2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

1. Tartalomjegyzék 1. TARTALOMJEGYZÉK 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 3. BEVEZETÉS 4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4.1. SZIKES TAVAK 4.2. NÁD ÉS NÁDAS 4.3. NÖVÉNY-ASSZOCIÁLT BIOFILMEK 4.4. SZIKES TAVAK MIKROBIÁLIS DIVERZITÁSA 5. CÉLKITŰZÉSEK 6. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 6.1. MINTAVÉTEL 6.2. BAKTÉRIUMKÖZÖSSÉGEK SZÉNFORRÁS HASZNOSÍTÁSON ALAPULÓ FENOTÍPUSOS UJJLENYOMATA 6.3. TENYÉSZTÉSEN ALAPULÓ VIZSGÁLATOK 6.3.1. CSÍRASZÁMBECSLÉS ÉS BAKTÉRIUMTÖRZSEK IZOLÁLÁSA 6.3.2. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK FENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 6.3.3. A BAKTÉRIUMTÖRZSEK GENOTÍPUSOS JELLEMZÉSE 6.3.4. TENYÉSZTÉSTŐL FÜGGETLEN KÖZÖSSÉGI DNS IZOLÁLÁSON ALAPULÓ MÓDSZEREK 7. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 7.1. A VELENCEI-TAVI NÁD BIOFILM VIZSGÁLATOK 7.1.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 7.1.2. DGGE VIZSGÁLATOK 7.1.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 7.1.4. A KLÓNOZÁS EREDMÉNYEI 7.2. A KELEMEN-SZÉK ÉS A NAGY-VADAS NÁD BIOFILM VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 7.2.1. BIOLOG KÖZÖSSÉGI SZÉNFORRÁS ÉRTÉKESÍTÉSI VIZSGÁLATOK 7.2.2. DGGE VIZSGÁLATOK 7.2.3. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATOK 7.2.4. KLÓNKÖNYVTÁRAK VIZSGÁLATA 8. ÖSSZEFOGLALÁS 9. KIVONAT 10. ABSTRACT 11. FELHASZNÁLT IRODALOM 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 13. FÜGGELÉK

1

1 2 3 5 5 9 12 15 23 24 24 26 27 27 29 31 35 43 43 43 52 54 69 75 75 79 81 98 106 113 115 117 133 134

2. Rövidítések jegyzéke Általános rövidítések DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis TGGE Temperature Gradient Gel Electorphoresis ARDRA Amplified Ribosomal DNS Restriction Analysis TRFLP Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism PCR Polimerase Chain Reaction PCA Principal Component Analysis PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria EPS exopoliszacharid MPN Most Propable Number SRB Sulfate Reducing Bacteria CFU Colony forming unit Egyéb rövidítések O/F médium Hugh-Leifson oxidatív-fermentatív glükóz-hasznosítási médium TSY Trypticase soy yeast agar BLAST Basic Local Alignment and Search Tool IPTG izopropyl-béta-D-thiogalactopyranozid X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galacto-pyranozid PAA poliakrilamid APS Ammónium-perszulfát TEMED N,N,N',N'-tetrametil-etilén-diamin Velencei-tavi mintavételek, 2000. április és 2001. július FTK, FTB Fürdető belső és külső nádasállományból izolált törzs GTK, GTB Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs LTK, LTB Lángi-tisztás belső és külső nádasállományból izolált törzs FNE, FNA Fürdető egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs GNE, GNA Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs LNE, LNA Lángi-tisztás egyéves és több éves nádasállományból izolált törzs Velencei-tavi mintavételek, 2003 és 2006 FB Fürdető, biofilm minta GB Agárd-Gárdony Hosszútisztás, biofilm minta LB Lángi-tisztás, biofilm minta Alföldi szikes tavak mintavételei, 2004. április, 2005-2006 KB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta VB Kelemen-szék nád biofilmjéből izolált törzs, illetve bifilm minta

2

3. Bevezetés A szigorúan védett szikes élőhelyek Magyarországon jelentős természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai és zoológiai sajátságaiknak köszönhetően. A nagy nyíltvízi felülettel és állandó vízborítottsággal jellemezhető Fertő és Velencei-tó mellett különleges szikes környezetek a kiskunsági „székek”, melyek igen sekély, nyár végén gyakran teljesen kiszáradó, alkalikus és enyhén sós vízterek. Hazánk másik nagy kiterjedésű szikes térsége a Tiszántúlon található, melynek sekély vizű szikes tavait viszonylag magas ionkoncentráció, lúgosság, sófelhalmozódás, nagyfokú egyedi és szezonális változatosság jellemzi. A nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel) Európa és Magyarország különböző tájainak flóraleíró munkáiban közönséges fajként szerepel. Nagy kiterjedésben megtalálható nagy tavaink (a Balaton, a Fertő, a Velencei-tó) és az alföldi szikes tavak parti régiójában. A tó és tágabb környezete életében a nádasok egyrészt víztisztító funkciójuk, másrészt trofikus kapcsolatokban játszott szerepük miatt nagyon jelentősek. Az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén a nádasok környezetének megismerését célzó mikrobiológiai kutatások elsőként a Fertő és a Velencei-tó esetében kezdődtek meg. Ezek a vizsgálatok elsősorban a nádnövénnyel kapcsolatban álló aerob és anaerob baktériumközösségek faji összetételét és anyagcsere aktivitását vizsgálták. Az alföldi szikes vízterek esetében eddig csak az üledék aerob baktériumközösségek feltérképezése történt meg. A nádszárak víz alatti részén kialakuló biofilmek aerob baktériumközösségeinek faji struktúrájára, a nádnövénnyel kialakított lehetséges szerepére vonatkozó ismereteink azonban meglehetősen szórványosak. A nád biofilm szerkezetének és működésének ismerete az adott víztérben azért lényeges, mert felépítése és összetétele alapján jól elkülöníthetők a környezettanilag különböző élőhelyek, minőségének és mennyiségének alakulása pedig a vízminőségi állapotot, illetve annak megváltozását tükrözi. Természetes környezetekben betöltött szerepének ismerete nagyon fontos lehet a szennyvízkezelési célból létesített mesterséges vizes élőhelyek mikrobiológiai folyamatainak optimalizálásában, hatékonyságának növelésében. Munkánk során a Velencei-tó és az alföldi Kelemen-szék és Nagy-Vadas nád biofilm felépítésében résztvevő baktériumközösségek faji összetételének feltérképezését és a közösségi anyagcsere mintázat megismerését tűztük ki célul, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerek alkalmazásával.

3

4. Irodalmi áttekintés 4.1 Szikes tavak A szárazföldek felszínének 1/15-ét borító vizes élőhelyek adnak otthont a legdiverzebb élővilágnak, különösen a mérsékelt éghajlati övezetben. A felszíni vizek hidrológiai tulajdonságaik alapján állóvizekre és vízfolyásokra oszthatók. Az állóvizek morfometriájuk alapján lehetnek mély- és sekély vízterek, valamint vizes élőhelyek (wetlands). A sekély vízterekre és a vizes élőhelyekre a litorális régió meghatározó aránya a jellemző a pelágikussal szemben (Lakatos és mtsai, 1998). A sekély vízterek és vizes élőhelyek különleges csoportját alkotják a sós vizek, melyen belül vízkémiai tulajdonságaik alapján elkülönülő egységet képeznek az alkalikus kémhatású szikes vizek. A Föld minden lakott kontinensén találunk elszórtan (gyakran szélsőségesen kontinentális viszonyok között kialakuló) sós, szikes tavakat, melyek becsült víztérfogata (104000 km3 – 125000 km3) megközelíti az édesvizekét (Boros, 1999). A sós tavak lehetnek tengeri eredetűek, vagy tengertől független, athalasszohalin kialakulásúak, neutrális, enyhén savas vagy lúgos kémhatásúak. Az athalasszohalin kialakulású, alkalikus sós tavakat nevezik szikes vizeknek. E víztestek közös jellemzője, hogy meghatározó anionjuk a CO32- és komplexei. A karbonát ionok eredetére vonatkozóan sok teória látott már napvilágot, melyek közül ma a legelfogadottabb, hogy a szikes tavak alapkőzete nagy mennyiségű Na2CO3-ot tartalmaz, ami a talajvíz kimosódása révén a tavak medencéjében akkumulálódik. A vízben így a Na+ és a HCO3-/CO32--ionok disszociált állapotban tartanak egyensúlyt, lúgos hidrolízisük okozza az alkalikus kémhatást. Mivel a HCO3-/CO32--ionok koncentrációja jóval meghaladja a Ca2+ és a Mg2+-ionokét, így azok csak kis mértékben képesek a karbonátot sóként kicsapni. Nagy Ca2+ koncentráció esetén neutrális sós tavak keletkeznek, pl. Nagy Sós-tó (USA). Ha a Ca2+ mellett jelentős mennyiségű Mg2+ is jelen van enyhén savanyú sós tavak (pl. Holt-tenger) keletkeznek (Grant, 1992). A szikes tómedrek jellemzője a felszíni lefolyás hiánya, aminek következménye, hogy a nagyarányú párolgás miatt vizükben sófelhalmozódás mehet végbe. A lefolyástalan medencék kialakulása általában komplex folyamat eredménye, melyben szerepet játszhat a vulkáni működés (pl. a törökországi Van-tó), a tektonikus mozgás (pl. a Kelet-afrikai árokrendszer tavai, az egyiptomi nátron tavak izolációja a Nílustól), valamint a szél és a

4

folyók medencealakító tevékenysége (pl. kiskunsági és tiszántúli szikes tavak) is (Grant, 1992; Duckworth és mtsai, 1996; Tamásné, 1999). A Föld szikes tavai közül legintenzívebben a Kelet-afrikai árokrendszer tavait, a kaliforniai Mono-tavat és a közép-ázsiai szikes tavakat vizsgálták. A tektonikusan aktív Keletafrikai árokrendszer tavai (pl. az Elementeita, a Magadi és a Natron-tó) Ca2+-ban és Mg2+-ban szegény, Na+-ban gazdag vulkáni kőzetek mélyedéseiben alakultak ki (Baker és mtsai, 1971). Észak-Amerika legismertebb szóda tava a Mono-tó (Kalifornia), mely szintén vulkanikus eredetű mélyedésben jött létre, vizét a Na+, Cl-, CO32- és SO42- ionok sói, valamint jelentős mennyiségű BO33- és K+ ion jellemzi, erősen alkalikus (pH 10) kémhatású (Humayoun és mtsai, 2003). Az ázsiai szikes tavak közül a transz-bajkáli, a mongóliai (Baer-tó) és a szibériai tavakat kutatták részletesen (Sorokin és mtsai, 2003; Ma és mtsai, 2004). Európában a kifejezetten kontinentális jellegű szikes vizek a keleti területekre korlátozódnak, melyek legnyugatibb tagjai a Kárpát-medencében találhatók. Jelentős részük áldozatul esett a belvízrendezési, csatornázási és mezőgazdasági tájátalakító (meliorációs) tevékenységeknek. A megmaradt szikes élőhelyek Európa-szerte kiemelkedő jelentőségű természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai, zoológiai tulajdonságaiknak

köszönhetően.

Megőrzésük

érdekében

1996-ban

minden

hazai

természetközeli állapotban fennmaradt szikes tavat országos jelentőségű védett területnek nyilvánítottak (Boros, 1999). A Kárpát-medence két legnagyobb sekély szikes víztere a Fertő és a Velencei-tó, számos szikes vizes élőhely található azonban az Alföldön is. A magyarországi szikes tavak többsége a nagytavak és szárazföldek közötti átmeneti jellegű vizes élőhelyek (wetland) csoportjába sorolható. Vizüket a világ más szikes tavaihoz képest a viszonylag alacsonyabb sótartalom (0,5-7,5 g l-1), de az igen magas lúgosság jellemzi. Meglehetősen ingadozó négykomponensű rendszerek, melyekben a Na2CO3, NaHCO3, Ca(HCO3)2 disszociált állapotban és a CaCO3 oldatlan állapotban tart egyensúlyt. A tiszántúli szikesekben a Na+ mellett a SO42- is jelentős lehet. A Kárpát-medencében előforduló szikes víztereket a sekélytavak (pl. Velencei-tó, Fertő), kistavak (ezt a csoportot szokták leggyakrabban „szikes tavakként” említeni, pl. Kelemen-szék, Zab-szék), fertők (pl. szegedi Gyevi-fertő), szikes mocsarak, és kisvizek kategóriákba sorolják (Boros, 1999). A Velencei-tó Magyarország második legnagyobb szikes tava, területe kb. 24,5 km2 (1. kép). Korát 10-12 ezer évesre becsülik. Mai alakja a századforduló tájékán a Nádas-tó lecsapolásával alakult ki. A szélsőséges vízjárású, lápi és szikes jelleget is magán viselő sekély tó az idők során természetes úton eutrofizálódott, melynek eredményeképpen az 19505

es évek végére a tó medre feliszapolódott, elmocsarasodott és vízfelületének 60%-át nád borította. A rekreációt megelőzően a tavat egymástól nádassávokkal elzárt belső tisztások jelenléte jellemezte, melyek között gyakorlatilag nem volt vízcsere. Így azoknak sajátos, egyedi vízminősége volt, a tó egésze pedig mozaikos jelleget öltött. Míg a tó DNy-i részén humin anyagokban gazdag, kevés lebegőanyagot tartalmazó, fenékig átlátszó barna vizeket, addig a tó középső részén a hullámzás miatt gyakran felkeveredő üledéktől kevéssé átlátszó szürke vizeket taláhattunk. Az ÉK-i területek vize az algák tömeges elszaporodása miatt zöld színű volt (Buckó és Schmidt, 1995). A kor igényeit követve, a tó egy részének üdülő tóvá, másik részének természetvédelmi területté való átalakítása érdekében 1960-tól átfogó rekreációs munkálatok kezdődtek: sor került a tó partszabályozására, mederrendezésén keresztül vízszint szabályozására. Ezeken felül nád- és hínárirtást is végeztek (Reskóné, 1999; Reskóné ésmtsai, 2001).

1. kép A Velencei-tó látképe A beavatkozás hatására a tó állapotában kedvezőtlen változások sora kezdődött. A mederkotrás és a nádasirtás következtében a planktonikusan oligotrófnak tartott víz fokozott mértékben eutrofizálódott (hínárosodás, algásodás), romlott a vízminőség, hiszen a megfogyatkozott partmenti makrofita öv nem tudta ellátni természetes víztisztító funkcióját. A fent említett negatív ökológiai folyamatok hatását tovább súlyosbította az 1980-as évek végén, 1990-es évek elején jelentkező száraz, aszályos periódus, aminek következtében a tó vízszintje lecsökkent, vize betöményedett, az eutrofizálódási folyamatok felgyorsultak. Komoly problémát jelentett a Microcystis aeruginosa toxintermelő kékalga és a Cladophora glomeratus zöldalga tömeges elszaporodása is. A nádasszegély körül felhalmozódó algatömeg 6

a nádasállomány súlyos károsodásához vezetett. A csapadékhiány felerősítette a munkálatok utóhatásaként jelentkező erőteljes szikesedési folyamatot, a tó lápi jellege csökkent. A vízhiány miatt erősen károsodott élővilágot és lényegében magát a kiszáradásnak indult tavat is csak mesterséges vízpótlással lehetett megmenteni A nádasállományok felszámolásával a tisztásokat egymással közlekedővé tették, ami az egyes vízterek közti éles határvonalak megszűnését eredményezte. Ezt az alga-élőbevonat vizsgálatai is alátámasztják: a tó különböző pontjairól származó bevonatok fajösszetétele és dominancia-viszonyai igen hasonlóvá váltak (Reskóné és mtsai, 2001). Alföldi asztatikus jellegű szikes vizeinket a szél és a folyók medencealakító tevékenysége hozta létre. A tavakat tápláló talajvizek nagy területről gyűlnek össze, és folyamatos áramlásban vannak a mélyebben fekvő szikes tómedrek felé. A nyári aszályos időszakban az erőteljes párolgás miatt csökken a víztestek térfogata, sótartalmuk koncentrálódik. A párolgás következtében kialakuló szívó hatás a mélyebb rétegekből is megindítja a talajvíz feláramlását, és növeli a felszíni sófelhalmozódást. Télen ezzel szemben sokszor fenékig befagynak ezek a sekély tavak. A víz színe alapján alföldi szélsőségesen sekély vizű szikes tavainknak két típusát különböztethetjük meg. Az élőhelyek szukcessziós folyamatában a „fehér vizű tavak” a legfiatalabb képződmények. Tejfehér vizük a kolloid mészsóktól állandóan zavaros, így a napfény csak a felső pár centiméteres rétegbe tud behatolni, s ez nagymértékben korlátozza a fotoszintetizáló szervezetek elterjedését. Aljzatukat szürkésfehér karbonát-mésziszap borítja, szezonális kiszáradáskor medrükön „kivirágzik” a sziksó, azaz a szóda. A fehér vizű tavak feltöltődésével jönnek létre a „fekete vizű tavak”, melyek átlátszó sárgásbarna színét a benne oldott humuszanyagok okozzák. A víztestbe a vörös tartományba eső napsugarak hatolnak be leginkább, és szolgáltatnak energiát a primer produkció számára. Ezekben a víztestekben már gazdag vízi és mocsári növényzet jelenik meg. A két forma egyazon mederben is megjelenhet az egyenlőtlen feltöltődés következtében (Boros, 1999). A kiskunsági székek medrét az ősi Duna-völgyben a folyó és a szél együttes munkája alakította ki. Miután a Duna elhagyta Szeged felé tartó folyásirányát a Duna-Tisza közén a folyóvízi feltöltődés megszűnt, és futóhomok, helyenként lösz rakódott le. A medencéket az ősi folyóágak pangó vize töltötte meg, vízutánpótlásuk jelenleg egyrészt csapadék eredetű, másrészt a jó vízáteresztő homokbuckák felől a mederbe áramló talajvízből származik. A szikesedési folyamatok 8-10 ezer évvel ezelőtt indultak meg, a tavak meszes-szódás jellege a homokból

kioldott

kalcitnak

köszönhető. Mivel a víztömeg nagy felületen kis

rétegvastagságban oszlik szét, a víz hőmérséklete szorosan követi a levegőét, kémhatása és 7

sókoncentrációja pedig a vízborítottság függvényében szélsőséges ingadozásokat mutat. A csekély vízmélység, és a szél keltette hullámzás következtében a víztest fizikai és kémiai tekintetben homogén és oxigén ellátottsága jó (Boros, 1999; Megyeri, 1999; Tamásné, 1999). A Kiskunsági Nemzeti Park (KNP) területén található Kelemen-szék (2. kép) nátrium és hidrokarbonát ion dominanciájú, az átlagos sótartalom 700–1200 mg l-1 (Schmidt, 2003).

2. kép Kelemen-szék látképe Magyarország legnagyobb összefüggő szikes területe a Tiszántúlon található, a tavak jelentős része UNESCO Bioszféra Rezervátum, illetve a Ramsari Egyezmény alapján is nemzetközi védettséget élvez. A tiszántúli szikes vizes élőhelyek és puszták mintegy 20 ezer évvel ezelőtt jöttek létre a Tisza megjelenésének köszönhetően. A Tisza mederrendszere kettévágta a terület Kárpátokból érkező észak-déli irányú folyóit, melyek közül a jobb partiak mellékfolyókká váltak. A bal parti terület azonban folyóvízellátás nélkül maradt, aminek következtében a Tisza áradása során jelentősen emelkedett, majd visszaesett a talajvízszint. A fluktuáló talajvízszint következtében az ártéri üledék karbonátja feloldódott, és a talajvíz igen lúgossá vált, melyben az üledék Na+ és K+-ion tartalmú szilikátjai (pl. földpátok) mállásnak indultak. A széteső szilikátokból a különböző kationok felszabadultak és hidratálódtak, a talajvíz alkáliákban dúsulni kezdett. A csökkenő talajvízszint kialakította a talaj kapilláris szerkezetét, így a párolgás hatására a víz és a benne oldott anyagok a gravitáció ellenére is képesek voltak a felszín felé vándorolni, ezáltal a vízben oldott anyagok, köztük a kovasav, a felszínen vagy a felszín közelében kicsapódhattak (Rónai, 1985; Sümegi és mtsai; 2000). 8

3. kép Nagy-Vadas látképe A Hortobágyi Nemzeti Park kezelésében lévő, a Hortobágy, a Hajdúság és a Nyírség területén fekvő szikes tavak közül előzetes terepbejárást követően a Nyíregyháza közelében fekvő Nagy-Vadast (3. kép) választottuk kutatási területként. 4.2 Nád és nádas A nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel) az egész Földön elterjedt, fásodó gyöktörzsű, kemény, de hajlékony szárú, a pázsitfűfélék (Graminales) családjába tartozó nedvességigényes növény. Hosszú, akár több méteres rizómái révén vegetatív szaporodásra is képes. A kifejlődő új növényegyedek az anyanövénnyel összeköttetésben maradnak, és kedvező feltételek mellett nagymértékben elősegítik a nádasok (Scirpo-Phragmitetum) terjedését a sekély vizek litorális zónájában, valamint a természetes és a mesterséges vizes élőhelyeken egyaránt (Buckó és Schmidt, 1995; Lakatos és mtsai, 1998; Kiviat és Hamilton, 2001). A nádasok a vizes élőhelyeken nagyon sokrétű feladatot töltenek be. A vizek anyagforgalmában és természetes öntisztulási folyamataiban mechanikai szűrőként működve, illetve tápanyagfelvételük révén közvetlenül, a társulás emerz makrofitonjainak víz alatti részein kialakuló élőbevonat aktivitása révén pedig közvetve vesznek részt. Ezen kívül költőhelyet biztosítanak a vízimadarak, ikrázóhelyet a halak és kedvező biotópot a vizek számos más élőlénye számára (Szabó és mtsai, 1993; Amann és mtsai, 1998).

9

A nádasállomány mechanikai szűrő funkciója egyrészt abban áll, hogy feltartóztatja a szárazföld felől érkező hordalékot, másrészt az áramlási sebességet lecsökkentve elősegíti a víztérben az üledékképződést, gátolja a főként elhalt szerves anyagokból álló üledék felkeveredését. A víztestben szabadon hozzáférhető tápanyagok mennyiségének ilyen módon/módokon való csökkentésével megakadályozza a fitoplankton feldúsulását is, és mérsékli az eutrofizálódási folyamatokat (Brenner és mtsai, 1999; Madsen és mtsai, 2001). A nádasok tápanyagaik egy részét a vízi üledékből veszik fel, így azok a növények biomasszájába épülve kivonódnak a vízből. A Balatonon végzett vizsgálatok szerint az üledék elemtartalmának növekedésével párhuzamosan a nád földfeletti szerveiben (szár, levél) nagyobb mennyiségű elem halmozódik fel. A levél nitrogén tartalma 1-3% között változik, de a szennyvízzel terhelt partszakaszokon a levelekben 1,5-2-szer, a szárban 2,5-3-szor nagyobb mennyiségű nitrogén mutatható ki. Ezek az adatok is igazolják, hogy a vegetációs időszakban a nád jelentős mennyiségű elemet képes a szerveiben felhalmozni, és ezáltal azokat meghatározott időre kikapcsolja a vízterek biogeokémiai ciklusából. A téli aratással a vegetációs időszakban mért elemmennyiségnek mintegy a 30-40%-a eltávolítható (Kovács és mtsai, 1998). A vízi ökoszisztémák tájképileg is meghatározó társulásaival, a nádasokkal kapcsolatban meg kell említenünk a világszerte egyre jobban terjedő nádpusztulás jelenségét, melynek következtében a nád uralta élőhelyek fokozatosan zsugorodnak. A pusztulás következményeként az eredetileg zárt nádasállományok a nyíltvíz oldaláról nádas foltokra szakadoznak, „babásodnak”. A károsodott nádegyedek alacsonyak, vékonyak, gyakran elágazók, törékenyek. Fejlődésük rendszerint vegetatív állapotban megreked (Dinka és Szeglet, 1999). A jelenség több mint 25 éve Magyarországon is felütötte fejét, de komolyabb károsodásokat csak a 80-as évek elejétől regisztráltak. A nádpusztulás okainak felderítésére az EUREED Project keretében az 1990-es években átfogó kutatómunka kezdődött nemzetközi és hazai szinten egyaránt (Ostendorp, 1989). A nyíltvíz és a nádas közötti egyensúly kulcsfontosságú a vizes élőhelyek ökológiai minőségének fenntartásában, így a nádelhalás messzemenő

következményekkel

járhat.

Kihatása

van

a

természetes

élőhelyek

fennmaradására, a szárazföldi és a vízi ökoszisztéma közötti pufferzóna megmaradására, a folyók és tavak partszegélyének stabilitására (Lakatos és mtsai, 1998; Szabó és mtsai, 1993). A nádasok eltűnése káros hatással lehet a vizek természetes öntisztulási folyamataira is, ami a vízminőség leromlásához vezethet. A jó minőségű nádasok nádszárainak élőbevonatában a kovaalgák a legelterjedtebbek. A pusztuló nádasokban a békanyál (Cladophora glomerata) és más fonalas zöldalgák tömeges elszaporodása jellemző, ami 10

megakadályozza a fiatal nádszárak kihajtását. Buczkó és Ács (1998) a Velencei-tavon végzett összehasonlító vizsgálatukban a degradálódó nádon a Fragilaria pulchella, Rhoicosphaenia abbreviata, Amphora pediculus és Nitzschia fajok, míg az egészséges nádon az Achnanthes minutissima, Gomphonema olivaceum, Cymbella lacustris és Cymbella lanceolata fajok nagyarányú jelenlétét találták. Lakatos és munkatársai hazai sekély tavainkban (Balaton, Fertő, Velencei-tó) a nád-perifiton komplex nehézfémtartalmának vizsgálata során azt találták, hogy az antropogén terhelésnek jobban kitett területeken a nád és a hozzá kapcsolódó perifiton nehézfémtartalma különösen magas volt, ami a nád-biofilm komplex biofilter szerepét igazolja (Lakatos és mtsai, 1999). Korábban a természetes ökoszisztémák öntisztító folyamataik révén képesek voltak megbirkózni az akkor még jóval alacsonyabb szintű szennyezéssel. A szennyező anyagok mikrobiális transzformációja és mineralizációja azokat ismét hozzáférhetővé tette az elsődleges produkció számára. A korszerűnek számító biológiai szennyvízkezelési eljárások napjainkban is ezeknek a komplex mikróbaközösségeknek az összehangolt tevékenységén alapulnak. Hatékony szennyvíztisztító rendszert létrehozni még ma is a természetben fellelhető folyamatok kihasználását, azok megfelelő tér- és időbeli összehangolását jelenti (Amann és mtsai, 1998). Ma már világszerte elterjedt a mesterséges vizes élőhelyek szennyvíz tisztítási célból történő alkalmazása. Ezeknek a rendszereknek szerves részei a szennyvíz tisztításában sokrétű szerepet betöltő vízi makrofitonok (Brix, 1987; Reed és mtsai, 1988). Az adott környezeti tényezők és a hipertróf viszonyok toleranciáján, valamint a stressztűrésen túl általános elvárások az alkalmazott növényfajokkal szemben, hogy nagy szennyezőanyag-eltávolító kapacitással bírjanak egyrészt közvetlen módon tápanyagfelvételük és raktározásuk, közvetetten pedig a mikrobiális tevékenységek elősegítése révén (Tanner, 1996). A nád vizes élőhelyeken betöltött sokrétű szerepe mellett nagy produktivitása, gyors szaporodása és terjedése miatt egyike a gyakran és széles körben alkalmazott növényfajoknak (Cooper, 1993). Az ilyen rendszerek nagy szennyezőanyag-eltávolító kapacitása tehát közvetlenül a növények tápanyagfelvételének és raktározásának, közvetett módon pedig a mikrobiális átalakító tevékenységnek (pl. nitrifikáció és denitrifikáció) köszönhető (Tanner, 1996).

11

4.3 Növény-asszociált biofilmek A nád a növényi tápanyagok felvételén és akkumulálásán túl a vízi élőhelyek öntisztulási folyamataihoz főként a felületéhez asszociálódó élőbevonat (biofilm, biotekton, perifiton) jelenléte és aktivitása révén járul hozzá (Amann és mtsai, 1998). A mikrobiális ökológiának nagy múltra visszatekintő és napjainkban is intenzív kutatások tárgyát képező területe a vízi ökoszisztémákban fellelhető növény-asszociált mikróbaközösségek vizsgálata. Ezek a mikróbaközösségek kiemelkedően fontos szereppel bírnak az adott vízi környezet szén- és más tápanyagkörforgalmában, valamint érzékeny indikátorai a környezetükben bekövetkező változásoknak, lehetővé téve vizsgálati eredményeik monitorozási célú felhasználását. Az

öntisztulási

folyamatok

hatékonyságát,

a

szerves

anyagok

lebontását

nagymértékben meghatározza a növények felületéhez asszociálódó élőbevonat (biofilm, biotekton, perifiton) összetétele és aktivitása (Amann és mtsai, 1998). Az alternatív szennyízkezelésben alkalmazott vízinövények és/vagy a rajtuk kialakuló biofilmek víztisztításért felelősnek tartott adottságainak és kölcsönhatásainak, a különféle hatásokra kialakuló változásoknak a felderítésére napjainkban számos kutatás irányul. Tanner munkájában (1996) több növényfaj, köztük a nád mesterséges szennyvíztisztítókban mutatott növekedését és tápanyagfelvételét hasonlította össze. Greenway és Woolley (1999) összehasonlító vizsgálatában eltérő típusú szennyvíztisztító rendszerekben mérték a különféle növényfajoknak a tápanyagok bioakkumulációjára vonatkozó kapacitását. Mauchamp és mtsai (2001) vizsgálatának tárgyát az alámerültség mértékének hatása képezte a nád növekedésére, ami igen fontos tényező az alternatív szennyvízkezelésben. Bár biológiai szennyvíztisztítást már több mint egy évszázada alkalmazunk, a szennyvíztisztítási folyamatokban résztvevő növények szennyvíztisztító hatékonyságát és mértékét alapvetően meghatározó mikróbaközösségek összetételéről és aktivitásáról elsősorban módszertani korlátok miatt egészen a kilencvenes évekig csak szórványos ismeretekkel rendelkeztünk. A nádasok és a víz alatti részeiken kialakuló biofilmek természetes környezetekben betöltött szerepének és az ezekért felelős mechanizmusoknak és kölcsönhatásoknak az ismerete ugyanakkor fontos információkat nyújthat a szennyvízkezelési folyamatok optimalizálásában és hatékonyságának növelésében is. A különféle molekuláris biológiai technikáknak a szennyvizek mikrobiológiai kutatásába való bevezetése tette lehetővé, hogy meghatározzuk a rendszerek mikróbaközösségeinek összetételét és dinamikáját és azonosítsuk a kulcsfontosságú mikrobiológiai folyamatokban résztvevő 12

szervezeteket (Wagner és mtsai, 2002). Juretschko és mtsai (2002) például, csoport-specifikus rRNS-célzott oligonukleotid próbákkal szennyvíztisztító növények mikróbaközösségein végzett FISH kísérleteikben igazolták, hogy a bakteriális próbákkal detektálható szervezeteknek csaknem felét β-proteobaktériumok (Zooglea ramigera, Azoarcus sensu lato, etc.) alkotják. További fontos in situ detektálható csoportok voltak még az αproteobaktériumok (nitrifikáló Nitrospira sp.), a γ-proteobaktériumok (polifoszfát-akkumuláló Acinetobacter sp.), a Planctomycetes és a Chloroflexi törzsek. A növényi felületeken, leveleken, szárakon vagy gyökérzeten megtelepedő mikroorganizmusok növény-mikróba interakciókban betöltött funkciójuk alapján lehetnek fitopatogén (növényi kórfolyamatokat indukáló), szaprotróf (tápelemek körforgalmában, komposztálásban, etc. résztvevő) vagy növényi növekedést elősegítő szervezetek. A természetben kialakuló élőbevonatok többségében prokarióta dominancia a jellemző, de az eukarióta szervezetek: algák, mikrogombák, protozoák és többsejtű állatok jelenléte is számottevő (Costerton és mtsai, 1995; Davey és O’Toole, 2000). Baktériumok játsszák a legfontosabb szerepet a kommunális és ipari szennyvizek kezelésében, tisztításában is. Számban és biomasszájuk tekintetében is dominálnak, továbbá nélkülözhetetlenek a szerves, illetve szervetlen anyagok eltávolításának folyamataiban (pl. nitrogén és foszfor eltávolítás). A baktériumok mellett a különféle protozoonok és többsejtű állatok elsősorban a szennyvízben található partikulumok felszínén való táplálkozásuk révén jelentősek a szennyvíz szűrésében, derítésében (Amann és mtsai, 1998). A mikroorganizmusok metabolikus sokféleségének és fenotípusos plaszticitásának köszönhetően biofilmek biotikus és abiotikus felszíneken egyaránt kialakulhatnak. A biofilmek olyan közösségi anyagcserére alapozott magasabb szintű szerveződések, melyben a mikróbafajok koordinált, funkcionálisan is jól tagolt közösséget képeznek. Bár korántsem rendelkezünk kielégítő ismeretekkel a növény-mikróba kölcsönhatásokban résztvevő mikroorganizmusok

in

situ

aktivitásáról,

azt

azonban

már

ismerjük,

hogy

e

mikroorganizmusoknak a növényi felületeken való megtelepedése (biofilm képződése) hasonló stratégiák és mechanizmusok szerint történik (Lugtenberg és mtsai, 2002). A biofilm kialakulásának korai fázisában a mikróbák aktív vagy passzív mozgással megközelítik a kolonizálandó felületet, és reverzibilisen kapcsolódnak a korábban főként szerves anyagokból keletkezett ún. kondicionáló filmhez, majd a megfelelő élő és élettelen környezet kiválasztását követően irreverzibilisen kötődnek (Davey és O’Toole, 2000). A végleges kötődés olyan gének expressziójának eredménye, melyek pl. a csillószintézist leépítik, ezáltal megszüntetnek egy, a biofilmet destabilizáló faktort (Watnick és Kolter, 13

2000). Kezdetben az azonos metabolikus aktivitású csoportok telepednek le egymás mellett, és a kedvező körülményeknek megfelelően intenzív sejtosztódásba kezdenek. Ennek eredményeképpen azonos fajhoz tartozó szervezetekből álló mikrokolóniák jönnek létre. A különböző mikrokolóniák tagjai exopoliszacharidokat (EPS) termelnek, ami mátrixot hoz létre a sejtek között. A mátrix anyagai a metabolikus aktivitás révén keletkező szerves és szervetlen anyagokkal együtt további fajok megtelepedését teszik lehetővé. Így az érés során az egyre heterogénebb, közösségi anyagcsere rendszerekké szerveződő tagokból álló biofilm strukturálisan és funkcionálisan is tagolttá válik. A biofilmben található sejtek a teljes szervesanyag-tartalom 10-90%-át, az EPSösszetevők pedig 50-90%-át tehetik ki (Christensen és Characklis, 1990; Apllegate és Byers, 1991; Nielsen és mtsai, 1997). Az EPS legnagyobb részét poliszacharidok képezik, de egyéb makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak és más heteroploimerek) is előfordulhatnak benne (Christensen, 1989). A baktériumokat körülvevő és a biofilmszerkezet kialakításában elsődleges szerepet játszó EPS mátrix homeosztázist és védelmet biztosít a megtelepedő mikroorganizmusok számára. A mátrix oldott szerves anyagokat képes felületén adszorbeálni, ezáltal a közösség számára fontos növekedési faktorokat és tápanyagokat koncentrál. Ioncserélőként működve korlátozza a különféle komponensek bediffundálását a biofilmbe a környezetből, így megakadályozhatja pl. bizonyos antimikrobiális ágensek, toxinok, fémek bejutását. Fizikailag védelmet nyújt a környezeti stresszhatásokkal (pl. UV-sugárzás, pHeltolódás, ozmotilus sokk és kiszáradás, valamint bakteriofágok) szemben. Az EPS mátrix mikrocsatornácskái révén a sejtcsoportok kapcsolatot létesítenek egymással, illetve a környezetükkel. A mikrocsatornácskákon keresztül bonyolódik a biofilm anyagforgalma: a tápanyag- és oxigénfelvétel, a metabolitok „cseréje”, valamint az anyagcsere végtermékek leadása. Bár a biofilm belseje többnyire a csatornácskáknak köszönhetően aerált, a mikrokolóniák belsejében létrejöhetnek mikroaerofil, sőt anaerob mikrokörnyezetek is. Az érett biofilmben a tagok között szervezett, mutualisztikus jellegű metabolikus kooperativitás valósulhat meg. A biofilm azért válhat komplex, jól működő, tagjai számára kedvező élőhellyé, mert a közösség élete szabályozott. Ennek alapját olyan aktívan

vagy

passzívan

transzportálódó

bakteriális

termékek

biztosítják,

melyek

megváltoztatják a szomszédos mikróbák állapotát, fehérje-expresszióját. A szignálmolekulák lehetnek metabolitok, proteinek, nukleinsavak egyaránt (Watnick és Kolter, 2000). A biofilm baktériumok körében egyúttal a konjugáció révén megvalósuló intra- és interspecifikus géntranszfer a szoros közelségben együtt élő fajok között hatékony

14

génkicserélődésre ad módot. Az új genetikai elemek lehetnek például antibiotikumrezisztencia faktorok, vagy patogenitási szigetek (Davey és O’Toole, 2000). 4.4 Szikes tavak mikrobiális diverzitása A szikes tavak talán a legproduktívabb vizes élőhelyek a Földön. Karbonátokban rendkívül gazdag vizük, a magas hőmérséklet, az intenzív napsugárzás és a nagy napfénytartam ideális környezetet jelentenek a fotoszintetizáló prokarióták számára. A szikes tavakban a primer produkciót aerob és anoxigénikus fototróf baktériumok biztosítják, melyek nagyfokú elszaporodása a domináns fajoktól függően gyakran a zöld, a narancs és a bíbor legkülönbözőbb árnyalataira „festi” a vizet. A kevésbé alkalikus vizek fő fototróf szervezetei a cianobaktériumok (pl. Spirulina, Chroococcus, Cyanospira), melyek egyben N2-fixálást is végeznek, míg az erősen lúgos vagy sós vizekben a cianobaktériumok mellett az anoxikus fototróf baktériumok (pl. Ectothiorhodospira, Halorhodospira) is megjelennek. Ez utóbbi csoport feltehetően igen nagymértékben járul hozzá a primer produkcióhoz, de szerepük, elterjedtségük és diverzitásuk még kevésbé tisztázott. A hatalmas mértékű primer produkcióra (>10 g C m-2 nap-1) aerob és anaerob kemoorganotróf baktériumok változatos közössége épül, általában a 105–106 CFU g-1 üledék értéket is elérve (Grant, 1992; Duckworth és mtsai, 1996; Jones és mtsai, 1998). Az aerob kemoorganotróf közösségekben a Gram-pozitív és a Gram-negatív szervezetek feltehetően egyaránt abundánsak. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitívokat elsősorban aktinobaktériumok (Streptomyces nemzetség;), valamint a Dietzia és a Nesterenkonia nemzetség képviseli (Ma és mtsai, 2004), míg a kis G+C tartalmú Gram-pozitívok jelentős része valószínűleg az obligát alkalofil Bacillusok közé tartozik, melyek extracelluláris hidrolitikus enzimeik révén a biopolimerek lebontásában játszanak kiemelkedő szerepet (Duckworth és mtsai, 1996). Az aerob Gram-negatív kemoorganotrófok többségében a γ-proteobaktériumok közül kerülnek ki, pl.: Halomonas, Pseudomonas, Aeromonas és Alteromonas nemzetségek (Duckworth és mtsai, 1996, 2000; Jones és mtsai, 1998). A szikes tavakban a gyakori oxigén limitáltság miatt az anyagkörforgalmi folyamatokban az anaerob baktériumközösségek is jelentős szerepet tölthetnek be. Az anaerob kemoorganotróf közösségek domináns biopolimer bontó képviselői (az ún. elsődleges fermentálók) főként a Clostridium és a Spirochaeta nemzetségekbe tartozónak bizonyultak. Az

általuk

termelt

H2-t

szulfátredukáló

szervezetek

(pl.

