuur aangepast uit Kramer N. et al, 2013 (8).

2.1.2 Videomicroscopie en data-analyse De migratie van de cellen in de celvrije zone wordt vastgelegd door fasecontrast ‘time-lapse’ microscopie in één focusvlak uitgevoerd op een Olympus® IX81 Motorized Inverted Research Microscope, objectief: CPLFLN 20XPH, gestuurd door Xcellence® software (CellM system, Olympus). CELLMIA software (Huyck et al., addendum 5) wordt gebruikt om de door Xcellence® gegenereerde ‘multi-tiff’ bestanden te analyseren en het migratietraject van de opgenomen cellen in (x,y) coördinaten om te zetten. Met deze coördinaten worden vervolgens migratieparameters berekend (voor details methodologie, zie Huyck et al, in voorbereiding (toegevoegd in addendum 5). Dataverwerking en statistiek gebeurt in Excel en R (www.r-project.org) in R-Studio .

2.2 ECM matrixbereiding Voor migratietesten wordt gewerkt met een bereiding van rattenstaart collageen type I (8.7 mg/ml BD biosciences, cat nr.: 354249, bereiding: zie tabel 1) met een finale collageen14

concentratie van 2 mg/ml, of zoals vermeld. Matrigel® Basement membrane matrix (‘phenol red free’, stock 10.7 mg/ml BD biosciences cat nr.: 356237) wordt verdund met cultuurmedium (zie § 2.3) tot de gewenste concentratie. Collageen oplossing (2 mg/ml)

(ml)

Collageen I (8,76 mg/ml) MEM (10x) Hank's balanced salt solution (pH 7,4) NaHCO3 (0,25 M) NaOH (1 M)

0.228 0.100 0.632 0.033 0.007

Totaal volume (ml)

1.000

Tabel 1: Samenstelling Collageenmatrix (2 mg/ml)

2.3 Celkweek en celmanipulaties 2.3.1 Cellen: Opstarten van een celcultuur Er wordt gewerkt met murine Ba/F3 cellen verkregen bij DSMZ® (Braunschweig, Duitsland). Ba/F3p190bcr-abl, Ba/F3p210bcr-abl en Ba/F3p210bcr-abl mutant (p210m) cellen, gemaakt zoals beschreven in (48) werden gekregen via samenwerking met de Université de Poitiers. Celstocks worden bewaard in een cryolocator in vloeibaar stikstof (-170°C) in 1 ml groeimedium met 10% HI FBS en 10% DMSO. Cellen worden 5 minuten gecentrifugeerd bij 800rpm (Eppendorf 5810R, A-4-62 rotor) en geresuspendeerd in 10ml groeimedium. Na een wasstap worden cellen in cultuur gehouden in 75cm2 ‘Filter Cap Suspension Culture Flasks’ met onbehandelde bodem voor suspensiecellen van Cellstar® (cat. nr.: 658-195). Het cultuurmedium bestaat uit RPMI 1640 medium van Gibco® Life Technologies® (cat. nr.: 61870-010, fenolrood als pH indicator) aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd (HI) foetaal bovine serum (FBS, Hyclone®) en 1% penicilline/streptomycine (Gibco®). De cellen worden gegroeid bij 37°C in een atmosfeer van 5% CO2. De cellen worden gesplitst (1/20) voor de densiteit oploopt tot 1x106 cellen/ml (interval van 3-4 dagen).

2.3.2 Cellen tellen en oogsten De cellen worden geteld met een Bürker telkamer (Marienfeld-superior®) met behulp van een lichtmicroscoop (Carl Zeiss, vergroting 10X). De Bürker telkamer omlijnt 9 vakjes met een totaal volume van 1.10-4ml. Het gemiddelde aantal cellen van deze 9 vakjes wordt vermenigvuldigd met de verdunningsfactor en 104 om het aantal cellen per ml te bekomen. Het gewenst aantal cellen wordt gecollecteerd met centrifugatie (3 minuten, 1200 rpm). De celpellet wordt geresuspendeerd in DPBS (Gibco®). Na een wasstap worden de cellen gebruikt of als pellet ingevroren door ‘flash-freezing’ en bewaard bij -80°C. 15

2.3.3 Invriezen van celstocks De cellen worden gecentrifugeerd bij 1200rpm (Eppendorf 5810R met A-4-62 rotor). De pellet wordt geresuspendeerd in groeimedium met 10% HI FBS en 10% DMSO (SIGMA) en overgebracht in cryovials (Nunc Cryotube®, cat: 377267), traag ingevroren bij -80°C en bewaard in vloeibare stikstof (-170°C).

2.3.4 Isotoopmerking voor massaspectrometrie De isotoopmerking van de Ba/F3 p210 cellen gebeurt door ‘stable isotope labeling with amino acids in cell culture’ (SILAC). De cellen worden gegroeid in SILAC RPMI (Silantes® cat: 283001300), lysine-, arginine- en glutaminevrij medium. Aan het medium worden ‘licht’ 200mg/ml L-arginine (12C6), penicilline/streptomycine, glutamamine en FBS HI toegevoegd. Voor p210-cellen wordt additioneel 80mg/ml L-lysine (13C6) toegevoegd, voor p190- en p210m-cellen 80mg/ml L-lysine (12C6). Verdere staalvoorbereiding voor massaspectrometrie, massaspectroscopische meting, Mascott analyse en extractie van L/H-expressieratios werd uitgevoerd door de onderzoeksgroep Medisch Proteïneonderzoek (Prof. K. Gevaert) (UGent/VIB) (zie addendum 4 voor details).

2.4 Kwantitatieve real time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) Om de expressie van een gen te kwantificeren op mRNA niveau wordt RT-qPCR uitgevoerd op een Lightcycler 480 (Roche®). Van elke Ba/F3 cellijn worden 6 culturen in parallel gestart. Deze worden gebruikt als biologische varianten. RNA werd bereid uit de Ba/F3 cellijnen en verkregen mRNA wordt omgezet naar complement-DNA (cDNA). Primerparen worden ontworpen voor doelwitgenen (een deel van de primersets waren reeds in het lab gevalideerd (addendum 1, tabel 1)). Huishoudgen primers waren reeds beschikbaar (addendum 1, tabel 2). Er werd bepaald welke geschikt zijn voor de Ba/F3 cellijnset.

2.4.1 Primerdesign De primers worden ontwikkeld met de ‘Lightcycler Probe Design Software 2.0’ van Roche® gebruikmakend van sequenties uit Ensembl Genome Browser, uitgave 66-68. Indien er verschillende transcripten bestaan voor een gen worden deze gealigneerd met de SDSC biology workbench (49) en primers worden gekozen die alle splicevarianten herkennen. Er wordt gezocht naar primerparen die tegen het 3’ einde van het gen liggen omdat het cDNA wordt aangemaakt m.b.v. Oligo-dT primers en bijgevolg mogelijk niet steeds volledig is aan het 5’ einde. Er wordt indien mogelijk gekozen voor primers die een exon-exongrens bevatten zodat ze geen genomisch DNA amplificeren. De smelttemperatuur van de primers ligt 16

idealiter tussen de 50-60°C en deze moet zo weinig mogelijk verschillen tussen de voorwaartse en terugkerende primers. De software geeft de primerparen scores aan de hand van bovenstaande parameters en het G/C %, de lengte, de specificiteit binnen het gen en complementariteit van de primers onderling. De geselecteerde primerparen worden vervolgens gebruikt voor een BLAST-analyse (‘Basic Local Alignment Search Tool’) in het volledige genoom van de muis. Als complementariteiten met ongewenste genen niet met grote waarschijnlijkheid worden gevonden, worden HPLC-gezuiverde primers besteld bij Proligo®.

2.4.2 RNA isolatie en cDNA synthese uit Ba/F3 celpellets RNA wordt uit de biologische varianten van de drie cellijnen geïsoleerd om cDNA te synthetiseren van mRNA. RNA isolatie gebeurt met de High Pure RNA Isolation Kit (Roche®) volgens bijgeleverd protocol uit 4.106 cellen. Er wordt gebruik gemaakt van RNase Erase® van MP Biomedicals om de werkomgeving en handschoenen schoon te maken. Het RNA wordt finaal bekomen in Tris/EDTA elutiebuffer. RNA concentratie wordt bepaald met de Nanodrop® ND-1000 (Isogen Life Sciences). De RNA zuiverheid wordt deels afgeleid uit de verhouding van absorbanties bij 260 en 280 nm (golflengtemaximum voor eiwitcontaminatie). A260/A280 >1.9 wordt beschouwd als zuiver RNA. Het RNA wordt op ijs gehouden en wordt bewaard bij -80°C. Het RNA wordt gebruikt als template voor cDNAsynthese m.b.v. reverse transcriptie (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche®). Als negatieve controles wordt voor elk van de drie cellijnen een reactie zonder Reverse Transcriptase uitgevoerd. Slechts één controle wordt gemaakt per cellijn uit een mengsel van de 6 biologische varianten. Het cDNA wordt op ijs gehouden en bewaard bij -80°C.

2.4.3 RT-qPCR meting Bij RT-qPCR wordt een deel van het doelwittranscript gekwantificeerd door een reeks amplificatiecycli met behulp van primers en thermostabiel DNA-polymerase. De kwantificatie van het amplicon wordt bepaald na elke cyclus met behulp van SYBR green I, een fluorochroom dat dsDNA bindt en hierdoor fluorescerend wordt. Een Ct (crossing threshold) wordt berekend die het cyclusnummer aangeeft waarin het signaal de drempelwaarde (achtergrond) overschrijdt. De RT-qPCR wordt uitgevoerd met de Lightcycler 480 van Roche®. Het Lightcycler 480 SYBR Green I Fast Start Master protocol van Roche® wordt gevolgd. Alle stalen worden met elke primerset in dubbel getest (PCR programma zie addendum 1 tabel 4)

17

2.4.4 DNA-agarosegelelektroforese Met deze techniek wordt het PCR product gescheiden door gelelektroforese waardoor amplicons met een verschillende lengte kunnen worden waargenomen. De scheiding gebeurt op een 2% agarosegel (10g agarose/500ml 1x TAE buffer) in een Chemigenius® toestel van Syngene bij een spanning van 100V in 1x TAE. Aan de stalen wordt ladingsbuffer toegevoegd (10x stock:50% glycerol, 5mM EDTA, 1% SDS en 0.02% broomfenolblauw). Als moleculaire gewichtsmerker wordt Quick-Load® 2-log DNA ladder (0.1-10Kbp) (New England Biolabs) gebruikt. Na scheiding wordt een kleuring uitgevoerd met GelRed® (Biotium). Het DNA-patroon in de gel wordt gevisualiseerd bij een excitatiegolflengte van 312 nm, emissie wordt gedetecteerd met een CCD camera via een ethidiumbromide filter.

2.4.5 Selectie van huishoudgenen In het lab zijn zeven gevalideerde primersets voor muis huishoudgenen aanwezig (addendum 1, tabel 2). Hieruit worden drie huishoudgenen gekozen die het meest stabiel geëxpresseerd zijn door huishoudgen expressieratios paarsgewijs te vergelijken in de verschillende cellijnen met Qbase® (Biogazelle) dat het GeNorm algoritme integreert (50). Het gemiddelde van de paarsgewijze variatie van de expressieratios levert de M-waarde van elk huishoudgen. Ook de coëfficiënt van variatie van de genormaliseerde relatieve referentiegenkwantificatie wordt bepaald. Beide waarden zijn lager bij stabiele genen.

2.4.6 Bepaling van primerefficiënties In ideale omstandigheden zal na elke amplificatiecyclus tijdens PCR een verdubbeling van de doelsequentie plaatsvinden. In de praktijk is de efficiëntie van de primers vaak verschillend van twee. De primerefficiënties worden bepaald met PCR van een cDNA-verdunningsreeks gaande van 1/12 tot 1/192 uit te voeren. Het gebruikte cDNA is een mengeling van alle cellijnen. Voor genen die hoge Ct waarden hebben wordt een verdunningsreeks van 1/2 tot 1/32 gebruikt. De Lightcycler® 480 software levert standaardcurves en primerefficiënties.

2.4.7 Relatieve kwantificatie van transcriptieniveau Voor de kwantificatie van de transcriptieniveaus worden de gemiddelde Ct-waarden met standaarddeviatie voor doelgenen en huishoudgenen, verkregen in elke variant van de geteste cellijnen, ingevoerd in Qbase® (Biogazelle). Voor elke cellijn wordt een normalisatiefactor bepaald op basis van de huishoudgen-transcriptieniveaus die aldus corrigeert voor variatie in starthoeveelheden cDNA. Na doorvoeren van de normalisatie, levert Qbase voor ieder transcript in elke staal de NRQ (normalised relative quantitiy). De gemiddelden van de 18

Log(NRQ) van de zes biologische varianten/cellijnen worden in Excel berekend en omgezet naar meanNRQ (en bijhorende SEM). Significante verschillen tussen meanNRQ per cellijn worden getest m.b.v. Kruskall-Wallis one way analysis of variance test in Sigmaplot®.

2.5 Western Blotting Expressie van de doelwitgenen op eiwitniveau wordt bepaald met Western Blotting. Er worden celpellets gemaakt van de Ba/F3 cellijnen zoals beschreven in 2.3.2. De pellets worden gelyseerd met een lysebuffer (thiourea/urea/CHAPS buffer, reducerend agens DTT, fosfatase en protease inhibitoren). Het lysaat wordt gesoniceerd met het Vibra-cell® (Sonics & Materials). De eiwitconcentratie in de lysaten wordt bepaald bij 595 nm met de Bradford methode m.b.v. Bio-Rad® Protein Assay oplossing. De lysaten worden gescheiden met SDSPAGE. Voor Arhgap22 wordt een 10% polyacrylamide separatiegel gebruikt, voor Tiam1 en Arhgap31 8% gels. Blotten gebeurt op Hybond® nitrocellulose membraan. Voor de samenstelling van scheidings- en ‘stacking’ gel en de gebruikte antilichamen zie addendum 2. Huishoudgen GAPDH werd gebruikt als ladingscontrole. Doelwitgen antilichamen werden gebruikt bij door fabrikant voorgestelde verdunning, GAPDH bij 1:20000. Voor Tiam1 en GAPDH wordt 30 µg eiwit geladen, voor Arhgap22 40 µg. Arhgap31 wordt met beide volumes geprobeerd.

19

3

Resultaten

De resultaten van de drie experimentele onderdelen in de twee onderzoeksluiken van deze thesis zullen apart besproken worden. Voor al deze onderdelen wordt gebruik gemaakt van muis Ba/F3 cellen die verschillende chimeren van het oncogen Bcr-Abl tot expressie brengen: p190Bcr-Abl, p210Bcr-Abl en de p210S509A met een mutatie in GEF domein dat RhoA recruteert. De details van dit modelsysteem zijn besproken in § 1.7. In het eerste deel van deze resultaten (§ 3.1) worden de bereikte stappen besproken in de ontwikkeling van een kwantitatieve celmigratietest voor migratie van suspensiecellen in 3Dmatrix, waarin meerdere stalen naast elkaar getest kunnen worden. In het tweede luik (§ 3.2) wordt de expressiedata beschreven die verkregen werd voor een gemaakte selectie van proteïnen met een potentiele rol in de Rho-GTPase-afhankelijke verschillen in celmigratie van bcr-abl getransformeerde cellen (zie § 3.2.1 voor details). Expressie van de geselecteerde genen werd gekwantificeerd op mRNA niveau met RT-qPCR. Ten slotte wordt in het derde deel (§ 3.3) de vergelijkende proteoomanalyse van de Bcr-abl Ba/F3 cellen voorgesteld.

3.1 Ontwikkeling van celmigratietest in 3D-matrix voor motiele leukocyten: getransformeerde Ba/F3 cellen als modelsysteem Om celmigratie te bestuderen moet men in staat zijn de cellen of hun omgeving te manipuleren (zie § 1.3 en 1.4) en de effecten van deze verschillende condities op de migratieeigenschappen kwantitatief te vergelijken. Optimaal gebeurt deze vergelijking binnen eenzelfde experiment. Bestaande migratietesten voor niet adherente cellen (sommige leukocyten) laten meestal echter het simultaan testen van meerdere condities niet toe. Om statistisch significante verschillen te detecteren is het ook belangrijk om een groot aantal migrerende cellen in elke conditie te analyseren. Met migratietesten waarbij ‘tracking’ van cellen in 3D-matrix opgenomen worden m.b.v. Z-stacking, is dit technisch niet mogelijk (39). In het lab beschikken we echter over een 3D-celmigratieplatform dat aan beide vereisten tegemoetkomt (Oris® invasietest, zie details Huyck et al, addendum 5 en Materiaal § 2.1). Figuur 7 toont hoe in deze assay de cellaag ‘gesandwiched’ is tussen twee matrixlagen, met een centrale celvrije zone. Voor aanvang van de thesis was dit enkel werkzaam voor adherente en relatief traag bewegende (kanker)cellen (met mediaansnelheid 0,3 µm/min). Voor deze cellen kunnen in de huidige Oris®-assay tot 60 stalen in parallel getest worden. Bovendien, aangezien bij start alle cellen in één focusvlak zijn (door adhesie op de onderste collageenlaag) kan in dit ene vlak gedurende voldoende lange tijd de migratie van een groot aantal (> 500) cellen gevolgd worden. Deze test is echter niet rechtstreeks bruikbaar voor niet20

adherente cellen waaronder bepaalde types leukocyten. Omdat de cellen van het Ba/F3 modelsysteem niet adherent zijn, wordt er voor geopteerd de cellen in te bedden in een zo dun mogelijke laag matrix. Hierbij wordt een startsituatie beoogd met een zo groot mogelijk aantal cellen

in

hetzelfde

z-vlak.

Verder

werden

de

instellingen

van

de

CELLMIA

beeldverwerkingssoftware (Huyck et al, addendum 5) afgesteld om Ba/F3 cellen te herkennen en te volgen in de tijd. Tenslotte werd de nieuwe experimentele opstelling gevalideerd door condities te vergelijken waarbij celmigratie wordt beïnvloed door extracellulaire en intracellulaire factoren. De Oris® invasietest wordt hier ofwel uitgevoerd met collageen type I ofwel, in analogie met (45), in Matrigel®.

3.1.1 Aanpassing van de experimentele opstelling De eerste stap in de Oris® invasietest is de aanmaak van een dunne onderste matrixlaag in elke well van een 96-well plaat (thin gel coating, tabel 2). Deze blijft voor de suspensiecellen behouden maar dikker gemaakt (20µl/well) (zie Tabel 2). Daar leukocyten doorgaans individueel bewegende cellen zijn, wordt voor de tweede stap afgestapt van het celexclusieconcept (§ 1.6) waarbij migratie van cellen in een centrale zone wordt gevolgd die bij aanvang celvrij wordt gehouden (Figuur 7). In tegenstelling kozen we ervoor om de cellen over het volledige welloppervlak aan te brengen aan een lage dichtheid. Om Ba/F3 cellen ingebed in een dunne laag matrix in de well aan te brengen, werd gezocht naar een manier om een volume van 10 µl matrix+cellen egaal over de bodem te spreiden. Er werden twee methoden vergeleken, (1) aanbrengen van 10 µl matrix met cellen en uitspreiden door korte centrifugatie of (2) aanbrengen van 50 µl matrix met cellen, een volume dat goed uitspreidt in de well, en onmiddellijk terug afnemen van 40 µl (tabel 2). Uit het testen van verschillende hoeveelheden (niet getoond) bleek het optimaal als 5000 cellen/well in de dunne matrixlaag aanwezig waren. Hier bovenop werd zoals in het oorspronkelijke protocol een bovenlaag van 40 µl collageenmatrix aangebracht. Telkens, na toevoegen van de collageenoplossing wordt dit 30 minuten gepolymeriseerd bij 37 °C. Optimalisatie van de experimentele opstelling gebeurde initieel met de p210 cellijn in 2 mg/ml collageen in 96-well platen. De geteste experimentele opstellingen zijn weergegeven in tabel 2. Hieruit blijkt ook de verandering in de parameters bij microsopische opname: we kozen voor 6 uur opname met een interval tussen opnames van 2,5 min.

21

Adherente cellen

Suspensiecellen

ORIS-invasietest

Methode 1 Centrifugatie

Matrix-bodemlaag

Gel coating

20 µl

Cellaag:

45000 cellen in groeimedium, 5000 cellen in 10 µl matrix, overnacht laten 10s centrifugatie bij 200 rpm, adhereren rond 30 min polymeriseren bij 37 °C ORIS stopper 40 µl matrix opbrengen 30 min polymeriseren 37 °C 200 µl

Matrix-toplaag Medium Videomicroscopie

20 min. interval 36-48 u

Methode 2 50 µl op, 40 µl af 20 µl 5000 cellen in 10 µl matrix, 50 µl aanbrengen en onmiddellijk 40 µl terug afnemen, 30 min polymeriseren bij 37 °C

2,5 minuten interval 6u

Tabel 2: Vergelijking van de experimentele opstelling in de originele ORIS-invasietest en in de nieuwe methoden voor niet-adherente cellen uitgevoerd in 96-well platen.

In 2 mg/ml collageen liggen bij methode 1 (met centrifugatie) de cellen effectief in het centrale deel van de well beter verdeeld en meer in één vlak dan bij methode 2 (zonder centrifugatie) (figuur 8). Het experiment werd herhaald in Matrigel® aan 2 mg/ml (1/5 verdunning van de stock). Dit wordt uitgevoerd zoals beschreven voor collageen in Tabel 2, maar de incubatietijden werden verlengd tot 50 minuten. De cellen lagen hier ook zonder de centrifugatiestap relatief goed in één vlak (figuur 9). Dit is mogelijk het gevolg van de tragere polymerisatie waardoor cellen tot op de bodemlaag matrix bezinken.

Figuur 8: links, Fasecontrastopname van p210 cellen in collageen 2 mg/ml aan gebracht volgens methode 1 (met centrifugatie (10 s, 200 rpm), 100x vergroting. Rechts, Fasecontrastopname van p210 cellen in collageen 2 mg/ml, aangebracht volgens methode 2 (50 µl matrix in en 40 µl matrix uit). 200x vergroting

Beide methoden lijken mogelijkheden te bieden. Er dient echter eerst bepaald te worden of de manipulaties geen effect hebben op celmigratie (zie § 3.1.3).

