2

1

2

3

4

6

G-pruhování je standartní technikou používanou k identifikaci jednotlivých chromosomů vyšších obratlovců (savci,plazi, ptáci), jinde moc nefunguje. Chromosomy se natráví trypsinem a obarví Giemsou. Vzniklé tmavé proužky jsou oblasti bohaté na AT. U člověka se takto běžně stanovuje 400-600 proužků (podle stupně kondenzace chromatinu), ale na rozvolněných profázních chromosomech jich bylo identifikováno kolem 2000. Q-pruhování bylo první metodou, která umožnila identifikovat jednotlivé chromosomy. Chromosomy jsou obarveny fluorescenční látkou chinakrinem, který přednostně znační AT-páry, čímž vzniknou zářivé proužky, GC oblasti tvoří bledé proužky. Pattern je tedy podobný jako u G-pruhování. Q-pruhování se dnes již téměř nepoužívá, protože narozdíl od G-pruhování vyžaduje fluorescenční mikroskop a chinakrin má řadu zdraví škodlivých účinků. R-pruhování (reverse banding) je technika, která generuje proužky opačné k proužkům G- a Q-pruhování. Inkubace v horkém fosfátovém pufru denaturuje DNA, hlavně AT-bohaté oblasti. Chromosomy se pak nabarví Giemsou. Zdenaturované AT-bohaté oblasti se barví méně. GC-bohaté více. R-pruhování se používá hlavně k zvýraznění konců chromosomů, které jsou často po Gpruhování světlé. http://geneticssuite.net/node/25 Obrázek R-pruhování z Pernice et al. 1998

7

8

Propidium jodid je fluorescenční látka, která se vkládá mezi báze DNA (= interkalační činidlo) bez ohledu na sekvenci, takže se používá i k odhadu koncentrace DNA. DAPI je fluorescenční látka která se silně váže na AT páry. Vkládá se do malého žlábku dvoušroubovice DNA. Chromomycin A3 (CMA3 ) je fluorescenční látka, která se váže na GC páry. Obrázek PI z https://www.lifetechnologies.com

9

10

11

Obrázek 1: lokalizace genu na pachytenních bivalentech motýla. Červeně sonda, modře podbarvení DAPI. Obrázek 2: lokalizace klastru genů pro 18S rRNA v interfázním jádře žábrohlísta. Sonda značená červeně, zeleně podbarvení fluorochromem YOYO. Obrázek 3: Lokalizace chromosomu W na pachyteních bivalentech motýla. Červeně sonda, modře podbarvení DAPI. Obrázek 4: Lokalizace chromosomu W pomocí komparativní genomové hybridizace (CGH). Hybridizace samčí genomové DNA (značená červeně) a samičí genomové DNA (značená zeleně) na pachytenní bivalenty samice motýla.

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) FISH je metoda, která umožňuje lokalizovat určitou sekvenci přímo na chromosomech. Je k ní potřeba sonda (značená DNA nebo RNA komplementární k sekvenci, kterou chceme na chromosomu lokalizovat) a chromosomální preparát. Princip: 1) Denaturace - vystavení sondy a chromosomů vysoké teplotě, zruší se vodíkové můstky mezi vlákny DNA v dvoušroubovici. 2) Hybridizace - sonda vyhledá na chromosomech komplementární místo a naváže se na něj. 3) Odmytí nezhybridizované sondy z preparátu. 4) Podbarvení chromosomů fluorochromem, který se váže na DNA (např. DAPI, propidium jodid).

Pokud je potřeba lokalizovat na chromosomech krátkou sekvenci (několik kilobází a méně), je potřeba použít zesílení signálu. Standartně jsou k tomu používány sondy značené proteinem biotinem nebo steroidem digoxigeninem (DIG). Po hybridizaci jsou biotin nebo DIG detekovány protilátkami, které jsou značeny fluorochromem, a jsou tedy viditelné. I tyto protilátky mohou být detekovány protilátkami. V každém kroku dochází k zesílení hybridizačního signálu, ale i k zesílení pozadí. Tato tzv. nepřímá FISH je i pracnější než přímá (tj. FISH se sondou značenou přímo fluorochromem). Velice citlivým systémem zesílení signálu je TSA (Tyramide Signal Amplification) využívající tyramid. Sonda značená biotinem nebo DIGem je detekována protilátkou s navázanou křenovou peroxidázou (horse radish peroxidase, HRP), enzymem, který mění molekuly tyramidu na reaktivní volné radikály, které reagují s proteiny ve svém okolí (tím signál zůstává lokalizován na místě kde je sonda). Na tyramid může být navázán fluorochrom nebo protein, který lze opět detekovat protilátkou a tím dále zesílit signál. TSA je údajně schopen 100x silnějšího signálu než standartní nepřímá FISH. Info o Tyramide Signal Amplification (TSA) např. zde: http://www.perkinelmer.com/pages/020/staticpages/tsasystemsquestionsanswers .xhtml Obrázky z http://www.perkinelmer.com/resources/technicalresources/applicationsupportkno wledgebase/tsa/ish.xhtml

