33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Část 9 – Adsorpční chromatografie: Chromatografie v normálním módu

Tento

chromatografický mód

je vysvětlen

na silikagelu

jako

nejdůležitějším

chromatografickém sorbentu.

Podstata adsorpce Povrch silikagelu je pokryt silanolovými skupinami. Tyto OH skupiny jsou statisticky distribuovány po celém povrchu (viz obrázek níže). Silanolové skupiny jsou centry reaktivity stacionární fáze. S molekulami ve své blízkosti interagují slabými vazbami, jejichž podstatou jsou následující mezimolekulární interakce: dipól–indukovaný dipól, dipól–dipól, vodíkové vazby, π-komplexy Aby k těmto interakcím mohlo dojít, musí mít molekula dvojnou vazbu (π-komplexy) nebo alespoň jeden atom s volným elektronovým párem. Tedy např. alkany takto

neinteragují, protože jsou nasycené a tvořené jen atomy C a H, které nemají volné elektronové páry.

Intenzita absorpce, a tím hodnoty k, rostou v následující řadě (eluční řada): nasycené uhlovodíky < olefiny < aromáty ≈ organické halogenderiváty < sulfidy < ethery < nitrolátky < estery ≈ aldehydy ≈ ketony < alkoholy ≈ aminy < sulfony < sulfoxidy < amidy < karboxylové kyseliny. Pokud má molekula několik funkčních skupin, retenční vlastnosti určuje ta nejpolárnější z nich. Na základě uvedeného lze učinit tři závěry: (a) Silikagel tvořící chromatografickou náplň je ze všech stran obklopen mobilní fází. Rozpouštědlo obsazuje více či méně pevně všechna vazebná místa. Molekula vzorku se může absorbovat pouze v případě, že se na silikagel adsorbuje pevněji než rozpouštědlo (mobilní fáze). (b) Všechny molekuly vzorku (i mobilní fáze) jsou vázány na povrch silikagelu tak, že jejich dvojné vazby nebo funkční skupiny jsou blízko silanolových skupin. Uhlovodíková část molekuly míří od silikagelu. Adsorbent proto nerozliší molekuly, které se vzájemně liší pouze v těchto uhlovodíkových částech. Například směs hexanolu, heptanolu a oktanolu proto nelze úspěšně adsorpční chromatografií separovat.

(c) Síla interakce nezávisí pouze na funkčních skupinách analytu, ale i na stérických vlivech. Molekuly s rozdílným stérickým uspořádáním, tj. izomery, lze velmi dobře separovat adsorpční chromatografií.

Tento kvalitativní koncept lze použít i kvantitativně. Pokud jsou známy rovnovážné koncentrace analytu v mobilní a stacionární fázi, lze vypočítat distribuční konstantu K. Závislost koncentrace analytu ve stacionární fázi na koncentraci v mobilní fázi popisuje adsorpční izoterma, která je specifická pro daný chromatografický systém (analyt–mobilní fáze–stacionární fáze).

Eluotropická řada Z předchozího textu je zřejmé, že různá rozpouštědla eluují analyty různou rychlostí. Pokud je mobilní fáze tvořená alifatickými uhlovodíky, je pro ně velice obtížné uvolnit molekuly analytu z aktivních míst sorbentu, a takové rozpouštědlo je proto označeno jako slabé. Na druhé straně tetrahydrofuran, který se na aktivní místa váže silně, neumožňuje, aby se molekuly analytu vázaly na sorbentu dlouhou dobu, a proto jsou rychle eluovány. Tento typ solventu se označuje jako silný. Vliv síly mobilní fáze na separaci je ukázán na níže uvedených chromatogramech. Hexan je příliš slabým rozpouštědlem pro analýzu uvedené testovací směsi a analýza trvá neúměrně dlouhou dobu, ale terc-butylmethylether je naopak příliš silné rozpouštědlo. Vhodným solventem je směs hexanu a terc-butylmethyletheru (9:1) (objemový poměr).

Eluční síla nebo síla různých rozpouštědel byla určena empiricky a číselně vyjádřena jako hodnota ε°. Řada slabých, středně silných a silných rozpouštědel je označována jako eluotropická řada.

