5/11/2015
Tömegspektrometria - áttekintés PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR
www.aok.pte.hu
VIZSGÁLHATÓ MINTA:: töltéssel rendelkezik (folyékony biológiai minták,
TÖMEGSPEKTROMETRIA
fehérjék, peptidek, oligoszaharidok, DNS, szérum, vér, vizelet, agy-, gerincvelői folyadék, kismolekulák, szilárd szöveti minták, gyógyszerek, …) MÛSZER: tömegspektrométer, tömegspektrométer tömeg : töltés arány mérése EREDMÉNY: tömeg : töltés eloszlás – spektrum (molekulatömeg, molekuláris összetétel/képlet, szerkezeti sajátságok) KIEGÉSZÍTÕ LEHETÕSÉGEK: komponensek szétválasztása szétválasztás tömeg : töltés arányuk alapján, képalkotás (MSI: mass spectrometry imaging)
Miért elterjedt? - elõnyök
BIOFIZIKA 2. 2015. április 9. Dr. Bugyi Beáta Biofizikai Intézet
Tömegspektrométer
NAGY ÉRZÉKENYSÉG: 10-10 – 10-16 g KIS MENNYISÉGŰ MINTA: 10-6 – 10-12 g (mikro – piko gramm) SZÉLES TÖMEGTARTOMÁNY: 1 – 106 atomi tömegegység (Da) BÁRMILYEN HALMAZÁLLAPOTÚ MINTA SPECIFICITÁS, REPRODUKÁLHATÓSÁG NINCS SZÜKSÉG JELÖLÉSRE
Ionizáció és analizátor
4.
IONFORRÁS – ionizáció 1.
2.
3.
1. IONFORRÁS: a vizsgált mintából ionizáció révén gáz fázisú ionok keletkeznek Pozitív ion mód: elektron hiány (+ töltésű) Negatív ion mód: elektron többlet (- töltésű)
2. ANALIZÁTOR: az ionok elválasztása a tömeg : töltés arányuk alapján 3. DETEKTOR: az ionok tömeg : töltés arány szerinti előfordulásának detektálása (ion ~ elektromos jel)
4. VÁKUUM: az ionok és a levegő molekulák közötti ütközések elkerülése…különben az elkerülése ionok nem jutnak el a detektorba 10 → 50 /atmoszférikus nyomás/ 1
0.1 → 40
1
10 → 40
ELEKTRON IONIZÁCIÓ /EI/ KÉMIAI IONIZÁCIÓ /CI/ ATMOSZFERIKUS NYOMÁSÚ KÉMIAI IONIZÁCIÓ /APCI/ ATMOSZFERIKUS NYOMÁSÚ FOTO IONIZÁCIÓ /APFI/ GYORS ATOM BOMBÁZÁS /FAB/ THERMOSPRAY IONIZÁCIÓ /TSI/
*ELEKTROSPRAY IONIZÁCIÓ /ESI/ *MÁTRIX*MÁTRIX-ASSZISZTÁLT LÉZER DESZORPCIÓS IONIZÁCIÓ /MALDI/ ANALIZÁTOR – tömeg : töltés arány szerinti szétválasztás SZEKTOR ANALIZÁTOR IONCSAPDA FOURIER TRANSFORM ION CYCLOTRON RESONANCE
*KVADRUPÓL *TIME*TIME-OFOF-FLIGHT /repülési idő, TOF/ *biológiai eredetű minták
Ionizáció: ELEKTROSPRAY IONIZÁCIÓ (ESI)
Analizátor: KVADRUPOL KVADRUPÓL: 4 párhuzamos hengerszerű rúd
kapilláris, elektromos tér
vákuum, párolgás
AC
a minta porlasztása porlasztás /spray/ révén apró cseppek keletkeznek (elektromos erőtér + vákuum) az oldószer gyorsan párolog a vákuumban a csepp mérete csökken, a töltéssűrűség megnövekszik a cseppben a megnövekedett elektrosztatikus taszítóerő a cseppet egyre kisebb cseppecskékre bontja
DC
a kvadrupól elektromos erőterében a részecske pályája függ a tömegétől és töltésétől egy adott elektromos erőtér esetén csak az annak megfelelő tömeg : töltés aránnyal rendelkező részecskék jutnak át (a többi a rudakba ütközik) az elektromos erőtér szekvenciális változatásával különböző tömeg : töltés aránnyal rendelkező részecskék detektálhatóak
1
5/11/2015
Ionizáció: MÁTRIXMÁTRIX-ASSZISZTÁLT LÉZER DESZORPCIÓS IONIZÁCIÓ /MALDI/
Analizátor: REPÜLÉSI IDÕ (time-of-flight, TOF) elektromos mező: á üö é"#
5 .á C .