14

Třídění chromosomů (Chromosome sorting) Chromosomy v suspenzi jsou obarvené fluorochromy – jedna s vazbou na AT, druhá s vazbou na GC. Chromosomy jsou identifikovány podle specifického patternu a odkloněny do různých zkumavek. Laserová mikrodisekce – chromosomální preparáty jsou připraveny na speciální tenké sklo pokryté folií. Z něho lze pod mikroskopem tenkým laserovým paprskem vyřezat vybrané chromosomy a ty silným pulzem katapultovat do víčka zkumavky. Chromosomy jsou následně namnoženy PCR s nespecifickými primery nebo Phi polymerázou, naznačeny a použity jako sonda. Lze použít i pro klonování a sekvenování. Je to univerzálnější ale pracnější metoda než chromosome sorting, získá se mnohem méně chromosomů. http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch19/chromosome-sorting.html

15

16

17

18

19

Komparativní genomová hybridizace (Comparative genomic hybridization, CGH) Srovnání dvou genomů hybridizací na chromosomy. Princip: -Izolace genomové DNA (gDNA) z nádoru + značení např. zeleným fluorochromem + izolace DNA ze zdravého jedince + značení např. červeným fluorochromem -Denaturace obou gDNA + Cot1 DNA (vysoce repetitivní DNA, používá se jako kompetitor, jeho přítomnost zlepšuje hybridizaci sond na chromosomy. U nemodelových druhů, kde často není k dispozici Cot1 DNA , lze jako specifického kompetitora použít neznačenou celogenomovou DNA.) -Hybridizace sond a Cot1 na chromosomy -Odmytí nezhybridizovaných sond -Obarvení chromosomů -Dokumentace a analýza intenzity hybridizačních signálů (HS). Pokud jsou HS obou gDNA stejně silné, tato část chromosomu se po překrytí signálů jeví jako žlutá, kde je u zeleně značené gDNA ztráta (delece) DNA, v tomto místě na chromosomu převládá červená barva, a naopak. Nevýhodou CGH je, že neumí odhalit přestavbu genomu, u kterých nedošlo k změně počtu kopií, tedy inverze a translokace. Také je poměrně málo citlivá, což lze obejít aplikací array-CGH (následující snímek).

20

Využití CGH v nádorové cytogenetice Výhodou CGH proti FISH je to, že ji lze aplikovat i tam, kde je obtížné získat chromosomy, např. u solidních nádorů. Při CGH se izoluje gDNA z nádoru a hybridizuje se se zdravou DNA na chromosomy zdravého jedince. Intenzitu HS hodnotí software, pokud HS přesáhne danou hranici, je v tomto úseku na chromosomu v nádorové buňce delece nebo amplifikace. Do analýzy se nezahrnují oblasti centromer, protože obsahují repetitivní DNA, jejíž počty kopií se mohou lišit mezi jedinci. Modifikací je array-CGH, kdy se gDNA z nádoru a referenční gDNA hybridizují na mikročip. Tato varianta je citlivější a schopná detekovat indel velký 100 kb.

Obrázek chromosomů z http://www.bloodjournal.org/content/91/8/3007 http://humrep.oxfordjournals.org/content/19/9.cover-expansion Array-CGH: http://www.viagenefertility.com/Available-PGD-Technologies.php

21

Využití CGH k identifikaci pohlavních chromosomů Pokud jsou jako sondy použity samčí a samičí DNA, umožňuje to identifikovat pohlavní chromosomy, pokud jsou na molekulární úrovni dostatečně diferencované. Na prvním obrázku jsou výsledky CGH, která lokalizovala vysoce diferencované pohlavní chromosomy X a Y u myši. Zajímavostí (ale ne výjimečným jevem) je zvýraznění repetitivní DNA na autosomech samičí sondou. Důvodem je přítomnost této sekvence na chromosomu X, tato sekvence je tedy v samičí sondě zastoupena ve vyšším množství než v samčí sondě (Traut et al. 1999). Na druhém obrázku je porovnání genomů samce a samice motýla zavíječe paprikového (Plodia interpunctella). Samičí DNA je značena zeleně, samčí červeně. Na obrázku je bivanlent WZ, silně je naznačen chromosom W. Části W, které obsahují DNA vyskytující se u obou pohlaví, jsou po přeložení HS žluté (obsahují převážně repetitivní DNA rozmístěnou i na autosomech), cca ¼ chromosomu W je zelená = místo se sekvencemi, které jsou pouze na W a které se tedy v samčím genomu nevyskytují (Vítková et al. 2007). Na třetím obrázku je CGH na chromosomech samců Drosophila melanogaster a Megaselia scalaris (obojí Diptera), které se liší úrovní diferenciace pohlavních chromosomů. U D. melanogaster jsou X a Y vysoce diferencované a tak je CGH jasně zvýraznila, zatímco u M. scalaris jsou X a Y evolučně mladé a zatím nediferencované, proto je CGH neodliší od autosomů. Použitá linie M. scalaris nese reciprokou translokaci mezi Y a autosomem (Traut et al. 1999).

