Az NMR-spektroszkópia szükséges feltétele a nullától különbözÿ magspin (I≠ ≠0) –I=0 mind a protonok mind a neutronok száma páros (12C, 16O) –I=1/2 ha tömegszáma páratlan (1H, 3H, 13C, 15N, 19F, 57Fe, 113Cd) vagy a protonok, vagy a neutronok száma páratlan. –I=k (k=1,2,..) mind a protonok mind a neutronok száma páratlan (2H, 14N) klasszikus modell: atommag – egy töltéssel rendelkezÿ részecske, – mely továbbá egy adott tengely mentén forog. Töltéssel rendelkezÿ mag + forgása = köráram létesítése. Köráram ÿ mágneses momentum (µ). “Bio-NMR” “Feles” spin kvantumszámú (I=1/2), µ éppen a mágneses dipolmomentum vektor (rúdmágnessel modellezhetÿ). A mágneses dipólmomentum (µ) arányos a szögimpulzusmomentum vektorral (I). Giromágneses állandó (γ) egy, az atommagra jellemzÿ mennyiség: µ =γ I.
Külsÿ mágneses tér hiányában a magok spinjei rendezetlenül állnak kérdés: Egy ilyen elemi dipólmomentum vektor (µ) a külsÿ térerÿnek (Bo) megfelelÿen, azzal párhuzamos irányba rendezÿdik-e? válasz:
Nem!
magyarázat: Az említett atommagokhoz mágnese tulajdonsága mellett forgó mozgást is rendeltünk, ezért az elemi mágneses dipólmomentum vektorok (µ) a külsÿ sztatikus mágneses térre (Bo) merÿleges sík szerinti forgó mozgást, úgynevezett precessziót fognak végezni.
ÿ
Külsÿ mágneses tér hatására rendezÿdött és precesszáló magok z’
y’
ÿ
x’
Külsÿ mágneses tér hatására rendezÿdött és precesszáló spinek (közös origóból ábrázolva)
(búgócsiga modell) Impulzusmomentum
Forgásirány Forgó korong impulzusmomentuma ωo szögsebesség nagysága arányos a külsÿ statikus térerÿ nagyságával: ωo = γBo. Az ωo szögsebességgel arányos νo (Larmor-frekvencia): νo = ωo/2π. A mágneses dipólmomentum vektor (µ µ) idÿbeli változását a következÿ vektoriális szorzat írja le: dµ/dt = –γ Bo ⊗ µ
A makroszkopikus-, globális- vagy mérhetÿ-mágnesezettség (M), a megfelelÿ elemi vagy mikroszkopikus mennyiség additív összege: M = Σ µ i Ennek segítségével a Larmor-precesszió átírható “makroszkopikus” alakba: d M /dt = -γ Bo ⊗ M A µi vektoroknak kizárólag a Bo -al párhuzamos, szokásosan “z” irányúnak nevezett komponensei adódnak konstruktívan össze. A termikus egyensúly állapotában tehát, a Mz = Σ (µ z)i Ha tehát I =1/2 (pl. 1H, 13C, stb.) akkor a (2I+1)=2 , azaz két állapot. két kvantumállapotot |α> és |β> két energia (Eα és Eβ) két betöltöttségek (Nα és Nβ) Nβ / Nα = exp (-∆E/kT). egy átmenet (Zeeman-átmenet) energiakülönbség (∆E): ∆E=hγΒο /2π
A BLOCH-egyenletek z-irányú mágnesezettség idÿbeni alakulása: dMz'/dt=–(Mz'–Mo)/T1 Az egyszer differenciál-egyenletet megoldásaként a következÿ függvényt kapjuk: Mz'(t)=Mo(1–exp(–t/T1) az x,y-síkban zajló csillapított amplitúdójú rotációt precesszió alakulása: dMx'/dt=(ωo–ω)My'–Mx'/T2 dMy'/dt=–(ω o–ω)Mx'–My'/T2 Csatolt differenciál-egyenletrendszer megoldásaként a következÿt kapjuk: Mx'(t)=Moexp(–t/T2)sin(ωo–ω) My'(t)=Moexp(–t/T2)cos(ωo–ω), ahol (ωo–ω) a forgó referencia rendszerben a precesszió szögsebessége.
Ennek a függvény a Fourier-transzformáltja az NMR-spektrum.
Külsÿ mágneses térben a makroszkopikus mágnesezettség gerjesztése annak precessziójához vezet, amely mérhetÿ indukált feszültséget eredményez
A nagy felbontású NMR-spektrumok öt jellemzÿ paramétere csatolási állandó félértékszélesség
multiplicitás
(J érték) terület
kémiai eltolódás δ=[(υM -υR)/ υR]106
Jellegzetes proton kémiaieltolódás értékek COOH 14 COH N=CH ArH RCONHQ Ar-OH C=CH ROH RQNH CH CH2 CH3 TMS
12
10
8
6
4
2
0
14
12
10
8
6
4
2
0
Spin-spin csatolás (a színkép finomszerkezete) a
A
b
B
A és B magok indirekt módon a és b elektronokon keresztül csatoltak.
A jelenség a spin-spin felhasadás, a skaláris csatolás vagy a J-csatolás
dublet mintázat
triplet mintázat
kvadruplet mintázat
Jellegzetes 13C kémiaieltolódás értékek 210 180 CO COH COOH COOQ CONHQ CN Ar alkin alkilhalogenid alkilamin alkén alkán CO (alkohol, éter)
150
120
90
60
30
0
210
150
120
90
60
30
0
180
Mekkora egy fehérje? néhány tucat aminosavtól esetleg több ezerig
3 bet s kód: -Thr-His-Ile-Ser-Ser-Ile-Met-Pro-Leu-Glu1 bet s kód:
T -H -I -S
S -I -M -P -L -E
Térszerkezet
Szekvencia
Funkció
Hány fehérjetérszerkezet ismert ?