MÁTRIXMÁTRIX-ASSZISZTÁLT: ASSZISZTÁLT a mintát megfelelő mátrixba ágyazva egy fémfelületre visszük LÉZER: LÉZER a mátrixot lézernyalábbal (UV) megvilágítva az elnyeli annak energiáját DESZORPCIÓ: DESZORPCIÓ a mátrix-minta keveréke a fémfelszínről leválik minta + mátrix fémfelületre szárítva
IONIZÁCIÓ: IONIZÁCIÓ a vákuumba gázfázisú molekulák jönnek létre, a minta részecskéit a mátrix ionizálja gázfázisú protontranszfer során
Detektor: KONVERZIÓS DINÓDA, ERÕSÍTÉS
ionok:
ö " 3 é" . ö é #
$%&'()*+á,+- . 1 $/&01á-+ 3 4 2 á3 á"5# é"3# 5ő #
példa: 5 1.5
15000: . 1.6 ∗ 10=> ?
1000@ 1.6 ∗ 10 4A ∗ 1000 "
4000@ 1.6 ∗ 10 4A ∗ 2000 "
$%&'()*+á,+- $/&01á-+ 1 . 3 4 2 5 8 7 2 9
2.7 ∗ 10 27 5.7 ∗ 10 57
Tömegspektrum, tömeg : töltés spektrum sok
előfordulás relatív előfordulás
dinódalánc másodlagos emisszió
konverziós dinóda ionelektron
CO2
O
CO
kevés kicsi
nagy tömeg : töltés (m/z)
FONTOS: TÖMEGSPEKTRUM = TÖMEG : TÖLTÉS ARÁNY SPEKTRUM erősítés: 106
Tömegspektrum elemzése
molekulatömeg: 400 töltés: + 1 m/z = 400
molekulatömeg: 1200 töltés: + 3 m/z = 400
Tandem tömegspektrometria: MS/MS, MS2
ISMERETLEN MINTA kísérletesen meghatározott tömegspektrum fragmentáció
D . #E → é #E F " G " D
m/z SPEKTRUM ADATBÁZIS TALÁLATOK A MINTA AZONOSÍTÁSA octadecanoic acid methyl ester
MS1: MS1 adott m/z aránnyal rendelkező prekurzor ion rögzítése ↓ fragmentáció MS2: MS2 a fragmentáció révén keletkezett termék ionok m/z arányának mérése pl. peptidek aminosav összetétel meghatározása
2
5/11/2015
Tandem tömegspektrometria: MS/MS, MS2
Tandem tömegspektrometria: MS/MS, MS2
ütközés indukálta disszociáció
D . #E → é #E F " G " D
D . #E → é #E F " G " D
MS2: MS2 adott m/z aránnyal rendelkező termék ion rögzítése ↑ fragmentáció MS1: MS1 az ehhez tartozó prekurzor ionok m/z arányának mérése
MS1: MS1 adott prekurzor ionhoz tartozó m/z arány és MS2: adott termék ionhoz tartozó m/z arány különbségének rögzítése (semleges fragmentum) az összetartozó prekurzor és termék ionok szkennelése
pl. funkciós csoportok vizsgálata, foszfát észter, karbohidrát módosulás
pl. funkciós csoportok vizsgálata, foszforiláció-foszforsav
Tandem tömegspektrometria: MS/MS, MS2
Alkalmazások PROTEOMIKA
D . #E → é #E F " G " D
MS1: MS1 adott m/z aránnyal rendelkező prekurzor ion és MS2: MS2 adott m/z aránnyal rendelkező termék ion rögzítése az összetartozó prekurzor és termék ionok szkennelése pl. komponens azonosítása
Alkalmazások - orvostudományok
molekulatömeg meghatározás aminosav összetétel és szerkezeti sajátságok poszttranszlációs módosulások/foszforiláció, glikoziláció,…/ diszulfid hidak aktív/kötőhelyek meghatározása fehérje-ligandum kölcsönhatás fehérjeelegyek kvantitatív vizsgálata
