MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Contoh darah diambil dari koleksi contoh yang tersedia di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Ternak Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian untuk penganalisaan protein darah dilakukan pada bulan Juli 2010 di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Materi Bahan-bahan penelitian yang digunakan meliputi 84 sampel plasma darah dari domba lokal UP3J (Unit Penelitian dan Pengembangan Peternakan Jonggol) betina. Peralatan yang digunakan meliputi perangkat elektroforesis terdiri dari sumber tenaga listrik model P-300 yang bertegangan maksimum 500 volt dan berkekuatan 250 mili Amphere, dua lempeng kaca pencetak gel, penjepit, sisir pembuat 13 sumur gel, 5 buah pipet Mohr 10 ml, microsyinge Hamilton, micro tip, 2 buah gelas piala 100 ml, gelas ukur 1000 ml, bola pipet, baskom, sarung tangan plastik, plastik crap dan label. Bahan Elektroforesis Gel elektroforesis terdiri dari gel pemisah dan gel penggertak. Gel pemisah merupakan gel yang dicampurkan dari beberapa bahan di antaranya bahan IA, IB, IC, dan ID. Masing-masing bahan terdiri dari: Bahan IA
: Acrylamide 39,0 gram; Bis Acrylamide 1,0 gram; Glycerol 20,0 ml, dan H2O sampai 100ml.
Bahan IB
: Tris 9,15 gram; HCl 3ml, dan H2O sampai 100ml.
Bahan IC
: ammonium persulfat dan 0,2 gram H2O sampai 100ml.
Bahan ID
: TEMED 400µl/100 ml H2O
Gel penggertak merupakan gel yang dicampurkan dari beberapa bahan di antaranya bahan IIA, IIB, IIC, dan IID. Masing-masing bahan terdiri dari: Bahan IIA
: Acrylamide 38,0 gram; Bis Acrylamide 2,0 gram; Glycerol 20,0 ml; dan H2O sampai 100 ml.
Bahan IIB
: Tris 1,5 gram, 1 ml HCl, dan H2O hingga 100 ml.
Bahan IIC
: Ammonium persulfat 0,4 gram dan H2O sampai 100 ml.
Bahan IID
: TEMED 200µl/100 ml H2O
Bahan Penyangga Elektrode Tris 1.5 g, glisin 7.2 g ditambah H2O sampai 1000 ml. Bahan Indikator Contoh Tris-HCl 0.5 M penyangga pH 6.8 25 ml dilarutkan dalam gliserin 40 ml, bromfenol blue 0.01 % 20 ml dan H2O 15 ml. Bahan Pewarna Commasie Brilliant Blue 1.25 g, methanol 225 ml, asam asetat 50 ml ditambah H2O 225 ml untuk penentuan protein albumin dan transferin,. Bahan Pencuci H2O 850 ml, methanol 100 ml dan asam asetat 50 ml. Prosedur Pola polimorfisme protein darah domba lokal Jonggol diidentifikasi dengan menggunakan metode elektroforesis gel akrilamid/PAGE (Polyacrilamide Gel Electrophoresis). Tahapan pekerjaan yang dilakukan dalam proses elektroforesis meliputi: pembuatan bahan analisis kimia, pembuatan gel elektroforesis, penetesan sampel darah dan running (proses pemisahan protein), pewarnaan dan pencucian. Teknik elektroforesis vertikal dengan gel poliakrilamid dilakukan berdasarkan metode yang disarankan oleh Ogita dan Markert (1979) yang dimodifikasi. Flow chart metode kerja disajikan pada Gambar 5. Pembuatan Gel Elektroforesis Gel elektroforesis terdiri dari dua larutan, yaitu gel pemisah (running gel atau separation gel) dan gel penggertak (stacking gel). Gel elektroforesis poliakrilamid dibentuk dari gel pemisah dan gel penggertak. Larutan gel pemisah untuk analisis plasma darah dibuat 5 % akrilamid dengan mencampurkan 2.5 ml larutan IA, 5 ml larutan IB (HCl 1N), 2.5 ml larutan IC, 2.5 ml larutan ID dan 7.5 ml H 2O. Larutan 22