3.1.2 Optimalisatie van instellingen bij automatische beeldverwerking: ‘cell-tracking’ Vooraleer de invloed van beide methoden op migratie kon bepaald worden, optimaliseerden we de beeldverwerkingsstap waarbij in elk beeld van een tijdssequentie de cellen dienen gedetecteerd te worden en hun migratietraject dus kan worden afgeleid. Binnen de groep

22

gebeurt beeldverwerking op een volledig geautomatiseerde wijze m.b.v. CELLMIA (Huyck et al., addendum 5). Hierin zijn twee algoritmen beschikbaar waarvan de instellingen door de gebruiker uitgebreid kunnen worden aangepast. Hiermee kunnen in de tijd zowel het oppervlak bezet door migrerende confluente celpopulaties (‘bulk’ genoemd in CELLMIA) afgelijnd worden, als de trajecten van individueel migrerende cellen worden bekeken. De Ba/F3 cellen verschillen van de eerder gebruikte cellen in grootte en (door hun meer afgeronde vorm) in contrast bij fasecontrastopnames. Door trial-and-error werden de instellingen geoptimaliseerd om Ba/F3 cellen als individuele cellen te herkennen en te volgen bij een vergroting van 100x en 200x (zie tabel 3). De sectie ‘segmentation’ betreft instellingen betreffende het herkennen van cellen en het eventueel indelen van cellen als ‘bulk’. Ons doel is het volgen van individuele cellen, daarom werd gekozen voor CELLMIA algoritme1 als start.

Figuur 9: p210-cellen in Matrigel® (2 mg/ml) aangebracht volgens methode 2 (tabel 2). Beelden werden geanalyseerd met CELLMIA met de geoptimaliseerde settings. Links is de opname op t=0s getoond, ieder gedetecteerde cel heeft een nummer, rechts op t=2,5u (60 opnames later) met celtrajecten (gekleurde lijnen). Migratie-experiment van 6u, beeldopnames met interval van 2,5 minuten, vergroting: x200

‘Bulk Cell Region Sigma’: bepaalt de grootte van de regio rond een cel waarin door de software gezocht wordt naar meerdere cellen om een bulk te vormen. ‘Bulk Cel Region Sensitivity’: bepaalt de gevoeligheid voor detectie van een cel in de nabijheid. ‘Cells are’: beschrijft het contrast van de cellen tegenover de achtergrond; cellen in onze setup zijn steeds lichter dan de achtergrond. Door de andere experimentele opstelling is ook de signaal/ruis verhouding kleiner. Het ‘Noise Level’ werd verhoogd tot 3,0%. De Sectie ‘tracking’ betreft instellingen die bepalen hoe een cel gevolgd wordt in functie van de tijd. Omwille van de vereiste korte tijdsinterval (2,5 minuten versus 20 minuten bij adherente cellen) werd de ‘maximum step distance’ verkleind.

23

Segmentation

Nieuwe instellingen 200x Nieuw 100x

Default settings 100x

Image content type: ORIS Cell segmentation: Bulk Cell Region Sigma: Bulk Cell Region Sensitivity: Cells are … than background Typical Cell Radius: Maximum Cell Radius: Noise Level:

Oris Algorithm 1 20.00 0.30 lighter 2.56 µm 8.10 µm 3.0 %

ORIS Algorithm 1 26.00 0.55 both light/dark 2.56 µm 8.10 µm 1.9 %

Tracking

Nieuwe instellingen 200x Nieuw 100x

Default settings 100x

Minimum Track Life: Maximum Step Distance: Remember Cell When Lost:

10 frames 15.0 µm 1 frame

10 20.00µm 1

ORIS Algorithm 1 20.00 0.30 lighter 1.28 µm 4.05 µm 4.00 % 10 10.00 µm 1

Tabel 3: Algoritme-instellingen in CELLMIA voor Ba/F3 celltracking bij 200x en 100x vergroting in vergelijking met de default instellingen.

De cellen van een p210 migratie experiment zonder centrifugatie (figuur 9) werden handmatig geteld om de efficiëntie van herkenning (segmentatie) met de nieuwe algoritme1 instellingen te bepalen. De software herkent 204/253 (80.6%) van de cellen (hoge positieve identificatie) en herkent geen of nauwelijks structuren in de achtergrond die geen cellen zijn (lage valse positieve identificatie). Deze dekking is voldoende om migratie te kwantificeren. Zoals te zien is op figuur 9, waar beelden getoond zijn bij start en na 60 opnames, is ook de ‘ cell tracking’ met de nieuwe instellingen succesvol (6u ‘time-lapse’, interval: 2.5 minuten). Uit visuele inspectie van filmpjes van de celtracking, blijkt eveneens dat de meeste cellen gedurende de volledige duur van de opnames gevolgd kunnen worden. (Zie CD-rom: ‘Cell-tracking’) Het dient te worden opgemerkt dat de cellen in de 3D-matrix bewegen (i.e. in x, y en z richtingen) maar – wegens opname in één xy-vlak – wordt hun traject in een 2D-vlak (als x-y-trajecten of een 2D-projectie van de realiteit) vastgelegd (zie verder discussie). Door het grote aantal cellen in één focusvlak bij start blijkt dat de cellen die op deze wijze opgenomen worden, toch voldoende lange tijd gevolgd kunnen worden. De output van CELLMIA zijn coördinaten van cellen in functie van de tijd waaruit migratieparameters kunnen bepaald worden. In deze thesis werd enkel gekeken naar de migratiesnelheid.

3.1.3 Invloed van verschillen in experimentele opstelling op migratiesnelheid Om het mogelijke effect van centrifugatie (gebruikt in methode 1) op celmigratie te bestuderen werden in een volgende reeks experimenten beide opstellingen (tabel 2) geanalyseerd met ‘time-lapse’ microscopie (§ 2.1.2). Enkel de p210 cellijn werd gebruikt. Dit gebeurde in duplicaat in Matrigel® en in triplicaat in collageen. Celmigratie werd gedurende 6u met intervallen van 2,5 minuten vastgelegd. ‘Cell-tracking’ gebeurt met CELLMIA met de 24

geoptimaliseerde algoritmesettings (tabel 3). Uit de afgeleide lengte van de celtrajecten en hun duur, werd een gemiddelde snelheid voor iedere traject afgeleid (in Excel template met macro’s). Celtrajecten die voor > dan 33% van hun tijd een gekozen translocatiecriterium niet overschrijden, werden weggefilterd. Dit vermijdt bijv. dat dode cellen worden in rekening gebracht. Binnen deze thesis werden voorlopig enkel de standaardcriteria (zie Huyck et al., addendum 5) voor datafiltering gebruikt. De distributie van de gemiddelde trajectsnelheid van alle replicaten van elke conditie wordt op twee manieren uitgezet in een ‘box and whiskers’ box plot en m.b.v. ‘Kernel density’ probability plot (figuur 10) (voor details zie Huyck et al., addendum 5). Merk op dat de inherente snelheden van de celpopulatie in matrigel aanzienlijk hoger is dan in collageengel.

1.5

1.0

0.5

0.0

n=655

coll centr

coll gn centr

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 matri centr

matri gn centr

1.4

2.0

matri centr matri gn centr

1.2

coll centr coll gn centr

1.5

density

1.0

density

n=441 n=720

single cell velocity (µm/min)


n=585

2.0

0.8 0.6 0.4

1.0

0.5

0.2 0.0

0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


Figuur 10: Boxplots (boven) en Kernel density waarschijnlijkheidsplots (onder) tonen de verdeling van gemiddelde trajectsnelheden van p210 Ba/F3 cellen in 2 mg/ml matrigel (links) en collageen (rechts) voor de twee methoden beschreven in tabel 2: methode 1: ‘centr’ (zwart) en 2: ‘gn centr’ (rood). N in de boxplots is het totaal aantal celtrajecten van alle replicaten/conditie.

Figuur 10 illustreert dat de verschillen tussen de twee methodes klein zijn. Via statistische analyse met een Kruskall-Wallis rank sum test gevolgd door paarsgewijze Wilcoxsontest werd allereerst nagegaan of de verschillen al dan niet significant zijn. Hierbij worden lage pwaarden afgeleid (tabel 4). P-waarden worden echter sterk bepaald door populatiegroottes. De grote hoeveelheid data (hier 441-720 trajecten) houdt gevaar in voor overinterpretatie van de p-waarde bij deze vergelijkingen. In navolging van Huyck et al. (addendum 5) gebruikten we 25

bijgevolg ook telkens de effectgrootte als maatstaf in deze statistische vergelijking door bepaling van ‘Cliff’s Delta’. Deze index geeft aan in welke mate de verdelingen van vergeleken experimenten overlappen en of de condities significant verschillend zijn rekeninghoudend met de verdeling per conditie maar onafhankelijk van de populatiegrootte. De delta waarden (d), en het 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) op d, werden berekend in R (www.r-project_org, R-studio) voor de beide paarsgewijze vergelijkingen in figuur 10. Samengevat worden condities als significant verschillend beschouwd bij p<0.05 en de ondergrens van het 95% BI op d > dlim (tabel 4 en addendum 3). Kruskall Wallis rank Cliffs Delta sum test d = 0.0406 Matrigel: methode 1 p = 0.206 versus methode 2 95% BI: [-0.0232;0.104] d= 0.172 Collageen: methode 1 p = 1.25E-06 versus methode 2 95% BI [0.0824;0.260]

Significantly Different? NO (p>0.05) NO 0.0824
Tabel 4: Statistische analyse op basis van p- en d-waarde van effect van centrifugatie (vergelijking methode 1 vs methode 2, tabel 4) op celmigratie van p210 Ba/F3 cellen in 2 mg/ml matrigel of 2 mg/ml collageen (BI: betrouwbaarheidsinterval)

Rekeninghoudend met p en d, heeft centrifugatie noch een significant effect in Matrigel®, noch in collageen. Desondanks concluderen we dat methode 1 weinig meerwaarde biedt, zeker niet in Matrigel. Er wordt voor 96-well platen verdergegaan met methode 2 (tabel 2).

3.1.4 Opschalen van experimentele opstelling van 96- naar 48-multiwell plaat Om hoge doorvoeranalyses te kunnen uitvoeren is het belangrijk voldoende celtrajecten te registreren per conditie door meerdere opnames per well te maken. In de 96-well plaat opstelling is dit moeilijk omdat een uitgesproken meniscus in de cellaag wordt gevormd (figuur 11). Centraal in een opname op 100x kunnen veel cellen geregistreerd worden, maar distaal liggen binnen één opname de cellen reeds zichtbaar op verschillende hoogten. Een mogelijkheid is meerdere wells per conditie op te nemen (zoals voor gedaan in § 3.1.3) of, alternatief, te werken in grotere wells. Hiervoor werd de setup aangepast aan 48-well platen (Nunc® cat:150687). Door de grotere welldiameter verwachtten we op zijn minst een grotere vlakke zone centraal in de well. De opschaling in beschikbaar oppervlak is een factor 2,344 (96-well, opp. 0.32 cm2, 48-well 0.75 cm2). Tabel 5 toont de gebruikte volumes en celaantallen in een 48-well plaat. Voor de bodemlaag voerden we een dubbele omrekening uit met factor 5,494x. Door de grotere omtrek van de well verwachtten we dat centraal een

26

dunnere laag matrix overblijft door cohesie aan de wanden.

Figuur 11: Meniscus in 96-well plaat. Centraal liggen cellen volledig in focus, distaal liggen ze boven het focusvlak. Vergroting: 100x

Bodem matrixlaag Cellaag: Top matrixlaag Medium

110 µl 7500 cellen in 23,5 µl 100 µl aanbrengen en onmiddellijk terug 76,5 µl afnemen 100 µl 400 µl

Tabel 5: Experimentele opstelling voor migratie van getransformeerde Ba/F3 cellen in 48-well platen

Figuur 12: Beelden uit een migratieopstelling van p190 cellen in 2 mg/ml Matrigel® in een 48-well plaat, genomen in hetzelfde focusvlak links: centraal deel van de well, rechts: perifeer deel van de well. 100x vergroting

De foto’s in Figuur 12 tonen duidelijk aan dat de meniscus in deze grotere wells praktisch verwaarloosbaar is. Binnen hetzelfde focusvlak kunnen over het volledige oppervlak van de well beelden worden gemaakt, die met succes geanalyseerd kunnen worden met CELLMIA (zie lager). Deze opstelling (Tabel 5) werd gebruikt voor verdere experimenten.

3.1.5 Validatie van de geoptimaliseerde migratietest voor suspensiecellen De migratietest die ontwikkeld werd, werd verder gevalideerd door cellen te testen na verandering van intra- en extracellulaire factoren. Het effect van Rock inhibitor Y-27632 op de p210 cellijn werd geanalyseerd. De migratietest op de p210 cellijn werd uitgevoerd in matrices met verschillende densiteit. Tenslotte werd de migratiesnelheid van drie Ba/F3 27

cellijnen geanalyseerd om het gebruik van het modelsysteem te valideren. Alle experimenten gebeuren zoals beschreven in 3.1.2-3.1.4 en in 48-wells zoals weergegeven in tabel 5, bij een vergroting van 200x, tenzij anders vermeld. Migratie-experimenten beslaan telkens 6u met een interval van 2.5 minuten, tenzij anders vermeld.

3.1.5.1 Invloed van Rock inhibitie op migratiesnelheid Het effect van behandeling met Rock inhibitor op migratiesnelheid werd bestudeerd op p210 cellen in 2 mg/ml Matrigel. Het verwachtte effect is een afname in migratiesnelheid van de cellijn p210 (amoeboïdaal) door interferentie met de RhoA/Rock signaalweg (45). 10 µM Rock inhibitor Y-27632 (Calbiochem® cat: 688000) wordt in de toplaag matrix en aan het medium toegevoegd. We tonen drie onafhankelijke experimenten waarbij de cellen werden ingebed in 2 mg/ml Matrigel (Figuur 13). Rock inhibitie verschuift de distributie van gemiddelde snelheden van de celtrajecten naar lagere waarden in experiment 1 en 3, maar in mindere mate bij experiment 2. 2.0 n=96

1.5

3

density


n=180

2

p210 p210 + RI

1.0

0.5

1 0.0 0.0

0

3.0

p210

p210 + RI

n=215

n=179

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


2.5 2.5

2.0 density


3.0

1.5

2.0 1.5 p210 p210 + RI

1.0

1.0

0.5

0.5

0.0

0.0

0.0 p210

p210 + RI

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


28

n=284

n=180

3.0

2.5

2.5

2.0

2.0

density


3.0

1.5

1.5 p210

1.0

1.0

0.5

0.5

p210 + RI

0.0

0.0

0.0 p210

p210 + RI

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


Figuur 13: Distributie van gemiddelde snelheden van de celtrajecten uitgezet in boxplots (links) en Kernel density waarschijnlijkheidsplots (rechts) van p210 Ba/F3 cellen met en zonder Rock inhibitie (RI) in Matrigel 2 mg/ml. De drie uitgevoerde experimenten worden getoond. N= totaal aantal gemeten celtrajecten.

Net als in § 3.1.3, werd de Cliff’s Delta berekend en p-waarde bekomen uit de Kruskal-Wallis ranks sum test om de significantie van het effect te berekenen. Hieruit blijkt een sterk significant verschil voor experimenten 1 en 3, terwijl op basis van dlim, in experiment 2 geen significante daling in snelheid optreedt (Tabel 6). Er moet opgemerkt worden dat de migratiesnelheid van de p210 cellen in de controleconditie eveneens gemiddeld lager ligt: dit ligt mogelijk aan de conditie van de cellen op het moment van het experiment of een mogelijk verschil in de matrixbereiding. Op basis van de consistentie tussen experiment 1 en 3, kunnen we concluderen dat het effect van ROCK inhibitie, en dus interferentie met deze specifieke intracellulaire signaalweg, met de migratietest kan bevestigd worden. experiment 1 Kruskall Wallis p = 0.570e-10 rank sum test Cliff's Delta d = 0.479 dlim = 0.105 [0.351;0.589] significant 95%BI

experiment 2 p=0.022e-2

experiment 3 p < 2.2e-16

d = 0.216 [0.101;0.325]

dlim = 0.105 d = 0.609 dlim =0.105 [0.524;0.682] significant niet

significant Tabel 6: Statistische analyse van celmigratie-experimenten op p210 Ba/F3 cellen met Rock inhibitie vs onbehandelde controlecellen.

3.1.5.2 Invloed van variatie in matrixdensiteit op migratiesnelheid De invloed van extracellulaire factoren op migratiesnelheid werd onderzocht door migratie van p210 cellen te vergelijken in verschillende matrices en bij verschillende densiteiten per matrix. Er werd Matrigel van 2, 3.33 en 5 mg/ml gebruikt en collageen van 1 en 2 mg/ml. Experimenten werden uitgevoerd zoals beschreven in 3.1.4 in 48-well platen. Migratie werd gedurende 6 u gemeten met ‘time-lapse’ microscopie met een interval van 2,5 minuten. De

29

distributies van de gemiddelde migratiesnelheid van de celtrajecten voor de replicaten in triplo van elke conditie werd uitgezet in een boxplot en een Kernel density plot (figuur 14). n=297

n=214

n=230

n=221

2.0 Matrigel 2mg/ml Matrigel 3.33mg/ml Matrigel 5mg/ml Collageen 1mg/ml Collageen 2mg/ml

3 density


n=461

2

1

1.5

1.0

0.5

0.0

0

0 Matrigel 2

Matrigel 3.33

Matrigel 5

Collageen 1

Collageen 2

1

2

3


Figuur 14: Distributie van gemiddelde snelheden van de celtrajecten uitgezet in boxplots (links) en Kernel density waarschijnlijkheidsplots (rechts) van p210 Ba/F3 cellen in Matrigel of collageen aan verschillende densiteit. N in boxplot = totaal aantal gemeten celtrajecten.

p-waarden Collageen.2 Matrigel.2 Matrigel.3.33 Matrigel.5

Collageen.1 2.30E-08 < 2e-16 < 2e-16 0.00011

Collageen.2 < 2e-16 0.00091 0.10525

Matrigel.2 < 2e-16 < 2e-16

Matrigel.3.33 3.00E-06

Tabel 7: Pairwise multiple comparison test, p-waarden zijn weergegeven, matrixconcentraties uitgedrukt in mg/ml

vergelijking: delta 95% ondergrens 95% bovengrens vergelijking: delta 95% ondergrens 95% bovengrens vergelijking: delta 95% ondergrens 95% bovengrens

matrigel 2 vs 3.33 matrigel 2 vs 5

matrigel 2 vs 1

matrigel 2 collageen 2 0.380 0.513 0.684 0.457 0.304 0.428 0.619 0.370 0.451 0.590 0.740 0.536 matrigel 3.33 vs matrigel 3.33 vs matrigel 3.33 vs matrigel 5 matrigel 5 collageen 1 collageen 2 collageen 1 0.246 0.451 0.172 0.215 0.141 0.358 0.067 0.108 0.345 0.535 0.273 0.317 matrigel 5 vs collageen 1 vs 2 collageen 2 0.090 0.309 -0.019 0.206 0.197 0.405

vs

vs

Tabel 8: Cliff’s Delta (d) waarden van elke paarsgewijze vergelijking met onder en bovengrens van het 95% BI. Matrixconcentraties uitgedrukt in mg/ml; de snelheidsdistributies in de paren ingekleurd in donkergrijs verschillen significant van elkaar.

Op de boxplots is een duidelijke daling van de mediane migratiesnelheid te zien als de Matrigelconcentratie verder boven de 2 mg/ml stijgt. Dit is te verwachten aangezien de hogere densiteit de amoeboidale migratie van de p210 cellen zal bemoeilijken. In collageenmatrix gaat de migratie globaal gezien trager dan bij Matrigel (zie ook figuur 10), 30

maar verassend genoeg schuift de mediaan van de distributie in 2 mg/ml naar een hoger waarde dan bij 1 mg/ml. Uit tabel 7 (pairwise comparison test) blijkt dat enkel de verdeling van de migratiesnelheden in Matrigel van 5 mg/ml niet significant verschillend is van deze in collageen 2 mg/ml. Rekeninghoudend met d en dlim (Tabel 8), is dit een indicatie dat we met de migratietest aantonen dat een stijgende matrixdensiteit p210 cellen gemiddeld vertraagt in Matrigel en versnelt in collageen. Geen conclusie kan gemaakt worden voor het experiment herhaald wordt.

3.1.5.3 Vergelijking van de Ba/F3 cellijnen Met de proefopstelling in 48-well platen (tabel 5) werd een vergelijkend migratie-experiment uitgevoerd met de drie Ba/F3 cellijnen in Matrigel van 2 mg/ml. 1.0 n=720

n=825

p190 (n=6) p210 (n=6) p210m (n=6)

0.8

4 density


5

n=921

3

0.6

0.4

2 0.2

1 0.0 0

0 p190

p210

1

2

3

4


p210m

Figuur 15: Distributie van gemiddelde snelheden van de celtrajecten uitgezet in boxplots (links) en Kernel density waarschijnlijkheidsplots (rechts) van p190, p210 en p210m Ba/F3 cellen in Matrigel 2mg/ml. n in boxplot = totaal aantal gemeten celtrajecten, n in waarschijnlijkheidplots: aantal replicaten.

De migratiesnelheid wordt opnieuw uitgezet voor elke cellijn in een boxplot en een ‘Kernel density’ waarschijnlijkheidsplot (figuur 15). Opnieuw werd hier de significantie van het verschil bepaald door het berekenen van de d- en p-waarde (tabel 9). Pairwise comparisons (p) p210

p190

p210

< 2e-16

-

p210m 0.0012 5.10e Alle significant

Cliff’s Delta (d)

comparison p190 vs p210 -10

p190 vs p210m

p210 vs p210m

d-waarde

0.270

0.092

0.188

95 % BI

[0.214;0.324]

[0.036;0.146]

[0.130;0.245]

dlim = 0.105

Significant

Nt significant

significant

Tabel 9: Statistische analyse van celmigratie analyse van de drie Ba/F3 cellijnen.

De migratiesnelheden van dit experiment bevestigen de resultaten van (45) die bekomen werden met andere testen: de p210 cellen migreren gemiddeld significant sneller dan de p190 en p210 cellen en zijn dus efficiënter. De distributies van de snelheden verkregen voor de p190 en p210m cellen verschillen niet significant van elkaar. We voerden dit experiment 31

meerdere malen uit, maar konden voorlopig de hogere snelheid van de p210 cellen niet herhalen. Vaak waren de gemiddelde snelheden voor de drie cellijnen lager. Verdere experimenten en standaardisatie van het protocol is nodig om de factoren bij celcultuur en/of matrixbereiding en –polymerisatie te controleren, die variatie tussen experimenten induceren.

