Állatkísérletek az Orvostudományban (Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata)
SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet 2013 / 2014 / 1
Mi a kurzus(ok) célja ? Az Európai Unió az állatkísérletek végzését engedélyhez köti (részleteket ld: http://www.felasa.eu/recommendations.htm ) FELASA = Federation of European Laboratory Animal Science Associations). A képzettség és engedély megszerzése az SZTE-n is szükséges. A Kormány 40/2013. (II. 14.) rendelete előírja a Magyar Felsőoktatási Akkreditációs Bizottság (MAB) által akkreditálásra kötelezett oktatási követelményeket. 2013/1. félévi új SZTE ÁOK kurzusok: Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata – A szintű specializációs képzés Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata – B szintű specializációs képzés „A” szint (12 hét); 40 kontaktóra, ebből 20 óra elmélet, 20 óra gyakorlat „B” szint (13 hét); 80 kontaktóra, ebből 40 óra elmélet, 20 óra szeminárium, 20 óra gyakorlat
Állatkísérletek az Orvostudományban (szabadon választható elméleti kurzus) A teljesítés (leckekönyv aláírás) feltétele: részvétel az előadások 2/3-án Írásbeli tesztvizsga (min. 50%-os eredményesség, 5 fokozatú jegy). Időpont: az utolsó előadást követő héten. Helyszíne: Sebészeti tanterem Az elméleti tanfolyam megfelel az „Állatkísérletek elmélete és gyakorlata „A” szintű specializációs képzés elméleti részének.
Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata specializációs képzésekről (A, B) A képzés hátterét az 1998. évi XXVIII. törvény az állatok védelméről és kíméletéről 30. § (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv uniós rendelkezései jelentik, melyeket 2013. január elsejétől hazánkban is alkalmazni kell. E kötelezettség teljesítése érdekében az irányelvben foglalt előírások átvétele, a kapcsolódó hazai szabályozás átalakítása megtörtént, az erre vonatkozó rendelet (40/2013. (II. 14.) Korm), részletesen előírja az állatkísérletetekkel foglalkozó személyek elméleti és gyakorlati képzését, a rendeletben foglalt tematika alapján.
„A” szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok gondozásával, kezelésével, tenyésztésével, állatkísérletek végzésével, kísérletek kivitelezésével foglalkozó • tudományos diákköri munkát végző graduális hallgatók • laboratóriumi asszisztensek • technikusok • általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, érettségivel rendelkező munkatársak számára. „B” szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok felhasználásra épülő kísérletek és kísérleti projektek tervezésével, végzésével és vezetésével foglalkozó • PhD hallgatók • tudományos minősítéssel nem rendelkező kutatók • kutatás-vezetők, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt • általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, felsőfokú végzettséggel rendelkező munkatársak számára, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt.
Elméleti rész (szabadon választható és ‘A’ szint) időpontja: hetente hétfőn 17.00-18:30; helyszíne: Sebészeti Klinika tanterme 1.
Bevezetés. Az állatkísérletek törvényi szabályozása, az engedélyezések menete (BM).
2.
Az állatkísérletek etikai vonatkozásai; Az állati jólét szempontjai; Az állatok tudományos célra való felhasználása mellett és ellen szóló érvek (BM)
3.
Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A helyettesítés, csökkentés és tökéletesítés (3R) követelménye; Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban (BM)
4.
A kísérleti állatok species specifikus biológiája I; Kis állatok (rágcsálók) bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája
5.
A kísérleti állatok species specifikus biológiája II; Nagy állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája
6.
Állatokkal való bánásmód és kezelési formák
7.
A kísérleti állatok tartásának jogi szabályozása és a környezetgazdagítás; A kísérleti állatok és állatházak higiénés fokozatai, a kísérleti állatház működtetése
8.
A fájdalom, a szenvedés és a stressz felismerése; Az altatás és a fájdalomcsillapítás általános szabályai; Kíméletes végpontok és az eutanázia alkalmazása
9.