Desulfonatronovibrio

hidrogenovorans), valamint alkalofil metanogének (Methanohalophilus zhilinae), és 15

homoacetogén szervezetek (Natrionella acetigena) hasznosítják. Azonosítottak több különleges anyagcseréjű baktériumot is, mint például az aminosavakat fermentáló acetogén ammonifikáló Tindallia magadiensist (Kevbrin és mtsai, 1998). Haloalkalofil ősbaktériumok, a Halobacteriaceae család tagjainak jelenlétét szintén számos szikes tóban igazolták, pl.: Natronobacterium, Natronococcus, Natronomonas, Natrialba, Natronorubrum, Halorubrum nemzetségek (Tindall, 1988; Zhilina és Zavarzin, 1994, Kamekura és mtsai, 1997). Az oldott sók nagy koncentrációjával (>20% NaCl) jellemezhető vizekben 107-108 CFU ml-1-es értékeket is elérhetnek a haloalkalofil ősbaktériumok képviselői, melyek növekedésükhöz a szerves tápanyagok különösen nagy mennyiségét igénylik. Jelenlétük feltehetően a tavak sókoncentrációjának fluktuációjával függ össze. Amikor az esőzések következtében a tavakban a sókoncentráció átmenetileg lecsökken, lehetővé válik a kevésbé halofil autotróf szervezetek elszaporodása. Később a csapadékhiány és a nagyarányú párolgás miatt a sókoncentráció visszaáll az eredeti magas szintre, az érzékeny algák elpusztulnak, és elhalt anyagaik szénforrásként szolgálhatnak a haloalkalofil kemoorganotróf mikroorganizmusok számára (Hamamoto és Horikoshi, 1992; Duckworth és mtsai, 1996). Kevésbé ismertek a szikeseket kolonizáló kemolitotróf közösségek, melyek közül a γproteobaktériumok

csoportjába

tartozó

obligát

autotróf

kén-oxidáló

baktériumok

(Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio és Thioalkalispira nemzetségek) bizonyultak a legdiverzebb és legdominánsabb csoportnak (Sorokin és mtsai, 2000b, 2003). Mellettük alkalofil metánoxidáló (Methilobacter alcaliphilus), nitrifikáló (Nitrosomonas halophila, βProteobacteria) és NO2-oxidáló fajokat (Nitrobacter alkalicus, α-proteobacteria;), valamint aerob denitrifikáló hidrogenotróf α-proteobaktériumokat is kimutattak (Khmelenina és mtsai, 1997; Sorokin és mtsai, 2000a). Magyarországon a szikes, alkalikus környezetek mikrobiológiai kutatása az elmúlt 10 évben vett lendületet. A nem higiénés célú bakteriológiai kutatások a Fertőn indultak meg a planktonikus és biofilm, valamint az üledék és nád rizóma baktériumközösségek mikróbaközösségeinek vizsgálatával. A Fertő baktériumközösségeinek részletes, tenyésztésen alapuló vizsgálata során a tó vizéből és a nád biofilm bevonatáról egyaránt izoláltak baktériumtörzseket, melyeket részletes fiziológiai-biokémiai tesztekkel karakterizáltak és azonosítottak. A Fertő vizéből és a nád biofilm bevonatáról izolált és a fenotípusos tesztekben meglehetősen inaktív, Gram-negatív dominanciájú (59%) törzsek között sok halotoleráns, alkalitoleráns vagy alkalofil szervezetet mutattak ki. A fenotípusos tulajdonságok alapján azonosított törzsek a Bacillus, a Micrococcus, a Pseudomonas, a Flavobacterium, az 16

Aeromonas és az Arthrobacter nemzetségekbe tartoztak. Az őszi-téli vizeket elsősorban a flavobaktériumok jellemezték, a Bacillusok csak az üledéktől felkeveredett vizekben fordultak elő nagyobb arányban. A nád biofilm bevonatára és a téli jég alól vett vízmintákra elsősorban a Pseudomonas alcaligenes, míg a nyílt vízterekre a Micrococcus nemzetség tagjai voltak jellemzőek. A „litter bag” kísérletben a Fertő nádasaiból aratás során felszaggatott rizómák felületén kialakuló tenyészthető közösségeket egy éven keresztül, negyedévenkénti mintavételekkel kísérték végig. A tó szikes jellegére való tekintettel egy alkalofil szervezetek számára ajánlott táptalaj módosított, cellulózzal dúsított változatát is alkalmaztuk az alkalikus környezethez jobban alkalmazkodott mikroorganizmusok tenyésztésbe vonásához. A törzsek hagyományos fenotípusos és BIOLOG szénforrás-értékesítési spektumának vizsgálata mellett a faji szintű azonosításra a 16S rDNS szekvencia analízise révén került sor. Az eredmények azt mutatták, hogy a Fertő vizében dekomponálódó rizómák felületéről kitenyészthető baktériumközösségekben

jellegzetes

változásokat

tapasztalhatók

az

évszakonkénti

mintavételezések során. Nyáron a fakultatív fermentatív anyagcseréjű, meleg eutróf vizekre jellemző Aeromonas fajok túlsúlya volt jellemző. Az őszi mintában fakultatív fermentatív, fakultatív kemolitotróf, emellett fakultatív nitrogén-fixáló és cellulolitikus fajok törzseit izoláltuk, melyek a nyári mintáktól jellegzetesen eltérő szénforrás-hasznosítást mutattak. Csak az őszi mintából kerültek kitenyésztésre egyes α-proteobacteria (Ancylobacter aquaticus, Rhizobium radiobacter) és β-Proteobacteria (Hydrogenophaga palleronii, Alcaligenes sp.) leszármazási vonalba tartozó fajok. A téli és a tavaszi mintavételek alkalmával kitenyésztett baktériumközösségek faji összetétele nem különbözött egymástól olyan mértékben, mint a nyári és az őszi mintáké (Kurdi és Borsodi, 1995; Borsodi és Sallai, 1997; Borsodi és mtsai, 1998, Borsodi és Sallai, 1998, Borsodi és mtsai, 2005b). A Velencei-tó üledékében jelenlévő ammonifikáló, deszulfuráló, aerob tioszulfátoxidáló, anaerob fototróf és szulfátredukáló baktériumok hosszútávú mennyiségi változásának nyomon követésére MPN módszerrel került sor. Az eredmények alapján a tápanyagokban gazdag üledék mikróbaközösségei nagy aktivitásal rendelkeztek. A tó vizében és üledékében az ammonifikálók és deszulfurálók közösségei elsősorban a tó lápi területén és a Fürdetőn voltak jelen legnagyobb csíraszámban és aktivitással. Mennyiségük szerves anyagokban gazdag külső vagy belső terhelés hatására nőtt, ezért az élőhelyek tápanyag ellátottságának indikátorai lehetnek. Csíraszámuk dinamikája az élőhely minőségéről tájékoztat: aktivitásuk jelentősebb változásával az átlagostól eltérő hatásokat jelezhetik (pl. kívülről érkező terhelés, hullámverés okozta felkeveredés). Az MPN értékek időben való egyenletes lefutása az adott térség önmaga által szabályozott, zavartalan anyagforgalmára utal (pl. Német-tisztás). A SRB 17

a tó vizében alig fordultak elő, üledékben való egyöntetű elterjedésük és aktivitásuk a mineralizációban betöltött alapvető szerepükre utal. Az üledék mélységével, annak minőségétől függően nemcsak aktivitásuk, hanem diverzitásuk is változott. A redukált kén vegyületek újra oxidálását végző tioszulfát-oxidálók általánosan elterjedtek a tó vizében és üledékében. Csíraszámuk a SRB-ét meghaladta, aktivitásuk a tó vízszintjének csökkenésével nőtt. Az anaerob fototrófok a SRB-hoz hasonló csíraszámban voltak jelen. A BIOLOG szénforrás

értékesítés

mintázata

alapján

a

Velencei-tó

vizének

és

üledékének

mikróbaközösségét 2001-2003 között vizsgálva, határozott térbeli különbségeket lehetett megfigyelni. Az első két évben a szezonális különbségek az üledékmintákban nagyobbak voltak, mint a vízmintákban. Ez alapján feltételezhető, hogy a metabolikusan aktív aerob kemoorganotróf sejtek aránya az üledékben nagyobb mértékben ingadozott, mint a víztestben (Reskóné és Borsodi, 2003). Az üledék aerob alkalofil és anaerob fermentáló és szulfát-redukáló szervezeteinek aktivitását és szénforrás-értékesítését Borsodi és mtsai (2001, 2003a, 2003b) kutatásai alapján ismerjük. A Velencei-tó üledékéből izolált baktériumtörzsek tenyésztésére alkalofil szervezetekre szelektáló táptalajt alkalmaztak. Fenotípusos tulajdonságokon alapuló numerikus analízist, majd ARDRA csoportosítást követően a reprezentáns törzseket 16S rDNS-ük parciális szekvenálásával azonosították. A fenotípusos tesztek eredményei ebben a vizsgálatban is nagy mértékű biokémiai inaktivitásra utaltak, az összes izolált törzs Grampozitív volt. Az identifikált törzsek a legnagyobb hasonlóságot a Bacillus cohnii, a B. pseudofirmus, a B. halmapalus és a B. marinus fajokkal mutatták, néhány törzs csak kis mértékű hasonlóságot mutatott a már ismert fajokkal, ezeket új taxonokként valószínűsítették. A tó nádasainak rizoszféra-asszociált aerob közösségeit Micsinai és munkatársai (2003) térképezték fel munkájuk során. Az egészséges és pusztuló nádrizómák vizsgálati eredményei arra utaltak, hogy kora nyáron az egészséges és pusztuló nádasállományok baktériumközösségei nem különböztek nagymértékben egymástól. A vegetációs periódus előrehaladtával mindkét közösség struktúrája megváltozott. Az őszi egészséges mintákból kitenyésztett baktériumközösség a környezeti változásokhoz sokkal adaptívabb metabolikus potenciállal rendelkezett, mint a pusztulóból nyert: képes volt a respiratórikus és a fermentatív anyagcsere között is váltani, továbbá a tápanyagok sokkal szélesebb spektrumát volt képes hasznosítani. A pusztuló nádasállomány baktériumközössége is változott időben, kisebb arányban voltak jelen fakultatív fermentatív szervezetek, mint az egészséges állományban. A kora nyári minták az őszi mintákhoz képest sokkal inkább hasonlítanak egymásra, és ez a faji összetételben is tükröződik. Az identifikáció eredményei arra utaltak, hogy a kora nyári és 18

őszi minták baktériumainak metabolikus aktivitásbeli változása mögött egy faji összetételváltás is meghúzódik. Az egészséges nádasállományok rizómáin az obligát respiratórikus anyagcserét folytató kora nyári közösség helyét őszre egy döntően fakultatív fermentatív közösség veszi át (Aeromonas, Erwinia, Pantoea fajok). A pusztuló nádasállománynál nem ilyen egyértelmű az eltolódás a fakultatív fermentatív anyagcseréjű fajok túlsúlyának irányába, mégis egészen más fajokat (Acinetobacter, Rhizobium, Brenneria, Curtobacterium) sikerült kitenyészteni. A tó nádasainak rizoszféra-asszociált anaerob közösségeit Vladár és munkatársai (2008) vizsgálták munkájuk során. A Velencei-tóból izolált és identifikált Clostridium fajok mindegyike előfordult mind az egészséges, mind a pusztuló nádasok rizoszféra környezetében, az egyes mintavételi helyek között azonban eltérés volt megfigyelhető a különböző

szénforrás

hasznosító

képességekkel

jellemezhető

fajok

arányában. A

Desulfovibrio alcoholivorans mellett D. fructosivorans, D. desulfuricans és egy feltételezhetően a tudomány számára új Desulfovibrio- és Desulfotomaculum faj került elő a rizoszférából A klónozás eredménye a tenyésztéses vizsgálatokkal egybehangzóan Desulfovibrio dominanciát mutatott, valamint Desulfobulbus nemzetséghez tartozó fajok kerültek elő számottevő mennyiségben. A nád biofilm baktériumközösségeinek kutatását megelőzően a Velencei-tó nádbevonatában található algák vizsgálatát Lakatos és Bartha (1989) kezdték meg. 1988-ban kisebb-nagyobb kihagyásokkal folytatódott a Velencei-tó bevonatlakó algáinak vizsgálata, aminek célja egyrészt a tó különböző területein a nádbevonat algaszervezeteinek mennyiségi és minőségi elemzése, másrészt a tó nádbevonatában bekövetkezett változások megismerése volt (Lakatos és Ács 1990, Lakatos és mtsai 1991; Ács és mtsai 1991, 1994, 2001; Ács és Buczkó 1994; Buczkó és Ács 1997, 1998). A Velencei-tó nádbevonatának nemcsak legfajgazdagabb, de relatív mennyiségét tekintve is legabundánsabb csoportját a kovaalgák képezik. Esetenként a cianobaktériumok és zöldalgák aránya is nagy. Az Ács és mtsai által végzett (2007) hosszú távú vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy számos konstans fajjal jellemezhető a Velencei-tó nádbevonata, melyek a tó két eltérő vízminőségű területén különbözőek ugyan, de évről évre megtalálhatók a bevonatban. Az utóbbi években az algavizsgálatokat bakteriológiai és elemtartalom vizsgálatok is kiegészítették, hogy a bevonat működéséről komplexebb képet kaphassunk (Ács és mtsai, 2003; Kröpfl és mtsai, 2003a, b; Záray és mtsai, 2005). Elkezdődtek egyes növényvédő szer származékok (acetoklór, atrazin) lebontását vizsgáló kísérletek is, melyekben a bevonat mikroszervezeteinek a szerepe elsődleges (Bohus és mtsai, 2005). 19

A Kiskunsági Nemzeti Park területén fennmaradt legjelentősebb szikes tavak természeti állapotfelmérése 1998-ban kezdődött meg. A térség szikes tavainak nekton-, mezozooplankton-, makrozoobenton- és Protozoa-közösségeit számos kutatás eredményeiből ismerhetjük meg (Forró és Boros, 1997; Szabó, 2001, 2003; Andrikovics és Murányi, 2003; Boros, 2003; Boros és mtsai, 2006). A fehér vizű szikesek fizikai és kémiai környezetének legutóbbi vizsgálatai (Vörös és V. Balogh, 2003; Vörös és mtsai, 2006) rámutattak, hogy ezeknek a tavaknak a vizében a fotoszintetikusan aktív sugárzás extinkciójához a fitoplankton kis mértékben járul hozzá. A magas sótartalmú, zavaros, fehér vizű kiskunsági tavakban rendkívül sajátos pikoplankton-együttest figyelhető meg, az 1 µm átmérőjű, magányos, fikocianin dominanciájú pikocianobaktériumok esetenként tömeges előfordulását mutatták ki. Tengerek és édesvizek vonatkozásában a trofikus státus és a pikoplankton részaránya közötti összefüggés igen jól dokumentált, eszerint a klorofill-a mennyiségének növekedésével a pikoplankton részesedése meredeken csökken. A vizsgált szikes tavak azonban nem „követték” ezt az általános trendet (Vörös és mtsai, 2005). A kiskunsági szikes vizek bakteriológiai kutatásai az üledék és víz heterotróf baktériumainak vizsgálatával kezdődtek meg. A Kiskunság szikes tavait tenyésztésen alapuló bakteriológiai vizsgálata során kétféle táptalajt alkalmazva a Halomonas, a Pseudomonas, a Nesterenkonia, a Micrococcus és az Agromyces nemzetségek mellett többségében a Bacillus nemzetségbe tartozó törzseket izoláltak. A fenotípusos tesztek nagy mértékű inaktivitásról tanúskodtak, és a törzsek több mint 80 %-a Gram-pozitív volt (Szabó és mtsai, 2004; Borsodi és mtsai, 2005a). A Tiszántúlon található Nagy-Vadas-tó és Fehér-szik üledék baktériumközösségeinek megismerését, metabolikus és faji diverzitásának feltárását Pollák és munkatársai (2006) végezték el. A két tó tenyésztéses vizsgálatok során megismert baktériumközösségei nem csak egymástól, hanem a hozzájuk hasonló vízkémiai paraméterekkel rendelkező kiskunsági tavaktól is elkülönültek. Az azonosított fajok közel fele 98%-nál alacsonyabb szintű szekvencia hasonlóságot mutatott már leírt fajokkal, így ezek feltehetően a tudomány számára új taxonok. A Fehér-szikből elsősorban különböző Bacillus fajok kerültek elő nagy diverzitásban, míg a Nagy-vadasból a Nesterenkonia és a Pseudomonas nemzetség képviselői. A klónozás anaerob, illetve kemolitotróf, mixotróf és fototróf szervezetek jelenlétének igazolásával egészítette ki a tenyésztéses vizsgálatok eredményeit. A BIOLOG vizsgálatok alapján az egyes minták elsődlegesen évszakonként csoportosultak. A fenti szerteágazó kutatásokat kiegészítendő kezdtük meg a Velencei-tó, a kiskunsági Kelemen-szék, valamint a tiszántúli Nagy-Vadas nádasainak biofilm baktériumközösségeinek

20

vizsgálatát hagyományos, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerek alkalmazásával. A hagyományos tenyésztésen alapuló eljárások alapvető fontossággal bírnak a bakteriológiai kutatásokban, hiszen csak általuk nyílik lehetőségünk az adott környezetben előforduló baktériumok sokoldalú laboratóriumi vizsgálatára. Ez egyrészt segíthet megérteni az egyes baktériumok közösségben betöltött szerepét, másrészt közelebb vihet bennünket a közösség egésze működésének megismeréséhez. A tenyésztéses eljárások során azonban általános problémaként merül fel, hogy elegendően sokféle táptalaj alkalmazása esetén is az adott környezetben jelenlévő és aktív baktériumközösségeket alkotó fajoknak csak töredékét, becslések szerint mindössze 0,1-10%-át sikerül izolálni és tiszta tenyészetben fenntartani (Amann és mtsai, 1998). A közösségek biokémiai aktivitási viszonyainak feltérképezésére és a változások nyomon követésére („anyagcsere ujjlenyomat”) a BIOLOG, Inc. (Hayward, California, USA) által kifejlesztett gyorsdiagnosztikai eljárás a közösség szénforrás hasznosító képességének tesztelésével közvetlenül, a mikroorganizmusok tenyésztése nélkül teremt lehetőséget. A BIOLOG GN2 lemezek 95, az ECO lemezek 31 különféle szénforrást (polimereket, szénhidrátokat, karbonsavakat, aminosavakat, aminokat, amidokat, stb.) és oxidált állapotú, színtelen tetrazólium-ibolya redox-indikátort tartalmaznak. A szénforrás hasznosítását követő színváltozás kolorimetriásan értékelhető, és a minták közti különbségek az adatok többváltozós statisztikai elemzésével meghatározhatók (Garland és Mills, 1991; Choi és Dobbs, 1999; Haack és mtsai, 1995, Victorio és mtsai, 1996; Garland, 1997; Konopka és mtsai, 1998; Smalla és mtsai, 1998). A baktériumközösségek faji diverzitásának mind teljesebb megismerésére a molekuláris biológiai technikáknak a mikrobiális ökológiába történő bevezetése és alkalmazása teremtett forradalmian új lehetőséget (Ferris és mtsai, 1996; Grey és Herwig, 1996; Felske és mtsai, 1997; Teske és mtsai, 1998; Santegoeds és mtsai, 1998). Ma már rendkívül sokféle molekuláris módszer áll rendelkezésünkre a baktériumközösségek genetikai diverzitásának és szerkezetének feltérképezésére. Ezek egy része a teljes genetikai információt vizsgálatára („whole genomic community DNA analyses”) nyújt lehetőséget, mint pl. a különböző mintákból származó DNS-ek hibridizáltatása vagy a prokarióta DNS-ek G+C-tartalmának különbözőségét kihasználó denzitás-gradiens módszer (Lee és Furhman, 1990; Holben és Harris, 1995). Más technikák a teljes genom egy részének („partial community DNA analyses”) a feltárására irányulnak diverzitás becslés és a közösség összetételének megismerése céljából. A közösségi mintából izolált összes genomiális DNS21

nek leggyakrabban a 16S rRNS-t kódoló szakaszát (16S rDNS) szaporítják fel PCR segítségével, és az így nyert vegyes PCR termékből különféle diverzitásbecslő eljárások segítségével (klónozás, DGGE, TGGE, ARDRA, TRFLP) következtetnek az előforduló fajok számára és sokféleségére. A módszerek egy részénél az egyes fajokra jellemző 16S rDNS szakaszok elkülönítése is megtörténik, ami lehetőséget ad az adott fajokra jellemző 16S rDNS parciális nukleotid-sorrendjének szekvenálással történő meghatározására, és mód nyílik a baktériumok nemzetség, vagy faji szintű azonosítására (Stackebrandt és mtsai, 1993; Dunbar és mtsai, 1999). A környezeti mintákból közvetlenül nyert közösségi DNS-ből kiinduló diverzitás becslésre a nagy adatbázis létrehozása miatt meglehetősen időigényes és költséges klónozásos eljárás mellett molekuláris ujjlenyomat módszerek, pl. a denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) is alkalmazható. A DGGE során kapott csíkok száma, helye és intenzitása információval szolgál a vizsgált közösség faji struktúrájáról, és így lehetőség nyílik különféle minták diverzitásának összehasonlítására is (Boon és mtsai, 2002). A módszer hátránya, hogy főként a mintában dominánsan előforduló fajokra szelektál, így előfordulhat, hogy kevésbé abundáns, de a közösség szempontjából fontos szereppel bíró fajok „rejtve” maradnak. E módszer segítségével, melyet természetes környezetek bakteriális közösségeinek vizsgálatára és mesterséges rendszerek, például szennyvíztisztítók növényeinek baktériumközösségei megismerésére is használnak, viszonylag gyorsan és költségkímélő módon juthatunk eredményhez (Muyzer és mtsai, 1997). Mindazonáltal meg kell jegyeznünk, hogy a molekuláris biológiai technikák más-más módon és mértékben, mint a tenyésztéses eljárások, de ugyancsak szelektívek (Rainey és mtsai, 1996; Vallaeys és mtsai, 1997; von Wintzingerode és mtsai, 1997). Ezért a vizsgált baktériumközösségek minél sokoldalúbb megismerése nem nélkülözheti a molekuláris biológiai módszerek és a tenyésztésen alapuló klasszikus eljárások ötvözését.

22

5. Célkitűzések Hazánk nagy tavainak (Balaton, Fertő, Velencei-tó), valamint alföldi szikes vizeinek parti régiójában található nádasok makrofita társulásalkotó növénye a nád (Phragmites australis/Cav./Trin et Steudel). A nád és a nádasok szerepét és működését sokan, sokféle szempontból vizsgálták, azonban a nád szár víz alatti részén kialakuló biofilm baktériumközösségek faji összetételéről és metabolikus aktivitásáról kevés adat áll rendelkezésünkre. Munkánk során hazánk három szikes tava: a Velencei-tó, a kiskunsági Kelemen-szék és

a

tiszántúli

Nagy-Vadas

tó

nádasállományainak

biofilmjében

található

baktériumközösségek metabolikus potenciálját és faji diverzitását kívántuk feltérképezni. Jelen munka egyik célja a vizsgált biofilm minták közösségi szintű anyagcseréjének és szezonális dinamikájának megismerése volt. További célként tűztük ki a biofilm minták baktériumközösségeinek szerkezetében megfigyelhető esetleges területi különbségek, illetve a szezonális dinamika feltárását. Ennek érdekében tavasszal, nyáron és ősszel végzett évszakos mintavételeket követően BIOLOG GN2 és ECO lemezek felhasználásával közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatokat végeztünk. A baktériumközösségek genetikai diverzitását és

annak

változását

dentauráló

gradiens

gélelektroforézis

(DGGE)

segítségével

tanulmányoztuk. Az elvégzett vizsgáltatok másik célja a vizsgált nád biofilmek alkotásában résztvevő, tenyészthető

aerob

baktériumközösségek

mennyiségi

viszonyainak

csíraszámbecslés

segítségével történő meghatározása, és a baktériumközösségekből izolált törzsek morfológiai, fiziológiai és ökológiai tolerancia tesztek alapján történő jellemzése volt. Célul tűztük ki továbbá mindhárom tó esetében a nád biofilm baktériumközösségek filogenetikai diverzitásának feltárását, tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris klónozásos vizsgálatok eredményeinek összehasonlításával.

23

6. Vizsgálati anyagok és módszerek 6.1 Mintavétel A Velencei-tó három pontján, a Fürdető (N 47º14.006’ E 018º39.042’), az AgárdGárdony Hosszútisztás (N 47º12.038’ E 018º35.786’) és a Lángi-tisztás (N 47º11.769’ E 018º33.939’) területén vettünk nádszár mintákat. A Kiskunsági Nemzeti Park területén a Kelemen-szék (N 46°47´ E 19°11´), a Tiszántúlon a Hortobágyi Nemzeti Park kezelésében lévő, Nyíregyháza közelében fekvő Nagy-Vadas-tó (N 47°52’; 21°40’E) nádasállományaiból végeztünk mintavételezést. Az egyes mintavételi területeket a 2. ábra mutatja. A mintavételi időpontokat és az egyes mintákkal elvégzett vizsgálatokat az 1. táblázat foglalja össze. Mintavételi hely

Mintavételi BIOLOG időpont GN2 plate 2000. 04. X

BIOLOG ECO plate

DGGE

2001. 07.

X

(Fürdető,

2003. 05.

X

X

Agárd-

2003. 08.

X

X

Gárdony-

2003. 10.

X

X

X

Hosszútisztás, 2006. 05.

X

X

Lángi-tisztás) 2006. 08.

X

X

2006. 10.

X

X

2004. 04.

X

X

2005. 05.

X

X

2005. 07.

X

X

szék és Nagy- 2005. 11.

X

X

2006. 05.

X

X

2006. 07.

X

X

2006. 10.

X

X

Vadas

klónozás

X

Velencei-tó

Kelemen-

tenyésztés

X

1. táblázat Az egyes területeken végzett mintavételek időpontjai és az elvégzett vizsgálatok (Az adott minta esetében alkalmazott módszert X jelöli.)

24

É F ürd e t ő

Ag á rd - G ár d o n y H o s s z ú - t is z tá s

L á n gi- t is z tá s

1. ábra Mintavételi helyek

25

Mindegyik mintavételi területen a vízfelszín alól kb. 10 cm-es mélységből 5-8 db 1520 cm hosszú nádszálat gyűjtöttünk, mind a fiatal, mind pedig a többéves nádasállományból. A mintákat a 24 órán belül elvégzett feldolgozásig 4-6°C-os hőmérsékleten, steril fiziológiás sóoldatban (0,9 g NaCl 100,0 ml desztillált vízben) tároltuk. A minták bakteriológiai feldolgozása során az egyes mintavételi területekről származó párhuzamos mintákból homogenizált preparátumot készítettünk úgy, hogy a nádszálak külső felületéről steril ecset segítségével fiziológiás sóoldatba mostuk a bevonatot.

6.2

Baktériumközösségek

szénforrás

hasznosításon

alapuló

fenotípusos

ujjlenyomata

A megfelelően szuszpendált és higított mintákból tenyésztés nélkül ún. közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatot végeztünk BIOLOG lemezek (GN2 mindhárom tó, ECO a Velencei-tó három mintavételi területe esetében) felhasználásával (Függelék 1. ábra). A BIOLOG gyors identifikációs teszt (Hayward, California, USA) 95 különböző szénforrás egyidejű bakteriális oxidációjának vizsgálatán alapul. Felhasználásával tiszta tenyészetek identifikálására, illetve közösségi anyagcsere-mintázat megismerésére és összehasonlítására van lehetőség. A lemezek mélyedései a dehidratált szénforrásokon kívül tetrazólium redoxindikátort tartalmaznak. A színtelen indikátor lilásrózsaszín formazánná történő redukciója jelzi, ha a baktériumtörzs, illetve közösségi vizsgálatok esetén a baktériumközösség valamely tagjai hasznosítják az adott vegyületet. A közösségi szénforrás értékesítési vizsgálat során a mintából steril fiziológiás sóoldat felhasználásával a GN2-NENT standardnak megfelelő sűrűségű inokulumot állítottunk elő. A szuszpenziók megfelelő denzitását turbidiméterrel állítottuk be. A kb. 20 ml térfogatú mintát steril műanyag edénybe öntöttük, majd ezekből automata pipetta segítségével 150 µl-nyi mennyiséget inokuláltunk a BIOLOG GN2, illetve ECO lemezeknek mind a 95, illetve 31 szénforrást és indikátort tartalmazó csövecskéjébe, valamint a kontroll csövecskébe (ez utóbbi szénforrást nem, csak indikátort tartalmazott). A lemezeket 28°C-on inkubáltuk. A szubsztrát hasznosítást mutató abszorpció értékeket ELISA Reader (Labsystems Multiscan PLUS) segítségével OD590 értéken olvastuk le 24, 48, 72, 96 és 120 óra elteltével. Kiértékelésnél a pozitív reakciót a csövecskékben lévő indikátor bíbor színűvé válása jelezte. Ennek erősségét a kontrollhoz (A1) viszonyított számérték nagysága határozza meg.

26

Az eredmények értékelésekor a mintákat az értékesített szubsztrátok típusa, valamint a különböző minták közösségi-szintű mikrobiális szénforrás értékesítési mintázatának főkomponens analízise (PCA) (Podani, 1997) alapján hasonlítottuk össze. A mikróba közösségek szubsztrát hasznosítására utaló átlagos színfejlődés mértékét [AWCD = Σ(i = 1, 95) (Ri−C)/95; ahol C a kontroll csőben (A1) mért adszorpció érték; Ri az i-edik csőben (A2−H12) mért adszorpció érték] 24, 48, 72 és 96 órás inkubáció elteltével határoztuk meg. Kiszámítottuk az egyes minták ún. „substrate richness” értékeit, azaz az adott BIOLOG lemez azon zsebeinek számát, melyek OD-je egy adott alap OD értéknél nagyobb volt (Gomez és mtsai, 2004). A főkomponens analízis (PCA) az ordinációs módszerek közé tartozik, melynek segítségével az adatmátrix dimenzióinak a számát új változók bevezetésével csökkentjük. Ennek során olyan koordináta transzformációkat hajtunk végre, amivel arra törekszünk, hogy az új tengelyek (komponensek) adataink összvarianciájának lehető legnagyobb részét megmagyarázzák. Az eredeti változókhoz képest nagyobb varianciát magyarázó új komponensek létezése a változók közötti lineáris korrelációknak köszönhető. Ezért amikor az új komponensek függvényében ábrázoljuk az objektumokat, és azok valamelyik komponens szerinti elkülönülését látjuk, a változók varianciájának szempontjából a csoporton belül kisebbek a különbségek, mint a csoportok között.

6.3 Tenyésztésen alapuló vizsgálatok 6.3.1 Csíraszámbecslés és baktériumtörzsek izolálása A táptalajok kiválasztásánál a következő szempontokat vettük figyelembe: - növény-mikróba interakciók vizsgálatakor alkalmazott táptalajok a King B (Cowan és Steel, 1974) és Trypticase soy yeast (TSY, DSMZ medium 92); - a vizsgált tavak vizének kémiai sajátságai miatt Horikoshi-féle alkalikus (Horikoshi, 1991) táptalaj; az alkalikus táptalaj a vizek kémiai sajátosságait tükrözi: lúgos kémhatás, magas Na+ és CO32- -ion koncentráció; - a természetes környezetekben jellemző oligotróf környezeteket modellező oligotróf jellegű Caulobacter (Poindexter, 1991) táptalaj;

27

- a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas esetében a velencei-tavi mintákhoz alkalmazott és a fentiekben felsorolt táptalajokat használtuk, a TSY táptalaj kivételével, amely helyett negyedik táptalajként a mesterséges tengervizes táptalajt (DSMZ medium 246) alkalmaztuk. A tengervizes táptalaj megemelt koncentrációban tartalmaz ionokat, kiemelten sok Na+-ot és Cl--ot. A homogenizált mintákból higítási sorozatot készítettünk, és annak egyes tagjaiból 0,1-0,1 ml-t az alábbi összetételű táptalajokra szélesztettünk: King B (Cowan és Steel, 1974) Proteóz pepton No 3.

20,0 g

Glicerin

10,0 g

K2HPO4

1,5 g

MgSO4 x 7H2O

1,5 g

Agar

18,0 g

Desztillált víz

1000,0 ml pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

Trypticase soy yeast (TSY) (DSMZ medium 92) Pankreásszal emésztett kazein

14,5 g

Papainnal emésztett szójaliszt

5,0 g

NaCl

5,0 g

Növekedési faktorok

1,5 g

Agar

20,0 g pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc Caulobacter táptalaj (Poindexter, 1991) Pepton

12,0 g

MgSO4

0,2 g

CaCl2 2H2O

0,15 g

Agar

20,0 g pH: 7,0-7,2

sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc

28

Horikoshi-féle alkalikus táptalaj (Horikoshi, 1991): Glükóz 10,0 g Pepszinnel emésztett pepton 5,0 g Élesztőkivonat 5,0 g 1,0 g K2H2PO4 MgSO4×7 H2O 0,2 g 5,0 g Na2CO3 Agar 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml pH: 9,0 sterilizálás: 121°C, 0,7 atm túlnyomás, 40 perc Mesterséges tengervizes táptalaj (DSMZ medium 246): Húskivonat Pepton Agar csapvíz tengervíz tengervíz: NaCl KCl CaCl2 * 2 H2O MgCl2 * 6 H2O NaHCO3 MgSO4 * 7 H2O desztillált víz

10,0 10,0 20,0 250,0 750,0

g g g ml ml

28,13 0,77 1,60 1,0 0,11 3,5 1000,0

g g g g g g ml

pH: 7,5 sterilizálás: 121°C, 1 atm túlnyomás, 15 perc Egy hetes 25°C-os inkubáció után a lemezeken kifejlődő telepek száma alapján csíraszámbecslést végeztünk, melynek során csak azokat a lemezeket vettük figyelembe, ahol 20-nál több, de 200-nál kevesebb telep jelent meg. A különálló kolóniák közül véletlenszerűen a lemezekkel azonos összetételű ferde agarra törzseket izoláltunk. 6.3.2 A baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése Kulturális-morfológiai vizsgálatok A kolóniák izolálása során feljegyeztük az egyes telepek következő tulajdonságait:

29

• • • • •

kolóniák mérete alakja színe konzisztenciája oldódó pigment jelenléte.

Sejtmorfológiai vizsgálatok • • •

sejtek mérete sejtek alakja Gram-szerinti festődés (Cowan és Steel, 1974)

Biokémiai-élettani vizsgálatok (Cowan és Steel, 1974) • • • • • • • • • • • • • • • •

oxidáz-teszt kataláz-teszt mozgásképesség vizsgálata Hugh-Leifson-teszt: a glükóz oxidatív és fermentatív értékesítése (24 órán, illetve 1 héten belül) gáztermelés glükóz hasznosításakor kénhidrogén-termelés ciszteinből indol-termelés triptofánból metilvörös-teszt Voges-Proskauer-reakció eszkulin-hidrolízis disszimilatív nitrát-redukció Tween 80 lipolitikus (észteráz) aktivitás keményítő-hidrolízis kazeáz-aktivitás zselatin bontás Horikoshi-féle alkalikus celluláz teszt (1995).

Ökológiai tolerancia tulajdonságok vizsgálata A Kelemen-székről és a Nagy-Vadasról származó nád biofilmből izolált törzsek esetében a pH- és sótűrési vizsgálatokat is végeztünk. • •

0%, 5%, 7%, 12%-os NaCl koncentrációjú és 8-as pH-jú nutrient levesek: NaCl tolerancia vizsgálata. 7, 8, 9, 10, 11 pH értékű, 5% NaCl koncentrációjú nutrient levesek: pH tolerancia vizsgálata.

30

6.3.3 A baktériumtörzsek genotípusos jellemzése A baktériumtörzseket részletes kulturális- és sejtmorfológiai, biokémiai-élettani vizsgálatoknak vetettük alá. A tisztított baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságait hagyományos tesztsorozatok segítségével vizsgáltuk. Ezt követően elvégeztük a törzsek ARDRA analízisét. A pontos faji meghatározás érdekében a csoportreprezentánsok 16S rDNS-ét parciálisan szekvenáltuk. Genomiális DNS kinyerése és tisztítása baktériumtörzsből A genomiális DNS kinyerését és tisztítását a Mikrobiológiai Tanszéken rendelkezésre álló módszerek és kitek segítségével végeztük. Ez a 2000. áprilisi és 2001. júliusi velenceitavi mintákból izolált törzsek esetében Rainey és mtsai (1996) módszerét jelentette, míg a 2004. áprilisában a Kelemen-szék és Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó törzsek esetében a Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (V-gene) alkalmazását (a gyártó útmutatásának megfelelően 24 órás baktériumtörzsekből kiindulva). A feltárás során fizikai és kémiai lépéseket egyaránt alkalmaztunk. Az izolált DNS-t -20°C-on tároltuk. Az egyes módszerek eredményességüket tekintve nem különböztek egymástól, választásunk az aktuális laboratóriumi gyakorlat szerint történt. • • • • • • • • •

400 µl NaCl-EDTA pufferben (0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA Na-sója, pH 8,0) egy kacsnyi baktériumot szuszpendáltunk fel egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőben. 10 µl lizozimoldatot (10 mg/ml) adtunk hozzá, vortexeltük, majd 30 percig 37 °C-on vízfürdőben inkubáltuk. 5 µl Proteináz-K-t (10 mg/ml) és 10 µl SDS-t (25% w/v) adtunk hozzá, vortexeltük és tovább inkubáltuk 60 °C-on 30 percig. A mintákat extraháltuk 400 µl TRIS/EDTA-val telített fenol hozzáadásával, majd vortexelés után 4 °C-on, 14000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó vizes fázist egy új 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe vittük át és extraháltuk 400 µl kloroform hozzáadásával, majd vortexelés után 4 °C-on, 14000 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó vizes fázisból 300 µl-t egy újabb 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe vittünk át, majd a DNA Extraction Kit (Fermentas) segítségével tovább tisztítottuk az alábbiak szerint: 900 µl Fermentas Binding Solutiont adtunk hozzá és óvatosan összeráztuk. 7 µl Fermentas Silica Powder Suspension mátrixot hozzáadva, enyhe rázás után 5 percig inkubáltuk 55 °C-on, közben kétszer vortexeltünk. 5 mp-es lepörgetés után óvatosan elöntöttük a felülúszót.

31

•

• • •

500 µl hideg Wash Buffert adtunk hozzá a csapadékhoz, majd vortexelés és 5 mp-es lepörgetés után ismét eltávolítottuk a felülúszót. A műveletet még kétszer ismételtük meg, ügyelve arra, hogy a pelletet mindig tökéletesen reszuszpendáljuk. A felülúszó utolsó leöntése után a mintát újból lepörgettük, majd a maradék Wash Buffert pipettás leszívással eltávolítottuk. 40 µl HPLC tisztaságú, steril víz hozzáadása és vortexelés után 5 percig 55 °Con inkubáltuk mintáinkat, majd 2 percig 13000 rpm-en centrifugáltuk. 35 µl felülúszót átvittünk egy újabb Eppendorf-csőbe és 4 °C-on tároltuk.

A templát DNS detektálása agaróz gélelektroforézissel • • • • •

1%-os agaróz gélt (90 ml bidesztillált víz + 1 g agaróz + 10 ml 10×TBE puffer) készítettünk, amely 5,0 µl etídium-bromidot tartalmazott. 5 µl mintát 3 µl töltőpufferrel (30 V/V% glicerin, 0,25 mM brómfenolkék) kevertünk össze, majd a zsebekbe töltöttük. 1 µl DNS molekulasúly markert (λ-fág EcoRI és HindIII restrikciós enzimekkel hasított DNS-e; Fermentas) az egyik szélső zsebbe mértünk, ezáltal megbecsülhettük a templát DNS hosszát. 20 percig 100 V-on futattuk a gélt 1×TBE pufferben (107,8 g/l TRIS, 55 g/l bórsav, 7,4 g/l EDTA, pH 8,3). UV fényben detektáltuk a DNS-t. Az etídium-bromid a DNS nagy árkába köt, így UV fényben láthatóvá teszi a molekulát.

A 16S rDNS szakasz felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) Mintánként és reakciónként 46 µl premix oldatot mértünk össze 0,2 ml-es PCR reakciócsövekbe az alábbiak szerint: • • • • • •

5 µl 10xPCR puffer (Fermentas) (200 mM TRIS/HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl) 10 µl dNTP keverék (Fermentas) (1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP) 4 µl MgCl2 0,5 µl 27 forward primer (5’ GAGTTTGATCCTGGCTCA 3’) (0,5 µg/ml) (Lane, 1991) 0,5 µl 1492 reverz primer (5’ TACGGC/TTACCTTGTTACGACTT 3’) (0,5 µg/ml) (Lane, 1991) 27 µl steril dH2O

Az így összemért premixet vortexeltük, majd rövid ideig centrifugáltuk. Hozzáadtunk 2 µl templát DNS-t, vortexeltük, majd az elegyet centrifugában a csövek aljára pörgettük. A mintákat Whatman Biometra Tpersonal PCR berendezésbe helyeztük, amelyben a kezdeti denaturációs lépés (98 °C, 5 percig) után a 94 °C-os hőmérséklet elérésekor a

32

reakcióközeghez 1 µl Taq polimeráz enzimet (LC low concentration Taq, 1 U/µl, Fermentas,) adtunk. Az alábbi hőprofil mellett futtattuk le a 28 ciklust: 1. 2. 3. 4.

Primer anelláció Extenzió Denaturáció Végső extenzió

52 °C 72 °C 94 °C 72 °C

30 mp 1 perc 30 mp 7 perc

28×(1.; 2.; 3.)

Végül a minták 4 °C-ra hűtése, és ilyen formában esetleges tárolása. A PCR termék detektálását agaróz gélelektroforézissel a tisztított DNS detektálásánál leírtakkal megegyező módon végeztük. A PCR termék tisztítása Viogene PCR-M Clean Up System Kit segítségével • • •

A gyártó útmutatásának megfelelően. Az így kapott mintákat további felhasználásig -20 °C-on tároltuk. A tisztított PCR terméket agaróz gélelektroforézissel detektáltuk a korábban ismertetett módon.

A PCR termék ARDRA mintázatának elemzése A PCR termékek restrikciós emésztését Hin 6I és Alu I enzimekkel végeztük (Fermentas). Egy reakcióra számolva az alábbi premix oldatot készítettük el: Y+/Tango puffer (Fermentas)

• • • • • • •

2,5 µl

dH2O

15,3 µl

Enzim

0,2 µl

7 µl tisztított 16S rDNS PCR terméket adtunk a csövekbe szétmért premix oldathoz és vortexeltük. min. 12 órán át 37 °C-os vízfürdőben inkubáltuk a mintákat. Az emésztett DNS termékeket agaróz gélben detektáltuk az alábbi módon: 100 ml 2%-os agaróz gélt készítettünk, amely 7 µl etídium-bromidot tartalmazott. 13 µl emésztett PCR terméket és 4 µl töltő puffert összekevertünk és a gélzsebekbe töltöttünk. 2 µl DNS molekulasúly markert 2 µl töltőpufferrel keverve a zsebekbe töltöttünk. 80 V-on 70 percig futtattuk a gélt 1×TBE pufferben (107,8 g/l TRIS, 55 g/l bórsav, 7,4 g/l EDTA, pH 8,3).

33

• •

A DNS fragmentumok által létrehozott sávmintázatot UV fényben detektáltuk, és lefényképeztük. A mintázati csoportokat (ARDRA-csoportok) manuális ellenőrzéssel alakítottuk ki.

Fajmeghatározás A tisztított 16S rDNS PCR termékek parciális szekvenálását a jelölt terminátorú ciklikus szekvenálás (Dye Terminator Cycle Sequencing, Perkin Elmer) módszerével és ABI PRISM 310 automata szekvenátorral (Perkin Elmer) végeztük el. A ciklikus szekvenáló reakció PCR csövekbe az alábbi összetételű premixet és 6 µl (–10 µl) tisztított PCR terméket mértünk: Big Dye Terminator Ready Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer)

2

µl

5x hígító puffer (Perkin Elmer)

3

µl

1

µl

6,5

µl

519r primer (5’ G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)G CTG 3’) (0,5 µg/ml) (Stackebarnadt és Liesack, 1993) Steril HPLC minőségű dH2O

A mintákat 96°C-on PCR készülékbe helyeztük, és az alábbi hőprofil mentén szaporítottuk fel a DNS szakaszt: 1. denaturáció 2. primer anelláció 3. extenzió

96 °C 50 °C 60 °C

10 mp 5 mp 4 perc

28×(1.; 2.; 3;)

A termékeket az eljárás folytatásáig 4 °C-on tároltuk. A szekvenáló reakció termékének tisztítása •

0,5 ml-es Eppendorf-csőbe az alábbi összetételű elegyhez 20,0 µl szekvenáló reakció terméket pipettáztunk: 95% etil-alkohol 62,5 µl 3 M Na-acetát-oldat

3

µl

steril HPLC minőségű dH2O

14,5

µl

34

• • • •

A mintákat vortexelés után 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 20°C-on 20 percig 14000 rpm-en centrifugáltuk, és a felülúszót óvatosan leszívtuk. A pellethez 250 µl 70%-os etanolt adtunk, és vortexeltük. Ismételt centrifugálás után (10 perc, 14000 rpm, 20 °C) a felülúszót pipettával eltávolítottuk. A csapadékot vákuumcentrifuga segítségével beszárítottuk (15–20 perc), és szükség esetén ebben a formában -20 °C-on tároltuk.

A szekvenáló reakció termékének futtatása • • • • •

A beszárított terméket 20 µl formamidban vettük fel, vortexeltük, lepörgettük, majd szekvenátor csövekbe vittük át. PCR készülékben 3 percig 95°C-on denaturáltuk a DNS-t, és amíg a szekvenáló berendezésbe (ABI PRISM 310 automata szekvenátor, Perkin Elmer) helyeztük jégen tartottuk. A kapott szekvenciákat az NCBI internetes adatbázisban (BLAST keresőprogrammal, Altschul és mtsai, 1997) megtalálható szekvenciákkal összehasonlítva azonosítottuk. Ezt követıen a 16S rDNS szekvenciákat az ARB (Strunk és mtsai, 1998), és a MEGA3 programcsomag (Kumar és mtsai, 2004) segítségével illesztettük és analizáltuk. Az evolúciós távolságok számításához Kimura modelljét (Kimura, 1980), a filogenetikai fák készítéséhez Saitou és Nei (1987) neighbour-joining módszerét alkalmaztuk.

6.3.4 Tenyésztéstől független közösségi DNS izoláláson alapuló módszerek A biofilm mintákból közösségi DNS-t a Fast DNA® kit for Soil (Bio101® Systems, Q-BIOgene) segítségével izoláltunk a gyártó által megadott útmutató szerint kémiai és fizikai feltáró lépéseket alkalmazva. Az így nyert közösségi DNS-t tartalmazó oldatot a továbbiakban GeneClean® Spin kit (Bio101® Systems, Q-BIOgene) segítségével tisztítottuk meg a kisebb DNS-daraboktól, RNS-től és egyéb, a PCR-t gátló anyagoktól. A módszer azon alapszik, hogy a DNS magas sókoncentráció jelenlétében kationhídon keresztül egy szilikagél-mátrixhoz kötődik, míg alacsony sókoncentrációnál a mátrix hidratálódik, és a DNS szabaddá válik. Klónkönyvtár létrehozása és feldolgozása A 2004. áprilisában a Kelemen-székről és a Nagy-vadasról, illetve a 2006. májusában a velencei-tavi Lángi-tisztásról vett nád biofilm mintákból izolált közösségi

35

DNS-t a tiszta törzseknél ismertetett módon PCR segítségével szaporítottuk fel a 16S rDNS régiót parciálisan, az E. coli 27-es és 519-es pozíciója között. A kapott PCR terméket megtisztítottuk (PCR-MTM Clean Up System kit, Viogene) a tiszta tenyészeteknél leírtaknak megfelelően. Ez a lépés azért volt szükséges, hogy eltávolítsuk a PCR során keletkezett primer dimereket, amelyek a klónozás során az általunk bejuttatni kívánt inzertekhez hasonlóan beépülhetnek a vektorba, rontva ezzel a folyamat hatékonyságát. A közösségi PCR során kapott termék poliklonális, ezért közvetlen fajmeghatározó szekvencia-analízisre

alkalmatlan.

A

szükséges

DNS-t

monomolekuláris

klónok

létrehozásával állítottuk elő Promega pGEM-T Easy Vector System® felhasználásával az alábbi lépésekben: Ligálás A gyártó által megadott ligáló elegyet (2x gyors ligáló puffer, pGEM-T vektor, T4 DNS ligáz) összemértük, és 3 µl PCR terméket adtunk hozzá. A ligáló elegyet overnight inkubáltunk 4 °C-on. Transzformálás A ligáló elegyhez hozzáadtuk a gyártó által előírt koncentrációban a kompetens sejteket, jégen inkubáltuk az elegyet, majd rövid hősokkot követően a megfelelő médiumban (SOC) felvett sejteket 90 percig 37 °C-os rázó termosztátban inkubáltuk. Ezt követően a sejtekből ampicillin, X-Gal és IPTG tartalmú lemezekre (LB) szélesztettünk, melyeket 16 órán át inkubáltunk 37 °C-on. Átpontozás A célszekvencia beépülésének sikerességét ún. kék-fehér szelekcióval ellenőriztük. A vektor plazmidon megtalálható az ampicillin rezisztencia génje, valamint klónozó helye a β-galaktozidáz enzim N-terminális részét tartalmazza. Ennek következtében a plazmid bejutásával a baktériumsejtbe (transzformáció) a β-galaktozidáz gén inaktiválódik. A transzformált sejtek klónjait egy mesterséges galaktozidot, a színtelen X-galt tartalmazó táptalajra szélesztettük, melyen az inzerttel nem rendelkező sejtekben létrejövő aktív β-

36

galaktozidáz (IPTG indukáló hatására) galaktózra és a baktériumtelepet kékre színező indigófestékre bontotta. Számunkra tehát azok a telepek voltak a továbbiakban felhasználhatók, amelyek növekedtek ampicillin tartalmú táptalajon (azaz vektorral transzformáltak voltak) és X-gal jelenlétében fehér színű telepeket képeztek (azaz tartalmazták az inzert-DNS-t). Ezeket a fehér telepeket steril fogpiszkáló segítségével új lemezekre pontoztuk át, hogy megfelelő méretűre növekedhessenek. 37 °C-on, 24 órán keresztül inkubáltuk őket. DNS izolálás Az egyes telepeket 30 µl steril HPLC minőségű dH2O-ba vettük fel, erősen vortexeltük,

5

percig

98 °C-on

cenaturáltuk,

majd

maximális

fordulatszámon

centrifugáltuk. A PCR templátjaként az így kapott felülúszó folyadékot vettük. Polimeráz láncreakció A klónokból M13 forward (5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) és M13 reverz (5’ GGAAACAGCTATGACCATG 3’) primerek (0,5 µg/ml) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) segítségével vágtuk ki a templátot, melyet egy második PCR során, univerzális, eubakteriális 27 forward és 519 reverz primerekkel szaporítottunk fel. A két PCR-re azért volt szükség, mert az univerzális primerek a kompetens E. coli sejt megfelelő szekvenciáját is fölszaporítanák, ezért előzőleg a templát szekvenciát M13 primerekkel ki kell „vágni”. A két PCR az alábbi ciklus szerint működött: 1. 2. 3. 4. 5.

Kezdeti denaturáció Denaturáció Primer anelláció Extenzió Végső extenzió

96 °C 94 °C 52 °C 72 °C 72 °C

4 perc 30 mp 30 mp 1 perc 10 perc

32×(2.; 3.; 4.)

Faji szintű azonosítás A PCR termékeket a tiszta tenyészeteknél leírtak szerint ARDRA-mintázatuk szerint csoportosítottuk, a reprezentáns PCR termékeket tisztítottuk, majd szekvenáltuk és azonosítottuk.