3.2 Intracellulaire signalisatie in Bcr-Abl Ba/F3-cellen: focus op regulatoren van RhoGTPasen 3.2.1 Geselecteerde doelwitgenen In een eerdere studie in samenwerking met Université de Poitiers werd een microarray profilering uitgevoerd die genexpressie vergelijkt tussen Ba/F3p190, p210 en p210 mutant (Van Troys M., resultaten niet gepubliceerd). De Ba/F3 cellijnen zijn niet meer beschikbaar en dus niet dezelfde stabiele klonen als die gebruikt in deze thesis. Met behulp van Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software werd in de oude micro-array dataset specifiek gezocht naar het transcriptniveau van genen waarvan reeds is aangetoond of waarvan verwacht wordt dat hun genproduct de activiteit van RhoA en/of Rac1 beïnvloeden. Er is een opregulatie van Arhgap22, Arhgap31, Tiam1 en RhoJ en een neerregulatie van CDC42EP3 in de p210 cellijn ten opzichte van de p190 cellijn. Deze genen werden vervolgens ingevoerd in de Pathway Explorer van IPA waardoor een overzicht werd bekomen van het directe of indirecte effect van de eiwitten op RhoA, Rac1 en Cdc42 (figuur 16).

Figuur 16: Signaalwegen van de kandidaatgenen met Rac1 en RhoA met relatieve expressie in p210 t.o.v. p190. Rood is opgereguleerd in p210, groen is neergereguleerd in p210 in de bestaande transcriptoomdata, grijs ingekleurde: geen verschil in transcriptniveau

In mens melanoomcellen wordt voorgesteld dat Arhgap22 downstream van Rock, Rac1 inhibeert (31). Arhgap31 is een gekend CDC42 en Rac1 GTPase activerend eiwit (51). Tiam1 32

verhoogt Rac1 activiteit via associatie met het PAR complex (52). Deze associatie wordt geïnhibeerd door activatie van Rock waardoor Tiam1 mogelijk een rol speelt in de negatieve interactie tussen de RhoA en Rac1 pathway (53). RhoJ onderdrukt in endotheelcellen actomyosinecontractie, vermoedelijk door inwerking op RhoA of rechtstreeks op Rock (54). Ten slotte is in een studie met fibroblasten aangetoond dat overexpressie van CDC42EP3 leidt tot verandering in de vorm van de cel met vorming van pseudopodia (55). Het gedaalde expressieniveau van Arhgap22 en Arhgap31 in p190 Ba/F3 cellen stemt overeen met wat kan worden verwacht uit de literatuurstudie omdat deze de RhoA-Rock pathway stimuleren. Men zou echter verwachten dat hier ook een stijging van RhoJ en Tiam1 mee gepaard gaat. Hiernaast werd ook gezocht naar andere interessante genen beschreven als determinanten van amoeboidale en mesenchymale migratie in de literatuur en werden RND3 (56) en NEDD9 (31) geselecteerd. RND3 inhibeert zowel RhoA als Rock1 (57). Tussen Rock1 en RND3 bestaat ook een ‘feedback’ lus (58). Nedd9 vormt met onder andere Dock3 een complex dat Rac1 activeert en zo mesenchymale migratie stimuleert (31). Nedd9 is belangrijk voor efficiënte migratie in 2D, maar is net hinderlijk voor migratie in 3D omgevingen (59). De finaal geselecteerde doelgenset bevat de drie GTPasen Rac1, RhoA, Cdc42 en hun regulatoren Arhgap22, Arhgap31, Tiam1, RhoJ, CDC42EP3, RND3 en NEDD9.

3.2.2 Kwantitatieve real time polymerase chain reactie (RT-qPCR) 3.2.2.1 Primersets van doelwitgenen voor RT-qPCR Primersets (addendum 1, tabel 3) werden ontworpen in ‘Lightcycler Probe Design Software 2.0’ van Roche® zoals beschreven 2.4.1.

3.2.2.2 mRNA concentratie De concentratie en de zuiverheid van het geïsoleerde mRNA van zes onafhankelijke culturen per cellijn werd bepaald met spectrofotometrie (tabel 10) zoals beschreven in 2.4.2 P190

P210

meting mRNA µg/µl

A260/ A280

RNA_1

0,408

RNA_2 RNA_3

P210m

meting mRNA µg/µl

A260/ A280

meting mRNA µg/µl

A260/ 280

2,07

0,587

2,08

0,385

2,11

0,578

2,09

0,397

2,09

0,673

2,12

0,591

2,10

0,679

2,07

0,365

2,09

RNA_4

0,630

2,09

0,432

2,09

0,617

2,08

RNA_5

0,725

2,08

0,387

2,09

0,470

2,08

RNA_6 0,554 2,08 0,307 2,11 0,810 2,10 Tabel 10: mRNA concentraties en A260/A280 absorbantieratios bepaald met de Nanodrop® ND-1000, De A260/A280 verhoudingen zijn >1.90 wat erop wijst dat geen eiwit met de isolatie is meegekomen.

33

3.2.2.3 Selectie van huishoudgenen Transcriptniveaus van zeven huishoudgenen werden getest op cDNA bereid volgens § 2.4.2 in elk van de zes varianten van de cellijnen. Met behulp van Qbase® (Biogazelle) werd volgens het GeNorm algoritme de gemiddelde expressieratio van de huishoudgenen in de celset berekend, de M waarde (zie figuur 17). Een lage waarde duidt op een gen dat stabiel geëxpresseerd wordt in verhouding tot alle andere geteste huishoudgenen. Vervolgens wordt stapsgewijs het gen met de hoogste M waarde uit de analyse verwijderd tot slechts de drie meest stabiele genen overblijven (zie tabel 11). 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Figuur 17: M-waarden van de 7 initieel geteste huishoudgenen.

Reference Target

M

CV

GAPDH

0,209

0,086

HXPRTF

0,199

0,084

PKG1

0,193

0,074

Tabel 11: M- en coëfficiënt van variatie (CV)-waarden van de geselecteerde huishoudgenen

GAPDH, HXPRTF en PKG1 zijn de meest stabiele huishoudgenen met een gemiddelde M waarde van 0.201. GeNorm levert ook de coëfficiënt van variatie van de genormaliseerde relatieve referentiegenkwantificatie en deze is bij deze drie genen zeer laag, gemiddeld 0.081 (zie tabel 11). De expressieniveaus van deze huishoudgenen werden gebruikt om normalisatiefactoren per staal te berekenen (addendum 1, tabel 6) die verder gebruikt werden voor de normalisatie van expressieniveaus voor elke cellijn.

3.2.2.4 Bepalen van primerefficiënties Om nauwkeurig de transcriptniveaus van de doelgenen te kwantificeren werden voor elk primerpaar de primerefficiënties bepaald door metingen op standaardreeksen uit te voeren, op een cDNA-verdunningsreeks gaande van 1/12 tot 1/192. Indien de Ct waarden van een doelwitgen te hoog waren werden de verdunningsreeksen aangepast naar 1/2 tot 1/32. De

34

Lightcycler® 480 software werd gebruikt om de standaardcurves op te stellen en de primerefficiënties te berekenen (tabel 12). Primerset PKG1 HXPRTF GAPDH RhoA Rock1 Nedd9

Efficiëntie 1.976 ± 0.00121 1.942 ± 0.00900 1.973 ± 0.00541 1.909 ± 0.00840 1.861 ± 0.0322 1.787 ± 0.00464

Primerset Rac1 Arhgap31 Arhgap22 CDC42 Tiam1

Efficiëntie 1.965 ± 0.00624 1.896 ± 0.102 2.175 ± 0.0518 2.073 ± 0.0158 2.124 ± 0.00579

Primerset RND3 CDC42EP3 RhoJ

Efficiëntie 1.163 ± 0.426 7.614 ± 0.280 2.046 ± 0.225

Tabel 12: Primerefficiënties ± standaarddeviatie

De primersets uit de eerste twee kolommen hebben scores binnen een aanvaardbare range en werden gebruikt voor RT-qPCR. De primersets voor RND3 en CDC42EP3 zijn niet geschikt voor RT-qPCR. RhoJ krijgt een aanvaardbare efficiëntie toegekend, maar deze is echter enkel gebaseerd op de eerste twee verdunningen omdat bij de andere geen signaal gedetecteerd werd (tabel 13). Name

Pos

Cp

Pos

Cp

pool 1/12|RhoJ

A8

36,72

B8

37,83

pool 1/24|RhoJ

A9

37,83

B9

36,85

pool 1/48|RhoJ

A10

B10

40

pool 1/96|RhoJ

A11

B11

40

pool 1/192|RhoJ

A12

40

B12

Tabel 13: RT-qPCR run op cDNA-verdunning 1/12 -1/192 voor bepaling van primerefficiëntie van RhoJ (Cp: crossing point = Ct; pos: positie op plaat, twee replicaten per condities werden getest. Merk de hoge Cp-waarden op.

Er werd een RT-qPCR experiment uitgevoerd met 1/5 verdund cDNA met RhoJ primers, maar de variatie tussen de replicaten liep op tot 3.6 Cp. Variaties gaande tot 0.5 Cp zijn aanvaardbaar

dus

de

RhoJ

primerset

kon

niet

worden

gebruikt

voor

verdere

transcriptkwantificatie.

3.2.2.5 Kwaliteitscontrole van RT-qPCR reacties Smeltcurves werden opgesteld met de Lichtcycler® software en vormen een eerste controle voor de homogeniteit van het PCR-product. Voorbeelden zijn getoond in addendum , figuren 1 en 2). Op de smeltcurve van Arhgap22 (addendum 5, figuur 1) is slechts één piek te zien (blauw = stalen, rood = negatieve controles) wat wijst op één amplicon. Bij de controles is de piek bij veel lagere temperatuur wat het resultaat is van primerdimeervorming; deze is slechts heel kleine bij de stalen. De smeltcurve voor CDC42EP3 (rood = stalen, paars = negatieve controles) zag er ook relatief goed uit (addendum 5, figuur 1), er werden geen primer-dimeren gedetecteerd. De smeltcurven van RND3 en RhoJ geven aanleiding tot meerdere en zeer variabele pieken (addendum 5, figuur 2). Herhaling van het experiment verhielp dit niet. Dit

35

geeft een indicatie voor aspecifieke amplificatie omdat primerdimeren doorgaans een lagere smelttemperatuur hebben. DNA-gelelektroforese werd uitgevoerd voor verdere analyse van de PCR-reacties.

RhoJ

RND3

Figuur 18:DNA-gelelektroforese van PCR product met stalen van RhoJ (links) en RND3 (rechts), met merkerlaan centraal

Tiam1

Arhgap31

Arhgap22

Figuur 19: DNA-gelelektroforese van Tiam1, Arhgap31 en Arhgap22. Primerdimeren van Arhgap22 moeilijk zichtbaar (rood kader)

De DNA-gelelektroforese van RhoJ en RND3 (figuur 18: respectievelijk 3 en 4 lanen PCR product) bevestigd dat er geen specifieke amplificatie is. Er zijn meerdere producten en primerdimeren. Het PCR-producten van de drie genen die voor verdere studie worden gebruikt werden gescheiden. Tiam1-PCR reactie toont één duidelijk product (laan 1) en geen primerdimeren in de controlelaantjes (lanen: 2 en 3 nrt, 4: ntc). Bij Arhgap31 (lanen 1-2: product, lanen 3-4 nrt en ntc) en Arhgap22 (laan 1: product, lanen 2-3 nrt, laan 4: ntc) is primerdimeervorming duidelijk zichtbaar (figuur 19). In de nrt controles van Arhgap22 is er ook amplificatie. Dit wijst op amplificatie van resterend genomisch DNA. De Ct waarden verschillen voldoende tussen de stalen en de controles om relatieve kwantificatie uit te voeren en ook de variatie tussen technische replicaten is voldoende klein. Een extra DNase behandeling hielp niet.

3.2.2.6 Bepalen van de transcriptniveaus van de doelgenen van interesse De genormaliseerde expressiewaarden (NRQ) van de (resterende) doelwitgenen Rac1, RhoA, Cdc42, Arhgap22, Arhgap31, Tiam1 en NEDD9 werden berekend met Qbase. Voor elk doelgen werd de gemiddelde relatieve expressie en de standaarddeviatie (SEM) op het gemiddelde berekend voor de zes biologische varianten (zie § 2.4.7) (addendum 1, tabel 5). Gemiddelde relatieve expressieniveaus met SEM zijn getoond in figuur 20. De data werden geanalyseerd met de Kruskal-Wallis one way ANOVA (Analysis of Variance) test, die bepaald of de 18 expressieniveaus van een gen in de zes biologische varianten van de drie cellijnen uit eenzelfde verdeling komen. Wanneer de p-waarde kleiner is dan 0.050 is 36

minstens één dataset anders verdeeld dan de andere met een betrouwbaarheid van 95% (tabel 14). Een positief resultaat wordt opgevolgd met een Tukey test die voor elke gen de mediaan NRQ in één cellijn met die in de andere vergelijkt. Hiermee wordt bepaald welke cellijnen een significant verschillende expressie vertonen met p < 0.05 voor een bepaald gen (tabel 15). Hieruit blijkt dat Tiam1 en Rac1 significant opgereguleerd zijn in de p190 cellen, in lijn met de beschreven verhoogde Rac1 activiteit en een mogelijk mesenchymale beweging. Anderzijds wordt dit niet teruggevonden in de p210S509A cellen die fenotypisch analoog zijn aan de p190 cellen. Arhgap31 vertoont ietwat verrassend een verhoogd transcriptieniveau in p210S509A cellen. 2.5 2 1.5 190 1

210m 210

0.5 0

Figuur 20: Genormaliseerde relatieve expressieniveaus van doelwitgenen in p190, p210 en p210m cellen (GADPH, HXPRTF en PKG1 zijn de huishoudgenen)

Gen Arhgap31 Arhgap22 CDC42 Nedd9 Rac1 RhoA Rock1 Tiam1

H-waarde 11.942 1.024 9.579 4.924 11.415 3.193 5.983 12.292

Vrijheids-graden 2 2 2 2 2 2 2 2

p-waarde 0.003 0.599 0.008 0.085 0.003 0.203 0.05 0.002

Tabel 14: Resultaten Kruskal-Wallis one way ANOVA: vergelijken van drie cellijnen voor elk gen (rood niet signifant)

Gen Arhgap31 CDC42 Rac1 Tiam1

P210m vs p190 Ja Ja Ja Nee

p210m vs p210 Ja Nee Nee Nee

p210 vs p190 Nee Ja Ja Ja

Tabel 15: Resultaten Tukey test: mediaan NRQ per gen paarsgewijs vergeleken tussen de cellijnen, getest verschil met p < 0.05.

37

3.2.3 Kwantificatie op eiwitniveau: Western Blotting Arhgap31 en Tiam1 die in RT-qPCR een significant gewijzigd transcriptniveau vertonen werden verder getest op eiwitniveau. Er was veel variatie op de PCR kwantificatie van Arhgap22 waardoor geen uitspraak kon gemaakt worden over de transcriptniveaus. Daarom werd dit eiwit ook meegenomen in de Western Blotting analyse op cellysaten van de drie Bcr-abl cellijnen (antilichamen beschreven in addendum 2). Het gebruikte Arhgap31 antilichaam gaf geen signaal bij verdunningen 1:1000 tot 1:200 (start verdunning 1:1000 volgens leverancier). Met de Arhgap22 en Tiam1 antilichamen werd in de drie cellijnen een vrij gelijkaardig signaal gedetecteerd bij 1:200 (figuur Figuur 21: Western blotting op p190, p210 en p210m cellysaten voor Arhgap22, Tiam1 en GAPDH.

21). Voor Tiam1 is vrij veel aspecifiek signaal. GAPDH werd als huishoudeiwit gebruikt ter controle

van fouten in concentratie en geladen hoeveelheid van de cellysaten. GAPDH expressie was echter zeer zwak en onregelmatig doorheen meerdere herhalingen. Er kan niet worden overgegaan tot kwantificatie zonder betrouwbaar normalisatiesignaal.

3.3 Proteoomanalyse van de Ba/F3 cellijnen Een massaspectrometrische proteoomanalyse werd uitgevoerd door ir. An Staes in de groep van prof. Dr. Gevaert, zie addendum 4 voor details over de uitvoering en § 2.3.4 voor celmerking. Er werden twee paarsgewijze analyses uitgevoerd. P190 bcr-Abl-cellen waarin de eiwitten metabolisch gemerkt werden met

12

C6-L-lysine (Light), werden vergeleken met

p210-cellen, gemerkt met zwaar L-lysine (13C6) (Heavy). Analoog werden 12C6-Lys gemerkte p210m cellen (Light) vergeleken met

13

C6-Lys gemerkte p210-cellen (Heavy). Om een

betrouwbare dataset met geïdentificeerde peptiden en eiwitten te verkrijgen werden filters toegepast. Een peptide werd in de analyse opgenomen als het voldoet aan drie voorwaarden: (1) minstens 7 aminozuren lang, (2) komt maar in één eiwit voor, en (3) wordt als statistisch betrouwbaar “true” beschouwd door Mascot Distiller (addendum 4).

38

Opgepikte peptiden

190 vs 210

2336

1980

Opgepikte proteïnen

190 vs 210

210m vs 210

2271

210m vs 210

1302

1090

1265

Figuur 22: Het aantal opgepikte peptiden (links) en eiwitten (rechts) en de overlap aan opgepikte peptiden en eiwitten tussen de twee analyses.

Uit de resulterende peptidelijst werd een lijst van geïdentificeerde eiwitten opgesteld gefilterd voor deze waarbij minstens twee peptiden per eiwit werden opgepikt. Figuur 22 toont de aantallen opgepikte peptiden en eiwitten na filtering en illustreert dat er een grote overlap is tussen de beide analyses (29,8 % op eiwitniveau). Uit deze dataset werden de peptiden en eiwitten met significant gewijzigde Light/Heavy ratio geselecteerd. De log2 waarde van alle L/H distributies van de opgepikte peptiden van de mediaan is optimaal 0, met 0 wijzend op een L/H=1. Tabel 16 toont de mediaan, standaarddeviatie en 95% betrouwbaarheidsinterval ([mediaan ± (1,960*SD)]) van de log2 L/H verdelingen. Peptiden met een L/H buiten dit interval zijn in significant verschillende hoeveelheden aanwezig in de vergeleken cellijnen. De gemiddelde log2 L/H ratio van de verschillende peptiden/eiwit ± SD levert de L/H-ratio voor elk geïdentificeerd eiwit. Figuur 23 toont het aantal peptiden met een significant gewijzigd L/H ratio en het aantal eiwitten met significante gewijzigde gemiddelde L/H waarde in beide vergelijkingen en in de onderlinge overlap. De volledige lijsten met massaspectrometrie resultaten zijn beschikbaar op de CDrom:’Mass_spec_results_JLibbrecht_130408’. Merk op dat in deze dataset het 99% betrouwbaarheidsinterval werd gebruikt voor het bepalen van significantie. De volledige lijsten van gereguleerde eiwitten met hun gemiddelde L/H ± SD in beide datasets bepaald op het 95% significantieniveau is ook beschikbaar op de CD-rom:’Gereguleerd 95% BI’ Mediaan Standaarddeviatie

190 vs 210 (log2L/H) 0.25 0.159

Tabel 16: mediaan en standaard betrouwbaarheidsintervallen

deviatie

210M vs 210 (log2L/H) -0.35 0.146 van

de

twee

datasets

95% BI [-0.312 ; 0.312] [-0.287 ; 0.287] en

de

corresponderende

95%

39

Opgereguleerde peptiden

210m vs 210

190 vs 210 410

136

367

Opgereguleerde proteïnen

210m vs 210

190 vs 210 67

10

37

Neergereguleerde peptiden

190 vs 210

341

130

210m vs 210

378

Neergereguleerde proteïnen

190 vs 210

69

19

210m vs 210

55

Figuur 23: Het aantal peptiden en proteïnen met significant gewijzigde L/H ratio (95% betrouwbaar) tussen p190- en p210 cellen en tussen p210m(p210S509A)-cellen en p210 cellen. Opgereguleerd betekent een verhoogde eiwitexpressie in de p210 cellen t.o.v. p190- en/of t.o.v. p210m-cellen (significant lage L/H); Neergereguleerd betekent een lagere eiwitexpressie in de p210 cellen t.o.v. p190- en/of t.o.v. p210m-cellen (significant hoge L/H).

Het aantal significant open neergereguleerde eiwitten in p210 cellen versus de twee andere cellijnen is beperkt en de overlap is klein, 31 eiwitten. Keratine van menselijke oorsprong behoort tot deze groep, dit is een contaminant door staalmanipulaties en werd uit de analyse verwijderd. Van de resterende 30 zijn er twee eiwitten die in de ene analyse neer en in de andere op gereguleerd zijn: annexine A1 en MT-A70, een adenosine-methyltransferase. We bekeken eveneens de standaarddeviatie van het log2 L/H ratio op eiwitniveau. In de figuren in addendum 4, figuur 1 werd voor iedere gemiddelde L/H ratio de SD uitgezet. Bij gemiddelden met een hoge SD werd gekeken naar de ratios van de overeenkomstige peptiden. Dit treedt meestal op doordat één van de peptiden van het eiwit niet in beide stalen van de paarsgewijze vergelijking (p190/p210m enerzijds en p210 anderzijds) wordt opgepikt, wat resulteert in een extreem grote |L/H| voor dit peptide, een dominant effect hiervan op de gemiddelde L/H voor het eiwit en een geassocieerde hoge SD. Op basis hiervan werd één van de 30 eiwitten in de overlap uit de analyse weggelaten. De resulterende 29 eiwitten zijn weergegeven op de CDrom in: ‘Gereguleerd 95% BI’ op tabblad ‘Overlap’. Om na te gaan welke biologische functies en signaalwegen in deze groepen eiwitten aangerijkt zijn, werd de dataset geanalyseerd met IPA (ingenuity pathway analysis, www.ingenuity.com). Het accessienummer en de gemiddelde log2 L/H ratio’s van de eiwitten die significant gewijzigd zijn werden ingevoerd met als ‘cut-off’ waarden de grenzen van het 95% betrouwbaarheidsinterval. Als achtergrond werden de geïdentificeerde overlappende maar niet-gereguleerde eiwitten ingevoerd. IPA geeft voor elke biologische functie of signaalweg een score (p-waarde), afhankelijk van het aantal gereguleerde eiwitten, 40

onafhankelijk van teken, in verhouding tot het aantal eiwitten binnen dezelfde groep in de achtergrond. Er wordt opgemerkt dat de achtergronddataset relatief groot is in vergelijking met de kleine set van gereguleerde eiwitten en dit leidt tot een onderschatting bij de berekening van de significantie van aangerijkte biologische functies. Bijgevolg wordt de rangschikking van de biologische functies als hoofdcriterium gehanteerd. Figuur 2 in addendum 4 toont de eerste tien moleculaire en cellulaire functies die het sterkst vertegenwoordigd zijn in eiwitten met significante deregulatie in p190 vs p210 cellen, p210m vs p210 cellen ten opzichte van de achtergrond. Hieruit blijkt dat ‘celgroei en proliferatie’ en ‘celdood en overleving’ respectievelijke op positie 6 en 3 voorkomen in de p190/p210 dataset en op positie 1 en 2 in de p210m/p210 dataset, terwijl deze niet in de top 10 voorkomen in de achtergrond. Opvallend was dat granzyme B in p190 en p210m sterk opgereguleerd is ten opzichte van p210 met log2 ratio’s van respectievelijk 2.906 en 2.281. ‘Granzyme Bsignaling’ is dan ook de top canonieke signaalweg in beide vergelijkingen: naast granzyme B opregulatie is hierin in p190 cellen caspase-3 neergereguleerd en in p210 cellen AFAP1 (apoptic activating protein 1). In de overige canonieke signaalwegen zijn ook telkens weinig opgepikte moleculen significant gereguleerd, vandaar dat we hier niet verder op ingaan. Figuur 2 in addendum 4 toont dat ook ‘cell motility’ (p190 vs p210) en ‘cell morphology’ (p210m vs p210) in de top 10 aanwezig is, echter ‘cell motility’ staat ook op positie 9 in de achtergronddataset. In de discussie wordt ingegaan op specifieke wijzigingen van eiwitten in relatie met celdood en celmotiliteit.