A műtétek általános elvei, az aszepszis szabályai, alapvető sebészi beavatkozások és sebkezelés
10. Kísérletek tervezése; Életjelenségek megfigyelése, rögzítése, nyilvántartása 11. Kísérletek és projektek tervezése, kivitelezése. A kísérleti adatok feldolgozása, a statisztikai analízis alapjai
Gyakorlati időpontok AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA „A” szint Szerda: 17.00-18.30 (19.30) 4 x 2 óra; + 4 x 3 óra Első gyakorlat: szeptember 25. Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet (Sebészeti Klinika épület alagsor)
AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA „B” szint Elmélet – szeminárium – gyakorlat Csütörtök: 8.00-11.00 Péntek: 8.00-10.00 Első gyakorlat: szeptember 19. Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet (Sebészeti Klinika épület alagsor)
Mi nem célja a szabadon válaszható kurzusnak? Gyakorlati képzés A gyakorlati képzések (A, ill. B) = specializációs részhez tartoznak (Állatkísérletek elmélete és gyakorlata - lásd ETR) Csak az elméleti képzés és a gyakorlati oktatás (együttesen) jogosítja fel állatkísérletek végzésére az illetőt az ország, ill. (hamarosan) az EU bármely intézményében.
…általában NEM célja a kurzusoknak:
„Te mit teszel az állatkísérletek ellen?” Semmit; nem érdekelnek
9%
Igyekszem tájékozódni róluk
24%
Ha tehetem, bojkottálom az állatokon tesztelt készítményeket
63%
Aktív állatvédő vagyok
4%
„Mi a véleményed Csernus doktorról?” Fogalmam sincs, ki az
5%
Fantasztikus szakember lehet
12%
Eladta magát a médiának
11%
Kemény legény
3%
Érdekes, szimpatikus egyéniség
22%
Ki nem állhatom
36%
Nem tartom hitelesnek
11%
„Állatkísérletek” a közgondolkodásban Állatkísérletek
Kókai Kata, 2005-02-16 20:45:51
Amikor megveszünk egy jó nevű kozmetikumot, vagy akár egy egyszerű szappant, többnyire nem tudhatjuk, hány állat életébe került annak kifejlesztése. Az Interneten borzasztó képeket látni kétfejű, és megcsonkított állatokról, s az állatvédők odaadó küzdelme ellenére a legnagyobb cégek többsége nem hagy fel a kísérletekkel. Az általános tévhittel szemben kísérleteket nem csupán rágcsálókon végeznek, majmok, kutyák, macskák is áldozatul esnek az emberi törekvésnek. Ráadásul a kísérletek nagy részére nem új gyógymódok kifejlesztésére, hanem nélkülözhető kozmetikai cikkek tesztelésére irányul. Több olyan rémhírt is olvashattunk az Interneten, miszerint állateledelt gyártó cégek kutyákat és macskákat hizlaltak felvagy éppen fogyasztottak le, brutális körülmények között tartva őket. Sok esetben szánt szándékkal megcsonkították, lebetegítették az állatokat, hogy megfigyeljék a táplálék rájuk gyakorolt hatását.
http://www.csaladinet.hu/hirek/csaladi_temak/allatbarat/1834/allatkiserletek/
A bevezető előadás témakörei •
A tudományos módszer: problémák definiálása és megoldásuk
•
A tudományos módszer része: a modellalkotás
•
Az orvostudományi modellalkotás gyakorlata: - a modellalkotás oka és célja - a modellalkotás (az állatkísérletek) korlátai - modellek főbb csoportjai az orvostudományi gyakorlatban
A tudományos kutatás elvi alapjai
Kit nevezünk „tudományos” kutatónak ?
Wikipedia: ”Individuals who use the scientific method”
A „módszerről” általában
It was six men of Indostan To learning much inclined, Who went to see the elephant, Though all of them were blind That each by observation Might satisfy his mind.
„Blind men and the elephant” John Godfrey Saxe (1816-1887)
And so these men of Indostan Disputed loud and long, Each in his own opinion Exceeding stiff and strong. Though each was partly in the right And all were in the wrong.
1. Következtetés A ”tények” megismerését lehetővé tevő vizsgálati módszer többféle megközelítésre és korrekciókra is alkalmas
Többféle megközelítésre és korrekciókra is alkalmas módszer Mit tudunk eddig? (mások eredményeinek összegzése) Hipotézis (javaslat – próba) Eredmények (az új adatok elemzése, mérlegelés) Új információ (a felismerést átadjuk másoknak)
Hipotézis alapú módszer - az orvos(tudományi) kutatás lényege Megfigyelés Megjegyzések
Hipotézis Predikció
Elvet
Teszt
1.
Hipotézisünk csakis kontrollálható lehet (!)
2.
Gyakrabban lesz elvethető, mint megerősíthető (!)
