2. Česká lipidomická konference

2. Česká lipidomická konference a Workshop ICCTI a INER 25. – 27. června 2012, hotel Prestige, Znojmo

PROGRAM KONFERENCE / SBORNÍK ABSTRAKT

Lipidomická sekce České společnosti pro biochemii a molekulární biologii Česká společnost pro genovou a buněčnou terapii a Mezinárodní konsorcium pro buněčnou terapii a imunoterapii pořádají

2. Českou lipidomickou konferenci a workshop

Rekombinantní vakcíny, buněčné vakcíny a transportní systémy Znojmo, hotel Prestige 25. – 27. června 2012 Hlavní partner konference

Partneři



Distributor GE HC pro Českou republiku

Adresa: Drahobejlova 27 Praha 9, 190 00 Tel.: + 420 220 518 399 E-mail: [email protected] www.apczech.cz

2nd Czech Lipidomic Conference Vědecký výbor konference doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D.  Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. prof. Ing. Michal Holčapek, Ph.D.  Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická, Katedra analytické chemie Ing. Miroslav Lísa, Ph.D.  Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická, Katedra analytické chemie prof. MUDr. Jaroslav Michálek, Ph.D.  Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Farmakologický ústav doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.  Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci, Ústav imunologie RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.  Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. doc. RNDr. Irena Valterová, CSc.  Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.

Zvaní přednášející Dr. Harald C. Köfeler  Core Facility Mass Spectrometry & Lipidomics, Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc.  Biology Centre ASCR, Institute of Entomology, České Budějovice Prof. Andrew David Miller  Pharmaceutical Sciences Division, Franklin-Wilkins Building, Waterloo Campus, King‘s College London Dr. Jürgen Schiller  University of Leipzig, Medical Department, Institute of Medical Physics and Biophysics, Germany

Organizace SYMMA, spol. s r.o. Aleš Martinek Kounicova 13 602 00 Brno Tel., Fax. +420 549 123 256 E-mail: [email protected] www.symma.cz



Programme

Monday, June 25, 2012

Monday, June 25, 2012 13:30 – 15:00 Registration 15:00 – 15:10 Conference opening 15:10 – 18:00 Section: LIPIDS IN LIVING SYSTEMS I. Chairman: Irena Valterová 15:10 – 15:50 Keynote lecture - Adaptive changes in lipid composition of biological membranes and storage fat reserves in animals exposed to low temperatures Košťál V. Biology Centre ASCR, Institute of Entomology, České Budějovice 15:50 – 16:10 Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Vaculová A.1,2, Tylichová Z.1,2, Skender B.1,2, Slavík J.3, Ciganek M.3, Kozubík A.1,2, Machala M.3 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic,v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, v.v.i.3 16:10 – 16:30 Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling Tylichová Z.1,2, Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Kozubík A.1,2 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 16:30 – 16:50 Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid metabolism and their role in trail-induced apoptotic signalling in colon cancer cells Skender B.1,2, Vaculová A.1, Slavík J.3, Machala M.3, Kozubík A.1,2, Hofmanová J.1,2 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, v.v.i.3

16:50 – 17:20 Coffee break / Company exhibition 

Programme

Monday, June 25, 2012

17:20 – 17:40 Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou eikosapentaénovou a dokosahexaénovou Komprda T., Zorníková G., Knoll A., Vykoukalová Z., Rozíková V. Škultéty O. Mendelova univerzita v Brně 17:40 – 18:00 Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků Bombus terrestris v průběhu života Jiroš P., Bučánková A., Kofroňová E., Kudzejová M., Šobotník J., Komzáková O.,Valterová I. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. 18:00 – 18:15 Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution Pól J. Thermo Fisher Scientific (Praha), s.r.o. 18:15 – 18:30 Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po metabolomiku pomocí plynové chromatografie Voldřichová M. Pragolab, s.r.o.

18:45 – 21:00 WELCOME PARTY – HOTEL PRESTIGE

Tuesday, June 26, 2012 8:30 – 12:00 Section: LIPIDS IN LIVING SYSTEMS II. Chairman: Michal Holčapek



8:30 – 9:10 Keynote lecture - Lipidomic profiling by high resolution mass spectrometry Köfeler H.C. Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria



9:10 – 9:30 Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic leukodystrophy: diagnostic applications and pathological basis Kuchař L.1, Tureček F.2, Asfaw B.1, Ledvinová J.1 Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General University Hospital in Prague1 Department of Chemistry, University of Washington, Seattle, USA2



9:30 – 9:50 Lipotoxicita a ektopické ukládání lipidů v patogenezi metabolického syndromu a diabetu Malínská H., Kazdová L. Institut klinické a experimentální medicíny



2nd Czech Lipidomic Conference

9:50 – 10:10 Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních kardioprotektivních mediátorů Pekarová M.1, Ambrožová G.1,2, Rudolph T.3, Ravekes T.3, Lojek A.1, Kubala L.1 Biofyzikální ústav, Akademie věd České republiky v.v.i.1 Oddělení experimentální biologie a imunologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita2 Oddělení kardiologie, Hamburg University Heart Center, Hamburg, Německo3

10:10 – 10:40 Coffee break / Company exhibition 10:40 – 11:00 Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy choroby Skoumalová A.1, Illner J.1, Klusáčková Z.1, Topinková E.2, Vyhnálek M.3, Lasz J.3, Hort J.3 Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1 Geriatrická klinika 1. LF UK a VFN2 Neurologická klinika 2. LF UK a FN Motol3 11:00 – 11:20 Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher disease Asfaw B., Kuchař L., Fialová M., Poupětová H., Ledvinová J., Elleder M. Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General University Hospital in Prague 11:20 – 11:40 Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky aktivovaných NMDA receptorů Kudová E.1, Chodounská H.1, Slavíková B.1, Vyklický V.2, Borovská J.2, Krausová B.2, Vyklický L. Jr.2 Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v.v.i.1 Fyziologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.2 11:40 – 12:00 In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu Kopeček M. BioTech a.s.

12:00 – 13:30 Lunch 13:30 – 17:00 Section: LIPID ANALYSIS & LIPIDOMICS Chairman: Josef Cvačka

13:30 – 14:10 Keynote lecture - Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Lipid Research Fuchs B., Süß R., Schiller J.



Programme

Tuesday, June 26, 2012 University of Leipzig, Medical Department, Institute of Medical Physics and Biophysics, Leipzig, Germany

14:10 – 14:30 Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers using Chiral HPLC/MS Lísa M., Holčapek M. University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry 14:30 – 14:50 Modern analytical methods in determination of polyunsaturated fatty acids in intact lipid molecules Tomčala A., Valterová I. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR 14:50 – 15:10 Lipidomic analysis of vernix caseosa Míková R.1, Vrkoslav V.1, Hanus R.1, Kaftan F.1,2, Rejšek J.2, Čmelíková T.3, Horká P.1,2, Zábranská M.1,2, Doležal A.4, Plavka R.4, Cvačka J.1 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.1 Přírodovědecká fakulta UK v Praze2 Gymnázium Joachima Barranda Beroun3 Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze4

15:10 – 15:40 Coffee break / Company exhibition

15:40 -16:00 Identification and quantitation of lipids using high-performance liquid chromatography and mass spectrometry Cífková E., Lísa M., Holčapek M. University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry

16:00 – 16:20 New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients with cardiovascular diseases Holčapek M.1, Cífková E.1, Červená B.1, Lísa M.1, Znaleziona J.2, Vostálová J.2,Galuszka J.3 University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry1 Palacký University Olomouc, Faculty of Medicine and Dentistry2 Faculty Hospital Olomouc, Czech Republic3 16:20 – 16:40 Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů Kapras V.1, Slavíková B.2, Slavíčková A.1, Rambousek L.2, Valeš K.2, Vyklický V.2,Vyklický L. Jr.2 , Kudová E.1, Chodounská H.1 Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, v. v. i.1 Fyziologický ústav, AV ČR, v. v. i.2



2nd Czech Lipidomic Conference 16:40 – 17:00 Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High Resolution Acquisition Workflow Simons B.1, Kauhanen D.2, Sylvänne T.2, Tarasov K.2, Duchoslav E.1, Ekroos K.2 AB SCIEX, Canada1 Zora BioSciences, Finland2

17:00 – 18:00 POSTER SESSION 19:00 – 21:00 SOCIAL DINER IN THE LOUKA MONASTERY IN ZNOJMO

19:00 Performance of the GIDEON string trio 19:45 ZNOVÍN wine tasting 20:15 Social dinner in the Stucco hall

Wednesday, June 27, 2012 8:30 – 11:20 Section: LIPID STRUCTURES AND DRUG DELIVERY SYSTEMS Chairman: Jaroslav Turánek



8:30 – 9:10 Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in vivo; what does it take to move into clinic? Miller A.D. Pharmaceutical Sciences Division, Franklin-Wilkins Building, Waterloo Campus, King‘s College London



9:10 – 9:30 Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and delivery of anticancer and antiviral drugs Turánek J. Veterinary Research Institute, Brno



9:30 – 9:50 Significant synergism of antitumor activities of HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate and IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes: a concept of modern chemoimmunotherapy Kovář M. Institute of Microbiology ASCR, v.v.i., Prague



10

9:50 – 10:10 Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs: paclitaxelas the example Koudelka Š.1,2, Turánek Knötigová P.1,2, Mašek J.1,2, Plocková J.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, Brno1 Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice2

Programme

Wednesday, June 27, 2012

10:10 – 10:40 Coffee break / Company exhibition 10:40 – 11:00 Preparation and characterisation of recombinant OspC liposomebased experimental vaccine with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP against Borrelia burgdorferi Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Křupka M. 4, Turánek-Knotigová P.1,2, Koudelka Š.1, Lukáč R.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2, Ledvina M.3, Raška M.4 Veterinary Research Institute, Brno1 Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno2 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Czech Academy of Science, Prague3 Faculty of Medicine, University of Palacky, Olomouc4 11:00 – 11:20 Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound diagnostics Lukáč R., Turánek J. Veterinary Research Institute, Brno 11:20 – 11:40 Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi na metaloafinitní liposomy ovlivňuje typ vyvolané imunitní odpovědi na myším modelu Křupka M.1, Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Koudelka Š.1, Ledvina M.2, Turánek J.1, Raška M.1 Ústav imunologie Lékařské fakulty UP1 ÚOCHB AV ČR2 11:40 – 12.00 The effect of water-based medium on the structure of gemini surfactant–DOPE–DNA complexes Pullmannová P.1, Lacinová Ľ.2, Funari S.S.3, Murugova T.4, Devínsky F.5, Uhríková D.1 Department of Physical Chemistry of Drugs, Faculty of Pharmacy, Comenius University, Slovak Republic1 Institute of Molecular Physiology and Genetics, S lovak Academy of Sciences, Slovak Republic2 HASYLAB at DESY, Hamburg, Germany3 Frank Laboratory of Neutron Physics, JINR, Dubna, Russia 4 Department of Chemical Theory of Drugs,Faculty of Pharmacy, Comenius University, Slovak Republic5 12:00 – 12.20 Nové trendy ve vědě - Protilátkové čipy a revoluční povrchy pro buněčnou kultivaci Kalfiřtová P. BARIA

12:20 – 13:30 Lunch 11

2nd ICCTI Workshop: Wednesday, June 27, 2012, LECTURES, Hotel Prestige 8:00 – 9:00 Registration

Section A

9:00 – 9:05 Opening of the workshop Michálek J.



9:05 – 11:00 Round Table Discussion – all invited speakers

11:00 – 13:00 Lunch break

Section B 13:00 – 13:30 ICCTI consortium – mission and the first year of experience Michálek J. 13:30 – 14.00 Genetically modified human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for cancer treatment Altaner C. 14:00 – 14:30 Transforming Regenerative Stem Cells to Cancer Immuneeffectors Dominici M. 14.30 – 15.00 Cell-mediated enzyme/prodrug gene therapy in cancer Kucerova L. 15:00 – 15:30 Coffee break

Section C 15:30 – 16:00 Bacterial ghosts as delivery systems Kudela P., Lubitz W. 16:00 – 16:30 Phase I/II clinical trials of dendritic cell-based immunotherapy in patients with the biochemical relapse of the prostate cancer and hormone refractory prostate cancer Spisek R. 16:30 – 16:50 In vivo tracking of dendritic cells and MSC Skopalik J., Michalek J., Turanek-Knötigova P., Turanek J., Redova M. 16:50 – 17:00 ICCTI concluding remarks Michálek J.

12

17:00 End of session

Recombinant Vaccines, Cellular Vaccines and Delivery Systems Day 2, June 28, 2012 PRACTICAL PART, University Campus Bohunice, Brno 8:00 – 9:00 Registration

9:00 – 10:00 Mesenchymal stromal cell expansion systems and QuantumTM Skopalík J.

10:00 – 16:00 Flow cytometry on FACS Canto II 10:00 – 11:00 Sample preparation and labeling (max. 5 persons) Jelínek J. 11:00 – 12:00 Multicolor analysis on FACS Canto II (max. 5 persons) Jelínek J. 12:00 – 13:00 Lunch break 13:00 – 14:00 Sample preparation and labeling (max. 5 persons) Skopalík J. 14:00 – 15:00 Multicolor analysis on FACS Canto II (max. 5 persons) Skopalík J. 15:00 – 16:00 Individual discussions with trainees Skopalík P., Jelínek J.



16:00 End of workshop

13

Všeobecné informace Místo konání

Hotel Prestige, Pražská 100, 669 02 Znojmo

Parkování

Možnost na hlídaném hotelovém parkovišti.

Registrační poplatky

Člen lipidomické sekce Kč 1 250,- převodem Kč 1 550,- na místě Nečlen Kč 1 600,- převodem Kč 1 900,- na místě Studenti Ph.D. Člen lipidomické sekce Kč 650,- převodem Kč 950,- na místě Nečlen Kč 1 000,- převodem Kč 1 300,- na místě /v registračním poplatku je zahrnuto vstupné na konferenci, 2 x oběd, vstupenka na společenský večer, občerstvení v průběhu konference, konferenční materiály a DPH /

Registrace účastníků

25. června 2012 12.00 – 16.00 hod 26. června 2012 8.00 – 15.00 hod 27. června 2012 8.00 – 10.00 hod Registrace účastníků bude umístěna ve foyer hotelu Prestige. Registrující osoby, které Vám budou k dispozici po celou dobu konání konference Vám rádi sdělí Vaše event. dotazy.

Oběd

Menu 26. června 2012 Menu 27. června 2012 Kuřecí vývar s masem a nudlemi Bramborová polévka 150g Smažený kuřecí řízek 150g Přírodní vepřový plátek Šťouchané brambory Bylinková rýže Nealkoholický nápoj Nealkoholický nápoj Obědy se vydávají oproti stravenkám, které obdržíte při registraci účastníků. Zájemce o bezmasé nebo dietní jídlo žádáme, aby svůj požadavek nahlásili registrujícím osobám.

Společenský večer

Společenský večer formou rautu se koná dne 26. června 2012 v historických prostorách Louckého kláštera. Vstupenku na společenský večer, která je zahrnuta v registračním poplatku obdržíte při registraci účastníků. Odjezd autobusu, který bude přistaven před hotelem Prestige do Louckého kláštera je naplánován na 18.30 hod.