41

4

Bespreking

4.1 Ontwikkeling van celmigratietest voor niet-adherent cellen in 3D-matrix Het doel van het technologische luik van deze thesis was het ontwikkelen van een in vitro test voor analyse van migratie in een 3D-matrix van cellen die van nature niet adherent zijn (zoals verschillende types leukocyten). We stelden volgende combinatie van criteria voorop als specificaties voor de test: (1) simultane analyse van multiple condities, (2) analyse van grote celpopulaties, (3) opleveren van kwantitatieve informatie over de kinetiek van migratie. In de groep is reeds een celmigratietest ontwikkeld voor adherente cellen gebaseerd op de Oris® test (Huyck et al., zie addendum 5). Deze werd gebruikt als basis, terwijl Bcr-abl-Ba/F3 cellijnen als modelcellijn dienden. 4.1.1 Doorgevoerde aanpassingen in experimentele opstelling Net als andere leukocyten, migreren Ba/F3 cellen sneller dan adherente cellen. De intervaltijd tussen opnames bij videomicroscopie moet voldoende klein zijn zodat tussen de opnames de cellen geen te grote ‘sprongen’ maken, waardoor informatie verloren gaat en ‘cell tracking’ bemoeilijkt wordt. Ik gebruikte finaal een intervaltijd van 2,5 minuten. Merk op dat dit bepalend is voor het aantal simultaan te analyseren condities (één van de gestelde criteria). Immers, het interval tussen opnames kan niet korter zijn dan de totale opnametijd van alle condities of opnameposities. Een interval van 2,5 minuten biedt (met de huidige microscoopopstelling) ruimte voor parallelle analyse van 18 opnames, wanneer de opnames gebeuren in één focusvlak (dus geen z-stacking). Dit laatste is een gekozen ‘compromis’ (zie ook lager, 4.1.3) precies in functie van het gestelde criterium om meerdere condities in parallel te kunnen analyseren. Uiteraard betekent dit dat we enkel cellen volgen gedurende de tijd dat ze zich in het xyz vlak bevinden (met z (‘depth of focus’) beperkt door de visualiseerbare dikte bij fasecontrastopname in één focusvlak). In functie van het tweede gestelde criterium (analyse van grote celpopulaties) is het dan weer uiterst belangrijk om bij aanvang van het experiment voldoende cellen in het opgenomen focusvlak te hebben. Niet-adherente cellen worden klassiek gemengd met de 3D-matrix zodat ze over de hele dikte van de gevormde matrix (meerdere mm in de z-richting) verspreid zitten. In één vlak zitten dan bijgevolg slechts enkele cellen in focus en de grote aantallen cellen op andere niveaus zorgen voor interferentie bij fasecontrastopnames. Een belangrijke doorgevoerde aanpassing was bijgevolg om de cellen aan te brengen in een dunne matrixlaag, die is ingebed tussen twee dikkere matrixlagen. Er werden twee methoden getest: centrifugatie van een klein volume van de viskeuze matrix-cel-oplossing of aanbrengen van 42

een groter volume dat zich goed uitspreid in de well gevolgd door gedeeltelijke afname zodat een klein volume matrix-celoplossing achterblijft. Centrifugatie zorgde inderdaad voor een dunne film matrix waarin de cellen zeer goed in één vlak liggen. Met de tweede methode lagen de cellen iets meer diffuus. Dit verschil was meer uitgesproken in collageen dan in Matrigel, waar beide methodes leidden tot een gunstige startsituatie. Echter, daar tussen de twee methoden geen significante verschillen waren in verdeling van de gemeten migratiesnelheden (zie § 3.1.3), werd gekozen voor de meer eenvoudige tweede methode. Zo worden eventueel ongekende gevolgen van of geïnduceerde variatie door centrifugatie uitgesloten. Ik optimaliseerde de celaantallen (5000 voor 96-well, 7500 voor 48 well) en dit laat uiteindelijk toe (zie bijv. § 3.1.2) dat in één opname tot ongeveer 200 tracks bepaald worden. Dit leidt tot de beoogde relatief grote datasets waarop robuste statistische analyse kan worden uitgevoerd. Ook de condities voor de ‘cell-tracking’ (door CELLMIA) werden geoptimaliseerd. De algoritme-instellingen die voor een experiment gekozen worden hangen af van de morfologie en snelheid van de gebruikte cellen, maar ook van de matrix of de vergroting waarbij beeldopnames werden gemaakt. De geoptmaliseerde instellingen voor 100x en 200x vergroting zijn beschreven in §3.1.4. De cellen worden hiermee met een hoog % herkend (>80%) en ik verifieerde (door visuele inspectie) dat ‘niet-cellen’ of ‘cellen uit focus’ niet herkend worden (bij de aangepaste instelling voor achtergrondcorrectie) en dat de celtrajecten correct gevolgd worden in de tijd. 4.1.2 Validatie van de ontwikkelde migratietest Vooraleer de migratietest bruikbaar is voor vergelijkende studies dient nagegaan te worden of gerapporteerde verschillen in migratie met de test kunnen worden gedetecteerd. Er werd getest of beïnvloeding van intracellulaire of extracellulaire factoren tot een detecteerbare wijziging in migratie leidt en of migratiesnelheidverschillen tussen cellijnen onderscheiden kunnen worden. In de nieuwe experimentele opstelling vertoonden p210bcr-abl Ba/F3 cellen behandeld met Rock inhibitor Y-27632 een gemiddeld lagere snelheid dan de onbehandelde cellen. Dit is in lijn met (45) waar (met andere methodes, o.a. Boyden chamber en xyz-time lapse) aangetoond werd dat ROCK inhibitie de migratie minder efficiënt maakt. We konden eveneens, in lijn met (11), significante verschillen in p210-migratiesnelheid aantonen in matrices van verschillende types met verschillende densiteit (collageen (1 en 2 mg/ml) en Matrigel (2, 3,33 en 5 mg/ml)). Migratiesnelheid in Matrigel daalde bij stijgende densiteit. Hogere densiteit van collageengel, leidde echter tot significant hogere migratiesnelheid van de p210-cellen. Bij eenzelfde eiwitconcentratie (bijv. 2 mg/ml) is p210 celmigratie sneller in 43

Matrigel dan in collageen. De migratietest zal toelaten deze geobserveerde verschillen verder mechanistisch te onderzoeken door na te gaan of in beide matrices voornamelijk actinemyosinecontractie bepalend is (zoals verwacht voor de amoeboidaal migrerende p210 cellen) of hierin proteolytische activiteit mogelijk toch ook een rol speelt. Tegengestelde bevindingen over protease-afhankelijkheid in matrigel versus collageen zijn gerapporteerd voor verschillende celtypes (60, 61) Uit vorig onderzoek is bekend dat in Matrigel de p210 cellijn meer efficiënt migreert dan zowel p190 als p210m cellijnen (45). We konden dit gerapporteerde verschil in één experiment bevestigen. We merken wel op dat de intrinsieke migratiesnelheid per cellijn soms sterk varieerde tussen herhalingen (zie ook 4.1.3). 4.1.3 Status en perspectieven Met de nieuwe experimentele opstelling kunnen we via videomicroscopie in één focusvlak, 18 condities in parallel testen waarbij per conditie telkens ~200 celtrajecten meetbaar zijn. Hiermee konden (kleine) verschillen in de distributie van snelheden tussen cellen in verschillende condities op significante wijze worden aangetoond. Er moet wel geconcludeerd worden dat verdere standaardisatie van het protocol nog nodig is, daar herhaalde experimenten niet steeds identieke data opleverden. Er kan worden uitgesloten dat parameters bij time-lapse of bij CELLMIA-analyse hiertoe bijdragen, daar dit telkens door visuele inspectie gecheckt werd. We vermoeden echter dat de timing van de polymerisatiestappen van de matrices cruciaal is. Door de multiwell platen op ijs te houden tot alle wells gevuld zijn en polymerisatietijden steeds constant te houden, kan mogelijk de matrixpolymerisatie meer reproduceerbaar gebeuren. Afgezien van deze vereiste standaardisatie, kan gesteld worden dat ik een bruikbare test ontwikkeld heb die aan de gestelde criteria voldoet. De throughput van de klassieke ‘transwell assay’ (eindpuntmethode) wordt met de hier voorgestelde test benaderd, maar de bekomen informatie is hier uitgebreider en levert inzicht in de migratiekinetiek van individuele cellen in een grote celpopulatie. Ondanks de keuze om slechts in één vlak opnames te maken, kunnen - dankzij de ontwikkelde startopstelling - toch veel cellen voor voldoende tijd gevolgd worden. De bekomen trajecten zijn uiteraard wel 2Dprojecties van xyz-stappen, maar de validatie toonde aan dat de hiermee verwachte verschillen in snelheid (na bijv.een specifieke behandeling) konden bevestigd worden. Het is uiteraard aan te raden om, ter bevestiging, voor geselecteerde condities van interesse zstacking gevolgd door 3D-tracking uit te voeren. Dit kan in dezelfde opstelling gebeuren en 23 condities (geselecteerd uit het grotere aantal reeds geteste condities) kunnen dan in parallel getest worden. 44

Leukocyten migreren in vivo frequent onder invloed van een chemotactische gradient (62). Een belangrijke uitbreiding van de experimentele opstelling zal zijn om chemotactische gradienten te creëren in de matrix. Eén mogelijkheid die hierbij onderzocht zal worden, is het plaatsen van ‘parels (nanobeads)’ in de matrix die traag een bepaald chemotactisch reagens vrijstellen (geplande samenwerking met onderzoeksgroep Prof. S. De Smet, FFW).

4.2 Inzicht in de moleculaire basis van de fenotypes van de bcr-abl getransformeerde Ba/F3 cellen Het tweede luik van de thesis omvat identificatie van intracellulaire spelers die bepalend zijn voor de verschillende eigenschappen van p190, p210 en p210m-bcr-abl-Ba/F3 cellen. De hier gebruikte cellen zijn de stabiele klonen beschreven in (45), maar er is reeds data beschikbaar over een vorige verloren gegane set van analoge bcr-abl Ba/F3 cellen. Op deze eerste set werd reeds massaspectrometrie- (via methionine-cofradic) en micro-array-analyse uitgevoerd (ongepubliceerd). Fenotypisch gedragen deze twee sets van cellijnen zich in vitro heel analoog, maar er zijn reeds verschillen in interne signalisatie vastgesteld. (Bourmeyster et al, niet gepubliceerd).

4.2.1 Kwantificatie van transcriptniveaus van Rho-GTPase regulatoren Eiwitten die potentieel een rol spelen in de Rac1 of RhoA/Rock signaalweg in de Ba/F3 cellijnen werden geselecteerd ofwel omdat ze gewijzigde expressie vertoonden tussen p210 en p190-cellen in de eerste stabiele celset (op basis van µ-array) ofwel op basis van literatuurstudie. mRNA niveaus van Arhgap22, Arhgap31, CDC42EP3, Nedd9, RhoJ, RND3 en Tiam1 werden geanalyseerd met RT-qPCR. RhoJ, RND3 en CDC42EP3 werden uit de analyse gehaald omdat de Ct waarden bij amplificatie steeds hoog en onregelmatig waren. Mogelijk komen deze genen in te kleine hoeveelheden tot expressie of zijn de gebruikte primersets niet geschikt. Verschillende primersets voor RhoJ werden getest met hetzelfde resultaat. De transcriptniveaus van Arhgap22 en Nedd9 bleken niet significant verschillend tussen de drie cellijnen. Arhgap31, een CDC42 en Rac1 GTPase activerend eiwit (51), is > 1.5 maal opgereguleerd in p210m cellen t.o.v. p190 en p210 cellijnen. Dit was enigszins verrassend omdat verwacht wordt dat p210m en p190-cellen zich gelijkaardig gedragen. Tiam1, een Rac1-activator (52), is in kleine mate opgereguleerd in p190. Dit komt overeen met de observatie dat migratie van p190-cellen Rac1-afhankelijk is (45). Opvallend, onze vaststellingen zijn tegengesteld aan de gegevens die de micro-array opleverde in de vroeger stabiele cellijn. Voor Arhgap22 laat de grote variatie op de metingen tussen de geteste 45

biologische varianten/cellijn niet toe te besluiten of transcriptniveaus tussen de cellijnen significant verschillend zijn. Er werd gestart om deze observaties op eiwitniveau te bevestigen, maar de kwaliteit van beschikbare antilichamen en de mogelijk kleine verschillen bemoeilijken dit. Het is ook mogelijk dat niet zozeer de totale hoeveelheid van deze regulatoren in de cel belangrijk, maar wel hun activatiegraad en/of de plaats in de cellen waar ze actief zijn. Dit zal in de toekomst voor Tiam1, Arhgap33 en 21 verder bestudeerd worden. Het zal ook van interesse zijn na te gaan via co-immunoprecipitatie of deze eiwitten gerecruteerd worden door de p190, p210 of p210m-bcr-abl signalosoomcomplexen.

4.2.2 Differentiële proteoomanalyse van de bcr-abl Ba/F3 cellijnen Het proteoom van de Bcr-abl expresserende Ba/F3 cellen werd geanalyseerd met ‘Shotgun’ massaspectrometrie, na metabolisch merken van de cellulaire eiwitten met ofwel licht(12C, Light) of zwaar (13C, Heavy)-lysine. Er werden paarsgewijze vergelijkingen uitgevoerd tussen p190(L)- en p210(H)-cellen en tussen p210m(L)- en p210(H)-cellen. Hierin werden respectievelijk 166 en 121 eiwitten met significant gewijzigde gemiddelde L/H ratio’s opgepikt. Slechts 31 eiwitten zijn gewijzigd in expressie in beide vergelijkingen (overlap, zie CD-rom: ‘Gereguleerd 95% BI). De proteoomdata waren pas in het laatste deel van de thesis beschikbaar en werden nog maar in beperkte mate geanalyseerd. De eiwitten geselecteerd in 3.1.2 werden niet opgepikt in deze analyse op eiwitniveau, deze en andere Rho-regulatoren zijn mogelijk in te kleine hoeveelheden aanwezig om via deze methode gedetecteerd te worden. Enkel IQGAP2, beschreven als een Rac1 en Cdc42-GAP (63), wordt in hogere hoeveelheid gevonden in p190- en p210m-cellen in vergelijking met p210-cellen. Gebruikmakend van IPA (Ingenuity Pathway Analysis) werd een rangschikking van moleculaire en cellulaire functies gemaakt op basis van het aantal eiwitten uit de datasets dat binnen een functie significant gereguleerd is. De meest uitgesproken aangerijkte functies in beide vergelijkingen zijn ‘celgroei en celproliferatie’ en ‘celdood en overleving’ (addendum 4, figuur 2). Figuur 3 in addendum 4 toont voor 38 eiwitten, die door IPA geassocieerd worden met de functie celdood, hoe deze gewijzigd zijn in expressie in p190-cellen en p210m-cellen versus p210 cellen. Het eiwit dat hierin het sterkst opgereguleerd is in zowel p190- als p210m-cellen in vergelijking met p210-cellen is granzyme B, met een gemiddeld log2L/H ratio van 2.593 (na normalisatie van de datasets). Dit is in overeenstemming met de proteoomdata bekomen uit de vorige bcr-abl Ba/F3 klonen. Granzyme B is een serine/threonineprotease dat een belangrijke 46

rol heeft in apoptose en vooral in deze context bestudeerd wordt. Het wordt voornamelijk geproduceerd door NK-cellen en cytotoxische T-cellen, maar meer recent is ook vastgesteld dat granzyme B ook in andere immuuncellen (waaronder B-cellen) en in niet-immuuncellen tot expressie komt (64, 65). Evidentie neemt toe dat naast een rol in caspase-afhankelijke celdood, dit protease ook betrokken is bij andere cellulaire processen. Granzyme B is ook reeds in verband gebracht met de Rac1 signaalweg. Dock2 induceert, mogelijk via Rac1, granzyme B expressie in T-cellen voor cytotoxische functie (66). In NK cellen is Rac1 essentieel stroomopwaarts van granzyme B expressie door phosphoinositide-3kinase signalisatie (67). Ten slotte, is er ook bewijs voor een rol van granzyme B in matrixproteolyse door cytotoxische lymfocyten. Gesecreteerd granzyme B vertoont sterke proteolytische activiteit op vitronectine, fibronectine en laminine (68). Het dient te worden onderzocht of de bcr-abl p190-cellen granzyme B secreteren. Met granzyme B inhibitoren kan onderzocht worden of de verhoogde expressie van dit protease hun overleving of proliferatie beïnvloedt of eerder een rol speelt in de mesenchymale migratie met matrixdegraderende activiteit. Deze matrixdegraderende werking werd voor p190-cellen recent voorgesteld door (46). Het wordt verwacht dat mogelijke substraten van granzyme B neergereguleerd zijn in p190/p210m cellen vs p210-cellen. In deze context is het opvallend dat het neurofilamenteiwit vimentine neergereguleerd is in beide datasets (zie CD-rom: ‘Gereguleerd 95% BI’). Dit eiwit wordt als granzyme B substraat voorgesteld door Plasman et al. (69). In de bekomen rangschikking van moleculaire en cellulaire functies zijn ook ‘cell motility’ en ‘cell morphology’ aanwezig in de Top 10 functies van respectievelijk de p190/p210 en de p210m/p210 vergelijking. Verschillende eiwitten geassocieerd met celadhesie (bijv. integrine alfa 2b (Q9QUM0) dat is opgereguleerd in 190 en 210m vs p210 cellen) en het actinecelskelet (gelsolin, capping protein, ENA, advilline, testin, etc. ) vertonen gewijzigde expressie in de p190/p210 vergelijking en/of p210m/p210 vergelijking. Gebruikmakend van de cellulaire functie ‘cytoskelet’ in IPA wordt in Addendum 4, figuur 4, de gewijzigde expressie van een set van eiwitten getoond die in IPA (rechtstreeks of onrechtstreeks) met het cytoskelet geassocieerd worden. Het zal van interesse zijn om in de p210 en of p190 cellen de expressie van deze eiwitten te manipuleren (door siRNA of overexpressie) en de effecten op migratie in 3D te testen, alsook op andere cellulaire eigenschappen zoals adhesie en proliferatie.

47

5

Referenties

1. Yang XS, Dormann D, Munsterberg AE, Weijer CJ. Cell movement patterns during gastrulation in the chick are controlled by chemotaxis mediated by positive and negative FGF4 and FGF8. Dev Cell. 2002 Sep;3(3):425-37. PubMed PMID: WOS:000178132800015. English. 2. Luster AD, Alon R, von Andrian UH. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 2005 Dec;6(12):1182-90. PubMed PMID: WOS:000233371900003. English. 3. Martin P. Wound healing - Aiming for perfect skin regeneration. Science. 1997 Apr 4;276(5309):75-81. PubMed PMID: WOS:A1997WR38600048. English. 4. Bogenrieder T, Herlyn M. Axis of evil: molecular mechanisms of cancer metastasis. Oncogene. 2003 Sep 29;22(42):6524-36. PubMed PMID: WOS:000185700700009. English. 5. Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 1962 Mar 1;115:453-66. PubMed PMID: 13872176. Pubmed Central PMCID: 2137509. 6. Zicha D, Dunn GA, Brown AF. A New Direct-Viewing Chemotaxis Chamber. J Cell Sci. 1991 Aug;99:769-75. PubMed PMID: WOS:A1991GB63100011. English. 7. Friedl P, Brocker EB. Reconstructing leukocyte migration in 3D extracellular matrix by time-lapse videomicroscopy and computer-assisted tracking. Methods in molecular biology. 2004;239:77-90. PubMed PMID: 14573911. 8. Kramer N, Walzl A, Unger C, Rosner M, Krupitza G, Hengstschlager M, et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res-Rev Mutat. 2013 Jan-Mar;752(1):10-24. PubMed PMID: WOS:000315072800003. English. 9. Germain RN, Robey EA, Cahalan MD. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 2012 Jun 29;336(6089):1676-81. PubMed PMID: WOS:000305794500042. English. 10. Friedl P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 2004 Feb;16(1):14-23. PubMed PMID: WOS:000188769900003. English. 11. Friedl P, Wolf K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 2010 Jan 11;188(1):11-9. PubMed PMID: WOS:000273507300004. English. 12. Friedl P, Wolf K. Proteolytic interstitial cell migration: a five-step process. Cancer Metast Rev. 2009 Jun;28(1-2):129-35. PubMed PMID: WOS:000264476600011. English. 13. Carragher NO, Walker SM, Carragher LSA, Harris F, Sawyer TK, Brunton VG, et al. Calpain 2 and Src dependence distinguishes mesenchymal and amoeboid modes of tumour cell invasion: a link to integrin function. Oncogene. 2006 Sep 21;25(42):5726-40. PubMed PMID: WOS:000240765800004. English. 14. Fey P, Stephens S, Titus MA, Chisholm RL. SadA, a novel adhesion receptor in Dictyostelium. Journal of Cell Biology. 2002 Dec 23;159(6):1109-19. PubMed PMID: WOS:000180150200019. English. 15. Wolf K, Muller R, Borgmann S, Brocker EB, Friedl P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 2003 Nov 1;102(9):3262-9. PubMed PMID: WOS:000186149400035. English. 16. Tondeleir D VJ, Ampe C. Actin and Actin Filaments. eLS John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. 2011. 17. Fletcher DA, Mullins D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 2010 Jan 28;463(7280):485-92. PubMed PMID: WOS:000273981100040. English. 18. Mattila PK, Lappalainen P. Filopodia: molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Bio. 2008 Jun;9(6):446-54. PubMed PMID: WOS:000256110900013. English. 19. Van Haastert PJM. Chemotaxis: insights from the extending pseudopod. J Cell Sci. 2010 Sep 15;123(18):3031-7. PubMed PMID: WOS:000281575100001. English. 20. Naumanen P, Lappalainen P, Hotulainen P. Mechanisms of actin stress fibre assembly. J MicroscOxford. 2008 Sep;231(3):446-54. PubMed PMID: WOS:000259611000011. English. 21. Salbreux G, Charras G, Paluch E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 2012 Oct;22(10):536-45. PubMed PMID: WOS:000310187500005. English. 22. Farooqui R, Fenteany G. Multiple rows of cells behind an epithelial wound edge extend cryptic lamellipodia to collectively drive cell-sheet movement. J Cell Sci. 2005 Jan 1;118(1):51-63. PubMed PMID: WOS:000226931500006. English. 23. Wolf K, Friedl P. Mapping proteolytic cancer cell-extracellular matrix interfaces. Clin Exp Metastas. 2009 Apr;26(4):289-98. PubMed PMID: WOS:000264174500003. English. 24. Wolf K, Alexander S, Schacht V, Coussens LM, von Andrian UH, van Rheenen J, et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in cell & developmental biology. 2009 Oct;20(8):931-41. PubMed PMID: 19682592.