Elfogad
A kutatás célja: az „igazság” keresése ‘A’ módszer
‘B’ módszer
A tudásanyag folyamatos integrálása és korrekciója
Az ismeretanyag teljes elfogadása
Nincs örökös érvényű elmélet „Tudományos”
Változatlan/változhatatlan elmélet „Nem tudományos”
Van tehát egy hipotézisem… Mit és milyen lépéseket tegyek, hogy 1.
a dolog (az „igazság”) végére járjak;
2.
és a következtetés mások számára is elfogadható legyen ?
”A tudomány nem magyaráz, vagy interpretál, hanem modelleket állít” (Neumann János)
Man’s urge to model Man finds the real world too difficult to comprehend. He lives in a bewildering infinity of space and time but his mind can understand only within finite limits. Man’s realization and definition of these limits form the basis for modelling. Arthur B. Otis (1972)
A „modell” helye és szerepe Mit nevezünk modellnek ?
1. A valóságos rendszer egyszerűsített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelő mása. 2. A világ leírásának, megértésének az eszköze, a világra vonatkozó ismereteinknek kifejezője.
Modellezési alapfogalmak 1. A modell legfontosabb jellemzője a jóság. 2. A modellt alkalmazásakor kísérletek útján összevetjük a forrásául szolgáló valóságos jelenséggel, és a megfigyelésekből következtetünk a modell használhatóságára. 3. A modell alkalmazásakor méréseket végzünk. A mérés az ismeretszerzés legalapvetőbb módszere. Minden tudományterület a természet jelenségein végzett mérésekre épít.
Jóság, használhatóság és mérések: a „tudományos” modell jellemzői
Jóság, használhatóság és mérések: a „tudományos” modell jellemzői
?
„2012 második felében hatalmas természeti csapás éri a Földet. Négy óra leforgása alatt mínusz 40-60 fokra lehűl a hőmérséklet, és ez a helyzet 2013 májusáig áll majd fenn.”
?
A modellalkotás általános érvényű elvei -
Szeparáció Szelekció Gazdaságosság
Alapfogalmak 1. Szeparáció: a modellezendő rendszert vagy jelenséget a többitől (külső környezettől, a világtól) el kell különíteni. 2. Szelekció: a modellezés során a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell (a kölcsönhatások között). 3. Gazdaságosság: a modellnek (a vizsgálat célkitűzésének megfelelve) a lehetőségek közül a legegyszerűbbnek kell lennie. Occam borotvája: ”Entia non sunt multiplicanda praeter necessitatem" (szükségtelenül ne szaporítsuk a dolgokat, és a redundáns dolgok leválaszthatók - ”Pluralitas non est ponenda sine necessitate”)
1. Következtetés 1. A szeparáció és a szelekció elvéből adódóan a modell a valóság egyszerűsített és hibás képe. 2. Hibás, DE szeparáció és szelekció nélkül a modellalkotás elképzelhetetlen.
A modellezés alapfogalmai A modell felállításához szükséges információk forrásai: 1. A priori ismeretek: a modellezendő jelenségre vonatkozó, a vizsgálat megkezdésekor rendelkezésre álló ismeretek összessége; 2. A posteriori ismeretek: a modellezési eljárás befejezésével rendelkezésünkre álló ismeretek (előzetes ismeretek + a jelenség megfigyelése során nyert információk összessége).
A modellezés alapfogalmai Deduktív modellalkotás => kizárólag a priori ismereteket használ Általános érvényű törvényszerűségekből kiindulva (természettudományos ismeretanyagra támaszkodva) egy konkrét, ismert jelenség leírására törekszik.
Induktív modellalkotás => kizárólag kísérleti adatokra épít - A kísérletek során végzett megfigyelések információt tartalmaznak a jelenség és annak környezete között érvényesülő kölcsönhatásokról (a rendszer bemenő és kimenő jeleiről) - A kísérleti vizsgálatok célja a jelenség olyan modelljének felállítása, mely utánozni képes a jelenség tényleges lefolyását.
2. Következtetés Az orvostudományi kutatás lényege a modell Releváns, jó modell => „Good science”
A modellek alaptípusai In vitro modell In vivo modell
In vitro modellek •
Egész szerv perfúzió
•
Szövet superfusio
•
Primér sejttenyészet
•
Immortalizált sejtvonal tenyészet
•
Szubcelluláris vizsgálatok
•
Molekuláris vizsgálatok - gén, protein expresszió
Értékes adatokat szolgáltatnak – DE sohasem biztos, hogy ezek pontosan reflektálják az integratív, élő természetet.
