Az ellenanyagok orvosbiológiai alkalmazása
PhD kurzus 2011/2012 II. félév
Ellenanyaggal működő módszerek Analitikai felhasználás
Analitikai felhasználás Ellenanyag / antigén kapcsolódás
Az Ab/Ag kapcsolat csak kapocs az analit és a jel között
Heterogén (szilárd) fázisú rendszerek
Az Ab/Ag kapcsolat önmagában egy jel megváltozása
Homogén (folyadék) fázisú rendszerek
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Általános felépítés Hordozó felület (műanyag, üveg, ill. ezek biopolimer bevonata, specifikus kapcsolóelem – ellenanyag, avidin) Minta / antigén kapcsolódik a hordozóhoz (vagy „aspecifikus”, kémiai kötéseken, vagy specifikus reakción alapuló kapcsolat) Detektáló ellenanyag (direkt vagy indirekt jelölt) kapcsolódik az antigénhez Jelet felfogjuk / mérjük Lépések között mosás, ezzel elkülönítjük a kötött és szabad reagenseket
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Detektáló műszer
Érzékenység Alacsony költségek Alacsony háttér
Y
Y
Minta / Antigén Hordozó felület
Y
Detektáló ellenanyag
Y
*
**
***
***
**
*
*
**
***
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Haptén jelölt
Y
Detektáló és/vagy jelhordozó ellenanyag
Direkt jelölt
Jelöletlen
Y
Y
*
***
***
***/**
*
**/***
Gyorsaság
***
**
*
Alacsony háttér
***
**
*
Minta / Antigén Hordozó felület Érzékenység Alacsony költségek
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k A felfogható jel
Foton
>>
Elektron
>>
Egyéb
Színintenzitás
Elektromos áram
Mechanikai jel
Fluoreszcencia
β-sugárzás
Mágneses rezonancia
Kemilumineszcencia γ-sugárzás
Ellenanyagokkal működő módszerek I. Szilárd fázisú assay-k Érzékenység
Linearitás
Stabilitás
Költség
Abszorbancia
*
*
***
***
Fluoreszcencia
**
***
**
**
Kemilumineszcencia
***
**
*
**
TRF
***
***
***
*
γ-sugár számlálás
****
***
*/***
*
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Homogén reakció: maga az Ag / ellenanyag kapcsolódás idéz elő mérhető jelet Nincs szükség a kötött / nem-kötött reagensek szétválasztására (mosás) Sok esetben közelebb áll a fiziológiás folyamatokhoz Hátrány: műszerigényes, drága, sok kémiai-biológia korlátja van, vagy nem elég érzékeny
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Immunprecipitáció / agglutináció
Y
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Turbidimetria / nefelometria
Y
Y
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Turbidimetria / nefelometria Klinikai laboratóriumi tesztek
Módszer
CRP
Turbidimetria
usCRP
Latex turbidimetria
RF
Latex turbidimetria
Ferritin
Latex turbidimetria
Transferrin
Turbidimetria
IgE
Latex turbidimetria
IgA
Turbidimetria
IgM
Turbidimetria
IgG
Turbidimetria
A1-antitripszin
Turbidimetria
C3
Turbidimetria
C4
Turbidimetria
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET)
Gerjesztett állapot (S1) hνex hνem
Köztes állapot (Sint)
Alapállapot (S0)
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Donor
Akceptor
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET)
Journal of Lipid Research, 2007, 48:19-29
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluorescence protection assay FRET elvén működik, de nem emittál az akceptor, csak elnyomja a donor fluoreszcenciáját Olcsóbb, egyszerűbb, de kevésbé érzékeny
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP)
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP)
P=(IP-IA)/(IP+IA) τ: fluoreszcens életidő
Ellenanyagokkal működő módszerek II. Folyadék fázisú assay-k Fluoreszcencia polarizáció (FP) FL_IgG-FITC
FL_EVBlue-FITC 2
r =0.9997 slope=288.3
100000 10000 1000
100000 10000 1000
100 1
10
100
1000
r2=0.9999 slope=277.8
1000000
FL intensity
FL intensity
1000000
100 0.1
10000
1
FITC (nM)
35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10
IgG-FITC Ex:180° Em: 90/180
1000
2000
FITC (nM)
100
1000
FITC (nM)
EVANS-BLUE-FITC Ex:180° Em: 90/180
FP (mP)
FP (mP)
Mw=150 kD
10
3000
35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10
100
200
300
FITC (nM)
400
Mw=1,35 kD
500
Alpha-technology 680 nm O•
O• 20 0
Y
Y
O•
nm
680 nm
Y
Y
O• O•
520-620 nm
Ellenanyaggal működő módszerek Preparatív felhasználás
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Y Y Y
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Y Y Y
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Y Y Y
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Y
Y Y Y
Y
Y
Preparatív felhasználás Makromolekulák
Y
Y Y Y
Y
Y
Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák
Y
Y Y Y
Y
Y
Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció
Preparatív felhasználás Makromolekulák Affinitás kromatográfia / immunprecipitáció Kovalens kötés a mátrix és az ellenanyag között Ag /Ab kapcsolás – fiziológiáshoz hasonló körülmények (alacsony ionerő, pH ~7) Elúció – fiziológiástól erősen eltérő körülmények (magas ionerő, savas v. lúgos pH) Emiatt hamar denaturálódnak az ellenanyag molekulák – egy oszlopot/ mátrixot csak néhányszor lehet használni!