37

Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE) A különböző mintavételi területekre jellemző baktériumközösségek faji diverzitását és szezonális dinamikáját DGGE segítségével is vizsgáltuk (Muyzer és mtsai, 1993, 1997). A DGGE futtatásokhoz szükséges GC-kapoccsal rendelkező PCR termékeket minden esetben nested PCR reakciókban állítottunk elő. Az izolált teljes genomi DNS-ből (6.3.4 pont) Eubacteria-specifikus primer párok segítségével felszaporítottuk a bakteriális 16S rDNS egy nagyobb szakaszát (az E. coli 16S rDNS-ének 27-es és 1492-es pozíciói között). Ezt követően az így kapott DNS fragmenteket PCR reakció segítségével, belsőbb primer párok alkalmazásával tovább dúsítottuk (F968fGC-1492r primer párral a 2003-as velencei-tavi minták, 338fGC-519r primerpárral a többi minta esetében), ahol a forward primer már GCkapoccsal rendelkezett. A futtatáshoz 6 (2003-as velencei-tavi minták), valamint 8%-os (összes többi minta) PAA, 40–70% közötti denaturáló gradiensű (urea és formamid) gélt alkalmaztunk. Ennek során a közösségi DNS-ből PCR-rel felszaporított, közel azonos hosszúságú, de eltérő szekvenciájú 16S rDNS szakaszokat tartalmazó vegyes termékeket viszonylag magas hőmérsékleten (60°C), egy egyenletesen növekvő koncentrációjú denaturáló ágenseket tartalmazó poliakrilamid gélben futtattuk. Az egyes fajokra jellemző PCR termékek bázissorrendjüktől és összetételüktől függően különböző denaturáló ágens koncentrációknál denaturálódtak és mozgásuk a gélben lelassult. A PCR termékek végén található GC-kapocs azért szükséges, hogy a denaturáció során megakadályozza egy-egy DNS molekula két szálának szétválását és ezáltal azt, hogy külön fussanak a gélben. A megjelenő elektroforetikus csíkok száma így tehát a mintákban előforduló fajok számára utal. A módszer további előnye, hogy a szétválasztott, immár fajokra jellemző DNS a gélből visszanyerhető, és a szekvenálást követően mód van a faj taxonómiai besorolására is. GC-farokkal rendelkező PCR termék előállítása nested PCR reakcióval Templát és primerek • •

Templátul a közösségi DNS mintákból származó 16S rDNS PCR termékek szolgálnak, amelyeket a tiszta tenyészetek PCR reakciójában leírtaknak megfelelően nyertünk. DGGE-hez szükséges primerek (0,5 µg/ml): 338fGC primer (5’ CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 3’) (Lane, 1991; Muyzer és mtsai, 1993)

38

F968fGC primer (5’ CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC 3’) (Nübel és mtsai, 1996); 519 reverz primer, illetve 1492 reverz primerek. Nested PCR reakció Mintánként és reakciónként a következő premix oldatot mértünk össze 0,2 ml-es reakció csövekbe: •

5 µl 10xPCR puffer (Fermentas) (200 mM TRIS/HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl) • 10 µl dNTP keverék (Fermentas) (1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dTTP, 1mM dCTP) • 4 µl MgCl2 • 338fGC/ F968GC primer (0,5 µg/ml) • 519r/1492r primer: (0,5 µg/ml) • 26,5 µl steril dH2O • 1,5 µl Taq polimeráz (LC Taq, 1 U/µl, Fermentas) • 2 µl templát Az így összemért premixet vortexeltük, majd rövid ideig centrifugáltuk. Biometra Tpersonal PCR készülékben az alábbi hőprofil mellett futattuk le a PCR ciklust:

anelláció extenzió denaturáció anelláció extenzió denaturáció végső extenzió hűtés

96°C 62°C→52°C 72°C 94°C 52°C 72°C 94°C 72°C 4°C

3 perc 30 mp ⎫ 40 mp ⎬ 10x 30 mp ⎭ 30 mp ⎫ 30 mp ⎬ 20x 30 mp ⎭ 10 mp ∞

A közösségi DNS mintából kiindulva a tiszta tenyészeteknél leírtaknak megfelelően PCR reakció segítségével a megfelelő DNS fragmentumokat felszaporítottuk. Az így kapott PCR termék szolgált templátként a következő PCR reakcióban, ahol a forward primer 5’ végéhez kapcsolt GC-kapocs kerül a PCR termékre (F968fGC-1492r, illetve 338fGC-519r).

39

Elektroforézis, a kapott elektroforetikus mintázat kiértékelése Felhasznált reagensek: • • • • • • • •

40 %-os akrilamid oldat (Akrilamid - Biszakrilamid 37,5 – 1; BIO-RAD) 50x TAE puffer (2 M Tris, 1 M ecetsav, 0,5 M EDTA, pH 8,0; BIO-RAD) Urea (BIO-RAD) Formamid (BIO-RAD) TEMED (BIO-RAD) 10%-os ammónium-perszulfát (APS; BIO-RAD) HPLC tisztaságú víz Gél töltőpuffer (70% glicerin, 0,05% brómfenolkék, 0,05% xilén-cianol; BIO-RAD)

Négy különböző törzsoldatot készítettünk, amelyekből 6 és 10%-os PAA tartományban a megfelelő poliakrilamid koncentációjú gél előállítható. A törzsoldatok összemérésére vonatkozó adatokat a 2. táblázat tartalmazza.

6 %-os PAA

6 %-os PAA

10 %-os PAA

10 %-os PAA

0 %-os denaturáló koncentráció

100 %-os denaturáló koncentráció

0 %-os denaturáló koncentráció

100 %-os denaturáló koncentráció

40 %-os akrilamid oldat

15 ml

15 ml

25 ml

25 ml

50x TAE puffer Urea Formamid

2 ml ––––– –––––

2 ml 42 g 40 ml

2 ml ––––– –––––

2 ml 42 g 40 ml

dH2O

83 ml

Anyagok

100 ml-re kiegészítve

73 ml

100 ml-re kiegészítve

2. táblázat A DGGE gél elkészítéséhez szükséges törzsoldatok adatai A grádiens gél megöntése a BIO-RAD gélöntő rendszerrel, a két különböző denaturáló koncentrációjú oldatból grádiens pumpa segítségével történt. Az oldatok elkészítése a törzsoldatokból az alábbi mennyiségeket összemérve történt: a 3. táblázat a 2003-ban vett velencei-tavi minták BIO-RAD Protean II xi készülékben való futtatásához készült gél

40

összetevőit, a 4. táblázat pedig az összes többi, DGGE-vel vizsgált és Ingeny PhorU készülékben futtatott minták géljének összetételét tartalmazza. A polimerizációt megindító APS-t csak közvetlenül a gélöntés előtt adtuk az oldatokhoz. A denaturáló grádiens gél megöntését követően a gél tetejére denaturáló szert nem tartalmazó töltőgélt rétegeztünk, ezáltal elősegítve a DNS egyenletes bejutását a zsebekből a poliakrilamid gélbe. A zsebekbe az előzőleg 9 µl töltőpufferrel összekevert 45 µl-nyi nested PCR termékeket Hamilton fecskendővel juttattuk. A minták futtatása BIO-RAD Protean II xi, illetve Ingeny PhorU készülékben 60°Con, 1%-os TAE pufferben az alábbi feszültség értékek mellett történt: 15 perc befuttatás 60 Von, 14 óra futtatás 90 V-on. Az elektroforézist követően a gélt 45 percig etídium-bromid oldatban festettük, majd 45 perc desztillált vízben történő festéktelenítés után a kialakuló sávmintázatot UV-fény alatt detektáltuk. Az eredményeket digitális képrögzítéssel dokumentáltuk. A kapott sávmintázatot a TotalLab (TL 120) v2006 szoftverrel értékeltük ki.

denaturáló szer koncentrációja 6%-os PAA 0%-os denaturáló koncentráció 6%-os PAA 100%-os denaturáló koncentráció 10%-os PAA 0%-os denaturáló koncentráció 10%-os PAA 100%os denaturáló koncentráció TEMED APS

6%-os PAA gél

töltő gél (0%)

40%

70%

7,2 ml

3,6 ml

8 ml

4,8 ml

8,4 ml

––––

––––

––––

––––

––––

––––

––––

10 µl

10 µl

8 µl

50 µl

50 µl

35 µl

3. táblázat A 2003-ban vett velencei-tavi minták BIO-RAD Protean II xi készülékben való futtatásához készült gél összetevői

41

denaturáló szer koncentrációja 6%-os PAA 0%-os denaturáló koncentráció 6%-os PAA 100%-os denaturáló koncentráció 10%-os PAA 0%-os denaturáló koncentráció 10%-os PAA 100%os denaturáló koncentráció TEMED 10% APS

8%-os PAA gél

töltő gél (0%)

40%

70%

7,2 ml

3,6 ml

3 ml

4,8 ml

8,4 ml

––––

7,2 ml

3,6 ml

3 ml

4,8 ml

8,4 ml

––––

20 µl

20 µl

6 µl

100 µl

100 µl

27 µl

4. táblázat Az Ingeny PhorU készülékben való futtatásokhoz készült gél összetevői

42

7. Eredmények és értékelésük 7.1 A velencei-tavi nád biofilm vizsgálatok 7.1.1 BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok A BIOLOG lemezek eredeti felhasználási területéből, vagyis a baktériumok gyors identifikációjából adódóan a felkínált szénforrások sem összetételükben, sem arányaikban nem tükrözik a természetes ökoszisztémákban általánosan előforduló és a mikróbák számára szén vagy/és energiaforrásként szolgáló szerves anyagokat. Victorio és mtsai (1996) ugyanakkor kísérletesen igazolták, hogy a természetes ökológiai rendszerekre jellemző szénforrások bontásának tesztelésekor, mivel a mikróbaközösségek nagy számban tartalmaznak a kérdéses szubsztrátokat értékesíteni képes szervezeteket, a közösségek közti különbségek feltárása nehezebb. Következésképpen a mikróbaközösségek anyagcsere diverzitására jellemzőbb „anyagcsere ujjlenyomatot” kaphatunk, ha olyan szénforrások oxidálásának képességét is vizsgáljuk, amire a közösséget alkotó baktériumfajoknak csak viszonylag kis hányada képes. Bár a szénforrások ilyen spektrumának alkalmazásával nem nyerhetünk betekintést az adott mikrobiális közösség tényleges „in situ” funkcionális diverzitásába,

mégis

a

kapott

eredmények

segítségével

nyomon

követhetők

a

mikróbaközösségek aktivitásában bekövetkező térbeli és időbeni változások. A Velencei-tó három mintavételi területéről 2000 áprilisában és 2001 júliusában vett nádminták biofilm közösségeinek szénforrás értékesítési mintázatát BIOLOG GN2 lemezek felhasználásával hasonlítottuk össze. A megfelelően szuszpendált és higított mintákkal közvetlenül végzett vizsgálatok során az abszorbancia értékeket 24, 48, 72, 96 és 120 óra elteltével olvastuk le. A minták többségénél a 96 órás inkubációs idő után már nem volt számottevő változás az összaktivitásban, vagyis az indikátor színfejlődésének mértékében, ezért a 96 órás inkubációnál leolvasott abszorbancia értékeket használtuk fel a mikróbaközösségek anyagcsere ujjlenyomatának összehasonlításához. A főkomponens analízis során az eltérő mintavételi helyekről származó öt-öt minta szolgált objektumként, a különféle szénforrások pedig változókként (2. ábra). A mikróbaközösségek anyagcsere potenciálját az értékesített szubsztrátok típusa (3. ábra a-b) alapján is összehasonlítottuk.

43

LTK-4 LTK-3 LTK-1 LTK-2 LTB-1 LTK-5 GTB-1 GTB-2 GTB-4 GTB-3 LTB -5 LTB-3 GTB-5 LTB-2

1

Axis 2 (19%)

0

GTK-5

GTK-1

-1

FTK-5

FTK-4

FTK-3 FTB-2 FTK-1 FTB-5

FTB-3

FTB-1

FTB-4

FTK-2

LTB-4

GTK-3 -2

GTK-4 -3 GTK-2 -2

0

-1

1

2

3

Axis 1 (38%)

2. ábra A Velencei-tavon 2000 áprilisában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső, LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány; 1-5: párhuzamos minták) A tavaszi minta esetében az ordinációs diagram két tengelyén megjelenített első két főkomponens magyarázta az összvariancia 57%-át (2. ábra). A Fürdetőről származó kétféle (külső és belső nádasállományból származó) minta mikróbaközössége rendelkezett a legnagyobb aktivitással (Axis 1 >1), ugyanakkor ezen közösségek szénforrás hasznosítása mutatta

a

legkisebb

mikróbaközösségek értékesítésében.

Az

eltérést

szintén

nagy

egymáshoz

képest.

hasonlóságot

Agárd-Gárdony

A

Lángi-tisztásról

mutattak

Hosszútisztásról

a

felkínált

gyűjtött

származó

szénforrások

két

mintatípus

mikróbaközössége a második főkomponens mentén mutatott elkülönülést a szénforrás értékesítési

tesztek

eredményei

alapján:

a

belső

nádasállományból

származó

mikróbaközösségek a Lángi-tisztás mintáinak mikróbaközösségeihez hasonló anyagcsere ujjlenyomattal rendelkeztek, míg a külső, nyíltvízzel érintkező nádról származó párhuzamos biofilm minták mikrobiális közösségei kevésbé egységes, és a többi mintától is eltérő szénforrás

hasznosítással

voltak

jellemezhetők.

A

Fürdetőről

származó

minták

mikróbaközösségei magas főkomponens értékekkel rendelkeztek, az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról származó párhuzamos minták ordinációs diagramon való elhelyezkedése

44

(negatív főkomponens értékek) a többi minta mikrobiális közösségeihez viszonyított alacsonyabb metabolikus potenciáljára utalt. A BIOLOG GN2 lemez szénforrásainak Garland és Mills (1991) szerinti csoportosítása alapján a szubsztrátok döntő többségét szénhidrátok (31), szerves savak (24) és aminosavak (20), míg kisebb mennyiségét polimerek (5), aminok/amidok (6) és egyéb szénvegyületek (észterek, alkoholok, aromások) (9) teszik ki (Függelék). A 96 órás inkubáció elteltével a vizsgált mikróbaközösségek a felkínált szénforrás csoportok 33-100%-át hasznosították (3. ábra a-b). Az egyes területekről származó kétféle mintatípus mikrobiális anyagcsere-ujjlenyomata mindhárom terület esetében hasonló volt egymáshoz. Minden esetben a polimerek és a szénhidrátok hasznosítására került sor a legnagyobb arányban, ezen kívül az aminosavak preferált értékesítése is jellemző volt. A szerves savak, valamint az aminok és amidok hasznosításában mutatkoztak a legnagyobb különbségek. Legkisebb arányú az aminok, illetve az amidok hasznosítása volt. Ebből a szempontból egyedül a Fürdető nyíltvizes kapcsolattal rendelkező, külső nádasállományának biofilm mintája volt kivétel, ebben az esetben a mikróbaközösség a fenti szubsztrátcsoportba tartozó vegyületek több, mint 80%-át hasznosította 96 órán belül.

a)

b)

100 88 90

83

89

100 97 87

90

85

80

78

71

67

63

hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

100

100 100

60 33

40

33

20

100

100 100 100 100 100 100

100 97

FTK

GTK

polimerek

79

80

89

85

78

75

60 33

40

33

20

szénhidrátok

szerves savak

FTB

LTK aminosavak

aminok/amidok

polimerek

egyéb

GTB szénhidrátok

szerves savak

c) 100 80

75

80

70

40

80 70

67

63

53

60

60 50

33

25

42

50 30

25

20 0

0 FNE

polimerek

szénhidrátok

LTB aminosavak

aminok/amidok

egyéb

d) hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

100 97

0

0

0

100

GNE szerves savak

LNE aminosavak

aminok/amidok

100

100

90

80

75

67

73 50

50

50

29

20

0 FNA

egyéb

60 50

40

38

40

75

67

60

60

20

80

polimerek

szénhidrátok

GNA szerves savak

LNA aminosavak

aminok/amidok

egyéb

3. ábra A Velencei-tavon 2000 áprilisában (a-b) és 2001 júliusában (c-d) vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján (FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső, LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány)

45

A három mintavételi területet összehasonlítva kitűnik, hogy a Fürdető két mintájának mikróbaközösségei hasznosították a legnagyobb arányban az egyes szénforrás csoportokhoz tartozó

vegyületeket.

Az

Agárd-Gárdony

Hosszútisztás

külső

mintájának

biofilm

mikróbaközössége a polimerek és az aminok/amidok kivételével az egyes szubsztrátcsoportok szénforrásait a többi minta aktivitásával összehasonlítva kisebb mértékben hasznosította. Ez az eltérés áll a fentiekben tárgyalt főkomponens analízis eredményeinek (a terület kétféle mintájának elkülönülése az ordinációs diagramon, valamint a GTK minta többihez viszonyított alacsony főkomponens értékei) hátterében. A nyári minták abszorbancia értékeivel végzett főkomponens analízis ordinációs diagramján a két főkomponens együttesen az összvariancia 48%-át magyarázta (4. ábra). Ebben az időpontban a három mintavételi terület közül az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról vett kétféle minta mikrobiális közösségei mutatták a legnagyobb hasonlóságot. A keleti nyíltvizes régióból (Fürdető) vett kétféle minta mikróbaközösségének szénforrás hasznosítása egymástól eltérő mintázatot mutatott: a többéves nádszár biofilm mikrobiális közösségei nagyobb

hasonlóságot

mutattak

az

Agárd-Gárdony

Hosszútisztáson

vett

minták

közösségeinek anyagcsere-mintázatához, mint az egyéves nádszáréhoz. A kétféle mintatípus közösségi szénforrás értékesítési mintázatának eltérése a nyugati, természetvédelmi területen elhelyezkedő Lángi-tisztás esetében volt a legkifejezettebb. Ez utóbbi közösségeknek az ordinációs diagramon való elhelyezkedése (Axis 1 >1) arra utalt, hogy a természetvédelmi területen található, a két másik mintavételi helyhez képest csekély nyíltvizes kapcsolattal rendelkező Lángi-tisztás biofilm mikróbaközösségei rendelkeztek a vizsgált időpontban a legnagyobb metabolikus potenciállal. A tavasszal vett minták szénforrás értékesítésével összehasonlítva a nyári biofilm minták mikróbaközösségei az egyes szubsztrátcsoportokba sorolt szénforrásokat kisebb mértékben hasznosították, egyedül a Lángi-tisztás többéves nádszárairól származó biofilm mikrobiális közösségek mutattak 100%-os felhasználást polimerek esetében, ezen kívül a különféle szénhidrátok nagyarányú értékesítése volt megfigyelhető ennél a mintánál a többi terület biofilm mikróbaközösségeinek metabolikus potenciáljához viszonyítva (3. ábra c-d).

46

LNE-4

3 2 FNE-1

Axis 2 (13%)

1 0

GNE-5 FNA-1 GNA-3 GNE-3 GNA-5 FNA-3 GNE-4 GNA-4 GNE-1 FNA-5 GNA-2

-1

LNE-3

FNA-2

-2

GNA-1 GNE-2

LNA-3 LNE-5 LNE-1

FNE-3 FNE-2

LNA-5

LNE-2 LNA-2

FNE-4

LNA-1 LNA-4

FNA-4

-3 FNE-5 -4 -2

-1

0

1 2 Axis 1 (35%)

3

4

5

4. ábra A Velencei-tavon 2001 júliusában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (FNE, FNA: Fürdető egyéves és több éves nádszár, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádszár, LTB, LTK: Lángi-tisztás egyéves és több éves nádszár biofilm minta; 1-5: párhuzamos minták) A tavaszi mintához hasonlóan a nyáron vett kétféle mintatípus (egyéves és több éves nádszárról származó biofilm) anyagcsere-ujjlenyomata a Fürdető és az Agárd-Gárdony Hosszútisztás esetében hasonló volt egymáshoz. Az ezekről a területekről származó többéves nád biofilm minták mikróbaközösségei mindössze 20-40%-os polimer-hasznosítást mutattak, míg az egyéves nádról származó minták mikróbaközösségei egyetlen felkínált polimert sem értékesítettek. A Lángi-tisztáson vett kétféle minta mikróbaközössége a polimer- és szénhidrát-hasznosítás szempontjából tért el számottevően egymástól (3. ábra c-d), és ez a különbség a két minta (LNE, LNA) ordinációs diagramon való elhelyezkedésében is jelentkezett (4. ábra). A szezonális változások nyomon követésére tavaszi, nyári és őszi mintavételezéseket követően 2003-ban GN2 lemezek, 2006-ban pedig ECO lemezek felhasználásával végeztünk BIOLOG anyagcsere ujjlenyomat vizsgálatokat. Mivel a korábbi (2000-es és 2001-es) időpontokban a közösségi szénforrás hasznosítás eredményei elsősorban a mintavételi területek és nem a különféle mintatípusok eltéréseit mutatták, ezekhez a szezonális vizsgálatokhoz mindhárom mintavételi helyen a nyíltvízzel érintkező külső nádasállományból 47

gyűjtöttünk fiatal és többéves nádszárakat vegyesen, és a párhuzamos lemezek számát mintánként háromra csökkentettük. A szezonális különbségek áttekinthetőbb megjelenítése érdekében az egyes lemezeken mért abszorbancia értékek átlagát használtuk fel a főkomponens

analízis

során

(5. ábra).

A

korábbiakhoz

hasonlóan

a

minták

mikróbaközösségeinek szénforrás hasznosítását az értékesített szubsztrátok típusa (6. ábra ac) alapján is összehasonlítottuk.

LB0308 2

GB0308 LB0310

Axis 2 (17%)

1

FB0310

0

FB0305

FB0308

-1 LB0305

GB0310

GB0305

-2 -3

-2

-1

0 Axis 1 (29%)

1

2

3

5. ábra A Velencei-tavon 2003-ban három időpontban vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás; 0305-május, 0308-augusztus, 0310-október) Az ordinációs diagramon (5. ábra), amelyen az első két főkomponens az összvariancia 46%-át

képviselte,

jól

megfigyelhető

a

tavaszi,

nyári

és

őszi

biofilm

minták

mikróbaközösségeinek egymástól való elkülönülése. Az első főkomponens mentén az őszi minták határozottan elkülönültek a tavaszi és nyári mintáktól, míg a második főkomponens mentén ez utóbbi minták is szétváltak egymástól (a Fürdető nyári mintájától eltekintve). Tavasszal a tó különböző részéről származó mintákat nagyfokú hasonlóság jellemezte, míg a nád biofilm közösségek szénforrás értékesítése szempontjából (a második főkomponens mentén) nyáron a Fürdető, ősszel az Agárd-Gárdony Hosszútisztás elkülönülése volt jellemző.

48

d)

100 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

80 60 40 20 0 FB0305

GB0305

LB0305

hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

a) 100

polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok fenolos vegyületek

80 60 40 20 0 FB0605

GB0605

e)

100 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

80 60 40 20 0 GB0308

hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

b)

FB0308

100 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok fenolos vegyületek

80 60 40 20 0

LB0308

FB0608

GB0608

100 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

80 60 40 20 0 GB0310

LB0608

f) hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

c)

FB0310

LB0605

100 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok fenolos vegyületek

80 60 40 20 0 FB0610

LB0310

GB0610

LB0610

6. ábra A Velencei-tavon 2003-ban (a-c) és 2006-ban (d-f) vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása BIOLOG GN2 és BIOLOG ECO lemezek szénforrás típusainak értékesítése alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás nád biofilm minta; 0305-május, 0308-augusztus, 0310-október; 0605-május, 0608-augusztus, 0610-október) A felkínált szénforrások közül valamennyi minta mikróbaközösségére a polimerek és a szénhidrátok preferált hasznosítása volt jellemző. A szerves savak és aminosavak hasznosulása kisebb mértékben, de szintén minden vizsgált mikróbaközösség esetében megfigyelhető volt. A fenti szubsztrátokhoz képest az aminok, illetve amidok és egyéb szénforrások értékesítésére került sor a legkisebb arányban. A szezonális különbségek kapcsán említésre érdemes, hogy míg tavasszal a polimereken és a szénhidrátokon túl az aminosavak hasznosítása a vizsgált mikróbaközösségek közös sajátsága volt, addig az őszi minták mikrobiális aktivitására – szintén a polimereken és a szénhidrátokon kívül – inkább a szerves savak értékesítése volt jellemző. Az egyes területek szezonális mintái anyagcsereujjlenyomatának összehasonlításakor kitűnik, hogy mindhárom esetben a tavaszi és őszi minták mutattak hasonlóságot egymáshoz, alapvetően a polimerek és szénhidrátok hasznosításában. A nyári biofilm minták közösségeire a Fürdető kivételével inkább a könnyen hasznosítható szénhidrátok értékesítése volt jellemző, a polimerek bontása kisebb arányban 49

ment végbe. A Lángi-tisztás és az Agárd-Gárdony Hosszútisztás tavaszi és őszi mintáinak mikróbaközösségei hasonló anyagcsere-ujjlenyomattal rendelkeztek, és a nyári mintáik mikrobiális közösségeinek szubsztrát értékesítési profilja is csak a szerves savak, illetve az aminosavak felhasználásának mértékében tért el számottevően egymástól. A Fürdető mindhárom szezonális mintájának mikrobiális szénforrás hasznosítása alapvetően a polimerek, az aminok/amidok és egyéb szénforrások hasznosításában mutatott eltérést a másik két mintavételi helyhez képest. A velencei-tavi nád biofilm mikrobiális közösségek szénforrás értékesítési jellegzetességeit 2006-ban BIOLOG ECO plate segítségével vizsgáltuk. Ebben az évben is három mintavételre került sor, a korábban már vizsgált három mintavételi területről. Az eredetileg bakteriális izolátumok azonosítására kifejlesztett GN2 lemezek mellett – a környezeti mintákkal dolgozó kutatók igényeit kielégítendő – az ECO jelzésű lemezek háromszoros ismétlésben összesen 31 különféle szénforrást tartalmaznak (közülük 25 megtalálható a GN2 lemezek szubsztrátjai között is) (Choi és Dobbs, 1999).

2

FB0608

Axis 2 (15%)

1

LB0608

GB0608

LB0605

0

FB0605 GB0605

FB0610 GB0610 -1

LB0610 -2

-1

0 Axis 1 (63%)

1

2

7. ábra A Velencei-tavon 2006-ban három időpontban vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG ECO szénforrás értékesítési adatai alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás; 0605-május, 0608-augusztus, 0610-október)

50

A 96 órás inkubációt követő mérések adataival készült ordinációs diagram (7. ábra) első két főkomponense a GN2 plate eredményeinek ordinációjához képest nagyobb, az összvariancia 78%-át magyarázta. Ugyanakkor ebben az esetben a minták szezonális csoportosulása kevésbé volt kifejezett. A minták mindkét főkomponens szerinti szétválása a nyári minták esetén volt a legszembetűnőbb. A minták közül mindhárom időpontban a Lángitisztás különbözött leginkább a másik két mintavételi területtől. Az ősszel vett mintákat - a GN2 lemezek eredményeihez hasonlóan – alacsony (Axis 1 < 0), a tavasziakat magas (Axis 1 > 0) főkomponens értékek jellemezték. A szubsztrátok hasznosításának összehasonlításakor (6. ábra d-f) kitűnik, hogy - a GN2 lemezekkel nyert eredményekhez hasonlóan - mindhárom mintavételkor a polimerek és a szénhidrátok preferált hasznosítása volt jellemző. Fenolos vegyületeket sem a Lángi-tisztás, sem az Agárd-Gárdony Hosszútisztás biofilm mikróbaközösségei nem értékesítettek, ezzel szemben a Fürdető esetében mindhárom minta mikróbaközössége 50%-os hasznosítást mutatott. Az egyes területek tavaszi és őszi mintáinak mikrobiális anyagcsere-potenciáljának hasonlósága a GN2 lemezeknél megfigyelhetőhöz hasonlóan kimutatható volt, egyedüli kivételt ez alól az aminok/amidok értékesítése képezett az Agárd-Gárdony Hosszútisztás és a Lángi-tisztás esetében. A GN2 és az ECO lemezekkel végzett vizsgálataink is a közösségi szintű szénforrás hasznosítási mintázatok mintavételi területek szezonális dinamikájára engedtek következtetni. Az ECO lemezek adatai alapján nagyobb főkomponens értékeket kaptunk, mint a GN2 lemezek esetében. Vízminták mikrobiális anyagcsere potenciáljának GN2 és ECO lemezekkel történő összehasonlító vizsgálatakor hasonló jelenséget tapasztaltak Choi és Dobbs (1999).

51

7.1.2 DGGE vizsgálatok Az

egyes

mintavételi

területekre

jellemző

baktériumközösségek

genetikai

diverzitásának szezonális változását és az egyes fajok relatív abundanciáját 2003-ban és 2006ban DGGE-vel vizsgáltuk. A gélfotókon megfigyelhető sávmintázatok alapján TotalLab (TL 120)

v 2006

szoftver

felhasználásával

végeztük

el

a

minták

csoportosítását

és

összehasonlítását (8-9. ábra). Mindkét gélfotón látható, hogy az eltérő helyekről és különböző időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeit reprezentáló csíkok fő sávjaikban megegyeznek, ami a baktériumközösségek hasonló domináns fajösszetételét jelzi. A sávok intenzitásában megfigyelhető jelentős eltérések ugyanakkor az egyes fajok abundanciájának változására utalnak. A legnagyobb hasonlóságot 2003-ban és 2006-ban is az ugyanarról a mintavételi területről eltérő időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeinek sávmintázatai mutatják. A nád biofilm minták fajösszetétele a DGGE mintázatok alapján tehát időben kisebb, de térben nagyobb mértékben tért el egymástól. Ez alól 2003-ban a Lángi-tisztás őszi, 2006-ban az Agárd-Gárdony Hosszútisztás nyári biofilm közössége képezett kivételt. Ezek a mikróbaközösségek a párhuzamosan végzett BIOLOG szénforrás értékesítési vizsgálat során a legkisebb anyagcsere aktivitást mutatták.

8. ábra A Velencei-tavon 2003-ban szezonálisan vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás 0305-május, 0308-augusztus, 0310-október)

52

9. ábra A Velencei-tavon 2006-ban szezonálisan vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás 0605-május, 0608-augusztus, 0610-október) A 2003-as DGGE gélfotó alapján készített dendrogramon (8. ábra) jól látható, hogy a Lángi-tisztásról tavasszal és nyáron vett minták baktériumközösségei mutatták a legnagyobb eltérést az ősziekhez képest, ami megegyezik a párhuzamosan végzett BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok eredményeivel. Nem szabad figyelmen kívül hagynunk azt, hogy a két évben mind az anyagcsere (GN2, illetve ECO lemezek), mind a DGGE (kétféle elektroforézis készülék) ujjlenyomatmódszer esetében eltértek az alkalmazott eszközök. Utóbbi elsősorban a felbontás mértékében eredményezett eltéréseket. Meg kell továbbá azt is említenünk, hogy a BIOLOG szénforrás értékesítési tesztekben a biofilm teljes mikróbaközösségének aktivitását detektáltuk, míg a DGGE a bakteriális közösség szerkezetének különbségei alapján tesz különbséget.

53

7.1.3 Tenyésztéses vizsgálatok A velencei-tavi nád biofilm tenyészthető baktériumközösségeinek megismerése céljából tavasszal és nyáron végeztünk mintavételezést. A három mintavételi területről (Fürdető, Agárd-Gárdony Hosszú-tisztás, Lángi-tisztás) származó minták csíraszám becslésének eredményeit az 5. táblázat mutatja táptalaj típusonként.

táptalaj mintavételi terület

King B

Trypticase soy yeast

Caulobacter

Horikoshiféle alkalikus

FTK

4,20*106

6,37*106

1,32*107

2,37*106

FTB

1,48*107

1,06*107

2,87*107

4,52*106

GTK

4,34*105

4,07*105

1,40*106

2,00*105

GTB

4,34*105

6,13*105

1,58*106

2,71*105

LTK

3,06*105

8,48*105

1,36*106

2,78*105

LTB

7,46*105

8,47*105

2,93*106

2,40*105

FNE

1,03*105

9,95*104

1,54*105

5,25*103

FNA

1,76*105

3,90*104

2,40*104

3,13*103

GNE

2,25*105

1,78*105

9,23*104

1,26*103

GNA

5,18*105

4,60*104

5,83*104

4,20*104

LNE

1,53*105

1,40*105

1,31*105

9,20*104

LNA

2,40*104

3,25*103

1,20*105

6,30*104

5. táblázat A velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből 2000 áprilisában és 2001 júliusában tenyésztéssel becsült baktérium csíraszám értékek (CFU/g) (FTB, FTK: Fürdető belső és külső, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás belső és külső, LTB, LTK: Lángi-tisztás belső és külső nádasállomány; FNE, FNA: Fürdető egyéves és több éves nádszár, GTB, GTK: Agárd-Gárdony Hosszútisztás egyéves és több éves nádszár, LTB, LTK: Lángi-tisztás egyéves és több éves nádszár biofilm minta) A

tavasszal

és

nyáron

vett

nád

biofilm

minták

csíraszám

értékeinek

összehasonlításakor megfigyelhető, hogy a tavasszal vett minták értékei a nyári mintákhoz képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. Tavasszal a legmagasabb csíraszám értéket a Caulobacter táptalajon a Fürdető belső nádasállományának biofilm mintájából, a legalacsonyabb csíraszámot az Agárd-Gárdony Hosszútisztás külső nádasállományának 54

biofilmjéből becsültük. A nyári minták esetében mind a legnagyobb, mind a legkisebb csíraszámot az Agárd-Gárdony Hosszútisztás mintáiban észleltük. A Fürdetőről származó tavaszi minták csíraszám értékei több esetben is egy nagyságrenddel magasabbak voltak az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és a Lángi-tisztásról származó mintákénál. A nyári minták különböző területeinek csíraszám értékei között nem volt nagyságrendi különbség. Az egyes területekről származó mintatípusok összehasonlításakor tavasszal egyedül a Fürdetőről vett kétféle minta csíraszám értékei mutattak nagyságrendi eltérést a szerves anyagban gazdag táptalajokon (King B, TSY). A nyári minták kétféle mintáját összehasonlítva kitűnik, hogy mindhárom területen volt olyan táptalaj, amelyen a vizsgált két mintatípus becsült csíraszámai egy nagyságrendnyi különbséget mutattak. A négyféle táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva a laboratóriumi tenyésztéshez általánosan alkalmazott King B és a biofilmre jellemző oligotróf közeget modellezni hivatott Caulobacter táptalajokon magasabb, míg a Horikoshi-féle alkalikus táptalajon a többi táptalajhoz képest alacsony csíraszám értékeket detektáltunk. A tavaszi minta esetében a TSY táptalaj bizonyult a leghatékonyabbnak a nád biofilm tenyészthető baktériumközösségeinek

feltérképezésére:

a

legnagyobb

diverzitást

(17 bakteriális

nemzetség/faj) ezen a médiumon detektáltuk. A Horikoshi-féle alkalikus táptalajon izolált baktériumtörzsek többségét nem sikerült hosszú távon laboratóriumi körülmények között fenntartani. Ez a tápközeg bizonyult a legszelektívebbnek: az erről a táptalajról izolált baktériumtörzseket összesen 6 baktériumfaj képviselőjeként azonosítottunk. A nyári biofilm mintákból izolált törzsállományok esetében nem volt számottevő különbség az azonosított fajok számában az egyes táptalajok tekintetében, a kizárólag egyféle táptalajról izolált törzs(ek) csak néhány fajt képviselt(ek). A 2000. áprilisában végzett mintavételt követően több mint 250 izolátumot hoztunk létre. Tiszta tenyészetben összesen 173 baktériumtörzset sikerült fenntartanunk, közülük 53 származott a Fürdető, 64 az Agárd-Gárdony Hosszútisztás, valamint 56 a Lángi-tisztás nád biofilm mintájából. (Számos Horikoshi-féle alkalikus táptalajról izolált törzs hosszú távon nem bizonyult fenntarthatónak laboratóriumi körülmények között.) A 2001. júliusi mintavételt követően összesen 251 törzset sikerült izolálni és tiszta tenyészetbe vinni. Az izolátumok területenkénti megoszlása a következő volt: 78 törzs származott a Fürdetőről, 67 az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és 106 a Lángi-tisztásról vett nádszár biofilm mintából.

55

Axis 2

80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70

4

16

20 8

5

15

17

18

12

10

21

2

FBT

FBN

LBT GBT

6

13

19 7

LBN

14 1

22

3

11 9

GBN -80

40

-60

-20

0 Axis 1

20

40

60

80

4.

5.

6.

7.

8.

kataláz aktivitás

D-glükóz oxidatív hasznosítása (24h)

D-glükóz fermentatív hasznosítása (24h)

gázteremlés O/F médiumban

D-glükóz oxidatív hasznosítása(1 hét)

D-glükóz fermentatív hasznosítása (1 hét)

H2S ciszteinből

indol triptofánból

NO3-NO2

NO3-N2

NO3-NH3

metilvörös reakció

Voges-Proskauer reakció

eszkulin hidrolízis

kazein hidrolízis

zselatin hidrolízis

keményítő hidrolízis

tween 80 hasznosítás

celluláz aktivitás

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

4 38 34 50 51 54

62 31 46 37 33 33

53 80 70 76 81 58

34 41 38 33 6 48

34 28 38 34 36 77 9 39 25 61 50 2 34 5 34 29 48 43 5 46 2 27 5 65 58 5 24 0 6 6 51 28 28 25 22 25 3 73 56 12 26 8

30 23 30 10 0 0

58 47 50 10 22 27

0 8 0 0 0 1

57 28 20 37 0 1

8 27 25 49 7 41

32 31 30 23 4 18

53 56 54 77 51 70

43 55 52 67 40 73

55 63 64 71 39 71

32 42 41 24 25 11

55 47 50 29 37 35

0 0 0 0 0 0

mozgás

3.

ammonifikáció

2.

oxidáz aktivitás

FBT GBT LBT FBN GBN LBN

1.

Gram reakció

10. ábra. A velencei-tavi mintavételi területekről származó nád biofilm mintákból izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredményeik alapján (FB: Fürdető, GB: Agárd-Gárdony Hosszútisztás, LB: Lángi-tisztás; T: 2000 tavaszi minta, N: 2001 nyári minta)

6. táblázat A velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből izolált baktériumtörzsek hagyományos tesztekben mutatott összesített százalékos pozitív eredményei

56

A tavasszal és nyáron vett biofilm minták tenyészthető baktériumközösségeit a fenotípusos tesztekben mutatott eredményeik (6. táblázat) alapján főkomponens analízis (PCA) segítségével (10. ábra) hasonlítottuk össze. Mivel celluláz aktivitást egyik minta törzsei sem mutattak, ez a tulajdonság nem került be a főkomponens analízis alapjául szolgáló tulajdonságok közé. Az ordinációs diagramon a tavaszi és a nyári mintákból izolált törzscsoportok az első főkomponens mentén különültek el egymástól. Ez leghatározottabban a Fürdető területéről származó

törzscsoportok

esetében

volt

megfigyelhető.

A

Lángi-tisztásról

izolált

baktériumtörzsek tavasszal az Agárd-Gárdony, nyáron a Fürdető törzseinek fenotípusos tulajdonságaival mutattak nagyfokú hasonlóságot. A tavaszi mintákból izolált baktériumtörzsek döntően Gram-negatív, aktív mozgásra képes szervezetek voltak, ez a két tulajdonság a Fürdetőről vett minta izolátumai esetében volt a legnagyobb százalékban jellemző. A tavaszi biofilm mintákból származó törzsek jellegzetes tulajdonságaként említhetjük meg a fermentációs aktivitást olyan tesztekben, mint például a glükóz 24 órán belül történő hasznosítása, melyben a glükóz heves fermentációja gyakran gázképzéssel is együtt járt, illetve a Voges-Proskauer teszt butilén-glikolos fermentációja. Mindezek mellett a tavaszi minták esetében nagyobb számban voltak jelen a nitrátot nitritig, illetve ammóniáig redukálni képes szervezetek. A szubsztrátok közül a keményítő és a tween 80 hasznosítása volt jellemző. A nyári mintákból kitenyésztett baktériumközösségeket Gram-pozitív dominancia jellemezte. A glükóz hasznosítására inkább az egy hét alatt megfigyelhető, lassú fermentációs aktivitás volt jellemző, valamint a vegyes savas fermentáció (metilvörös teszt). Ebből a szempontból a Gárdonyról származó törzsek képzetek kivételt, amelyek a peptonból ammóniát képeztek és a ciszteinből kénhidrogént termeltek. A vizsgált szubsztrátok közül a nyári minták törzsei nagy arányban voltak képesek az eszkulin és a kazein hidrolízisére, ezekben a tesztekben a tavasszal izolált törzsek kisebb arányú aktivitást mutattak. A DNS izolálást és a 16S rDNS régió PCR-el való felszaporítását követően a törzseket ARDRA mintázatuk alapján csoportosítottuk Az eltérő hasítási mintázatok alapján a tavasszal izolált törzsek esetében összesen 38, a nyári törzsek esetében 23 különböző ARDRA csoportot hoztunk létre. Ezt követően került sor a csoportonként kiválasztott törzsek 16S rDNS szekvencia analízisen alapuló identifikációjára (Függelék 1-2. táblázat). A velencei-tavi nádasok biofilmjéből izolált törzsek taxonómiai hovatartozását a 16S rDNS parciális szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai fákon mutatjuk be (11-12. ábra). 57

A tavaszi és a nyári minták tenyésztéssel nyert faji összetételét vizsgálva megállapítható, hogy mindkét törzsállományban jelen voltak az α- és γ-proteobaktériumok, valamint a kis és nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok képviselői. A tavaszi mintában ezen felül előfordultak még a β-proteobaktériumok csoportjába tartozó törzsek is. A 2000 áprilisában vett nád biofilm minták közül a tó nyugati részén található Lángitisztásról és a tó középső részén található Agárd-Gárdony Hosszútisztásról közel azonos számú (18 és 16) taxont sikerült azonosítani. Az oligotróf édesvizekben gyakori βproteobaktériumok jelenlétét kizárólag erről a két területről sikerült kimutatni. A Fürdető tavaszi törzsei összesen 10 fajt képviseltek, amelyek többsége az édesvizekben közönséges előfordulású α- és γ-proteobaktériumok közül került ki. A 2001 júliusában történt mintavételek eredményeként az identifikált fajok száma alapján a két nyíltvizes terület hasonlított egymáshoz. A Fürdető és az Agárd-Gárdony Hosszútisztás esetében 14 és 15 különböző fajt detektáltunk. Nyáron a legtöbb, 21 taxont a Lángi-tisztásról származó törzsek között azonosítottuk.

58

α- pr oteobaktériu mok β -proteobakt ériumok γ-proteoba ktériumok

Firmi cutes (kis G+C tartalmú Gra m-pozitív baktériumo k) A ktinobaktér iumok (n agy G +C ta rtalmú Gram- pozitív bak tériumok)

LTB-26 (AM263534) LTK-8 (AM263532) LTB-60 (AM263533) Agrobacteri um vitis (D12795) Agrobacterium tumefaciens (M11223) GTB-37 (A M263538) Delftia acidovorans (AF149849) LTK-7 (AM 263539) Acidovor ax delafieldi i (AF078764) FTK -20 (AM263536) Hydrogenophaga palle ronii (AF019073) LTK-12 (AM263537) Rhodofer ax ferm entans (D16211) FTB-40 (AM 263519) LTK-92 (AM 263520) LTK-102 (A M263521) FTB-35 (AM263523) FTB-34 (AM263522) FTK-60 (AM263524) Ps eudom onas anguilliseptica (X 99540) FTK-55 (AM263525) Pseudom onas marginalis (Z76663) GTB-14 (A M263526) Pseudomonas fragi (D84014) GTB-87 (AM 263527) Ps eudom onas putida (Z76667) Pseudomonas graminis (Y11150) Pseudomonas fluor escens (Z76662) LTK-87 (AM 263528) LTB-21 (AM263529) Aeromonas sobria (X60412) Aeromonas salmonicida (X71836) FTB-38 (AM263530) Shewanella put refacie ns (AF170300) LTK-90 (AM263531) Aeromonas veronii (X74684) GTB-41 (AM263535) Ps ychrobacter phenylpyruvicus (U46144) GTB-67 (AM 263544) Marinibacillus mar inus (AJ237708) Marinibacillus campisalis (AY 190535) GTB-86 (AM 263545) GTB-34 (AJ875425) GTK -61 (AM263543) Bacillus pumilus (X60637) LTK-22 (AM263540) LTK-100 (AM263541) LTK-43 (AM263542) Bacillus cereus (D16266) GTB-46 (AM 263546) GTB-47 (AM 263547) Paenibacillus apiarius (U49247) GTB-19 (AM263548) Brevibacillus agri (D78454) GTK-22 (AM 263549) Exiguobacterium aurantiacum (X70316) GTK-28 (AM263550) Kocuria r oseus (X87756) Kocur ia ery thromyxa (Y11330) GTB-43 (AM263551) Kocuria palustris (Y16263) LTB-37 (A M263553) LTB-45 (AM263552) Ar throbacter c rystallopoi etes (X 80738) Micrococcus lute us (M38242) LTK-14 (AM 263555) Microbacterium im periale (X77442) Microbacterium arborescens (AB007421) GTK-6 (AM263554) Aureobacterium kitamiense (A B013919) Desulfovibrio fructosivorans (AF050101)

0.10

11. ábra. A Velencei-tó nád biofilm mintáiból 2000 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 10% nukleotid különbséget jelöl.)

59

LNE72 (A M397637) Marinibacillus campisalis (AY190535) GNE53 (AM397638) Marinibacillus marinus (AJ 237708) GNE46 (AM 397639) Bacillus firmus (D16268) FNA10 (A M397640) Bacillus pumilus (AB020208) LNE42 (AM397641) Bacillus licheniformis (D31739) LNE7 (AM397642) Bacillus cereus (AF290548) GNA22 (AM397643) Bacillus fusiformis (AY548954) LNA82 (AM397645) Kocuria rosea (X87756) GNA51 (AM397644) Kocur ia palustris (Y16263) LNA21 (AM397654) Arthrobacter ramosus (X80742) LNA60 (AM 397646) Micrococcus sp. (AJ313024) FNE36 (AM397647) Microbacterium sp. (AJ876685) LNE4 (A M397648) Microbacterium impe riale (AB007414) FNE2 (AM397655) Aureobacte rium k itamiense (A B013920) GNA34 (AM397649) Rhodococcus erythropolis (AJ237967) LNE51 (AM397656) Defluvibacter lusatiae (AJ132378) FNE 10 (AM397650) Rhodobacter c apsulatus (D16428) Aeromonas s almonicida (Af200329) FNE 1 (AM397652) Aeromonas popoffii (AJ 223180) FNA26 (AM397653) GNA20 (AM397651) Klebsiella pneumoniae (AY043391) Serratia marcescens (AJ297946) LNE35 (AM397657) LNE12 (AM397658) Pseudomonas gessardii (AF074384) Ps eudomonas putida (AF095892) GNE25 (AM 397659) Desulfovibrio fructosivorans (AF050101)

Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

α- proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

0. 10

12. ábra. A Velencei-tó nád biofilm mintáiból 2001 júliusában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 10% nukleotid különbséget jelöl.)