In vivo modellek Humán vizsgálatok - (általában) nem lehet invazív - a háttér információk kérdései Nem humán (pl. állati) vizsgálat - a fenti problémákat megoldja - DE: nem biztos, hogy az eredmények alkalmazhatók lesznek humán esetekre
In vivo modellek • Krónikus vizsgálatok - Problémák: pl. tartósan beültetett eszközök, katéterek, etc. kérdésköre • Akut vizsgálatok - Problémák: pl. anaesthesia hatása - Eltérések az élettani állapottól
Az eddigiek összefoglalása A tudományos módszer humán / nem emberi Problémafelvetés
A háttér elemzése
Hipotézis megfogalmazása
in vivo, in vitro
Kísérletek elvégzése
További kísérletek tervezése Új kísérletek
Kiértékelés Elemzés
Végső következtetés
Problémamegoldás
A hipotézis érvényessége (modell) kísérletekkel igazolható Kísérleti alaptípus a tárgy alapján élő vagy élettelen (alcsoport: in silico), in vivo kísérleti lehetőség: emberi vagy nem emberi (állati vagy növényi) lehet.
Analógia A tudományos módszer alkalmazása a klinikumban
Panaszok
Anamnaesis
Differenciáldiagnózis
További vizsgálatok
A módszer ismételt alkalmazása embereken
Vizsgálatok
Adatok alapján a diagnózis szűkítése
Több lehetőség
Végső diagnózis
Kezelés
Csak egy lehetőség
Az orvosi döntéshozatal analógiája: az adatgyűjtéstől a betegség kezeléséig
Hogyan lehet alkalmazni a tudományos módszert – azaz a modellalkotást - az orvosi gyakorlatban, a klinikumban ?
Helsinki Deklaráció (1964) 1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez fűződő jogának, emberi méltóságának oltalmazása. 2. A kutatás feleljen meg az általánosan elfogadott tudományos elveknek. 3. A kutatás alapuljon a tudományos irodalom alapos ismeretén. 4. A kutatást előzze meg laboratóriumi és állatkísérlet. 5. A kutatást meg kell tervezni és világosan megfogalmazott protokoll szerint kell eljárni.
Szabályozási rendszerek
Laboratóriumi eredmények In vitro modellek
Állatkísérletek In vivo modellek
Emberi (klinikai) vizsgálatok In vivo modellek
Mi az élő állatokat igénylő modellalkotás oka ? (Miért végzünk állatkísérleteket?)
Miért végzünk állatkísérleteket?
Hogy megfeleljünk a törvények előírásainak
Miért végzünk állatkísérleteket?
Mert szükségesek a tudományos módszer alkalmazása – vagyis a jelen (és valószínűleg a jövő) tudományos fejlődése szempontjából. Mert bizonyos hipotéziseket nem lehet embereken vizsgálni (nem lehet emberi modelleken megoldani)
A tudományos módszer tárgyai az medicinában
Terápia: veszettség (kutyák, nyulak); angolkór (kutya); lepra (majom, tatu); stb. Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); bárányhimlő (majom); kanyaró (majom) Felfedezés: inzulin (kutya); modern anaesthesia (kutya); DNS (egér, patkány) Fejlesztés: laparoszkópos sebészet (disznó); nyitott szívműtét (kutya); stb.
Mi korlátozza az élő állatokat igénylő modellalkotást (azaz az állatkísérleteket) ? (a morális kérdésektől eltekintve ?)
A legfontosabb korlát: az eredmények nem minden esetben relevánsak – nem mindig alkalmazhatók - humán körülmények között (!) (1) Species különbségek Csokoládé (theobromin) toxikus a kutyákra Kortizon teratogén egerekben Inzulin toxikus lehet több állatban (stb.) (2) Egyes fontos jeleket, bizonyos változásokat nehéz / lehetetlen felismerni (pl. enyhébb fájdalom) (c) Bizonyos esetekben alternatívák lehetségesek (ld. alább)
A 3 R - Russel & Burch (1959) (a) Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése (b) Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának csökkentése a lehetőségek határáig (pl: az emberi reakcióknak megfelelően, genetikusan módosított állatok használata). (c) Replacement: az állati modellek helyettesítése más modellekkel (i) Relatív helyettesítés: olyan kísérletek, melyek teljesen megszüntetik az állati szenvedést, anélkül hogy mindez kizárná a vizsgálatok további folytatását (tökéletes finomítás, absolute refinement) (ii) Teljes helyettesítés: olyan kísérletek, melyekhez nem szükséges állati eredetű biológiai anyag
Replacement / helyettesítés (a) Információ-áramlás fokozása (szükségtelen ismétlések számának csökkentése) (√) (b) Computer-alapú rendszerek, matematikai modellezés (?) (c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását előrejelző EYTEX rendszer (Draize teszt helyettesítése), stb. (?) (d) Alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák) alkalmazása (pl. Ames teszt). (?) (e) Emberi vizsgálatok, pl. önkéntesek, populációk (?) (f) Sejt, szövet és szerv kultúrák (?)