Shora terc-butylmethylether, směs terc-butylmethylether-hexan, hexan.

Požadované eluční síly lze dosáhnout také smícháním dvou rozpouštědel. Způsob výběru binárních směsí je ukázán níže. Jestliže potřebujeme sílu rozpouštědla např. ε° = 0,4 dosáhneme ji vytvořením následujících binárních směsí: přibližně 60 % terc-butylmethyletheru v hexanu, 45 % tetrahydrofuranu v hexanu, 50 % ethylacetátu v hexanu, 15 % isopropanolu v hexanu,

20 % terc-butylmethyletheru v dichlormethanu, 45 % tetrahydrofuranu v dichlormethanu, 50 % ethylacetátu v dichlormethanu, nebo

15 % isopropanolu v dichlormethanu.

Selektivita mobilní fáze Selektivitou eluentu se rozumí vliv složení mobilní fáze na separační faktor α dvou a více látek ve vzorku. Nesouvisí se silou rozpouštědla ε°, ale představuje jiný způsob jak ovlivnit výsledek separace. Selektivita v adsorpční chromatografii má dva hlavní aspekty – lokalizaci a bazicitu. Lokalizace je mírou schopnosti molekul rozpouštědla interagovat se sorbentem, který je stacionární fází. Adsorpční centra silikagelu jsou tvořeny silanolovými skupinami. Molekuly, které s těmito místy interagují svými polárními funkčními skupinami, jako jsou ethery, estery, alkoholy, nitrily a aminy, budou zaujímat vzhledem k okolním silanolovým skupinám určitou orientaci. Povrch silikagelu obsazený takovými zorientovanými molekulami solventu nebo vzorku je pokrytý dobře definovanou vrstvou molekul. Rozpouštědla, jejichž molekuly se nelokalizují jako např. dichlormethan nebo benzen, interagují se silikagelem mnohem slaběji a pokrytí povrchu je neuspořádané. První polovina rozpouštědel uvedených v elutropní řadě, od fluor alkanů po dichlormethan, jsou nelokalizující se rozpouštědla, výjimku tvoří diethylether. Diethylether spolu s dolní polovinou tabulky od triethylaminu po vodu patří mezi rozpouštědla, která se na povrchu silikagelu lokalizují. Proto se ve své selektivitě liší rozpouštědla se stejnou (podobnou) silou ε°, jako např. dichlormethan (bez lokalizace) a diethylether (s lokalizací) s hodnotami ε° 0,30 a 0,29. Bazicita tvoří další hranu trojúhelníku selektivit rozpouštědel. Nejbazičtějšími rozpouštědly běžně používanými v HPLC jsou ethery.

Volba a optimalizace složení mobilní fáze Nejvhodnější eluční sílu mobilní fáze pro daný problém lze zjistit tenkovrstvou chromatografií (TLC, angl. thin-layer chromatography) a představuje ji takové složení mobilní fáze, ve kterém je hodnota retardačního faktoru RF cca 0,3. Výsledky z TLC jsou snadno přenositelné do oblasti HPLC, tedy pokud je v obou metodách shodná stacionární fáze, lze predikovat hodnoty retenčních faktorů k (i přes rozdílnou velikostí částic sorbentu). Eluční vzdálenost pouhých 5 cm je pro tento test dostatečná a lze jej proto provádět na malých TLC destičkách a velmi rychle. Malé uzavíratelné sklenice jsou dostatečnou náhradou speciálních vyvíjecích komor.

Zóny látek lze detekovat: (a) UV zářením (pro látky absorbující UV záření bývá používano vrstev s fluorescenčním indikátorem); (b) parami jodu; (c) aerosolem (z rozprašovače) reakčního činidla, pokud postupy (a) a (b) nefungují.