IGAZSÁGÜGYI ALKALMAZÁSOK drogok szűrése doppingszerek szűrése mérgező anyagok szűrése
GYÓSZERTUDOMÁNYOK ORVOSTUDOMÁNYOK MIKROBIOLÓGIA MEZŐGAZDASÁG ÉLELMISZERIPAR ŰRKUTATÁS
Anyagcsere betegségek
ÚJSZÜLÖTTEK SZŰRÉSE: VELESZÜLETETT ANYAGCSEREBETEGSÉGEK • • • • • • • • • • •
karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, szervessav aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinek, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai
TERÁPIÁS MONITOROZÁS immunoszuppreszív szerek, antimikotikus szerek, antiepilepsziás szerek, antivirális szerek
ANDROGÉN HORMON PROFIL KARNITIN ELEMZÉS SULFONYLUREA ELEMZÉS ZSÍRSAV ELEMZÉS Refsum betegség, adrenoleukodisztrófia /ALD, Siemerling-Creutzfeld betegség, Schilder betegség/
3
5/11/2015
Anyagcsere betegségek
Anyagcsere betegségek
középközép-láncú acetylacetyl-CoA dehydrogenase hiány (MCAD) (MCAD) zsírsavoxidáció zavara marker metabolit: C6, C8, C10:1-karnitin
propionsav aciduria (PA) szerves savak ürítésével járó betegség marker metabolit: C3-karnitin
Képalkotó tömegspektrometria endogén biomolekulák /kismolekulák, szerek, biomarkerek, metabolitok, lipidek, peptidek, fehérjék/ tömeg : töltés arányának mérésén keresztül lehetővé teszi azok térbeli eloszlásának mérését szövetekben és szervekben CÉLOK DIAGNOSZTIKA betegségek diagnosztizálása, pl.: különböző szövetek /tumor, egészséges/ összehasonlítása PROGNOSZTIKA betegek kategorizálása a betegség súlyossága alapján TERÁPIA gyógyszerek hatásának vizsgálata, hogyan reagál a páciens egy kezelésre
1. MINTAELŐKÉSZÍTÉS kezelés, biopszia hisztológiai metszetek készítése /szerv, szövet/
2. TÖMEGSPEKTROMETRIA minden egyes x,y koordinátapárban a tömegspektrum felvétele
3. ELEMZÉS a tömegspektrum kép rekonstrukciója /software/ elemzés, molekulák azonosítása, mennyiségének meghatározása
HER2 HER2 pozitív emlőrák fokozott m/z 8404 termelés
HER2 negatív emlőrák
HER2: humán epidermális növekedési faktor túltermelése fontos szerepet játszik az agresszív emlőrákok kialakulásában és fejlődésében a sejtmembránon csoportokba rendeződve lokalizálódik terápiás lehetőség: trastuzumab /Herceptin/ csak a HER2-t túltermelő sejtek esetén hatásos, egyébként mellékhatások
4
5/11/2015
tumor
fő vérerek
koncentráció↑
Tömegspektrometria kulcsfogalmak ESIESI-kvadrupól, kvadrupól, MALDIMALDI-TOF módszerek Tömegspektrum Alkalmazási lehetõségek
A
B emésztőrendszer
rákellenes szer eloszlása egérben A) keresztirányú metszet B) IMS kép
www.aok.pte.hu
5