Konferenční materiály

Při registraci obdržíte program konference vč. sborníku abstrakt, blok, tužku a jmenovku.

Konferenční technika

Dataprojektor, PC, bezdrátová myš, laserové ukazovátko a náhledový monitor. Techniku je možné vyzkoušet před zahájením konference nebo v průběhu přestávek. Technická obsluha bude k dispozici po celou dobu konání akce v přednáškovém sále.

Prezentace

Prezentace, které od Vás převezme technik v přednáškovém sále, prosíme dodat na CD/DVD nebo USB Flash disku.

14

SBORNÍK ABSTRAKT

SBORNÍK ABSTRAKT 2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE 25. – 27. června 2012

ABSTRAKTA NEPROŠLA JAZYKOVOU ÚPRAVOU

15

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Obsah: Adaptive changes in lipid composition of biological membranes and storage fat reserves in animals exposed to low temperatures.................................................................................................................19 Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics................................................................20 Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling ...............................................................21 Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid metabolism and their role in trailinduced apoptotic signalling in colon cancer cells ........................................................................................22 Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou eikosapentaénovou a dokosahexaénovou ............23 Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků Bombus terrestris v průběhu života .........................................................................................................................................................24 Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution...............................................................................................25 Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po metabolomiku pomocí plynové chromatografie.............................................................................................................................................................26 Lipidomic profiling by high resolution Mass Spectrometry.........................................................................27 Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic leukodystrophy: diagnostic applications and pathological basis . ...................................................................................................................28 Lipotoxicita a ektopické akumulace lipidů v patogenezi metabolického syndromu a diabetu ....29 Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních kardioprotektivních mediátorů............30 Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy choroby . ............................................31 Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher disease ...........................................32 Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky aktivovaných NMDA receptorů ....................33 In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu....................................................................................34 Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Lipid Research............................................................35 Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers using Chiral HPLC/MS .......................36 Modern analytical methods in determination of polyunsaturated fatty acids in intact lipid molecules . .....................................................................................................................................................................37 Lipidomická analýza novorozeneckého mázku ...............................................................................................38 New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients with cardiovascular diseases . ...39 Identification and quantitation of lipids using high-performance liquid chromatography and mass spectrometry ............................................................................................................................................40 Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů .....................................................................41 Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High Resolution Acquisition Workflow .........42 Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in vivo; what does it take to move into clinic?........................................................................................................................................43 Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and delivery of anticancer and antiviral drugs................................................................................................................................................................44

16

SBORNÍK ABSTRAKT Significant synergism of antitumor activities of HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate and IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes: a concept of modern chemoimmunotherapy ...........45 Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs: paclitaxel as the example ........................46 Preparation and characterisation of recombinant OspC liposome-based experimental vaccine with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP against Borrelia burgdorferi ..........47 Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound diagnostics............................................48 Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi na metaloafinitní liposomy ovlivňuje typ vyvolané imunitní odpovědi na myším modelu . .................................................................49 The effect of water-based medium on the structure of gemini surfactant–DOPE–DNA complexes........................................................................................................................50 Lipid alterations induced by supplemented fatty acids in human colon fetal and carcinoma cells.....................................................................................................................................................51

POSTEROVÁ SEKCE Nové matrice pro MALDI-MS analýzu uhlovodíků .........................................................................................54 Essential fatty acid diagnostics using modern analytical methods for nutrition studies?................55 Application on fish.......................................................................................................................................................55 Alternativní přístupy strukturní analýzy uhlovodíků ....................................................................................56 A non-aterogenic and atherogenic lipoprotein profile in examined individuals with dyslipoproteinemia.....................................................................................................................................................57 Vliv pohlaví potkanů na cholesterol v séru, játrech a exkrementech při dietě s cholesterolem ...58 Změny ve složení membránových fosfolipidů v erytrocytech u Alzheimerovy choroby .................59 Analýza kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů . ..........................................60 Influence of cholesterol on the solubilization of multilamellar and unilamellar liposomes caused by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide . .....................................................................................61 Klinické aspekty lipidomického profilování v kardiologii . ...........................................................................62 Recombinant CDO from T. mentagrophytes ....................................................................................................63 DNA vaccination of different glycosyltransferses induced immune response after hydrodynamic DNA vaccination of mice ............................................................................................................64 N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide as a structural modulator of monoolein cubic phases...................................................................................................................................................................65

17

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE REJSTŘÍK AUTORŮ Befekadu Asfaw Debela, E-mail: [email protected] Cífková Eva, Ing., E-mail: E-mail: [email protected] Cvačka Josef doc., RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected] Galuszka Jan, MUDr., Ph.D., E-mail: [email protected] Hofmanová Jiřina, doc., RNDr., CSc., E-mail: [email protected] Holčapek Michal, prof., Ing., Ph.D., E-mail: [email protected] Horká Petra, Mgr., E-mail: [email protected] Hubčík Lukáš, Mgr., E-mail: [email protected] Huláková Silvia, E-mail: [email protected] Chodounská Hana, RNDr., CSc., E-mail: [email protected] Jiroš Pavel, Mgr., PhD., E-mail: [email protected] Kašperová Alena, E-mail: [email protected] Klusáčková Zdeňka, Mgr., E-mail: [email protected] Köfeler H.C., Kohutiar Matej, MUDr., E-mail: [email protected] Komprda Tomáš, prof., MVDr., Ing., CSc., E-mail: [email protected] Kopeček Milan, E-mail: [email protected] Košťál Vladimír, doc. Ing., CSc., E-mail: [email protected] Koudelka Štěpán, Ing., Ph.D., E-mail: [email protected] Křupka Michal, Mgr., Ph.D., E-mail: [email protected] Kudová Eva, RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected] Kuchař Ladislav, E-mail: [email protected] Lísa Miroslav, Ing., Ph.D., E-mail: [email protected] Lukáč Róbert, Mgr., E-mail: [email protected] Malínská Hana, RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected] Marounek Milan, prof., E-mail: [email protected] Miller A.D., prof., Mašek Josef, PharmDr., E-mail: [email protected] Oravec Stanislav, doc., MUDr., CSc., E-mail: [email protected] Pekarová Michaela, Ph.D., E-mail: [email protected] Pól Jaroslav, Ph.D., E-mail: [email protected] Pullmannová Petra, Mgr., PhD., E-mail: [email protected] Schiller Jürgen, Dr., Schneedorferová Ivana, Bc., E-mail: [email protected] Skender Belma, E-mail: [email protected] Skoumalová Alice, MUDr., Ph.D., E-mail: [email protected] Stuchlová Horynová Milada, Mgr., E-mail: [email protected] Tomčala Aleš, Mgr., Ph.D., E-mail: [email protected] Turánek Jaroslav, RNDr., CSc., E-mail: [email protected] Tylichová Zuzana, Mgr., E-mail: [email protected] Voldřichová Magdalena, E-mail: [email protected] Vrkoslav Vladimír, Ph.D., E-mail: [email protected]

18

SBORNÍK ABSTRAKT Adaptive changes in lipid composition of biological membranes and storage fat reserves in animals exposed to low temperatures Koštál V. Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Institute of Entomology Animals living in temperate and polar zones have to cope with low temperatures on a seasonal basis. This challenge is most important in ectotherms as their body temperature is dictated by the environment and may even fall below the freezing point. Many species of insects are known to overwinter in the field at body temperatures as low as -60°C and, in laboratory, some show ability for cryopreservation in liquid nitrogen (-196°C). Insects evolved whole array of evolutionary adaptations, including the capacity for rapid acclimatory changes, at all levels of biological organization. Lipidomic change represents a widespread feature of cold-acclimation in different ectotherm animals and also in plants and microorganisms. In this lecture, basic theoretical paradigms that adaptively explain seasonal changes in lipid composition of biological membranes and storage fat reserves in animals will be summarized. These changes either help to maintain and compensate physiological functions at low body temperatures in active animals (capacity adaptation) or they help to prevent damage to the biological structures in those animals that circumvent low temperatures by entering a state of dormancy (resistance response). Major classes of seasonal modifications of lipid composition (such as desaturation; shortening the fatty acyl chain length; reshuffling of fatty acids; phospholipid head group restructuring; changes in sterol content) will be explained in mechanistic terms. Examples from research conducted on insect models in the Laboratory of diapause, Biology Centre ASCR will be presented.

19

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Vaculová A.1,2, Tylichová Z.1,2, Skender B.1,2, Slavík J.3, Ciganek M.3, Kozubík A.1,2, Machala M.3 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic,v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, v.v.i.3 Dietary fatty acids, especially essential n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and shortchain fatty acid butyrate produced by microbial fermentation of fibre in the colon, appeared to be important modulators of cell kinetics in colonic crypts. Thus, the significant role of these compounds in colorectal carcinogenesis is supposed. Composition, structure, and metabolism of cellular lipids are associated with membrane properties and intracellular signalling, thus altering cell behaviour and response to various stimuli. We suggest that PUFAs and butyrate may operate together and they can also modulate the effects of endogenous regulators, such as apoptotic inducers of tumor necrosis factor (TNF) family cytokines. Moreover, their action may be different in the cells on various level of malignant transformation. First, we compared proliferative, differentiation and apoptotic response of the cell lines derived from human colon fetal (FHC), adenoma (AA/C1, RG/C2), and carcinoma tissues (HT-29, HCT116) to treatment with sodium butyrate (NaBt) and n-3 (DHA, 22:6) or n-6 (AA, 20:4) PUFAs alone or in combination. NaBt induced G0/G1 or G2/M arrest of the cell cycle, differentiation (FHC, AA/C1, HT-29) and/or apoptosis (RG/C2, HCT-116) depending on the cell line. Combination of NaBt with AA or especially with DHA suppressed differentiation in FHC, AA/C1 and HT-29 cells and then evoked apoptotic response, particularly in FHC cells. Searching for the attendance of cytokinetic modulation with cellular lipid alterations we detected changes of plasma membrane lipid structure (flow cytometry, merocyanine 540), cytoplasmic lipid droplet accumulation (flow cytometry, Nile red), reactive oxygen species (ROS) production (flow cytometry, DHR-123) and fatty acid content and profile (LC/MS-MS, GC/ MS). Moreover, after treatment wih fatty acids and their combination we detected changes in endogenous fatty acid synthesis associated with modulation of fatty acid synthase expression. All these parameters were the most pronounced in the fatty acid sensitive FHC cells. Fatty acids and their combination also activated nuclear receptor/tran­scription factor PPARgamma and modulated expression of some specific proteins associated with cell growth and death regulation and lipid metabolism. Next, we showed that pretreatment with PUFAs sensitized relatively resistant colon epithelial cell lines to subsequent treatment with endogenous apoptotic inducers anti-Fas antibody (CH11) and TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). In summary, our results imply that dietary fatty acids alone or especially in combination significantly affect behaviour of colon epithelial cells depending on cell transformation status and modulate cell sensitivity to endogenous apoptotic regulators. Supported by grants Nos. P301/11/1730 and 303/09/H048 of Czech Science Foundation.

20

SBORNÍK ABSTRAKT Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling Tylichová Z.1,2, Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Kozubík A.1,2 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 In colon epithelium, a balance between proliferation, diferentiation and apoptosis is essential for maintaining homeostasis. Dysregulation of this condition substantially contributes to colorectal carcinogenesis. The development and progression of this disease may be significantly influenced by dietary lipids, especially by specific fatty acids required for a wide range of physiological functions. Thus, we investigated modulatory effects of short-chain fatty acid sodium butyrate (NaBt), essential polyunsaturated n-3 docosahexaenoic acid (DHA) and their combination in colon cancer cells with different grade of malignancy – human colon fetal (FHC) and adenocarcinoma (HT-29). Since hyperactivation of pro-survival PI3K/Akt signalling pathway is frequent in colorectal cancer, we suppose that it may be involved also in the effects of NaBt and DHA. We used specific Akt 1/2 inhibitor to block this PI3K/Akt pathway. First, we focused on cytokinetic changes induced by NaBt and DHA. Using fluorimetry and western blotting methods we investigated various parameters and found that NaBt decreased cell proliferation (CyQUANT), induced differentiation (alkaline phosphatase activity) and/or apoptosis (caspase-3 and PARP cleavage). Akt1/2 inhibitor increased fatty acid induced differentiation and decreased apoptosis without changes of cell proliferation. Second, we were interested in fatty acid induced lipid alterations. Membrane lipid structure changes - lipid unpacking (Merocyanine 540), lipid droplet accumulation (Nile red), reactive oxygen species production (DHR-123) and decrease in mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry were highly influenced by combined NaBt/DHA treatment and Akt inhibition. Moreover, we detected expression of proteins associated with lipid metabolism. Akt inhibitor additionaly reinforced NaBt/DHA induced decrease in expression of Fatty Acid Synthase (FASN), an enzyme which is often overexpressed in colon cancer cells. We also noticed NaBt/DHA increased activation (Luciferase assay), but decreased expression of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma; (PPARgamma), nuclear receptor mediating the effects of fatty acids on transcription level. Interestingly, activation of PPARgamma correlates with increased expression of caveolin1, protein connected with lipid droplet formation. In summary, our results suggest that fatty acids induced antiproliferative, differentiation and/ or apoptotic effects are associated with specific cellular lipid alterations in colon cancer cells and PI3K/Akt pathway plays the role in these effects. Supported by grants Nos. 303/09/H048 and P301/11/1730 of Czech Science Foundation.

21

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid metabolism and their role in trail-induced apoptotic signalling in colon cancer cells Skender B.1,2, Vaculová A.1, Slavík J.3, Machala M.3, Kozubík A.1,2, Hofmanová J.1,2 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1 Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, v.v.i.3 Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) including their n-3 series representative docosahexaenoic acid (DHA) have been shown to influence the development of colorectal cancer. DHA has unique structural and functional abilities, which allow it to affect diverse physiological and pathological processes at the level of the cell membrane?asociated events and cell signaling pathways involved in regulation of cytokinetics. It is documented that DHA can modulate processes associated with regulation of cancer cell apoptosis. We hypothesized that DHA exerts beneficial effects in sensitizing colon cancer cells to apoptosis induced by TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), thus contributing to their more effective elimination. TRAIL is a  TNF family cytokine which selectively induces apoptosis in cancer cells while sparing normal cells. Because of these unique effects, it is considered as a  promissing anticancer agent. However, some cancer cells such as colon are resistant to TRAIL-induced apoptosis. We showed that pretreatment with physiological doses of DHA resulted in significant enhancement of TRAIL-induced apoptosis of otherwise resistant human colon cells, as documented by increased caspase activation and cleavage of their substrates. Following the combined treatment, stimulation of mitochondrial apoptotic pathway and activation of crucial proapototic effector molecules of the Bcl-2 family such as Bax and Bak were demonstrated. Cellular lipid analyses (HPLC-MS-MS) revealed that treatment with DHA resulted in changes of amount of specific classes of sphingolipids, which are suggested to modulate the cancer cell sensitivity/re­sistance to TRAIL. Analysis of DHA-mediated changes in sphingolipid metabolism, and their impact on apoptotic signaling induced by TRAIL will be presented in our contribution. This work was supported by grants Nos. 301/11/1730 and 303/09/H048 of the Czech Science Foundation.