Hogyan ismerhetÿ meg a fehérjetérszerkezet?
kristályosítás
oldatkészítés
röntgen-diffrakció
NMR-spektroszkópia
elektron s r ség térkép
geometriai kényszerfeltételek
szerkezetfinomítás
3D-szerkezet
számítógépes modellezés
Miért szükséges a fehérjetérszerkezet ismerete? Közismert betegségek megértése: •Sarlósejtes anémia (Glu ⇔ Val mutáció ÿ dezoxihemoglobin fokozott agregációja) •Kergemarha kór (Creutzfeld-Jakob disease) (prion fehérje „misfold”) •szivacsos enkefalopátisz •Alzheimer kór (β-amiloid „misfold” és aggregáció)
Racionális gyógyszertervezés: pl. HIV proteáz inhibítor
Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia alapjelenség
eltérÿ kémiai környezet eltérÿ rezonancia frekvencia
NH
α-H β-H
γ-H
Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia 1. jelhozzárendelés
a jelhozzárendelés vagy spektrum asszignáció ez elÿbbi megfigyelésen alapszik
eltérÿ rezonancia frekvencia eltérÿ kémiai környezet
NH
α-H β-H
γ-H
Homonukleáris NMR-spektroszkópia egy dimenzióban
14
12
10
8
6
4
2
0
10
8
6
4
2
0
NH(W indol) NH(amid gerinc) NH(amid oldallánc) H(aromás) CH(α) CH(ε) CH(β) CH(δ) CH(γ) CH3 TMS 14
12
Homo- vagy Heteronukleáris NMR-spektroszkópia két dimenzióban
Ala
A3X
COSY
O N CH C *H α
CH3
β
TOCSY
Gly
AX
COSY
H O N C C
α1
α2
TOCSY
*H
H
Val
A3B3MX
COSY
O N CH *
C
H CH CH3 CH3
α
β
γ 1 γ2
TOCSY Lys
A2(F2T2)MPX
O
COSY
N CH C H *H C H CH2 CH2 α
ε
β1 β2
γ
δ
TOCSY
CH2 NH2
Leu
A3B3MPTX
COSY
O N CH C H *H C H CH CH3
α
β1 β2
γ
CH3
δ1 δ2
TOCSY Ile
A3MPT(B3)X
COSY
O N CH C *H
γ2
CH CH3 γ H C H γ CH3 11
α
β
γ11
γ12
γ2 δ
TOCSY
12
J típus
AMX
O
COSY
N CH C H* C H H R α
β1
β2
TOCSY R = OH
Ser SH Cys COOH Asp CONH2 Asn Phe C6H5 C6H5OH Tyr C3H3N2 His C8H6N1 Trp
Phe gyÿrÿ
AA’XX’M
H*
COSY
O
N CH C CH2 H δ
H ε
ζ
ε
Hζ
δ
TOCSY Tyr gyÿrÿ
AA’XX’
H*
COSY
O
N CH C CH2 H δ
δ
ε
TOCSY
Hε OH
His gyÿrÿ
AX
O
COSY
N CH C *H
CH2 H
N NH * δ2
ε1
H
TOCSY Trp gyÿrÿ
A(X)MP + A
H*
COSY
O
N CH C
H
CH2
δ
H
ζ2
H η2
N H* H ζ2 ε3
δ ε3
η2
TOCSY
ε3
H
ε3
NOESY
Hβ βAla
D
B
Hβ β1Ser
G
Hβ β2Ser F C
A
Hα αAla Hα αSer
E
NHSer NHAla
TOCSY
CO F E
H C H N G
C
OH
Ser
D
intrareziduális NOE (A,B,E,F,G)
CO H C
A
H C H
H N B
interreziduális NOE (C,D)
CH3 Ala
Homonukleáris NMR-spektroszkópia
Jelhozzárendelés
Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia 2. szerkezetmeghatározás
Távolság jellegÿ adatok (NOE) ÿ 3D-szerkezet
Schistocerca gregaria kimotripszin inhibitor (SGCI) hidrofób magja
Makromolekulák 3D szerkezetének meghatározása NMR adatok alapján NMR spektrumok NMR jelhozárendelés távolság jellegÿ kényszerfeltételek torziószög típusú kényszerfeltételek
Kezdeti szerkezet
distance geometry restrained dynamics simulated annealing Konvergencia ? IGEN Restrained dynamics Restrained minimization
3D szerkezet
NEM
Egy helikális fragmens szerkezetének finomítása
Magnetic Resonance Imaging (MRI) a gyógyászatban elÿnyök:
- nem használ ionizáló sugárzást mint a röntgen - nem kell feszték vagy kontrasztanyagot bevinni - „lágy-szövetek” kontrasztosabbak
kivitelezés: tipikus 1H-NMR kisérlet ahol a szöveteket felépít sejtek protonjait figyeljük meg. képalkotás függ: az adott szövetben lév protonok számától, az adott protonok relaxációs idejét l (T1 spin-mátrix relaxációs id és T2 spin-spin relaxációs id ) felhasználási terület: tumor sejtek, ödémák, koros elváltozások azonosítása
31P-NMR
sejt-metabolizmusok követése