A fenti csoportokat képviselő izolátumok számának összehasonlításakor szembetűnő különbségek figyelhetők meg. A tavaszi mintákat a Gram-negatív baktériumok túlsúlya (128 törzs) jellemezte. A legtöbb (92) törzs a γ-proteobaktériumok körébe tartozott, a βproteobaktériumokat képviselte a legkevesebb (12) törzs. Közel azonos számú törzs nyert besorolást az α-proteobaktériumok (24), a kis (21) és a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé. Ezzel szemben a nyári minták egyértelmű Gram-pozitív dominanciát (180 törzs) mutattak. Ezen törzsek közül 83 a kis, 97 pedig a nagy G+C tartalmú Grampozitívok csoportjába tartozott. Jóval kevesebb törzs képviselte az α- (30 izolátum) és γproteobaktériumokat (41 izolátum). A tavaszi és nyári mintákból származó törzsek csoportosításának és azonosításának eredményeit a Függelék (1-2. táblázat) tartalmazza. A tavaszi mintában az α-proteobaktériumokat az Agrobacterium nemzetség képviselte. Az oxidatív anyagcserét folytató törzsek többsége képes volt az eszkulin hidrolízisére. Képviselőik elsősorban a kétszikűek potenciális növénypatogénjeként ismertek. Az Agrobacterium tumefaciens hatására a növények gyökerén, de földfeletti szárán is sejt- és

60

szövetburjánzások keletkezhetnek. A tumort indukáló gének a baktérium egy nagyméretű plazmidjában (Ti plazmid) lokalizálódnak; az apatogénekben ez hiányzik (Érsek és Gáborjányi, 1998). Az Rhizobium (Agrobacterium) vitis a szőlő kórokozója. Micsinai és mtsai (2003) is izoláltak az ebbe a nemzetségbe tartozó baktériumokat egy őszi mintavétel során a Velencei-tó pusztuló nádasainak rizómáiról. Az Agrobacterium tumefaciens a nemzetség egyetlen nitrogénfixációra képes tagja (Eady, 2001), és amennyiben nem kórokozó - és inkább ez valószínűsíthető - szerepe feltehetően az asszociatív nitrogén fixációban nyilvánulhat meg (Kovács, 2001). A nyári biofilm mintákból az α-proteobaktérumok két másik nemzetségét azonosítottuk. A törzsek közös tulajdonságaként az eszkulin hidrolízisét említhetjük meg. A Rhodobacter

nemzetségbe

tartozó

baktériumok

anaerob

fotoorganotróf

és

aerob

kemoorganotróf növekedésre is képesek. A sötétrózsaszín telepeket képező baktériumok fényben, anaerob körülmények között szerves anyagokat (malátot, acetátot) használnak elektron donorként, de egyes törzseik képesek szulfidot és/vagy tioszulfátot hasznosítani. Ily módon fontos szerepet játszhatnak a tavi és tengeri ökoszisztémák lokális kénkörforgalmában, csakúgy, mint a szerves anyagok ásványosítási folyamataiban (Sinha és Baneriee, 1997). A Rhizobiales rendbe tartozó nemzetség általunk is megtalált képviselője a szigorúan aerob Defluvibacter lusitae, amelyet szennyvíziszapból izoláltak először (Fritsche és mtsai, 1999). A β-proteobaktériumok négy nemzetségének (Acidovorax, Delftia, Hydrogenophaga, Rhodoferax) tagjait kizárólag a tavaszi mintákból származó törzsek képviselték. A βproteobaktériumok közönséges előfordulásúak vízi környezetekben, képviselőiket nagy számban mutatták ki szennyezett vizekből és szennyvíziszap mintákból is. Szennyező anyagokkal szembeni toleranciájuk és metabolikus képességeik sokfélesége révén ezek a szervezetek fontos tagjai a szennyezett vizek mikróbaközösségeinek (Brümmer és mtsai, 2003). Az Acidovorax genusz tagjai elsősorban szénhidrátokat oxidálnak aerob körülmények között, de egyes fajaik (például az A. delafieldii és az A. temperans) denitrifikációra is képesek (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Acidovorax fajokat aktivált szennyvíziszap mintákból is kimutattak fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) segítségével (Schulze és mtsai, 1999). A β-proteobaktériumok egyes általunk is meghatározott nemzetségeiről (pl. Acidovorax, Hydrogenophaga) ismert, hogy képesek fakultatív kemolitotróf anyagcserére, melynek során molekuláris hidrogént használnak elektron donorként (Willems és mtsai, 1989). Jelenlétüket Makk és mtsai (2003) is kimutatták dunai nád biofilmből. 61

A γ-proteobaktériumok közül Pseudomonasokat mind a tavaszi, mind a nyári mintából, mindhárom mintavételi területről azonosítottunk. A tavaszi mintákból származó törzseket a pozitív oxidáz és kataláz teszt jellemezte, míg más tesztekben (pl. nitrát-redukció, ammonifikáció,

kénhidrogén

termelés,

valamint

különféle

biopolimerek

bontása)

variábilisnak mutatkoztak. A nyáron izolált törzsek közös tulajdonságaként a kazein és a tween 80 hidrolízisét említhetjük, míg pl. ammonifikáció, nitrtrát-redukció és kénhidrogén termelése szempontjából – hasonlóan a tavaszi törzsekhez –variábilisak voltak. A nemzetséget reprezentáló törzsek, illetve az identifikált fajok számában szembetűnő eltéréseket lehetett megfigyelni. A tavaszi mintákból kitenyésztett 41 törzs a nemzetség 4 faját (P. anguilliseptica, P. fragi, P. marginalis, P. putida), míg a nyári mintákból összesen 17 izolátum 2 fajt (P. gessardii, P. putida) képviselt. Az egyetlen faj, amelyet mindkét időpontban sikerült kitenyészteni, a P. putida volt. A velencei-tavi Pseudomonas törzsek és fajok számának (a tavaszihoz képest nyáron megfigyelt) csökkenésében feltehetően az érett biofilm

struktúrára

jellemző

fluktuáló

aerob-anaerob

mikrokörnyezetek

mellett

a

vízhőmérséklet jelentős emelkedésének is szerepe lehetett. A szigorúan respiratórikus anyagcseréjű

Pseudomonasok

elsősorban

az

őszi-téli

időszakban

tipikusak

vízi

környezetekben, talajokban és növény-asszociált mikróbaközösségekben (Borsodi és mtsai, 1998; 2003a, 2003b; Makk, 2003; Smit és mtsai, 2001). A Pseudomonas nemzetség tagjai lehetnek szaprotrófok, de közöttük humán-, állat- és növénypatogéneket is számon tartanak. Terminális elektronakceptoruk az oxigén, de egyes fajaik, mint például a P. stutzeri és P. fluorescens anaerob körülmények között alternatív elektronakceptorként nitrátot is képes elfogadni. Katabolikus sokféleségük miatt, főként szerves savak és aminosavak oxidációja révén, és mert magas szerves anyag koncentrációt is tolerálnak, fontos szerepük van a szerves anyagok mineralizációjában. Néhány fajuk fakultatív kemolitotróf, ezek hidrogént is hasznosíthatnak elektrondonorként (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). A P. angulliseptica fajt, melyet halak kórokozójaként tartanak számon, a tavaszi minták közül zömében a Fürdető mintájából izoláltuk. A szintén csak a tavasszal vett mintákból kitenyésztett P. marginalis és P. fragi fajok képviselői potenciális növénypatogén baktériumokként ismertek. A P. putidaként identifikált velencei-tavi törzseket az AgárdGárdony Hosszútisztásról mind a két szezonban, a Fürdetőről tavasszal, a Lángi-tisztás területéről pedig nyáron izoláltuk. A Fürdető és a Lángi-tisztás területéről származó nyári mintákból tenyésztettük ki a P. gessardii faj képviselőit. Ezt a fajt először természetes ásványvizekből izolálták (Verhille és mtsai, 1999). Az ún. fluoreszcens csoportba tartozó Pseudomonas fajokról ismert, hogy részt vesznek a növényi kórokozó mikroorganizmusok 62

eliminálásában. Vashiányos körülmények között fluoreszkáló sziderofórokat állítanak elő, melyek megkötik a vasat, ami ezáltal más szervezetek, köztük a patogének számára is hozzáférhetetlenné válik, így azok képtelenek tovább fejlődni, populációik mérete erősen csökken (Kloepper és mtsai, 1980). Berg és mtsai (2002) a P. putida izolátumokat, Benhamou és mtsai (1996) a P. fluorescens törzseket találták hatékonynak egyes fertőző ágensek ellenében. Fluoreszcens pigmentet termelő Pseudomonasokat korábban Makk és mtsai (2003) téli dunai nádminták biofilmjéből, Micsinai és mtsai (2003) őszi velencei-tavi egészséges nádrizómák külső és belső felületéről is kimutattak. A γ-proteobaktériumok körébe tartozó Aeromonas nemzetség, ugyancsak mind a tavaszi, mind a nyári nád biofilm minták tenyészthető közösségalkotójának bizonyult. Valamennyien hasonló anyagcsere képességekkel rendelkeztek, amit a nitrát nitritig történő redukciója, az intenzív oxidatív és fermentatív, gyakran gázképződéssel járó glükóz hasznosítás, a pozitív Voges-Proskauer teszt és számos biopolimer bontásának képessége jellemzett. Abundanciájukban a Pseudomonasokhoz hasonló szezonális eltérést tapasztaltunk. Az A. sobria fajt képviselő 43 (mindhárom mintavételi területről izolált) törzs képezte a tavaszi törzsek legnagyobb csoportját, 4 törzs képviselőjét A. veroniiként azonosítottunk. Ezzel szemben nyáron mindössze 16 törzs képviselte a nemzetséget. Az A. popoffiit (1 törzs) nyáron a Fürdető mintájából izoláltuk, emellett az A. salmonicida fajt 15 (mindhárom mintavételi területről izolált) törzs képviselte. Az Aeromonasok közönségesek édesvizekben (Langó és mtsai, 2002), szennyvizekben, sőt az ivóvízben is előfordulhatnak. Humán- és állatpatogének is ismeretesek közöttük (Kaper és mtsai, 1981; Seidler és mtsai, 1980, Fehr és mtsai, 2007). Az Aeromonasok gyakorisága, valamint a hőmérséklet, a foszfát, a nitrogén, a szerves szén és a klorofill-a koncentráció növekedése között egyenes arányosság, míg az oldott oxigén vonatkozásában fordított arányosság figyelhető meg (Rhodes és Kator, 1994). Anaerob vagy mikroaerofil körülmények közötti szaporodásukat az teszi lehetővé, hogy oxidatív és fermentatív metabolizmusra egyaránt képesek. Ilyen környezetben elsősorban egyszerű cukrokat fermentálnak, de hasznosítanak aminosavakat is. Monfort és Baleux (1990) szerint az A. sobria faj feltehetően az eutróf ökoszisztémák autochton tagja. Az A. salmonicida természetes környezetben halparazita, lazacok és pisztrángok megbetegedéséért tehető felelőssé (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). A γ-proteobaktériumok más nemzetségeinek jelenlétét vagy csak a tavaszi, vagy kizárólag a nyári mintákból sikerült kimutatni. Ilyenek a tavaszi mintákból származó, Shewanella és Psychrobacter nemzetségbe sorolt törzsek. A mindössze négy törzsre az oxidáz- és kataláz pozitivitás, valamint a nitrát nitritig történő redukciója volt jellemző. A 63

Shewanella putrefaciens faj reprezentánsai gyakoriak vizes élőhelyeken. Kemoorganotróf növekedésük során főként szerves savakat (például hangyasavat, ecetsavat, tejsavat, piroszőlősavat) értékesítenek, de fakultatív kemolitotróf életmódra is képesek, ekkor hidrogén oxidálásával biztosítják az energiát életfolyamataik számára. Aerob körülmények között az oxigén a végső elektronfelvevőjük, az oxigén alacsony parciális nyomása mellett viszont a következő szervetlen elektronakceptorokat redukálhatják: NO32-, Fe3+, Mn4+, S0, SO32- és S2O32-. Ennek következtében fontos szerepet tölthetnek be a vas, a mangán és a kén biogeokémiai ciklusában is (Lee és mtsai, 1977; Lovley és mtsai, 1989; MacDonell és Colwell, 1985; Widdel és Pfenning, 1992). A Psychrobacter nemzetség tagjai hidegtűrő, halotoleráns szervezetek, amelynek számos faját mutatták ki tengervízből és alga-asszociált mikróbaközösségekből is (Yoon és mtsai, 2005; Lee és mtsai, 2006). Két kifejezetten halofil fajt, a P. submarinust és a P. marincolat szintén tengeri környezetből izolálták és írták le elsőként Romanenko és munkatársai (2002). A nemzetséget képviselő két velencei-tavi törzset TSY táptalajról izoláltuk, közös sajátságuk a glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása, valamint a kazein, zselatin és keményítő bontásának hiánya volt. A reprezentáns törzset mindössze 95%-os szekvencia hasonlósági szinten sikerült a nemzetség tagjaként azonosítanunk, ezért feltételezhetően új fajt képvisel. Az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumokat csak a nyári mintákból sikerült izolálni, mind a három mintavételi területről. Ezen izolátumok közös fenotípusos tulajdonsága a glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása, a nitrát nitritig történő redukciója, valamint az eszkulin hidrolízise volt. A Klebsiella nemzetség képviselői (3 törzs) kizárólag King’s B táptalajról származtak. Egyes fajaik humán patogénekként ismeretesek (Podschunn és Ullmann, 1998), ugyanakkor néhány természetes környezetben előforduló képviselőjükről leírták, hogy nitrogén fixációra is képesek (Schmitz és mtsai, 2002). A Serratia marcescenst 5, a Lángi-tisztásról és az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról származó törzs képviselte. Ezek a baktériumok talajokban és vizes környezetekben is megtalálható,

fermentációra

is

képes

szervezetek.

Egyes

törzseiket

a

biológiai

növényvédelemben is tesztelték növénypatogénekkel szemben (Roberts és mtsai, 2005). A tenyésztésen alapuló vizsgálatok eredményei a kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok abundanciájában és diverzitásában szintén szezonális különbségeket tártak fel. Az áprilisi minták mindössze 23 törzse nyert besorolást ebbe a csoportba, amelyek a vizsgált fenotípusos tesztekben törzsenként változó, de általában nagy aktivitást mutattak. A Grampozitív dominanciával jellemezhető nyári minták törzsállományából azonban már 83 izolátum 64

képviselte a csoportot. Ezek a Gram-variábilisan festődő törzsek lassú vegyessavas fermentációra (pozitív metilvörös teszt), valamint az eszkulin és egyes polimerek, például a kazein és zselatin hidrolízise képes szervezetek voltak. A fenotipikai tesztek eredményeivel végzett PCA analízis kapcsán korábban említésre került, hogy a nyári mintavétel alkalmával kitenyésztett közösségekre inkább a lassú, egy héten belül megfigyelhető fermentatív aktivitás volt jellemző, ennek egyik feltételezhető oka többek között a Bacillus és rokon nemzetségekbe tartozó törzsek nagy száma lehet. A tavaszi minták kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumai összesen öt nemzetségbe nyertek besorolást. A Bacillus nemzetség tagjain (B. cereus) kívül közelrokon nemzetségek, mint a Brevibacillus, a Paenibacillus és Marinibacillus, valamint az Exiguobacterium is képviseltették magukat. Az utóbbi nemzetségekhez tartozó törzsek mindegyikét az AgárdGárdony Hosszútisztás mintájából, TSY táptalajról izoláltuk. A Brevibacillus és a Paenibacillus nemzetség faji szinten nem identifikált tagját reprezentáló törzsek alacsony szekvencia-hasonlósági értékei arra utalnak, hogy ezek az izolátumok esetleg a fenti nemzetségek új fajait képviselik. A nyáron vett mintákból a Bacillus (B. pumilus, B. cereus, B. licheniformis, B. firmus és B. fusiformis) és a Marinibacillus (M. marinus és M. campisalis) nemzetségek fajait sikerült azonosítani. A mintavételi területek szempontjából nem volt a tavaszi mintákhoz hasonló elkülönülés, említésre méltó azonban, hogy a Marinibacillus marinust képiselő mindkét törzs az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról származott, míg a B. cereus és B. licheniformis fajok jelenlétét egyedül a Lángi-tisztás biofilmjében sikerült kimutatni. A Bacillus nemzetség képviselői általánosan előfordulnak talajokban, üledékekben, gyökérkörnyezetben, ezért a nádszár biofilmjében való előfordulásuk nem meglepő. Az általunk izolált Bacillus fajok majdnem mindegyikét kimutatták már növények környezetéből. Kovács (2001) a keskenylevelű gyékény (Typha angustifolia) gyökérkörnyezetében a Grampozitív baktériumok között tenyésztéses módszerekkel domináns fajként írta le az alkalitoleráns B. pumilust. Ugyanez a faj a tenyészthető baktériumok között a Fertő üledékében is dominánsként szerepelt (Borsodi és Sallai, 1998). A Velencei-tó üledékéből Borsodi és mtsai (2003b) több Bacillus fajt is kimutattak, köztük az általunk is identifikált alkalofil és pszichrofil Marinibacillus marinust. A dunai nád biofilm baktériumközösségeiben szezonálisan változó Bacillus fajok jelenlétét mutatták ki Makk és mtsai (2003), és Bacillusokat kovamoszatokhoz asszociált baktérium közösségekből is leírtak (Makk, 2002). A Bacillusok endospóráik révén a kedvezőtlen körülményeket is képesek átvészelni, bár éppen e képességük révén a tenyésztéses módszerekkel nyert eredmények alapján nehezen 65

dönthető el, hogy valós számukról és aktivitásukról kapunk-e képet. Molekuláris módszerekkel történő vizsgálatok során azonban gyakran alulreprezentáltak maradnak, főként nehezen lizálható sejtfaluk és/vagy endospóra burkuk miatt (Smit és mtsai, 2001). Számos fajukról ismert a polimerek (cellulóz, keményítő, zselatin) bontásának képessége is (Pourcher és mtsai, 2001). Mások nitrogénkötő képességüknél fogva (Melnikova és mtsai, 2000) képesek lehetnek az igen magas C:N aránnyal (Boschker és Cappenberg, 1998) jellemezhető nádtörmelék környezetében az elemi nitrogén ammóniává történő redukciójára, majd ez utóbbi asszimilációjára. A Bacillus fajok között számosat, mint növényi növekedést serkentő rizobaktériumot (ún. PGPR fajt) tartanak számon (Shishido és mtsai, 1995; Petersen és mtsai, 1996; Bach és mtsai, 2001; Joo és mtsai, 2004), többek között fent leírt tulajdonságukból adódóan, de egyes törzsek növénypatogénekkel szembeni antagonista tulajdonságokkal is rendelkeznek (Berg és mtsai, 2002). Elsősorban a B. pumilus és B. subtilis fajokról ismert, hogy hatékony gyökérkolonizáló szervezetek (Benhamou és mtsai, 1996; Juhnke és mtsai, 1987). A B. pumilusról kimutatták, hogy a rizs magjának endofitájaként elősegítheti a rizsnövény fejlődését egyrészt a gyökér korai kolonizációjának, másrészt a rizoszférában a növény-mikróba interakciók szabályozásán keresztül (Bacilio-Jiménez és mtsai, 2001). A B. cereus fajról paradicsom növényen végzett kutatások során kiderült, hogy növényvédő szerepe lehet – a patogén mikroorganizmusok

szupresszióján

keresztül

–

egyes

betegségek

kialakulásának

megakadályozásában (Smith és mtsai, 1999). A Bacillus nemzetségből különválasztott Paenibacillus nemzetség tagjai szintén általános előfordulásúak talajokban és növények gyökérkörnyezetében (von der Weid és mtsai, 2000; Berge és mtsai, 2002). Számos biopolimert és egyéb anyagot képesek transzformálni, többek között PAH-okat (Daane és mtsai, 2002), cellulózt (Wenzel és mtsai, 2002; Pourcher és mtsai, 2001), pektint (Sakiyama és mtsai, 2001). Egyes fajaik továbbá antifungális anyagok termelésére is képesek (Beatty és Jensen, 2002; Chung és mtsai, 2000), valamint meglehetősen gyakori atmoszférikus nitrogén-kötő tulajdonságuk is (Seldin és mtsai, 1998; Rosado és mtsai, 1998). Az Exiguobacterium aurantiacum faj típustörzsét egy burgonya feldolgozó üzem szennyvizéből írták le, és jellegzetes tulajdonsága a széles pH tartományban való szaporodás (optimum pH 9, növekedés a pH 6,5-11 tartományban) (Collins és mtsai, 1983). A Velenceiés a Fertő-tó nádrizómáiról szintén kitenyésztették ezt a fajt (Micsinai és mtsai, 2003; Borsodi és mtsai, 2005b).

66

A Gram-negatív dominanciával jellemezhető tavaszi mintákban a törzsek kis számban (24) képviselték a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat. Ezekre a törzsekre a zselatin hidrolízise volt jellemző. Az egy kivételével az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról és a Lángi-tisztásról

származó

törzsek

reprezentánsait

5 nemzetségbe

(Micrococcus,

Microbacterium, Aureobacterium, Arthrobacter, Kocuria) tartózóként identifikáltuk. Ezzel szemben a nyári törzsállományon belül mind a három mintavételi területről előkerült nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok képezték a legnagyobb csoportot (97 törzs). A tavaszi mintákból azonosított nemzetségeken kívül a Rhodococcus nemzetség képviselte a nyáron izolált törzsek egyik legnagyobb (22) törzsszámú csoport. A Micrococcus és Microbacterium nemzetségek tagjaiként azonosított reprezentánsok csoportjaiba szintén nagyszámú (24, illetve 28) törzs tartozott. Néhány kivételtől eltekintve az eszkulin, a zselatin és a kazein hidrolízise, valamint a metilvörös reakció és a glükóz egy héten belül történő oxidatív és fermentatív felhasználása voltak a törzsek jellemző pozitív tesztjei. A Micrococcus nemzetség tagjai a nyugodt nyílt víz tipikus lemezelhető baktériumai (Kotsis és mtsai, 1982), melyek obligát aerob anyagcserét folytatnak, és jól tolerálják a környezet sókoncentrációjának ingadozását. A Fertő nádasainak biofilmjéből a M. luteus faj jelenlétét mutatták ki Borsodi és mtsai (1998a). Lilley és munkatársai (1996) cukornád gyökérkörnyezetét vizsgálva detektálták e nemzetség több képviselőjét. A vízi környezetekben közönségesen előforduló Microbacterium nemzetség tagjai közül a tavaszi minták közül két Lángi-tisztásról származó törzs képviselte a M. imperiale fajt. A nyári, mindhárom területről származó törzsek szintén ezzel a fajjal mutattak nagy szekvencia-hasonlóságot. Egyetlen, Lángi-tisztásról izolált törzset azonosítottunk M. (korábban Aureobacterium) flavescensként. A két nemzetség képviselői monofiletikus leszármazásúak, legtöbb fenotípusos és kemotaxonómiai sajátságukban hasonlítanak egymásra, alapvetően a sejtfalszerkezetükben megnyilvánuló különbségek alapján különülnek el egymástól (Takeuchi és Hatano, 1998). Az Aureobacteriumok főként oxidatív anyagcseréjű, de fermentációra is képes szervezetek. A nemzetség tagjai közül az A. kitamiense faj képviselőit sikerült mindkét mintavétel során kitenyészteni. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív Aureobacteriumok, Microbacteriumok, valamint Rhodococcusok

jelenlétét

cukornád

gyökeréről

kitenyésztett

aerob

heterotróf

baktériumtörzsek zsírsav-metilészter gázkromatográfiás (FAME-GC) vizsgálata is igazolta (Lilley és mtsai, 1996). Humuszban előforduló baktériumok növényi növekedést elősegítő tulajdonságait és egyes boreális fafajok gyökerének kolonizációs képességét vizsgálva Elo és mtsai (2000) az Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus és Bacillus nemzetségek gyakori 67

jelenlétét mutatták ki. A Rhodococcus erythropolisról igazolták nitrogén fixációs képességét is. A nemzetségbe tartozó baktériumok metabolikus sokféleségük révén számos szerves anyag, többek között különféle xenobiotikumok bontására is képesek (Larkin és mtsai, 2005). Mind a tavaszi, mind a nyári mintából kimutatható volt a Kocuria rosea és a Kocuria palustris fajok jelenléte. Az aerob respiratórikus anyagcserével bíró K. rosea tipikus előfordulású talajokban és vízi környezetekben, az egyes környezeti tényezők értékeinek (pl. sókoncentráció, pH vagy hőméréséklet) széles skáláját képes tolerálni (Borsodi és mtsai, 2007). Kovács és mtsai (1999) a keveskenylevelű gyékényről a tudomány számára két új Kocuria fajt írt le: a K. palustrist és a K. rhizophilat. Nitrátlégző és keményítőbontó képességük révén valószínűleg aktívan bekapcsolódnak a nádrizóma felületein kialakuló szénés nitrogén anyagcserébe is. Érdekes, hogy nagy számban voltak kimutathatók a nádrizómák belső felületein is (Micsinai és mtsai, 2003), ami egybevág Andrews és Harris (2000) feltételezésével, mely szerint a Kocuriak növényi növekedésserkentő gyökérbaktériumok (PGPR) is lehetnek. Az Arthrobacter nemzetség két faját, az A. crystallopoietest a Lángi-tisztásról tavasszal, az A. ramosust a Lángi-tisztásról és az Agárd-Gárdony Hosszútisztásról nyáron azonosítottuk. A Gram-pozitív, aerob oxidatív anyagcserét folytató nemzetség képviselői talajokban általános előfordulásúak, de megtalálhatók édesvizekben, tengervízben és szennyvízben egyaránt. Komplex poliszacharidokat bontó képességüknél fogva a növényi szerves anyagok lebontásában is szerepet játszhatnak. A növények gyökerét is közvetlenül képesek kolonizálni (Sato és Yiang, 1996), sőt egyes fajok opinok katabolizmusára is képesek (Gardener és de Brujin, 1998). A legtöbb Arthrobacter képes nitrogént fixálni (Jones és Keddie, 2000). A nemzetség egyes tagjai herbicidek degradálására is képesek (Tixier és mtsai, 2002).

68

7.1.4 A klónozás eredményei A Velencei-tó természetvédelmi területén található Lángi-tisztás a másik két mintavételi területhez képest háborítatlan, széles összefüggő nádasövvel határolt térség. A 2000-es és 2001-es tenyésztésen alapuló és BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok, valamint a 2003-as anyagcsere és genetikai ujjlenyomat vizsgálatok eredményei is azt mutatták, hogy az itt található nád biofilm közösség gazdag fajösszetételű és széleskörű metabolikus aktivitással rendelkezik, ezért 2006-ban a három mintavételi hely közül ezt a területet választottuk a tenyésztéstől független, molekuláris klónozásos módszerrel történő vizsgálatra. A mintából izolált közösségi DNS-ből a 16S rDNS körülbelül 500 bázispár hosszú szakaszának felszaporítása PCR segítségével történt. Az egyes DNS szakaszok klónozását követően 140 klónt számláló könyvtárat hoztunk létre. Az inszertet tartalmazó klónokat (126) az izolált törzsekhez hasonló módon ARDRA segítségével csoportosítottuk, és a klónokat 36 különböző hasítási mintázattal rendelkező csoportotba soroltuk. Ezt követően a csoportonként kiválasztott reprezentáns klónokat a 16S rDNS szekvencia analízisére alapozva identifikáltuk (Függelék 5. táblázat). A reprezentatív klónok taxonómiai helyzetét a 16S rDNS parciális szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramon mutatjuk be (13. ábra). Összesen 9 szekvencia bizonyult a klónozás során keletkezett ún. kiméra szekvenciának. Mikrobiális közösségek DNS-alapú klónozással történő vizsgálatakor a PCR során alkalmazott eubakteriális primerek a feltárt mintában jelen levő növényi-, illetve alga kloroplasztisz géneket is amplifikálhatják (Normander és Prosser, 2000; Yang és Crowley, 2000). Jelen vizsgálatunk során mi is kimutattuk, hogy a velencei-tavi nád perifitonban a baktériumközösségek mellett feltehetően a korábban Ács és munkatársai (2003) által részletesen tanulmányozott kovaalga, valamint a cianobaktérium közösségek is fontos szerepet játszhatnak. A klónkönyvtárban 4 csoportba soroltuk a 23 kovaalga kloroplasztisz, illetve 15 cianobaktérium DNS-ként azonosított klónszekvenciát. Bár a környezeti mintából izolált teljes közösségi RNS-ből kiinduló klónozásos technika alkalmazásával kiküszöbölhető a nem kívánt génszakaszok vizsgálata, és e módszerrel a vizsgált közösség tényleges aktivitásáról is képet kaphatunk, azonban a környezeti mintákból történő RNS izolálás optimalizációja és amplifikációja az RNS molekula DNS-hez viszonyított érzékenysége, valamint az RN-ázok általános előfordulásának problematikája miatt idő- és laborigényesebb, mint a DNS alapú munka (Nikolausz és mtsai, 2004).

69

L119 Rickettsiales bakterium klón (DQ223223) Rickettsia peacockii (U55820) 100 L18 Sphingomonas kaistensis (AY785128) 100 L42 baktérium klón (EF540429) 100 L19 90 Methylophilaceae baktérium klón (AF418951) Alfa-proteobaktérium klón (DQ432405) 90 L33 100 65 Paracoccus kocurii (D32241) Rhodobacter capsulatus (D16428) 79 100 L43 Alfa-proteobaktérium klón (EF220748) 100 L48 90 Baktérium klón (AY338037) Methylobacillus flagellatus (DQ287787) 93 100 L9 Beta-proteobaktérium klón (DQ501338) Denitratisoma oestradiolicum (AY879297) 100 L96 98 Beta-proteobaktérium klón (EF417647) 86 L88 100 Aquabacterium sp. (EF179861) 59 Aquabacterium citratiphilum (AF035050) 94 L14 63 Lysobacter niastensis (DQ462462) 100 Lysobacter brunescens (AB161360) 99 L136 90 Xanthomonadaceae baktérium klón (EF019778) 99 L66 96 Gamma-proteobaktérium klón (DQ351758) Methylococcus capsulatus (X72770) 98 L65 92 baktérium klón (AJ548901) Chondromyces comitans (X91814) 100 L16 54 Sphingobacteria baktéium klón (EF520603) 91 L83 100 Flavobacterium sp. (DQ530100) Flavobacterium johnsoniae (AM230489) 100 L106 Sphingobacteria baktérium klón (DQ003154) 100 L21 Flexibacter ruber (M58788) L15 65 100 baktérium klón (AJ318142) Cytophaga sp. (AJ224414) 96 94 99 L10 Haliscomenobacter hydrossis (AJ784892) 99 100 L135 Sphingobacteria baktérium klón (EF520596) 53 100 L2 Bacteriodetes baktérium klón (DQ917823) 99 L29 100 baktérium klón (EF203206) Chlorobi baktérium klón (EF562071) 100 L47 100 baktérium klón (AY940555) Spirochaeta sp. (X97096) 100 L62 100 Verrucomicrobia baktérium klón (EF220751) Verrucomicrobium spinosum (X90515) 100 L95 100 Chloroflexi baktérium klón (EF220771) Levilinea saccharolytica (AB109439) 100 L129 99 Gemmatimonadetes baktérium klón (DQ828292) Gemmatimonas aurantiaca (AB072735) 100 100 L22 Gemmatimonadetes baktérium klón (EF220497) Termodesulphobacterium thermophilum (AF334601) 97

52

100

α- p roteobaktériumok

β-proteobakté riumok

γ-proteo baktériumok

Bacteriod etes

Chlor obi (zöld kén baktériumok ) Spirocha etes Verruc omicrobia Chl oroflexi (zö ld nem ké n baktér iumok)

Gemmatimonadetes

0.05

13. ábra. A velencei-tavi Lángi-tisztás nád biofilmjéből származó klónok neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramja (Méretarány: 5% nukleotid különbség.) 70

Az általunk végzett kutatás keretein belül is megkezdődtek a biofilm minták RNSalapú vizsgálatai, jelenleg a DNS-től mentes RNS-minták kinyerésének optimalizációja folyik. A Lángi-tisztásról gyűjtött nád biofilm mintákból származó 79 baktériumklón, és a korábban (2000 áprilisában és 2001 júliusában) kitenyésztett 106 törzs nagyobb filogenetikai csoportonkénti megoszlását (14. ábra) összehasonlítva kitűnik, hogy klónozás révén a nád biofilm alkotásában résztvevő baktériumközösségek szélesebb diverzitását tártuk fel. Bár a korábbi vizsgálatok során alkalmazott tenyésztési feltételek és módszerek mellett a kimutatott klónokhoz hasonló szervezetek kitenyésztésére nem is vállalkozhattunk, mégis meglepő eredmény volt, hogy a klónszekvenciák nagy része (68 klón) eddig még tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciával mutatta a legnagyobb fokú hasonlóságot. Ugyanakkor az is feltűnő, hogy a klónkönyvtárban egyetlen Gram-pozitív baktériumot sem azonosítottuk. A kétféle (tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független) módszerrel nyert különböző eredmények hátterében feltehetően az alkalmazott technikák eltérő szelektivitása áll. A tenyésztéssel feltárt mikróbaközösségek összetételében gyakran megfigyelhető jelenség a Gram-pozitív illetve spóraképző szervezetek túlsúlya (Smit és mtsai, 2001). A molekuláris klónozást megelőző DNS izolálás során előfordulhat egyes baktériumok preferenciális feltáródása, például a sejtfal-sajátságok eltérései miatt és ennek következtében nagyobb arányú detektálásuk az adott mintában (von Wintzingerode, 1997; Frostegard és mtsai, 1999; Martin-Laurent és mtsai, 2001). A klónszekvenciák közel fele tartozott a tenyésztéssel is kimutatott három proteobaktérium csoport valamelyikébe. Az így nyert egyes csoportok aránya azonban eltérő volt: legnagyobb részük nem a γ-, hanem az α-proteobaktériumok rokonsági körébe tartozott. A legnagyobb szekvencia hasonlóságot pl. antarktikus talajból, édesvízből, alkalikus szikes tavi vízmintából származó bakteriális klónokkal mutatták (Függelék 5. táblázat). Faji szinten a Sphingomonas kaistensist sikerült azonosítanunk. Ez a szervezet speciális, biotechnológiai szempontból hasznosítható exopoliszacharidok termelése, valamint egyes xenobiotikumok bontásának képessége révén gyakran tárgya az alkalmazott kutatásoknak (Seo és mtsai, 2004). A törzsek és a klónok szintén eltérő arányban képviselték a β-proteobaktériumokat. A különféle vízi környezetekből származó klónokkal mutatott hasonlóságon kívül egy ARDRAreprezentánst a Lysobacter niastensis faj képviselőiként azonosítottunk, amelyet uborka növények gyökérkörnyezetéből izoláltak és írtak le először (Weon és mtsai, 2007). Az Aquabacterium nemzetséget egy ARDRA-csoport klónjai képviselték. Az Aquabacteriumokat

71

polifoszfát-felhalmozó és széleskörű szerves sav hasznosító képességük (Kalmbach és mtsai, 1999) hozzásegíti a biofilmeket jellemző oligotróf környezethez való adaptálódáshoz. A klónok mindössze 10%-a nyert besorolást a γ-proteobaktériumok közé, amelyek kizárólag tenyésztésbe nem vont (nehézfémmel szennyezett tengeri üledékből, illetve rezgőnyár gyökérkörnyezetéből származó) környezeti klónokkal (Függelék 5. táblázat) mutattak nagyfokú szekvencia hasonlóságot. α-proteobaktériumok β-proteobaktériumok

100%

γ-proteobaktériumok

80%

Firmicutes (kis G+C)

60%

Aktinobaktériumok (nagy G+C) Bacteriodetes

40%

Gemmatimonadetes

20%

Verrucomicrobia Spirochaetes

0% törzsek

klónok

Chlorobi Chloroflexi

14. ábra A velencei-tavi Lángi-tisztás nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása A klónkönyvtár vizsgálata alapján a különböző baktériumcsoportok képviselőiként azonosított szekvenciák többsége (35%) a Bacteriodetes csoportba nyert besorolást. Ezek közül számos klón más tenyésztésbe nem vont klónnal mutatott hasonlóságot, amelyek különféle környezeti mintákból (pl. édesvízű tavak, ásványi alzaton kialakult biofilm, magas sótartalmú szennyvíz, stb.) kerültek elő. A törzs képviselői nemcsak vízi környezetekben, hanem

talajokban

és

növény-asszociált

mikrobiális

közösségekben

is

közönséges

előfordulásúak, képviselőiket azonosították pl. egészséges és Erwiniaval fertőzőtt burgonyanövények, valamint Ni-felhalmozó növények gyökérkörnyezetéből (Reiter és mtsai, 2002; Idris és mtsai, 2004). Ezek a kutatások rámutattak, hogy a növény-asszociált mikrobióta köztük a gyakran abundáns Bacteriodetes csoport tagjai sokrétű hasznos szerepet tölthetnek be a növény és szűkebb környezete életében. A Bacteriodetes csoportból a Flexibacter, Haliscomenobacter és Flavobacterium taxonokat sikerült nemzetség, illetve faji szinten 72

indentifikálnunk. A Flavobacteriaceae családba tartozó nemzetség tagjainak számos faja tengeri környezetből származik, ahol elsődleges szerepük az elsődleges produkció révén keletkező szerves anyagok mineralizációjában jelölhető ki (Bowman és Nichols, 2005). A Flavobacteriumok és a Sphingobacteriumok a tenyésztés körülményeivel (pl. sókoncentráció, szerves anyag tartalom) összefüggő érzékenységükről ismeretesek, és valószínűleg ez lehet az egyik oka annak, hogy a tenyésztéshez képest klónozás segítségével nagyobb arányban azonosítottuk őket. Az adatbázisokban fellelhető viszonylag kevés tenyésztésbe vont Bacteriodetes baktériumot képviselő szekvencia szintén azt jelzi, hogy a tenyésztésen alapuló vizsgálatok továbbfejlesztése nagymértékben hozzájárulhat a csoport sokféleségének és aktivitásának megismeréséhez (Jooste és Hugo, 1999; O’Sullivan és mtsai, 2002). Több baktériumcsoportot csak klónozással detektálnunk. Ezek az ARDRA csoportok minden esetben kevés számú (1-5) klónt tartalmaztak és a klónok 1-6%-át képviselték. Reprezentánsaik a Verrucomicrobia, a Gemmatimonadetes, a Spirochaetes, valamint a zöld kén (Chlorobi) és a zöld nem kén baktériumok (Chloroflexi) körébe nyertek besorolást. Az adatbázisokban fellelhető szekvenciák nagy része ezidáig tenyésztésbe még nem vont képviselőktől származik, a legtöbb irodalmi adat molekuláris biológiai, nukleinsav-alapú módszerek alkalmazásával nyert eredményekről áll rendelkezésre. A Gemmatimonadetes és a Verrucomicrobium filogenetikai ág is mindössze 1-1 tenyésztésbe vont fajjal rendelkezik, azonban a környezeti mintákból származó szekvencia adatok alapján feltehetően széleskörben elterjedt, és meglepően nagy filogenetikai diverzitással rendelkezik (Schlesner, 1988; Zhang és mtsai, 2003). Borsodi és mtsai (2005a) a kiskunsági

Kelemen-szék

molekuláris

klónozással

történő

vizsgálata

során

a

Gemmatimonadetes csoport 6%-os arányát mutatták ki. A Spirochaetes csoport tagjai fakultatív vagy obligát anaerob szervezetek, amelyek tengeri és édesvízi környezetekben egyaránt megtalálhatók. Különleges környezeti feltételekhez (pl. szélsőséges alkalinitás, sótartalom, hőmérséklet, nyomás) adaptálódott képviselőik speciális enzimeiknek köszönhetően a biotechnológiai alkalmazás lehetőségét hordozzák magukban (Hoower és mtsai, 2003). A Lángi-tisztás nád biofilm mintájából olyan zöld kén és zöld nem kén baktériumok (Chlorobi és Chloroflexi) jelenlétére utaló szekvenciákat sikerült kimutatnunk, amelyekhez legközelebbi rokon szekvenciák talajokból és üledékekből származtak (Függelék). A klónozásos módszer alkalmazásával számos, eddig tenyésztésbe nem vont, illetve az általunk tenyésztéssel nem kimutatott baktérium jelenlétét sikerült igazolnunk a Lángi-tisztás nád biofilm baktériumközösségében. Míg tenyésztéses vizsgálatainkkal az aerob heterotróf 73

kemoorganotróf baktériumközösségeket tudtuk vizsgálni, a klónozás rámutatott számos más metabolizmussal jellemezhető szervezet jelenlétére is, melyek feltehetően igen fontos szerepet játszanak a nád biofilm közösségi anyagcseréjében. A klónozás a tenyésztéses vizsgálatokhoz képest gyors, kevés időt igénylő mikrobiális ökológiai módszer. Ez a környezeti mintából közvetlen, teljes közösségi DNS izolálásán és vizsgálatán alapuló technika hozzájárul a tenyésztéssel esetlegesen nehezen feltárható és így rejtve maradó diverzitás feltárásához.

74

7.2 A Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm vizsgálatának eredményei és értékelésük 7.2.1 BIOLOG közösségi szénforrás értékesítési vizsgálatok A BIOLOG GN2 lemezek felhasználásával végzett közösségi szénforrás hasznosítási mintázatok szezonális változásainak nyomon követésére 2005-ben és 2006-ban vettünk nád biofilm mintákat a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas egy-egy reprezentatív helyéről tavasszal, nyáron és ősszel. A velencei-tavi mintáknál ismertetett módon az abszorbancia értékeket öt különböző időpontban (24, 48, 72, 96 és 120 óra inkubációt) követően mértük le. Mindkét mintavételi hely esetében a 96 órás inkubációt követő adatok bizonyultak megfelelőnek a mikróbaközösségek

anyagcsere-ujjlenyomatának

összehasonlításához

(a

szénforrások

hasznosítása és az indikátor színfejlődése nem nőtt számottevően 96 óra után). Mintánként 33 párhuzamos lemez átlagának leolvasási értékeit használtuk az eredmények kiértékelésekor. A mintákkal közvetlenül végzett közösségi BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési vizsgálat eredményeit főkomponens analízis (15., 17. ábra), valamint az értékesített szubsztrátok típusa (16., 18. ábra) alapján hasonlítottuk össze. A Kelemen-szék esetén az ordinációs diagram első főkomponense mentén az objektumok határozottan két csoportra váltak szét (15. ábra). A nagy szubsztrát hasznosítással jellemezhető (Axis 1 > 1) 2005. évi és 2006 őszi minták kerültek az egyik, míg a kis szubsztrát hasznosítással jellemezhető (Axis 1 < -5) 2006. évi tavaszi és nyári minták a másik csoportba. A második főkomponens mentén pedig a 2006 őszi minta vált el a többitől. A felkínált szénforrások közül a 2005 tavaszi és őszi minta mikróbaközösségei hasonló szénforrás hasznosítással voltak jellemezhetők (16. ábra). A szerves savak és az aminok/amidok kivételével, amelyeket az őszi közösségek némileg nagyobb arányban hasznosítottak, az egyes szénforrás típusokat 60% érték közeli arányban értékesítették. Hasonlóság mutatkozott az egyéb kategóriába sorolt észterek, alkoholok és aromás vegyületeket alacsony mértékű hasznosításában. A nyári minta mikróbaközösségei a két másik mintáétól eltérően értékesítették a felkínált szubsztrátokat: a szerves savak hasznosulása meghaladta a 80%-ot, és az egyéb szénforrások felhasználása a többi szubsztrát csoporthoz hasonló mértékű volt. A 2006-ban vett nád biofilm minták mikrobiális közösségeit az őszi minta kivételével az előző évi mintákéihoz képest alacsonyabb aktivitás jellemezte, ezt

75

az ordinációs diagramon való, negatív Axis 1 értékekkel rendelkező elhelyezkedésük is alátámasztja (15. ábra).

2 1

Axis 2 (11%)

0

KB_0505

KB_0507 KB_0605

KB_0511

KB_0607

-1 -2 -3 -4

KB_0610 -8

-6

-4

-2 0 Axis 1 (73%)

2

4

15. ábra A kiskunsági Kelemen-széken vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (KB: Kelemen-szék biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005 május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006 május, július, október) A Kelemen-szék két éves eredményei alapján a tavaszi minták mikrobiális szénforrás hasznosítási profilját a polimerek és szénhidrátok kivételével a felkínált szénforrás típusok többé-kevésbé hasonló mértékű hasznosítása jellemezte.

100

80 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

60 40 20 0

hasznosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

100

80 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

60 40 20 0

KB_0505

KB_0507

KB_0511

KB_0605

KB_0607

KB_0610

16. ábra A kiskunsági Kelemen-széken vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján (0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október)

76

A nyári minták mikrobiótájának közös jellemzője a polimerek kismértékű értékesítése, valamint az egyéb szénforrások többi mintához viszonyított nagyobb arányú felhasználása volt. Az őszi minták esetében nem találtunk a mikróbaközösségekre mindkét évben jellemző szénforrás értékesítési sajátságot. A 2006-os évben a tavaszi és nyári minták bizonyultak hasonlónak egymáshoz, ezen minták mikróbaközösségeit az aminosavak és aminok/amidok preferált hasznosítása, valamint a polimerek és szénhidrátok kismértékű értékesítése jellemezte. Az őszi minta mikróbaközösségei (a másik két minta csekély hasznosításához hasonlóan) nem értékesítették egyik felkínált polimert sem, azonban a másik két minta mikrobiótájával ellentétben a szénhidrátok több mint felét hasznosították 96 órán belül. Szerves- és aminosavakat, valamint aminokat/amidokat az őszi minta mikróbái is felhasználtak, azonban a másik mintához viszonyítva kisebb mértékben (16. ábra).

3

VB_0507

2

Axis 2 (11%)

1

VB_0605 VB_0607 VB_0610

0

-1 VB_0505 -2

VB_0511 -4

2

0

2

4

6

Axis 1 (72%)

17. ábra A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm minták ordinációja a mikróbaközösségek BIOLOG GN2 szénforrás értékesítési adatai alapján (VB: Nagy-Vadas biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005 május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006 május, július, október) A Nagy-Vadas mintáinak ordinációs diagramján megjelenített két főkomponens a szénforrások hasznosításában mutatkozó összvariancia 83%-át magyarázta (17. ábra). A 2005-ben vett három minta a mikrobiális közösségi szénforrás hasznosítási mintázatok 77

alapján távol került egymástól. A tavaszi és a nyári minták mindkét főkomponensre nézve magas értékekkel (Axis 1 > 4) rendelkeztek, míg az őszi és a 2006. évi minták mikróbaközösségeinek anyagcsere-potenciálját negatív főkomponens értékek (Axis 1 < -1) jellemezték. A 2006-ból származó három minta a közösségei szénforrás értékesítési profilok alapján nagyon közeli pozícióba került egymáshoz az ordinációs diagramon (17. ábra).