22

SBORNÍK ABSTRAKT Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou eikosapentaénovou a dokosahexaénovou Komprda T., Zorníková G., Knoll A., Vykoukalová Z., Rozíková V. Škultéty O. Mendelova univerzita v Brně Jedním z  rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění (CVO) je zvýšená hladina krevních lipidů (triacylglyceroly [TAG], cholesterol). K  nutriceutikům s  prokázanou historií snížení rizika CVO patří rybí olej (RO) s vysokým obsahem kyseliny eikosapentaénové (EPA) a dokosahexaénové (DHA). Ovlivnění triacylglycerolémie a cholesterolémie působením EPA a  DHA je na molekulární úrovni založeno na modulaci signálních drah zprostředkovaných transkripčními faktory PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) a  SREBP (sterol response element-binding protein). Na rozdíl od jednoznačného snížení triacylglycerolémie působením EPA/DHA, jsou výsledky epidemiologických studií ohledně cholesterolémie kontroverzní. Cílem experimentu bylo posoudit ovlivnění cholesterolémie potkanů krmených přídavkem RO, včetně zjištění exprese genu insig (inzulinem indukovaný gen), v  jehož promotoru se předpokládá prvek odezvy pro PPAR-alfa, a který kóduje protein INSIG, jenž inhibuje signální dráhu SREBP-2 s důsledkem potlačení exprese klíčových jaterních genů kódujících proteiny řídící homeostázu cholesterolu: 3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktázu (HMG-CoAR) a receptor lipoproteinů nízké hustoty (LDL-R). Byly použity dvě skupiny potkanů (Wistar albino) po 10 jedincích: kontrolní (K), krmená standardní krmnou dávkou (SKD) a  pokusná, krmená SKD s  přídavkem RO (3 %) po dobu 48 dnů. Po odběru krve v  anestezi a  následném utracení zvířat byla odebrána jaterní tkáň. Celkový plazmatický cholesterol, včetně jeho frakcí v  LDL a  HDL (lipoproteiny o  vysoké hustotě) byl stanoven enzymaticko-kolorimetrickou metodou. Z  homogenizované jaterní tkáně byla izolována mRNA, a pomocí metody qRT-PCR byla po korekci na expresi genu pro β-aktin kvantifikována úroveň exprese genů kódujících PPAR-alfa, SREBP-2, INSIG, HMG-CoA-R a LDL-R. Z alikvotního vzorku jater byly extrahovány celkové lipidy směsí hexan/isopropanol a následně bylo stanoveno zastoupení mastných kyselin metodou plynové chromatografie. U RO-potkanů byla oproti kontrole průkazně snížena (P<0,05) hladina celkového plazmatického cholesterolu (1,07 vs. 1,19 mmol/l) a  HDL-cholesterolu (0,75 vs. 0,85 mmol/l); hladina LDLcholesterolu nebyla ovlivněna (0,35 vs. 0,34 mmol/l; P>0,05). Zastoupení EPA+DHA v lipidech jaterní tkáně bylo u RO-skupiny výrazně zvýšeno (P< 0,01) oproti kontrole: 10,9 vs. 4,9 % ze sumy mastných kyselin. Relativní zvýšení exprese genu insig bylo v játrech RO-potkanů více než šestinásobné oproti kontrole (P<0,05). Potlačení exprese genů pro HMG-CoA-R a LDL-R působením EPA/DHA však nebylo prokázáno (P>0,05).

23

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků Bombus terrestris v průběhu života Jiroš P., Bučánková A., Kofroňová E., Kudzejová M., Šobotník J., Komzáková O., Valterová I. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR Životní cyklus matek čmeláka zemního (Bombus terrestris) je provázen fyziologickými změnami, které jsou velmi výrazné. Pro tyto fyziologické pochody mají matky potřebu akumulace značného množství energie. Zvláště pro hibernaci a dále také ve fázi kladení vajíček musejí pokrýt značné energetické nároky. K pokrytí těchto nároků dochází prostřednictvím zásob v tukovém tělese. Jedná se především o glykogen a triacylglyceroly. Na definovaných jedincích z  laboratorního chovu jsme pozorovali a  stanovovali množství (včetně složení) jednotlivých zásobních látek v 6 životních stádiích (farátní, čerstvě vylíhnuté, před a po hibernaci, kladoucí a staré matky). Vedle chemicko-analytických metod bylo také použito vyhodnocování z fotografií ultrastruktur tukového tělesa pořízených elektronovým mikroskopem. Triacylglyceroly byly měřeny pro jednotlivá stádia pomocí LC-MS s  APCI ionizační technikou. Z výsledků vyplývá, že pro jednotlivé fyziologické etapy života matek jsou různé potřeby využití zásobních látek, a také že se mění složení triacylglycerolů v průběhu života. Autoři děkují Technologické agentuře ČR (projekt č. TA01020969) za finanční podporu.

24

SBORNÍK ABSTRAKT Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution Pól J. Thermo Fisher Scientific (Praha), s.r.o.

25

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po metabolomiku pomocí plynové chromatografie Voldřichová M. Pragolab s.r.o.

26

SBORNÍK ABSTRAKT Lipidomic profiling by high resolution Mass Spectrometry Köfeler H.C. Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria

27

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic leukodystrophy: diagnostic applications and pathological basis Kuchař L.1, Tureček F.2, Asfaw B.1, Ledvinová J.1 Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General University Hospital in Prague1 Department of Chemistry, University of Washington, Seattle, USA2 Metachromatic leukodystrophy (MLD, OMIM 250100) is caused by the deficiency of arylsulphatase A (ASA) resulting in lysosomal storage of sulphatides. Three clinical forms of MLD (late infantile, juvenile and adult) can be distinguished by symptoms manifestation. Bone marrow transplantation is the only treatment approach in milder forms of MLD but often with an uncertain outcome. Prenatal diagnosis prevents further occurrence in affected families. Intralysosomal storage of nondegraded sulphatides also occurs in disorders caused by defects in the activator proteins, saposin B or its precursor prosaposin, necessary for arylsuphatase A function. Early diagnosis is important for genetic consulting in families of patients. Different diagnostic approaches are known but only few of them are suitable for screening. Previous diagnostic methods utilized HPTLC chromatographic evaluation of sulphatides excreted in urine. We developed new method based on Folch extraction of urines followed by flow injection analysis and multiple reaction monitoring in negative ion mode by tandem mass spectrometry (FIA-ESI-MS/MS Evaluation of urinary sulphatides pattern in urines from MLD patients.revealed isoform shift toward molecular species with long chain fatty acid. Similarly altered sulfatide isoforms were also found in saposin B and prosaposin deficiences – sulfatidoses of different origin. Based on these data, we developed a  new method of selected (primary elevated) urinary sulphatides isoform measurement. In this procedure, DEAE membranes for selective sulphatide binding were applied on week anex groups to simplify the to avoid liquid sample transportation and to get sulfatide sample partialy purified. We also found Percetually most stable C18:0 isoform was used as indigenous internal standard thus avoiding the need for internal standards from commercial sources. This makes new method simple, fast and reliable. Pathophysiological basis of isoform shift was proposed. Urinary sulphatide profile was monitored over three years in a  patient with juvenile form of MLD after BMT to evaluate the efficiency of treatment. Results were consistent with the patient´s clinical status while the results of ASA activity in leukocytes did not correspond. We conclude that urinary sulfatide profiling offers a robust method applicable for screening studies and treatment monitoring. The benefit is the usage of DEAE membrane that avoids liquid transfers like DBS in enzymology, which is however still missing in the case of MLD. // This work was supported by the project PRVOUK-P24/LF1/3, the Grant SVV 264 502 from the Charles University in Prague, Czech Republic.//

28

SBORNÍK ABSTRAKT Lipotoxicita a ektopické akumulace lipidů v patogenezi metabolického syndromu a diabetu Malínská H., Kazdová L. Institut klinické a experimentální medicíny Metabolický syndrom, který postihuje v  rozvinutých zemích až čtvrtinu populace, výrazně zvyšuje riziko rozvoje diabetu a  kardiovaskulárních chorob. Klíčovou úlohu v  rozvoji metabolického syndromu a s ním asociovaných poruch má nepochybně dyslipidémie a s ní spojené zvýšené ukládání triglyceridů a jejich metabolitů (diacylglycerolů, mastných kyselin s dlouhým řetězcem a ceramidů) mimo tukovou tkáň (ektopicky) do kosterních svalů, jater a  myokardu. Příčinou ektopické akumulace lipidů může být nadměrný kalorický příjem, nerovnováha mezi syntézou lipidů a  jejich nízkou oxidací při nízké fyzické aktivitě, snížená diferenciační schopnost v  tukové tkáni, nižší antilipolytický účinek inzulinu a  řada dalších příčin. Ektopicky uložené lipidy pak nejen vstupují do metabolických pochodů, ale ohrožují i přímo existenci buněk a funkčnost celých orgánů. Nadbytek lipidových metabolitů negativně ovlivňuje funkci buněčných organel, především mitochondrií a  endoplazmatického retikula a  je spojena se zvýšenou produkcí reaktivních metabolitů kyslíku (ROS-reactive oxygen species), oxidačním stresem a aktivací zánětlivých procesů v  metabolicky aktivních tkáních. Tento proces, označovaný jako lipotoxicita, může hrát důležitou úlohu v patogenezi inzulínové rezistence v kosterních svalech, nealkoholické jaterní steatóze, srdečním selhání a  může vést k  rozvoji renálních dysfunkcí. Přestože je otázkám lipotoxicity věnována značná pozornost, zůstávají mechanizmy, kterými dyslipidémie ovlivňuje zánětlivé procesy, oxidační stres a inzulinovou rezistenci neobjasněny. Vliv ektopické akumulace lipidů jsme sledovali v našich studiích na kmeni potkanů s geneticky fixovanou hypetriglyceri­démií, kteří vykazují většinu metabolických poruch spojených s  metabolickým syndromem (dyslipidémie, zhoršená glukózová tolerance, rezistence tkání k účinku inzulinu, hypertenze). Výrazně zvýšené sérové hladiny triglyceridů u těchto potkanů vedly k akumulaci triglyceridů v játrech, kosterních svalech a aortě. Chronicky zvýšené hladiny NEMK pozorované u těchto potkanů jak při OGTT tak během 24 hodinového denního profilu se rovněž mohou uplatnit v patogenezi lipotoxicity. Zvýšené hladiny NEMK u těchto potkanů mohou být důsledkem jejich zvýšené sekrece z adipocytů a nižšího antilipolytického účinku inzulinu. K  akumulaci lipidů může příspívat i  jejich snížená oxidace sledovaná v  kosterních svalech podle inkorporace 14C-palmitátu do CO2 ve svalu. Dyslipidémie a  ektopická akumulace triglyceridů u těchto potkanů byla spojena s nižšími sérovými koncentracemi adiponektinu a  zvýšenými hladinami prozánětlivých faktorů C-reaktivního proteinu, TNF-, a  IL6. Zvýšené koncentrace lipoperoxidačních produktů a  nižší aktivita antioxidačních enzymů zjištěné ve tkáních hypertriglyce­ridemických potkanů svědčí pro oxidační stres. Získané výsledky ukazují, že v  negativních účincích lipotoxicity mohou hrát roli zvýšené koncentrace NEMK ovlivňující negativně glukózovou homeostázu a  utilizaci glukózy v  periferních tkáních. Rovněž se mohou uplatnit zánětlivé procesy indukované zvýšenou produkci prozánětlivých cytokinů. Tyto poruchy spolu s oxidačním stresem mohou přispívat k  rozvoji inzulinové rezistence a  s  ní spojených orgánových komplikací, kterými je jaterní steatóza, diabetes a kardiovaskulárních poruchy. Studie byla podpořena projektem (MZ) rozvoje výzkumné organizace 00023001(IKEM) a granty IAA 500110805 a P301/11/2418.

29

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních kardioprotektivních mediátorů Pekarová M.1, Ambrožová G.1,2, Rudolph T.3, Ravekes T.3, Lojek A.1, Kubala L.1 Biofyzikální ústav, Akadenie věd České republiky v.v.i.1 Oddělení experimentální biologie a imunologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita2 Oddělení Kardiologie, Hamburg University Heart Center, Hamburg, Německo3 Srdeční selhání, jako časté a  závažné onemocnění, je stále jednou z  největších ekonomických zátěží ve zdravotnictví. Příčinou tohoto patofyziologického stavu je narušení fyziologických funkcí kardiomyocytů, buněk hladké svaloviny i  endoteliálních buněk cév a  vznik kardiovaskulární dysfunkce. Klíčovým terapeutickým cílem moderní kardiologie je minimalizace poškození srdeční tkáně. Pro úspěšné naplnění tohoto cíle je nezbytné pochopit a  objasnit, jak molekulární mechanizmy účastnící se poškození myokardu tak i  biologické principy uplatňující se v nově zaváděných terapiích. Proto je cílem tohoto projektu objasnění role nitrovaných mastných kyselin (nitro-MK), jenž jsou endogenně produkovány v různých tkáních a buněčných membránách, jako potenciálních kardioprotektivních látek, v srdečním selhání. V  posledních několika letech vícero studií potvrdilo protizánětlivé účinky nitro-MK v různých in vivo a in vitro modelech, včetně modulace aktivace makrofágů, prevence aktivace leukocytů, krevních destiček a rozvoje aterosklerózy. Tyto výsledky naznačují možný ochranný účinek nitro-MK také u  srdečního selhání. Naše předběžné studie ukázaly slibné výsledky potvrzující, že tvorba nitro-MK během procesů srdečního selhání má kardioprotektivní účinky zprostředkované především inhibicí transkripčního faktoru NF-kappaB a  redukcí produkce reaktivních metabolitů kyslíku a  dusíku, což naznačuje jejich významnou roli v  regulaci intracelulárních signálních drah, jenž jsou spojeny s rozvojem kardiovaskulární a také imunitní dysfunkce.