48

25. Harley BA, Kim HD, Zaman MH, Yannas IV, Lauffenburger DA, Gibson LJ. Microarchitecture of three-dimensional scaffolds influences cell migration behavior via junction interactions. Biophysical journal. 2008 Oct;95(8):4013-24. PubMed PMID: 18621811. Pubmed Central PMCID: 2553126. 26. Provenzano PP, Inman DR, Eliceiri KW, Trier SM, Keely PJ. Contact Guidance Mediated ThreeDimensional Cell Migration is Regulated by Rho/ROCK-Dependent Matrix Reorganization. Biophysical journal. 2008 Dec 1;95(11):5374-84. PubMed PMID: WOS:000260999500036. English. 27. Ulrich TA, Pardo EMD, Kumar S. The Mechanical Rigidity of the Extracellular Matrix Regulates the Structure, Motility, and Proliferation of Glioma Cells. Cancer Res. 2009 May 15;69(10):4167-74. PubMed PMID: WOS:000266214400012. English. 28. Petrie RJ, Doyle AD, Yamada KM. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev Mol Cell Bio. 2009 Aug;10(8):538-49. PubMed PMID: WOS:000268238200015. English. 29. Raftopoulou M, Hall A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 2004 Jan 1;265(1):23-32. PubMed PMID: WOS:000187669700003. English. 30. Mierke CT, Rosel D, Fabry B, Brabek J. Contractile forces in tumor cell migration. Eur J Cell Biol. 2008 Sep;87(8-9):669-76. PubMed PMID: WOS:000259370300019. English. 31. Sanz-Moreno V, Gadea G, Ahn J, Paterson H, Marra P, Pinner S, et al. Rac activation and inactivation control plasticity of tumor cell movement. Cell. 2008 Oct 31;135(3):510-23. PubMed PMID: 18984162. 32. Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007 Jun;26(6):726-40. PubMed PMID: WOS:000247646900007. English. 33. Friedl P, Weigelin B. Interstitial leukocyte migration and immune function. Nat Immunol. 2008 Sep;9(9):960-9. PubMed PMID: WOS:000258559600004. English. 34. Miller MJ, Wei SH, Parker I, Cahalan MD. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 2002 Jun 7;296(5574):1869-73. PubMed PMID: 12016203. 35. Pereira JP, Kelly LM, Cyster JG. Finding the right niche: B-cell migration in the early phases of Tdependent antibody responses. Int Immunol. 2010 Jun;22(6):413-9. PubMed PMID: WOS:000279109000001. English. 36. Gotz A, Jessberger R. Dendritic cell podosome dynamics does not depend on the F-actin regulator SWAP-70. Plos One. 2013;8(3):e60642. PubMed PMID: 23544157. Pubmed Central PMCID: 3609734. 37. Guiet R, Verollet C, Lamsoul I, Cougoule C, Poincloux R, Labrousse A, et al. Macrophage mesenchymal migration requires podosome stabilization by filamin A. J Biol Chem. 2012 Apr 13;287(16):13051-62. PubMed PMID: 22334688. Pubmed Central PMCID: 3339984. 38. Muinonen-Martin AJ, Veltman DM, Kalna G, Insall RH. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. Plos One. 2010;5(12):e15309. PubMed PMID: 21179457. Pubmed Central PMCID: 3001854. 39. Adanja I, Megalizzi V, Debeir O, Decaestecker C. A New Method to Address Unmet Needs for Extracting Individual Cell Migration Features from a Large Number of Cells Embedded in 3D Volumes. Plos One. 2011 Jul 15;6(7). PubMed PMID: WOS:000292811700038. English. 40. Li S, Ilaria RL, Jr., Million RP, Daley GQ, Van Etten RA. The P190, P210, and P230 forms of the BCR/ABL oncogene induce a similar chronic myeloid leukemia-like syndrome in mice but have different lymphoid leukemogenic activity. The Journal of experimental medicine. 1999 May 3;189(9):1399-412. PubMed PMID: 10224280. Pubmed Central PMCID: 2193055. 41. Tong WG, Estrov Z, Wang YT, O'Brien S, Faderl S, Harris DM, et al. The synthetic heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitor EC141 induces degradation of Bcr-Abl p190 protein and apoptosis of Ph-positive acute lymphoblastic leukemia cells. Invest New Drug. 2011 Dec;29(6):1206-12. PubMed PMID: WOS:000294824200009. English. 42. Verma D, Kantarjian HM, Jones D, Luthra R, Borthakur G, Verstovsek S, et al. Chronic myeloid leukemia (CML) with P190(BCR-ABL): analysis of characteristics, outcomes, and prognostic significance. Blood. 2009 Sep 10;114(11):2232-5. PubMed PMID: WOS:000269698400007. English. 43. Kurzrock R, Kantarjian HM, Druker BJ, Talpaz M. Philadelphia chromosome-positive leukemias: from basic mechanisms to molecular therapeutics. Annals of internal medicine. 2003 May 20;138(10):819-30. PubMed PMID: 12755554. 44. Daubon T, Chasseriau J, El Ali A, Rivet J, Kitzis A, Constantin B, et al. Differential motility of p190(bcr-abl)- and p210(bcr-abl)-expressing cells: respective roles of Vav and Bcr-Abl GEFs. Oncogene. 2008 Apr 24;27(19):2673-85. PubMed PMID: WOS:000255259500002. English. 45. Rochelle T DT, Van Troys M, Harnois T, Waterschoot D, Ampe C, Roy L, Bourmeyster N, Constantin B. p210bcr-abl induces amoeboid motility by recruiting ADF/destrin through RhoA/ROCK1. The FASEB journal. 2013 January;27:12. 46. Daubon T, Rochelle T, Bourmeyster N, Genot E. Invadopodia and rolling-type motility are specific features of highly invasive p190(bcr-abl) leukemic cells. Eur J Cell Biol. 2012 Nov-Dec;91(11-12):978-87. PubMed PMID: WOS:000311775000019. English.

49

47. Daubon T, Rochelle T, Bourmeyster N, Genot E. Invadopodia and rolling-type motility are specific features of highly invasive p190(bcr-abl) leukemic cells. Eur J Cell Biol. 2012 Nov-Dec;91(11-12):978-87. 48. Daley GQ, Baltimore D. Transformation of an Interleukin-3-Dependent Hematopoietic-Cell Line by the Chronic Myelogenous Leukemia-Specific P210ber/Abl Protein. P Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-6. 49. Subramaniam S. The Biology Workbench--a seamless database and analysis environment for the biologist. Proteins. 1998 Jul 1;32(1):1-2. PubMed PMID: 9672036. 50. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7). PubMed PMID: WOS:000207581200010. English. 51. Wormer D, Deakin NO, Turner CE. CdGAP regulates cell migration and adhesion dynamics in two-and three-dimensional matrix environments. Cytoskeleton. 2012 Sep;69(9):644-58. PubMed PMID: 52. Wang S, Watanabe T, Matsuzawa K, Katsumi A, Kakeno M, Matsui T, et al. Tiam1 interaction with the PAR complex promotes talin-mediated Rac1 activation during polarized cell migration. The Journal of cell biology. 2012 Oct 15;199(2):331-45. PubMed PMID: 23071154. Pubmed Central PMCID: 3471226. 53. Nakayama M, Goto TM, Sugimoto M, Nishimura T, Shinagawa T, Ohno S, et al. Rho-kinase phosphorylates PAR-3 and disrupts PAR complex formation. Dev Cell. 2008 Feb;14(2):205-15. PubMed PMID: 54. Kaur S, Leszczynska K, Abraham S, Scarcia M, Hiltbrunner S, Marshall CJ, et al. RhoJ/TCL Regulates Endothelial Motility and Tube Formation and Modulates Actomyosin Contractility and Focal Adhesion Numbers. Arterioscl Throm Vas. 2011 Mar;31(3):657-U425. PubMed PMID: WOS:000287409900027. English. 55. Hirsch DS, Pirone DM, Burbelo PD. A new family of Cdc42 effector proteins, CEPs, function in fibroblast and epithelial cell shape changes. J Biol Chem. 2001 Jan 12;276(2):875-83. PubMed PMID: 56. Chardin P. Function and regulation of Rnd proteins. Nature reviews Molecular cell biology. 2006 Jan;7(1):54-62. PubMed PMID: 16493413. 57. Wennerberg K, Forget MA, Ellerbroek SM, Arthur WT, Burridge K, Settleman J, et al. Rnd proteins function as RhoA antagonists by activating p190 RhoGAP. Curr Biol. 2003 Jul 1;13(13):1106-15. PubMed PMID: WOS:000183995700020. English. 58. Riento K, Totty N, Villalonga P, Garg R, Guasch R, Ridley AJ. RhoE function is regulated by ROCK Imediated phosphorylation. Embo J. 2005 Mar 23;24(6):1170-80. PubMed PMID: WOS:000228327000008. 59. Zhong J, Baquiran JB, Bonakdar N, Lees J, Ching YW, Pugacheva E, et al. NEDD9 Stabilizes Focal Adhesions, Increases Binding to the Extra-Cellular Matrix and Differentially Effects 2D versus 3D Cell Migration. Plos One. 2012 Apr 11;7(4). PubMed PMID: WOS:000305336600077. English. 60. Cougoule C, Van Goethem E, Le Cabec V, Lafouresse F, Dupre L, Mehraj V, et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. Eur J Cell Biol. 2012 Nov-Dec;91(11-12):938-49. PubMed PMID: WOS:000311775000015. 61. Sodek KL BT, Ringuette MJ. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 2008 5 August 2008;8(223). 62. Jin T, Xu XH, Hereld D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 2008 Oct;44(1):1-8. PubMed PMID: WOS:000260700600001. English. 63. Brill S, Li SH, Lyman CW, Church DM, Wasmuth JJ, Weissbach L, et al. The Ras GTPase-activatingprotein-related human protein IQGAP2 harbors a potential actin binding domain and interacts with calmodulin and Rho family GTPases. Mol Cell Biol. 1996 Sep;16(9):4869-78. PubMed PMID: WOS:A1996VC89700032. 64. Hagn M, Jahrsdorfer B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 2012 Nov;1(8):1368-75. PubMed PMID: WOS:000316280700016. 65. Boivin WA, Cooper DM, Hiebert PR, Granville DJ. Intracellular versus extracellular granzyme B in immunity and disease: challenging the dogma. Lab Invest. 2009 Nov;89(11):1195-220. PubMed PMID: WOS:000271248200002. English. 66. Jiang HS, Erickson LM, Jang MS, Sanui T, Kunisaki Y, Sasazuki T, et al. Deletion of DOCK2, a regulator of the actin cytoskeleton in lymphocytes, suppresses cardiac allograft rejection. Journal of Experimental Medicine. 2005 Oct 17;202(8):1121-30. PubMed PMID: WOS:000232929500012. English. 67. Jiang K, Zhong B, Gilvary DL, Corliss BC, Hong-Geller E, Wei S, et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nat Immunol. 2000 Nov;1(5):41925. PubMed PMID: WOS:000165076100015. English. 68. Buzza MS, Zamurs L, Sun JR, Bird CH, Smith AI, Trapani JA, et al. Extracellular matrix remodeling by human granzyme B via cleavage of vitronectin, fibronectin, and laminin. J Biol Chem. 2005 Jun 24;280(25):23549-58. PubMed PMID: WOS:000229880000019. English. 69. Plasman K, Van Damme P, Kaiserman D, Impens F, Demeyer K, Helsens K, et al. Probing the Efficiency of Proteolytic Events by Positional Proteomics. Mol Cell Proteomics. 2011 Feb;10(2). PubMed PMID: WOS:000287846500019. English.

50

6

Addenda

6.1 Addendum 1 Rock1

Forward: 5’-GGAGACCTTCAAGCACGA-3’ Reverse: 5’-CTTGTTCTAACCGCTGTTGTAT-3’

RhoA

Forward: 5’-AACCTGAAGAAGGCAGAGATA-3’ Reverse: 5’-GATGAGGCACCCAGACT-3’

Rac1

Forward: 5’-TCGCCTTACTTTACTCAGAGC-3’ Reverse: 5’-AGTCACATGACAGTGTTGGT-3’

Cdc42

Forward: 5’-GGAGGACAGAGTATTTCCACAT-3’ Reverse: 5’-ACAGACTGGACCCACTCA-3’

Rnd3

Forward: 5’-AGCACTACAGAGATTGCGT-3’ Reverse: 5’-TCGCCTTACTTTACTCAGAGC-3’

Tabel 2: Gevalideerde doelwitgen primersets reeds aanwezig in het lab

gen 1=GAPDH 2=18S 3=PGK1 4=UBC 5=TBP 6=G6PDHx 7=HXPRTF

Sequentie Forward

5’-CCCCAATGTGTCCGTCGTG-3’

Reverse

5’-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3’

Forward

5’-TTGACGGAAGGGCACCACCAG-3’

Reverse

5’-GCACCACCACCCACGGAATCG-3’

Forward

5’-CTCCGCTTTCATGTAGAGGAAG-3’

Reverse

5’-GACATCTCCTAGTTTGGACAGTG-3’

Forward

5’-AGGTCAAACAGGAAGACAGACGTA-3’

Reverse

5’-TCACACCCAAGAACAAGCACA-3’

Forward

5’-GGCCTCTCAGAAGCATCACTA-3’

Reverse

5’-GCCAAGCCCTGAGCATAA-3’

Forward

5’-CAGGCTTTAACCGCATCATAGT-3’

Reverse

5’-AGGGCCAAAGATCCTGTTAGC-3’

Forward

5’-TCAGTCAACGGGGGACATAAA-3’

Reverse

5’-GGGGCTGTACTGCTTAACCAG-3’

Tabel 2: Huishoudgen primersets

I

Gen

sequentie

RhoJ

Forward: 5’-GGCGAAAGCGATTGGAG-3’

991-

Exon

Reverse: 5’ TAATTGCACAGCAGCCGT-3’

1142

Boundary

Forward: 5‘-TCCACGTTTGTGTATGCC-3’

3064-

3’ - UTR

Reverse: 5’-AGAGCAATATTACAACTAAGTGGT-3’

3222

Forward: 5‘-GTCCTCATCCGCAAACA-3’

1167-

Reverse: 5’-CCATCCAGAGATGAAGTCCTA-3’

1330

Forward: 5’-CTCAAGTATCAAAGGAAGCAG-3’

2349-

Exon

Reverse: 5’-GTCTTCTTCATCCATCTCGTG-3’

2500

Boundary

Forward: 5’-CAAGGCAATTCATTGCATGTT-3’

1670-

3’ - UTR

Reverse: 5’-ATCCTGTAAGGTTGCTCG-3’

1830

Forward: 5’-ACGATGACTTTATATTTATACACAAACG-3’

6233-

Reverse: 5’-CATGAACAACAGACACACG-3’

6405

Nedd9

Arhgap22

Arhgap31

CDC42EP3

Tiam1

positie

locatie

Coderend

3’ – UTR

Tabel 3: Primersets van de doelwitgenen

Pre-incubatie Amplificatie Denaturatie DNA Hybridisatie primers Elongatie door polymerase Smeltcurve Uitsmelten Afkoeling

Duur 5 minuten

Temperatuur (°C) 95°C

10 seconden 10 seconden 8 seconden 5 seconden 30 seconden 2°C/seconde 10 seconden

95°C 55°C 72°C 95°C 65°C 97 °C 40°C

Tabel 4: RT-qPCR programma. Pre-incubatiestap waarbij het FastStart® Taq DNA polymerase geactiveerd wordt en het cDNA gedenatureerd wordt. 45 amplificatiestappen. Na het experiment wordt een smeltcurve opgesteld

II

Samples 190 1 190 2 190 3 190 4 190 5 190 6

ARHGAP31 0.852±0.124 0.815±0.071 0.643±0.032 0.832±0.135 0.734±0.113 0.829±0.082

Arhgap22 0.991±0.073 0.361±0.056 NaN 0.753±0.077 2.170±0.158 1.436±0.062

CDC42 0.672±0.011 0.759±0.084 0.929±0.055 0.705±0.065 0.880±0.100 0.806±0.021

GADPH 1.084±0.016 1.117±0.030 1.119±0.029 1.037±0.016 1.069±0.023 1.049±0.024

HXPRTF 1.045±0.005 1.025±0.048 0.955±0.070 1.154±0.041 1.090±0.011 1.080±0.030

Nedd9 1.002±0.087 1.151±0.042 1.039±0.028 1.280±0.024 1.046±0.097 1.060±0.024

210m 1 210m 2 210m 3 210m 4 210m 5 210m 6

1.409±0.072 1.671±0.111 1.690±0.299 1.341±0.074 1.421±0.076 1.539±0.049

1.670±0.112 0.885±0.139 0.409±0.022 0.923±0.069 NaN 0.808±0.139

0.902±0.030 1.211±0.056 1.222±0.254 1.054±0.044 1.010±0.108 1.156±0.0057

0.983±0.008 0.881±0.046 0.836±0.012 0.885±0.018 0.985±0.018 0.879±0.012

1.014±0.008 1.055±0.137 1.149±0.036 1.033±0.030 0.935±0.052 1.146±0.027

1.028±0.004 1.077±0.046 1.058±0.065 0.939±0.012 1.005±0.018 0.941±0.018

210 1 210 2 210 3 210 4 210 5 210 6

2.456±0.085 0.373±0.049 0.609±0.075 1.504±0.074 1.756±0.097 1.798±0.071 Rac1 1.222±0.103 1.177±0.141 1.182±0.073 1.298±0.027 1.042±0.029 1.060±0.017

1.378±0.042 0.879±0.038 1.133±0.084 1.571±0.027 1.048±0.042 1.136±0.032 RhoA 1.033±0.057 1.124±0.077 0.891±0.046 1.160±0.015 1.066±0.080 1.045±0.089

1.034±0.045 1.092±0.026 1.069±0.067 0.971±0.040 1.018±0.024 0.959±0.017 Rock1 0.889±0.028 0.862±0.018 0.711±0.029 0.893±0.013 1.012±0.011 1.065±0.017

0.934±0.027 0.815±0.060 0.805±0.158 0.942±0.122 0.927±0.068 0.990±0.055 Tiam1 1.168±0.027 1.350±0.023 1.114±0.084 1.251±0.032 1.297±0.009 1.568±0.026

1.155±0.036 0.762±0.077 0.875±0.088 1.032±0.060 0.810±0.057 0.877±0.028

190 1 190 2 190 3 190 4 190 5 190 6

1.068±0.073 0.728±0.025 1.013±0.066 0.899±0.066 0.625±0.049 0.856±0.072 PKG1 0.883±0.005 0.873±0.021 0.936±0.026 0.836±0.013 0.858±0.007 0.883±0.033

210m 1 210m 2 210m 3 210m 4 210m 5 210m 6

1.003±0.005 1.076±0.047 1.041±0.012 1.094±0.016 1.086±0.023 0.992±0.036

0.973±0.005 0.984±0.043 0.988±0.061 0.826±0.014 0.981±0.019 0.861±0.013

0.930±0.078 1.039±0.072 0.847±0.026 0.824±0.041 1.117±0.032 0.948±0.022

1.042±0.019 1.199±0.052 1.175±0.015 1.042±0.012 1.004±0.020 1.030±0.047

0.900±0.007 1.158±0.075 1.044±0.019 0.986±0.018 0.955±0.018 0.881±0.012

210 1 210 2 210 3 210 4 210 5 210 6

1.035±0.022 1.125±0.036 1.162±0.076 1.093±0.047 1.059±0.025 1.053±0.019

0.982±0.031 0.989±0.029 0.950±0.061 0.834±0.037 0.849±0.023 0.951±0.017

1.003±0.028 1.069±0.029 1.001±0.070 1.073±0.045 0.942±0.059 0.967±0.038

1.072±0.025 0.917±0.025 1.013±0.065 1.217±0.067 0.968±0.026 1.027±0.021

1.048±0.202 0.714±0.017 0.770±0.050 0.926±0.038 0.656±0.017 0.708±0.013

Tabel 5: NRQ (normalised relative quantification). Genormaliseerde expressieniveaus van de doelwitgenen

III

GADPH HXPRTF

PKG1

Normalization Factor

190nrt

0

0

0

0

190tr1

1,016

0,978

0,824

0,935

190tr2

0,968

0,884

0,753

0,864

190tr3

1,131

0,961

0,943

1,008

190tr4

0,985

1,1

0,79

0,95

190tr5

0,872

0,887

0,698

0,814

190tr6

1,019

1,052

0,856

0,972

210muttr1

1,286

1,336

1,311

1,311

210muttr2

0,845

1,016

1,036

0,962

210muttr3

0,894

1,242

1,118

1,075

210muttr4

0,887

1,041

1,103

1,006

210muttr5

1,264

1,204

1,396

1,285

210muttr6

0,757

0,991

0,856

0,863

210tr1

0,792

0,708

0,793

0,763

210tr2

1,369

1,016

1,41

1,252

210tr3

1,03

0,767

1,122

0,961

210tr4

1,191

1,159

1,343

1,229

210tr5

1,03

0,935

1,072

1,011

210tr6

0,909

0,938

1,001

0,948

Tabel 6: Normalisatiefactoren voor iedere staal (tr: eigenlijke cDNA prep; nrt: negatieve controle)