Mi tehát az állatkísérletek - vagyis az állatkísérletes modellalkotás – gyakorlati célja ?
Az állatkísérletes modellalkotás célja Magának a fajnak, reakcióinak tanulmányozása (állatorvosi kutatás) Állati viselkedés kutatása (pl. stressz-tűrő képesség mechanizmusa) Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok) Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis 2 vizsgálatok) Oktatási cél (pl. egyetemi hallgatók) Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása - nem közvetlenül orvosi célú kutatás ( következtetések humán biológiai mechanizmusokra) - általános orvostudományi cél (pl. rák, AIDS kutatás, xenotranszplantáció)
Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása = alapkutatások Leíró vizsgálatok - Élettan, kórtan, etológia - Nincs valódi hipotézis => kísérleti tervezés, minőségbiztosítás nehéz Válaszreakció valamilyen intervenciót követően - Élettan, kórtan, viselkedés - A kísérleti tervezés meghatározó fontosságú
Biológiai mechanizmusok vizsgálata, állatokat tanulmányozva, megfigyelve, a kapott következtetéseket extrapolálva ilyen a legtöbb kísérlet… • • • • • •
Terápiás - “preklinikai vizsgálatok” Toxikológia / beavatkozások biztonsága Anatómia, sebészet Fertőzések és immunitás Daganatos mechanizmusok (kutatás, diagnózis) Viselkedés / pszichológia
Miért nem lehetséges (mindig) az extrapoláció? Mert a fajok közötti összehasonlíthatóság mindig kérdéses lesz… (kiragadott példa: LD50 értékek, eltérő toxikus szintek, stb…)
Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van szükség !
Állati modellek főbb csoportjai 1. Spontán modell 2. Indukált modell 3. Negatív modell 4. „Egyéb” modell
1. Spontán modellek Hasonló (azonos) mechanizmusok emberben és állatban Vizsgált faj
Humán megfelelője
Defektus / érzékenység
Miért alkalmazzák
Min egér
Mutáns apc-gén Fam. adenomatosus polyposis (colon cc)
Azonos emberi végpont
Macska
Asztma
Asztma
Azonos patológia
Ír szetter
VIII faktor hiány
Hemophilia A
Terápiás vizsgálat
Mormota
Hepatitis B érzékenység
Hepatitis B
Infekció vizsgálat
Tatu (armadillo)
Lepra
Lepra
Terápiás vizsgálat
2. Indukált (kiváltott) modellek Valamilyen manipuláció szükséges
Viselkedés, pl. stressz – tanulás Kérdés: azonos-e az emberi és állati stressz? Sebészi beavatkozások, pl. idegek átmetszése, erek elzárása Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől ? Genetikai manipulációk, pl. transzgén, knock-out, knock-in Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől, mik a genetikai ”előkezelés” nem ismert következményei?
3. Negatív modell “Miért nem modellek”
Miért nem… - kapnak a kutyák atherosclerosist; - lesznek AIDS-esek a HIV vírussal fertőzött csimpánzok?
4. “Egyéb” modellek Jellegzetességek, melyeknek fontos biológiai jelentőségük lehet - Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van - Kérődzőknek sok γδT-sejtjük van - Az állati leukosis fertőző - Mutáció indukció, mint fontos kutatási terület
Az orvostudományi modellalkotás alapfeltétele: az a állati biológia ismerete
A patkány mint standard modell Ember
Jellegzetesség
Patkány
++
Plazma-protein kötés
alacsony
Orr-száj
Légzés
Orr
Kis coecum
Bélflóra eltérés
Nagy coecum
Szőrtelen
Bőr
Szőrös
Eltérő
Teratogenitás
Eltérő
Ritka
Albinizmus
95%
+
Epehólyag
-
Eltérés: albinizmus
Defektus: tirozináz hiány Idegrendszeri eltérések Fényérzékenység, retina károsodás Halláscsökkenés Szövettani eltérések Alacsony P450 aktivitás Alacsony szérum protein szintek (befolyásolja a xenobiotikumok reakcióit): streptomycin, clindamycin, klorokvin, klórpromazin, nikotin, pilocarpin, serotonin, adrenalin, noradrenalin, dopamin.