100 hasnosított szubsztrátok (%)

hasznosított szubsztrátok (%)

100 80 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

60 40 20 0 VB_0505

VB_0507

80 polimerek szénhidrátok szerves savak aminosavak aminok/amidok egyéb

60 40 20 0

VB_0511

VB 0605

VB 0607

VB 0610

18. ábra A tiszántúli Nagy-Vadason vett nád biofilm minták mikrobiális szénforrás hasznosításának összehasonlítása a BIOLOG GN2 szénforrás típusok értékesítése alapján (0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október) Az egyes szubsztrát típusok 96 órán belüli értékesítésének összehasonlításakor (18. ábra) kitűnik, hogy a 2005-ben vett minták közül a tavaszi és őszi minták mikróbaközösségei hasonló értékesítési mintázattal rendelkeztek. Eltérés csak az őszi minta közösségének néhány százalékkal nagyobb mértékű aminosav-, valamint némileg kisebb mértékű szénhidrát hasznosításában volt megfigyelhető. A részletes, mind a 95 szénforrás értékesítési adatainak varianciáját vizsgáló főkomponens analízis során (17. ábra) ez a hasonlóság a részletesebb adatértékelés révén nem mutatkozott meg. A nyári minta közössége az előbbi két mintához képest nagyobb arányban értékesítette az egyéb kategóriába sorolt szénforrásokat, az aminok/amidok felhasználásában pedig a másik két minta közösségeihez képest alacsonyabb aktivitást mutatott. A 2005-ös minták közösségeihez képest, amelyeket az egyes szubsztrát csoportok többé-kevésbé kiegyenlített és egymáshoz hasonló mértékű értékesítése jellemzett, a 2006-ban vett minták közösségeinek közös sajátsága a szerves savak és aminosavak preferált hasznosítása volt. Az őszi minta kivételével a polimerek hasznosulása kisebb mértékű volt a többi szénforrás típushoz, valamint a 2005-ben tapasztaltakhoz képest. A szénhidrátok értékesítése a 2005-ös adatokhoz hasonlóan alakult, ez alól szintén az őszi minta közösségei képeztek kivételt: a felkínált szénhidrátok mindössze 39%-át hasznosították a 96 órás inkubációs periódus során. A mérési adatok alapján a tavaszi minta közösségeinek amin/amid hasznosítása teljesen visszaszorult az egyéb szubsztrát csoportokhoz képest. A két

78

év tavaszi és nyári mintájának mikróbaközösségei alapvetően eltérő szénforrás értékesítési mintázattal rendelkeztek, eredményeik alapján nem lehetett szezonális jellegzetességet megfigyelni. Az őszi minták mikrobiális szénforrás hasznosításai azonban hasonlóságot mutattak a szerves savak és aminosavak preferenciális hasznosításában, valamint a felkínált polimerek 60%-os arányú értékesítésében. A BIOLOG GN2 lemezekkel végzett két éves szénforrás értékesítési vizsgálatok eredményei a módszer alkalmasságát igazolták a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm mikróbaközösségek összehasonlítására és a szezonális változások nyomon követésére. Az első két főkomponens mindkét esetben az összvariancia több mint 80%-át magyarázta, ami sokkal magasabb, mint a 2003-as velencei-tavi minták GN2 közösségi szénforrás értékesítésekor tapasztaltak. 7.2.2 DGGE vizsgálatok A két alföldi szikes vízterület nád biofilm baktériumközösségeinek diverzitását, a közösségi szerkezetben bekövetkező szezonális változásokat és az egyes fajok relatív abundanciáját DGGE segítségével vizsgáltuk (19-20. ábra).

19. ábra A Kelemen-széken vett nád biofilm minták DGGE sávmintázatának összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram (KB: Kelemen-szék biofilm; 0505, 0507, 0511: 2005. május, július, november; 0605, 0607, 0610: 2006. május, július, október) A Kelemen-szék nád biofilm baktériumközösségeinek sávmintázata alapján készült (19. ábra) dendrogramon a 2005-ben vett minták alkottak egy csoportot, míg a 2006-ban vett minták közül a tavaszi és a nyári minták baktériumközösségeinek DGGE sávmintázata mutatkozott hasonlónak egymáshoz. A 2006 októberében vett minta baktériumközösségének 79

DGGE „ujjlenyomata” a többi mintától elkülönülve inkább a 2005. évi mintákkal mutatott hasonlóságot. A Nagy-Vadasról a két egymást követő évből származó szezonális minták baktériumközösségei DGGE sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást mutattak (20. ábra). Mind a 2005-ös, mind a 2006-os minták közül a nyári és őszi minták baktériumközösségeinek sávmintázata mutatott egymással nagy hasonlóságot, míg a tavaszi minták közösségei a többi mintától eltérő sávmintázattal rendelkeztek. Mindhárom 2006-ban vett minta esetében megfigyelhető egy nagy intenzitású sáv, míg a 2005-ös évszakos minták baktériumközösségeinek sávmintázatában nem figyelhető meg hasonló egységesség.

20. ábra A Nagy-Vadasról 2005-ben (0505-május, 0507-július, 0511-november) és 2006-ban (0605-május, 0607-július, 0610-október) vett szezonális nád biofilm minták DGGE sávmintázatuk összehasonlítása alapján készült UPGMA dendrogram VB: Nagy-Vadas biofilm

80

7.2.3 Tenyésztéses vizsgálatok A

Kelemen-székről

és

a

Nagy-Vadasról

a

nád

biofilm

tenyészthető

baktériumközösségeinek megismerése céljából 2004 áprilisában végeztünk mintavételezést. A minták négyféle táptalajon becsült csíraszámait a 7. táblázat mutatja táptalaj típusonként. táptalaj Horikoshimintavétel helye King B Caulobacter féle alkalikus Kelemen-szék 8.56*106 1.82*107 1,89*107 2,34*106 Nagy-Vadas 3,76*106 7,6*105 1,03*107 2,23*105 7. táblázat A kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből 2004 áprilisában tenyésztésbe vont baktériumok csíraszám értékei (CFU/g) Mesterséges tengervizes

A Kelemen-szék esetében a négyféle táptalajon kalkulált értékeket összehasonlítva a nagy szerves anyag tartalmú King B és Horikoshi-féle alkalikus táptalajon a többi táptalajhoz képest alacsonyabb csíraszám értékeket detektáltunk, míg az oligotróf közeget modellezni hivatott Caulobacter és az ún. mesterséges tengervizes táptalajokon a csíraszám becslés magasabb

értékeket

eredményezett.

A

Nagy-Vadas

mintájából

a

legalacsonyabb

csíraszámokat a mesterséges tengervizes és az alkalikus táptalajokon, a legmagasabbat Caulobacter táptalajon becsültük. A 137 Kelemen-székről származó izolátumból a King B és a Caulobacter táptalajról származók mintegy felét, a mesterséges tengervizes és alkalikus táptalajról izolált törzsek közel 70%-át (összesen 80 baktériumtörzset) sikerült hosszú távon laboratóriumi körülmények között fenntartanunk. A Nagy-Vadas nád biofilmjéből random módon izolált 123 tenyészet közül összesen 72 baktériumtörzset tudtunk tiszta tenyészetben fenntartani laboratóriumi vizsgálatok céljára. A Caulobacter táptalajon izolált törzsek közel 60, a mesterséges tengervizes és az alkalikus táptalajról származó izolátumok közel 80%-át tudtuk hosszú távon tenyészetben fenntartani laboratóriumi körülmények között. A King B táptalaj ugyanakkor kevésbé volt megfelelő a hosszú távú törzsfenntartás szempontjából: az izolátumoknak mindössze 30%-át sikerült fenntartanunk. Mindkét mintavételi terület, illetve mind a négy táptalaj esetében voltak olyan fajok/nemzetségek, amelyeket kizárólag az adott tápközegről izolált törzsek képviseltek, például az α-proteobaktériumokat csak alkalikus táptalajról izoláltuk a Kelemen-szék mintájából. α-proteobaktériumokat a Nagy-Vadasról legnagyobb arányban (összesen 8 81

azonosított taxon közül 7) a mesterséges tengervizes táptalajról izolált törzsek esetében azonosítottunk. A γ-proteobaktériumok, a kis és a nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok képviselői között előfordultak csak a mesterséges tengervizes táptalajról izolált baktériumok a Nagy-Vadas izolátumai között. A Kelemen-szék izolátumai közül számos kis és nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumként azonosított törzs származott mesterséges tengervizes táptalajról, illetve erről a tápközegről származó törzsek között sikerült a legnagyobb számú (10) fajt/nemzetséget azonosítanunk. A fentiek alapján a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm baktériumainak vizsgálatához a mesterséges tengervizes táptalaj bizonyult a legalkalmasabbnak a diverzitás tenyésztéses módszerekkel történő feltárására. Az összesített fenotípusos teszteredményekkel elvégzett főkomponens analízis alapján sem a Kelemen-szék, sem a Nagy-Vadas nád biofilmje estében nem lehetett jellegzetes elkülönülést megfigyelni az izoláló táptalaj szerint kialakított törzscsoportok között. A törzseket ezért az ARDRA-t és a reprezentáns törzsek azonosítását követő filogenetikai hovatartozásuk alapján soroltuk csoportokba és a fenotípusos tesztekben mutatott eredményeik (8-9. táblázat) alapján főkomponens analízis segítségével (21-22. ábra) hasonlítottuk össze. Mivel a Nagy-Vadas törzsei közül indol képzésére triptofánból egy sem volt képes, és egy esetben sem figyeltünk meg gáztermelést O/F médiumban, továbbá egy törzs sem adott pozitív eredményt a nitrát nitrogénig történő redukciójában, ezek a tulajdonságok nem kerültek be a főkomponens analízisbe. A Kelemen-székről származó törzsek Gram-pozitív dominanciával (42 törzs) voltak jellemezhetők. A hat filogenetikai csoportba sorolt törzseket (a β-proteobaktériumok kivételével) a kataláz pozitivitás jellemezte. A tween 80 bontására a törzsek többsége képes volt. Fakultatív anaerob nitrát-redukáló szervezeteket alacsony számban detektáltunk a törzsek között. A D-glükóz 24 órán, illetve 1 héten belül történő hasznosítására a vizsgált izolátumoknak szintén csak kis hányada volt képes. Ezen kívül szintén kevés törzs adott pozitív eredményt a metilvörös- és Voges-Proskauer reakciókban (8. táblázat). A fenti eredmények a tenyészthető baktériumközösség anyagcseréjének alapvetően aerob légző jellegére utalnak. A fenti általános jellegzetességeken túl az α-proteobaktériumokra az eszkulin

bontása,

β-proteobaktériumokra

a

mozgásképesség

volt

jellemző.

A

γ-

proteobaktériumként azonosított törzsek több mint 50%-a adott pozitív eredményt az oxidáz tesztben, a D-glükóz egy héten belül történő oxidatív hasznosításában, a nitrát nitritig történő redukciójában és a kazein bontásában. A Bacteriodetes csoport izolátumainak jellemzője a nitrát nitrogénig, illetve ammóniáig történő redukciója volt. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok esetében a zselatin bontása volt további közös tulajdonság. A legkevésbé aktív 82

törzscsoport a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte: az egyetlen teszt, amelyben többségük pozitívnak bizonyult, az eszkulin hidrolízise volt. Fontos azonban megemlíteni, hogy az összes cellulóz bontására képes törzs ebbe a csoportba nyert besorolást (21. ábra). A Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó törzsek többsége (45 törzs) Gram-pozitívnak bizonyult. A vizsgált törzsek közül majdnem az összes kataláz pozitív volt, több mint 50%-uk volt képes a zselatin bontására, és a törzsek közel fele hidrolizálta az eszkulint. Fakultatív anaerob nitrát redukcióra képes szervezetet rendkívül alacsony számban detektáltunk a törzsek között. Kevés törzs adott pozitív eredményt a metilvörös- és a Voges-Proskauer reakciókban (9. táblázat). Az α-proteobaktériumok közé sorolt törzsek többsége kataláz pozitív szervezet volt, a tween 80 bontásán túl a D-glükóz egy héten belüli oxidatív hasznosítását említhetjük közös tulajdonságukként. A γ-proteobaktériumok oxidáz és kataláz pozitív izolátumai a többi törzscsoporthoz képest aktívabbnak bizonyultak a vizsgált tesztekben, többek között egyes biopolimerek bontásában és a nitrát nitritig történő redukciójában. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe sorolt törzsek többsége mozgásra képes szervezet volt. Ezek a törzsek a γ-proteobaktérium izolátumokhoz hasonló arányban hasznosították a D-glükózt oxidatív, illetve fermentatív módon. További jellemző tulajdonságuk a zselatin és a tween 80 bontása volt. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok törzsek csoportja alapvetően inaktívnak mutatkozott a vizsgált tesztekben, az egyetlen nagy arányban megfigyelt pozitív teszteredmény a D-glükóz egy héten belüli oxidatív hasznosításában mutatkozott, valamint említésre méltó, hogy az egyetlen cellulázpozitív törzs is ebbe a filogenetikai csoportba nyert besorolást (22. ábra, 9. táblázat).

83

13 19 7

γ-proteobaktériumok 22

2

1

14 11

16 4 817 21 12 6 5

18

9

23

nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok

10

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok 0

-50

50

Axis 1

100

tween 80 hasznosítás

0 13 15 44 13 11

75 0 75 0 92 0 78 0 73 0 30 22

celluláz aktivitás

keményítő hidrolízis

zselatin hidrolízis

kazein hidrolízis

eszkulin hidrolízis

Voges-Proskauer reakció

13 25 0 38 38 0 50 0 0 0 0 25 0 0 100 0 38 13 0 0 13 0 13 100 0 0 0 0 13 0 0 13 13 25 31 23 15 54 38 15 77 38 23 54 8 46 31 23 31 62 46 33 0 0 44 11 0 56 22 0 11 56 78 11 0 44 11 44 13 13 0 33 20 20 67 7 0 40 7 40 13 13 47 40 100 4 4 0 4 4 4 26 4 0 0 0 7 19 0 52 11 37

metilvörös reakció

D-glükóz fermentatív hasznosítása (1 hét)

100 38 77 100 93 93

NO3-NH3

D-glükóz oxidatív hasznosítása(1 hét)

38 38 54 56 27 11

NO3-N2

gázteremlés O/F médiumban

13 0 0 56 87 100

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

NO3-NO2

8.

indol triptofánból

7.

H2S ciszteinből

6.

D-glükóz fermentatív hasznosítása (24h)

2.

mozgás

5.

D-glükóz oxidatív hasznosítása (24h)

1.

ammonifikáció

4.

kataláz aktivitás

Alfa Béta Gamma CFB Low GC High GC

3.

oxidáz aktivitás

21. ábra A kiskunsági Kelemen-székről 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredmények alapján, standardizált PCA segítségével

Gram reakció

Axis 2

60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80

kis G+C tartalmú Gram-pozitívok 20 Bacteriodetes 3

15

8. táblázat A kiskunsági Kelemen-székről 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált baktériumtörzsek összesített adatai a hagyományos tesztekben mutatott százalékos pozitív eredmények feltüntetésével

84

Axis 2

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50

1

9

Kis G+C tartalmú Gram-pozitívok

7 12

8

18

16

5

4

19

17

11

10

15

3

14 20

nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok

γ-proteobaktériumok 13 6

2

α-proteobaktériumok -80

-60

-40

-20

0 20 Axis 1

40

60

80

100

D-glükóz fermentatív hasznosítása (1 hét)

celluláz aktivitás

D-glükóz oxidatív hasznosítása(1 hét)

tween 80 hasznosítás

47 6 82 30 60 100 44 22 78 31 8 44

keményítő hidrolízis

D-glükóz fermentatív hasznosítása (24h)

0 0 0 3

zselatin hidrolízis

D-glükóz oxidatív hasznosítása (24h)

24 6 12 6 30 40 30 20 22 11 44 0 14 6 6 33

kazein hidrolízis

kataláz aktivitás

0 53 100 0 6 59 0 0 41 0 80 90 30 10 40 40 20 60 78 22 100 11 22 44 44 33 89 97 6 100 3 8 81 6 3 14

eszkulin hidrolízis

oxidáz aktivitás

9. 10. 11. 13. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

Voges-Proskauer reakció

8.

NO3-NH3

7.

NO3-NO2

5.

H2S ciszteinből

4.

mozgás

3.

ammonifikáció

2.

metilvörös reakció

Alfa Gamma LowGC High GC

1.

Gram reakció

22. ábra A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált törzscsoportok elkülönülése a hagyományos tesztekben mutatott pozitív eredményeik alapján, standardizált PCA segítségével

6 20 22 0

88 90 78 22

0 0 0 3

9. táblázat A tiszántúli Nagy-Vadasból 2004 áprilisában vett nád biofilm mintából izolált baktériumtörzsek összesített adatai a hagyományos tesztekben mutatott százalékos pozitív eredményeik feltüntetésével

85

A pH- és sótűrés vizsgálatát célzó tesztek eredményei szerint a két mintavételi területről származó törzsek túlnyomó többsége számára az 5 és 7%-os sókoncentrációk, valamint a pH 8 érték bizonyultak optimálisnak a növekedéshez. A tenyésztés során sikeresen izoláltunk halo- és alkalitoleráns, illetve kifejezetten alkalofil törzseket is. Az egyes törzsek eredményeit a többi fenotípusos teszteredményhez hasonlóan filogenetikai csoportonként hasonlítottuk össze (23. és 24. a-b ábrák). α-proteobaktériumok

a) növekedést mutató törzsek (%)

100

β-proteobaktériumok

80

γ-proteobaktériumok 60

Bacteriodetes 40 20 0

pH7

pH8

pH9

pH10

pH11

α-proteobaktériumok

b) 100

növekedést mutató törzsek (%)

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok) Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

β-proteobaktériumok

80

γ-proteobaktériumok

60

Bacteriodetes 40 20

0 0% NaCl

5% NaCl

7% NaCl

10%NaCl

12% NaCl

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok) Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

23. ábra A Kelemen-székről kitenyésztett baktériumtörzsek pH (a) és sótűrése (b), filogenetikai csoportonként összesítve A 23. a) ábrán látható, hogy a Kelemen-szék Gram-negatív festődésű (proteobaktérium és Bacteriodetes) törzscsoportok inkább alkalitoleráns sajátságokat mutattak, pH 9 érték felett a törzseknek csak kis százaléka volt képes növekedni (a Bacteriodetes csoportba sorolt

86

törzsek pH 11 értéknél már egyáltalán nem mutattak növekedést). A mérsékelten alkalofil jellegeket hordozó (kis és nagy G+C tartalmú) Gram-pozitív festődésű törzscsoportokat a növekedésükhöz szükséges pH 8 és 9 optimum értékek mellett a törzsek nagyobb százalékára kiterjedő szélesebb pH tartomány jellemezte. A Nagy-Vadas esetében a két azonosított proteobaktérium csoport törzsei 7-es és 8-as pH értékű, valamint NaCl-mentes tápközegben hasonló arányban mutattak növekedést, azonban az ennél magasabb alkalinitási értékek, illetve sótartalom mellett csak az α-proteobaktérium törzsek jelentős része volt képes növekedésre. A γ-proteobaktérium törzsek számára a pH 7 és 8 értékek, illetve az 5 és 7%-os sótartalom volt optimális a növekedéshez. A kis és nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok törzscsoportjai hasonló pH tűréssel rendelkeztek: pH 7 és 9 között 80-100%-uk mutatott növekedést, pH 10 és pH 11-es értékeknél mindkét csoport törzsei között hasonló arányban találtunk alkalofil törzseket (24. a ábra). A Kelemen-szék nád biofilm mintájából izolált törzsek sótűrés vizsgálatának eredményei (23. b ábra) arra utalnak, hogy az izolált törzsek többsége, a Bacteriodetes csoport és a β-proteobaktériumok egy részének kivételével NaCl-mentes közegben nem volt képes növekedni. Az α-proteobaktériumok törzsei a másik két proteobaktérium, illetve a Bacteriodetes csoporthoz képest nem az 5-7%-os, hanem inkább a 7-10%-os sótartalmú tápközegben mutatott optimális növekedést. Az α-proteobaktériumokon kívül 10%-os sókoncentráció mellett a két Gram-pozitív csoport törzsei növekedtek nagy számban, valamint ezen szervezetek közel 40%-a volt képes a 12%-os sókoncentráció tolerálására is. A NagyVadas törzsei esetében említésre méltó, hogy sótűrés tekintetében a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumtörzsek nagy hányada széles sókoncentráció tartományban (5-12%) volt képes növekedni, ez a kis G+C tartalmú Gram-pozitívok esetében 5 és 10% volt (24. b ábra). A törzsek fenti pH-és sótűrési tesztekben mutatott eredményei arra utalnak, hogy a tenyésztéssel feltárt nád biofilm baktériumok képesek a magas pH és a viszonylag nagy sótartalommal jellemezhető környezethez való adaptációra.

87

növekedést mutató törzsek (%)

a)

α-proteobaktériumok

100

γ-proteobaktériumok

80 60

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

40 20 0 pH7

pH8

pH9

pH10

pH11

α-proteobaktériumok

b) növekedést mutató törzsek (%)

Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

100 80

γ-proteobaktériumok

60 Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

40 20 0 0% NaCl

5% NaCl

7% NaCl

10%NaCl

12% NaCl

Firmicutes (kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok)

24. ábra A Nagy-Vadas nád biofilmjéből kitenyésztett baktériumtörzsek pH (a) és sótűrése (b), filogenetikai csoportonként összesítve A velencei-tavi törzsekhez hasonlóan a DNS izolálást és a 16S rDNS régió PCR-el való felszaporítását követően a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilmjéből származó törzseit is ARDRA mintázatuk alapján csoportosítottuk (Függelék 3-4. táblázat). Az eltérő hasítási mintázatok alapján közülük összesen 33 (Kelemen-szék), illetve 20 (Nagy-Vadas) csoportot hoztunk létre. A két mintavételi terület nádasainak biofilmjéből izolált törzsek taxonómiai helyzetét a reprezentáns törzsek 16S rDNS parciális szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramok mutatják be (25-26. ábra).

88

KB135 (AM902205) Agrobacterium albertimagni (DQ363142) 100 KB119 (AM 902203) Paracoccus carotinifaciens (AB006899) 96 KB40 (AM902202) Acidovorax temperans (AY880181) 98 86 9 7 KB50 (AM902201) Acidovorax delafiledii (AF332187) 100 80 KB18 (AM902199) 100 Hydrogenophaga sp. (AM26353 6) Hydrogenophaga taeniospiralis (AF0 78768) KB13 (AM902193) 83 100 KB46 (AM902196) Pseudomonas anguilliseptica (AM263520) 100 100 KB103 (AM902197) Pseudomonas stutzeri (U65012) 97 99 KB88 (AM902198) Pseudomonas fluorescens (DQ439976) 100 Yersinia intermedia (AF366380) 88 KB30 (AM902194) 71 Yersinia aldovae (AJ871363) KB9 (AM902262) KB54 (AM902206) 84 100 Sphingobacterium sp. (AY571816) Pedobacter in sulae (EF100697) 100 91 KB87 (AM902208) 100 Flavobacterium sp. (AM493418) Flavobacterium aquidurense (AM17739 2) 100 KB79 ( AM902255) Strep tomyces flavofungini (EF571003) 62 100 KB111 (AM9 02259) Dietzia natronolimnea (AJ717374) Cellulomononas terrae (AY884570) 75 KB23 (AM902253) 98 77 KB113 (AM 902254) 42 Cellulomonas sp. (Y09656) 100 63 KB26 (AM902252) Cellulomonas flavigena (AF14 0036) KB74 (AM902258) 100 S anguibacter marinus (AJ783958) 68 KB105 (AM902257) 78 Sanguibacter inulinus (X79452) 77 KB12 (AM902250) 100 Plantibacter sp. (AM396918) Plantibacter flavus (AY27550 9) KB100 (AM902256) 99 Arthrobacter agilis (AF440440) 81 100 KB123 (AM90226 0) Kocuria rosea (AM397645) 51 Nesterenkonia sandarakina (AY588277) 100 KB109 (AM902249) 65 Nesterenkonia sp. (DQ108403) 86 KB5 (AM9 02247) Nesterenkonia luteus (AY58 8278) KB89 (AM9022 42) 100 72 KB11 4 (AM902243) 87 Bacillus sp. (DQ448 755) 68 KB72 (AM902192) Bacillus horikoshii (DQ36 3137) 100 KB104 (AM902245) 88 KB80 (AM902244) 100 71 Planococcus sp. (DQ6 43135) Planococcus maritimus (DQ333301) 78 100 KB2 (AM902239) Bacillus licheniformis (EF423608) 69 KB57 (AM902240) 99 55 KB86 (AM902241) Bacillus firmus (AJ491843) Thermodesulfobacterium thermophilum (AF334601) 100

99

99

68

α- proteobaktériumok

β-proteobaktérium ok

γ-proteo baktériumok

Bacteriodetes

A ktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

Firmicutes (kis G+C tart almú Gra m pozitív baktériumok)

0.05

25. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nád biofilm mintáiból 2004 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

89

VB45 (AM902237) 90 100 Afipia sp. (AJ864853) Bosea thiooxidans (AY488508) VB43 (AM902233) 100 Paracoccus carotinifaciens (AB006899)

99

100 70 100

VB93 (AM902229) Halomonas alkantarctica (AJ564880)

100

VB31 (AM902232) Acinetobacter lwoffii (AM284986)

VB26 (AM902231) Pseudomonas marginalis (AM263525) VB97 (AM902230) 100 100 Shewanella putrefaciens (X81623) VB58 (AM902227) 99 Xanthomonas sp. (AJ130782) 100 Xanthomonas campestris (AF123092) VB23 (AM902224) 100

72

α- proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

100

Microbacterium oxydans (AM237353) VB16 (AM902223) 98 Microbacterium ginsengisoli (AB271048) VB28 (AM902225) 100 Microbacterium testaceum (DQ122218) VB12 (AM902221)

99 77

99

100

60

VB114 (AM902220) Nesterenkonia sandarakina (AY588277) 100 Nesterenkonia sp. (AM051260) 98 VB118 (AM902222) Nesterenkonia halophila (AY820953) VB25 (AM902226) 99 Cellulomonas flavigena (AF140036) VB72 (AM902228) 100 Nocardiopsis exhalans (AB368714) VB78 (AM902211) 100 Planococcus maritimus (DQ333301) 54 95

VB56 (AM902209) Planococcus southpolaris (AJ314745) VB91 (AM902212) 54 83 Jeotgalibacillus alimentarius (AF281158) VB86 (AM902214) 100 100 Bacillus firmus (EF032672) VB98 (AM902213) 100 Staphylococcus lentus (D83370) Thermodesulfobacterium thermophilum AF334601 72

A ktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

Firmicutes (kis G +C tartalm ú Gram pozitív baktériumok)

0.05

26. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nád biofilm mintáiból 2004 áprilisában izolált baktériumtörzsek, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

90

A reprezentáns törzsek azonosítása révén a Kelemen-szék esetében összesen 26, a Nagy-Vadas esetében 18 különböző fajt/nemzetséget sikerült detektálnunk. A Kelemenszék 8, a Nagy-Vadas 7 ARDRA-reprezentánsa alacsony (≤97%) szekvencia-hasonlóságot mutatott már leírt fajokkal, ennek alapján lehetséges, hogy ezek a törzsek új fajok képviselői (Függelék 3-4. táblázat). A kelemen-széki törzsek közül 27 a nagy, 15 a kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte. A proteobaktériumok közül a legtöbb (13) törzs a γproteobaktériumok körébe tartozott, az α- és a β-proteobaktériumok közé egyaránt 8-8, a Bacteriodetes csoportba 9 törzs nyert besorolást. A Nagy-Vadasról származó törzsek közül a legtöbb törzs (36) szintén a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte, míg a kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokhoz összesen 9 izolátum nyert besorolást. A proteobaktériumok közül a legtöbb (13) törzs ugyancsak az α-proteobaktériumok körébe került, míg a γ-proteobaktériumok közé 10 törzs tartozott. A törzsek csoportosításának és azonosításának eredményeit a Függelék 3. és 4. táblázata tartalmazza. A táblázatokban a csoportokhoz tartozó törzsek teszteredményeit százalékos formában tüntettük fel. A törzseknek 10 (Kelemen-szék), illetve 21%-a (Nagy-Vadas) tartozott az αproteobaktériumok közé. A Kelemen-székiek mindegyikét alkalikus, a Nagy-Vadasról származókat alkalikus és Caulobacter táptalajról izoláltuk. pH-tűrés szempontjából alkalitoleránsnak bizonyultak, míg a sótűrés tekintetében inkább halofil jelleget mutattak. A sótűrési vizsgálatok eredményeinek hátterében (miszerint az α-proteobaktériumok törzsei inkább a 7-10%-os sótartalmú tápközegben mutattak optimális növekedést) az állhat, hogy a csoport törzseinek többségét Paracoccus carotinifaciensként azonosítottuk. A Kelemen-szék ezen izolátumai jellemzően eszkulin és tween 80 bontására képes szervezetek voltak. A halofil Paracoccusok speciális, ornitin tartalmú külső membránja szerepet játszhat sótűrésükben (Wilkinson és mtsai, 1982). A Pholidota articulata epifita trópusi orchidea gyökérkörnyezetéből származó mikróbaközösségek vizsgálata során a Paracoccus nemzetség auxin-termelésre képes képviselőit is kimutatták (Tsavkelova és mtsai, 2007). A Nagy-Vadas összesen 3 törzse az Afipia, egy Kelemen-székről származó törzs pedig az Agrobacterium nemzetséget képviselte. Utóbbi oxidatív anyagcseréjű törzs képes volt az eszkulin és a tween 80 hidrolízisére. Az általunk identifikált A. albertimagni faj képviselőit etiópiai pillangósok családjába tartozó növényfajok gyökérkörnyezetéből is leírták (Woldemeskel és mtsai, 2005). Egy vízi makrofita, a fésűs békaszőlő (Potamogeton pectinatus) felületéről izolálták a faj arzénbontásra képes törzsét (Salmassi és mtsai, 2002). A nemzetség

91

jelenlétét a velencei-tavi nádasállományok biofilmjéből szintén tavasszal vett mintából sikerült kimutatnunk. A nemzetség növénypatogén fajaival kapcsolatos vizsgálatok eredményeit számos publikáció tárgyalja, azonban az Agrobacteriumok szerepe egyszikűek esetében még nem tisztázott. β-proteobaktériumokat csak a Kelemen-szék nád biofilmjéből sikerült izolálnunk, a csoport két nemzetségének (Acidovorax, Hydrogenophaga) képviselőit identifikáltuk. Ezek a törzsek pH 7 és 8 értékek, valamint 5 és 7% sókoncentrációk mellett mutattak optimális növekedést. Mindegyikük képes volt aktív mozgásra és a tween 80 hidrolízisére. A Velenceitó nád biofilmjéből szintén tavaszi mintavétel során izoláltuk a fenti két nemzetség képviselőit. A Hydrogenophaga nemzetség tagjait kimutatták a nádon kívül más makrofiton asszociált biofilmekből is (Salmassi és mtsai, 2006). A nemzetség képviselői kemoorganotróf vagy kemolitoautotróf növekedésre is képesek. Elfogadják energiaforrásként a hidrogént, szénforrásként pedig a szén-dioxidot (Kämpfer és mtsai, 2005). Az Acidovorax nemzetség tagjai elsősorban szénhidrátokat oxidálnak aerob körülmények között, de egyes fajaik (pl. az A. delafieldii és az A. temperans) denitrifikációra is képesek (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). PGPR-baktériumok borsnövényekre gyakorolt hatásának vizsgálata során többek között az Acidovorax nemzetség képviselőit is azonosították Kang és munkatársai (2007). A Velencei-tavon végzett vizsgálatok során mindhárom mintavételi területen, mindkét időpontból származó nád biofilm mintában sikerült kimutatnunk különféle Pseudomonas fajokat. A kelemen-széki mintából hasonlóképpen ezeket a szervezeteket izoláltuk a legnagyobb számban. Jellemző tulajdonságuk az oxidáz és kataláz pozitivitás és kazein bontás volt. Egyes tesztek (pl. D-glükóz egy héten belül történő hasznosítása, ammonifikáció, tween 80 bontása) tekintetében variábilisnak mutatkoztak. Optimális növekedést 5 és 7%-os sókoncentrációk, illetve pH 7 és 8 értékek mellett mutattak. A nemzetség tagjai közül a P. anguilliseptica, P. fluorescens és a P. stutzeri fajokat identifikáltuk. A nemzetséget a NagyVadas mindössze két törzset számláló csoportja reprezentálta. A két izolátum variábilisnak mutatkozott több teszt (pl. D-glükóz hasznosítása, kénhidrogén termelése ciszteinből, nitrát redukciója) szempontjából. A reprezentáns törzset mint Pseudomonas marginalist identifikáltuk. Ude és munkatársai (2006) biofilm képzési sajátságaik vizsgálatakor ezt a fajt más környezeti Pseudomonas izolátumokkal együtt cellulóztartalmú mátrix képzésére találták képesnek. Metabolikus sokfélesége mellett ez a jellegzetesség fontos tagjává teszi ezt a fajt a nádfelszíni biofilmek baktériumközösségeiben.

92

A Kelemen-szék nád biofilm mintájából az Enterobacteriaceae család képviselőit is azonosítottuk. A Yersinia nemzetségbe három, fakultatív anaerob anyagcseréjű törzs került. Közös sajátságaikként egyedül a tween 80 bontását említhetjük meg. A nemzetség több faja (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterolytica) humán- és állatpatogén tulajdonságukról ismert (Brubaker, 1991; Hinnebusch, 1997; Neubauer és mtsai, 2000), míg az általunk identifikált Y. aldovae és Y. intermedia fajok széles metabolikus aktivitással rendelkeznek és közönséges előfordulásúak vízi környezetekben (Brenner és mtsai, 1980; Bercovier és mtsai, 1984). A Nagy-Vadasról azonosított egyéb γ-proteobaktérium nemzetségeket kisszámú (1-3) törzs képviselte. A Shewanella putrefaciensként azonosított reprezentáns 3 tagú ARDRA csoportot képviselt, melyek mindegyikét tengervizes táptalajról izoláltuk, és teszteredményeik néhány kivételtől eltekintve (pl. zselatin és tween 80 hidrolízis, oxidáz és kataláz teszt) variábilisak voltak. A fajt a Velencei-tó tavaszi, Fürdetőről származó nád biofilm mintájából is kimutattuk. Szintén három, zselatin- és tween 80 bontó törzs képviselte az Acinetobacter lwoffii fajt. Ezek a Voges-Proskauer tesztben negatív izolátumok nem termeltek kénhidrogént ciszteinből, sem indolt triptofánból. A nemzetség tagjai talajokban, vizekben, szennyvizekben is gyakoriak. Anyagcseréjüket tekintve szigorúan aerob légző szervezetek. Főként szénhidrátokat és szerves savakat hasznosítanak (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994). Jelenlétüket Kovács és mtsai (1999) gyékény, Micsinai és mtsai (2003) nád rizoplánban is kimutatták. A γ-proteobaktériumok további két nemzetségének jelenlétét mintánkban egy-egy izolátum azonosítása igazolta. Egy Caulobacter táptalajról izolált, oxidáz és kataláz pozitív törzs a nitrát redukciós tesztek kivételével a legtöbb vizsgált tulajdonságra nézve pozitív volt, és a Xanthomonas nemzetség tagjaként határoztuk meg. Faji szinten nem sikerült ezt a törzset identifikálnunk, parciális szekvenciája csak 96%-ban hasonlított egy, az adatbázisban található X. campestris szekvenciához. A nemzetség számos faja ismert különféle növényi megbetegedésekben játszott szerepéről. A Xanthomonas nemzetség taxonómiája az utóbbi időben sok változáson ment keresztül, számos, korábban különálló fajt ma már mint patovart tartanak számon (Trebaol és mtsai, 2000). A nemzetségnek nád növénnyel való kapcsolatáról eddig még nem állnak rendelkezésre adatok. A Halomonas nemzetséget szintén egy törzs képviselte, amelyet a Xanthomonas törzshöz hasonlóan alacsony

(97%)

szekvencia-hasonlósággal

azonosítottunk

a

H.

alkantarctica

faj

képviselőjeként. A nemzetségbe tartozó baktériumok a sókoncentráció széles tartományát képesek tolerálni. Halotoleráns szervezetekként gyakori előfordulásúak szikes tavakban (Ventosa és mtsai, 1998). Számos szerves vegyület bontására képesek és egyes képviselőik 93

toxikus fémionok akkumulációjára is képesek (Duckworth és mtsai, 1996, 2000; Vreeland és mtsai, 1999). A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé 15 Kelemen-székről származó törzs került, amelyek többsége magas pH- és nagy sókoncentrációt is tolerált. Az ARDRA reprezentánsok azonosítása révén többségük az alkalitoleráns, illetve alkalofil Bacillus licheniformis, B. firmus és B. horikoshii fajokat képviselte. A nemzetség jelenlétét mind a tavaszi, mind a nyári velencei-tavi mintákból kimutattuk. Annak ellenére, hogy a Bacillusok széleskörű

dekomponáló

aktivitásuk

révén

a

természetes

környezetek

bakteriális

közösségeinek fontos tagjaiként ismeretesek, az általunk Bacillusként azonosított törzsek relatíve inaktívnak bizonyultak a vizsgált fenotípusos tesztekben. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe tartozó kelemen-széki törzsek közül 3 izolátumot a zselatin, a tween 80 és a DNS hidrolízisének képessége jellemezett. Mindegyikük növekedést mutatott 10%-os sókoncentráció mellett. Ezeket a törzseket a szekvencia analízis eredményei alapján a Planococcus maritimus faj tagjaként azonosítottuk. A faj képviselői gyakran izolálhatók tengervízből (Claus és mtsai, 1999), de képviselőiket kimutatták már tengeri algákhoz és cianobaktériumokhoz asszociált baktériumközösségek tagjaként is (Reddy és mtsai, 2002; Ivanova és mtsai, 2006). A Nagy-Vadas 9, kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokhoz sorolt kataláz pozitív törzse egy kivétellel tengervizes táptalajról került izolálásra. Az ARDRA reprezentánsok azonosítása révén többségük (5 törzs) a Kelemen-szék nád biofilmjében is detektált P. maritimus fajt képviselte. 10% sókoncentráció mellett mindegyikük mutatott növekedést és a zselatin, a keményítő és a tween 80 hidrolízisének képessége jellemezte őket. Egy izolátumot (Caulobacter táptalajról) a P. southpolaris faj tagjaként sikerült identifikálni. Ez a törzs a másik Planococcus fajba sorolt törzsekhez képest több tesztben (pl. ammonifikáció, kénhidrogén termelése ciszteinből, kazein és keményítő hidrolízis) eltérő eredményt adott. További egy, nem mozgó, ammonifikációra és ciszteinből kénhidrogén termelésére képes, számos hidrolízis tesztben pozitív törzs Staphylococcus lentusnak bizonyult. 1-1 törzs a B. firmus fajt, valamint a Jeotgalibacillus nemzetséget képviselte. Mindkét törzs nőtt 5 és 10%-os sókoncentrációk mellett, valamint a vizsgált legmagasabb (pH 11) értéken. Mind a Kelemen-szék, mind a Nagy-Vadas nád biofilm baktériumainak kitenyésztett törzsei legnagyobb számban (27, illetve 36) a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselték. Többségük 5 és 10%-os sótartalom és pH 8-9 értékek mellett mutatott növekedést, a Nagy-Vadas ebbe a csoportba sorolt törzseinek egy része azonban

94

ennél magasabb értékeknél is képes volt növekedésre. Említésre méltó, hogy a 27 Kelemenszékről izolált törzs a reprezentánsok identifikációja révén összesen 8 különféle nemzetségbe (Nesterenkonia, Cellulomonas, Arthrobacter, Sanguibacter, Kocuria, Dietzia, Streptomyces és Plantibacter) nyert besorolást, míg a 36 Nagy-Vadasról származó törzset ehhez képest összesen négy, a Nesterenkonia, a Cellulomonas, a Microbacterium és a Nocardiopsis nemzetségek képviselőiként azonosítottuk. A Kelemen-szék esetében a Pseudomonason és a Bacilluson kívül kívül a Nesterenkonia nemzetséget képviselte a legtöbb (9) törzset számláló csoport. A kelemen-széki törzsek az eszkulin és a tween 80 hidrolízisén kívül alapvetően inaktívak voltak a vizsgált tesztekben. A kemoorganotróf, mérsékelten halofil nemzetség tagjai közül a N. sandarakina és N. luteus fajokat azonosítottuk. A nemzetség tagjai közül a Nagy-Vadas esetében a legtöbb törzset (22) ugyancsak a N. sandarakina faj tagjaként azonosítottuk, valamint egy törzs esetében a szekvencia-hasonlóság mindössze 96%-nak adódott egy N. halobia szekvenciával. Ezeknek a kataláz pozitív törzseknek a jellegzetessége a D-glükóz egy héten belüli oxidatív hasznosítása, valamint a pozitív metilvörös teszt volt. A különféle hidrolízis tesztekben alapvetően inaktívnak bizonyultak. A nemzetség alkalofil és mérsékelten halofil fajait (N. aethiopica, N. halobia) korábban szintén szikes tavakból izolálták (Martins és mtsai, 2001; Delgado és mtsai, 2004). A N. halobiat eredetileg Micrococcus halobilusként írták le Japánban sólepárlóból (Onishi és Kamekura, 1972). A Fertőből származó nádrizómák felületéről Borsodi és mtsai (2005b) az izolált törzsek között szintén kimutatták a N. halobiat. A Cellulomonas nemzetség jelenlétét szintén mindkét mintavételi terület nád biofilmjéből sikerült igazolnunk (összesen 6 törzs a Kelemen-székről, valamint egyetlen Nagy-Vadasról származó izolátum). A C. flavigena és C. terrae fajokkal mutatott alacsony (≤97%) parciális szekvencia-hasonlóság alapján feltételezhető, hogy a nemzetség új faját/fajait képviselő izolátumokról lehet szó. A Cellulomonas nemzetség tagjainak legjellegzetesebb tulajdonsága a cellulóz bontásának képessége volt. Aerob és anaerob körülmények között egyaránt tudnak növekedni (anoxikus környezetben nitrátot használnak elektron akceptorként). A természetben a cellulózbontás általában sokféle szervezet közreműködésével történhet. Szárazföldi körülmények között a gombák jóval nagyobb szerepet kapnak a komplex szénhidrátok lebontásában. Itt az általában alacsony nedvességtartalom, a szerves nitrogénformák alacsony hozzáférhetősége előnyt biztosít számukra a baktériumokkal szemben, és extracelluláris cellulázaik, lignolitikus, aktív oxigénformákat termelő enzimeik révén hatékonyan bontják a talajban felhalmozódó növényi anyagokat, a lignint is beleértve 95

(Lynd és mtsai, 2002). Ez azonban nem zárja ki a cellulózbontó baktériumok (Cytophaga, Bacillus és Cellulomonas) talajokban való előfordulását. Mindenesetre abból, hogy a talajmélységgel a cellulózbontás intenzitása csökken, arra lehet következtetni, hogy szárazföldi ökoszisztémákban a cellulóz-degradáció elsősorban aerob folyamat (Vardavakis, 1989). A cellulóz bontásában szerepet játszó baktériumok általában vagy obligát anaerob fermentatív szervezetek, mint például a Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Fibrobacter, Acetivibrio; vagy aerob szervezetek, amelyek a csúszó mozgásra képes Cytophaga, Sporocytophaga, vagy a Gram-pozitív Cellulomonas és Thermobifida nemzetségekbe tartoznak. A cellulózbontók között számos termofil mikróba található, de ezek a tavakban uralkodó természetes körülmények között aligha járulnak hozzá a cellulóz degradációjához. Víz által befolyásolt, elárasztott környezetekben azonban a szerves anyagok lebontása során az anaerob folyamatok dominálnak, így itt a baktériumok előnyhöz juthatnak a gombákhoz képest. Rizsföldek talajában obligát anaerob fermentatív anyagcseréjű cellulózbontó Clostridum fajok jelenlétét mutatták ki Chin és mtsai (1998), de emellett nagy tömegben izoláltak fermentációra is képes Bacillus fajokat, Verrucomicrobia, Bacteroides divízóba és Actinobacteria osztályba tartozó szervezeteket. Chin és mtsai (1998) rizsföldek baktériumközösségeit vizsgálva a cellulóz bontására képes izolátumok között egy új leszármazási vonalat képviselő, α-proteobaktérium rokonsági körbe tartozó, fakultatív fermentatív – acetátot és etanolt termelő - törzset (KCB90) is találtak, amelyről vizsgálataik eredményeképpen feltételezték, hogy nincs jelen nagy számban a környezetben. Vélhetően gyökér-asszociált és szeneszcens növényi anyagokat értékesíthet. Az Arthrobacter nemzetség jelenlétét a Kelemen-szék nád biofilm baktériumai között siekrült igazolnunk, négy eszkulin-bontó törzs révén. Az ARDRA csoport reprezentáns parciális 16S rDNS szekvenciája mindössze 96%-os hasonlóságot mutatott egy A. agilis faj szekvenciájával. A korábban Micrococcus agilisként leírt faj közönséges előfordulású talajokban és vízi környezetekben (Koch és mtsai, 1995). A nemzetség két másik faját a Velencei-tó nád biofilmjéből származó törzsek képviselték. Az Arthrobacterek jellemzően a talajból, bomló szerves anyagokból izolálható aerob, oxidatív anyagcseréjű baktériumok. Komplex poliszacharid-bontó képességüknél fogva a növényi szerves anyag lebontásában játszhatnak szerepet (Gardener és de Brujin, 1998). A Gram-pozitív, oxidatív anyagcserét folytató nemzetség képviselői talajokban általános előfordulásúak, de megtalálhatók édesvízben, tengervízben és szennyvízben egyaránt. A Sanguibacter nemzetség két faját sikerült kimutatnunk a Kelemen-szék nád biofilmjének baktériumközösségeiben. Az ide sorolt törzsek közös jellemzője az eszkulin- és 96

zselatinbontás, valamint a mozgásképesség volt. Ennek a nemzetségnek az első képviselőit szarvasmarhák véréből és tejéből mutatták ki Fernández-Garayzábal és mtsai (1995), a későbbiekben az általunk is detektált S. antarcticust és a S. marinust antarktikus talajból és tengeri üledékből izolálták először (Pascual és mtsai, 1996; Huang és mtsai, 2005). Ennek fényében nem meglepő, hogy az általunk ebbe a csoportba sorolt törzset tengervizes táptalajról sikerült izolálni. A nemzetségnek eddig összesen 6 faja ismert, ebből egyedül a S. soli származik rizoszféra környezetből, egy ginzeng-ültetvény talajából (Kim és mtsai, 2008). A S. marinusként azonosított törzsünk parciális szekvenciája alapján a nemzetség esetleges új faját képviseli. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé tartozó Kocuria rosea fajként két Kelemen-székről származó, kataláz pozitív, eszkulin bontó, alkalofil táptalajról izolált törzset azonosítottunk. Ezt az aerob respiratórikus anyagcserével bíró fajt a Velencei-tó nádasállományainak bifilmjéből is sikerült kimutatnunk, mind a tavaszi, mind a nyári mintavétel során. A tenyésztés során egy alkalofil táptalajon izolált, eszkulin, tween 80 és DNS bontásában pozitív eredményt mutató törzset azonosítottunk a Dietzia natronolimnea faj tagjaként. Ezt a nemzetséget szintén csak a Kelemen-szék mintájából azonosítottuk. A Dietzia fajok széleskörűen elterjedtek vízi környezetekben, pl. mélytengeri üledékek és kelet-afrikai szóda tavak baktériumközösségeinek tagjaiként (Duckworth és mtsai, 1996; Takami és mtsai, 1997; Colquhoun és mtsai, 1998). Képviselőik megtalálhatók voltak a Fertő nádrizomáinak és a velencei-tavi pusztuló nádasállományok rizómáinak belső és külső felületéről kora nyáron izolált törzsek között is (Micsinai és mtsai, 2003; Borsodi és mtsai, 2005b). Szintén

egyetlen,

Kelemen-székről

izolált

törzs

képviselte

a

Streptomyces

nemzetséget. A különféle bontási képességeket tesztelő vizsgálatok többségében a törzs pozitív eredményt adott, valamint képes volt ciszteinből kénhidrogén termelésére. A szekvencia analízis alapján ezt a törzset S. flavofunginiként identifikáltuk. A különféle antibiotikum- és antifungális anyagok termelésére képes aktinobaktériumok, köztük Streptomycesek ipari, illetve egészségügyi célú felkutatása több évtizedes múltra tekint vissza. A különböző természetes környezetek mikrobiális diverzitásának feltárása révén számos, ebből a szempontból értékes mikroorganizmust izoláltak és detektálnak. A számos növényi vonatkozású munka közül példaként említhetjük az erdőtalajból származó Streptomycesek hatásának vizsgálatát a közönséges luc (Picea abies) fitpatogénekkel szembeni védekezésére (Lehr és mtsai, 2008), vagy egy sivatagi zsályafaj (Artemisia tridentata) gyökérkörnyezetének

97

vizsgálatát antifungális anyagokat termelő aktinomicéták felkutatása érdekében (Basil és mtsai, 2004). A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok körébe tartozó kelemen-széki törzsek közül egy eszkulin- és tween 80-bontó törzs képviselte a Plantibacter flavus fajt, melynek típustörzsét a Microbacteriaceae családba tartozó, a filloszféra abundáns tagjainak számító korineform baktériumok vizsgálata és taxonómiai helyzetének tisztázása során fűminták vizsgálatakor írták le (Behrendt és mtsai, 2002). A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok további két nemzetségét csak a Nagy-Vadas nád biofilm mintájában detektáltuk. A reprezentatív törzsek a Microbacterium nemzetség három fajának képviselői voltak. A M. ginsengisoli és M. oxydans fajba sorolt törzsek többé-kevésbé egységes fenotípusos sajátságokkal bírtak, míg a M. testaceum fajhoz sorolt 3 törzs a fenti törzsektől eltérő metabolikus aktivitásokkal bírt. Tengervizes táptalajról származott az a 4 izolátum, amelynek ARDRA reprezentánsát Nocardiopsis exhalansként azonosítottuk. Ezeket a törzseket nagy sókoncentráció- és magas pH értékek tűrése és a nitrát redukció hiánya jellemezte, valamint mindegyikük bontotta a zselatint és a tween 80-at. 7.2.4 Klónkönyvtárak vizsgálata A velencei-tavi kutatásokhoz hasonlóan a tenyésztés mellett a két alföldi szikes tó nád biofilm baktériumközösségeinek faji összetételét is vizsgáltuk DNS alapú molekuláris biológiai módszerrel. Az egyes DNS szakaszok klónozását követően 129 (Kelemen-szék), illetve 158 (Nagy-Vadas) klónt számláló klónkönyvtárat hoztunk létre. A klónokat az izolált törzsekhez hasonló módon ARDRA segítségével csoportosítottuk. Ennek eredményeképpen a Kelemen-szék klónjaiból 36, a Nagy-Vadasról származó klónokból 33 csoportot alakítottunk ki (Függelék 6-7. táblázat). A Kelemen-szék klónkönyvtárában a kovaalga-kloroplasztisz, illetve cianobaktérium DNS-ként azonosított klónok (17, illetve 12 szekvencia) összesen 3 csoportba kerültek, míg további 3, összesen 7 klónt tartalmazó ARDRA csoport reprezentánsa kimérának bizonyult. A Nagy-Vadas esetében kovaalga-kloroplasztiszként 16, cianobaktérium DNS-ként 10 (2 csoport) szekvenciát azonosítottunk, és 3, összesen 9 klónt tartalmazó ARDRA csoport reprezentáns klónszekvenciái bizonyultak kimérának. A baktérium klónok, valamint a 2004 tavaszán a nád biofilm mintákból izolált törzsek filogenetikai csoportonkénti megoszlásának összehasonlítását a 27. és a 28. ábra szemlélteti.