IV

6.2 Addendum 2 Reagens (ml)

8%

10 %

stacking

Volume

5

5

2

Bidest H2O

2.3

2

1.36

30% acrylamide/Bis

1.3

1.7

0.325

1.5 M Tris pH 8.8

1.3

1.3

0.26

10 % SDS

0.050

0.05

0.02

10 % ammonium persulfaat ( APS)*

0.050

0.05

0.02

TEMED*

0.003

0.002

2

Tabel 1: Bereidde polyacrylamide gels voor SDS-PAGE

Eiwit

Leverancier

Catalogus nummer

Oorsprong

Arhgap31

Cell signaling

6954S

Konijn

Tiam1

Santa Cruz

sc-872

Konijn

Arhgap22

Santa Cruz

sc-249959

Geit

GAPDH

Abcam

ab8245

Muis

Primaire antilichamen

Secundaire antilichamen Anti-konijn

Li-cor

926-32211

Geit

Anti-muis

Li-cor

926-32210

Geit

Anti-geit

Li-cor

926-32214

Ezel

Tabel 2: Gebruikte antilichamen bij Western Blotting

V

6.3 Addendum 3

Tabel: data gebruikt voor berekening van mean_dlim, gebruikte maat van inherente variatie in distributie van celtrajectsnelheden tussen replicaten van één conditie

Op basis van vier onafhankelijke migratie-experimenten voor elk van de drie celllijnen werd een delta limietwaarde (dlim) bepaald, die de maat is voor de inherente variatie in de distributie van trajectsnelheden binnen de replicaten van één conditie (voor details zie Huyck et al, addendum 5. De gemiddelde variatie binnen één conditie werd voor deze cellijnen bijgevolg gelijkgesteld aan dlim=0.105

VI

6.4 Addendum 4

Mass spectrometry Protocol Protocol obtained from Ir. An Staes (research group Prof. K; Gevaert, Ugent, dd 11/04/2013) The differential proteome analysis can be divided in four major steps. Starting with the sample preparation, followed by the mass spectrometry analysis, continuing with a database search and ending with data analysis. Sample preparation The cell pellets are first lysed by adding lysis buffer (50 mM sodium phosphate pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.8% CHAPS (wt/vol) and protease inhibitor tablet). Once lysed, protein concentrations are measured using the Bradford assay and equal amounts of the light (12C6 Lysine and heavy (13C6 Lysine) samples are mixed together for each sample pair. Next, samples are reduced and alkylated using TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine) and IAA (iodo-acetamide) and desalted on a nanosep Mw cut-off filter. After desalting, the samples are digested with endoproteinase Lys-C. The peptide mixtures are fractionated by RP-HPLC in order to avoid a too crowded peptide sample for analysis on the LTQ-Orbitrap Velos. Next, fractions differing 20 min in retention time are pooled to reduce the number of LC-MS/MS runs. Mass spectrometry The 20 peptide fractions are analysed by LC-MS/MS on the LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer for each comparison. Database searching The data obtained from the LTQ-Orbitrap Velos are searched against the Swiss-Prot database, limited to “Mus musculus” taxonomy. To identify the proteins, we link each sequence to a protein using the Mascot database search engine. The identification is carried out with confidence settings of 99%. This means that the score always has to be higher than or equal to the identity threshold at 99% confidence in order for a peptide identification to be valid. The threshold score itself is set by the 99% confidence interval setting, the size of the database, tolerances set to the measured masses to the precursor and the fragments and so on. Quantification is performed by the Mascot Distiller algorithm. This algorithm provides “true” and “false” quantifications, where the “true” ones are statistically trustworthy, while the “false” ones are not. Data analysis The results of the database search are stored in our ms-lims system1. To analyse the data, we use the software program “Knime”2. As a standard procedure for differential proteome analysis a statistical analysis was performed. This analysis shows the quality of the experiment and is also a powerful guideline to select for peptides/proteins with a significant different L/H ratio.

1 2

Helsens, et al. ms_lims, a simple yet powerful open source LIMS for ms-driven proteomics. Proteomics 2010 Mar,10(6):1261-4 http://www.knime.org/

VII

Figuur 1: SD waarden voor elk gemiddelde LH ratio van opgepikte eiwitten uitgezet voor p190 vs p210 (boven) en p210m vs p210 (onder).

VIII

Figuur 2: Top 10 van moleculaire en cellulaire functies (IPA) in de p190- en p210m vs p210 vergelijking en in de achtergronddataset.

IX

Figuur 3: 38 eiwitten, door IPA geassocieerd met de functie celdood. Hoe deze gewijzigd zijn in expressie in p190cellen en p210m-cellen versus p210 cellen. Rood: opgereguleerd tov p210, groen: neergereguleerd tov p210, grijs: niet opgepikt in p190/p210m.

X

Figuur 4: 38 eiwitten, door IPA geassocieerd met het cytoskelet. Hoe deze gewijzigd zijn in expressie in p190-cellen en p210m-cellen versus p210 cellen. Rood: opgereguleerd tov p210, groen: neergereguleerd tov p210, grijs: niet opgepikt in p190/p210m.

XI

6.5 Addendum 5 Shifting Quantitative Analysis of Migration Dynamics in 3D matrices to Higher Throughput Huyck Lynn1,2, De Backer Steve3, Masuzzo Paola1,2, Degroeve Sven1,2, Vandekerckhove Joël1,2, Ampe Christophe1,2, Weyn Barbara3, Van Troys Marleen1,2 1 UGent, Department of Biochemistry, Ghent, Belgium 2 VIB, Department of Medical Protein Research, Ghent, Belgium 3 DCILabs, Digital Cell Imaging Labs, Keerbergen, Belgium Abstract Growing demands in fundamental migration/invasion research and in drug discovery of anti-invasion cancer drugs require in vitro test systems allowing high complexity, high information content and higher throughput. The two first criteria are obtained by imaging migration/invasion dynamics of cells embedded in 3D matrices, the last requires automation in image analysis and data processing. These are met by the presented workflow that includes novel image analysis software CELLMIA and validated data analysis. Cell migration is an essential process during development and in adult life. Deregulated cell motility in cancer is the basis of tumor cell dissemination, metastasis and lethality {Van Troys, 2008 #190}. Commonly used cell-based assays probing effects on migration and invasion in vitro remain popular but suffer, certainly for use as antiinvasive drug screening tools, in varying extent from one or more shortcomings: low complexity by using 2D systems to understand 3D phenomena, qualitative or end point instead of quantitative and dynamic analysis, limited automation in analysis, low throughput or requirement of cell labeling {reviewed in \Decaestecker, 2007 #9351;Hand, 2009 #3453} We present a workflow and tools overcoming these shortcomings. It utilizes quantitative analysis of the dynamics of in vitro cell migration in 3D matrices that combines throughput with detailed insight, and, as such, has potential for a.o. preclinical drug screening and thorough characterization of drug effects on in vitro cancer cell invasion (Figure 1a). This cell migration platform exploits 1) two invasion assays on cells fully embedded in different 3D matrices, 2) phase-contrast time lapse imaging of 3) large cell populations of 4) multiple parallel samples (e.g. different treatments) in combination and 5) new, in-house developed, fully automated image analysis software with associated data processing. Together this generates a detailed description of cell invasion dynamics (single cell speed, collective migration speed, directionality) (Figure 1a,b). The implemented assays (see Methods §1.2.2) are a 2D/3D application of woundhealing-like ORISTM migration {Gough, 2011 #448;Hulkower, #3437} and the multicellular tumor spheroid (MCTS) assay {De Wever, 2010 #3422;Truong, 2012 #3440}, both thus far mostly - if not only used for qualitative and/or static, end point quantitative analysis. Here, they are used for dynamic monitoring of invasion at a throughput of 96 and 48 samples per run, respectively. Taking into account technical sample replicates, this allows direct comparison of at least 16 (ORIS TM) or eight (MCTS assay) conditions such as different cell lines, cell treatments (e.g. drugs) or matrix properties (type, density). In addition, parallel analysis of cells under 2D- and 3D-conditions is possible with the woundhealing-like assay (see below). Figure 2a,b illustrates the different behavior (in casu velocity) of a non-invasive epithelial cell line under 2Dand 3D-conditions, confirming the 3D nature of the woundhealing-like ORISTM setup in which the cells are embedded between two matrix layers. By showing a side-view of a Z-stack after fixation and fluorescent labeling, Figure 2c in addition demonstrates that after 36 h of invasion in collagen type I matrix, MDA-MB-231 are present at different z-levels. A common property in both of the 3D setups is, however, that high cell numbers invading the 3D matrix can be monitored by phase-contrast imaging in one focus plane (i.e. at the cell layer in the woundhealing-like assay or at the circumference at the mid plane of the spheroid). Figure 1. Automated quantitative analysis of invasion of large cell populations in 3D matrices at higher throughput. (a) Workflow overview of the migration/invasion platform including the various flexible experimental setups, the dynamic monitoring, the automated digital image analysis (CELLMIA), data processing and parameter extraction. (b) Representative images, extracted from time lapses, showing raw images overlaid with CELLMIA image analysis for MDA-MB-231 invading a 3D collagen type I matrix for the multicellular tumor spheroid assay (top) and 3D woundhealing-like invasion assay (bottom; white asterisk: cell-free zone). The multicolored, numbered tracks indicate the trajectories of detected individually moving cells; the red line delineates in each time frame the area occupied by the bulk of the cells (i.e. the expanding spheroid (top) or the peripheral cell sheet invading the central zone (bottom)); right panels: detail of end point overlay images.

Figure 1a Key in the presented workflow is the potent fully automated Cell Migration and Invasion Analysis software (CELLMIA/MIA) that is applicable on both assays. It is unique in not only tracking large populations of individually moving cells but also in registering (in the same time lapse) the dynamics of migration/invasion of the bulk cell population by measuring in time the area occupied by this population (spheroid or cell sheet), as illustrated in Figure 1b. As such, a very complete picture of the invasion process and its kinetics can be generated with a high flexibility in choice of cells (with different migratory properties: epithelial, mesenchymal, amoeboid, individual, collective) and conditions. CELLMIA algorithms are developed and validated for unlabeled cells fully embedded in 3D matrices. This is in contrast to most existing tracking software packages {references in \Hand, 2009 #3453} with some exceptions {Adanja, 2011 #4654}. CELLMIA consequently performs particularly well in the highly variable background inherent to 3D assays, a feature that is further enhanced by highly tunable algorithms settings. The properties and output of CELLMIA and the ensemble of extracted invasion parameters are collectively presented in Table 1 and Figure 3 and 4, respectively, and are described in detail in Supplementary Notes (§1.2.3) and Supplementary Figures S1-S5). The extracted data are more extensive than obtained from traditionally used end point assays that usually yield an invasion index (based on scoring (low) absolute numbers of invading cells or on scoring the cell populated area at end versus start). Indeed, our approach allows quantifying, first, for cells individually invading the 3D matrix: (i) the trajectories (Figure 3a,b), (ii) the population velocity dynamics i.e. the distribution of mean velocities/trajectory for a large cell population, implying the possibility to identify subpopulations (Figure 3c,d,e) and (iii) (mean) migration directionality of the cell population using different indicators (Figure 4, Figure S4). Second, for the (associated) matrix-invading cell sheet, the kinetics of invasion (i.e. cell sheet velocity) (iv) are determined (Figure 3f-h). Data processing (quality evaluation, parameter extraction, plotting and statistics) currently employs semi-automated VBA- macros in Excel, in combination with R (R version 2.13.1, http://www.R-project.org/) while a JAVA-based, high throughput-amenable, analysis tool for CELLMIA output is being developed. The data processing methodology and coupled statistics are explained in detail in Supplementary Note 2-3 (§1.2.3) and Figures 3-4 and S3-5.

i

TABLE 1 Single Cell Tracking: output parameters ID of track Time index cell row cell col Velocity (µm moved between time points) Angle of movement Delta of Angle of movement Angle of movement relative to "center" Length of track Consistency of motion Cumulated distance travelled Distance between start and endpoint

number frame number in which a trajectory is detected x coordinate y coordinate translocation between two consecutive frames angle of step in trajectory, versus fixed XY axes turning angle between consecutive steps angle of step in trajectory versus XY axes with origin in center of the image (useful for chemo/haptotaxis) total number of frames or time points the cell was detected (Euclidian distance tt0)/total distance at time t

Bulk Cell Area: output parameters Time

frame number of time lapse

Area (µm²)

area covered by bulk of cells

Centroid X Centroid Y Eccentricity

Majoraxislength

additional parameters for spheroid location and shape

Minoraxislength

total distance of track (µm) Euclidian distance of track (µm)

Figure 1b

Figure 2. Comparative analysis of 2D migration and 3D invasion in woundhealing-like setup; (a) Phase-contrast images, extracted from time lapses of non-invasive MCF-7 cells on a 2D collagen coating (left) or in 2 mg/ml collagen 3D matrix (right); white asterisk: cell-free zone. MCF-7 move as a confluent sheet (collective migration); the increase in area occupied by the cells is measured in time using CELLMIA image analysis. (b) Barplot illustrating significant difference in mean cell sheet velocity (calculated from slope of area versus time plot, see also Figure 3f) in 2D (n=5) versus 3D (n=4) conditions (see a); error bars represent SEM; p-value = 0.016 (Wilcoxon rank sum test). (c) Side view of z-stack of confocal microscopy images of MDA-MB-231 cells, stained with DAPI (top) or for F-actin (bottom), after 36 h of invasion in the ORIS invasion assay (collagen, 2 mg/ml), 20x magnification. White arrow indicates direction of migration; delta Z is 90 µm.

Figure 3 a-e. CELLMIA-based velocity analysis of individually moving cells. Overview of output (for details see Supplementary notes 1, 2.1 and 3 and Figure S3) (a) Trajectories of cells invading a 3D collagen matrix, overlaid on the end image of the time lapse or (b) plotted as (x,y)-tracks for a small selection of trajectories of the same time lapse (with (x,y) at time zero set to (0,0)). For each track, a mean cell velocity can be calculated. (c-e) Analysis of the distributions of mean cell velocities/trajectory for detected populations of invading cells: (c) Kernel density probability plot representations of the distribution of mean cell velocities for a control condition (MDA-MB 231 cells in 3D woundhealing-like setup) and after two treatments. This demonstrates (i) the wide inherent velocity distribution (left), (ii) the shift in the distribution upon treatment 1 (in casu inhibition) and (iii) the presence of a slow and fast subpopulation upon treatment 2. The cumulated data of eight replicates/condition are taken into account (control: n=613; 1: n=726; 2: n=244 tracks). (d) For control and treatment 1 (but not for treatment 2) the distribution can in a valid manner also be represented in a Box and Whisker plot with n = size of populations. (e) Distributions of the mean cell velocity for all individual replicates for the control and treatment 1 condition. This is represented as a heat map after hierarchical clustering rendering insight in replicate reproducibility and/or in differences between conditions; the binning is based on mean cell velocity; light to dark blue: low to high mean frequency at specific velocity.

ii

Below, we present a validation of the workflow by describing the effects of known motility inhibitors on invasive cell lines (Figures 6-11). Additional information, valuable in e.g. cancer drug characterization, can be generated by performing staining on the samples post invasion (see below, Figure 11b), and by parallel measuring of effects on cell proliferation {Huyck, 2012 #9839} (see also CHAPTER 1 §1.1). Figure 5 illustrates that under the conditions used for invasion (i.e. same matrixembedding and same high cell density), selected drugs (also used below) do not or only marginally affect cell proliferation of MDA-MB-231 at the concentration applied. Using the workflows in Figure 1a, we analyzed 3D invasion and 2D migration of the breast cancer cell line MDA-MB-231. Individually moving control cells are significantly slower in 3D collagen matrix (2 mg/ml) than on top of a 2D collagen coating (compare mean trajectory velocity for control condition in Figure 6a (3D woundhealinglike assay) and in Figure 6d (MCTS) with that in Figure 6e (2D woundhealing-like assay)). Inhibiting Rho-kinases (ROCKs), key mediators of Rho-regulation of cytoskeletal dynamics and amoeboid motility {Wyckoff, 2006} decelerates invasion in collagen gel matrix and induces a strongly elongated cell morphology.

Figure 3 f-h. CELLMIA-based analysis of kinetics of bulk cell movement. Overview of output (for details see Supplementary notes 1, 2.3 and 3 and Figure S5) (f) Measured area increase in function of time (36 h) for bulk cell population of MDA-MB-231 cells invading a collagen matrix (2 mg/ml) (top) or Matrigel (1.25 mg/ml) (bottom) in 3D woundhealing-like setup for different replicates (n=5) and displaying either a linear (top) or non-linear (bottom) area over time dependency. (Insert) Mean cell sheet velocity in µm²/min, based on the mean of the slopes from linear fitting of the ‘area over time’ plots of the replicates; error bar represents SEM. (g) Data from f (bottom plot) + data for MDA-MB-231 in more dense (5 mg/ml) Matrigel, each presented as mean area of replicate raw data ± SEM versus time (symbols) and as non-linear fit on the mean (red line). (h) Result of statistical comparison of area increase between conditions in g (as indicated in y-axis) at each time point (a comparison independent of fitting). Gray squares indicate when in time the area increase is statistically significantly different (i. e. p≤0.05).

Figure 5. Proliferation measurement in invasion assay setup. Mean proliferation fold ± SEM of untreated and drug-treated (y-27632 (a) and IPA 3 (b)) MDA-MB 231 after 24 hours in ORISTM-woundhealing-like setup either in 2D culture (on a collagen coating) and/or embedded as cell layer in 3D collagen matrix (2 mg/ml). As for testing invasion, cells were seeded as a confluent sheet (40,000 cells per well); when seeded at lower density (10,000 cells/well) proliferation fold at t24 approximates 2 and 1.2 in 2D and 3D, respectively {Huyck, 2012 #9839} (see CHAPTER 1 §1.1). Y27632 and IPA 3 are ROCK and PAK inhibitors, respectively; for all conditions, control and treated samples are not significantly different (p>0.05).

with that in Figure 6e (2D woundhealing-like assay)). Inhibiting Rhokinases (ROCKs), key mediators of Rho-regulation of cytoskeletal dynamics and amoeboid motility {Wyckoff, 2006 #4105} decelerates invasion in collagen gel matrix and induces a strongly elongated cell morphology. In the 3D woundhealing-like assay, 10 µM y-27632 (ROCK inhibitor) shifts the velocity distribution of the population of individually moving cells to lower values, with a median velocity reduction of >40% (effect size d > 0.6) (box plot representation and Kernel density plot in Figure 6a (top) and Figure 6b, respectively), and also significantly slows down the kinetics of bulk cell movement (area over time plots in Figure 6a (bottom) and derived mean cell sheet velocity in Figure 6c). Reproducibility (% CV in mean cell velocities) for replicates within one experiment and across experiments is adequate (Table 2). Higher y27632 concentrations are required to slow down invasion in the spheroid assay (Figure 6d) than in the 3D woundhealing-like assay (Figure 6a). This may be due to a distinct collagen fiber orientation in the two 3D assays, with a radial orientation around the spheroid possibly promoting haptokinetic single cell invasion {Provenzano, 2008 #4102} and/or to a different rigidity in the collagen fiber network {Fraley, 2010 #9362;Fraley, 2011 #10954}. Using more than one in vitro 3D setup, may thus provide opportunities for increased insight in signaling underlying invasion. The quantification in addition shows that invasion in 3D collagen is only partially reduced by y-27632 (Figure 6a,b,d), in line with the occurrence of (interconverting) migration modes (amoeboid and mesenchymal). Since on a 2D surface, mesenchymal migration is expected to dominate, 2D migration is only marginally affected by y27632 treatment (Figure 6e), both on the level of bulk cell migration or single cell velocity (median velocity decreases ~15 % versus control, d=0.35). Table 2 - Reproducibility

Figure4 Figure 4. CELLMIA-based analysis of directionality of individually invading/migrating cells. Overview of output (for details see Supplementary Note 2.2 and 3, and Figure S4). (a) Schematic representation of CELLMIA output related to directionality: Euclidian (‘E’) and cumulative (‘C’) distance of the cell trajectories; the ‘delta angle of movement’ or ‘frame-based turning angle’ is the angle between two consecutive frames (velocity independent indicator) as indicated. (b) Histogram representing mean % frequencies of frame-based turning angles in 10° bins. This mean is the calculated mean % frequency in each bin over all replicate time lapses (n=5) of a condition; error bars represent SEM (c) Comparison of % frequency (for data shown in b) within and outside the -30 ° to +30 ° angular section.

CV (%)

y-27632 (µM) technical replicate

biological replicate

0

7.77

12.85

2

11.53

12.82

5

7.97

21.10

10

13.24

18.19

Table 2. Reproducibility. Coefficients of variation (n=6) of mean cell velocities of individually moving cells for MDA-MB-231 invasion in the 3D collagen (2 mg/ml) woundhealing-like setup for untreated cells and y-27632 treated cells in replicates from one experiment (technical replicates) and across experiments (biological

iii

replicates) (data from Figure 6a (top)) and an identical independently performed experiment (not shown)).

Figures 6a,d,e also clearly demonstrate that the single cell velocity analysis is based on large numbers of tracked cells (e.g. n>900 tracks/condition, Figure 6e, left). This number is well above the sample size minimally required to discriminate populations with shifts in median velocity of 12-50 % (effect size 0.6>d>0.24) (Figure S6), proving the analysis is highly reliable and sensitive. This is discussed in Supplementary Note 4 (§1.2.3) together with the requirement for combining p-values and effect sizes when comparing large samples sizes, as applied here. For all experiments shown below, the results of statistical testing on the single cell velocity distributions is displayed in the figures (p-value, effect size d) and in Supplementary Table S1 (p, d and 95 % confidence interval on d). Figure 7a-c demonstrate that we obtain very similar results on the fibrosarcoma cell line HT-1080 as on MDA-MB-231: faster 2D migration versus 3D invasion, partial inhibition of 3D invasion by y-27632, and no effect with comparable doses under 2D conditions.

Figure 6 de MDA-MB-231 cell motile properties in 3D (MCTS assay) and 2D migration. (d) cell invasion analyzed in the spheroid invasion setup (2 mg/ml collagen); (e) cell migration analyzed using a 2D collagen-coated surface in woundhealing-like setup. For details on panels (i, ii, iii, iv) see (a).