22

Genomová in situ hybridizace je další metoda, která používá celogenomové sondy. Využívá se k lokalizaci určitých chromosomů, především u hybridů dvou druhů, kdy hybridizace celogenomových sond z rodičů na chromosomy hybrida umožňuje identifikovat chromosomy podle jejich původu (čili které chromosomy pocházejí od kterého rodiče). Obrázky chromosomů z Matoba et al. 2007

23

Multicolor FISH je metoda, která umožňuje obarvit všechny chromosomy najednou, každý pár homologních chromosomů jinou barvou. Protože označení každé sondy pro jednotlivý chromosom jiným fluorochromem by vyžadovalo mikroskop vybavený mnoha filtry propouštějící velmi úzké pásmo vlnové délky (tedy pro člověka 22 autosomů + X+ Y= 24 filtrů), což by bylo nesmírně drahé a náročné, využívá se jiný přístup. Každá sonda je značena jinou kombinací fluorochormů (viz tabulka v horním obrázku), pro všechny lidské chromosomy tak stačí 5 fluorochromů. Multicolor FISH se používá hlavně v lidské cytogenetice k detekci chromosomálních přestaveb. Obrázky z http://www.chrombios.com/cms/website.php?id=/en/index/aboutfish/multicolor.ht m

24

Umělé bakteriální chromosomy (BAC) jsou plazmidy odvozené od F-plazmidu, schopné pojmout velké inserty chromosomální DNA (150-350 kbp). BACknihovna je soubor bakterií E. coli, které společně nesou BACy obsahující celý genom daného organismu (v několikanásobném pokrytí, aby se zajistilo, že každá sekvence je přítomna alespoň jednou). BACy se používaly především ke klasickému sekvenování genomu Sangerovou metodou, protože představovaly zvládnutelnou porci genomu. Lze je použít i k lokalizaci genů na chromosomech, tzv. BAC-FISH, protože velký BAC se detekuje mnohem snáz než poměrně malý gen. Nevýhodou je to, že BACy obsahují i repetitivní DNA, kterou však lze zablokovat použitím kompetitorové DNA. Obrázek BAC-FISH z Yoshido et al. (2005)

25

26

C0t analýza je technika, založená na reasociační kinetice DNA, která umožňuje rozlišit v genomu frakce různě repetitivní DNA. Principem je, že vysoce repetitivní sekvence v roztoku ssDNA (= single strand, jednořetězcové DNA) rychleji najdou komplementární sekvenci než unikátní sekvence, a tato rychlost je přímo úměrná množství jejich kopii v genomu. Zastavením renaturace k určitém čase získáme poměrně přesně definovanou frakci již ds (double strand, dvouřetězcové) molekul a ještě ss molekul. Využívá se k měření množství repetic a unikátních sekvencí v genomu a k izolaci jednotlivých frakcí pro další využití (např. vysoce repetitivní DNA jako kompetitor při FISH, unikátní DNA k tvorbě knihoven pro studium genů). Postup při C0t analýze je následující: 1)

Izolovaná gDNA je nalámána na definované fragmenty (sonikací, enzymaticky, mechanicky nebo vysokou teplotou)

2)

dsDNA o známé koncentraci je rozdělena do zkumavek, které jsou následně důkladně uzavřeny. Zkumavky jsou umístěny do vodní lázně, kde je DNA denaturována vysokou teplotou, vznikne ssDNA.

3)

Zkumavky jsou umístěny do teploty, která je optimální pro renaturaci DNA. Tam jsou ponechány po různě dlouhou dobu (t) (několik vteřin až několik dní).

4)

Zkumavky jsou po uplynutí doby (t) vyjmuty, naředěny 100-násobkem 0,03M sodno-fosfátového pufru (SPB) a naneseny na hydroxyapatitovou kolonu. Při této koncentraci pufru se na kolonu zachytí veškerá DNA (ds i ss).