98

Klónozás révén a tenyésztéses vizsgálatok eredményeihez képest a nád biofilmben jelenlévő baktériumközösségek filogenetikai csoportjainak jelentős arányeltolódását tapasztaltuk. α-Proteobaktériumok 100%

β-Proteobaktériumok

80% γ-Proteobaktériumok 60% Firmicutes (kis G+C) 40% Aktinobaktériumok (nagy G+C)

20%

Bacteriodetes

0% törzsek

klónok Fibrobacter/Acidobacteria

27. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása α-Proteobaktériumok 100%

β-Proteobaktériumok

80% γ-Proteobaktériumok 60% Firmicutes (kis G+C) 40% Aktinobaktériumok (nagy G+C)

20%

Bacteriodetes

0% törzsek

klónok Chloroflexi

28. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből származó klónok és baktériumtörzsek filogenetikai csoportok közötti megoszlásának összehasonlítása

99

A szekvenciák közül a Kelemen-szék klónjainak 30, a Nagy-Vadas szekvenciáinak összesen 22%-a eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciával mutatott hasonlóságot, ami a vizsgált nád biofilm baktériumközösségeinek még fel nem tárt, rejtett diverzitására utal. A reprezentatív klónok taxonómiai helyzetét a 16S rDNS parciális szekvencia adatok alapján neighbor-joining módszerrel készült filogenetikai dendrogramokon mutatjuk be (29-30. ábra). A klónok vizsgálata alapján a két alföldi szikes tó nád biofilmjének baktériumközösségei Gram-negatív dominanciával voltak jellemezhetők. A

Kelemen-szék

baktérium

klónjai

közül

a

legkevesebb

(9%)

az

α-

proteobaktériumokat képviselte, közülük három tenyésztésbe nem vont klónok szekvenciáival mutatott hasonlóságot. Faji szinten az Agrobacterium sanguineumot sikerült kimutatnunk. A nemzetséget tenyésztés segítségével is azonosítottuk. Az eredetileg a Balti-tengerből leírt fajjal kapcsolatban több filogenetikai-taxonómiai vonatkozású kutatást végeztek. Több Atlanti-óceánból

származó

Agrobacterium

izolátum

bizonyult

új

fajnak,

amelyek

genotipizálásuk alapján a nemzetség egy elkülönülő leszármazási vonalát képviselik, egyes bifenil-és dibenzofurán bontó A. sanguineum törzseket pedig Porphyrybacter sanguineusként írtak le (Rüger és Höfle, 1992; Hiraishi és mtsai, 2002). A Nagy-Vadas bakteriális klónjainak 19%-a nyert besorolást az α-proteobaktériumok közé. A szigorúan aerob, kemoheterotróf Sphingomonasok

több

biotechnológiai

szempontból

hasznosítható

tulajdonságuk

(xenobiotikumok bontása, különféle exopoliszaharidok és karotinoidok szintézise) miatt számos vizsgálat tárgyát képezik (Ederer és mtsai, 1997; Zablotowicz és mtsai, 1999; White és mtsai, 1996; Silva és mtsai, 2004). Az általunk identifikált S. jaspsi fajt 2007-ben írták le Asker és munkatársai édesvízből. Az Agrobacterium nemzetség tagjait a tenyésztés eredményei alapján nem, csak klónozás segítségével sikerült kimutatnunk. Ezzel ellentétben a Paracoccus nemzetség képviselőinek jelenléte a Nagy-Vadas nád biofilmjében mind a két módszer segítségével igazolást nyert.

100

P28 (AM940072) Agrobacterium sp. (AY826532) Agrobacterium albertimagni (AF316615) 100 P126 (AM940073) 74 Agrobacterium sanguineum (AB062106) 99 P117 (AM940074) 74 uncultured bacterium clone (EF029254) Phenylobacterium koreense (AB166881) 92 P138 (AM940075) 98 uncultured bacterium clone (DQ066963) 43 Ideonella dechloratans (X72724) 98 P91 (AM940076) Pelomonas saccharophila (AB021407) 99 P57 (AM940077) 76 Hydrogenophaga taeniospiralis (AY771764) 73 P23 (AM940078) Hydrogenophaga atypica (AJ585992) 85 68 P134 (AM940079) 84 99 Comamonadaceae baktérium klón (EF370588) Polaromonas hydrogenivorans (DQ094183) 82 P26 (AM940080) 74 100 Dechloromonas denitrificans (AJ318917) 59 P129 (AM940081) Dechloromonas hortensis (AY277621) 100 P140 (AM940082) Aquimonas voraii (AY544768) Rheinheimera aquimaris (EF076758) 59 P128 (AM940083) 100 P45 (AM940084) 78 P35 (AM940085)) Rheinheimera chironomi (DQ298025) 64 P116 (AM940086) Rheinheimera sp. (EF575565) 100 P85 (AM940087) Cellvibrio gandavensis (AJ289162) 97 P38 (AM940088) 68 Gamma-proteobaktérium klón (AF141439) Marinobacter taiwanensis (EU164778) 100 P7 (AM940089) Dyadobacter fermentans (AF137029) 100 P8 (AM940090) Paludibacter propionicigenes (AB078842) 99 P47 (AM940091) 99 100 CFB baktérium klón (AY043735) Sphingoterrabacterium pochensis (AB267718) P94 (AM940092) 100 Pedobacter insulae (EF100697) Sphingobacterium sp. (AY571816) 99 P69 (AM940093) baktérium klón (AB297423) 99 P17 (AM940094) 55 Bacteriodetes sp. baktérium klón (AJ534686) Marinilabila salmonicolor (M62422) 84 P103 (AM940095) 60 P131 (AM940096) 70 98 Flavobacterium sp. (AJ876670) Flavobacterium tegetincola (U85887) 99 P19 (AM940097) 93 Flavobacterium hibernum (AJ251068) 99 P123 (AM940098) 61 69 Flavobacteria baktérium klón (AM279209) 100 P32 (AM940099) Gelidibacter sp. (AY259512) Gelidibacter gilvus (AF001369) 100 P11 (AM940100) 97 baktérium klón (AJ232823) Fibrobacter succinogenes (M62689) 100 P106 (AM940101) Arhtrobacter agilis (EF010549) Thermodesulfobacterium thermophilum (AF334601) 98

64

61

100

α- proteoba ktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Bacteriodetes

Fibrobacter/Aciobacteri a csoport Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram pozitív baktériumok)

0,05

29. ábra A kiskunsági Kelemen-szék nádasállományának biofilmjéből származó klónok, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

101

93 73

V83 (AM940 103) 98 V23

(AM940104)

Agrobacterium al bertimagni (D Q363142)

67

R hizobiu m giardini (U86 344) V88 (AM94 0105)

98 97

Alfa-proteobaktérium klón (AJ888555) 90

α- proteobaktériumok

V72 (AM940 102) Paracoccus sp. (AJ3 09981)

10 0 86

Paracoccus carot inifaciens (AB006899) 1 00

V2 (AM940106) Sphingomonas ja spsi (AB264131)

99

1 00V55 (AM9 40107)

Ag rob acteri um sanguineum (DQ36313 9) V51 (AM940111 )

96

Aquabacterium honkon gens is (DQ489306) 89 V93

(A M940108)

V57 (A M940109)

87

Hydrogenophaga taeniospiralis (AF078768)

66

Hydrogenophaga atypica (AJ585992) V3 (AM940110) V53 (AM94 0112 )

61

V66 (AM940113) 94 94

Ideonella dech lorat ans (X72724)

β-proteob aktérium ok

Ideonel la sp. (AB21123 3) 63

V114 (AM940 114 ) V11 (AM 940115)

99

Ma likia spinosa (AB02 1387) V46 (AM94 011 6)

1 00 97

Polaromonas a quati ca (AM039830) V9 (AM940117)

70 84 92 99

baktérium klón (AY546509 ) V90 (AM940118)

Béta-proteobaktérium klón (AY678517) Methillobaci llus f lagell atus (DQ287787)

V7 (AM940 122)

98 77

Gamma-proteobaktérium k lón (AJ810621) Marinob acter lutaoensis (AF288157) 100

V16 (AM940121) Cellvibr io vulgaris (AF448513)

γ-proteobaktériumok

92 V11 8 (AM940120) 1 00

Rheinheimera sp. (EF575565) Rheinheimera chironomi (DQ2980 25)

1 00V54 (AM940 119 )

Aquim onas voraii (AY 544768) 93 89 50

Flavobacter ium kamogawaensi s (AB275 999) V1 31 (AM940127)

64 92

V4 (AM940106)

98

Flavobacterium colu mna re (AJ49182 4) 99

57

V133 (AM940128) Flavobacter ium filum (DQ3 72981)

V127 (AM940125)

Ba cteriodetes

Fluviicola taffens is (AF493694) 100

100

V50 (AM9401 24) Bacteriodetes sp. kl on (DQ463716)

10 0

V3 5 (A M940123)

Algor iphagus halophi lus (AY264839) 100

V70 (AM940129)

Chloro flexi

Chloroflexi baktérium klón (AY921893 ) Thermo desu lfobacterium thermo phil um (AF334601)

30. ábra A tiszántúli Nagy-Vadas nádasállományának biofilmjéből származó klónok, valamint a velük közvetlen rokonságban álló baktériumok neighbor-joining módszerrel készült dendrogramja (A méretarány 5% nukleotid különbséget jelöl.)

102

A kelemen-széki klónok 14%-adódott β-proteobaktériumok rokonsági körébe tartozónak. E csoport nagyobb diverzitását tártuk fel a tenyésztéshez képest, a Hydrogenophaga nemzetség tagjain kívül a Dechloromonas és a Pelomonas nemzetségek képviselőit is sikerült identifikáltunk. A Dechloromonas nemzetség több faját, köztük a D. hortensist is perkloráttal szennyezett talajból írták le. Bioremediációs célú felhasználásuk lehetősége a humán eredetű, kémiailag rendkívül stabil szennyező vegyület, a perklorát disszimilatív redukciójára való képességükben rejlik (Wolterink és mtsai, 2005). Az általunk identifikált fakultatív aerob D. denitrificans típustörzsét talajlakó Aporrectodea caliginosa földigiliszta faj bélflórájából izolálták. A nitrát nitrogénig történő redukcióján kívül szintén képes a klorát és perklorát redukciójára, valamint számos szerves sav hasznosítására (Horn és mtsai, 2005). Az aerob, nitrogén fixációra képes Pelomonas saccharophila faj korábban a Pseudomonas nemzetséghez tartozott, reklasszifikációja révén ma a Pelomonas nemzetség típusfaja (Xie és Yokota, 2005). Összesen két klón alkotta azt az ARDRA csoportot, amely reprezentatív szekvenciájának analízise alapján a Comamonadaceae családhoz tartozónak bizonyult. Szintén két klón bizonyult hasonlónak egy másik olyan Comamonadaceae klónhoz, amelyet RNS-alapú vizsgálatok során találtak a metilotróf, szénkörforgalomban szerepet játszó bakteriális közösség aktív tagjának édesvízi üledékminták feltérképezésekor (Nercessian és mtsai, 2005). A Nagy-Vadas klónszekvenciáinak 21%-a képviselte a βproteobaktériumokat. Ezek a szekvenciák a Hydrogenophaga, Malikia, Aquabacterium és Ideonella nemzetségek képviselőinek bizonyultak, valamint kis számban környezeti klónok szekvenciáival mutattak hasonlóságot. Többségük vízi környezetek, gyakran szennyezett vizek, vagy kifejezetten szennyvizek mikrobiótájának közönséges előfordulású tagjai. A Kelemen-szék nád biofilmjéből tenyésztés révén is kimutatott Hydrogenophaga nemzetségbe tartozó H. taenospiralis fajt korábban a Pseudomonasok körébe sorolták, a H. defluviit és a H. atypicat eleveniszapos szennyvízből izolálták először (Willems és mtsai, 1989; Kämpfer és mtsai, 2005). Ezek a Comamonadaceae családba tartozó baktériumok kemoorganotróf és fakultatív kemolitoautróf növekedésre is képesek. A szintén ebbe a családba tartozó Malikia spinosa (korábban Pseudomonas) egy szennyvíziszapból származó másik faj, a M. granosa leírását követően került ebbe a nemzetségbe (Spring és mtsai, 2005). Az Aquabacterium honkongensis fajhoz tartozó szekvencia, amellyel az egyik reprezentatív klón hasonlóságot mutatott, ivóvízből izolált törzstől származott. Egyes klónok az adatbázisban található, édesvízi illetve szennyezett talajvíz eredetű Ideonella szekvenciák alapján kerültek azonosításra. A Polaromonas nemzetség tagjai víz-, üledék- és talajmintákban fordulnak elő (Jeon és mtsai, 2004; Kämpfer és mtsai, 2006; Sizova és Panikov, 2007). 103

A Kelemen-székről származó klónszekvenciák közel egyötöde (17%) a γproteobaktériumokat képviselte. A Rheinheimera, Aquimonas és Cellvibrio nemzetségek rokonsági körébe a Nagy-Vadas klónszekvenciái (10%) nyertek besorolást. Ezek az aerob heterotróf, respiratórikus anyagcseréjű szervezetek édesvízi (Aquimonas voraii), tengeri (Rheinheimera sp.) környezetekben közönséges előfordulásúak. Nagy szerves anyag terhelésnek kitett vízi környezetben a γ-proteobaktériumok, köztük a Rheinheimera nemzetség

képviselőinek

számbeli

növekedését

tapasztalták,

ami

a

megváltozott

körülményekhez való alkalmazkodási képességükre utal (Pinhassi és Berman, 2003). A γproteobaktériumok egyes képviselőit (Cellvibrio gandavensis) korábban talajmintákban is detektálták (Mergaert és mtsai, 2003; Romanenko és mtsai, 2003; Saha és mtsai, 2005). A Cellvibrio nemzetség egyes tagjai képesek a pektin és a cellulóz bontására, ezen sajátságaik növény-asszociált környezetben a mikrobióta fontos tagjává teszi őket. A nemzetség tagjai más környezeti mintákban is közönséges előfordulásúak (Humphry és mtsai, 2003). A Kelemen-szék klónjainak közel 30%-a, a Nagy-Vadas klónszekvenciáinak egynegyede nyert besorolást a Bacteriodetes csoportba, amelynek tagjai a tengervíz domináns baktériumcsoportjainak egyikét képezik (Bowman és mtsai 1997; Pinhassi és mtsai, 1997; Glöckner mtsai, 1999) és fontos szerepet játszanak a vízi ökoszisztémák remineralizációs folyamataiban (Kirchman, 2002). A kelemen-széki nád biofilm mintából a vízi környezetekben gyakori előfordulású Flavobacterium és Sphingobacterium nemzetségeken kívül (Jooste és Hugo, 1999), amelyeket izolátumok is képviseltek, a klónozás segítségével további nemzetségek (Dyadobacter, Paludibacter, Gelidibacter) tagjait is identifikáltuk. A Nagy-Vadas esetében szintén detektáltuk (három ARDRA-csoport összesen 16 klónja) a Flavobacterium nemzetséget, közülük egy reprezentánst rendkívül alacsony hasonlósági szinten sikerült azonosítani. Tavi vízmintákból származó izolátumok aktivitását vizsgálva Geller (1986) megfigyelte, hogy Flavobacterium törzsek a komplex, nehezen bontható szubsztrátokat nagyobb hatékonysággal voltak képesek hasznosítani a többi izolátumhoz képest. A biofilmek exopoliszaharid mátrixa a komplex makromolekulák „csapdázása” révén ideális környezetet biztosít, és hozzájárul a baktériumok aktivitásának kifejtéséhez (Battin és mtsai, 2001). Az aerob, kemoorganotróf Dyadobacterek számos szénforrás hasznosítására képesek. A nemzetség több képviselőjét növényi környezetből mutatták ki, a D. fermentanst például kukorica növényről (Chelius és Triplett, 2000), amelynek típustörzse nitrogénlimitált környezetben mutatott optimális növekedést. A Gelidibacter nemzetséget faji szinten nem sikerült identifikálnunk: az adott klón szekvenciája egy sós mocsárból származó izolátummal mutatott 97%-os hasonlóságot. A Flavobacteriaceae családba tartozó nemzetség tagjainak 104

számos faja származik tengeri környezetből, ahol fontos szerepük van az elsődleges produkció révén keletkező szerves anyagok mineralizációjában (Bowman és Nichols, 2005). A Nagy-Vadas klónkönyvtárának vizsgálata révén sikerült igazolnunk az Algoriphagus nemzetség jelenlétét is. Képviselőiket számos alkalommal mutatták ki tengervízből, illetve algák környezetéből (Bowman és mtsai, 2003; Nedashkovskaya és mtsai, 2004). Az egyik Nagy-Vadasról származó reprezentatív klón szekvencia analízise a Fluviicola taffensis típustörzsének szekvenciájával való 97%-os hasonlóságot eredményezett. Ezt a szigorúan aerob, pigment termelő fajt a nemzetséggel együtt folyóvízből írták le (O’Sullivan és mtsai, 2005). A fenti két nemzetségen kívül Bacteriodetes csoport esetében is találtunk olyan klónt, amelyet faji szinten nem sikerült azonosítani, és csak környezeti mintákból származó más klónokkal mutatott rokonságot (Brümmer és mtsai, 2000; Battin és mtsai, 2001). A

Nagy-Vadas

nád

biofilm

baktériumközösségeinek

klónozással

történő

feltérképezése révén nem sikerült Gram-pozitív szervezeteket kimutatnunk. A Kelemen-szék esetében egy mindössze 3 klónt (a klónkönyvtár 2%-a) számláló csoport reprezentáns szekvenciája pedig a nagy G+C tartalmú Gram-pozitívok csoportjának, azon belül egyedül az Arthrobacter nemzetséget képviselőinek jelenlétét igazolta. A kétféle módszerrel nyert eredmények szembetűnő kontrasztja mögött feltehetően az alkalmazott technikák a Lángitisztás nád biofilm mintájának klónozása kapcsán már említett szelektivitása áll. A két területről származó biofilm minták vizsgálata során egyes csoportokat kizárólag klónozás révén sikerült kimutatnunk. A Kelemen-szék egy ARDRA csoportjának (4 klón, 3%) reprezentatív klónja a szekvencia analízis alapján a Fibrobacter/Acidobacteria törzsbe nyert besorolást. A csoport képviselőit szennyvíztisztításban alkalmazott membrán biofilmek polifázikus taxonómiai vizsgálata során szintén detektálták (Chen és mtsai, 2004). Az általunk azonosított szekvencia az angol perje (Lolium perenne), illetve a fehér lóhere (Trifolium repens) gyökérkörnyezetének mikrobiális vizsgálatából származó klónkönyvtár (Marilley és Agarno, 1999) egy tagjával mutatott 98%-os hasonlóságot. A Nagy-Vadas klónjainak mindössze 1%-a, egy két klónt tartalmazó ARDRA csoport révén sikerült igazolnunk a Chloroflexi törzs jelenlétét. Annak ellenére, hogy pl. talajban a mikrobióta viszonylag kis hányadát képezik, számos természetes környezetet mikrobiális szempontból vizsgáló tanulmány igazolta a törzs tagjainak jelenlétét tenyésztéstől független, nukleinsav-alapú módszerekkel (Costello és Schmidt, 2006).

105

8. Összefoglalás Munkánk célja hazánk három (morfometriai, hidrológiai, vízminőségi, stb. tulajdonságait tekintve jelentősen különböző) szikes tavának, a Velencei-tónak, a kiskunsági Kelemen-széknek és a tiszántúli Nagy-Vadas tónak a területén található eltérő kiterjedésű nádasállományok víz alatti szárfelületein képződött biofilmek alkotásában résztvevő baktériumközösségek megismerése volt. Mivel a mikrobiális ökológiai kutatásokban alkalmazott módszerek mindegyike önmagában csak korlátozott mértékben alkalmas a teljes mikrobiális diverzitás feltárására, ezért munkánk során a rendelkezésünkre álló tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerek kombinálásán alapuló ún. polifázikus megközelítést alkalmaztunk. Kutatásunk során a nád biofilmet felépítő mikrobaközösségek egészének anyagcsere és filogenetikai diverzitását, és annak szezonális és térbeli változását ujjlenyomat módszerek (BIOLOG közösségi szénforrás értékesítés és DGGE) segítségével tanulmányoztuk. Az egyes tavak nád biofilm közösségeit alkotó baktériumközösségek faji struktúráját tenyésztésen alapuló technika, illetve molekuláris klónozás révén a baktérium törzsek és klónok 16S rDNS szekvencia analízisére alapozva tártuk fel. A három tóra kiterjedő nád biofilm vizsgálatok 2000 és 2006 között folytak. A közösségi szintű mikrobiális anyagcsere mintázatokat BIOLOG GN2 és ECO lemezek felhasználásával követtük nyomon. A minták többségénél a 96 órás inkubációs idő után már nem volt számottevő változás az összaktivitásban, vagyis az indikátor színfejlődésének mértékében, ezért minden esetben a 96 órás inkubációnál leolvasott abszorbancia értékeket használtuk fel a mikróbaközösségek anyagcsere ujjlenyomatának elemzéséhez. Az eredményeket főkomponens analízis során, valamint az értékesített szubsztrátok típusa alapján hasonlítottuk össze. A Velencei-tó esetében kétféle mintatípust vizsgáltunk annak érdekében, hogy a nagyméretű nádasállományok esetleges elhelyezkedésbeli (nádasállományok belső és nyíltvizes kapcsolattal rendelkező külső részéből származó minták), illetve kor (egy- és többéves nádszár minták) szerinti különbségeit feltárjuk a biofilm mikróbaközösségek vonatkozásában. A főkomponens analízis eredményei alapján az egyes mintatípusok mikróbaközösségei nem mutattak egyértelmű elkülönülést szénforrás értékesítésük alapján, ezért a későbbi szezonális vizsgálatokhoz mindhárom tó esetében a nyíltvízzel érintkező külső nádasállományból gyűjtöttünk fiatal és többéves nádszárakat vegyesen. A Velencei-tó

106

esetében mindkét típusú (GN2 és ECO) BIOLOG lemez adatainak elemzése az egyes minták szezonális csoportosulását eredményezte. Az ordinációs diagramokon a vizsgált években a tavaszi minták helyezkedtek el a legközelebb egymáshoz, míg a nyáriak jelentős területi elkülönülése volt megfigyelhető. Az alföldi szikes tavak vizsgálati eredményei alapján az egyes évek tavaszi és nyári mintái egymáshoz nagyfokú hasonlóságot mutattak, azonban a két évet összehasonlítva különböztek egymástól. Az őszi minták mindkét tó esetében az első főkomponens mentén hasonlónak, a második főkomponens alapján pedig eltérőnek mutatkoztak. Valamennyi időpontban és területen vett minta mikróbaközösségeit a különféle szubsztrát csoportok közül a polimerek és a szénhidrátok preferált hasznosítása jellemezte. Összességében megállapítható, hogy a GN2 és az ECO lemezekkel végzett vizsgálataink egyaránt a közösségi szintű szénforrás hasznosítási mintázatok a Velencei-tó mintavételi területei szerinti eltérő szezonális dinamikájára engedtek következtetni. Az ECO lemezek ugyanakkor az egyes mikróbaközösségek aktivitásának összehasonlítására alkalmasabbnak bizonyultak, mint a GN2 lemezek. A GN2 és ECO lemezek szénforrásainak összetételében a szénhidrátok és a szerves savak számában van a legnagyobb különbség. A GN2 lemezek számos olyan az ECO lemezeken nem található, de a baktériumok által könnyen hasznosítható szénhidrátot tartalmaznak, amelyek többségét a vizsgált minták mikróbaközösségeinek mindegyike jól értékesítette. A GN2 lemezeken mért abszorbancia adatok főkomponens analízise ezért a minták anyagcsere-ujjlenyomatában sokkal kisebb összvarianciát eredményezett. A BIOLOG GN2 lemezekkel végzett két éves szénforrás értékesítési vizsgálatok főkomponens értékei a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm mikróbaközösségek esetében a velencei-tavi mintákhoz képest az összvariancia közel kétszeresét magyarázták. A jelenség magyarázata feltehetően az lehet, hogy a Velencei-tóhoz képest a szélsőségesen változó vízforgalommal és fiziko-kémiai paraméterekkel jellemezhető alföldi szikes vízterek nádasállományán fejlődő biofilm közösségek anyagcsere aktivitásuk nagyfokú változásában is tükrözik mikrokörnyezetük változását. A partszegélyén található nádasok ezen vízterek esetében ugyanis a velencei-tavinál sokkal kevésbé összefüggőek és kisebb kiterjedésűek, így a víztestben kialakuló változások kifejezettebben és közvetlenebbül befolyásolhatják a nád biofilm mikróbaközösségeinek szerkezetét és aktivitását. A mindhárom szikes tóról származó nád biofilm baktériumközösségek szerkezetében bekövetkező szezonális változásokat és az egyes fajok relatív abundanciáját DGGE-vel vizsgáltuk. A Velencei-tó esetében az eltérő helyekről és különböző időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeit reprezentáló csíkok mintázata és a sávok intenzitása alapján a 107

legnagyobb hasonlóságot mindkét évben az ugyanarról a mintavételi területről eltérő időpontokban

gyűjtött

minták

baktériumközösségeinek

sávmintázatai

mutatták.

A

korábbiakban ismertetett közösségi szintű mikrobiális anyagcsere nyomon követését célzó BIOLOG vizsgálatok eredményei elsősorban a szezonális dinamikára, míg a DGGE vizsgálatok eredményei inkább a mintavételi területek közti különbségekre utalnak. A látszólagos ellentmondás hátterében feltehetően a Velencei-tó egyes területein előforduló eltérő fajösszetételű, de hasonló anyagcsere potenciállal rendelkező, szezonálisan változó baktériumközösségek állhatnak. A kelemen-széki nád biofilm minták DGGE sávmintázatuk alapján elsődlegesen a mintavétel éve szerint váltak szét, és a baktériumközösségek egyes tagjainak abundancia-változásaiban a BIOLOG eredmények főkomponens analízisével megegyező

csoportosulást

figyelhettünk

meg. A Nagy-Vadasról

származó

minták

baktériumközösségei DGGE sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást mutattak. Megállapíthatjuk tehát, hogy a kétféle közösségi szintű vizsgáló módszer alkalmasnak bizonyult a vizsgált nád biofilm minták közösségeinek vizsgálatára, azonban az egyes területek, illetve a szezonális dinamika jellemzéséhez további részletesebb, több mintavételi pontra kiterjedő, és gyakoribb mintavétellel egybekötött vizsgálatsorozatra volna szükség. A mintákban a baktériumok mennyiségi viszonyait csíraszámbecsléssel, a biofilm baktériumközösségek diverzitását részben tenyésztésen alapuló, részben molekuláris klónozás segítségével térképeztük fel. A nád biofilm minták tenyészthető baktériumközösségeinek fenotípusos sajátságairól az izolátumok hosszú távú laboratóriumi vizsgálatok során nyert eredményei alapján szereztünk információt. A tenyésztésbe vont törzsek, valamint a reprezentatív klónok identifikáláshoz 16S rDNS szekvencia analízist végeztünk. A Velencei-tó mindhárom mintavételi területéről vett nád biofilm mintákban tavasszal a csíraszám értékek a nyáriakhoz képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. A velenceitavi területek közül tavasszal a Fürdető csíraszám értékei több esetben is egy nagyságrenddel magasabbak voltak a másik két területről származó mintákénál, valamint a kétféle minta típus értékei is nagyságrendi eltérést mutattak a szerves anyagban gazdag táptalajokon. A különböző területekről származó nyári minták csíraszám értékei között nem volt nagyságrendi különbség, ugyanakkor volt olyan táptalaj, amelyen a vizsgált két mintatípus becsült csíraszámai mindhárom területen egy nagyságrendnyi különbséget mutattak. A négyféle táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva mindhárom tó mintáinak esetében többnyire a Caulobacter táptalajon figyeltük meg a legmagasabb becsült csíraszámokat. A Kelemen-szék és a Nagy-Vadas nád biofilm baktériumainak vizsgálataihoz a mesterséges tengervizes 108

táptalaj bizonyult a legalkalmasabbnak a bakteriális diverzitásának tenyésztéses módszerekkel történő feltárására. A három tó nád biofilm mintáiból kitenyésztett törzsállományok közül a velencei-tavi törzsek alapvetően fakultatív fermentatív metabolizmussal bírtak. Ezen belül a Gram-negatív dominanciájú tavaszi minták törzseit inkább a gyors (glükóz 24 órán belül történő hasznosítása, mely gyakran gázképzéssel is együtt járt, illetve a Voges-Proskauer teszt butilén-glikolos fermentációja), míg a döntően Gram-pozitív festődésű nyári minták törzseit a lassú (a glükóz egy hét alatt megfigyelhető fermentációja, valamint pozitív metilvörös teszt) fermentatív aktivitás jellemezte. A vizsgált szubsztrátok közül a tavaszi törzsekre a keményítő és a tween 80 hasznosítása, a nyári minták izolátumaira az eszkulin és a kazein hidrolízise volt jellemző. A kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas tó kitenyésztett baktériumainak többsége Gram-pozitív festődésű volt, a kitenyésztett baktériumok a vizsgált tesztekben a velencei-taviakhoz képest alacsony aktivitást mutattak. A velencei-tavi törzsállományokkal ellentétben az alföldi törzsek teszteredményei alapvetően aerob légző anyagcserére utaltak. Említésre méltó, hogy a Velencei-tóból egyáltalán nem, a Kelemen-szék és a Nagy-Vadas esetében is csak néhány cellulóz bontó szervezetet sikerült kimutatnunk. Az általunk vizsgált biofilm minták minden esetben egészséges nádnövények száráról származtak, ezért nem meglepő a cellulózbontó szervezetek hiánya/kis száma a vizsgált biofilmek baktériumközösségeiben. Az

ARDRA-csoportosítást

követően

a

reprezentatív

törzsek

azonosításának

eredményei alapján mindhárom tó nád biofilm baktériumközösségeinek széles diverzitását sikerült feltárnunk. Az egyes területekről származó mintákból azonosított taxonok számában és egymáshoz viszonyított arányában jellegzetes eltéréseket tapasztaltunk, valamint az egyes filogenetikai törzsekhez tartozó nemzetségek és fajok összetételében is csak részleges átfedéseket lehetett megfigyelni. A velencei-tavi nád biofilm minták közül tavasszal és nyáron is a tó nyugati természetvédelmi területén található Lángi-tisztásról származó mintákból azonosítottuk a legtöbb baktérium taxont, a legkevesebbet pedig a nyíltvizes területen található Fürdető mintáiból. A Nagy-Vadas mintájából a Lángi tisztás mintáival közel egyező számú taxont identifikáltunk. A legtöbb baktérium taxont ugyanakkor a Kelemen-szék nád biofilmjéből határoztuk meg. Az utóbbi két szikes tóból származó törzsek közül több alacsony (≤97%) szekvencia-hasonlóságot mutatott már leírt fajokkal, ennek alapján lehetséges, hogy ezek a törzsek új fajok képviselői.

109

A tavaszi és nyári velencei-tavi minták törzseinek azonosítását összehasonlítva részben átfedő faji szerkezetet állapíthatunk meg. Az α-proteobaktériumok más-más nemzetségeit azonosítottuk tavasszal és nyáron, a β-proteobaktériumokat csak a tavaszi minta törzsei képviselték. A γ-proteobaktériumok körébe tartozó Aeromonas nemzetség mind a tavaszi, mind a nyári nád biofilm minták tenyészthető közösségalkotójának bizonyult, azonban a tavaszi minta törzsállományában a nyáriénál nagyobb számú törzs képviselte ezt a nemzetséget. A fenotípusos tesztek alapján a tavaszi velencei-tavi minta gyors fakultatív fermentatív aktivitással rendelkező tenyészthető baktériumközösségként volt jellemezhető, feltételezhető, hogy a jelenség mögött többek között az azonosítás révén feltárt faji összetétel, ezen belül az Aeromonasok említett nagy száma állhat. A kis G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok közé relatíve kevés törzs került a Velencei-tó tavaszi mintáiban, míg nyáron a második legnagyobb számú törzscsoport képviselte ezt a törzset. A feltárt sokféleség tekintetében azonban a tavaszi minták bizonyultak diverzebbnek. A nyáron izolált és ebbe a csoportba sorolt, többségükben vegyessavas fermentációt mutató törzsek túlnyomó részét Bacillus pumilusként azonosítottuk. A nyári mintavétel alkalmával kitenyésztett közösségekre inkább a lassú, egy héten belül megfigyelhető fermentatív aktivitás volt jellemző, ennek egyik feltételezhető oka többek között a Bacillus és rokon nemzetségekbe tartozó törzsek nagy száma lehet. A velencei-tavi tavaszi minták törzsállományán kívül a többi esetben a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte a legtöbb törzs, és összességében ennek a filogenetikai

csoportnak

Aureobacterium,

tártuk

Cellulomonas

fel

tenyésztéssel

Dietzia,

Kocuria,

a

legszélesebb

Micrococcus,

(Arthrobacter, Microbacterium,

Nesterenkonia, Nocardiopsis, Plantibacter, Rhodococcus, Sanguibacter, Streptomyces) diverzitását. A két alföldi szikes tó közül a Kelemen-szék nád biofilm mintájából kitenyésztett baktériumok azonosításának eredményei a Nagy-Vadasénál nagyobb átfedést mutattak a velencei-tavi minták általunk tenyésztéssel detektált faji összetételével. A nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumok számos, a β-proteobaktériumok Acidovorax és Hydrogenophaga nemzetségeinek, az Agrobacterium, valamint az Enterobacteriaceae család egyes tagjainak jelenlétét a Nagy-Vadas nád biofilm mintájában nem, csak a kiskunsági Kelemen-szék esetében sikerült igazolnunk. Az alföldi szikes tavak esetében több olyan nemzetséget (Paracoccus, Halomonas, Planococcus, Nesterenkonia) sikerült kimutatnunk, amelyek képviselőinek

jelenléte

a

vizsgált

szikes

vizek

nádon

baktériumközösségeinek szikes környezethez való alkalmazkodására utal. 110

kialakuló

biofilm

A tenyésztéses vizsgálatok révén a Pseudomonas és a Bacillus nemzetségek képviselőinek jelenlétét az összes vizsgált nád biofilm minta baktériumközösségében igazoltuk. A három tó biofilm mintáiból a Pseudomonas, a Bacillus és a vele közelrokon nemzetségek fajainak csak részben átfedő, de összességében nagy fajgazdaságát (P. anguilliseptica, P. fluorescens, P. fragi, P. gessardi, P. marginalis, P. putida, P. stutzeri; B. cereus, B. firmus, B. fusiformis, B. horikoshii, B. licheniformis, B. pumilus, Brevibacillus agri, Marinibacillus campisalis, Marinibacillus marinus, Paenibacillus sp., Jeotgallibacillus sp.) tártuk

fel.

Ezek

a

metabolikus

sokféleségükről

ismert

fajok

növény-asszociált

mikróbaközösségek tagjaként széles körben elterjedtek a különféle vízi környezetekben. Az egyes tavak nád biofilm baktériumközösségeinek diverzitását molekuláris klónozással is feltérképeztük. A velencei-tavi Lángi-tisztást a korábbi eredmények alapján választottuk a tenyésztéstől független vizsgálatra. Az alföldi szikes területek esetében a tenyésztéssel is feldolgozott nád biofilm mintákból izolált közösségi DNS-ből hoztunk létre klónkönyvtárat. Mindhárom klónkönyvtár esetében a vizsgált szekvenciák bizonyos hányada kovaalga-kloroplasztisz,

illetve

cianobaktérium-szekvenciának,

valamint

kimérának

bizonyult. Ez egyrészt a növényi környezetből származó biofilm minták bakteriális diverzitásának feltérképezésekor a DNS-alapú, eubakteriális primerek felhasználásával történő klónozásos technika módszertani hátrányára utal, másrészt azonban ráirányítja a figyelmet a nád perifitonban a baktériumközösségek mellett a kovaalga, valamint a cianobaktérium közösségek jelenlétére és szerepére. A klónozás révén mindhárom minta esetében a nád biofilm alkotásában résztvevő baktériumközösségek széles diverzitását tártuk fel. A könyvtárak közös sajátsága volt, hogy klónjaik jelentős hányada eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciáival mutatott nagyfokú hasonlóságot. A klónok vizsgálata mindhárom tó esetében a nád biofilm baktériumközösségek Gram-negatív dominanciájára engedett következtetni. Egyedül a Kelemen-szék klónjai között találtunk a Gram-pozitív Arthrobacter nemzetséghez tartozó képviselőt, melyet tenyésztéssel is sikerült igazolnunk a minta baktériumközösségében. A tenyésztéssel feltárt mikróbaközösségek összetételében gyakran megfigyelhető jelenség a Gram-pozitív, illetve endospóra képző szervezetek túlsúlya. A molekuláris klónozást megelőző DNS izolálás során előfordulhat egyes baktériumok (pl. a sejtfal-szerkezeti eltérések miatti) preferenciális feltáródása és ennek következtében nagyobb arányú detektálása az adott mintában. A három klónkönyvtár klónjai a reprezentánsok identifikációja révén az α-, β- és γ-proteobaktériumokat és a Bacteriodetes csoportot képviselték. Ezek közül

111

β-proteobaktériumokat csak a Velencei-tó egyes területeiről és a Kelemen-székről sikerült kis számban kitenyésztenünk. A Bacteriodetes csoportba tartozó szervezeteket kizárólag a Kelemen-szék biofilm baktériumai között azonosítottuk tenyésztéses eljárással is. A fenti két csoport képviselői klónozásos vizsgálatok alapján gyakran bizonyulnak különféle környezeti minták, köztük növény-asszociált mikrobióta abundáns tagjainak, ahol sokrétű szerepet tölthetnek be a növény és szűkebb környezete életében. Az adatbázisokban fellelhető viszonylag kevés tenyésztésbe vont Bacteriodetes baktériumot képviselő szekvencia szintén azt jelzi, hogy a tenyésztésen alapuló vizsgálatok továbbfejlesztése nagymértékben hozzájárulhat a csoport sokféleségének és aktivitásának megismeréséhez. A fenti csoportokon kívül mindhárom minta esetében azonosítottunk olyan csoportokat klónozás segítségével, amelyeket az általunk választott és alkalmazott tenyésztési feltételek mellett nem detektálhattunk a nád biofilm baktériumközösségek tagjaként. Ilyenek voltak a Lángi-tisztás esetében a Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Spirochaetes, Chlorobi

és

Chloroflexi

csoportok,

a

Kelemen-szék

biofilm

mintájában

a

Fibrobacter/Acidobacteria, valamint a Nagy-Vadas nád biofilmjében a Chloroflexi csoport. A Lángi-tisztás reprezentatív klónjainak azonosítása révén a faj/nemzetség szintjén identifikált taxonok egyikét sem mutattuk ki tenyésztéssel az adott minta biofilm baktériumai között. A két alföldi szikes nád biofilm minta esetében is rendkívül csekély átfedést tapasztaltunk ebben a tekintetben (Agrobacterium, Hydrogenophaga és Arthrobacter nemzetségek a Kelemen-szék, Paracoccus nemzetség a Nagy-Vadas mintájában). Az Agrobacterium és a Hydrogenophaga nemzetségek tagjainak mindhárom tó nád biofilmjében való jelenlétét csak a két diverzitás elemző módszer ötvözésével sikerült igazolnunk. Munkánk során az alkalmazott módszerek lehetővé tették, hogy betekintést nyerjünk a vizsgált növény-asszociált biofilmek baktériumainak potenciális metabolikus aktivitásába, valamint filogenetikai és taxonómiai diverzitásába. A közösségi szintű anyagcserét feltérképezni hivatott BIOLOG szénforrás értékesítési tesztek és a baktériumközösségek szerkezetének megismerésére használt DGGE módszerrel kapott eddigi eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy az egyes mintavételi területek, illetve a szezonális dinamika megbízható feltérképezéséhez további hosszú távú, gyakori mintavételezéssel kivitelezett vizsgálatok szükségesek. A tenyésztéses és a klónozásos vizsgálatok eredményeinek részleges átfedése a két mikrobiális ökológiai diverzitás vizsgáló módszer eltérő szelektivitására utal. A tenyésztéses vizsgálatok kibővítésével (pl. további táptalajok bevonásával, a tenyésztési technikák

módosításával)

a

szikes

tavak

nádasain

kialakuló

biofilmek

baktériumközösségeinek eddig még feltáratlan, rejtőzködő diverzitására is fényt derülhet. 112

9. Kivonat Munkánk során a Velencei-tó, a kiskunsági Kelemen-szék és a tiszántúli Nagy-Vadas nádasainak biofilmjét felépítő mikrobaközösségek egészének szezonális és térbeli változását anyagcsere és genetikai ujjlenyomat módszerek (BIOLOG közösségi szénforrás értékesítés és DGGE) segítségével tanulmányoztuk. A baktériumok mennyiségi viszonyainak csíraszám becsléssel történő felmérését követően, a közösségek taxonómiai és filogenetikai diverzitásának feltárását tenyésztésen alapuló és molekuláris biológiai módszer (klónozás) segítségével végeztük. A tenyésztésbe vont törzsek, valamint a reprezentatív klónok identifikáláshoz a 16S rDNS gén szekvencia analízisét alkalmaztuk. Vizsgálataink 2000 és 2006 között folytak. A Velencei-tó esetében a különböző nádszár típusok biofilm mikróbaközösségei a szénforrás értékesítési profilokat összehasonlító főkomponens analízis eredményei alapján nem különültek el egymástól. Az ECO lemezek a GN2 lemezeknél alkalmasabbak voltak a közösségi szintű szénforrás hasznosítási mintázatok mintavételi területek szerint eltérő szezonális dinamikájának összehasonlítására. A DGGE vizsgálatok eredményei alapján a Velencei-tó esetében a legnagyobb hasonlóságot mindkét évben az ugyanarról a mintavételi területről eltérő időpontokban gyűjtött minták baktériumközösségeinek sávmintázatai mutatták. A Kelemen-szék nád biofilm mintái DGGE sávmintázatuk alapján elsődlegesen a mintavétel éve szerint váltak szét, és a baktériumközösségek egyes tagjainak abundanciaváltozásaiban a BIOLOG eredmények főkomponens analízisével megegyező csoportosulást figyeltünk

meg.