30

SBORNÍK ABSTRAKT Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy choroby Skoumalová A.1, Illner J.1, Klusáčková Z.1, Topinková E.2, Vyhnálek M.3, Lasz J.3, Hort J.3 Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1 Geriatrická klinika 1. LF UK a VFN2 Neurologická klinika 2. LF UK a FN Motol3 Mozková tkáň obsahuje vysoký podíl lipidů, z  nichž významnou část tvoří polynenasycené mastné kyseliny (PUFA). Změny v  lipidovém složení hrají významnou úlohu v  rozvoji Alzheimerovy choroby (ACH). Peroxidace mozkových PUFA doprovází patogenezi ACH a vede k tvorbě lipofilních produktů, které mohou difundovat do krve. Cílem naší práce je hledání specifických degradačních produktů peroxidace mozkových lipidů v krvi u pacientů s ACH, které by mohly sloužit jako biomarkery této choroby. Dále jsme se zaměřili na tzv. mírnou kognitivní dysfunkci (MCI), která představuje prodromální fázi ACH a je z  hlediska časného záchytu ACH a terapie významným cílem v hledání biomarkerů ACH. Do naší studie byli zařazeni pacienti s diagnostikovanou ACH, dále pacienti s MCI a kontroly. Degradační produkty peroxidace lipidů byly stanovovány v  erytrocytech. Celkem bylo zpracováno 60 vzorků. Analýzy byly provedeny pomocí fluorescenční spektroskopie a  na základě zjištěných fluorescenčních maxim bylo provedeno kvantitativní srovnání jednotlivých skupin. Pomocí matematického zpracování fluorescenčních spekter byly hledány rozdíly ve složení degradačních produktů peroxidace lipidů u jednotlivých pacientů. Získaná fluorescenční spektra ukazují na významnou kumulaci degradačních produktů peroxidace lipidů u  pacientů s  MCI v  porovnání s  kontrolami (přibližně dvojnásobek) . V erytrocytech pacientů s ACH byly také prokázány ve zvýšené míře tyto produkty, ale jejich množství je nižší než u  MCI. Matematické derivace fluorescenčních spekter ukazují změny ve složení degradačních produktů peroxidace lipidů ve skupinách pacientů s  MCI a  ACH. Nejvýznamnější změny byly prokázány při fluorescenčních maximech 310/360, 335/360 a 390/440 nm (excitace/emise). Závěrem lze shrnout, že nejvyšší kumulace degradačních produktů v  krvi byla prokázána u  pacientů s  MCI, což má z  hlediska hledání biomarkeru a  zahájení včasné terapie s  cílem zmírnit progresi ACH velký význam. Tato práce byla podporována grantem GAUK 604 912.

31

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher disease Asfaw B., Kuchař L., Fialová M., Poupětová H., Ledvinová J., Elleder M. Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General University Hospital in Prague Beta-glucocerebrosidase (GBA1) is a  key lysosomal hydrolase in catabolism of glycosphingolipids, and removes glucose from glucosylceramide (GlcCer). The deficiency of GBA1 activity causes a lysosomal metabolic defect known as Gaucher disease. Undegraded substrate glucosylceramide accumulates in macrophage derived cells known as Gaucher cells. Glucosylpsychosine (lyso-GlcCer), another substrate of GBA1 which is known for its cell toxicity, is also elevated, e.g. in the plasma of Gaucher patients. Although most aspects of Gaucher disease are well defined, still its molecular mechanism, including macrophage specific accumulation of GlcCer and lack of visible storage in other affected cells, is not clearly understood. Therefore, we studied the fate of the critical substrates of GBA1, GlcCer and lyso-GlcCer, in living cells using feeding experiments with mass labeled sphingolipids. Substrates and degradation products were then analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS) . We used skin fibroblasts from Gaucher type II patients ((L444P/S107L) including the most severe phenotype (?Collodion baby?, R359X/V398F). Three types of materials were analyzed in each in situ experiment: cells, supernatant and sediment (containing depleted cells) from centrifuged cultivation medium. Results: When cell homogenates were in vitro incubated with C12:0 GlcCer, Gaucher cells samples showed almost zero enzyme activity. This is in agreement with the values measured with fluorogenic substrate. In contrast, the same cell lines in situ revealed similar degree of GlcCer degradation and pattern of products as in control cells. A  small quantity of lyso-GlcCer was measured in all cell lines. Tracking of lyso-GlcCer with GlcCer precursor double-labeled on ceramide (C23:0-D2-Gb3Cer) confirmed that there is no direct deacylation reaction forming lyso-GlcCer from GlcCer. Both GlcCer and lyso-GlcCer were present only in cells and sediment from cultivation medium (consisting of detached and dead cells). Higher concentration of GlcCer and lyso-GlcCer in the sedimented detached cells of cultivation medium than in living cells suggests a direct connection between both lipids and the pathology of the cells. Conclusions: Application of natural mass labeled glycolipid substrates in combination with MS/MS analysis represents more effective approach for evaluation of experiments in metabolic studies than previous methods. Since our results suggest that deacylation of GlcCer to lyso-GlcCer is not alternative degradation route in GBA1 deficient cells, defining molecular mechanism of Gaucher disease stays as challenge of our future studies. This work was supported by the project PRVOUK-P24/LF1/3, the grant project of Ministry of Education MSM 0021620806 and by the grant No 19509 from the Grant Agency of the Charles University, Czech Republic

32

SBORNÍK ABSTRAKT Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky aktivovaných NMDA receptorů Kudová E.1, Chodounská H.1, Slavíková B.1, Vyklický V.2, Borovská J.2, Krausová B.2, Vyklický L, Jr.2 Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v.v.i.1 Fyziologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.2 Receptory pro kyselinu N-metyl-D-asparagovou (NMDA) hrají klíčovou roli pro excitační synaptický přenos a také při synaptické plasticitě. Přílišná aktivace NMDA receptoru způsobená jeho vlastním agonistou (kyselinou L-glutamovou) vede k excitotoxické smrti buněk. Funkce NMDA receptoru může být ovlivněna exogenními i  endogenními ligandy, mezi které patří neurosteroidy – endogenní sloučeniny, které jsou syntetizovány v mozku a ovlivňují činnost CNS. 20-Oxo-5β-pregnan-3α-yl sulfát (pregnanolon sulfát; PA-S) je endogenní neurosteroid schopný inhibovat NMDA receptory, který má také neuroprotektivní vlastnosti. Jeho nízká biodostupnost a malá metabolická stabilita však limituje jeho in vivo užití. Byla připravena série nových, metabolicky stabilnějších derivátů pregnanolonu s negativně nabitým substituentem v poloze C-3, které se liší vzdáleností záporného náboje a steroidním skeletem – hemiestery kyseliny šťavelové, malonové, jantarové, glutarové, adipové, pimelové a suberové. Pro tyto látky byla metodou terčíkového zámku (patch-clamp) určena míra inhibice a hodnoty IC50 na HEK293 buňkách o podjednotkovém složení NR1–1a/NR2B a také krysích hipokampálních neuronech. Takto byla experimentálně určena přímá souvislost mezi mírou inhibice a  hodnotami IC50 a  délkou řetězce substituentu na C-3, resp. jeho lipofilicitou pro nově připravené syntetické analogy pregnanolon sulfátu. Taktéž bylo prokázáno, že se tyto sloučeniny liší v míře inhibice tonicky vs. fázicky aktivovaných NMDA receptorů. Schopnost predikovat míru inhibice a hodnoty IC50 nových syntetických analogů PA-S a zároveň zlepšení jejich farmakologických vlastností by mohlo vést k  praktickým výstupům v  oblasti léčby vážných neurologických onemocnění jako např. mozkové mrtvice, epilepsie, Alzheimerovy choroby. Práce byla provedena za podpory grantu GAČR 303/12/1464 výzkumného záměru RVO 61388963.

33

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu Kopeček M. BioTech a.s.

34

SBORNÍK ABSTRAKT Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Lipid Research Fuchs B., Süß R., Schiller J. University of Leipzig, Medical Department, Institute of Medical Physics and Biophysics, Leipzig, Germany Although matrix-assisted laser desorption and ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) often but not exclusively coupled with a time-of-flight (TOF) mass analyzer is particularly established in the protein field, there is increasing evidence that MALDI MS is also very useful in lipid research: MALDI MS is fast, sensitive, tolerates sample impurities to a  considerable extent and provides very simple mass spectra with (often) negligible fragmentation of the analyte. Additionally, MALDI mass spectrometers originally purchased for „proteomics“ can be used also for lipids without the need of major system alterations. After a short introduction into the method and the related ion-forming process, the MALDI mass spectrometric characteristics of some selected glycero-(phospho)-lipids will be discussed. Special attention will be paid to (a) the analysis of mixtures and (b) quantitative aspects of MALDI MS because this is normally considered to be the „weak“ point of the method. Although the detailed role of the matrix is not yet completely clear, it will be also explicitly shown that the careful choice of the matrix is crucial in order to be able to detect all compounds of interest in a mixture. This is particularly important regarding the detection of less abundant compounds. Two rather recent developments will be highlighted: „Imaging“ MS is nowadays widely established and significant interest is paid in this context to the analysis of lipids because lipids ionize particularly well and are, thus, more sensitively detectable in tissue slices than other biomolecules such as proteins. It will also be shown that MALDI MS can be very easily combined with thin-layer chromatography (TLC) allowing the direct „rasterizing“ of the TLC plate and the detection of lipids with a higher sensitivity than common staining protocols.

35

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers using Chiral HPLC/MS Lísa M., Holčapek M. University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry Triacylglycerols (TGs) are important components of human diet used as a source of energy, fatty acids (including essential ones), fat soluble vitamins and other nonpolar compounds. The variety of TG species is enormous due to a high number of fatty acids present in natural samples differing in acyl chain lengths, their position on the glycerol skeleton (regioisomers, enantiomers) and number, position(s) and cis-/trans- configuration of double bonds (DBs), all having great differences in their biological and nutritional properties. The detailed characterization of fatty acid composition including the determination of individual isomers is important from the nutrition point of view due to their different biological activity. The stereospecific analysis of individual TGs represents a  challenging task in the lipidomics due to different bioavailability of fatty acids on the glycerole skeleton in the stereospecific environment of enzymes in the human body. We have optimized a chiral HPLC/MS analysis for the separation of TG isomers using cellulose-based chiral HPLC column in the normal-phase mode. Under optimized chromatographic conditions, both regioisomers and enantiomers are separated in one analysis. The retention behavior of TGs is governed mainly by the number of DBs, i.e., retention times of TGs increase with increasing number of DBs. At least partial separation of TGs based on acyl chain lengths or position and configuration of DBs is also achieved using optimized chiral HPLC method. TGs are identified based on their positiveion atmospheric pressure chemical ionization (APCI) mass spectra providing protonated molecules and high relative abundance of fragment ions formed by the neutral loss of fatty acid from the glycerol skeleton. The comparison of relative abundances of these fragment ions is used for the differentiation of individual regioisomers, because the loss of fatty acid from sn-2 position is less preferred, which results in a  fragment ion with lower relative abundance in comparison to sn-1 and sn-3 positions. No visible differences are observed in APCI mass spectra of enantiomers identified based on retention times of identical standards. We have developed a method for the synthesis of TG enantiomers with wide range of fatty acids commonly present in natural samples (i.e., palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic and arachidic acids). The retention behavior of TGs isomers is also studied using mixtures of TG isomers prepared by the randomization reaction of selected monoacyl TG standards providing mixtures of all isomers in an equal amount. We have demonstrated the utilization of developed chiral HPLC/MS method for the separation of complex natural TG mixtures of plant oils or human plasma samples. This work was supported by the project 203/09/0139 sponsored by the Czech Science Foundation.

36

SBORNÍK ABSTRAKT Modern analytical methods in determination of polyunsaturated fatty acids in intact lipid molecules Tomčala A., Valterová I. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR Modern biological studies in the fields of health, nutrition, physiology, and pharmacology require detailed chemical data obtained from appropriate methods of sample analyses. Determination and quantification of biological sample composition on the molecular level is essential. In this lipidomic study, we focused on glycerolipids (GLs). Recently, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are in focus. PUFAs are essential for normal brain development and function. Furthermore, they are tested for medical treatment of metabolic syndrome, a combination of medical disorders that increase the risk of cardiovascular disease and diabetes. Central adiposity is a key feature of the syndrome. Regular supply by ω-3 and ω-6 PUFAs prevents occurrence of obesity in mice. PUFAs belong to essential fatty acids, i.e. they must be taken from the diet as humans lack the Δ12– and Δ15-desaturases necessary for inserting double bonds in the n-3 or n-6 (ω-3 or ω-6) positions. The most important long chain n-3 PUFAs are eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3). We developed analytical methods suitable for PUFAs determination and quantification in most biological samples. Firstly, we used the total lipid extraction method designed by Folch followed by the solid phase extraction (SPE) which divides total lipid extract to three fractions: non-polar lipids, free fatty acids, and phospholipids. The presence of PUFAs is determined by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with electrospray ionization (ESI) and mass detection (MS). HPLC/ESI/MS provides us with information about the carbon chain length, number of double bonds, origin (phospholipids or non-polar lipids), and position of PUFA in the lipid molecule. Subsequent derivatization, namely acid transesterification of a particular fraction, followed by gas chromatography and mass spectrometry (GC/MS), gives us the information about position of double bond in the carbon chain. These analytical methods represent an excellent tool for rapid and reliable determination and quantification of PUFAs. Examples of analyses of different biological samples will be given. Folch et al.: J. Biol. Chem. 1957, 226, 497. Financial support by the Czech Science Foundation (# 502/10/1734) and Technological Agency of the Czech Republic (#TA01020969) is gratefully acknowledged.

37

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Lipidomická analýza novorozeneckého mázku Míková R.1, Vrkoslav V.1, Hanus R.1, Kaftan F.1,2, Rejšek J.2, Čmelíková T.3, Horká P.1,2, Zábranská M.1,2, Doležal A.4, Plavka R.4, Cvačka J.1 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.1 Přírodovědecká fakulta UK v Praze2 Gymnázium Joachima Barranda Beroun3 Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze4 Novorozenecký mázek (vernix caseosa, VC) je biofilm, který pokrývá lidský plod během posledních stádií těhotenství a novorozence v prvních dnech po narození. Jeho hlavní funkcí je ochrana kůže před macerací v plodové vodě, usnadnění porodu, adaptace kůže v prvních dnech po narození a  dočasná podpora imunitního systému. VC vykazuje antimikrobiální a  antioxidační vlastnosti a  současně má pozoruhodnou schopnost urychlovat hojení ran. Značná pozornost je proto věnována přípravě umělých náhražek VC, které by se uplatnili v klinické praxi u předčasně narozených dětí s nezralou kůží nebo při léčbě popálenin. Z hlediska chemického složení je VC tvořen vodou, bílkovinami a lipidy. Lipidy VC tvoří extrémně bohatou směs, kterou se i přes značné úsilí dosud nepodařilo uspokojivě charakterizovat. Zároveň není prakticky nic známo o změnách složení VC při jeho ontogenezi, o variabilitě mezi jednotlivci, o vlivu různých onemocnění na jeho složení či o jeho možném využití v diagnostice. V rámci projektu jsou charakterizovány lipidy VC s využitím standardních i nově vyvíjených metod chromatografie a  hmotnostní spektrometrie (MS). VC je studován v  intaktní formě metodami MS založenými na ambientní ionizaci (DESI, DAPPI) nebo MALDI. Účinnost různých metod izolace lipidů (Folchova metoda, extrakce s  MTBE apod.) je vzájemně porovnávána. Lipidové extrakty jsou dále děleny do jednotlivých tříd pomocí adsorbční chromatografie v  kolonovém a  TLC formátu. K  podrobné charakterizaci lipidů v  jednotlivých třídách je používána buď přímá MS analýza nebo její kombinace s  chromatografií, nejčastěji HPLC. Jedním z  prvních výsledků projektu je zjištění statisticky významných rozdílů ve složení některých lipidů u vzorků VC chlapců a dívek. Tato práce vznikla za podpory GAČR P206/12/0750 a projektu RVO 61388963.