5)

K oddělení ss a dsDNA z hydroxyapatitu se použije SPB o různé

27

koncentraci. Nízká koncentrace vymyje jen ssDNA, vysoká koncentrace vymyje dsDNA. Z kolony je nejprve vymyta ssDNA přelitím 0,12M SPB. Pak je vymyta dsDNA 0,5M SPB. 6)

Na spektrofotometru se změří koncentrace ssDNA a dsDNA, ze kterých se následně spočítají % ssDNA. Ta jsou do grafu vynesena na osu Y.

7)

Pro jednotlivé časy renaturace vypočítáme C0t: C0t = C0, čili počáteční koncentrace nukleotidů (mol/l) x čas renaturace (t) x faktor pufru (dán koncentrací kationtů v SPB). C0 může být pro různé zkumavky různá, vysoká počáteční koncentrace znamená rychlejší reasociaci a používá se ke zkrácení reasociačního času, který by jinak pro unikátní sekvence trval i několik dní. Nižší koncentrace se naopak používá pro krátké reasociační časy, aby byly vůbec měřitelné (jsou v řádu vteřin). Hodnoty C0t jsou na grafu na ose X.

8)

Z % ssDNA a C0t vzniknou tzv. C0t body, jejichž propojením vznikne C0t křivka. Na té lze odlišit 2-3 frakce sekvencí (vysoce repetitivní, středně repetitivní, unikátní sekvence). Díky C0t křivce budeme vědět, jak dlouho musíme genomovou DNA konkrétního druhu nechat reasociovat, abychom získaly určitou frakci.

Info a obrázek z http://plantgenome.agtec.uga.edu/CBCS/hub/webpages/cot.htm

27

Obrázek z http://www.mgel.msstate.edu/pdf/cot.pdf

28

Hybridizace různých C0t frakcí obsahujích unikátní (single-copy) a repetitivní sekvence na pachyteních chromosomech samice obaleče jablečného (Cydia pomonella). Modře jsou obarveny chromosomy, červeně sonda (= C0t frakce). Bílou šipkou je označen chromosom W, o kterém je známo, že obsahuje vysoké množství repetitivní DNA, především mobilních elementů. Obrázky pocházejí z magisterské práce Blažková 2012.

29

30

Preparáty buněk/chromosomů určené pro imunocytogenetické techniky musejí být připraveny speciální technikou, aby byly zachované proteiny v chromatinu a mohly reagovat s protilátkou. Značená protilátka je pak lokalizovaná na místě, kde je její cílový protein. Na obrázku je část polyploidního jádra buňky Malpighiho trubice po imunodetekci s protilátkou proti H4 acetylovanému na K5 (11b). Šipka ukazuje na sex-chromatin (W heterochromatin). Obr. 11a. Jádro obarvené DAPI. Obr. 11b. Jádro obarvené Alexou 546. Měřítko = 20 µm. Z Dalíková 2006.

31

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) je metoda, která umožňuje izolovat z genomu sekvence podle toho, s jakým proteinem interagují. Lze tak identifikovat např. transkribované úseky (např. podle přítomnosti RNA polymerázy) nebo izolovat eu- nebo heterochromatin podle typických modifikací histonů. Na počátku se buňky vystaví činidlu, které spojí proteiny s DNA, na které právě sedí. Použít lze UV záření (které má ale tu nevýhodu, že jeho účinek není reverzibilní) nebo formaldehyd (crosslinking lze odstranit). Následně se buňky zlyzují a DNA se nafragmentuje pomocí sonikace. DNA s navázanými proteiny se inkubuje s protilátkou proti proteinům, které nás zajímají. Protilátka je navázaná na nosiči (např. na magnetických kuličkách), což umožní ze směsi izolovat jen DNA s proteiny, které reagovaly s protilátkou. Proteiny se následně odstraní, DNA přečistí a lze jí dále analyzovat. V současné době jsou dva hlavní přístupy jak získanou DNA analyzovat. 1) ChIP on chip, kdy se DNA hybridizuje na mikročip nebo 2) ChIP-seq, kdy se DNA osekvenuje prostřednictvím next generation sequencing (což je přesnější a čím dál levnější). Nevýhodou formaldehydu je to, že preferuje cross-linking proteinů mezi sebou před DNA-protein, což generuje nepřesnosti. Proto se prosazuje varianta native ChIP, kdy se crosslinking nedělá (např. histony jsou přirozeně s DNA spojené) a fragmentace se dělá mikrokokální nukleázou (MNase). Obrázek z Hoffman a Jones 2009, obsahuje též popis různých variant ChIP. http://joe.endocrinology-journals.org/content/201/1/1.full.pdf Protokol na ChIP např. zde: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/9/pdb.prot5279.full