Figure 6 abc. MDA-MB-231 cell invasion analyzed in the 3D collagen (2 mg/ml) woundhealing-like setup. MDA-MB-231 are untreated (control) or treated with y27632 as indicated. (a) Several panels from top to bottom: (i) box plot of the mean distribution of single cell velocities, (ii) table with associated p-values and effect sizes d (white boxes: significant difference, gray boxes indicate no significant difference, significance is based on p<0.05 or d>0.15) (for details see Supplementary Note 3 and 4), (iii) kinetics of cell sheet migration documented by a plot of the mean area increase in time over n replicates (symbols; error bars: SEM); line: quadratic fit and (iv) the result of comparisons of the area increase at each time point for the different conditions (indicated in y-axis) (for details see Supplementary Note 3); gray squares represent for each comparison a statistically significant difference (p<0.05) at the respective time point. (b) Kernel probability density plot of velocity distributions of individually invading cells; this plot documents the unimodal character of these distributions that are also shown in (a) (top panel). (c) (top) data from (a, panel (iii)) but shown with linear fitting (lines); (bottom) the mean slopes of linear fits of individual replicates are used to quantify cell sheet velocity for each condition. Multiple comparison results in p-values indicated in table below the graph.

As a second drug treatment, we used LatrunculinB (LatB) which directly targets the motor of motility, i.e. the dynamics of the actin cytoskeleton by exerting F-actin depolymerization. This drug strongly affects invasion in 3D collagen (woundhealing-like setup), inhibiting both the cell sheet (Figure 8b) and single cells escaping the sheet (Figure 8a): at 0.5 µM LatB, single cell invasion and bulk cell movement is nearly completely inhibited.

Our workflow easily allows testing combinations of anti-invasive drugs or migration effects in different matrices. We inhibited in MDA-MB-231 both Rho-ROCK and Rac-PAK signaling using y-27632 and Class I PAK inhibitor IPA 3, respectively and tested effects on 3D invasion in collagen. PAK inhibition induces the appearance of a slower subpopulation (as demonstrated by the Kernel probability plot of the velocity distribution (Figure 9 (top)). The combined effect of low concentrations of both drugs was also tested (Figure 9). A combination of 2.5 µM of both drugs has a significantly stronger effect than 2.5 µM of each of the drugs added individually indicative of additive effect (see p and d-values in Table in Figure 9: the effect of the 2.5 µM combination is significant versus control, that of each individual addition at 2.5 µM is not; the effect of the combination is in addition also significant versus the individual use of each drug). The combination of 2.5 µM of both drugs, however, did not induce a stronger effect than 5 µM of the individual drugs. Figure 10a (woundhealing-like assay) and Figure 10b (MCTS assay) show the results of testing of the effects of matrix density (by increasing collagen concentrations) and of the degree of fiber crosslinking (by comparing native collagen (which is non-pepsin-treated) with pepsintreated collagen (Nutragen, with reduced cross-linking ability due to absence of terminal telopeptides in collagen molecules) on MDA-MB231 invasion velocity in both assays. Our quantification shows that higher density (compare different concentration of Nutragen or different concentration of collagen) as well as higher crosslinking (compare Nutragen and collagen at the same concentration) significantly slow down both single cell and bulk cell invasion in the 3D woundhealing-like assay (Figure 10a). Similarly, single cells escape from the MCTS at lower velocity in a matrix of higher protein concentration or higher crosslinking degree (see shifts in maximum of the velocity distributions to in the Kernel probability plots Figure 10b, left). Largely similar effects are observed based on the velocity kinetics of the bulk spheroid. In addition, Figure 10c shows that cell migration becomes less directional with increased density and/or cross-linking of the collagen fibrous matrix. In Matrigel, a mimic of the dense basement membrane, we demonstrate that MDA-MB-231 display different and initially significantly slower invasion kinetics when dense (5 mg/ml) Matrigel was used (compared to 1.25 or 2.5 mg/ml) (Figure 11a). Post invasion staining demonstrated that in the dense Matrigel the cells display a ‘follow the leader’ migration mode (likely because the denser matrix imposes proteolytic migration), whereas in less dense Matrigel, similar as in collagen gel, true single cell migration is more prominent (Figure 11).

iv

Figure 9. Drug combination effects on MDA-MB-231 cell invasion in the 3D collagen (2 mg/ml) woundhealing-like setup: effect of ROCK and PAK inhibition. MDA-MB231 are untreated (control) or treated with 2.5 µM or 5 µM y-27632, 2.5 or 5 µM IPA 3, 2.5 µM y-27632 + 2.5 µM IPA 3 or 5 µM y-27632 + 5 µM IPA 3. The Kernel probability density plots of mean single cell velocities are shown (only for a selection of the conditions), a table with p-value and effect sizes d for comparisons of the mean single cell velocity distributions for all conditions tested (gray boxes indicate no significant difference based on p>0.05 or d<0.15).

Figure 7. (see next page) Analysis of kinetics of invasion or migration of HT-1080 cells. HT-1080 are untreated (control) or treated with y-27632 as indicated. HT-1080 cell invasion or migration and effect of ROCK inhibition analyzed in (a) the 3D collagen (2 mg/ml) woundhealing-like setup, (b) the spheroid invasion setup (2 mg/ml collagen) and (c) on a 2D collagen-coated surface in woundhealing-like setup. (left) Distribution of single cell velocities, thresholding: 33 % motile steps/track and >1.895 µm/step; p-values from a multiple comparison and corresponding effect sizes d are shown. (right, top) Kinetics of cell sheet movement shown as plot of the mean area increase in time over n replicates (symbols; error bars: SEM; line: quadratic fitting); (right, bottom) result of statistical analysis of the area increase at each time point for the different conditions; gray squares represent for each comparison (indicated in y-axis) a statistically significant difference (p<0.05) at the respective time point.

Figure 8. Effect of Latrunculin B on MDA-MB-231 invasion (a) Single cell velocity distribution of invading MDA-MB-231 in 3D collagen (2 mg/ml) woundhealing-like setup. MDA-MB-231 are untreated (control) or treated with Latrunculin B (LT). BH-corrected p-values and d for the pairwise comparisons are shown in the table (not for 750 nM condition). (b) (top) Mean area increase in time (over 4 replicates) of cell sheet invasion (top, open symbols, error bars: SEM, lines: quadratic fitting). (bottom) Statistical analysis: gray squares represent for each comparison (indicated in y-axis) a statistically significant difference (p<0.05) at the respective time point.

In summary, this validation using different cell lines, different inhibitors and different matrix conditions demonstrate the potency, flexibility and sensitivity of the experimental setup and of the CELLMIA-based image analysis as well as the statistical robustness of the data analysis. Importantly, the higher throughput implies no trade-off to data quality which is not only quantitative but also renders insight in kinetics. As such, this approach provides perspective for use in high-throughput screening approaches in 3D matrix, more particular in the early steps of target, biomarker or drug identification that are known to largely determine clinical usefulness. Automation and further increase of throughput of the experimental part of both assay types is possible, as based on recent reports {http://www.platypustech.com`, Truong, 2012}.

Figure 10 ab. MDA-MB-231 cell invasion in 3D collagen-based matrices.: non-pepsin treated collagen type I (C) and Nutragen (pepsin-treated) (N) at different concentrations. (a) 3D woundhealing-like setup (1, 2 and 4 mg/ml) (the statistical analysis of the area kinetics is limited to comparing the different concentration within one matrix type and to a comparison of each concentration in the two matrix types) and in (b) spheroid assay (2 and 4 mg/ml). Panels as described in Figure 6 and 8.

v

Methods Cell culture Human breast adenocarcinoma fibroblast-like MDA-MB-231 (ATCC: HTB26) and human fibrosarcoma HT-1080 (ATCC: CCL-121) were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplemented with 10 % heat-inactivated foetal calf serum (FCS) (Gibco), 20 mM L-GlutaMaxI (Gibco). Human mammary adenocarcinoma epithelial-like MCF-7 (ATCC: HTB-22) were cultivated in 1:1 ratio of DMEM/F12 nutritional component HAM medium (DMEM/F12 1:1, Gibco) supplemented with 10 % heat-inactivated FCS (Gibco), 20 mM L-GlutaMaxI (Gibco). The non-tumorigenic epithelial mammary gland cell line MCF10A was grown in DMEM/F12 with 20 nM GlutamaxI, 20 ng/ml EGF (Sigma), 10 µg/ml insulin (Sigma), 500 ng/ml hydrocortisone (Sigma), 5% horse serum (Gibco). All cells were maintained in media with 1 % penicillin-streptomycin (Gibco) at 37 °C in humidified 5 % CO2 atmosphere. ECM protein handling Non-pepsin-treated collagen type I (Rat-tail, acid-extracted, hereafter termed collagen) and Matrigel were obtained from BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA); Nutragen (bovine, pepsin-treated collagen type I) was from Advanced Biomatrix (San Diego, CA, USA); Fibronectin (from human plasma) was from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 2D coating of monomeric collagen or fibronectin was done by incubating wells of a 96-well plate (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) one hour at room temperature with 100 µl 40 µg/ml collagen in calcium and magnesium containing Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS, Gibco) or at 37°C with 100 µl 1 µg/ml fibronectin. ECM preparation was performed using ECM protein obtained in sufficiently large amounts to ensure using identical batches of ECM protein for a related series of experiments. Furthermore, care was taken to perform all steps in the preparation of the ECM solution under as constant conditions as practically feasible. Special attention is paid regarding the order of addition of all components, setting of pH, working temperature (solution is kept on ice during handling prior to polymerization and the incubation temperature and time for polymerization. The solution for gelled collagen 3D matrix consists of 2 mg/ml (or as specified) collagen, 1x MEM (Gibco) and 8.3 mM NaHCO3 in Hank’s Balanced Salt Solution (Gibco) and was adjusted to a pH of 7.4 – 8 using 1 M NaOH. Nutragen (6 mg/ml) was diluted with the growth medium used in the assay to 4.8 mg/ml and the pH was adjusted to 7.4 – 8 using 1 M NaOH; the Nutragen solution was than further diluted with the respective growth medium to the desired concentration. Matrigel was diluted 2, 5 or 8 fold with normal growth medium to a final concentration of 5, 2 and 1.25 mg/ml (based on approximate batch concentration provided by the manufacturer). The collagen, Nutragen and Matrigel solutions were kept on ice until further use. Migration/Invasion assays 2D woundhealing-like assay (OrisTM cell migration assay (Platypus Technologies)) 40,000 to 50,000 cells/well were seeded on fibronectin or (monomeric) collagen-coated 96-well plates, populated with OrisTM cell seeding stoppers (Platypus Technologies) in normal growth medium. As described {Gough, 2011 #448}, this generates an outer rim of confluent cells (‘cell sheet’) around a central homogeneously sized cell-free area into which migration can occur. After minimally 1.5 - 2 h or maximally overnight cell adhesion and spreading, the growth medium was replaced with 200 µl of the desired medium (e.g. control medium, drug-supplemented medium). Phase-contrast time lapse movies (of approximately ¼ of the well) were recorded for 24 h (HT-1080 and MDA-MB-231) to 48 h (MCF-7) with an interval of 15 min or as indicated. 3D woundhealing-like assay We used the OrisTM cell invasion assay protocol (Platypus Technologies) with small adaptations. In the wells of a 96-well plate, a thin bottom matrix layer (collagen, Nutragen or Matrigel) was generated by pipetting and immediately removing the matrix solution. Oris TM cell seeding stoppers were immediately inserted in the wells i.e. before matrix polymerization. Matrix polymerization was allowed for approximately 15 minutes at 37 °C and 5 % CO2 and cells (40-50,000/well) were subsequently seeded around the stoppers in normal growth medium on top of the matrix layer. After minimally 1.5 -2 h or maximally overnight cell adhesion and spreading, the seeding stoppers and the growth medium were removed and the cells were overlaid with a second layer (40 µl) of the matrix solution (if needed with added inhibitors). Following polymerization (30 min at 37 °C and 5 % CO2), 200 µl medium (e.g. control medium, drug-supplemented medium) was added on top of the cell containing matrix layers. The insertion of stoppers before polymerization of bottom layer results in a bottom layer in which the center is slightly depressed versus the rim. The cells that are seeded as a confluent layer at the rim and that largely invade the cell free central area in the same plane of focus (see Figure 1B), are consequently mainly confronted with and assumed invading the top matrix layer. After covering the multiwell plate with a glass plate and sealing the edges with

microporous tape (Millipore), it was positioned on the robotic stage of the microscope and the optimal focus for imaging was manually set in each well; subsequently the time lapse was started. Phase-contrast time lapse movies (of approximately ¼ of the well) of cell invasion were recorded for 36 h (HT-1080 and MDA-MB-231) to 48 h (MCF-7) with an interval of 20 min (or as specified).

Figure 10 c. Analysis of directionality of invading MDA-MB-231 cells in matrices of different density and crosslinking degree. Distribution of turning angles for invasion in 2 mg/ml (top) and 4 mg/ml (middle) collagen matrix in 3D woundhealinglike setup. (bottom) Comparison of mean summed frequency (%) in angular section [30 °, 30 °] for invasion in 3D matrices (collagen type I and Nutragen) at different concentrations (1, 2 and 4 mg/ml) in 3D woundhealing-like setup. Results of statistical comparison are shown with * p<0.05, ** p<0.01

Multicellular (tumor) spheroid assay Multicellular spheroids were generated in agarose gels with microwells (330 microwells/gel, 800 µm diameter/well) that were made using polydimethyl-siloxane (PDMS) micromolds (MicroTissues Inc, Providence, Rhode Island, USA) {Napolitano, 2007 #4474} as follows. PDMS micromolds and Ultrapure agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA) powder were separately sterilized by autoclaving. 2,75 ml of a heated 2 % (w/v) agarose solution was pipetted into each PDMS micromold taking care trapped air bubbles are removed. The resulting agarose gel wasseparated from the PDMS micromold using a spatula, transferred to a well of a six-well tissue culture plate, and equilibrated for minimally 2 h with growth medium. Per agarose gel, 200 µl normal growth medium containing 500,000 cells, was subsequently seeded in the microwells. Cells settled into the microwells (10-20 min) and then normal growth medium was added to submerge the entire gel. After 72 h incubation at 37 °C and 5 % CO2, the spheroids are formed. Uniformly sized ones are picked using a Pasteur pipette and dropped into the center of a well of 24 or 48-well plate that is filled with cold matrix solution (450 or 200 µl per well, respectively). The spheroid-containing matrix was allowed to polymerize for 45 min at 37 °C and 5 % CO2. The spheroid-containing matrix was allowed to polymerize for 45 min at 37 °C and 5 % CO 2. The subsequent steps include (i) addition of medium on top of matrix, (ii) covering of the multiwell plate with a glass plate and (iii) sealing the edges with microporous tape (Millipore), (iv) positioning the plate on the robotic stage of the microscope, (v) setting in each well the optimal focus for imaging and (vi) immediately initiating the time lapse. The time between the start of the matrix polymerization step and the start (frame 1) of imaging is thus kept (relatively) constant and is not dependent on the onset of single cells escaping the spheroid. Invasion was followed using 24 h phase-contrast time lapse imaging at an interval time of 20 min or as specified. Media and drug treatments during migration/invasion Migration/invasion of MDA-MB-231 cells was followed in low serum medium (DMEM, 1 % heat-inactivated FCS, 20 mM L-GlutaMaxI) supplemented with 1 nM EGF (Sigma). Under these conditions, the cells migrate/invade faster and have lower proliferation rates than in growth medium. Migration of HT-1080 and MCF-7 was assayed in normal growth medium; MCF10A cells migrated in normal growth medium or growth medium with low serum concentrations (0.5%). Cells were treated with different concentrations of the ROCK inhibitor y27632 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) {Ishizaki, 2000

vi

#9750} and/or the class I PAK inhibitor IPA 3 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA) {Deacon, 2008 #304}. The inhibitors were added by replacing the growth medium with drug-containing medium (2D) before the start of the time lapse. In the 3D matrix-embedded setups, the drugs were added both to the matrix (top layer in 3D woundhealing-like setup) and to the growth medium overlaying the matrix. Cell proliferation assay in 3D matrix Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche, Basel, Switzerland) was used for measuring cell proliferation of cells embedded in 3D matrix using the manufacturers’ protocol described for 2D cultures. Cells were seeded in TM the matrix layer setup as described above (3D ORIS cell invasion assay), but without populating the 96-wells with stoppers {Huyck, 2012 #9839}. At 0 h (t0) and in parallel samples after 24 h proliferation (t24), 50 µl of the XTT labeling mixture was added to the 100 µl of growth medium present on top of the 40 µl collagen I gel. All conditions were performed in 5 (y-27632) / 8 (IPA 3) replicates. Per condition, blanks containing matrix, drugs etc. but no cells, were included. Absorbance was measured 3 h after XTT addition at 450 nm and at a reference wavelength (620 nm). After log transformation of the values, net absorbances (A 450 – A620)

Image analysis, data processing and statistics for migration/invasion analysisSee Supplementary Notes (§1.2.3)

Supplementary Notes Overview: Supplementary Note 1

CELLMIA software: properties, output, performance and quality control

Supplementary Note 2

Data-processing: methodology and validation


Data-processing: interferential and descriptive statistics CELLMIA tracking of individually moving cells: p-values and effect sizes, minimal size tracked population.


SUPPLEMENTARY NOTE 1. CELLMIA software: properties, output, performance and quality control The CELLMIA package is a dedicated, stand-alone software package for detailed quantification of cell migration of unlabelled cells under 3D conditions. It is thus specifically designed for segmenting images of cells TM present in a 3D matrix (collagen, Nutragen, Matrigel ) and registered by TM phase-contrast time lapse recording. It is developed for the 3D ORIS woundhealing-like assay and for a multicellular spheroid invasion assay (Figure 1, see Methods (§1.2.2) for a description of the assays) but can also be used for quantifying migration of cells in a 2D woundhealing-like setup (Figure 6e), for quantification of random migration of sparsely seeded cells (in experiments where no bulk cell region is present) or for analysis of (homogeneously) fluorescent cell populations in all formats (Figure S1a). The input is an imaged time series. This is converted to the correct file format using a powerful importer that is incorporated in the software and that can accept images from most common work stations (scanning station independent import).

Figure 11. MDA-MB-231 cell invasion in Matrigel. (a) MDA-MB-231 cell invasion kinetics in Matrigel at different densities (5, 2 and 1.25 mg/ml) in 3D woundhealing-like setup and associated statistics comparing the area increase at each time point for the different conditions (indicated in y-axis) in a pairwise fashion; gray squares represent for each comparison a statistically significant difference (p<0.05) at the respective time point (See supplementary Note 3). All panels show mean of n replicates (n=8); error bars: SEM. (b) Post invasion staining of the nuclei and F-actin cytoskeleton in 3D collagen (left) or Matrigel (middle, right) after invasion analysis in 3D woundhealing-like assay. Note the difference in migration mode in collagen versus Matrigel.

were calculated and mean net absorbances over all replicates per condition at t0 and at t24 were calculated and blank-corrected (by subtracting the mean of the blanks). Mean cell proliferation at t24 was expressed as mean fold increase versus t0 ± SEM. Post invasion staining MDA-MB-231 cells embedded in between two layers of ECM (collagen or Matrigel) in a 96- well plate (3D woundhealing-like setup) were fixed in 4 % paraformaldehyde (20 min), permeabilized with 0.5 % Triton X-100 in D-PBS (15 min) and blocked in 2 % BSA (bovine serum albumin, SigmaAldrich)/1 % Glycine in D-PBS (30 min). AlexaFluor 594 phalloidin (Molecular Probes) was diluted 1:200 in 2 % BSA / 1 % Glycine in D-PBS and incubated for 30 min at 37 °C to visualize filamentous actin. Nuclei were stained with a filtered (0.22 µm pore size, Millipore) DAPI solution (1 µg/ml) (Molecular Probes) (1 min incubation). A washing step (incubation with D-PBS while ‘shaking’) was included after permeabilization (1 time, 1 min), after phalloidin staining (2 times, 10 min) and after DAPI staining (3 times, 10 min). Microscopy Migration and invasion imaging in all setups was performed using a 10X UPlanFL objective (N.A. 0.30) on a CellM System with an upright microscope (IX81) equipped with a xyz-robotic stage, temperature- and CO2-control (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan). For both the 2D and 3D setups, phase-contrast imaging is done in one plane of focus. In each well the optimal plane of focus (z) and xy position are set manually of the start of the time-lapse. This results in a postion list with an xyz/well (e.g. a 60-position list) that is re-used at each time step for the total duration of the time-lapse movie. Fluorescent images post invasion were obtained on an Olympus FluoView 1000 – confocal laser scanning microscope using a 20x UPlanFL objective (N.A. 0.50, Olympus). Image montages were generated using ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).