Eltérés: viselkedés • Éjszakai vagy nappal aktív (fordított fény ciklus?) • Szociális rangsor (természetes viselkedés vagy csak indukciós modell - úsznak-e a patkányok?) • Tigmotropizmus (egymáshoz tapadás) - túlzsúfoltság tenyésztés alatt és kísérletek közben
Eltérés: emésztőrendszer
Fogak Gyomor (üres vagy sem?) A táplálék (rosttartalom) Coecum (coecotropok – koprofágia)
Eltérés: kórélettan
Betegség jelei (láz vagy hipotermia) Harder mirigy Speciális betegségek
Porfirin nyomok az orrnyílás környékén
Eltérés: gyógyszerek reakciói
A species választás befolyásolja a farmakológiát, toxikológiát, anaesthesiát A metabolizmus hőmérséklet függő Species különbségek gyakran összefüggnek a testfelszínnel
Szalicilátok plazma fél-életideje
A trimetoprim fél-életideje
Lehetséges megoldások 1. Allometrikus extrapoláció (Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; 741-754: 1996; K. Schmidt-Nielsen: Scaling, Cambridge 1984)
Y = dosage level A = species independent scaling coefficient bw = body weight B = 1.00 - if Y depends upon body weight B = 0,75 - if Y depends upon metabolic rate B = 0,67 - if Y depends upon body surface
Y = Abw
B
2. Egyszerű dózis-skálázási faktor a testsúlyhoz viszonyítva (Peters-Volleberg et al. Reg. Tox. Pharmacol. 20;248-258:1994)
Man Beagle Monkey Rabbit Rat Mouse
Body weight (kg) 60 8 6 2 0,2 0,02
Scaling factor 1 2 2 3 5 8
Modellek a gyakorlatban = a klinikai gyakorlat modellezése 1. Szepszis – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főleg a pathomechanizmus tisztázatlan 2. Vérzéses shock – súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főképp a kezelési elvek tisztázatlanok
Modellek a gyakorlatban I. Rágcsáló modellek a humán szepszis vizsgálatára Áttekintés: LPS (endotoxin) CLP – coecum lekötés és punctio Fecalis inokuláció Intravénás baktérium Pneumonia
LPS (endotoxin)
Előnyök Egyszerű – pl. i.p. injectio, shock 4-6 órán belül
DE: Anti-LPS hatékony LPS ellen állatokban, de emberekben (klinikumban) nem
CLP
Előnyök Pl. perforált appendicitishez hasonló DE: Standardizálás nehéz Műtétet igényel (behatolás, zárás, felépülés)
Fecalis inoculum
Előny
Standard, konzisztens Alkalmazása egyszerű (IP injekció)
DE
Nincs jelentős trauma
Pneumonia modellek
Előnyök Egyszerű beadni (tracheába vagy az orrba) A dózis ellenőrizhető, reprodukálható DE Esetenként csak helyi reakció (nincs szisztémás gyulladás)
Intravénás baktérium
Előny Könnyű dozírozni Szisztémás infekció DE Gyorsan elpusztul, befolyásolja a gazdaszervezet immunitását
Eredmények (intravénás baktérium és kezelés) Kezelés
Iv. E. coli (kísérlet)
Klinikai szepszis (humán)
Methylprednisolon
hatékony1
hatástalan2 / ront3
Anti-TNFα
hatékony4
hatástalan5
1Hinshaw
et al. Ann Surg 1981;194:51-56 SSCSG N Eng J Med 1987;317:659-665 3Bone et al. N Engl J Med 1987;317:653-658 4Tracey et al. Nature 1987;330:662-664 5Abraham et al. JAMA1995;273:934-941 2VA
Mi lehet a probléma oka ? Jó a modell ? Eltér-e a valóságtól ?