A

Nagy-Vadasról

származó

minták

baktériumközösségei

DGGE

sávmintázatuk alapján kevésbé egyértelmű csoportosulást mutattak. A Velencei-tó mindhárom mintavételi területén vett nád biofilm mintákban tavasszal a csíraszám értékek a nyáriakhoz képest több nagyságrenddel magasabbak voltak. A négyféle táptalajon megfigyelt értékeket összehasonlítva mindhárom tó mintáinak esetében többnyire a Caulobacter táptalajon figyeltük meg a legmagasabb becsült csíraszámokat. A velencei-tavi tavaszi mintákból származó Gram-negatív dominanciájú törzseket a gyors fermentatív aktivitás jellemezte, míg a főként Gram-pozitív festődésű nyári minták törzsei lassú fermentatív aktivitást mutattak. Az alföldi szikes tavakból kitenyésztett baktériumok többsége Gram-pozitív festődésű volt, és alacsony metabolikus aktivitással rendelkezett.

113

A reprezentatív törzsek azonosításának eredményei alapján az egyes területekről származó mintákból azonosított taxonok számában és egymáshoz viszonyított arányában jellegzetes eltéréseket tapasztaltunk, és az egyes filogenetikai törzsekhez tartozó nemzetségek és fajok összetételében is csak részleges átfedéseket lehetett megfigyelni. A velencei-tavi tavaszi minták törzsállományán kívül a többi esetben a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív baktériumokat képviselte a legtöbb törzs, és összességében ennek a filogenetikai csoportnak tártuk fel tenyésztéssel a legszélesebb diverzitását. Az alföldi szikes tavak esetében több olyan nemzetséget

is

kimutattunk,

amelynek

jelenléte

a

nádon

kialakuló

biofilm

baktériumközösségek szikes környezethez való alkalmazkodására utal. A tenyésztéses vizsgálatok révén a Pseudomonas és a Bacillus nemzetségek képviselőinek jelenlétét az összes vizsgált nád biofilm minta baktériumközösségében igazoltuk, ugyanakkor a nemzetségek fajainak csak részben átfedő, de összességében nagy fajgazdaságát tártuk fel. A velencei-tavi Lángi-tisztásról származó nádminta klónkönyvtárának jelentős hányada eddig tenyésztésbe nem vont szervezetek szekvenciáival mutatott hasonlóságot. A klónok vizsgálata mindhárom szikes tó nád biofilm baktériumközösségeinek Gram-negatív dominanciájára utalt, és a klón reprezentánsok az α-, β- és γ-proteobaktériumokat és a Bacteriodetes csoportot képviselték. Mindhárom szikes tó esetében azonosítottunk olyan csoportokat klónozás segítségével, amelyeket az alkalmazott tenyésztési feltételek mellett nem

detektáltunk

a

nád

biofilm

baktériumközösségek

tagjaként

(Lángi-tisztás:

Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Spirochaetes, Chlorobi és Chloroflexi; Kelemen-szék: Fibrobacter/Acidobacteria; Nagy-Vadas: Chloroflexi csoportok).

114

10. Abstract The objective of the present work was to uncover the seasonal and spatial changes of reed biofilm microbial communities in three Hungarian soda lakes (Lake Velencei, Kelemenszék and Nagy-Vadas) using metabolic as well as genetic fingerprinting methods (BIOLOG community-level physiological profiling and DGGE). Following the germ count estimation of bacteria within the studied samples, taxonomic and phylogenetic diversity of biofilm bacterial communities was revealed by cultivation based and molecular biological cloning techniques. Representative strains and clones were indentified according to their partial 16S rDNA sequence analysis. The investigations were carried out between 2000 and 2006. Based on the results of principal component analysis, Lake Velencei biofilm microbial communities originating from different types of reed samples did not differ from each other by their carbon source utilization patterns. Contrary to GN2, ECO plates proved to be more adequate to follow the seasonal dynamics of community-level physiological profiles by comparing the BIOLOG plates. Based on the results of genetic fingerprinting, the DGGE patterns of biofilm bacterial communities originating from different sampling times of a given sampling site of Lake Velencei showed the highest similarity. The band patterns of Kelemenszék biofilm bacterial communities showed primary separation according to the years of sampling, and the changes in the abundance of community members correlated with the results of principal component analysis of BIOLOG data. Bacterial communities of NagyVadas biofilm samples did not grouped clearly by their DGGE patterns. The CFU values of bacteria within the biofilm taken in spring were at least one order of magnitude higher than in summer at all sampling sites of Lake Velencei. Comparing the media applied during the study, the CFU values were mostly the highest on Caulobacter medium. In the case of Lake Velencei, dominantly Gram-negative strains isolated from the spring biofilm samples were characterized by their fast, while the mostly Gram-positive strains of the summer samples by their slow fermentative activities. The majority of isolates originating from the Kelemen-szék and Nagy-Vadas biofilm samples stained Gram-positively and showed low activities in the studied phenotypic tests. Results of the identification of representative strains revealed differences within the numbers and ratios of the identified taxa of the studied bacterial communities in the three

115

lakes. Only partial overlaps can be observed among the genera and species of different phylogenetic phyla identified within the biofilm bacterial communities, as well. Except of the strains of the spring samples taken in Lake Velencei, the high G+C Gram-positives were represented by the greatest number of isolates. The overall species diversity revealed by cultivation in our samples was the greatest in the case of this phylogenetic phylum, as well. A number of genera identified from the biofilms of Kelemenszék and Nagy-Vadas referred to the adaptation of reed biofilm bacteria to the special (saline, alkaline) characteristics of the studied lakes. Representatives of the genera Pseudomonas and Bacillus were found to be present in the bacterial communities of each studied reed bioiflm sample. A partly overlapping but a great overall species diversity of the members of these genera was revealed from the biofilm bacterial communities of the studied lakes. The results of molecular cloning revealed a Gram-negative dominated diversitiy within the reed biofilm bacterial communities of the studied sites (Lángi-tisztás in Velenceitó, Kelemen-szék and Nagy-Vadas). The clones represented the α-, β- és γ-proteobacteria and the Bacteriodetes group. A great number of sequences obtained from the clone library of Lángi-tisztás were affiliated with uncultured environmental clones. The presence of certain bacterial groups within the reed biofilm bacterial communities of the three studied lakes was verified

by

cloning

Gemmatimonadetes,

but

not

Spirochaetes,

by

cultivation Chlorobi

Fibrobacter/Acidobacteria; Nagy-Vadas: Chloroflexi).

116

and

(Lángi-tisztás: Chloroflexi;

Verrucomicrobia, Kelemen-szék:

11. Felhasznált irodalom Ács É., Buczkó K., Lakatos Gy. (1991) A Velencei-tó és a Fertő nádbevonatának összehasonlító algológiai elővizsgálata. (Comparative algological study of the reedperiphyton in Lake Velencei and Lake Fertő). Bot. Közlem. 78: 95-111. Ács É, Buczkó K., Lakatos Gy. (1994) Changes in the mosaic-like water surfaces of Lake Velencei as reflected by reed periphyton studies. Studia Botan. Hung. 25: 5-19. Ács É., Buczkó K. (1994) Daily changes of reed periphyton composition in a Hungarian shallow lake (Lake Velencei). In: Marino, D., Montresor M. (eds.): Proc. 13th Internat. Diatom Symp. Biopress Limited, Bristol. pp. 1-10. Ács É., Borsodi A.K., Makk J., Molnár P., Mózes A., Rusznyák A., Reskóné M.N., Kiss K.T. (2003) Algological and bacteriological investigations on reed periphyton in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 549-557. Ács É., Lakatos Gy., Reskóné N.M. (2001) A Velencei-tó nádbevonatában bekövetkezett változások. Hosszú távú algológiai vizsgálatok. Hidrol. Közl. 81: 308-310. Ács É., Borsodi A.K., Kiss É., Kiss K.T., Kröpfl K., Szabó K., Vladár P.,Várbíró G., Záray Gy. (2007) Comparative examinations of biofilms on different substrata in a shallow sodic lake: combining analytical chemistry, community-level physiological profiling and microscopy. Aquat. Ecol. in press DOI 10.1007/s10452-007-9132-0. Altschul S.F., Madden T.L., Schaeffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Amann R., Lemmer H., Wagner M. (1998) Monitoring the community structure of wastewater treatment plants: a comparison of old and new techniques. FEMS Microbiol. Ecol. 25: 205-215. Andrews F.H., Harris R.F. (2000) The ecology and biogeography of mikroogranisms on plant surafaces. Annu. Rev. Phytopathol. 38: 145-180. Andrikovics S., Murányi D. (2003) Zoobentosz együttesekről a Szabadszállás-Fülöpszállás környéki fehér szikes vizekben. Természetvédelmi Közlemények 10: 251-271. Applegate D.H., Bryers J.D. (1991) Effects of carbon and oxygen limitations and calcium concentrations on biofilm removal processes. Biotechnol. Bioeng. 37: 17-25. Bach H., Hartmann A., Schloter M., Munch J.C. (2001) PCR primers and functional probes for amplification and detection of bacterial genes for extracellular peptidases in single strains and in soil. J. Microbiol. Methods. 44: 173-182. Bacilio-Jiménez M., Aguilar-Flores S., del Valle M.V., Pérez A., Zepeda A., Zenteno E. (2001) Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonozation of roots by Azospiriilum brasilense. Soil Biol. Biochem. 33: 167-172. Baker B.H., Williams L.A. J., Miller J.A., Fitch F.J. (1971) Sequence and geochronology of the Kenya rift volcanics. Tectonophysics 11: 191-215. Basil A.J., Strap J.L., Knotek-Smith H.M., Crawford D.L. (2004) Studies on the microbial populations of the rhizosphere of big sagebrush (Artemisia tridentata). J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 278-88. Battin T.J., Wille A., Sattler B., Psenner R. (2001) Phylogenetic and functional heterogeneity of sediment biofilms along environmental gradients in a glacial stream. Appl. Environ. Microbiol. 67: 799-807. Beatty P.H., Jensen S.E. (2002) Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agent of blackleg disease of canola. Can. J. Microbiol. 48: 159-69. Behrendt U., Ulrich A., Schumann P., Naumann D., Suzuki K. (2002) Diversity of grassassociated Microbacteriaceae isolated from the phyllosphere and litter layer after

117

mulching the sward; polyphasic characterization of Subtercola pratensis sp. nov., Curtobacterium herbarum sp. nov. and Plantibacter flavus gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1441-1454. Benhamou N., Kloepper J.W., Quadt-Hallman A., Tuzun S. (1996) lnduction of defenserelated ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria. Plant Physiol. 112: 919-929. Bercovier H., Steigerwalt A.G., Guiyoule A., Huntley-Carter G., Brenner D.J. (1984) Yersinia aldovae (formerly Yersinia enterocolitica-like group X2): a new species of Enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 166172. Berg G., Rokot N., Steidle A., Eberl L., Zock A., Smalla K. (2002) Plant-dependent genotypic and phenotypic diversity of antagonistic rhizobacteria isolated from different Verticillium host plants. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3328–3338. Berge O., Guinebretiere M.H., Achouak W., Normand P., Heulin T. (2002) Paenibacillus graminis sp. nov. and Paenibacillus odorifer sp. nov., isolated from plant roots, soil and food. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 607-16. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1994) Holt J.G. (ed.) Williams & Wilkins, Baltimore/London. Bohus I., Rékasi T., Szikora Sz., Barkács K., Záray Gy, Ács É. (2005) Interaction of acetochlor and atrazine with natural freshwater biofilms grown on polycarbonate substrate in lake Velence (Hungary). Microchem. J. 79: 201-205. Boon N., De Windt W., Verstraete W., Top E.M. (2002) Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group-specific 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants. FEMS Microbiol. Ecol. 39: 101-112. Boros E. (1999) A magyarországi szikes tavak és vizek ökológiai értékelése. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 13-80. Boros E. (2003) Vízimadár populációváltozások és környezeti okai a Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavain és mocsarain (KNP II. sz. területének térségében). Természetvédelmi Közlemények 10: 289–312. Boros E., Andrikovics S., Kiss B., Forró L. (2006) Feeding ecology of migrating waders (Charadrii) at sodic-alkaline pans in the Carpathian Basin. Bird Study 53: 86–91. Borsodi A., Sallai K. (1997) A Fertő fenéküledékének alkalofil baktériumközösségei. Hidrol. Közl. 77: 259-263. Borsodi A., Farkas I., Kurdi P. (1998) Numerical analysis of planctonic and reed biofilm bacterial communities of Lake Fertő. Wat. Res. 32: 1831-1840. Borsodi A., Sallai K. (1998) Alkalofil Bacillusok szerepe a Fertő szervesanyag lebontási folyamataiban. Hidrol. Közl. 78: 306-308. Borsodi A., Beszteri B., Reskóné N.M., Micsinai A., Márialigeti K. (2001) A Velencei-tó üledékéből kitenyésztett alkalofil baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése. Hidrol. Közl. 81: 334-336. Borsodi A.K, Vladár P., Cech G., Gedeon G., Beszteri B., Micsinai A., Reskóné, N.M., Márialigeti K. (2003a) Bacterial activities in the sediment of Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 721-728. Borsodi A., Reskóné N.M., Gedeon G., Vladár P., Boros E., Márialigeti K. (2003b) Szikes tavak baktériumközösségeinek szénforrás értékesítési vizsgálata BIOLOG rendszerrel. Hidrol. Közl. 83. 25-28. Borsodi A., Vladár P., Rusznyák A., Szabó G., Sipos R., Márialigeti K. (2005a) Tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris biológiai vizsgálatok a Kiskunsági NP szikes tavainak baktériumközösségein. Hidrol. Közl. 85: 23-25.

118

Borsodi A.K., Micsinai A., Rusznyák A., Vladár P., Kovács G., Tóth E.M., Márialigeti K. (2005b) Diversity of alkaliphilic and alkalitolerant bacteria cultivated from decomposing reed rhizomes in a Hungarian soda lake. Microb. Ecol. 50: 9-18. Borsodi A.K, Rusznyák A., Molnár P., Vladár P., Reskóné M.N., Tóth E.M., Sipos R., Gedeon G., Márialigeti K. (2007) Metabolic activity and phylogenetic diversity of reed (Phragmites australis) periphyton bacterial communities in a Hungarian shallow soda lake. Microb. Ecol. 53: 612-620. Boschker H.T.S., Cappenberg T.E. (1997) Patterns of extracellular enzyme activities in littoral sediments of lake Gooimeer, The Netherlands. Microbiol. Ecol. 25: 79-86. Bowman J.P., McCammon S.A., Brown M.V., Nichols D.S., McMeekin T.A. (1997) Diversity and association of psychrophilic bacteria in Antarctic sea ice. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3068–3078. Bowman J.P., Nichols C.M., Gibson, J.A.E. (2003) Algoriphagus ratkowskyi gen. nov., sp. nov., Brumimicrobium glaciale gen. nov., sp. nov., Cryomorpha ignava gen. nov., sp. nov. and Crocinitomix catalasitica gen. nov., sp. nov., novel flavobacteria isolated from various polar habitats. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1343–1355. Bowman J.P., Nichols D.S. (2005) Novel members of the family Flavobacteriaceae from antarctic maritime habitats including Subsaximicrobium wynnwilliamsii gen. nov., sp. nov., Subsaximicrobium saxinquilinus sp. nov., Subsaxibacter broadyi gen. nov., sp. nov., Lacinutrix copepodicola gen. nov., sp. nov., and novel species of the genera Bizionia, Gelidibacter and Gillisia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1471-1486. Brenner D.J., Bercovier H., Ursing J., Alonso J.M., Steigerwalt A.G., Fanning G.R., Carter G.P., Mollaret H.H. (1980) Yersinia intermedia: a new species of Enterobacteriaceae composed of rhamnose-positive, melibiose-positive, raffinose-positive strains (formerly called Yersinia enterocolitica or Yersinia enterocolitica-like). Curr. Microbiol. 4: 207212. Brenner M., Keenan L.W., Miller S.J., Schelske C.L. (1999) Spatial and temporal patterns of sediment and nutrient accumulation in shallow lakes of the Upper St. Johns River Basin, Florida. Wetlands Ecology and Management 6: 221-240. Brix H. (1987) Treatment of watewater in the rhizopshere of wetland plants: the root-zone method. Water Sci. Technol. 19: 107-118. Brubaker R.R. (1991) Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersiniae. Clin. Microbiol. Rev. 4: 309-324. Brümmer I.H.M., Fehr W., Wagner-Döbler I. (2000) Biofilm community structure in polluted rivers: abundance of dominant phylogenetic groups over a complete annual cycle. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3078-3082. Brümmer I.H.M., Felske A., Wagner-Döbler I. (2003) Diversity and seasonal variability of βProteobacteria in biofilms of polluted rivers: analysis by temperature gradient gel electrophoresis and cloning. Appl. Environ. Microbiol. 69: 4463-4473. Buczkó K., Ács É. (1997) Zonation of periphytic algae in two Hungarian shallow lakes (Lake Velence and Fertő) Acta Bot. Hung. 40: 21-34. Buczkó K., Ács É. (1998) Comparison of succession of reed periphyton in a degraded and in an undisturbed part of a shallow lake (Lake Velencei, Hungary, Central Europe). Verh. Internat. Verein. Limnol. 26: 1674-1676. Buckó K., Schmidt A. (1995) Szikes tavak. In: Járainé Komlódi M. (ed.) Pannon Enciklopédia Magyarország Növényvilága, Dunakanyar 2000 Kiadó, Budapest, pp. 7476. Chelius M.K., Triplett E.W. (2000) Dyadobacter fermentans gen. nov., sp. nov., a novel gram-negative bacterium isolated from surface-sterilized Zea mays stems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50 : 751-758.

119

Chen C.L., Liu W.T., Chong M.L., Wong M.T., Ong S.L., Seah H., Ng W.J. (2004) Community structure of microbial biofilms associated with membrane-based water purification processes as revealed using a polyphasic approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 466-473. Chin K.J., Rainey F.A., Janssen P.H., Conrad R. (1998) Methanogenic degradation of polysaccharides and characterization of polysaccharolytic clostridia from anoxic rice field soil. Syst. Appl. Microbiol. 21: 185–200. Choi K.H., Dobbs F.C. (1999) Comparison of two kinds of Biolog microplates (GN and ECO) in their ability to distinguish among aquatic microbial communities. J. Microbiol. Meth.36: 203-13. Christensen B.E. (1989) The role of extracellular polysaccharids in biofilms. J. Bacteriol. 10: 181-202. Christensen B.E., Characklis W.G. (1990) Physical and chemical properties of biofilms. In: Characklis, W.G. and Marshall K.C (eds) Biofilms. John Wiley and sons, New York, pp. 93-130. Chung Y.R., Kim C.H., Hwang I., Chun J. (2000) Paenibacillus koreensis sp. nov., a new species that produces an iturin-like antifungal compound. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1495-1500. Claus D., Fritze D., Kocur M. (1999) The genus Planococcus. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 1781-1791. Collins M.D., Lund B.M., Farrow J.A.E., Schleifer K.H. (1983) Chemotaxonomic study of an alkalophilic bacterium, Exiguobacterium aurantiacum gen nov., sp. nov. J. Gen. Microbiol. 129: 2037-2042. Colquhoun J.A, Heald S.C., Li L., Tamaoka J., Kato C., Horikoshi K., Bull A.T. (1998) Taxonomy and biotransformation activities of some deep-sea actinomycetes. Extremophiles 2: 269-277. Cooper P.F. (1993) The use of reed bed systems to treat domestic sewage: The European design and operational guidelines for reed bed systems. In: Moshiri G.A. (ed.), Constructed Wetlands for Water Quality Improvement. Lewis Publishers, Boca raton, FL pp.: 203-217. Costello E.K., Schmidt S.K. (2006) Microbial diversity in alpine tundra wet meadow soil: novel Chloroflexi from a cold, water-saturated environment. Environ. Microbiol. 8: 1471-1486. Costerton, J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lapin-Scott H.M. (1995) Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49: 711-745. Cowan S.T., Steel K.J. (1974) Manual for the identification of medical bacteria. University Press, Cambridge. Daane L.L., Harjono I., Barns S.M., Launen L.A., Palleron N.J., Haggblom M.M. (2002) PAH-degradation by Paenibacillus spp. and description of Paenibacillus naphthalenovorans sp. nov., a naphthalene-degrading bacterium from the rhizosphere of salt marsh plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 131-139. Davey M.E., O’Toole G.A. (2000) Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 847-867. Delgado O., Quillaguamán J., Bakhtiar S., Mattiasson B., Gessesse A., Hatti-Kaul R. (2004) Nesterenkonia aethiopica sp. nov., an alkaliphilic, moderate halophile isolated from an Ethiopian soda lake. Extremophiles 8: 63-71. Dinka M., Szeglet P. (1999) Carbohydrate and nutrient content in rhizomes of Phragmites australis from different habitats of Lake Fertő/Neusiedlersee. Limnologica 29: 47-59.

120

Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., van Steenberg R. (1996) Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles. FEMS Microbiol. Ecol. 19: 181-19. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., Meijer D., Márquez M.C., Ventosa, A. (2000) Halomonas magadi sp. nov., a new member of the genus Halomonas, isolated from a soda lake of the East African Rift Walley. Extremophiles 4: 53-60. Dunbar J., Sahnnon T., Barns S.M., Davis J.A., Kuske C.R. (1999) Levels of bacterial community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1662-1669. Eady R.R. (2001) The nitrogen-fixing bacteria chap. 22 In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 942-951. Ederer M.M., Crawford R.L., Herwig R.P., Orser C.S. (1997) PCP degradation is mediated by closely related strains of the genus Sphingomonas. Mol. Ecol. 6: 39–49. Elo S., Maunuksela L., Salkinoja-Salonen M., Smolander A., Haahtela K. (2000) Humus bacteria of Norway spruce stands: plant growth promotingproperties and birch, red fescue and alder colonizing capacity. FEMS Microbiol. Ecol. 31: 143-152. Érsek T., Gáborjányi R. (1998) Növénykórokozó mikroorganizmusok. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest. Fehr D., Burr S.E., Gibert M., d’Alayer J., Frey J., Popoff M.R. (2007) Aeromonas exoenzyme T of Aeromonas salmonicida is a bifunctional protein that targets the host cytoskeleton. J. Biol. Chem. 282: 28843–28852. Felske A., Wolterink A., van Lis R. Akkermans A.D.L. (1997) Screening for dominant bacterial 16S rDNA sequences in soil. Antonie van Leeuwenhoek Fernández-Garayzábal J.F., Dominguez L., Pascual C., Jones D., Collins M.D. (1995) Phenotypic and phylogenetic characterization of some unknown coryneform bacteria isolated from bovine blood and milk: description of Sanguibacter gen.nov. Lett. Appl. Microbiol. 20: 69-75. Ferris M.J., Muyzer G., Ward D.M. (1996) Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community. Appl. Environ. Microbiol. 62: 340-346. Forró L., Boros E. (1997) Microcrustacean zooplankton as potential food of Recurvirostra avosetta in sodic waters of the Hungarian Plain. Wetlands Int. Pub. 43: 239–250. Fritsche K., Auling G., Andreesen J.R., Lechner U. (1999) Defluvibacter lusatiae gen. nov., sp. nov., a new chlorophenol-degrading member of the alpha-2 subgroup of proteobacteria. Syst. Appl. Microbiol. 22: 197-204. Frostegård Å., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X., Simonet P. (1999) Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 65: 5409-5420. Gardener B.B.M., de Bruijn F.J. (1998) Detection and isolation of novel rhizopinecatabolizing bacteria from the environment. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4944-4949. Garland J.L., Mills A.L. (1991) Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community level sole-carbon-source utlization. Appl. Environ. Microbiol. 57: 2351-2359. Garland J.L. (1997) Analysis and interpretation of community-level physiological profiles in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 289-300. Geller, A. (1986) Comparison of mechanisms enhancing biodegradability of refractory lake water constituents. Limnol. Oceanogr. 31: 755-764. Glöckner F.O., Fuchs B.M., Amann R. (1999) Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3721-3726.

121

Gomez E., Garland J., Conti M. (2004) Reproducibility in the response of soil bacterial community-level physiological profiles from a land use intensification gradient. Appl. Soil Ecol. 26: 21-30. Grant W.D. (1992) Alkaline Environments. In: Lederberg J. (ed.) Encyclopedia of Microbiology. Academic Press, New York. pp. 73-80. Greenway M., Wooley A. (1999) Constructed wetlands in Queensland: performance, efficiency and nutrient bioaccumulation. Ecol. Eng. 12: 39-55. Grey J.P., Herwig R.P. (1996) Phylogenetic analysis of the bacterial communities in marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4049-4059. Haack S.K., Garchow H., Klug M.J., Forney L.J. (1995) Analysis of factors affecting the accuracy, reproductibility, and interpreation of microbial community carbon source utilization patterns. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1458-1468. Hamamoto T., Horikoshi K. (1992) Alkaliphiles. Encyclopedia of Microbiology. Vol. 1. pp. 81-87. Hinnebusch B.J. (1997) Bubonic plague: a molecular genetic case history of the emergence of an infectious disease. J. Mol. Med. 75:645–652. Hiraishi A., Yonemitsu Y., Matsushita M., Shin Y.K., Kuraishi H., Kawahara K. (2002) Characterization of Porphyrobacter sanguineus sp. nov., an aerobic bacteriochlorophyll-containing bacterium capable of degrading biphenyl and dibenzofuran. Arch. Microbiol. 178: 45-52. Holben W.E., Harris D. (1995) DNA-based monitoring of total community structure in environmental samples. Mol. Ecol. 4: 627-631. Hoower R.B., Pikuta E.V., Bej A.K., Marsic D., Whitman W.B., Tang J., Krader P. (2003) Spirochaeta americana sp. nov., a new haloalkaliphilic, obligately anaerobic spirochaete isolated from soda Mono Lake in California. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 815-821. Horikoshi K. (1991) Microorganisms in Alkaline Environments. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim. Horikoshi K. (1995) Discovering novel bacteria, with an eye to biotechnological applications. Curr. Opin. Biotechnol. 6: 292-297. Horn M.A., Ihssen J., Matthies C., Schramm A., Acker G., Drake H.L. (2005) Dechloromonas denitrificans sp. nov., Flavobacterium denitrificans sp. nov., Paenibacillus anaericanus sp. nov. and Paenibacillus terrae strain MH72, N2Oproducing bacteria isolated from the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1255-1265. Huang Y., Dai X., He L., Wang Y., Wang B., Liu Z., Liu S. (2005) Sanguibacter marinus sp. nov., isolated from coastal sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1755–1758. Humayoun S.B., Bano N., Hollibaugh J.T. (2003) Depth distribution of microbial diversity in Mono Lake, a meromictic soda Lake in California. Appl. Environ. Micobiol. 69: 1030– 1042. Humphry D.R., Black G.W., Cummings S.P. (2003) Reclassification of 'Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa' NCIMB 10462 (Ueda et al. 1952) as Cellvibrio japonicus sp. nov. and revival of Cellvibrio vulgaris sp. nov., nom. rev. and Cellvibrio fulvus sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 393-400. Idris R., Trifonova R., Puschenreiter M., Wenzel W.W., Sessitsch A. (2004) Bacterial communities associated with flowering plants of the Ni hyperaccumulator Thlaspi goesingense Appl. Environ. Microbiol. 70: 2667–2677. Ivanova E.P., Wright J.P., Lysenko A.M., Zhukova N.V., Alexeeva Y.V., Buljan V., Kalinovskaya N.I., Nicolau D.V., Christen R., Mikhailov V.V. (2006) Characterization

122

of unusual alkaliphilic gram-positive bacteria isolated from degraded brown alga thalluses. Mikrobiol. Z. 68: 10-20. Jeon C.O., Park W., Ghiorse W.C., Madsen E.L. (2004) Polaromonas naphthalenivorans sp. nov., a naphthalene-degrading bacterium from naphthalene-contaminated sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 93–97. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. (1998) Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles. 2: 191-200. Jones D., Keddie R.M. (2000) The Genus Artrobacter, chapter. 55 In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 945-960. Joo G.J., Kim Y.M., Lee I.J., Song K.S., Rhee I.K. (2004) Growth promotion of red pepper plug seedlings and the production of gibberellins by Bacillus cereus, Bacillus macroides and Bacillus pumilus. Biotechnol. Lett. 26: 487-491. Jooste P.J, Hugo C.J (1999) The taxonomy, ecology and cultivation of bacterial genera belonging to the family Flavobacteriaceae. Int. J. Food Microbiol. 53: 81-94. Juhnke M.E., Mathre D.E., Sands D.C. (1987) Identification and characterization of rhizosphere-competent bacteria of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 53: 2793-2799. Juretschko S., Loy A., Lehner A., Wagner M. (2002) The microbila community composition of a nitrifying-denitrifying activated sludge from an industrial sewage treatment plant analyzed by the full-cycle rRNA approach. Syst. Appl. Microbiol. 25: 84-99. Kalmbach S., Manz W., Wecke J., Szewzyk U. (1999) Aquabacterium gen. nov., with description of Aquabacterium citratiphilum sp. nov., Aquabacterium parvum sp. nov. and Aquabacterium commune sp. nov., three in situ dominant bacterial species from the Berlin drinking water system. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 769-777. Kamekura M., Dyall-Smith M.L., Upasani V., Ventosa A., Kates M. (1997) Diversity of alkaliphilic halobacteria: proposals for transfer of Natronobacterium vacuolatum, Natronobacterium magadii, and Natronobacterium pharaonis to Halorubrum, Natrialba, and Natronomonas gen. nov., respectively, as Halorubrum vacuolatum comb. nov., Natrialba magadii comb. nov., and Natronomonas pharaonis comb. nov., respectively. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 853-857. Kämpfer P., Busse H.J., Falsen E. (2006) Polaromonas aquatica sp. nov., isolated from tap water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 605-608. Kämpfer P., Schulze R., Jäckel U., Malik K.A., Amann R., Spring S. (2005) Hydrogenophaga defluvii sp. nov. and Hydrogenophaga atypica sp. nov., isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 341–344. Kang S.H., Cho H.S., Cheong H., Ryu C.M., Kim J.F., Park S.H. (2007) Two bacterial endophytes eliciting both plant growth promotion and plant defense on pepper (Capsicum annuum L.). J. Microbiol. Biotechnol. 17: 96-103. Kaper J.B., Lockman H., Colwell R.R. (1981) Aeromonas hydrophila: ecology and toxigenicity of isolates from an estuary. J. Appl. Bacteriol. 50: 359-377. Kevbrin V.V., Zhilina T.N., Rainey F.A., Zavarzin G.A. (1998) Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits Curr. Microbiol. 37: 94-100. Khmelenina N.V., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. (1997) Isolation and characterisation of halotolerant alcaliphilic metanotrophic bacteria from Tuva Soda Lakes. Curr. Microbiol. 35: 257-261. Kim M.K., Pulla R.K., Kim S.Y., Yi T.H., Soung N.K., Yang D.C. (2008) Sanguibacter soli sp. nov., isolated from soil of a ginseng field. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 538-541. Kimura M. (1980) A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16: 111–120.

123

Kirchman D.L. (2002) The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments. FEMS Microbiol. Ecol. 39: 91–100. Kiviat E., Hamilton E. (2001) Phragmites use by Native North Americans. Aquat. Bot. 69: 341-357. Kloepper J.W., Leong J., Teintze M., Schroth N.M. (1980) Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria. Nature 286: 885-886. Koch C., Schumann P., Stackebrandt E. (1995) Reclassification of Micrococcus agilis (AliCohen 1889) to the genus Arthrobacter as Arthrobacter agilis comb. nov. and emendation of the genus Arthrobacter. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 837-839. Konopka A., Oliver L., Turco R. F. (1998) The use of carbon substrate utilization patterns in environmental microbiology. Microbil. Ecol. 35: 103-115. Kotsis I., Fehér E., Cziráki R. (1982) A Balaton nyílt vize baktériumnépességének összetételéről. MTA Biol. Oszt. Közl. 25: 245-260. Kovács M., Engloner A., Turcsányi G. (1998) A Balaton sekélyvízi zónája növényzetének (hínárosok, nádasok) vizsgálata, szerepük a tápanyageliminációban (összefoglalás). In: Salánki J., Padisák J. (eds.): A Balaton kutatásának 1997-es eredményei. Veszprém. Kovács G., Burghardt J., Pradella S., Shumann P., Stackebrandt E., Márialigeti K. (1999) Kocuria palustris spec. nov. and Kocuria rhizophila spec. nov. isolated from the rhizoplane of narrow-leaved cattail (Typha angustifolia). Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 167173. Kovács G. (2001) Klasszikus és molekuláris biodiverzitási vizsgálatok úszólápon növő keskenylevelű gyékény (Typha angustifolia, L.) rizoplán baktérium-közösségén. ELTE Mikrobiológiai Tanszék, PhD disszertáció. Kröpfl K., Záray Gy., Ács É. (2003a) Investigation of lead and nickel contaminated natural biofilms. Spectrochimica Acta B 58: 2177-2181. Kröpfl K., Záray Gy., Vladár P., Mages M., Ács É. (2003b) Study of biofilm formation by total-reflection X-ray fluorescence spectrometry. Microchem. J. 75: 133-137. Kumar S., Tamura K., Nei M. (2004) MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief Bioinform. 5: 150-163. Kurdi P., Borsodi A. (1995) A Fertő-tó nádasok övezte belső tavai planktonikus baktérium közösségeinek numerikus analízise. Hidrol. Közl. 75: 238-244. Lakatos Gy., Bartha Zs. (1989) Plankton - und Biotekton- untersuchungen im Velencei-see (Ungarn). Acta Biol. Debrecina 21: 37-66. Lakatos Gy., Ács É. (1990) Nád élőbevonat vizsgálatok aVelencei-tavon (1978-88). [Investigations on the reedperiphyton in Lake Velence (1978-88).] IV. Fejér megyei Környezetvédelmi Szeminárium 1990. okt. 15-17. pp. 291-302. Lakatos Gy., Ács É., Buchtijarova L.N. (1991) Study on reed-periphyton in Lake Velence. Ann. Hist. Mus. Nat. Hung. 83: 187-197. Lakatos Gy., Grigorszky I., Bíró P. (1998) Reed-periphyton complex in the littoral of shallow lakes. Verh. Internat. Verein. Limnol. 26: 1852-1856. Lakatos Gy., Kiss M., Mészáros I. (1999) Heavy metal content of common reed (Phragmites australis /Cav./ Trin ex Steudel) and its periphyton in Hungarian shallow standing waters. Hydrobiologia 415: 47-53. Lane D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds.) Nucleic acid techniques in bacterial systematics, John Wiley and Sons, Chichester, pp. 115-147. Langó Zs., Borsodi A.K., Micsinai A. (2002) Comparative studies on Aeromonas strains isolated from lakes Balaton (Hungary) and Fertő/Neusiedlersee (Hungary). Acta Microbiol. Immunol. Hung. 49: 37-45.

124

Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.R., (2005) Biodegradation and Rhodococcus-masters of catabolic versatility. Curr. Opin. Biotechnol. 16: 282-290. Lee J.V., Gibson D.M., Shewan J.M. (1977) A numerical taxonomic study of some Pseudomonas-like marine bacteria. J. Gen. Microbiol. 98: 439-451. Lee S., Furham J.A. (1990) DNA hybridization to compare species composition of natural bacterioplankton assemblages. Appl. Environ. Microbiol. 56: 739-746. Lee Y.K., Jung H.J., Lee H.K. (2006) Marine bacteria associated with the Korean brown alga, Undaria pinnatifida. J. Microbiol. 44: 694-698. Lehr N.A., Schrey S.D., Hampp R., Tarkka M.T. (2008) Root inoculation with a forest soil streptomycete leads to locally and systemically increased resistance against phytopathogens in Norway spruce. New Phytol. 177: 965-976. Lilley, A. K., Fry, J. C., Bailey, M. J., Day, M. J. (1996) Comparison of aerobic heterotrophic taxa isolated from four root domains of mature sugar beet (Beta vulgaris). FEMS Micobiol. Ecol. 21: 231-242. Lovley D.R., Phillips E.J.P., Lonergan D.J. (1989) Hydrogen and formate oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese by Alteromonas putrefaciens. Appl. Environ. Microbiol. 55: 700-706. Lugtenberg B.J.J., Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V. (2002) Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie van Leeuwenhoek 81: 373-383. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 506-577. Ma Y., Zhang W., Xue Y., Zhou P., Ventosa A., Grant W.D. (2004) Bacterial diversity of the Inner Mongolian Baer Soda Lake as revealed by 16S rRNA gene sequence analyses. Extremophiles 8: 45–51. MacDonell M.T., Colwell R.R. (1985) Phylogeny of the Vibrionaceae, and recommendation for two new genera, Listonella and Shewanella. System. Appl. Microbiol. 6: 171-182. Madsen J.D., Chambers P.A., James W.F., Koch E.W., Westlake D.F. (2001) The interaction between water movement, sediment dynamics and submersed macrophytes. Hydrobiologia 44: 71-81. Makk J. (2002) Kovaalgákohoz asszociált baktériumközösségek vizsgálata dunai biofilmekben. ELTE Mikrobiológiai Tanszék, PhD disszertáció. Makk J., Ács É., Márialigeti K., Kovács G. (2003) Investigations on the Danube gravelbiofilm diatom associated bacterial communities. Biologia 58: 729-742. Marilley, L., Aragno M. (1999) Phylogenetic diversity of bacterial communities from different proximity to Lolium perenne and Trifolium repens roots Agric. Ecosyst. Environ. Appl. Soil Ecol. 13: 127-136. Martin-Laurent F., Phillipot L., Hallet S., Chaussod R., Germon J.C., Soulas G., Catroux G. (2001) DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2354-2359. Martins R.M., Davids W., Al-Soud W.A. (2001) Starch-hydrolyzing bacteria from Ethiopian soda lakes. Extremophiles 5: 135-144. Mauchamp A., Blanch S., Grillas P. (2001) Effects of submergence ont he growth of Phragmites australis. Aquat. Bot. 69: 147-164. Megyeri J. (1999) A szikes tavak és élőviláguk: vizsgálatok a Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavain. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 161-169. Melnikova M., Karpunina L.V., Ostakhina N.V., Ignatov V.V. (2000) Enzyme activity of lectins from the nitrogen-fixing soil bacterium Bacillus polymyxa. Current Microbiol. 41: 246-249. Mergaert J., Lednicka D., Goris J., Cnockaert M.C., De Vosand P., Swings J. (2003) Taxonomic study of Cellvibrio strains and description of Cellvibrio ostraviensis sp.

125

nov., Cellvibrio fibrivorans sp. nov. and Cellvibrio gandavensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 465-471. Micsinai A., Borsodi A., Csengeri V., Horváth A., Oravecz O., Nikolausz M., Reskóné M. N., Márialigeti K. (2003) Rhizome-associated bacterial communities of healthy and declining reed stands in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509:707-713. Monfort P., Baleux B. (1990) Dynamics of Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria and Aeromonas caviae in a sewage treatment pond. Appl. Environ. Microbiol. 56: 20072011. Muyzer G., Brinkhoff T., Nübel U., Santegoeds C.M., Schäfer H., Wawer C. (1997) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In: Akkermans A.D.L., van Elsas J.D., de Bruijn F.J. (eds) Molecular microbiology manual vol. 3.4.4. Kluwer, Dordrecht, the Netherlands. pp. 1-27. Muyzer G., De Waal E.C., Uitterlinden A.G. (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 695-700. Nedashkovskaya O.I., Vancanneyt M., Van Trappen S., Vandemeulebroecke K., Lysenko A.M., Rohde M., Falsen E., Frolova G.M., Mikhailov V.V., Swings J. (2004) Description of Algoriphagus aquimarinus sp. nov., Algoriphagus chordae sp. nov. and Algoriphagus winogradskyi sp. nov., from sea water and algae, transfer of Hongiella halophila Yi and Chun 2004 to the genus Algoriphagus as Algoriphagus halophilus comb. nov. and emended descriptions of the genera Algoriphagus Bowman et al. 2003 and Hongiella Yi and Chun Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1757-1764. Nercessian O., Noyes E., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. (2005) Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71: 6885-6899. Neubauer H., Aleksic S., Hensel A., Finke E.J., Meyer H. (2000) Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int. J. Med. Microbiol. 290: 61-64. Nielsen P.H., Jahn A., Palmgren R. (1997) Conceptual model for production and composition of exopolymers in biofilms. Water Sci. Technol. 36: 11-19. Nikolausz M., Márialigeti K., Kovács G. (2004) Comparison of RNA- and DNA-based species diversity investigations in rhizoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion. J. Microbiol. Meth. 56: 365-373. Normander B., Prosser, J.I. (2000) Bacterial origin and community composition in the barley phytosphere as a function of habitat and presowing conditions. Appl. Environ. Microbiol. 66: 4372-4377. Nübel U., Engelen B., Felske A., Snaidr J., Wieshuber A., Amann R.I., Ludwig W., H. Backhaus (1996) Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by temperature gradient gel electrophoresis. J. Bacteriol. 178: 5636-5643. Onishi H., Kamekura M. (1972) Micrococcus halobius sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 233-236. Ostendorp W. (1989) Die-back of reeds in Europe - a critical review of literature. Aquat. Bot. 35:5-26. O'Sullivan L.A, Weightman A.J, Fry J.C (2002) New degenerate Cytophaga-FlexibacterBacteroides-specific 16S ribosomal DNA-targeted oligonucleotide probes reveal high bacterial diversity in River Taff epilithon. Appl. Environ. Microbiol. 68: 201-210. O'Sullivan L.A., Rinna J., Humphreys G., Weightman A.J., Fry J.C. (2005) Fluviicola taffensis gen. nov., sp. nov., a novel freshwater bacterium of the family

126

Cryomorphaceae in the phylum 'Bacteroidetes'. Int. J. Syst. Evol Microbiol. 55: 21892194. Pascual C., Collins M.D., Grimont P.A., Dominguez L., Fernandez-Garayzabal J.F. (1996) Sanguibacter inulinus sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 811-813. Petersen D.J., Srinivasan M., Chanway C.P. (1996) Bacillus polymyxa stimulates increased Rhizobium etli populations and nodulation when co-resident in the rhizosphere of Phaseolus vulgaris. FEMS Microbiol. Lett. 142: 271-276. Pinhassi J., Zweifel U.L., Hagström A. (1997) Dominant marine bacterioplankton species found among colony-forming bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3359-3366. Pinhassi J., Berman T. (2003) Differential growth response of colony-forming alpha- and gamma-proteobacteria in dilution culture and nutrient addition experiments from Lake Kinneret (Israel), the eastern Mediterranean Sea, and the Gulf of Eilat. Appl. Environ. Microbiol. 69: 199-211. Podani J. (1997) Bevezetés a többváltozós biológiai adatfeltárás rejtelmeibe. Scientia Kiadó, Budapest. pp. 212-227. Podschunn R., Ullmann U. (1998) Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin. Microbiol. Rev. 11: 589603. Poindexter J.S. (1991) Dimorphic prosthecate bacteria: the genera Caulobacter, Asticcacaulis, Hyphomicrobium, Hyphomonas and Thiodendron. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 2176-2196. Pollák B., Rusznyák A., Palatinszky M., Márialigeti K., Borsodi A. (2006) Tiszántúli szikes tavak baktériumközösségeinek összehasonlító vizsgálata. Hidrol. Közl. 86: 88-90. Pourcher A.M., Sutra L., Hébé I., Moguedet G., Bollet C., Simoneau P., Gardan L. (2001) Enumeration and characterisation of cellulolytic bacteria from refuse of a landfill. FEMS Microbiol. Ecol. 34: 229-241. Rainey F.A., Ward N., Sly L.I., Stackebrandt E. (1996) The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 1088-1092. Reddy G.S., Prakash J.S., Vairamani M., Prabhakar S., Matsumoto G.I., Shivaji S. (2002) Planococcus antarcticus and Planococcus psychrophilus spp. nov. isolated from cyanobacterial mat samples collected from ponds in Antarctica. Extremophiles 6: 253261. Reed S.C., Middlebrooks E.J., Crites R.W. 1988. Natural systems for watewater treatment. In: Wetland systems. McGraw-Hill, New York, pp.: 164-202. Reiter B., Pfeifer U., Schwab H., Sessitsch A. (2002) Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Appl. Environ. Microbiol. 68: 2261-2268. Reskóné N.M. (1999) A Velencei-tó mai arculata, vízminősége. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9. 175-182. Reskóné N.M., Ponyi J., Szító A., Kiss G., Ács É., Borsodi, A.K. (2001) A Velencei-tó biológiai állapota. Hidrol. Közl. 81. 448-451. Reskóné N.M., Borsodi A.K. (2003) Long-term investigations on the changes of the MPN values of bacterial communities in the sulphur cycle in Lake Velencei, Hungary. Hydrobiologia 506-509: 715-720. Rhodes M.W., Kator H. (1994) Seasonal occurence of mesophilic Aeromonas spp. as a function of biotype and water quality in temperate freshwater lakes. Water Res. 28: 2241-2251.

127

Roberts D.P., Lohrke S.M., Meyerb S.L.F., Buyer J.S., Bowers J.H., Bakerd C.J., Lie W., de Souzaf J.T., Lewis J.A,. Chungg,S. (2005) Biocontrol agents applied individually and in combination for suppression of soilborne diseases of cucumber. Crop. Prot. 24: 141155. Romanenko L.A., Schumann P., Rohde M., Lysenko A.M., Mikhailov V.V., Stackebrandt E. (2002) Psychrobacter submarinus sp. nov. and Psychrobacter marincola sp. nov., psychrophilic halophiles from marine environments. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1291–1297. Romanenko L.A., Uchino M., Falsen E., Zhukova N.V., Mikhailov V.V., Uchimura (2003) Rheinheimera pacifica sp. nov., a novel halotolerant bacterium isolated from deep sea water of the Pacific. Int J Syst Evol Microbiol 53: 1973-1977. Rónai A. (1985) Az Alföld negyedidőszaki földtana. Geol. Hung. 21: p. 446. Rosado A.S., Duarte G.F., Seldin L., van Elsas J. D. (1998) Genetic diversity of nifH gene sequences in Paenibacillus azotofixans strains and soil samples analyzed by denaturing gradient gel electorophoresis of PCR-amplified gene fragments. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2770-2779. Rüger H.J., Höfle M.G. (1992) Marine star-shaped-aggregate-forming bacteria: Agrobacterium atlanticum sp. nov.; Agrobacterium meteori sp. nov.; Agrobacterium ferrugineum sp. nov., nom. rev.; Agrobacterium gelatinovorum sp. nov., nom. rev.; and Agrobacterium stellulatum sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 133-43. Saha P., Krishnamurthi S., Mayilraj S., Prasad G.S., Bora T.C., Chakrabarti T. (2005) Aquimonas voraii gen. nov., sp. nov., a novel gammaproteobacterium isolated from a warm spring of Assam, India. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1491-1495. Saitou N., Nei M. (1987) The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406–452. Sakiyama C.C., Paula E.M., Pereira P.C., Borges A.C., Silva D.O. (2001) Characterization of pectin lyase produced by an endophytic strain isolated from coffee cherries. Lett. Appl. Microbiol. 33: 117-121. Salmassi T.M., Venkateswaren K., Satomi M., Neolson K.H., Newman D. K., Hering J.G. (2002) Oxidation of arsenite by Agrobacterium albertimagni, AOL15, sp. nov., isolated from Hot Creek, California. Geomicrobiol. J. 19: 53–66. Salmassi T.M., Walker J.J., Newman D.K., Leadbetter J.R., Pace N.R., Hering J.G. (2006) Community and cultivation analysis of arsenite oxidizing biofilms at Hot Creek. Environ. Microbiol. 8:50-59. Santegoeds C.M., Ferdelman T.G., Muyzer G., de Beer D. (1998) Structural and functional dynamics of sulphate-reducing populations in bacterial biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3731-3739. Sato K., Yiang H.Y. (1996) Gram-positive bacterial flora on the root surface of wheat (Triticum aestivum L.) growth under different soil conditions. Biol. Fert. Soils 23: 121125. Schlesner H. (1988) Verrucomicrobium spinosum gen. nov., sp. nov.; a fimbriated prosthecate bacterium Syst. Appl. Microbiol. 10: 54-56. Schmidt A. (2003) Kiskunsági szikes tavak összehasonlító vízkémiai vizsgálata. Természetvédelmi Közlemények 10. pp. 153-162. Schmitz R.A., Klopprogge K., Grabbe R. (2002) Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae and Azotobacter vinelandii: NiFL, transducing two environmental signals to the nif transcriptional activator NifA. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4: 235-242. Schulze R., Spring S., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K.H., Kampfer P. (1999) Genotypic diversity of Acidovorax strains isolated from activated sludge and description of Acidovorax defluvii sp nov. Syst. Appl. Microbiol. 22: 205-214.