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mechanikus, fluoreszcens és mágneses válogatás (Cell sorting)
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mechanikus válogatás
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás
Fluoreszcensen jelölt sejtek
Fluoreszcens válogatás
Detektor Lézer
+
-
Preparatív felhasználás Sejtszeparálás Mágneses válogatás
Ellenanyaggal működő módszerek Funkcionális felhasználás
Funkcionális felhasználás Makromolekulák kölcsönhatásának gátlása Vírus neutralizáció Toxin neutralizáció
Vakcináció
Adhézió gátlás Citokin neutralizáció Sejt aktiváció / depléció Sejthalál indukció Receptor mediált aktiváció
Ellenanyag terápia / RIT
Funkcionális felhasználás Receptor szignalizáció modellezése
CD3 mIgM /IgD FcεRI EGFR
CD95L
Ellenanyaggal működő módszerek Analitikai felhasználás Szilárdfázisú assay-k
Szilárd fázisú tesztrendszerek ELISA / RIA / FLIA Bead-array Fehérje micro-array Western-blot NanoPro EMSA-Supershift Immun-mikroszkópia Áramlási citometria ELISPOT
ELISA Enzime-linked immunosorbent assay Szilárd fázis – mosás Enzimatikus erősítés Mikrolemez formátum (96-, 384-, 1526-lyuk/lemez) – automatizálás, nagy áteresztőképesség, kedvező kontroll/minta arány Standardizált infrastruktúra (lemezek, pipetták, robotok, mosók, mérőműszerek) Olcsó, egyszerű
ELISA Y
Y Y
Y
Kompetitív tesztek
Antigén teszt (szendvics)
Jel
Jel
Ellenanyag teszt
Y
Y
Analit koncentráció
Analit koncentráció
ELISA Y
Y
Y
Y Y Y Y Y Y
9 Y
Y
Y Y
Y
Kompetitív teszt
Y
9
Y
9
Szendvics teszt
8
Y Y Y Y Y Y
Bead-array 40 szérumminta 1 szérum biomarker
40 szérumminta 10-100 szérum biomarker
Bead-array Y
Y α-IL1
α-TNFα
α-IL6
α-IL8
α-MCP-1
α-IFNγ
α-TGFβ
α-IL10
Bead-array
Gyöngyszám
FL1
FL2
FL3
Fehérje micro-array Üveg vagy membrán felület Antigén chip vagy ellenanyag chip Szendvics elrendezés FLIA
Western-blot -
+ Molekulatömeg szerinti szétválasztás utáni mérés Aspecifikus reakcióra érzékeny (membrán egységesen alapreakciót ad) Keresztreakcióra / polireaktivitásra kevésbé érzékeny, mint az ELISA /array típusú módszerek, mert a molekulatömeg segít
Western-blot
NanoPro
EMSA-Supershift Y
-
Nem fiziológiás körülmények között kell működniük Monospecificitás nagyon fontos
+
Immun-mikroszkópia Immunhisztokémia /Immuncitokémia Enzim jelölés, színes kicsapódó szubsztrát
Immunfluoreszcens mikroszkópia Fluoreszcens jelölés
Immun-elektromikroszkópia Arany-kolloid jelölés
Immun-mikroszkópia
Immun-mikroszkópia
Áramlási citometria (FACS) Fluoreszcensen jelölt sejtek
Detektor Lézer
+
-
ELISPOT
Szendvics módszer Sejtek produktumait méri, de nem kvantitatív módon, hanem a termelő/nem-termelő sejtek arányában Ritka események is jól mérhetőek Speciális membrán aljú steril 96-lyukú mikrotiter lemez Standardizálás műszerigényes
ELISPOT
Y Y Y YY Y Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y
ELISPOT Y
Y
YY
Y Y Y
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YYY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YY YY Y YY Y
Y
ELISPOT n=1 000 000 p=46 f=4,6*10-5
Jövő heti program…
Dr. Nagy György: Ellenanyag terápia