38

SBORNÍK ABSTRAKT New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients with cardiovascular diseases Holčapek M.1, Cífková E.1, Červená B.1, Lísa M.1, Znaleziona J.2, Vostálová J.2, Galuszka J.3 University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry1 Palacký University Olomouc, Faculty of Medicine and Dentistry2 Faculty Hospital Olomouc, Czech Republic3 Lipidomics contributes towards the understanding how lipids function in a biological system and for the elucidation of the mechanism of lipid-related diseases, such as cardiovascular diseases. For this purpose, a  complex lipidomic approach using off-line 2D-LC/MS/MS is developed together with the complementary information from conventional GC/FID profiling of fatty acid methyl esters. The study design contains 5 groups (3 types of cardiovascular diseases, subjects with class I obesity and healthy controls), 10 men per group aged between 40 and 55 and analyzed samples are plasma, erythrocytes, HDL, LDL and VLDL. Total lipid extracts are fractionated using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) in the first dimension, which enables the isolation of more than 15 classes of polar lipids, such as different classes of phospholipids, sphingolipids, glycolipids, etc. Non-polar lipids (triacylglycerols, diacylglycerols, sterols, cholesterol esters) are separated and quantified by fast normal-phase LC/MS method. Isolated fractions of individual lipid classes are separated in the second dimension either using reversed-phase HPLC with C18 porous shell particles column or with sub-2 μm particles in UHPLC mode. Individual lipid species are separated according to acyl chain lengths, number and position of double bonds in individual fatty acids. All obtained data are statistically evaluated by principal component analysis with the goal to identify lipid biomarkers of cardiovascular diseases. Finally, samples representing each of five patient groups are characterized by multiple 1D and 2D LC/MS methods including silver-ion, RP and chiral HPLC modes. This work was supported by the project No. 206/11/0022 sponsored by the Czech Science.

39

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Identification and quantitation of lipids using high-performance liquid chromatography and mass spectrometry Cífková E., Lísa M., Holčapek M. University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry The identification and quantitation of all lipids in complex biological tissues is the first step towards the understanding how lipids function in a biological system and the elucidation of the mechanism of lipid-related diseases including obesity, atherosclerosis, cancer, cardiovascular diseases, etc. High-performance liquid chromatography and mass spectrometry coupling (HPLC/MS) has the highest potential to obtain comprehensive information about the whole lipidome. Our optimized HILIC-HPLC/MS enables the fractionation of more than twenty individual lipid classes including 3 regioisomeric pairs in a  wide range of polarities in one analytical run. The development of method for the quantitation of main lipid classes and also lipid species within these classes is a  challenging task. For this reason, novel non-targeted lipidomic quantitation was described and results were compared with the conventional approach with multiple SRM scans measured on triple quadrupole analyzer. Concentrations of individual lipid classes were obtained by the peak integration in the HILIC mode multiplied by response factors calculated for individual classes and correlated with sphingosyletha­ nolamine (d17:1/12:0) as an internal standard. Non-targeted lipidomic quantitation is an appropriate tool for the comprehensive lipidomic characterization of individual lipid classes and the determination of all minor and unknown species inside these classes. Detailed lipidomic analysis of various tissues has a  potential for search of unknown lipid species at trace concentrations, which may play an important role in the signaling of serious diseases. This work was supported by the grant project No. 203/09/0139 (Czech Science Foundation).

40

SBORNÍK ABSTRAKT Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů Kapras V.1, Slavíková B.2, Slavíčková A.1, Rambousek L.2, Valeš K.2, Vyklický V.2, Vyklický L. Jr.2 , Kudová E.1, Chodounská H.1 Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, v. v. i.1 Fyziologický ústav, AV ČR, v. v. i.2 Steroidy a jim podobné sloučeniny jsou důležitou složkou téměř všech živých organismů. Účastní se trávení, jsou důležitou součástí signálních drah i  stavebními bloky biologických membrán. Mnoho z  těchto funkcí bylo podrobně prostudováno, ale stále se objevují další. Jako příklad mohou sloužit tzv. neurosteroidy, které jsou mozkem produkovány pro regulaci nervových procesů. Nové objevy umožnil rychlý rozvoj sofistikovaných metod studia biologických dějů. Tyto metody k optimálnímu fungování vyžadují vhodné standardy a molekulární sondy. Připravili jsme izotopicky značené steroidní molekuly, fluorescenční a  fotoaktivovatelné steroidní sondy. Syntetizované molekuly byly zatím použity pro stanovení farmakokinetiky steroidních neuroprotektiv a pro studium kinetiky transportu neuroaktivních steroidů do neuronů.

41

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High Resolution Acquisition Workflow Simons B.1, Kauhanen D.2, Sylvänne T.2, Tarasov K.2, Duchoslav E.1, Ekroos K.2 AB SCIEX, Canada1 Zora BioSciences, Finland2 Abstract: Shotgun lipidomics has evolved into a variety of multi-dimensional strategies for molecular lipid characterization that comprise bioinformatics tools for mass spectrum interpretation as well as quantitative measurements to study systems-lipidomics in complex biological extracts. Taking advantage of spectral mass accuracy, scan speed and sensitivity of improved quadrupole linked time-of-flight mass analyzers, a bias-free global lipid profiling acquisition technique of sequential precursor ion fragmentation called MS/MSALL was developed. This generic information-independent tandem mass spectrometry technique consists of a Q1 stepped mass isolation window through a set mass range in small increments, fragmenting and recording all product ions and neutral losses. The molecular lipid species, including distinction of isomeric and isobaric species, are resolved based on the accurate MS and MS/MS information, and then composed into more precise lipidomic outputs. The method demonstrates good reproducibility and at least 3 orders of dynamic quantification range for isomeric ceramides in human plasma. Over 400 molecular lipids in human plasma have been uncovered and quantified in less than 7 minutes, including acquisitions in both positive and negative polarity modes. We anticipate that the performance of the MS/MSALL technique both in quality and throughput, will aid in uncovering of new avenues throughout the biomedical research community, enhance biomarker discovery and provide novel information target discovery programs as it will prospectively shed new insight into the affected metabolic and signaling pathways.

42

SBORNÍK ABSTRAKT Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in vivo; what does it take to move into clinic? Miller A.D.1,2 Institute of Pharmaceutical Science, King‘s College London, Franklin-Wilkins Building Waterloo Campus, 150 Stamford Street, London, SE1 GlobalAcorn Limited, London, W4 5NW, UK2 All biopharmaceutical agents such as plasmid DNA (pDNA) or RNA interference (RNAi) effectors are capable of potent therapeutic effects at target sites in vivo but they need a delivery system to help them get there. The creation of new, synthetic delivery technologies has been the subject of intense interest in my laboratory for over 10 years now, and we currently believe that the best opportunity lies with lipid-based nanoparticles that conform to the synthetic, self-assembly ABCD nanoparticle paradigm. A number of ABC and ABCD nanoparticles (100nm diameter, -potential near zero) can now be described that are able to mediate successful, functional delivery of pDNA to lung and RNAi effectors to murine liver, and to xenograft tumours in vivo. In addition, the ABCD nanoparticle paradigm can be adapted for the development of imaging nanoparticles, leading to the creation of a number of magnetic resonance imaging (MRI) active, fluorescent labeled ABC and ABCD nanoparticles for cancer diagnosis. This has led on to the creation of theranostic nanoparticles that allow for functional delivery of therapeutic agents with simultaneous real time diagnostic imaging. Experience with all these nanoparticles suggests that there are basic biophysical and chemical guidelines that underpin nanoparticle-mediated delivery to different organs. These basic rules can be summed up in terms of the four “S’s” of nanotechnology (size, shape, surface, structure) and the four “T’s” of nanodelivery (trafficking, triggerability, targeting and timing). With the use of such emerging rule sets we can be confident of creating next generations of delivery nanoparticle systems appropriate for routine clinical use.

43

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and delivery of anticancer and antiviral drugs Turánek J. Veterinary Research Institute, Brno Liposomes represent the oldest nanoparticle systems described for applications in biological studies as model membranes and in medicine. Over nearly half a  century, liposomes have been shown to be suitable drug delivery systems for applications ranging from cosmetics and dermatology through to medical applications in anti-infection therapy, anticancer therapy and veterinary vaccination. Liposome-based vaccines have been around for about 30 years and numerous products have been developed, some with evident immune-stimulatory properties and attractive safety profiles hence resulting in registered products on the market or preparations in advanced stages of clinical testing (e.g. Hepatitis A – HepA, Epaxal) Liposomes represent almost ideal carrier/delivery systems for the components of synthetic vaccines due to their ready biodegradability and their ability to retain/incorporate a variety of essential vaccine components simultaneously, even components possessing quite different physico-chemical properties (i.e., different size, hydrophobicity, charge etc.). Different synthetic vaccine components can be encapsulated within the aqueous cavities of liposomes (if hydrophilic) or associated with liposome bilayers (if at least partially hydrophobic in character). Furthermore, essential components can be attached to either internal or external outer leaflet membrane by electrostatic, covalent or metallochelation interactions. The most diverse synthetic vaccine components are typically adjuvants needed to provoke innate immune reactions (e.g. monophosphoryl lipid A  [MPL A], CpG oligonucleotides, muramyl dipeptide [MDP] and analogues). In addition, these can be combined with antigens needed to provoke specific immunity such as soluble or membrane proteins, synthetic peptides and oligosaccharide antigens. Finally, the liposome may present ligands to assist functional delivery of antigens and adjuvants to antigen-presenting cells necessary to invoke immunostimulation. Liposomes are compatible with various routes of application (i.n., i.m., i.d., p.o., s.c., etc.) This is the main advantage of liposomes over other adjuvants. At present, there is a need of new vaccines against world spread or emerging infectious diseases as well as cancer. This factor together with the stress on safety of vaccines drives the research in the field of vaccine research. Many new synthetic components like cationic lipids, neoglycolipids, activated lipids and metallochelating lipids are now available for construction of liposomal carriers well tailored for specific antigen. Defined new synthetic adjuvants are designed and tested, e.g. compounds based on muramyl or norAbu-muramyl peptides, CpG oligonucleotides and MPL-A. The potential for the participation of liposome-based recombinant vaccines in the human and veterinary vaccine market is very promising. New approach for construction of recombinant vaccines will be presented and discussed. ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by the following grants: the Grant Agency of the Czech Republic (GAP304/10/1951), (GAP503/12/G147), the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (KAN200100801) to J.T., the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE0002716202), and the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (CZ.1.07/2.3.00/20­.0164).

44

SBORNÍK ABSTRAKT Significant synergism of antitumor activities of HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate and IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes: a concept of modern chemoimmunotherapy Kovář M. Institute of Microbiology ASCR, v.v.i., Prague Resume In this manuscript, we demonstrate that antitumor activity of advanced chemotherapy by HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate synergizes with novel kind of immunotherapy by IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes due to low immunosuppressive activity of the former one and extraordinary high immunostimulatory activity of later one, which is moreover selective for immune subsets with positive role in tumor immunotherapy, i.e. NK, memory and recently activated CD8+ T cells. Thus, the concept of combining the chemotherapy having low immunosuppressive activity with potent immunostimulation could be an efficient approach to treat cancer. Abstract IL-2 has been approved for treatment of metastatic renal cancer and malignant melanoma. However, its unfavorable pharmacologic properties, severe side effects and the negative role of IL-2 in maintaining T regulatory cells are severe drawbacks. It has been shown that immunocomplexes of IL-2 and certain anti-IL-2 mAbs possess selective and high stimulatory activity in vivo. Here, we show that IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes expand not only CD122high subsets and recently activated CD8+ T cells, but also NKT cells and γδ T cells. Further, we demonstrate that NK cells expanded by IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes in vivo have high cytolytic activity, which can be further increased by coadministration of IL-12. We also demonstrate that IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes possess noticeable antitumor activity in two syngeneic mouse tumor models, namely BCL1 leukemia and B16F10 melanoma, but only if administered early in tumor progression. To effectively treat established tumors, we administered the tumor-bearing mice first with HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate, and subsequently with IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes alone or with IL-12 to induce an efficient antitumor immune response. Importantly, we show that the conjugate has significantly lower immunosuppressive activity than free doxorubicin when using dosage with comparable antitumor activity, thus eliminating the majority of tumor cells while leaving the immune system mostly unimpaired for stimulation with IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes. Indeed, we demonstrate that the conjugate and IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes together have synergistic antitumor activity.

45

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs: paclitaxel as the example Koudelka Š.1,2, Turánek Knötigová P.1,2, Mašek J.1,2, Plocková J.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, Brno1 Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice2 Liposomal carriers represent versatile and advanced nanodelivery systems for a wide range of anticancer drugs. These relatively non-toxic systems have a considerable potential to entrap both hydrophobic and hydrophilic drugs. The entrapment of the drug into the liposomes is used to bypass the frequent generic toxicity associated with the drug. Thus, it represents a  very effective route that enhances the drug therapeutic effect. The final amount of the encapsulated drug is affected by a selection of an appropriate preparation method providing a preparation of liposomes of various size, lamellarity and physico-chemical properties. The modification of liposomes permits a passive or active targeting of the tumour site. This effect enables an efficient drug payload into the malignant cells of tumour, while the non-malignant cells become minimally impacted. Over the past three decades, taxanes represent one of the most important new classes of drugs approved in oncology. Paclitaxel (PTX), the prototype of this class, is an anticancer drug approved for the treatment of breast and ovarian cancer. However, notwithstanding a suitable premedication, present-day chemotherapy employing a  commercial preparation of PTX (Taxol®) is associated with serious side effects and hypersensitivity reactions. The liposomebased carriers represent promising delivery systems of PTX superior to Taxol®. Generally, in vivo mice tumour models demonstrated that liposomal PTX formulations significantly increase a maximum tolerated dose (MTD) of PTX which outperform that for Taxol®. We developed a stable lyophilized formulation of PTX (7 mol%) encapsulated in the liposomes composed of SOPC/POPG/MOPC lipids (molar ratio, 60:20:20) and doped with vitamin E (5 mol%). The prepared liposomes had the size distribution of 180–190nm (PDI, 0.1) with potential of –31 mV. The stabilized PTX liposomes were prepared by lyophilization with sucrose (lipid:sugar molar ratio, 1:5–1:10). The suppressed PTX crystallization as well as the original size and morphology of liposomes were preserved for 6 months at 4oC. This liposomal PTX formulation did not show any evidence of toxicity in C57BL/6 mice treated with the highest doses of PTX (100 mg/kg administered as a single dose and 150 mg/kg as a cumulative dose applied in three equivalent doses in 48-h intervals). A dose-dependent anticancer effect was found in both hollow fibre implants and syngenic B16F10 melanoma mouse tumour models. Generally, this developed liposomal PTX formulation demonstrated safety and efficacy profiles and could be favourable for clinical applications. Acknowledgement This work was supported by the following grants: the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE0002716202), the Technology Agency of the Czech Republic (TA01011165) to J.T., the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (KAN200100801) to J.T.