128

Seidler R.J., Allen D.A., Lockman H., Colwell R.R., Joseph S.W., Daily O.P. (1980) Isolation, enumeration and characterization of Aeromonas from polluted waters used for diving operations. Appl. Environ. Microbiol. 39: 1010-1018. Seldin L., Rosado A.S., da Cruz D.W., Nobrega A., van Elsas J.D., Paiva E.(1998) Comparison of Paenibacillus azotofixans strains isolated from rhizoplane, rhizosphere, and non-root-associated soil from maize planted in two different brazilian soils. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3680-3688. Seo E.J., Yoo S.H., Oh K.W., Cha J., Lee H.G., Park C.S. (2004) Isolation o fan exopolisaacharide-producing bacterium Sphingomonas sp. CS101, which forms an unusual type of sphingan. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: 1146-1148. Shishido M., Loeb B.M., Chanway C.P. (1995) External and internal root colonization of lodgepool pine seedlings by two growth-promoting Bacillus strains originated from different root microsites. Can. J. Microbiol. 41: 707-713. Silva C., Cabral J.M., van Keulen F. (2004) Isolation of a betacarotene over-producing soil bacterium, Sphingomonas sp. Biotechnol. Lett. 26: 257–262. Sinha S.N., Banerjee R.D. (1997) Ecological role of thiosulfate and sulfide utilizing purple nonsulfur bacteria of a riverine ecosystem. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 211-220. Sizova M., Panikov N. (2007) Polaromonas hydrogenivorans sp. nov., a psychrotolerant hydrogen-oxidizing bacterium from Alaskan soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 616619. Smalla K., Wachtendorf U., Heuer H., Liu W.T., Forney L. (1998) Analysis of BIOLOG GN substrate utilization patterns by microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1220-1225. Smit E., Leeflang P., Gommans S., van den Broek K., van Mil S., Wernars K. (2001) Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of the bacterial soil community in a wheat field as determined by cultivation and molecular methods. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2284–2291. Smith K.P., Handelsman J., Goodman R.M. (1999) Genetic basis in plants for interactions with disease-suppresive bacteria. Agricultural Sciences 96: 4786-4790. Sorokin D.Y., Kuenen J.G. (2000a) A novel facultatively autotrophic hydrogen oxidizing bacterium from alkaline environment. Extremophiles 4: 237–245. Sorokin D.Y., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Tourova T.P., Jones B.E., Rainey F.A., Robertson L.A., Kuenen G.J. (2003) Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov. and Thioalkalimicrobium sibericum sp. nov., and Thioalkalivibrio versutus gen. nov., sp. nov., Thioalkalivibrio nitratis sp. nov. and Thioalkalivibrio denitrificans sp. nov., novel obligately alkaliphilic and obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1779-1783. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Lysenko A.M., Mityushina L.L., Kuenen J.G. (2000b) Thioalkalivibrio thiocyanoxidans sp. nov. and Thioalkalivibrio paradoxus sp. nov., novel alkaliphilic, obligately autotrophic, sulfur-oxidizing bacteria capable of growth on thiocyanate, from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 2157-2163. Spring S., Wagner M., Schumann P., Kämpfer P. (2005) Malikia granosa gen. nov., sp. nov., a novel polyhydroxyalkanoate- and polyphosphate-accumulating bacterium isolated from activated sludge, and reclassification of Pseudomonas spinosa as Malikia spinosa comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 621-629. Stackebrandt E., Liesack W., Goebel B.M. (1993) Bacterial diversity in a soil sample from a subtropical Australian environment as determined by 16S rDNA analysis. FASEB J. 7: 232-236.

129

Stackebrandt E., Liesack W. (1993) Nucleic acids and classification. In: Goodfellow M., O’Donnel A. (eds.), Handbook of New Bacterial Systematics. Academic Press, New York, pp. 151-194. Strunk, O., Gross, O., Reichel, B., May, M., Hermann, S., Stuckmann, N., Nonhoff, B., Lenke, M., Ginhart, T., Vilbig, A., Ludwig, T., Bode, A., Schleifer, K. H., Ludwig, W. (1998) ARB: A software environment for sequence data. Department of Microbiology, Technical University Munich, Munich (Germany). Sümegi P., Molnár A., Szilágyi G. (2000) Szikesedés a Hortobágyon. Természet Világa 131: 5. Szabó A. (2001) A Kiskunsági Nemzeti Park (KNP) szikes kisvizeinek Protozoológiai (Ciliata) vizsgálata. Hidrol. Közl. 81: 462–464. Szabó A. (2003) Protozoológiai (Protozoa, Ciliata) vizsgálatok a Fülöpszállás-Szabadszállás környéki szikes kisvizekben (1998–1999). Természetvédelmi Közlemények 10: 229239. Szabó G., Borsodi A., Vladár P., Cech G., Tóth E., Boros E., Márialigeti K. (2004) A Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavainak bakteriológiai vizsgálata. Hidrol. Közl. 84: 147-150. Szabó I., Szeglet P., Tóth I. (1993) Preliminary case study of sludge deposition around the Keszthely bay of the Lake Balaton. First International Conference On Environmental Engineering, Leicester, Great Britain, 21-23 September 1993, Book of Abstracts. Takami H., Inoue A., Fuji F., Horikoshi K. (1997) Microbial flora in the deepest sea mud of the Mariana Trench. FEMS Microbiol. Lett. 152: 279-285. Takeuchi M., Hatano. K. (1998) Union of the genera Microbacterium Orla-Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redifined genus Microbacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 739-747. Tamásné D.Zs. (1999) Hazai szikes vizeink kémiai jellege. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 9: 281-292. Tanner C.C. (1996) Plants for constructed wetland treatment systems – a comparisonof the growth and nutrient uptake of eight emergent species. Ecol. Eng. 7: 59-83. Teske A., Ramsing N.B., Habicht K., Fukui M., Küver J., Jørgensen B.B., Cohen Y. (1998) Sulphate-reducing bacteria and their activities in cyanobacterial mats of solar lake (Sinai, Egypt). Appl. Environ. Microbiol. 62: 2943-2951. Tindall B.J. (1988) Procaryotic life in alkaline, saline, athalassic environment. In: RodriguezValera (ed.): Halofilic bacteria Alicante, Spain: CRC Press Inc., Boca Raton, Florida pp. 31-67. Tixier C., Sancelme M., Aït-Aïssa S., Widehem P., Bonnemoy F., Cuer A., Truffaut N., Veschambre H. (2002) Biotransformation of phenylurea herbicides by a soil bacterial strain, Arthrobacter sp. N2: structure, exotoxicity and fate of diuron metabolite with soil fungi. Chemosphere 46: 519-526. Trebaol G., Gardan L., Manceau C., Tanguy J.L., Tirilly Y., Boury S. (2000) Genomic and phenotypic characterization of Xanthomonas cynarae sp. nov., a new species that causes bacterial bract spot of artichoke (Cynara scolymus L.) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1471-1478. Tsavkelova E.A., Cherdyntseva T.A., Botina S.G., Netrusov A.I. (2007) Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin. Microbiol. Res. 162: 69-76. Ude S., Arnold D.L., Moon C.D., Timms-Wilson T., Spiers A.J. (2006) Biofilm formation and cellulose expression among diverse environmental Pseudomonas isolates. Environ. Microbiol. 8: 1997-2011.

130

Vallaeys T., Topp E., Muyzer G. (1997) Evaluation of denaturing gradient gel electrophoresis int he detection of 16S rDNA sequence variation in rhizobia and methanotrophs. FEMS Microbiol. Ecol. 24: 279-285. Vardavakis E. (1989) Seasonal fluctuations of aerobic cellulolytic bacteria, and cellulase and respiratory activities in a soil profile under a forest. Plant Soil 115: 145–150. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. (1998) The biology of aerobic moderately halophilic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 504-544. Verhille S., Baida N., Dabboussi F., Hamze M., Izard D., Leclerc H. 1999. Pseudomonas gessardii sp. nov. and Pseudomonas migulae sp. nov., two new species isolated from natural mineral waters. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 1559-1572. Victorio L., Gilbride K.A., Allen D.G., Liss S.N. (1996) Phenotypic fingerprinting of microbial communities in wastewater treatment systems. Wat. Res. 30: 1077-1086. Vladár P, Rusznyák A, Márialigeti K, Borsodi AK. (2008) Diversity of sulfate-reducing bacteria inhabiting the rhizosphere of Phragmites australis in Lake Velencei (Hungary) revealed by a combined cultivation-based and molecular approach. Microb. Ecol. In press DOI 10.1007/s00248-007-9324-0. von der Weid I., Paiva E., Nobrega A., van Elsas J.D., Seldin L. (2000) Diversity of Paenibacillus polymyxa strains isolated from the rhizosphere of maize planted in Cerrado. Soil Res. 151: 369-81. von Wintzingerode F., Göbel U.B., Stackebrandt E. (1997) Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiol. Rev. 21: 213-229. Vörös L., Boros E., Sschmidt A., V. Balogh K., Németh B., Somogyi B., Mózes, A. (2006) A fitoplankton fizikai és kémiai környezete fehér vizű szikes tavainkban. Hidrol. Közl. 86: 139–141. Vörös L., V. Balogh K. (2003) Fotoautotróf pikoplankton a Duna-Tisza közi szikes tavakban. Természetvédelmi Közlemények 10: 185–189. Vörös L., V. Balogh K., Boros E. (2005) Pikoplankton dominancia szikes tavakban. Hidrol. Közl. 85: 166–168. Vreeland R.H. (1999) The genus Halomonas. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 1098-1109. Wagner M., Loy A., Nogueira R., Purkhold U., Lee N., Daims H. (2002) Microbial community composition and function in wastewater treatment plants. Antonie van Leeuwenhoek 81: 665-680. Watnick P., Kolter R. (2000) Biofilm, city of microbes. J. Bacteriol. 182: 2675-2679. Wenzel M., Schonig I., Berchtold M., Kampfer P., Konig H. (2002) Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis. J. Appl. Microbiol. 92: 32-40. Weon H.Y., Kim B.Y., Kim M.K., Yoo S.H., Kwon S.W., Go S.J., Stackebrandt E. (2007) Lysobacter niabensis sp. nov. and Lysobacter niastensis sp. nov., isolated from greenhouse soils in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 548-51. White D.C., Sutton S.D., Ringelberg D.B. (1996) The genus Sphingomonas: physiology and ecology. Curr. Opin. Biotechnol. 7: 301–306. Widdel F., Pfenning N. (1992) The genus Desulfuromonas and other Gram-negative sulfurreducing eubacteria. In: The Prokaryotes 3rd Edition. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.H., Stackebrandt E. (eds.), Springer, New York, pp. 33793389.

131

Wilkinson B.J, Sment K.A, Mayberry W.R (1982) Occurrence, localization and possible significance of an ornithine-containing lipid in Paracoccus denitrificans. Arch. Microbiol. 131: 338-343. Willems A., Busse J., Goor M. (1989) Hydrogenophaga, a new genus of hydrogen-oxidizing bacteria that includes Hydrogenophaga flava comb. nov. (formerly Pseudomonas flava), Hydrogenophaga palleronii comb. nov. (formerly Pseudomonas palleronii), Hydrogenophaga pseudoflava comb. nov. (formerly Pseudomonas pseudoflava and "Pseudomonas carboxydoflava"), and Hydrogenophaga taeniospiralis comb. nov. (formerly Pseudomonas taeniospiralis). Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 319-333. Wolde-meskel E., Terefework Z., Frostegard A., Lindström K. (2005) Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from agroforestry legume species in southern Ethiopia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1439–1452. Wolterink A., Kim S., Muusse M., Kim I.S., Roholl P.J., van Ginkel C.G., Stams A.J., Kengen S.W. (2005) Dechloromonas hortensis sp. nov. and strain ASK-1, two novel (per)chlorate-reducing bacteria, and taxonomic description of strain GR-1. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2063-2068. Xie C.H., Yokota A. (2005) Reclassification of Alcaligenes latus strains IAM 12599T and IAM 12664 and Pseudomonas saccharophila as Azohydromonas lata gen. nov., comb. nov., Azohydromonas australica sp. nov. and Pelomonas saccharophila gen. nov., comb. nov., respectively. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 2419-2425. Yang C.H., Crowley D.E. (2000) Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status. Appl. Environ. Microbiol. 66: 345-351. Yoon J.H., Lee C. H., Kang S. J., Oh T. K. (2005) Psychrobacter celer sp. nov., isolated from sea water of the South Sea in Korea. 55: 1885–1890. Zablotowicz R.M., Leung K.T., Alber T., Cassidy M.B., Trevors J.T., Lee H., Veldhuis L., Hall J.C. (1999) Degradation of 2,4-dinitrophenol and selected nitroaromatic compounds by Sphingomonas sp. UG30. Can. J. Microbiol. 45: 840–848. Záray Gy., Kröpfl K., Szabó K., Taba Gy., Ács É., Berlinger B., Salih B., Akbulut A. (2005) Comparison of freshwater biofilms grown on polycarbonate substrata in the Lake Velence (Hungary) and Lake Mogan (Turkey). Microchem. J. 79: 145-148. Zhang H., Sekiguchi Y., Hanada S., Hugenholtz P., Kim H., Kamagata Y., Nakamura K. (2003) Gemmatimonas aurantiaca gen. nov., sp. nov., a Gram-negative, aerobic, polyphosphate-accumulating micro-organism, the first cultured representative of the new bacterial phylum Gemmatimonadetes phyl. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 1155-1163. Zhilina,T.N., Zavarzin G.A. (1994) Alcalophilic anaerobic community at pH 10. Curr. Microbiol. 29: 109-112.

132

12. Köszönetnyilvánítás Szeretném mindenkinek megköszönni a segítségét, akinek része volt abban, hogy ez a dolgozat elkészülhetett.

Kiemelten köszönettel tartozom:

Dr. Borsodi Andreának, témavezetőmnek, a szakmai vezetésen, bátorításon és ösztökélésen túl a kitartásáért és türelméért,

Dr. Márialigeti Károly tanszékvezetı úrnak, hogy a Mikrobiológiai Tanszéken lehetővé tette számomra a munkám elvégzését és mindvégig támogatott,

és Micsinai Adriennek és Vladár Péternek, akiknek a segítségére mindig számíthattam,

Reskóné Nagy Máriának és Kiss Gábornak, a mintavételezésekben nyújtott segítségéért,

a Mikrobiológiai Tanszék mindenkori dolgozóinak, szakdolgozóinak és doktoranduszainak, akik számtalanszor nyújtottak segítı kezet,

és végül, de nem utolsósorban köszönöm családomnak a nélkülözhetetlen támogatást és hátteret, és hogy végig rendületlenül hittek a munkámban és bennem.

133

13. Függelék GN2 MicroPlateTM A1 water

A2 αcyclodextrin

A3 dextrin

A4 glycogen

A5 tween 40

A6 tween 80

A7 N-acetyl-Dgalactos amine

A8 N-acetyl-Dglucosamine

A9 adonitol

A10 L-arabinose

A11 D-arabitol

A12 cellobiose

B1

B2 D-fructose

B3 L-fucose

B4 D-galactose

B5 gentiobiose

B6 α-D-glucose

B7 m-inositol

B8 α-D-lactose

B9 lactulose

B10 maltose

B11 D-mannitol

B12 D-mannose

C2 ß-methyl-Dglucoside

C3 D-psicose

C4 D-raffinose

C5 L-rhamnose

C6 D-sorbitol

C7 sucrose

C8 D-trehalose

C9 turanose

C10 xylitol

C11 methyl pyruvate

C12 monomethyl succinate

D1 acetic acid

D2 cis-aconitic acid

D3 citric acid

D4 formic acid

D5 D-galactonic acid lactone

D6 Dgalacturonic acid

D7 D-gluconic acid

D8 Dglucosamini c acid

D9 Dglucuronic acid

D10 α-hydroxy butyric acid

D11 ß-hydroxy butyric acid

D12 γ-hydroxy butyric acid

E1 p-hydroxy phenilacetic acid

E2 itaconic acid

E3 α-keto butyric acid

E4 α-keto glutaric acid

E5 α-keto valeric acid

E6 D,L-lactic acid

E7 malonic acid

E8 propionic acid

E9 quinic acid

E10 D-saccharic acid

E11 sebacic acid

E12 succinic acid

F1 bromo succinic acid

F2 succinamic acid

F3 glucuron. amide

F4 alaninamide

F5 D-alanine

F6 L-alanine

F7 L-alanylglycine

F8 L-asparagine

F9 L-aspartic acid

F10 L-glutamic acid

F11 glycyl-Laspartic acid

F12 glycyl-Lglutamic acid

G1 L-histidine

G2 hydroxy Lproline

G3 L-leucine

G4 L-ornithine

G5 Lphenylalanin e

G6 L-proline

G7 Lpyroglutami c acid

G8 D-serine

G9 L-serine

G10 L-threonine

G11 D,Lcarnitine

G12 γ-amino butyric acid

H1 urocanic acid

H2 inosine

H3 uridine

H4 thymidine

H5 phenyl ethylamine

H6 putrescine

H7 2-amino ethanol

H8 2,3butanediol

H9 glycerol

H11 D,L-aglycerol phosphate

H11 glucose-1phosphate

H12 glucose-6phosphate

i-erythritol C1 D-melibiose

ECO MicroPlateTM A1 water

A2 ß-Methyl-DGlucoside

A3 DGalactonic acid γLactone

A4 L-Arginine

A1 water

A2 ß-Methyl-DGlucoside

A3 DGalactonic acid γLactone

A4 L-Arginine

A1 water

A2 ß-Methyl-DGlucoside

A3 DGalactonic acid γLactone

A4 L-Arginine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 DGalacturonic acid

B4 LAsparagine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 DGalacturonic acid

B4 LAsparagine

B1 Pyruvic acid methyl ester

B2 D-Xylose

B3 DGalacturonic acid

B4 LAsparagine

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 LPhenylalanin e

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 LPhenylalanin e

C1 Tween 40

C2 i-Erythritol

C3 2-Hydroxy Benzoic Acid

C4 LPhenylala nine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

D1 Tween 80

D2 D-Mannitol

D3 4-Hydroxy Benzoic acid

D4 L-serine

E1 α-C ycloDextrine

E2 N-Acetyl-DGlucosamine

E3 Hydroxybut yric acid

E4 L-Threonine

E1 α-CycloDextrine

E2 N-Acetyl-DGlucosamine

E3 Hydroxybut yric acid

E4 L-Threonine

E1 α-CycloDextrine

E2 N-Acetyl-DGlucosamine

E3 Hydroxybut yric acid

E4 L-Threonine

F1 Glycogen

F2 D- Glucosaminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-LGlutamic acid

F1 Glycogen

F2 D- Glucosaminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-LGlutamic acid

F1 Glycogen

F2 D- Glucosaminic acid

F3 Itaconic acid

F4 Glycyl-LGlutamic acid

G1 DCellobiose

G2 Glucose-1Phosphate

G3 αKetobutyric acid

G4 Phenylezhylamine

G1 DCellobiose

G2 Glucose-1Phosphate

G3 αKetobutyric acid

G4 Phenylethylamine

G1 DCellobiose

G2 Glucose-1Phosphate

G3 αKetobutyric acid

G4 Phenylethylamine

H1 α-D-Lactose

H2 D,L-αGlycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

H1 α-D-Lactose

H2 D,L-αGlycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

H1 α-D-Lactose

H2 D,L-αGlycerol Phosphate

H3 D-Malic acid

H4 Putrescinee

1. ábra

134

törzsek származása minta táptalaj

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság)

törzsek száma

Agrobacterium vitis (AB118158; 97-98%)

24

L, G, F

Acidovorax delafieldii (AF332187; 99%)

3

L

Delftia sp. (AF509481; 99%)

3

L, G

Hydrogenophaga sp. (AM051269; 99%)

5

G, F

1

2

3

4

A, B, O, T

-

25

50

-

B

-

-

+

-

A, B, T

-

+

33

33

O, T

-

-

14

-

5

9

fenotípusos sajátságok 10 11 12 13 14

15

16

4

-

42

-

-

13

-

33

-

-

-

-

-

+

-

-

6

7

8

-

-

4

-

-

-

-

-

+

+

-

33

-

-

-

-

-

-

-

-

-

29

29

-

-

57

-

-

17

18

19

20

21

4

-

-

-

+ 14

22

23

96

-

4

4

8

-

-

+

-

-

+

-

+

+

+

+

-

-

-

14

-

-

57

-

-

-

Rhodoferax fermentans (D16212; 99%)

1

L

B

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Pseudomonas anguilliseptica (AF439803; 98-100%)

21

L, F

B, O, T

-

29

38

-

5

-

-

-

90

86

10

-

33

-

76

-

-

5

10

24

10

67

-

Pseudomonas fragi (D84014; 98%)

4

L, G

A, B, T

-

50

75

-

-

-

-

-

-

25

50

-

-

-

-

-

-

-

-

-

25

+

-

Pseudomonas marginalis (AF311387; 99%)

8

L, F

B, O

-

75

88

-

-

-

25

-

-

50

-

-

-

-

63

-

-

+

+

+

-

-

-

Pseudomonas putida (AY972175; 98%)

8

G, F

B, O

-

+

88

-

-

-

88

-

-

50

13

-

25

63

88

-

-

13

25

25

-

25

-

Aeromonas sobria (X74683; 99-100%)

43

L, G, F

B, O, T

-

91

70

+

+

95

+

+

-

98

-

98

+

-

47

21

93

93

+

98

91

95

-

Aeromonas veronii (X74684; 99%)

4

L, G, F

O, T

-

+

75

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

25

50

+

+

75

+

75

75

-

Shewanella putrefaciens (X81623; 97%)

2

F

O

-

+

50

-

-

-

50

-

-

+

-

-

+

-

50

-

-

-

-

-

-

50

-

Psychrobacter sp. (DQ337539; 95%)

2

L, G

T

-

+

+

+

+

-

+

+

-

-

-

-

50

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

Bacillus cereus (AY842872; 99-100%)

8

L, G, F

B, O, T

+

+

25

63

50

25

63

50

-

-

-

25

25

-

-

50

25

25

25

+

50

25

-

Bacillus sp. (AF414443; 99%)

5

G

O, T

+

+

-

20

20

-

60

60

-

20

-

-

40

-

20

60

-

60

+

80

60

20

-

Marinibacillus marinus (AJ237708; 98%)

2

G

A, O

+

50

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

+

+

50

50

50

-

Brevibacillus agri (AB039334; 96%)

3

G

B, T

+

+

-

+

+

-

+

+

-

-

-

-

67

-

-

+

+

+

+

67

67

-

-

Paenibacillus sp. (AB043868; 95%)

2

G

T

+

+

-

50

50

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

-

+

-

+

+

50

-

Exiguobacterium aurantiacum (DQ019166; 98%)

1

G

T

+

+

-

+

+

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

+

+

-

-

Kocuria palustris (AJ536438; 99%)

6

L, G, F

T

+

+

-

17

17

-

+

+

-

-

-

-

67

-

-

67

17

-

50

17

-

17

-

Kocuria rosea (AY211171; 99%)

3

L, G

T

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

Micrococcus sp. (AY357893; 95%)

7

L, G

A, B, T

+

86

14

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

14

71

+

-

29

-

Arthrobacter crystallopoietes (X80738; 99%)

4

L

A, B, T

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

25

75

75

+

-

Aureobacterium kitaminense (AB013919; 99%)

2

G

B

+

50

-

+

50

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

50

+

+

-

-

Microbacterium arborescens (AY649756; 97%) 2 L B, O + + + + + fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3- redukciója NO2--té; 14 NO3- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontás rövidítések: T, Lángi-tisztás; G, Gárdony; F, Fürdető; A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, TSY táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív 1. táblázat A Velencei-tó három mintavételi területéről származó nád biofilm mintákból 2000. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

135

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság)

törzsek száma

törzsek származása minta táptalaj

1

2

3

4

5

6

7

8

9

fenotípusos sajátságok 10 11 12 13 14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Bacillus pumilus ( AJ458441; 99%)

59

F, G, L

A, B, O, T

53

36

39

61

46

-

98

95

3

31

5

-

2

-

10

73

25

+

78

80

12

25

-

Bacillus cereus (AB257305; 100%)

2

L

A, B

+

-

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

50

50

+

-

+

+

-

-

Bacillus licheniformis (AB039328; 99%)

1

L

T

+

-

-

-

-

-

+

+

-

+

-

-

+

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

Bacillus firmus (AF526919; 99%)

6

F, G, L

A, O, T

50

83

+

33

17

-

83

33

-

83

17

-

17

-

50

17

17

67

83

+

83

-

-

Bacillus fusiformis (AY548954; 97-100%)

5

F, G, L

B, T

+

-

+

-

-

-

40

-

40

20

20

-

20

-

20

-

-

60

20

20

40

40

-

Marinibacillus marinus (AJ237708; 99%)

2

G

A

+

+

+

-

-

-

-

-

50

50

+

-

-

-

-

-

-

50

+

+

+

-

-

Marinibacillus campisalis (AY190535; 98%)

8

F, G, L

B, O, T

75

-

+

-

-

-

13

-

-

25

-

-

25

13

-

-

-

63

+

+

75

-

-

Rhodococcus erythropolis (AF420422; 99%)

22

F, G, L

A, B, O, T

77

23

77

-

-

-

4

-

95

-

32

-

9

-

-

-

-

23

-

32

-

4

-

Micrococcus sp. (AJ313024; 99%)

24

F, G, L

A, O, T

+

21

+

-

-

-

17

-

13

4

-

-

-

-

-

4

-

17

+

96

-

46

-

Microbacterium flavescens (AB004716; 98%)

1

L

B

+

-

-

+

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

+

-

-

-

Microbacterium sp. (AJ876685; 99%)

27

F, G, L

A, B, O, T

67

48

96

33

4

-

+

89

-

15

-

-

7

-

44

74

41

+

96

96

4

56

-

Aureobacterium kitaminense (AB013920; 99%)

3

F, L

B, O

+

-

33

33

-

-

+

67

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

33

+

67

-

-

Arthrobacter ramosus (X80742; 97%)

9

G, L

A, B, O, T

78

11

11

-

-

-

-

-

-

-

22

-

11

-

-

44

11

89

+

89

-

-

-

Kocuria rosea (DQ060382; 99%)

2

L

A, O

+

-

+

-

-

-

+

+

-

-

-

-

50

-

-

-

50

-

-

-

-

-

-

Kocuria palustris (AJ536438; 100%)

9

F, G, L

A, O, T

89

22

+

-

-

11

78

56

22

-

-

-

89

-

-

-

-

11

-

11

56

22

-

Rhodobacter sp. (U63934; 98%)

28

F, G, L

A, B, O, T

-

21

93

-

-

-

32

7

-

7

7

-

4

-

-

11

-

79

4

-

-

18

-

Defluvibacter lusatiae (AJ132378; 98%)

2

L

A

-

+

+

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

+

50

+

-

-

-

-

-

Klebsiella pneumoniae (AY043391; 99%)

3

F, G, L

B

-

-

67

+

+

33

+

+

-

67

-

-

67

-

-

67

-

+

-

-

-

33

-

Serratia marcescens (AY043387; 98%)

5

G, L

A, B, T

-

60

80

80

80

-

+

+

-

-

20

-

80

-

-

40

40

+

60

40

-

20

-

Pseudomonas putida (AF095892; 97%)

8

G, L

B, O, T

-

38

38

-

-

-

75

-

38

88

13

-

25

-

-

-

-

-

50

13

13

+

-

Pseudomonas gessardii (AF074384; 100%)

9

F, L

B, O, T

-

44

78

78

-

-

78

22

22

44

-

-

89

-

11

-

-

33

+

44

-

89

-

Aeromonas salmonicida (AF541929; 99%)

15

F, G, L

A, B, O, T

-

93

27

+

+

60

+

+

-

+

13

47

87

-

40

13

47

60

+

80

93

+

-

Aeromonas popoffii (AJ223180; 99%) 1 F T + + + + + + + + + + + + + + fenotípusostesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3 redukciója NO2 -té; 14 NO3 redukciója N2-né ; 15 NO3 redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontás rövidítések: L, Lángi-tisztás; G, Gárdony; F, Fürdető; A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, TSY táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív 2.táblázat A Velencei-tó hátom mintavételi területéről származó nád biofilm mintákból 2001. júliusában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

136

1

2

3

4

5

6

7

8

9

fenotípusos sajátságok 10 11 12 13 14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

A

-

50

+

17

17

-

17

17

33

50

-

-

-

-

17

-

-

+

-

50

-

67

-

1

A

-

-

+

-

+

-

+

+

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

+

-

Hydrogenophaga taeniospiralis (AF078768; 97%)

2

B, O

-

50

50

-

-

-

-

-

50

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Acidovorax delafieldii (AF332187; 99%)

4

B, O

-

25

50

25

-

-

25

-

+

+

-

-

-

-

25

-

-

25

25

25

25

+

-

Acidovorax temperans (AY880181; 99%)

2

O

-

50

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

50

-

+

-

Yersinia aldovae (AJ871363; 99%)

2

B

-

-

+

+

+

+

+

+

-

+

-

50

+

-

50

+

+

+

-

-

-

+

-

Pseudomonas anguilliseptica (AF439803; 99%)

1

B

-

+

+

-

-

-

-

-

+

+

-

+

+

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság)

törzsek száma

táptalaj

Paracoccus carotinifaciens (AB006899)

7

Agrobacterim albertimagni (DQ363142)

Yersinia intermedia (AF366380; 99%)

1

O

-

-

+

+

+

-

+

+

-

+

-

+

+

-

-

+

+

+

-

-

-

+

-

Pseudomonas anguilliseptica (AM263519; 99%)

4

O

-

50

75

25

-

-

75

25

50

75

50

-

50

-

50

-

-

25

+

75

25

+

-

Pseudomonas stutzeri (U65012; 99%)

2

T

-

+

50

-

-

-

-

50

+

+

50

-

50

50

+

-

-

-

50

50

50

+

-

Pseudomonas fluorescens (DQ439976; 99%)

3

O, T

-

67

67

-

-

-

33

-

33

33

67

-

-

-

-

33

-

-

67

67

-

+

-

Sphingobacterium sp. (AY571816; 98%)

3

O

33

33

+

-

-

-

-

-

33

33

-

-

33

-

33

-

-

67

-

33

-

33

Flavobacterium pectinovorum (AM230490; 96%)

6

O, T

67

67

+

50

-

-

67

17

-

67

33

-

-

83

+

17

-

33

17

50

67

+

-

Nesterenkonia luteus (AY588278; 99%)

5

B, T

+

20

+

-

-

-

-

-

-

20

-

-

-

-

-

20

-

-

20

-

-

-

-

Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 98%)

4

A

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

Plantibacter flavus (AY275509; 98%)

1

B

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

Cellulomonas flavigena (AF140036; 96%)

4

B

+

25

75

-

-

-

-

-

-

75

-

-

-

-

-

-

-

50

-

25

-

-

+

Cellulomonas flavigena (AF140036; 96%)

1

B

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

+

+

Cellulomonas terrae (AY884570; 97%)

1

A

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+

+

Streptomyces flavofungini (EF571003; 98%)

1

T

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

50

-

25

50

-

-

Arthrobacter agilis (AF440440; 96%)

4

T

+

25

75

-

-

-

-

-

-

75

-

-

-

-

-

-

-

50

-

25

-

-

-

Sanguibacter antarcticus (EF211071; 98%)

2

T

+

-

+

-

-

-

-

-

-

50

-

-

-

-

-

50

-

+

-

+

-

-

-

Sanguibacter marinus (AJ783958; 97%)

1

T

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

Dietzia natronolimnea (AJ717374; 99%)

1

A

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

+

-

Kocuria rosea (AM397645; 98%)

2

A

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

50

-

50

-

Bacillus licheniformis (EF423608; 99%)

2

B

+

-

+

50

50

-

50

+

-

+

-

-

+

50

+

+

+

+

-

+

-

+

-

Bacillus firmus (DQ089748; 98%)

1

O

+

-

+

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

+

-

+

-

Bacillus firmus (DQ089748; 98%)

4

T

75

25

75

-

-

-

-

-

25

25

-

-

-

-

50

-

-

50

50

+

-

50

-

Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%)

1

T

+

-

+

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

+

-

Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%)

1

T

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

Bacillus horikoshii (DQ363137; 98%)

3

A

+

33

+

33

33

-

33

33

-

33

-

-

+

-

-

-

-

-

33

+

33

+

-

Planococcus maritimus ( DQ333301; 98%)

1

T

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

50

-

+

-

50

-

2 A, T Planococcus maritimus ( DQ333301; 98%) + + + 50 + 50 fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3 redukciója NO2 -té; 14 NO3 redukciója N2-né ; 15 NO3 redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontás rövidítések: A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, mesterséges tengervizes táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív 3.táblázat A Kelemen-székről származó nád biofilm mintából 2004. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

137

legközelebbi rokon faj/nemzetség (parciális 16S rDNS szekvencia hasonlóság)

törzsek száma

táptalaj

Paracoccus carotinifaciens (AB006899; 99%)

14

Afipia sp. (AJ864853; 99%)

3

Xanthomonas campestris (AF123092; 96%)

1

2

3

4

A, O

-

57

+

-

O

-

33

+

-

1

O

-

+

+

-

Halomonas alkantarctica (AJ564880; 97%)

1

T

-

+

+

Shewanella putrefaciens (X81623; 98%)

3

T

-

+

+

5

fenotípusos sajátságok 10 11 12 13 14

15

16

17

18

21

43

14

-

7

-

14

7

-

33

33

67

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

-

-

6

7

8

9

19

20

21

22

23

-

-

50

-

33

-

+

-

43

-

86

7

93

-

67

33

67

-

67

-

-

-

+

-

+

+

+

-

+

-

+

-

-

+

+

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

33

67

67

33

-

33

-

33

-

-

-

33

+

-

+

-

Pseudomonas marginalis (AM263525; 99%)

2

B, O

-

50

+

50

-

-

50

50

-

50

50

-

50

-

50

50

-

50

+

+

-

50

-

Acinetobacter lwoffii (AM284986; 98%)

3

B, O

-

67

67

33

33

-

33

33

33

33

-

-

33

-

33

33

-

33

67

+

67

+

-

Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 99%)

9

A, T

+

-

+

-

11

-

67

11

22

-

-

-

-

-

-

56

-

-

11

33

-

33

-

Nesterenkonia sandarakina (AY588277; 99%)

13

A, B, O, T

+

-

+

-

8

-

92

8

-

-

-

-

8

-

8

15

-

31

-

15

-

-

-

Nesterenkonia halophila (AY820953; 96%)

1

A

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

Microbacterium ginsengisoli (AB271048; 98%)

3

B, O

+

-

+

-

-

-

+

-

-

50

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

Microbacterium oxydans (AM237353; 99%)

2

B

+

-

+

-

-

-

+

-

-

50

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

Microbacterium testaceum (DQ122218; 99%)

3

B, O

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

Cellulomonas flavigena (AF140036; 97%)

1

B

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

Nocardiopsis exhalans (AB368714; 99%)

4

T

75

25

+

-

-

-

75

-

25

25

75

-

-

-

-

-

-

-

25

+

-

+

-

Jeotgallibacillus (AF281158; 96%)

1

T

+

-

+

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

Bacillus firmus (EF032672; 97%)

1

T

+

-

+

+

+

-

+

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Planococcus maritimus (DQ333301; 98%)

5

T

50

50

+

-

25

-

25

25

50

+

-

-

-

-

50

-

-

50

-

75

50

75

-

Planococcus southpolaris (AJ314745; 97%)

1

O

+

-

+

-

-

-

-

+

-

+

+

-

-

-

+

-

-

+

+

+

-

+

-

Staphylococcus lentus (D83370; 99%)

1

T

+

-

+

-

-

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

-

-

-

+

+

-

+

-

fenotípusos tesztek: 1 Gram reakcó; 2 oxidáz; 3 kataláz; 4 D-glükóz oxidatív (24h); 5 D-glükóz fermentatív (24h) ; 6 gáztermelés D-glükóz fermentáció közben ; 7 D-glükóz oxidatív (1 hét) ; 8 D-glükóz fermentatív (1 hét); 9 ammonifikáció; 10 mozgás; 11 H2S ciszteinből; 12 indol triptofánból; 13 NO3- redukciója NO2--té; 14 NO3- redukciója N2-né ; 15 NO3- redukciója NH3-vá; 16 metilvörös reakció; 17 Voges-Proskauer reakció; 18 eszkulin hidrolízis; 19 kazein hidrolízis; 20 zselatin hidrolízis; 21 keményítő hidrolízis; 22 tween 80 hidrolízis; 23 cellulózbontás rövidítések: A, Horikoshi-féle alkalikus táptalaj; B, King's B táptalaj; O, Caulobacter táptalaj; T, tengervizes táptalaj; +, 100 % pozitív; -, 100% negatív 4.táblázat A Nagy-Vadasról származó nád biofilm mintából 2004. áprilisában kitenyésztett baktériumtörzsek fenotípusos jellemzése az ARDRA vizsgálatukat követően kialakított törzscsoportok szerint, teszteredményeik százalékos formában való feltüntetésével, valamint az egyes ARDRA csoportok reprezentánsainak 16S rDNS parciális szekvencia-analízise alapján történt identifikáció.

138

ARDRA csoport klónjainak száma

α-proteobaktériumok

4 1

környezeti klón (EF220748) környezeti klón (DQ432405)

5

környezeti klón (AF418951)

3 3

környezeti klón (EF540429) Sphingomonas kaistensis ( AY785128) tenyésztésbe nem vont Rickettsiales batérium klón (DQ223223) Aquabacterium sp. (EF179861) környezeti klón (DQ501338) környezeti klón (EF417647) tenyésztésbe nem vont Mehylophilaceae baktérium klón (AY338037) Lysobacter niastensis ( DQ462462) környezeti klón (DQ351758) tenyésztésbe nem vont Xanthomonadaceae baktérium klón (EF019778) tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (EF520603) Flavobacterium sp. (DQ530100) tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (AM157589) Flexibacter ruber (M58788) Haliscomenobacter hydrossis ( AJ784892) tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (AJ318142) tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (DQ003154) tenyésztésbe nem vont Sphingobacteria baktérium klón (EF520596) tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes baktérium klón (DQ917823)

2

β-proteobaktériumok

3 3 3 3 1 7

γ-proteobaktériumok

1 3 2 2 3 2

Bacteriodetes

4 3 4 5

Chlorobi (zöld kén baktériumok) Chloroflexi (zöld nem kén baktériumok) Spirochaetes Verrucomicrobia

2 1 3 1 2

Gemmatimonadetes 3 kloroplaszt cianobaktérium klónok

legközelebbi rokon nemzetség/faj

14 9 8 7 4 1 3 1

környezeti klón (EF203206) tenyésztésbe nem vont Chloroflexi baktérium klón (EF220771) környezeti klón (AY940555) tenyésztésbe nem vont Verrucomicrobia baktérium klón (EF220751) tenyésztésbe nem vont Gemmatimonadetes baktérium klón (EF220497) tenyésztésbe nem vont Gemmatimonadetes baktérium klón (DQ828292)

cianobacterium klón (AY580403) cianobacterium klón (DQ289925) kiméra kiméra kiméra kiméra

szekvencia hasonlóság 99% (414/418) 98% (400/408) 99% (413/415), 97% (390/401) 98% (410/416) 98% (422/428) 99% (436/439) 98% (470/485) 98% (465/473) 97% (467/477) 96% (451/466) 98% (469/478) 97% (500/514) 97% (481/494) 98% (464/473) 97% (462/475) 96% (474/489) 97% (451/461) 98% (458/467) 95% (451/470) 98% (465/470) 96% (470/485) 97% (438/450) 98% (464/470) 96% (444/458) 98% (425/433) 99% (476/478) 98% (439/444) 98% (470/477) 97% (392/402) 99% (386/387) 98% (412/418) 97% (434/447)

5.táblázat A velencei-tavi Lángi-tisztás nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

139

ARDRA csoport legközelebbi rokon nemzetség/faj klónjainak száma

szekvencia hasonlóság

3

Agrobacterium sp. (AY826532)

98% (406/403)

6

Agrobacterium sanguineum (AB062106)

99% (410/414)

3

környezeti klón (EF029254)

98% (407/415)

környezeti klón (AF236002)

97% (404/415)

2

Hydrogenophaga atypica (AJ585992)

97% (446/459)

2

Hydrogenophaga taeniospiralis (AY771764)

98% (427/434)

3

Dechloromonas denitrificans (AJ318917)

98% (448/454)

3

Dechloromonas hortensis (AY277621)

98% (459/466)

4

Pelomonas saccharophila (AB021407)

98% (424/432)

2

tenyésztésbe nem vont Comamonadaceae baktérium klón (EF370588)

97% (428/440)

2

környezeti klón (DQ066963)

97% (428/441)

5

Rheinheimera sp. (EF575565)

98% (441/449)

Rheinheimera aquimaris (EF076758)

97% (347/357)

1

Rheinheimera chironomi (DQ298025)

98% (419/425)

4

Rheinheimera chironomi (DQ298025)

98% (398/404)

1

Rheinheimera sp. (EF575565)

98% (406/414)

4

környezeti klón (AF141439)

97% (394/404)

4

Cellvibrio gandavensis (AJ289162)

99% (413/414)

3

Aquimonas voraii (AY544768)

98% (429/435)

4

Dyadobacter fermentans (AF137029)

97% (370/379)

4

Palucidibacter propionicigenes (AB078842)

98% (423/429)

6

tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes sp. klón (AJ534686)

94% (403/425)

2

Flavobacterium hibernum (AJ251068)

98% (299/305)

2

Gelidibacter sp. (AY259512)

97% (427/437)

3

környezeti klón (AY043735)

98% (406/414)

1

környezeti klón (AB297423)

97% (429/442)

4

Sphingobacterium sp. (AY571816)

98% (439/447)

Pedobacter insulae (EF100697)

97% (433/446)

3

Flavobacterium sp. (AJ876670)

97% (447/457)

4

tenyésztésbe nem vont Flavobacteria baktérium klón (AM279209)

97% (450/462)

1

Flavobacterium sp. (AJ876670)

97% (446/458)

3

Arthrobacter agilis (EF010549)

97% (367/375)

4

környezeti klón (AJ232823)

98% (442/448)

α-proteobaktériumok

β-proteobaktériumok

γ-proteobaktériumok

Bacteriodetes

Aktinobaktériumok (nagy G+C tartalmú Gram-pozitív Fibrobacter/Acidobacteria csoport

6.táblázat A Kelemen-szék nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

140

ARDRA csoport legközelebbi rokon nemzetség/faj klónjainak száma

α-proteobaktériumok

α-proteobaktériumok

α-proteobaktériumok

szekvencia hasonlóság

6

Sphingomonas jaspsi (AB264131)

98% (382/389)

6

Agrobacterium albertimagni (DQ363142)

98% (428/436)

4

Agrobacterium sanguineum (DQ363139)

99% (401/402)

4

Agrobacterium albertimagni (DQ363142)

97% (405/417)

7

Paracoccus sp. (AJ309981)

97% (422/434)

Paracoccus carotinifaciens (AB006899)

96% (419/432)

4

környezeti klón (AJ888555)

97% (389/400)

4

Hydrogenophaga teinospiralis (AF078768)

98% (396/402)

2

Hydrogenophaga defluvii (AJ585993)

98% (470/476)

3

környezeti klón (AY546509)

97% (401/410)

4

Malikia spinosa (AB021387)

96% (391/404)

6

Polaromonas aquatica (AM039830)

98% (384/390)

3

Aquabacterium honkongensis (DQ489306)

98% (411/418)

3

Ideonella sp. (DQ664241)

97% (457/471)

1

tenyésztésbe nem vont Ideonella sp. baktérium klón (AY435508)

98% (463/472)

4

Ideonella sp. (AB211233)

94% (402/425)

3

Hydrogenophaga atypica (AJ585992)

99% (467/471)

1

környezeti klón (AY678517)

97% (468/479)

5

környezeti klón (AJ810621)

98% (392/399)

3

Cellvibrio vulgaris (AF448513)

96% (406/419)

5

Aquimonas voraii (AY544768)

99% (440/443)

3

Rheinheimera sp. (EF575565)

100% (434/434)

Rheinheimera chironomi (DQ298025)

97% (421/430)

11

Flavobacterium columnare (AJ491824)

99% (419/421)

3

Flavobacterium filum (DQ372981)

98% (410/417)

2

Flavobacterium kamogawaensis (AB275999)

92% (427/463)

3

Fluviicola taffensis (AF493694)

97% (407/418)

5

tenyésztésbe nem vont Bacteriodetes sp. Baktérium klón (DQ463716)

97% (433/443)

16

Algoriphagus halophilus (AY264839)

96% (337/350)

2

tenyésztésbe nem vont Chloroflexi baktérium klón (AY921893)

97% (420/432)

Bacteriodetes

Chloroflexi csoport

7.táblázat A Nagy-Vadas nád biofilmjéből száramzó klónok ARDRA-csoportosításának, valamint a reprezentáns klónok parciális 16S rDNS szekvencia analízisén alapuló identifkációjának eredményei

141