A modell és a valóság 1. Kísérletes szepszis
Klinikai szepszis
Homogén genetikai háttér (egy nem)
Heterogén (mindig két nem)
Beltenyészet
„Outbred”
Eltérő fajok: patkány, kutya, sertés
Homo sapiens
Egészségesek
Társbetegségek
Fiatal felnőttek
Újszülöttek vagy idősek
Endotoxin érzékenység eltérő (koprofágia/szennyezett környezet)
Rendszerint tiszta környezet
A modell és valóság 2. Kísérletes szepszis
Klinikai szepszis
Általában előkezelés
Addig nem lehet kezelni, amíg a betegség nincs jelen
Nincs adjuváns kezelés
Aktív terápia (folyadék, antibiotikum, inotróp szerek)
Nincs pl. lélegeztetés
Lélegeztetés gyakori
A fertőzés leggyakrabban hematogén utón történik
Fészek („nidus”)
Heparin, anesthesia, analgesia
Optimális kezelés
Uniform inzultus
Helye és mértéke változó
Gyors kialakulás
Rendszerint lassú
A vizsgálat ideje standardizált
Egyedi lefutás
Különféle végpontok (rendszerint nem a lethalitás)
Klinikai végpontok, szervfunkciók, mortalitás
Modellek a gyakorlatban 2. A vérzéses shock Alapvető lehetőségek a vérzés modellezésére
Ellenőrzött véreztetés (konstans nyomás vagy térfogat) Éber vagy altatott Nem ellenőrzött vérzés
Újraélesztési-kezelési stratégiák A kezelés klinikai lehetőségei
Hipotenziós újraélesztés Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok) Kolloid oldatok Hemoglobin szubsztitúció, teljes vér adása Friss fagyasztott plazma Etc.
Az állandó nyomás modell Wiggers, C.J. The present state of the shock problem. Physiol. Rev. 1942;22:74-123.
• Vérzés az a. femoralis-ból egy nyitott reservoir-ba. • Az érpálya hidrosztatikai nyomását az előre meghatározott artériás középnyomás (MAP) értékre állítják (MAP=40 Hgmm) • Újraélesztés meghatározott időben (pl. 60 perckor)
Állandó térfogat modell Számított vértérfogat = testsúly %a (≈60 ml vér/tskg). Vérzés az artéria femoralisból 1 ml/perc sebességgel a 40% vértérfogat eléréséig Reszuszcitáció 60 perckor
Eredmények állandó térfogatú vérvesztés esetén Esetszám
Súly (g)
Oxigén felhasználás ml/min/kg
Túlélés
n=8
289 ± 12
≥6
+
n=11
298 ± 16
≤5
-
Tanulságok 1.
A patkányok vértérfogat / testsúly aránya 100 és 400 g között a testsúly növekedésével lineárisan csökken. Rágcsálóknál a csoportok közötti kicsiny (pl. 20-30 g) súlykülönbséget nem könnyű felismerni. Arra következtethetünk, hogy a kezelés hatékony, pedig csupán az állatok súlya kissé alacsonyabb a kezeletlen kontrollokhoz képest. Rágcsálók esetén a kísérletes protokoll állandó része a testsúly szigorú ellenőrzése (!)
Tanulságok 2. Nem árt ismerni a társ- vagy távoli szakterületek irodalmát (is). A testsúly/vértérfogat következményét leíró eredeti közlemény: Lee, H.B. & Blaufox, MD. J. Nuclear Med. 1985;26:72-76.* * The use of an arbitrary value of 7% for estimation of blood volume can lead to significant errors in calculating radiopharmaceutical distribution. The use of the general formula for the blood-volume calculation described here should improve the accuracy and reliability of estimates of radiopharmaceutical distribution. BV (ml) = 0.06 X BW + 0.77 (r = 0.99, n = 70, p < 0.001). The difference between male and female rats was not statistically significant.
Gainer és mtsai* vizsgálatai
280 g-os patkány Kiindulási O2 felhasználás = 23 ml/perc/kg
40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti Vérzés alatt az O2 felhasználás = (23-10) 13 ml/perc/kg Várhatóan túlélő
315 g-os patkány Kiindulási O2 felhasználás = 15 ml/perc/kg
40% vérzés az O2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti A vérzés alatt az O2 felhasználás = (15-10) 5 ml/perc/kg Várhatóan nem éli túl a vérzést
* Gainer JL et al. Hemorrhagic shock in rats. Lab Animal Sci 1995; 45(2): 169-172.
További tényezők - az anaesthesia hatása Tanulmány
Watts et al.1
Custalow et al.2
Anestheticum (mg/kg)
Éber*
Súly (g)
300-450
Altatott Ketamin/ Xylazin (70/3 mg/kg) 350-420
MAP (Hgmm)
40 ± 0.8
38 ± 1
Vértérfogat
15.5 ± 0.6
14 ± 0.4
Laktát 60’
16 ± 0.5
7 ± 0.5
Art. pH 60’
7.09 ± 0.04
7.27 ± 0.02
* Éber vérzéses modellek csak szigorú feltételek mellett engedélyezhetők 1Watts, JA, et al. AJP 2001;281:G498-G506 2Custalow, CB, et al., Shock 2001;15(3):231-238
Tanulságok Éber vs altatott modellek összefoglalása
Az anaesthesia jelentősen befolyásolja a központi idegrendszer által irányított autonóm reflexeket.