Popsaným TLC testem lze vyhledat potřebnou hodnotu eluční síly ε°, ale selektivita musí být dále optimalizována pokud mají být všechny píky zcela rozděleny. Změny selektivity se dosáhne volbou rozpouštědla (směsi rozpouštědel) s odlišnou lokalizací a bazicitou. Mobilní fáze jsou v mnoha případech tvořeny dvěma rozpouštědly A a B. Obvyklým rozpouštědlem A je hexan, který má prakticky nulovou eluční sílu, lokalizaci a bazicitu. Ale preferovaným solventem by zde měl být heptan (také s ε° = 0), neboť na rozdíl od hexanu není neurotoxický. Jako B je nejlepší zvolit rozpouštědlo, které se nelokalizuje, nebo se lokalizuje ale není bazické, nebo bazické rozpouštědlo, které se lokalizuje. Pro systematické testování selektivity a dosažení maximálních změn eluce je třeba testovat všechny tři typy rozpouštědel B. Typickým rozpouštědlem B, které se nelokalizuje, je dichlormethan. Typickými rozpouštědly B, která se lokalizují a nejsou bazická, jsou acetonitril a ethylacetát. Acetonitril je pouze málo (v malém rozsahu) mísitelný s hexanem; ethylacetát má vysoko hranu absorpce UV záření (až 260 nm). Typickým rozpouštědlem B, které se lokalizuje a je bazické je terc-butylmethylether. Protože selektivita není v praxi jediným sledovaným parametrem, používají se i další rozpouštědla. Z ekologických důvodů se např. halogenovaná rozpouštědla používají jen pokud je to poslední výše uvedený obrázek. Jestliže vzorek obsahuje analyty s kyselými vlastnostmi, může být nutné přidat do eluentu malé množství kyseliny octové, trifluoroctové nebo mravenčí; pro bazické analyty se přidává např. triethylamin.

Deaktivátory Všechna adsorpční místa na povrchu silikagelu (nebo aluminy) nemají stejnou aktivitu. Výsledkem je to, že kolonu lze snadno přetížit a retenční faktory jsou závislé na množství vzorku, i když je dávkováno jen malé množství vzorku. Navíc se objeví chvostování píků. Adsorpční kapacitu sorbentu lze nejůépe využít pouze v případě, že jsou nejaktivnější centra záměrně obsazena, tzv. deaktivována. Toho se dosáhne přídavkem malého množství na povrchu se lokalizující látky do mobilní fáze. Deaktivátor obsadí místa s nejvyšší aktivitou, takže následně molekuly vzorku již interagují s poměrně homogenním povrchem obsahujícím adsorpční centra o přibližně stejné aktivitě. Voda je nejdůležitějším deaktivátorem (moderátorem). Je silně polární a přítomná ve všech rozpouštědlech, ačkoliv někdy pouze ve stopových množstvích. Její vliv na chromatografickou separaci je menší, čím polárnější je mobilní fáze a čím je silikagelová kolona

starší

(nové

kolony

jsou

choulostivější).

Alkoholy,

methanol,

ethanol

a isopropanol lze také použít jako deaktivátory. Ačkoli je to obvykle zbytečné, kontrola aktivace může být důležitá při použití samotného čistého nepolárního solventu A nebo pokud je separace velmi náročná. V adsorpční chromatografii je možné aplikovat gradientovou eluci, ale jen tehdy, jestliže rozdíl polarit obou solventů není příliš velký. Gradientová eluce může být obtížná, a je méně doporučována než v případě chromatografie na reverzních fázích: (a) složení solventu se v koloně může měnit adsorpcí polárnějšího rozpouštědla; (b) obsah modifikátoru v obou rozpouštědlech může být různý; (c) znovuobnovení rovnovážných podmínek po analýze, tj. reekvilibrace kolony, může dlouho trvat; (d) je vhodnější nezačínat gradient s 0 % rozpouštědla B, ale s určitým (malým) obsahem silnějšího rozpouštědla B.

Aplikace Silikagel je vynikající stacionární fáze pro separaci isomerů.

Jak již bylo uvedeno, nelze pro separaci složitých vzorků na silikagelu všeobecně doporučit gradientovou eluci, protože reekvilibrace sorbentu na počátku analýzy může trvat mnohem déle než u chemicky modifikovaných fází. Nicméně lze tuto techniku úspěšně použít, jak ukazuje tento chromatogram separace karotenoidů gradientem acetonu v petroletheru.

Další chromatogram níže ukazuje separaci velmi polárních látek na silikagelu. Karotenoid krocetin, který je nejméně polární látkou a eluuje první, a jeho mono a diglykosylové estery patří mezi látky izolované z extraktu šafránu.