46

SBORNÍK ABSTRAKT Preparation and characterisation of recombinant OspC liposome-based experimental vaccine with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP against Borrelia burgdorferi Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Křupka M. 4, Turánek-Knotigová P.1,2, Koudelka Š.1, Lukáč R.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2, Ledvina M.3, Raška M.4 Veterinary Research Institute, Brno1 Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno2 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Czech Academy of Science, Prague3 Faculty of Medicine, University of Palacky, Olomouc4 Lyme disease caused by spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato is a tick-born illness that can lead to chronic complications. The immune response to Borrelia is mediated by phagocytic cells and by Borrelia-specific complement-activating antibodies associated with Th1-cell activation. Liposomes represent almost ideal carrier system for the preparation of synthetic vaccines due to their biodegradability and versatility as regards the incorporation of various molecules having different physico-chemical properties. A  new experimental vaccine was constructed using a  non-lipidized form of recombinant OspC protein from B. burgdorferi s.l. and liposomes containing synthetic non-pyrogenic lipophilic norAbuMDP analogues as immunopotentiating molecules. His-tagged OspC protein was mounted onto the surface of liposomes by nickel-chelation bond. The His-tag was attached either to N-terminus or to C-terminus providing two variants of OspC antigen. These two forms exhibited different thermal stability profiles (free protein as well as liposomebound) as demonstrated by DSC and dynamic light scattering techniques. The structure of proteoliposomes was determined by transmission electron microscopy. New chemical modifications of synthetic norAbuMDP analogues and the application of metallochelating lipid provide new ways of approaching the construction of safe recombinant vaccines. Vaccines based on metallochelating liposomes were proved to be safe (a  pig intradermal model) as well as efficient (a mouse immunization model). Acknowledgements This work was supported by grants: GAČR P304/10/1951(to JT, ML and MR); TAČR TA01011165 (to JT, ML and MR); MSM 6198959223 (to MR); MZE 0002716202 (to JT); KAN 200520703 AVČR and KAN 200100801 (to JT and ML); Grant of Faculty of Medicine and Dentistry, UP Olomouc, CR LF_2012_11 (to MK).

47

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound diagnostics Lukáč R., Turánek J. Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic Lipid-coated gas-filled microbubbles (MB) represent a  new class of drug delivery systems with both diagnostic and therapeutic applications. Considering drug delivery and targeting, the main advantage of microbubble application is a  reduction of undesired side effects such as toxicity. Furthermore, the diagnostic application of ultrasound imaging using MB has become highly popular because ultrasound is a non-invasive and relatively low-cost tool. It uses portable, real-time imaging equipment and also avoids hazardous ionizing radiation. Considering MBs themselves, they are small (typically 1-8 μm in diameter) microspheres filled with high-molecular-weight gases like perfluorocarbons or sulfur hexafluoride, which results in decreased solubility and prolonged lifespan of the MB within the circulation. Until now, MBs have been characterized by optical microscopy, static light scattering, and flow cytometry. Following the reported studies, we applied all the mentioned methods, and moreover, we attempted to preserve the MB using lyophilization as described in a previous liposome study. Recently, targeting ligands that have been widely used in cardiovascular system and tumour diagnosis and therapy were attached to the surface of the MBs. Recently, magnetic resonance imaging (MRI) that is generally used to obtain three-dimensional images of various organs and blood vessels proved useful as one of the leading non-invasive imaging modalities. Safety, high resolution, and the ability to obtain a  precise anatomical localization of the lesion represent the advantages of MRI. However, there are serious difficulties in early tumour detection related to contrast resolution, e.g, small tumours may have the same signal intensity (SI) as the neighbouring tissue. In such a case, the use of paramagnetic contrast agents (CAs) is helpful. Most CAs used in clinical applications consist of small, soluble molecules that can easily cross the endothelial barrier of blood vessels. However, these CAs have a short lifetime and thus a narrow time window of optimal contrast enhancement. These characteristics may not be advantageous as regards the differences in the vascular properties of tumour tissue with respect to normal tissues. While in normal tissues the tight barrier formed by the endothelial cells prevents the extravasation of macromolecular CAs out of the vessels, in tumour tissues the leaky vessels may allow the extravasation of objects hundreds of nanometers in size. It has been proposed that the increase in weakness and permeability of the endothelial barrier of the tumour is the key to developing new macromolecular CAs for tumour diagnosis. Macromolecular CAs may offer a greater contrast enhancement between the tumour and surrounding tissue and a wider diagnostic-time window. The use of paramagnetic contrast agents is required to obtain clinically significant images. Gd is the most commonly used contrast agent for MRI. References: Lukáč R, Kauerová Z, Mašek J, Bartheldyová E, Kulich P, Koudelka Š, Korvasová Z, Plocková J, Papoušek F, Kolář F, Schmidt R, Turánek J. Preparation of metallochelating microbubbles and study on their site-specific interaction with rGFP-HisTag as a model protein. Langmuir 2011;27:4829-37 Erdogan S, Roby A, Sawant R, Hurley J, Torchilin VP. Gadolinium-loaded polychelating polymercontaining cancer cell-specific immunoliposomes. J Liposome Res 2006;16:45-55 Bertini I, Bianchini F, Calorini L, Colagrande S, Fragai M, Franchi A,Gallo O, Gavazzi C, Luchinat C. Persistent contrast enhancement by sterically stabilized paramagnetic liposomesin murine melanoma. Magn Reson Med 2004;52:669-672 Acknowledgements: This work was supported by grants: MZE 0002716202; KAN 200520703 AVČR; GAČR P304/10/1951 and TAČR TA01011165.

48

SBORNÍK ABSTRAKT Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi na metaloafinitní liposomy ovlivňuje typ vyvolané imunitní odpovědi na myším modelu Křupka M., Mašek J., Bartheldyová E., Koudelka Š, Ledvina M., Turánek J., Raška M. Ústav imunologie Lékařské fakulty UP Lymská borrelióza je multisystémové onemocnění vyvolávané spirochetami z  druhového komplexu Borrelia burgdorferi. Tato choroba je nerozšířenější antropozoonózou ve střední Evropě a může způsobovat dlouhodobé komplikace navzdory antibiotické terapii. Protektivní imunitní odpověď proti Borreliím je zprostředkovávána hlavně fagocytujícími buňkami a  komplement aktivujícími protilátkami asociovanými s  typem imunitní odpovědi Th1. Lze proto předpokládat, že vyvolání tohoto typu odpovědi je základem pro konstrukci účinné preventivní vakcíně proti borrelióze.1 V naší studii jsme testovali imunomodulační působení liposomů v komplexu s metalochelatačně vázanými rekombinantními antigeny a nepyrogenními lipofilními deriváty nor-aminobutyryl muramildipeptidu (norAbuMDP). Liposomy byly připraveny ze směsi fosfatydilcholinu a nikl chelatujícího lipidu DOGS-NTA. Vazba rekombinantních antigenů na liposomy byla umožněna nekovalentní vazbou mezi polyhistidinovou sekvencí antigenu a molekulou chelatovaného niklu2. Jako antigeny byly použity rekombinantní nelipidizované apyrogenní proteiny OspA a OspC izolované ze spirochety Borrelia burgdorferi sensu stricto. Vakcinační preparáty byly testovány na myším modelu a byla vyhodnocována tvorba antigenně-specifických protilátek v isotypech IgG1 (Th2 odpověď) a IgG2a (Th1 odpověď). Adjuvantní působení norAbuMDP bylo srovnáno s hydroxidem hlinitým a muramyldipeptidem. Preparáty obsahující deriváty nor-muramyl dipeptidu poskytovaly adjuvantní účinek srovnatelný s muramyldepep­tidem, ale bez jeho typických vedlejších účinků. U těchto preparátů došlo k  výraznému zvýšení produkce specifických IgG2a spojených s  Th1 typem imunitní odpovědi. U proteinu OspC bylo navíc zjištěno, že imunogenita proteinu je silně ovlivněna polohou histidinové sekvence na N- nebo C-konci proteinu. Využití metalochelatačních liposomů s vázanými deriváty nor-muramyl dipeptidu se tak jeví jako slibná cesta pro vývoj vakcín stimulujících tvorbu opsonizačních protilátek. Tato byla podpořena granty LF_2012_011, MSM6198959223 a GAP304/10/1951.. LITERATURA Krupka M., Zachova K., Weigl E., Raska M.: J Control Release, In Press (2011). Mašek J, Bartheldyova E., Korvasova Z., Skrabalova M., Koudelka S., Kulich P.,Kratochvilova I., Miller A.D., Ledvina M., Raška M., Turanek J.: Anal. Biochem. 408 (2011).

49

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE The effect of water-based medium on the structure of gemini surfactant– DOPE–DNA complexes Pullmannová P.1, Lacinová Ľ.2, Funari S.S.3, Murugova T.4, Devínsky F.5, Uhríková D.1 Department of Physical Chemistry of Drugs, Faculty of Pharmacy, Comenius University, Slovak Republic1 Institute of Molecular Physiology and Genetics, Slovak Academy of Sciences, Slovak Republic2 HASYLAB at DESY, Hamburg, Germany3 Frank Laboratory of Neutron Physics, JINR, Dubna, Russia 4 Department of Chemical Theory of Drugs,Faculty of Pharmacy, Comenius University, Slovak Republic5 Gemini surfactant propane-1,3-diyl-bis(dodecyldimethylammonium bromide) (12-3-12) and neutral lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) were used for preparation of cationic liposomes (CL). CL condense highly polymerized DNA forming complexes 12-3-12– DOPE– DNA. Complexes of this composition were reported to have good transfection efficiency in vitro and in vivo. Small angle X-ray diffraction was used to study the microstructure of 123-12–DOPE–DNA complexes with focus on the effect of different water-based media on the arrangement of complexes. We compare the structure of complexes prepared in NaCl solution (150 mmol/l) and commercial transfection medium Opti-MEM® combined with DMEM (Dulbecco-modified minimal Eagle medium) and DMEM supplemented with 5 % of FBS (fetal bovine serum), respectively. We examined the effect of medium on the structure of the complexes as a function of the 12-3-12 molar fraction in CL, the amount of DNA, and the temperature. The binding capacity of CL for DNA was determined spectrophotometricaly. A condensed lamellar phase (LαC) was identified as dominant structural arrangement, although at high 12-3-12 molar fraction (Φ = 0.5) we observed a coexistence of two lamellar phases. Structural parameters of complexes were evaluated and thoroughly discussed concerning the effect of various media. Financial support provided by the European Community‘s Seventh Framework Program (FP7/2007 2013) under grant agreement no 226716 (HASYLAB project II-20100372 EC), by the JINR project 07 4 1069 09/2011, and by grants VEGA 1/1224/12 and APVV-0212 10 is gratefully acknowledged.

50

SBORNÍK ABSTRAKT LIPID ALTERATIONS INDUCED BY SUPPLEMENTED FATTY ACIDS IN HUMAN COLON FETAL AND CARCINOMA CELLS Josef Slavík1, Miroslav Ciganek1, J. Hofmanová2, Z. Tylichová2, Miroslav Machala1 Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute, v.v.i., Hudcova 70, 621 00 Brno, Czech Republic1 Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic2 Dietary lipids, especially omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and butyrate, the short-chain fatty acid produced by microbial fermentation of fibre, are important modulators of colon epithelial cell kinetics and play an important role in colon inflammation and carcinogenesis. Using cell lines derived from human colon fetal (FHC) and adenocarcinoma tissues (HCT116) we analyzed cellular fatty acid content and profile (GC/MS of FAME) and phospholipid remodelling (LC/MS/MS) after treatment with sodium butyrate (NaBt, 3mM), arachidonic acid (AA, 20:4, omega-6, 50µM), docosahexaenoic acid (DHA, 22:6, omega-3, 50µM) and/or their combination (AA/NaBt, DHA/NaBt). After 24 or 48 h samples from cell pellets containing 8 x 106 cells were prepared by modified Bligh-Dyer extraction procedure. Total cell extract was divided into three aliquots for tandem HPLC/MS/MS analysis (phospholipid classes and TAG profiling) and GC/MS analysis of total fatty acid content and fatty acid content in polar and nonpolar fractions after SPE separation, consequently. Fatty acids were always analysed by GC/MS in a form of fatty acid methylesters (FAME). NaBt treatment increased the concentrations of saturated (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFAs) in both cell lines, which reflects de novo fatty acid synthesis. On the other hand, both PUFAs as well as their combination with NaBt reduced this parameter in FHC, but not in HCT-116 cells. Treatment of FHC as well as HCT-116 cells with AA or DHA considerably increased the amount of the respective PUFAs and products of their metabolism. This is additionally increased after combined fatty acid treatment except a combination of DHA/NaBt in FHC cells. Subsequently, the ratio of n-3/n-6 was decreased after AA (or AA/NaBt) exposure or increased after DHA (or DHA/NaBt). Moreover, the treatment with both PUFAs and their combination with NaBt increased the unsaturation index (UI) and increased the SA:OA ratio, which reflects changes of membrane properties (especially its fluidity) to a certain level. Using LC/MS/MS we analyzed the composition of major PL classes (i. e. diacylglycerophosphocholines (PC), -ethanolamines (PE), -serines (PS), -inositols (PI) as well as sphingomyelins (SM), and ceramides (Cer). Mass spectra showed that NaBt induced only minor changes compared to control, but treatments with AA, DHA and their combination with NaBt decreased the content of species containing dominant fatty acids and simultaneously increased AA- or DHA-containing species, respectively. The modulations observed were most pronounced in PC and PE, lower but with a similar tendency in PI and PS, and insignificant in Cer or SM species. In FHC cells, where more apparent changes in the lipid composition were detected after treatment with fatty acids, additional detailed analyses verifying the distribution of AA and

51

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE DHA in polar (PLs) and neutral (mostly triacylglycerols - TAGs) lipid fractions were performed. Compared to control, no significant changes of fatty acid distribution in both classes were found after NaBt treatment. On the contrary, after treatment with AA or DHA a considerable percentage of the respective fatty acid was detected in both polar lipids and TAGs supposed to be located in cytoplasmic lipid droplets. After treatment with PUFA alone, more AA was detected in polar lipids, whereas DHA was incorporated predominantly to TAGs. Moreover, NaBt cotreatment with AA or DHA decreased the content of both PUFAs in the PL fraction and increased their accumulation in TAGs. In summary, our results confirmed significant changes in fatty acid content, spectra, distribution and metabolism caused in colon cells by supplementation of AA, DHA and their combination with NaBt. These changes may be associated with subsequent modulation of cell proliferation, differentiation and/or apoptosis induced by these fatty acids. Supported by grants Nos. P301/11/1730 and 303/09/H048 of Czech Science Foundation.