Az anaesthesia általában jelentősen befolyásolja (deprimálja) a légzést.
Bizonyos anaesthetikumok jelentősen befolyásolják (csökkentik) a gyulladást.
Ellenőrzött vs ellenőrizetlen vérzéses modellek összefoglalása
Állandó nyomás és állandó térfogatú ”ellenőrzött” vérzéses modellekben a kiindulási artériás középnyomás értékekig történő újraélesztés adta a legjobb eredményt (jobb túlélés). 1990 évek: az „aggresszív” reszuszcitáció káros lehet, „ellenőrizetlen” vérzéses modellben a hipotenziv újraélesztés jobb eredményeket adott.
N.B. 1918: Cannon et al.: al.: The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 1918;15:1392 1918;15:1392--1395. “If the pressure is raised before the surgeon is ready to check the bleeding that may y take place, blood that is sorely needed may be lost. ma lost.
Tanulságok - a Nem szerepe
A legtöbb vizsgálatra hímeket használnak… Azonban: Alacsony tesztoszteron és magas ösztradiol védő hatású (és pl. kivédi az immunszuppressziót is (Angle, M.K. et al.: Effect of gender and sex hormones on immune responses following shock. Shock 2000;14(2):81-90) Azóta védőhatást igazoltak (állatokban): Ivartalanítás Estradiol Flutamide (androgén receptor antagonista) DHEA (ösztrogén agonista) Etc. esetén
Tanulság: a ‘gyengébbik’ nem jobban tolerálja a traumás vérzést….
A vérzéses modellek tanulságai
A (pl. 40 Hgmm-es) középnyomás csökkenésre adott reakció nem uniform (ld. testsúly…).
A nem és az altatás befolyásolja a kórlefolyást, a súlyosságot is…
A vérvesztés (pl. 40 Hgmm-es MAP elérése) módja sem mellékes, és a nyomáscsökkenés sebessége is befolyásolja a vesztett vértérfogatot, különösen éber állapotban.
A tanulságok összefoglalása
Irreleváns, klinikailag nem megfelelő, alkalmatlan modellek → elhibázott kísérletek → hibás klinikai vizsgálatok → hibás következtetések
1. Tanács
A hatékony kutatómunkához alapos tervezésre - és az állati modellek korlátainak ismeretére van szükség. A célt világosan meg kell határozni és sohasem szabad túlbecsülni: Élettani jelenség kutatása Kórélettani mechanizmus kutatása Kórélettani változások befolyásolása Kezelések (pre-klinikai) vizsgálata
2. Tanács
A modellt mindig a valósághoz viszonyítva kell kialakítani Minden állatkísérlet legfontosabb eleme (eredményeit és következtetéseit leginkább befolyásoló tényezője): a megfelelő kontroll csoport. A háttér alapos ismerete előtt nem szabad következtetéseket levonni saját eredményeink fontosságáról.
Ajánlott irodalom - összefoglalók
Deitch, E.A. Animal models of sepsis and shock: A review and lessons learned. Shock 1998;9(1):1-11.
Schulz, M.J., van der Poll, T. Animal and human models for sepsis. Ann. Med. 2002;34:573-581.
Esmon, C.T. Why do animal models (sometimes) fail to mimic human sepsis? Crit. Care Med. 2004;34(5):S219-S222.
Gems of wisdom from Watson and his colleagues that should guide young scientists in all fields on how to be the best that one can and how to learn from failures 1. Conventional wisdom is often wrong. 2. Take real joy in the discoveries of others; what matters most is whether the result is important. 3. "Jim and Francis believed that in order to go fast, you must share information in the expectation of learning things, rather than withhold it from fear of theft." 4. Sometimes, "a beautiful insight could solve a jigsaw puzzle even when the best solid evidence had been ignored." 5. There is value in scientific partnerships of equals. 6. "Two people are better than one. Otherwise you get in a rut, you can get too fond of your own ideas, you get the wrong idea, you can't get out of it." 7. Young scientists who feel the need to assert their independence should not do it by cloistering themselves. 8. "Rosalind Franklin just needed a collaborator. She didn't have somebody to break the pattern of her thinking." 9. Above all, find the best mentor. Judah Folkman in Nature Medicine (April 2003): Watson and DNA: Making a Scientific Revolution