Supplementary Figure 1. CELLMIA Performance (a) CELLMIA analysis of fluorescent cells. End image of time series of GFP-expressing MDA-MB-231 cells in the 2D-woundhealing-like setup overlaid with CELLMIA analysis. (b) Background subtraction. Image of a multicellular spheroid embedded in 3D-collagen gel (left) unprocessed (middle) after background subtraction; (right) Localized maxima in intensity after background subtraction are assigned as single cells (red dots, shown overlaid on raw data). (c) Two algorithms to meet variation in image contrast and background. Analysis of selected images or image parts of 3D-woundhealing like assay (left) or spheroid assay (right) of MDA-MB-231 embedded in 3D collagen matrix demonstrating a more close delineation of the bulk cell area by algorithm type 1; algo 1 (type1): top panels, algo 2 (type2): bottom panels

Since a major problem for automated cell detection in phase-contrast images - especially in 3D matrices - is the high and variable background (variable within one image; variable between images of one time series or of different time series), CELLMIA provides - for both assays - the choice of two algorithm types (termed algo 1 and 2) that have a different segmentation basis and that moreover are highly tunable via userfriendly modulation of multiple algorithm settings. Together this accommodates – in our experience – high quality analysis of images within a wide range of contrast or ‘signal to noise’ levels. Background illumination correction is achieved using grayscale morphological operators (Figure S1b). Algo 1 is an ‘intensity-based’ algorithm that, in every image, first segments the individual cells and then estimates the bulk cell region from found cells. The single cell segmentation is based on the local maxima in intensity that remain after a background

vii

subtraction (using settings “maximal cell radius”, “cells lighter and/or darker than background”), a smoothing step using the setting “typical cell radius” and application of the set “noise level”. The bulk cell region is subsequently assigned to regions of high cell density (with cell density obtained using Kernel density estimation) and using two bulk cell region settings (one for the area scanned around a single cell to determine if it is in the bulk and a sensitivity parameter). Algo 2 is an ‘edge’ based algorithm, that - based on the derivative of the images - looks at strong local variations in intensity for single cell and bulk cell area detection using the setting “sensitivity” as threshold for foreground/background separation. In contrast to algo 1, bulk cell region detection and single cell detection are independent in algo 2. Applied to the two assays used here, the bulk cell region corresponds to the peripheral cell sheet in the woundhealing-like assays or to the spheroid itself, and this bulk cell region evolves through the image series (i.e. in time). The bulk cell region is delineated by a red line in each image and its area is registered (Figure 1b). Single cell tracking only uses cells detected outside the bulk cell region. Tracking is performed using a simple Brownian motion model. Linking of segmented cells in consecutive time steps is implemented using the Hungarian algorithm (Matlab implementation by Alex Melin, 2006) with the distance between cells of consecutive time steps as cost matrix. Two adaptations have been made: (1) a (tunable) limit is set on the distance the cells can jump in one time step, (2) a (tunable) option is included to reconnect lost cell-tracks, allowing a more robust tracking in case a tracked cell is not detected at one or more time points. Default algo 1 and 2 settings are available. These can however be adapted to the specific needs of the images on multiple levels (e.g. noise level, sensitivity, typical and maximum cell diameter, etc.). For the analyzes presented here, default settings were mostly used. Once settings are defined by the user, the image analysis is fully automated and no further manual intervention is required. The CELLMIA-output is both qualitative (image-based ) and quantitative (txt-based). Using generated overlay images (TIFF) the result of the analysis can be qualitatively evaluated side by side with the original raw data in a powerful viewer. As mentioned in the main text, the software results in data on two major migration/invasion phenomena: (i) individual cell motility via determining cell trajectories in time (with as default (but adjustable) minimal trajectory length of 10 frames) and (ii) the invasion of more collectively moving cells by determining the evolution in time of the bulk cell covered area. Multiple features characterizing these phenomena are provided in two separate text files for each time lapse as listed in Table 1. As stated above, the need to incorporate two algorithms in CELLMIA was necessitated by the strong variance in the acquired images; this variance is instrument-, cell type- and 3D matrix-related and is manifested as variable homogeneity of illumination and variable signal to noise ratios. Overall, for high quality images (high signal to noise, high contrast, high illumination homogeneity), algo 1 appears the algorithm of choice especially for single cell tracking, whereas algo 2 (which is more sensitive) also performs on images of lower contrast (algo 2 was e.g. used for images generated using the spheroid assay). A drawback of algo 2 is that it more frequently leads to oversegmentation of small objects (cells, artifacts) in specific images. However, an evident advantage of the higher sensitivity of algo 2 is that it succeeds in more closely delineating the bulk cell area (Figure S1c). The automated tracking by CELLMIA was compared to manual tracking using the ImageJ plug-in ManualTrack (Figure S2a,b) (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html). Manual tracking requires clicking the centroid of a cell of interest in each frame of a time series. Figure S2a shows an overlay of a selection of five trajectories obtained using either manual tracking or automated CELLMIA analysis. This demonstrates that the automated tracking is sufficiently reliable. Despite this strong overlap in the tracking results of specific cells, Figure S2b shows for a control and for an inhibitor-treated cell population, that the median velocity values strongly differ when obtained using manual tracking (19 cells were picked by the user from the time series of a control sample and 19 cells from a treated (10 µM y-27632) sample) or using the fully automated tracking (CELLMIA) of the same two time series (identified tracks n=163 and 203 for control and treated, respectively). CELLMIA results in a lower median value and a wider distribution for both the control and inhibited condition. We believe the lower median is caused by the fact that the user is biased to picking cells with a higher motility, whereas in CELLMIA a larger population is tracked in a manner unbiased by velocity level. The problem of selecting ‘representative’ population subsets during manual tracking, resulting in lower reliability, was also documented for 2D migration {Huth, 2010 #3431}. Together, this demonstrates the power of unbiased, automated tracking in general and by CELLMIA, in particular. Please note that the data presented in Figure S4e obtained by automated tracking are already filtered (using stringent conditions, see below (Supplementary Note 2.1))

to exclude immobile artifacts or dead cells that could erroneously contribute to a decrease in the median velocity. SUPPLEMENTARY NOTE 2. Data-processing: methodology and validation 2.1. Velocity of individually moving cells Based on the (x,y)-coordinates of the single cell trajectories (Figure 3a,b), the distances (in µm) per step or frame are given by the software (Table 1). These are used to obtain the distribution of mean cell trajectory velocities for the tested populations under a given condition. Data from dead cells or non-cell objects are excluded from the datasets, using a criterion for minimal cell motility. First, we defined a default (but adaptable), camera dependent, minimally required translocation (Δz) between two time points (or steps) as follows:

Supplementary Figure 2. CELLMIA Performance: Automated tracking compared to manual tracking. MDA-MB-231 invasion in 3D collagen (2 mg/ml) in the 3D woundhealing-like setup was followed for 36 h using a 30 minute time interval. (a) (x,y)-trajectories of a selection of cells tracked by CELLMIA (closed symbols) or via Manual Tracking (ImageJ) (open symbols). (b) Comparison of distribution of mean single cell velocities for 19 cell trajectories manually picked from the population and tracked using Manual Tracking (ImageJ) or automated tracking of the population detected by CELLMIA for control MDA MB 231 cells and cells treated with y-27632 (ROCK inhibitor); thresholding for CELLMIA data processing (see also Supplementary Note 2.1) was set at 1.895 µm minimal step size and 33 % motile steps/trajectory. Table shows p-values and effect sizes, indicating significant differences for the shown comparisons between two conditions.

z √(

-

(

-

√

(eq 1) or in our experimental setup with 0.76 pixel/µm as conversion factor z (eq 2) Only cell trajectories that meet this criterion in - at minimum - a specifically set percentage of steps of their total trajectory, are subsequently taken into account. Based on the cell lines and inhibitors we assayed, setting this % of motile steps/trajectory between 20 and 33 % appears most suitable. As such, this approach may be more favorable for excluding true artifacts than simply using a lower cut-off-value for mean trajectory velocity, also since it better takes into account the observed phenomenon of cell pausing during motility. Both for the entire (no selection) and for the selected set of trajectories, a distribution of mean trajectory velocities is obtained for the cell populations for each of the n replicates of a tested condition. These distributions for each replicate are used as such (e.g. for cluster analysis, Figure 3e) or the distributions of the n replicates are cumulated per condition. The mean single cell velocity distribution per condition is represented using a Kernel density probability plot (Figure 3c), as this is suitable for each distribution type: i.e. unimodal (normal, non-normal) and multimodal (i.e. containing different subpopulations and thus local maxima, e.g. treatment 2 in Figure 3c); for the two first unimodal distribution types, traditional box and whisker plots can also be used (Figure 3d). All calculations are performed in custom-designed Excel files furnished with formulas and VBA-macros (available upon request). Graphs are generated in R; the distributions for different conditions are statistically compared (see below: Supplementary Note 3 and 4 on statistics). The results are obtained in parallel for the entire dataset (no selection, raw data) and for a selection. Important, the criteria for the selection (minimal translocation/step, % motile steps/trajectory, see above) can be easily changed by the user. In Figure S3a, we demonstrate this need for flexible thresholding. Kernel density plots are shown for MDA-MB-231 cells that are untreated, treated with ROCK inhibitor or with IPA 3 invading a 3D collagen gel (see also experiment in Figure 9). In the raw data (Figure S3, left panel, no selection), the probability distribution for the control curve displays a shoulder which we consider originating from artifacts (dead cells, noncell objects); for the IPA 3 treated cells, the presence of two

viii

subpopulations is, however, much more outspoken. The level of required thresholding is set such that the (artifact related) shoulder in the control condition is removed and this criterion is then applied to all the conditions in the comparison. Subpopulations that are retained after thresholding in conditions other than the control, are considered a true effect of the treatment. Thresholding level can be modulated either by varying the level of required % motile steps/trajectory (Figure S3a, top panels) or by varying the required minimal translocation/step (Figure S3a, bottom panels). In the presented example, the optimal thresholding is either 33 % motile steps/trajectory + 1.645 µm translocation/step (ΔSQR of 1.5 pixels in eq. 1) or 25 % + 1.895 µm/step (eq. 2). After this thresholding, the probability distribution for the IPA 3 treated cells still displays two subpopulations. This example illustrates that too strong thresholding (e.g. 33 % + 1.895 µm/ step) needs to be avoided since it removes relevant data on inhibition and in casu results in loss of the data for the IPA 3-induced, slow invading subpopulation. 2.2. Directionality of individually moving cells Different directionality indicators of the individually moving cells can be determined based on CELLMIA output (Table 1). First, the ratio of Euclidian (E) to cumulative (C) distance of the trajectories can be calculated (Figure 4a, left). This ratio, which is frequently used as (crude) measure of directionality, approximates 1 for highly directional cells. We, however, opted to mainly use the turning angles between consecutive frames (delta angle of movement (Table 1), frame-based turning angle) (Figure 4a, right). These measurements are expected to monitor the dynamics better and moreover, in contrast with e.g. E/C ratios, are entirely independent of cell velocities. Since it has little sense determining directionality when cells are not translocating, we only take into account turning angles corresponding to frames in which translocation is sufficient (as determined using same criteria for thresholding on frame on trajectory level as used in velocity calculations, Supplementary Note 2.1). For the remaining motile frames of the selected trajectories of a cell population in one time lapse, all turning angles were collected as one dataset and their distribution expressed as percental frequency per bin of 10° (or mean % frequency/bin ± SEM over the different replicate time lapses belonging to a specific condition)(Figure 4b). Finally, the summed mean % frequency ± SEM within a narrow angular sector around 0 ° (typically between -30 and +30° [-30,+30] for each condition is used to compare directionality between conditions (Figure 4c). The more strongly this angular sector is occupied, the higher the directionality of the cell population.

Supplementary Figure 3. Data Processing: Single cell velocity. The need for a flexible criterion for minimal cell motility. For MDA-MB-231 cells (control, two different treatments, see also Figure 9) in 2 mg/ml collagen matrix in the 3D woundhealing-like setup, Kernel density probability plots are shown either using no selection or by applying the criterion for minimal motility with different stringency using different combinations of minimal step size/frame (rows) and % of minimal number of frames with minimal step size (% motile, columns). Optimal thresholding levels (i.e. suppressing artifact-related shoulder only in the control condition) are indicated by red boxes.

The applicability as measure of directionality of the distribution of frame-based turning angles per population or condition (and the associated % occupancy of the [-30°,+30°] angular section) was validated by comparing it (i) with E/C ratios and (ii) with distributions of mean turning angle/trajectory (Figure S4). A dataset originating from six replicate time lapses corresponding to MDA-MB-231 invading 2 mg/ml collagen in the 3D woundhealing-like setup was used. We split the dataset (after trajectory selection and thresholding as described above) in two subpopulations, one with low and one with high directionality based on E/C ratios (Figure S4a, top left panel). The turning angle distributions (and occupancies of the [-30,+30] degree section) for each subpopulation is shown (Figure S4a, two lower panels). This demonstrates that the derived occupancies of the [-30,+30] degree

sections proves a useful measure to distinguish the subpopulations with low and high directionality in a statistically significant manner (Figure S4a, top right panel). Similarly, we did the initial identification of the subpopulations based on the population mean (i.e. over all trajectories) of the mean turning angle/trajectory (the latter was obtained by averaging the absolute value of the turning angles for a trajectory) (Figure S4b, top left panel). A highly directional subpopulation typically has a relatively low value for this population mean. The turning angle distributions (finally plotted as % frequency/bin) and occupancies of the [-30,+30] degree sections calculated for these subpopulations, also distinguished the highly directional from the less directional subpopulation (Figure S4b).

Supplementary Figure 4. Data Processing: Validation of population distribution of frame-based turning angle and of the occupancy of the [-30°,+30°] angular section as indicators of directionality. (a) E/C ratios of selected subpopulations (low: n= 69, high: n= 98) of MDA-MB-231 cells invading collagen gel (2 mg/ml) in 3D woundhealing-like setup corresponding to low and high directionality (top left); histograms of % frequency of frame-based turning angle for the selected subpopulations with high or low directionality (two bottom panels), (mean of 6 replicates covering 1191 and 1294 data points, respectively); occupancy of [30°,+30°] angular section in selected subpopulations with high or low directionality (top right). (c) Population mean of the mean turning angle/trajectory (calculated using |turning angles|) for selected subpopulations (low: n=83, high: n=53) of MDA-MB231 cells invading collagen gel (2 mg/ml) in 3D woundhealing-like setup with high and low directionality (top right); histograms of % frequencies of turning angles for selected subpopulations with high and low directionality (mean of 6 replicates together covering 1277 and 823 data points, respectively) (two bottom panels); occupancy of [-30°,+30°] angular section in selected subpopulations with high and low directionality (top right). Error bars: SEM. Results of statistical comparison are shown with ** p<0.01

2.3 Velocity of bulk cell movement The CELLMIA output contains another main attribute describing the bulk cell movement (Table 1) based on the area of the bulk cell region at each time point (i.e. the area enclosed by the red line in each image of a time series (Figure 1b)). These raw area data are first corrected for sudden, and therefore suspicious, increases (termed ‘jumps’) that are infrequently observed and that arise either from merging of the main spheroid with a smaller nearby cell mass in the spheroid assay, or from incorrect segmentation (underestimation) of the area mainly in the first time frames in 2D/3D woundhealing-like assays. This is illustrated schematically in Figure S5a. A rise in area between two consecutive time frames is considered an artificial jump when it is larger than a specified percentage of the total area; this rise is subtracted from the area values in all subsequent steps of the series as shown in Figure S5b. The presence of ‘jumps’ and quality control of ‘jump correction’ can easily be visualized in ‘area over time’ plots for the different replicates for a specified condition (Figure 3f), before and after jump correction, respectively. For relatively fast moving cells (as MDA-MB-231 or HT1080), we use 7 % as default jump assignment criterion (since only these large jumps affect data outcome). For cells that move more slowly, setting the percentage to a lower value is favorable. Upon raw data import in a custom-designed Excel file furnished with formulas and VBAmacros (available upon request), all calculations, including jump correction, and area over time plots are obtained semi-automatically. Area over time plots of the replicate time lapses for a condition, as shown in Figure 3f, allow evaluating the kinetics of the bulk cell invasion or migration. Alternatively, the data are presented as the calculated mean of all replicates ± SEM or by the result of fitting the mean of the

ix

Supplementary Figure 5. Bulk cell velocity: data processing. (a) Schematic representation of observed causes for artificial rises (‘jumps’) in detected area: areas merging during spheroid invasion (between time t n and tn+1) (left) and underestimation of the bulk cell area in an early time frame (t n) (n usually <15) followed by correct segmentation in a subsequent time frame t n+1 (woundhealing-like assay) (right). (b) Area over time plots before (left) and after (right, red line) correction of an observed jump.

replicate data (assuming either linear, quadratic (Figure 3g) or more complex ‘area over time’ dependency). When the area growth in time sufficiently displays linearity (high R² upon linear fitting), the mean bulk cell (or cell sheet) velocity for a specific condition is determined based on the mean slope (± SEM) of the linear fits of the area over time plots of the replicates (Figure 3f, insert). This mean velocity is used to compare different conditions (see below, Supplementary Notes 3 and 4 on statistics). In all cases (and without making any assumptions on the area over time dependency), a statistical comparison of the kinetics of the bulk cell invasion/migration between different conditions is done on a time-point basis (see Statistics) (Figure 3h). SUPPLEMENTARY NOTE 3. Data-processing: interferential and descriptive statistics Comparison between two conditions is always done using a two-sided unpaired Wilcoxon rank sum test. For multiple comparison (i.e. of more than two conditions), a KruskalWallis test (one-way ANOVA on ranks) is performed. We subsequently perform pairwise comparisons using the Wilcoxon rank sum test with Benjamini Hochberg alpha adjustments (to suppress Type I errors (false positives)) using the R-command pairwise.wilcox.test(velocity, treatment, p.adj= "BH") on the entire dataset. Conditions are accepted to be statistically different when tests render adjusted p-values below (or equal to) 0.05. This approach was used (i) to compare distributions of mean single cell velocities (e.g in Figure 6a top panels), (ii) of the mean % occupancies in a specific angular sector (e.g. Figure 10c, bottom panel), and (iii) of the mean bulk cell velocities (derived from the slopes of the linear fits of area over time data) (e.g. in Figure 6c). To statistically compare the kinetics of bulk cell movement between different conditions, pairwise comparisons of the area increases are performed at each time point using a two-sided Wilcoxon rank sum test; in this case, we subsequently adjusted the p-value using Benjamini Hochberg alpha correction in a separate step (using R-command padjust) to take into account the number of comparisons in the entire experiment. This renders for each pair of conditions in the experiment an adjusted p-value at every time point. This is visualized as illustrated in Figure 3h, by indicating using gray squares those time points at which the area increase is significantly different (p≤0.05) between two conditions. Statistics are performed in R. Effect sizes associated with a comparison between two conditions or upon treatment are estimated using the R-package ‘orddom’ and are expressed using the Cliff’s delta d (i.e. the degree of overlap between two distributions; the distributions can deviate from the normal mode) {Cliff, 1993 #9828;Cliff, 1996 #9829} and the 95 % confidence interval on d. d varies between 0 and 1, with high values indicating large effects. Effect sizes are used to describe the changes in velocity distribution of the populations of individually invading or migrating cells upon treatment. SUPPLEMENTARY NOTE 4 CELLMIA tracking of individually moving cells generates large datasets: p-values and effect sizes, minimal size tracked population. Depending on the number of time lapse replicates that are taken into account and the assay type, a typical control condition (e.g. untreated MDA-MB-231 cells) yields between 400 and 1500 (or more) trajectories. The corresponding median cell velocity values/trajectory display a relatively broad distribution, proving the tracking has a large dynamic range (e.g. Figure 3c,d). Due to the very large datasets, the p-values obtained for comparing two populations are mostly very small, even if

these populations have only slightly dissimilar and strongly overlapping velocity distributions (e.g. with <10% shift in population median, Figure 6e). p-values thus need to be evaluated in relation to effect size d (a parameter independent of population size, Supplementary Note 3 on statistics)). We determined an estimate of lower limit of effect size, dlim, by averaging the d-values obtained by comparing complementary subsets of the control replicates obtained using random sampling (number of sampling repeats for a total of n control replicates = ½ n!/((n/2)!)²). Relevant differences between two populations are thus characterized by a double criterion: p<0.05 and d > dlim. Since dlim values are consistently low ( < 0.15), a 20 % shift in median velocity can be -13 quantified in a robust manner (e.g. 2 versus 5 µM y-27632, p=5.10 , d=0.24, median velocity)=20.8 %, (Figure 6a)), underscoring the high sensitivity of the quantification. In all experiments comparing mean single cell distributions, a comparison with d <0.15 was thus regarded as not significantly different, even if p < 0.05. (Semi-)manual cell tracking is still common practice in the migration field {Huth, 2010 #3431} (especially for 3D migration) and necessarily results in analysis of relatively small datasets (e.g. 30-50 trajectories). Whereas very large datasets warrant additional comparison strategies, working with too small populations can lead to false conclusions. We here document the minimally required sample size for discriminating two populations. To this purpose we performed repeated random sampling for a whole range of population sizes for data of two conditions (applied to selected data from control and y-27632 treated samples from Figure 6a,e). Pairs of datasets were selected in order to obtain a set of pairs with a range in p-value and in effect size (Figure 6a,e and legend to Figure S6). Population size was varied from 10 (or 20) to the size of the smallest population with a step of 10 (or 20). The difference between each pair of random samples of the two conditions of a given size was tested: p-values are determined using pairwise comparison. The % of finding p<0.05 during the paired bootstrapping was plotted in Figure S6 (middle (for data from Figure 6e) and bottom (for data from Figure 6a)). Performing 100 bootstraps is sufficient to obtain a consistent result as indicated by Figure S6 (top). The required minimal size of a population/condition is obviously related to effect size, but the analysis demonstrate that for effects sizes with d≈0.25 or larger, only datasets containing 150-250 cell tracks (per condition) allow making a fully reliable statement (100 %) on a significant difference (p<0.05). This required minimum is larger than sample sets usually reported based on manual tracking and much smaller than those obtained using our approach, indicating results derived here are highly reliable. This may even applies to comparisons with very small effect sizes, provided this effect size is larger than the dlim of the respective experiment.

Figure S6. Evaluation of minimally required population size for comparing velocity distributions. For differently sized random samples extracted from two datasets of median track velocity (100 samples per size), the percentage of finding p<0.05 (termed ‘significance (%)’) upon pairwise comparison (Wilcoxon test) is plotted versus the tested size (see Supplementary Note 4). (top) For a selected comparison the ‘significance (%)’ is determined for different sample sizes using either 100, 200 or 300 bootstrapping repeats B, indicating B=100 is sufficient. (middle) ‘Significance (%)’ for comparisons on datasets from Figure 6e (top panels): control vs 15µM y27632: p<2.10-16, d=0.35; control vs 5µM: p<2.10-16, d=0.25; 5µM vs 15µM: p=0.000011, d=0.12; 5µM vs 10µM: p=0.000066, d=0.10 (values calculated for full datasets (see n in Figure 6e)). (bottom) Significance (%) for comparisons on datasets from Figure 6a (top panels): control vs 10µM y-27632: p<2.10-16, d=0.62; control vs 2µM: p<2.10-16, d=0.34; 2µM vs 10µM: p<2.10-16, d=0.36; 5µM vs 10µM: p=0.0012, d=0.13 (values calculated for full datasets (see n in Figure 6a)).

x

6.6 Cd-rom:

 Data massaspectrometrie o ‘Mass_spec_results_JLibbrecht_130408’: volledige file met resultaten van de o

massaspectrometrie van de p190 vs p210 en p210m vs p210 vergelijking zoals we ze verkregen van de groep van Prof. Dr. Gevaert. (99% BI) ‘Gereguleerd 95% BI’: lijst met gemiddelde log2 L/H ratio’s en SD’s van gereguleerde eiwitten in de p190 vs p210 en p210m vs p210 vergelijking en de overlap van beide vergelijkingen op het 95% significantieniveau.

 ‘Cell-tracking’ o ‘CM_P013_E009 raw 018’: video van ‘time-lapse’ migratietest met p210m in Matrigel 2 mg/ml, uitgevoerd zoals beschreven in 3.1.4 in een 48-well plaat. Gedurende 6 u met beeldopname interval van 2.5 minuten bij 200x vergroting o CELLMIA ‘cell-tracking’ van ‘CM_P013_E009 raw 018’ met de geoptimaliseerde CELLMIA instellingen zoals beschreven in 3.1.2. voor 200x

xi


Jelle Libbrecht



3D migratie van immuuncellen in vitro: invloed van intracellulaire en extracellulaire factoren

Recommend Documents