52

POSTEROVÁ SEKCE

POSTEROVÁ SEKCE

53

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Nové matrice pro MALDI-MS analýzu uhlovodíků Horká P., Vrkoslav V., Pecková K., Cvačka J. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Ionizace/desorpce laserem za spoluúčasti matrice (MALDI) je stále důležitější ionizační technikou pro analýzu látek s  nízkou polaritou a  molekulární hmotností, jako jsou např. nepolární lipidy. Tato metoda je vhodná pro výzkum lipidových směsí přírodního původu a nabízí velké množství výhod ve srovnání s  jinými analytickými metodami. Ionizace zcela nepolárních uhlovodíků nebo uhlovodíkových polymerů je náročná, jelikož tyto sloučeniny postrádají polární skupinu vhodnou k protonaci nebo k vazbě s kationtem. V  oblasti lipidů, zejména u  nízkomolekulárních nepolárních lipidů, bylo zatím popsáno jen málo účinných matric. Ionizace nízkomolekulárních nepolárních látek je možná pomocí iontů různých kovů, kdy dochází k  tvorbě aduktů. K  účinné ionizaci lipidů je možno využít lithných kationtů za vzniku aduktu [M+Li]+. Pro zcela nepolární látky byla vyvinuta matrice 2,5-dihydroxybenzoan lithný (LiDHB). Tato matrice byla aplikována mimo jiné na analýzu hmyzích kutikulárních uhlovodíků. Ačkoliv se LiDHB ukázala, jako velice účinná matrice pro uhlovodíky, citlivost detekce není excelentní. Během této práce zaměřené na výzkum nových efektivních matric pro MALDI-MS analýzu uhlovodíků byla testována řada stříbrných a lithných solí organických kyselin (např. kyseliny 2,5-dihydroxybenzoové, 2,5-dihydroxytereftalové, 2,5-dimetoxybenzoové, α-kyano-4hydroxyskořicové, sinapové, benzoové, salicylové a  vanilové) jako potenciálních MALDI matric. U těchto látek byly vyhodnoceny „MALDI vlastnosti“ a porovnány s vlastnostmi 2,5dihydroxybenzoanu lithného. Také byl stanoven detekční limit pro uhlovodíky v jednotlivých matricích. Podařilo se najít několik účinných MALDI matric. Bylo zjištěno, že účinnost matrice je závislá na přítomnosti hydroxylové skupiny v molekule matrice. Ukázala se i souvislost mezi účinností a obsahem krystalové vody v matricích. Účinnost ionizace uhlovodíků vhodnými matricemi byla ověřena na reálných směsích. Tato práce vznikla za podpory GAČR P206/12/1093 a projektu RVO 61388963.

54

POSTEROVÁ SEKCE Essential fatty acid diagnostics using modern analytical methods for nutrition studies? Application on fish Schneedorferová I., Průchová M., Tomčala A., Valterová I. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Health and nutrition studies are nowadays based on sophisticated analytical chemistry data. Determination and quantification of food composition on the molecular level are essential. For nutrition, the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are very important. We distinguish two types of PUFAs: n-3 and n-6. These fatty acids are essential, i.e. they must be taken from the diet because humans lack the Δ12– and Δ15-desaturases necessary for inserting double bonds in the n-3 or n-6 (ω-3 or ω-6) positions of the FA carbon chain. The n-3 PUFAs are the most studied class of PUFAs and have prevailing benefits for human health. The most important long chain n-3 PUFAs are eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3). These PUFAs are essential for normal brain development and function. For determination of particular PUFAs, we used several analytical techniques that include extraction according Folch, pre-separation due solid phase extraction (SPE), separation on high performance liquid chromatography (HPLC) column, and detection by mass spectrometry (MS). Gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) methodology with acid derivatization was employed, too. The primer producers of essential fatty acids are marine and freshwater algae. In the food chain, fatty acids accumulate in fish, which is primary source of PUFAs for humans. PUFAs are known to be sensitive to oxidation caused by light or heat. This study aims at finding which fish species (both marine and freshwater) is a powerful source of PUFAs and which cooking treatment is most suitable for fish preparation. Last but not the least, the influence of storage on PUFAs levels will be discussed. Present results show that marine fish is a better source of PUFAs, namely EPA and DHA, than freshwater fish. Three cooking treatment were examined: preparation on grill, pan, and in the oven. It seems that for each fish species, a different kind of cooking treatment is best for preservation of EPA and DHA level and their ratio. The amounts and ratios of PUFAs are species specific. Folch et al.: J. Biol. Chem. 1957, 226, 497. Financial support by the Czech Science Foundation (#502/10/1734) is gratefully acknowledged.

55

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Alternativní přístupy strukturní analýzy uhlovodíků Vrkoslav V., Cvačka J. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Nejčastěji používanou metodou analýzy uhlovodíků je plynová chromatografie. Spojení plynové chromatografie s  hmotnostním detektorem (GC/MS) se využívá k  jejich strukturní charakterizaci. K ionizaci uhlovodíků se nejčastěji používá elektronová ionizace (EI), případně chemická ionizace (CI). Metoda je ideální pro analýzu kratších uhlovodíků s menším počtem dvojných vazeb. Z EI spekter je i v tomto případě poměrně složité, a někdy nemožné, s určitostí popsat přesnou strukturu uhlovodíku, tj. polohy dvojných vazeb a  větvení. Pro identifikaci dvojných vazeb lze použít CI za využití acetonitrilu jako reakčního plynu. Fragmentací molekulových aduktů vzniklých v  iontovém zdroji z  reakčního plynu a  analytu lze získat fragmenty charakterizující polohu dvojné vazby. Další možností je využití vhodné derivatizační reakce a analýza produktů GC/EI-MS. Výše popsané metody nelze použít pro analýzu uhlovodíků s  větším počtem uhlíků nebo s  větším počtem dvojných vazeb. Tyto sloučeniny jsou při teplotách potřebných k  jejich eluci z  GC kolony teplotně nestálé. Za vyšších teplot v  GC může dojít k  jejich degradaci. Pro strukturní analýzu zvláště nenasycených uhlovodíků s  dlouhým uhlíkovým řetězcem je nutné využít principiálně jinou metodu. Tato práce popisuje využití ionizace laserem za účasti matrice (MALDI) a chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) pro ionizaci uhlovodíků a jejich strukturní charakterizaci pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS). Nedávno byla popsána metoda charakterizace poloh dvojných vazeb nenasycených voskových esterů využívající tvorby molekulových aduktů [M+55]+. v APCI iontovém zdroji. Molekulové adukty vznikají v  případě, kdy je v  mobilní fázi přítomen acetonitril. V  MS/MS spektrech aduktů [M+55]+. byly popsány ionty, které jasně definují polohu dvojné vazby v původní molekule. Tvorba [M+55]+. byla pozorována i v APCI-MS spektrech nenasycených uhlovodíků. Analogicky k voskovým esterům, fragmentací těchto aduktů byly získány ionty charakterizující polohu dvojné vazby. Ke štěpení uhlovodíkového řetězce dochází před a za dvojnou vazbou. Pro MALDI uhlovodíků lze s  úspěchem využít tvorby molekulárních aduktů s  lithnými a  stříbrnými kationty [M+Li]+ a  [M+Ag]+. Fragmentací molekulárních aduktů metodou LIFT (Ultraflextreme, Bruker Daltonic, Brémy, Německo) vznikají fragmenty, ze kterých lze určit polohu větvení uhlovodíkového řetězce, protože k  fragmentaci dochází poblíž tohoto větvení. Tato práce byla financována z projektu RVO 61388963 a z grantu GAČR P206/12/1093.

56

POSTEROVÁ SEKCE A non-aterogenic and atherogenic lipoprotein profile in examined individuals with dyslipoproteinemia Oravec S., Kučera M., Vacula I., Gašpar Ľ. 2nd Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovak Republic A  new method of electrophoretic lipoprotein separation on polyacrylamide gel (PAG) with the use of Lipoprint LDL System quantifies a  non-atherogenic and atherogenic plasma lipoproteins including small dense LDL, the strong atherogenic lipoprotein subpopulations. With respect to the predominance of a non-atherogenic or an atherogenic lipoproteins in the whole lipoprotein profile in plasma, this method distinguishes a non-atherogenic lipoprotein profile phenotype A from an atherogenic lipoprotein profile phenotype B. The contribution of this method is to confirm the existence of a  non-atherogenic type of hyper-betalipoproteinemia and the existence of normolipidemia with atherogenic lipoprotein profile, along the common and well known atherogenic hyperlipoproteinemia and a  nonatherogenic normolipoproteinemia. According to our preliminary analysis of normolipidemic population, the atherogenic lipoprotein profile was determined in more than 6 % of normolipidemic young healty individuals and in more than 40% persons in the general group of subjects. These persons represent a risk population. The facilities for identifying these normolipidemic individuals are limited for the time being. On the other site a  non-atherogenic hyper-betalipoproteinemia can be identified, which represents approx 20% of examined individuals with hypercholesterolemia and is not combined with a premature development of atherosclerotic arterial vascular impairment. Novo zavedená elektroforetická metóda na separáciu lipoproteínov na polyakrylamidovom géli (PAG), Lipoprint LDL Systém, kvantifikuje neaterogénne a aterogénne lipoproteíny, včítane malých denzných LDL, silne aterogénnych lipoproteínových subpopulácií. Z  ohľadom na prevahu v zastúpení neaterogénnych, alebo aterogénnych lipoproteínov v lipoproteínovom spektre plazmy, táto metóda identifikje neaterogénny lipoproteínový profil, fenotyp A a aterogénny lipoproteínový profil, fenotyp B. Prínosom tejto metódy je potvrdenie existencie neaterogénneho typu hyper-betalipoproteinémie a  existencie normolipémie s  aterogénnym lipoproteínovým profilom, popri často sa vyskytujúcej a dobre už charakterizovanej aterogénnej hyperlipoproteinémii a neaterogénnej normolipémii. Na základe naších predbežných analýz populácie normolipemikov, sa zistil aterogénny lipoproteínový profil u viac než 6% normolipemických mladých probandov a u viac než 40% osôb v  randomizovanej vzorke obyvateľstva. Tieto osoby predstavujú rizikovú populáciu. Možnosti k  identifikácii týchto normolipemických osôb sú v  dnešnej dobe ešte stale obmedzené. Na druhej strane sa dá identifikovať neaterogénna hyper-betalipoproteinémia, ktorá predstavuje približne 20% vyšetrených subjektov s hypercholoesterolémiou a nie je spojená s predčasným aterosklerotickým poškodením kardiovaskulárneho systému.

57

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Vliv pohlaví potkanů na cholesterol v séru, játrech a exkrementech při dietě s cholesterolem Marounek M., Volek Z., Skřivanová E. VÚ živočišné výroby Cholesterolemie u potkanů je stabilní a není snadné ji zvýšit přídavkem cholesterolu do krmiva. Dietu potkanů obou pohlaví jsme doplnili o  10 g cholesterolu/kg. U  samců tento doplněk zvýšil cholesterolemii z  2,20 na 2,48 μmol/ml a  u  samic z  2,06 na 2,92 μmol/ml. Cholesterol v játrech byl u samců zvýšen z 5,4 na 15,0 μmol/g a u samic z 6,1 na 19,9 μmol/g. Rozdíly mezi samci a samicemi byly statisticky významné. Doplněk cholesterolu zvýšil fekální koncentraci cholesterolu desetinásobně u  samců a dvanáctinásobně u samic. Zvýšení fekální koncentrace žlučových kyselin bylo menšího rozsahu. Cholesterol zvýšil expresi jaterní 7α-hydroxylasy. Samice potkanů jsou proto více vhodné k  pokusům s cholesterolem než samci. Vyloučení cholesterolu výkaly je významnější způsob odstranění přebytku cholesterolu než jeho konverze na žlučové kyseliny.

58

POSTEROVÁ SEKCE Změny ve složení membránových fosfolipidů v erytrocytech u Alzheimerovy choroby Klusáčková Z.1, Vyhnálek M.2, Laczó J.2, Hort J.2, Topinková E.3, Skoumalová A.1 Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1 Neurologická klinika 2. LF a FN Motol2 Geriatrická klinika 1. LF a VFN3 Oxidační stres, který doprovází patogenezi Alzheimerovy choroby (ACH), se v mozkové tkáni manifestuje peroxidací fosfolipidů, které se vyznačují vysokým podílem polynenasycených mastných kyselin (PUFA). Díky oboustranné výměně mastných kyselin mezi mozkovou tkání a krví změny v zastoupení PUFA v mozkové tkáni související s  oxidačním stresem ovlivňují složení PUFA v  membránách erytrocytů. Naším cílem bylo analyzovat složení mastných kyselin ve fosfolipidech membrán erytrocytů u pacientů s ACH, a také u pacientů v prodromální fázi ACH představovanou tzv. mírnou kognitivní dysfunkcí (MCI) a u pacientů se subjektivní poruchou paměti (SMC). Izolovali jsme membrány erytrocytů u pacientů s různými typy neurodegenerativních chorob a kontrol. Pacienti byli řazeni do skupin dle neuropsychologické diagnostiky, laboratorního vyšetření a magnetické rezonance mozku. Skupiny zahrnovaly pacienty s diagnózami SMC, MCI, ACH a kontroly. Membrány erytrocytů jsme následně podrobili analýze lipidového složení pomocí plynové chromatografie. Výsledky naší studie ukazují, že membrány erytrocytů u  SMC a  MCI vykazují největší změny v  zastoupení jednotlivých metylesterů mastných kyselin v  porovnání s  kontrolami. Nejvýznamnější rozdíly jsou v zastoupení metylesterů kyselin linolové, linolenové a  arachidonové. Poměr nasycených a  nenasycených PUFA je nejvyšší u  SMC a  MCI, klesá u pacientů s ACH a nejnižší je u kontrol. Závěrem lze shrnout, že v  membránách erytrocytů u  pacientů s  SMC a  MCI je obsah PUFA snížen v  porovnání s  ACH a  kontrolami. Tento fakt může ukazovat na to, že patologické procesy v  mozku doprovázené oxidačním stresem jsou nejvíce vyjádřeny v  prodromálních fázích ACH. Tato práce je podporována grantem GAUK 604 912, European Regional Development Fund - Project FNUSA-ICRC (No. CZ.1.05/1.1.00/02.0123) a grantem IPL 2/2012.