gel pemisah tersebut dimasukkan ke dalam cetakan gel yang terdiri dari dua lempengan kaca spacer dan penjepit. Larutan dimasukan dengan pipet sampai ketinggian tertentu untuk menyisakan ruang gel penggertak. Pembuatan gel pemisah
Pembuatan gel penggertak
Persiapan sampel
Running elektroforesis
Pewarnaan CBB
Pencucian methanol & asetat
Pembacaan hasil Gambar 5. Bagan Alir Metode Kerja Menurut Ogita dan Markert (1979) Larutan gel penggertak untuk analisis plasma darah merupakan larutan dengan persentase gel 3 % yang dibuat dengan cara mencampurkan 1.5 ml larutan IIA, 5 ml larutan IIB (HCl 1N), 2.5 ml larutan IIC, 2.5 ml larutan IID dan 8.5 ml H2O. Dosis larutan gel penggertak dibagi dua. Larutan penggertak dimasukkan ke dalam cetakan gel setelah gel pemisah terbentuk sampai ujung bagian atas kaca yang berbentuk lengkungan dan dimasukkan sisir sebagai pencetak tempat contoh sebelum gel membeku. Slab atau cetakan contoh yang telah jadi disimpan di dalam lemari pendingin dengan ditutupi aluminium foil pada bagian atasnya. 23
Penetesan Contoh dan Proses Pemisahan Protein (running) Alat elektroforesis disiapkan. Slab dipasang pada bak yang telah diberi larutan penyangga elektroda cetakan sisir dibuka setelah larutan penyangga elektroda diisi pada bak bagian atas. Contoh darah yang sudah siap dibiarkan mencair terlebih dahulu kemudian dimasukkan ke dalam tempat contoh dalam gel dengan menggunakan pipet Hamilton yang sebelumnya dicampur dengan larutan indikator contoh pada coke microtiter. Contoh plasma darah sebanyak 2 l dicampur merata dengan larutan indikator 2 l, selanjutnya diambil 2 l dari campuran tersebut. Alat elektroforesis dihubungkan dengan tegangan tetap (constant voltage) regulator 150 volt. Lama running selama satu jam empat puluh lima menit untuk menganalisis plasma darah. Teknik Pewarnaan dan Pencucian Slab dibuka salah satu kacanya dan gel yang masih melekat pada salah satu lempeng kaca lainnya disentuhkan ujungnya hingga terlepas seluruhnya pada pewarna Commassie Brilliant Blue untuk plasma darah pada baki plastik tertutup. Gel dioven selam dua puluh menit. Gel dipisahkan dari pewarna dan diganti dengan pencuci dan larutan pencuci diganti beberapa kali sampai jernih dan terlihat pita-pita protein plasma darah. Pencucian dilakukan dengan pendiaman selama satu malam. Teknik Pembacaan Hasil Elektroforesis Pita-pita protein yang terlihat setelah proses pencucian dibaca bedanya dengan menggunakan contoh standar yang diketahui mempunyai beberapa pita yang berbeda-beda. Perbedaan letak pita digambar dengan menggunakan perbandingan antara jarak per pita dengan panjang lintasan yang disamakan. Analisis Data Lima lokus protein, yaitu Albumin (Alb), Post albumin (Pa), Transferrin (Tf). Post transferrin 1 (PTf1) dan Post transferrin 2 (PTf2) dianalisis dengan perhitungan yang menggunakan rumus Nei (1987).
24
Frekuensi Genotip
Dimana : x = frekuensi genotip Xi = jumlah genotip N = jumlah contoh yang diamati Frekuensi Alel
Dimana : xi = frekuensi alel ke-i xii = alel homozigot xij = alel heterozigot N = jumlah contoh yang diamati Heterozigositas Per Lokus
Dimana :
= heterozigositas per lokus xi = frekuensi alel ke-i i = alel ke-1, 2, 3, … n N = jumlah contoh yang diamati
Rerata Heterozigot Seluruh Lokus
Keterangan : Ĥ = rerata heterozigositas seluruh lokus ĥ = nilai heterozigositas lokus ke-j r = jumlah lokus j = ke-1, 2, 3, … n
25