59

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Analýza kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů Kohutiar M., Wilhelm J. Ústav lékařské chemie a biochemie 2. LF UK1 Fyziologický ústav AV ČR2 Mitochondrie jsou neustále vystaveny působení ROS. Oxidační stres spojený s metabolizmem mitochondrií má významný vliv na složení membránových lipidů. Produkty lipoperoxidace vedou k alteraci biomolekul a změny v struktuře mají negativní dopad na fyziologii buněk. V poslední době je věnována pozornost molekule peroxynitritu. Nedávné výzkumy naznačují, že jeho vznik a reaktivita in vivo stojí v pozadí vzniku mnoha civilizačních nemocí. Cílem naší práce je sledování kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů. Pro experimentální sledování in vitro jsme izolovali mitochondrie z  hovězího srdce. Vzorky s  obsahem proteinů 10 mg/ml jsme vystavili působení iniciátorů lipoperoxidace tertbutylperoxidu a  peroxynitritu. Pro sledovávání kinetiky jsme použili řadu koncentrací tertbutylperoxidu (0,05 mM; 0,2mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM a 4 mM) a peroxynitritu (0,05 mM; 1 mM; 2 mM; 3 mM a 4 mM). Alikvotní podíly peroxidovaných mitochondrií byly odebrány okamžitě po přidání oxidačního činidla, následně po 1 a  po 24 hodinách. Změny jsme sledovali v porovnání s kontrolami z paralelních inkubací. Produkty oxidace jsme detekovali kyselinou thiobarbiturovou (TBA). Změny v množství TBA-reaktivních ekvivalentech malondialdehydu byly analyzovány spektrofotometricky při 532 nm. Ve všech vzorcích inkubovaných s  peroxynitritem jsme zaznamenali zvýšení absorbancí s  maximem po 1 hodině při koncentraci peroxynitritu 1 mM (vzestup o  380 %). V  0,05 mM řadě jsme pozorovali okamžité zvýšení absorbancí v porovnání s kontrolou (vzestup o 252 %). Toto pozorování naznačuje vysokou reaktivitu již při nízkých koncentracích řádově shodných s koncentracemi in vivo. Nejvyšší absorbance v tert-butylperoxidové řadě jsme zaznamenali při koncentraci 4 mM (vzestup o 1025 %) po 1 hodině inkubace. Na základě naměřených dat se zdá být pravděpodobné, že množství oxidačních produktů stoupá v čase lineárněji a bez přítomnosti výrazného maxima v  porovnání s  peroxynitritovou řadou. Snížení množství TBA-reaktivních molekul v řadě peroxynitrit při vyšších koncentracích může být ve spojitosti s  doposud neznámými reakcemi peroxynitritu s  produkty lipoperoxidace. Trend nárůstu absorbancí u obou kontrol je mírně vzestupný, což souvisí s autooxidací během inkubace. Sumárně, rozdíly v trendech naměřených hodnot naznačují variabilitu v chemizmu reakcí, což je významné pro další studium mechanizmů lipoperoxidací. Tato práce je podporována grantem GAČR P303/11/0298.

60

POSTEROVÁ SEKCE Influence of cholesterol on the solubilization of multilamellar and unilamellar liposomes caused by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Huláková S.1,Gallová J.1, Balgavý P.1, Murugova T.2 Comenius University in Bratislava, Faculty of Pharmacy, Department of Physical Chemistry of Drugs, Slovak Republic1 Frank Laboratory of Neutron Physics, Joint Institute for Nuclear Researche, Dubna, Russia2 The aim of our study was to determine the effect of cholesterol on the solubilization of multilamellar and unilamellar egg yolk phosphatidylcholine (EYPC) liposomes. Solubilization was induced by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide (C12NO), which is very potent bactericidal and algicidal agent with amphiphilic character. It is supposed, that amphiphilic charakter is related with the solubilization of membranes. Solubilization is characterized by transformation from bilayers to mixed micelles. This transformation is accompanied by a  change in particle size, therefore a  turbidimetry, spectroscopic method based on light scattering, was used. We investigated influence of C12NO in concentration range 0–3 mmol/ dm3 on multilamellar and unilamellar liposomes, which contained cholesterol in different molar ratios CHOL:EYPC= 0; 0,2; 0,6. Kinetics of solubilization was studied in time interval from 0 to 72 hours after sample mixing. The solubilizing concentration (cS) was estimated as the C12NO concentration causing the half-maximum decrease of turbidance. We found, that cS grows linealy with increasing CHOL:EYPC molar ratio for both multilamellar and unilamellar liposomes. Higher cS values with the increasing molar ratio CHOL:EYPC mean, that a higher concentration of C12NO was needed for liposomes solubilization. We observed approximately exponential decreases of cS in time. This decrease of cS was slower in the case of multilamellar liposomes where the system reached equilibrium after cca 48 hours. In the case of unilamellar liposomes, equilibrium was achieved in just 6 hours. We suppose, that a greater number of lamelles in multilamellar liposomes, slows down the solubilizing effect of C12NO. The equilibrium cS values for multilamellar liposomes were smaller than for unilamellar liposomes. The inclusion of cholesterol into EYPC bilayers makes the bilayers more resistant to solubilization and long term exposure of C12NO. We suppose that it is connected with ordering effect of cholesterol on EYPC acyl chains. Acknowledgments: This work was supported by 496/2012 FaF, VEGA 1/0159/11, 04-4-1096-2009/2014 grants.

61

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE Klinické aspekty lipidomického profilování v kardiologii Galuszka J.1, Galuszková D.1, Holčapek M.2, Cífková E.2, Vostálová J.3, Lísa M.2, Červená B.2, Znaleziona J.3, Netušilová K.2, Táborský M.1, Šimánek V.3 Fakultní nemocnice Olomouc1 Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice2 LF UP Olomouc3 Úvod: Účast látek lipidové povahy v etiopatogeneze řady kardiovaskulárních onemocnění je nepochybná a přitom stále nedostatečně objasněná. Lipidomika jako obor přináší objevné poznatky o nových lipidových species, jejich struktuře, funkci a metabolických interakcích. Cíl: Porovnání lipidomického profilu osob subjektivně zdravých oproti skupině nemocných s poruchami srdečního rytmu, srdečním selháním a překonaným infarktem myokardu. Metoda: Lipidomické profilování za použití 1D a 2D LC/MS metod, zahrnujících metody silverion, RP a chiral HLPC. Výsledky: Metoda lipidomického profilování byla ověřena na souboru 30 osob s onemocněním kardiovaskulárního aparátu a  20 kontrol. Předběžné výsledky prvního ze tří plánovaných odběrů naznačují diverzitu částí lipidového spektra mezi zkoumanými skupinami. Závěr: Lipidomický přístup je příslibem nových poznatků , týkajících se palčivých problémů současné kardiologie, jako jsou například srdeční infarkt, srdeční arytmie, srdeční selhání, nebo kardiolipotoxicita. Dosavadní dílčí výsledky sledovaného souboru probandů doplníme v roce 2012 o plánované kontrolní odběry s cílem statistického vyhodnocení. Práce vznikla za podpory projektu GAČR č.206/11/0022.

62

POSTEROVÁ SEKCE Recombinant CDO from T. mentagrophytes Kasperova A.1, Cahlikova R.1, Kunert J.1, Sebela M.2, Raska M.1 Department of Immunology, Faculty of Medicine and Dentistry1 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacky University in Olomouc2 Cysteine dioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) catalyzes the oxygenation of cysteine to cysteine sulfinic acid leading to the production of sulfite, sulfate, and taurine as the final metabolites of cysteine catabolism. We produced the recombinant CDO protein from Trichophyton mentagrophytes and analyzed the enzyme activity by monitoring the production of cysteine sulphinate using mass spectrometry. To estimate the involvement of CDO in the biochemical pathways leading to the reduction of disulphide bridges of proteins, we used the stimulation of CDO synthesis in T. mentagrophytes cultures by application of L-cystine into growth medium. CDO mRNA transcriptional activity was determined by real-time PCR after normalization to housekeeping genes. To estimate the involvement of posttrasnlational regulation of CDO activity, formerly identified in mammalian cells, we used hyperimmune serum from CDOimmunized BALB/c mice for western-blot analysis of CDO protein level in //T. mentagrophytes //cultured with and without L-cystine supplementation. This work was supported by MSM 6198959223 and MSM 6198959216.

63

2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE DNA vaccination of different glycosyltransferses induced immune response after hydrodynamic DNA vaccination of mice Stuchlová-Horynová M.1, Weigl E.1, Městecký J.1, Novák J.2, Raška M.1,2 Department of Immunology, Faculty of Medicine, Palacky University, Olomouc1 Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA2 We focus our work on the study of mechanisms involved in generation of galactose (Gal)deficient O-glycans on IgA1 molecules in patients with IgA nephropathy. O-glycosylation is initiated by attachment of GalNAc to Ser/Thr residues of the hinge region by Nacetylgalactosaminyltransferase 2 (GalNAc-T2) followed by addition of Gal to the GalNAc catalyzed by β1,3-galactosyltransferase 1 (C1GalT1). This structure can be modified by attachment of SA to the Gal residues in a  reaction catalyzed by a  α2,3-sialyltransferase (ST3Gal) and/or to the GalNAc residues catalyzed by α2,6-sialyltransferase II (ST6GalNAc II). The cDNAs coding for transmembrane human glycosyltransferases (GalNAc-T2, GalNAcT14 and C1GalT1, ST6GalNac II, and ST6GalNac I) were cloned into mammalian expression plasmid. Recombinant plasmids were administered by hydrodynamic application into BALB/c mice. In parallel, the cDNAs coding for soluble portion of human glycosyltransferases GalNAcT2, GalNAc-T14 and C1GalT1, ST6GalNac II, and ST6GalNac I  (without the transmembrane domain) were cloned into mammalian expression plasmid behind sequences coding for mouse immunoglobulin secretory signal and His tag. Respective recombinant proteins were expressed in HEK 293T cells, isolated by affinity NiNTA chromatography, and identified by Western blotting with anti-His-tag antibody. Their identity was verified by high-resolution tandem mass spectrometry. Recombinant proteins served for evaluation of specific serum antibodies from DNA-immunized mice using Western blotting techniques. Sera were also tested in fluorescence microscopy for identification of respective glycosyltransferases. Our data showed that hydrodynamic DNA vaccination induces high titers of specific antibodies to respective recombinant enzymes. This work was supported by grants GAČR P302/10/1055, IGA MZ NT11081 and LH11046.

64

POSTEROVÁ SEKCE N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide as a structural modulator of monoolein cubic phases Hubčík L.1, Funari S.S.2, Devínsky F.1, Uhríková D.1 Faculty of Pharmacy, Comenius University, Bratislava1 Hasylab, DESY, Hamburg2 Monoolein or glycerol monooleate is a biodegradable polar lipid that has no marked toxic effects. In excess of water monoolein forms a bicontinuous cubic phase of Pn3m symmetry that shows good stability at wide range of temperatures from 20 °C to 85 °C (1,2). Pn3m cubic phase of monoolein is formed by curved bicontinuous lipid membrane extending in three dimensions, separating two congruent networks of water channels. Due to its unique structure and high stability in excess of water the Pn3m cubic phase of monoolein is widely studied as delivery system for drugs of various polarities (3). The encapsulation and release of drugs from cubic phases can be controlled by the regulation of the diameter of water channels by the addition of amphiphilic substances that incorporates into the lipid bilayer and changes its curvature (4,5). In our work we study the effect of pH responsive surfactant N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide (C12NO) on structural parameters of cubic phase of monoolein. The microstructure of monoolein and mixtures of monoolein with C12NO in excess of water was examined using synchrotron small angle X-ray diffraction (SAXD). At pH≈7, where C12NO is present in nonionic form, we have observed the Pn3m cubic phase in mixtures of C12NO and monoolein up to molar ratio 0.2 mol/mol. At molar ratios C12NO:monoole­in≥ 0.3 mol/mol the mixture has shown no regular arrangement. The lattice parameter (a) of cubic phase of monoolein and its mixtures with C12NO depends on both, temperature and C12NO:monoolein molar ratio. At 20 °C, the lattice parameter increases from a=9.87 nm for Pn3m cubic phase of monoolein up to 16.92 nm for C12NO:monoole­in=0.2 mol/mol. With increasing temperature we have observed the decrease of lattice parameters of cubic phases. For monoolein, a =7.56 nm at 80 °C, and for the mixture C12NO:monoolein= 0.2 mol/mol we determined a=8.92 nm. Changing pH into acidic (pH ~4), C12NO becomes cationic, and the regular structure of C12NO:monoolein has disappeared. Our experiments show that pH responsive C12NO can significantly affect the structural parameters of cubic phase of monoolein and can be potentially used for regulation of drug binding and release into monoolein cubic phase systems used for drug delivery. Acknowledgement. The research leading to these results has received funding from the European Community‘s Seventh Framework Programme (FP7/2007–2013) under grant agreement n° 226716 (HASYLAB project II-20100372 EC), by the VEGA grant 1/1224/12 to DU and grant FaF UK/46/2012 to LH. References 1. Larsson K., Journal of Physical Chemistry 1989; 93: 7301–7314. 2. Larsson K., Current Opinion in Colloid and Interface Science 2000; 5: 64–69. 3. Shah J.C., Sadhale Y., Chilukuri D.M., Advanced Drug delivery reviews 2001; 47: 229–250. 4. Angelov B., Angelova A., Garamus V.M., Journal of the American Chemical Society 2007; 129: 13474–13479. 5. Angelov B., Angelova A., Vainio U. et al., Langmuir 2009; 25: 3724–3742.

65

2. Česká lipidomická konference Workshop ICCTI 25. – 27. června 2012, Znojmo, hotel Prestige ODBORNÝ PROGRAM, SBORNÍK ABSTRAKT Editoři: Holčapek M., Cvačka J., Turánek J., Michálek J., Valterová I., Lísa M. Nakladatel: MSD, Lidická 23, 602 00 Brno Rok vydání: 2012 ISBN: 978-80-7392-194-1

66

PUSHING THE LIMITS IN SENSITIVITY

Exceedingly sensitive. Sharply focused. THE 6500 SERIES WITH IONDRIVE ™ TECHNOLOGY See what couldn’t be seen. Until now. The new AB SCIEX 6500 LC/MS/MS series with multi-component IonDrive™ technology is the world’s most sensitive triple quadrupole, improving sensitivity up to 10X and detector dynamic range by 20X over the best selling high performance triple quad – with no compromise in mass range. Unique QTRAP® linear ion trap technology and optional SelexION™ differential ion mobility technology help enhance data quality and improve throughput while reducing the need for sample preparation. With ultra-sensitivity and unrivaled robustness the 6500 Series enables scientists to push the limits in LC/MS/MS sensitivity and achieve the lowest limits of quantitation for today’s most challenging quantitative assays. The new AB SCIEX 6500 Series. It’s the farsighted successor to a long line of leading AB SCIEX mass spec systems.

Explore visionary sensitivity at www.absciex.com/6500

© 2012 AB SCIEX. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. The trademarks mentioned herein are the property of AB SCIEX Pte. Ltd. or their respective owners.

You are

ready Building on industry-leading capabilities, our new line of mass spectrometers identify, quantitate and confirm compounds in the most demanding samples. Whether unraveling protein structures, developing new drugs, or analyzing trace pesticides, we help move your science and productivity forward with industry-leading technology and expertise. And as you drive discovery and face new unknowns, our advanced systems and software provide unprecedented confidence in the final result. Whatever challenges arise in the future, you’ll be ready.

for the toughest challenges in mass spectrometry UÊsee our new line up at www.thermoscientific.com/ready Orbitrap™ Elite Hybrid LC-MS Gold standard for accurate mass and now to 240,000 resolution

© 2011 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.

Q Exactive Benchtop Orbitrap High resolution, accurate mass and simultaneous qual/quan

Velos Pro Ion Trap Fastest, most sensitive ion trap with HCD fragmentation

TSQ Quantum XLS Ultra GC-MS/MS High sensitivity and selectivity in GC and LC triple quadrupole MS