1) Vznik vyšších proteinových struktur 2) Nekovalentní vazby v polypeptidovém řetězci 3) Sbalování proteinů pomocí chaperonů 4) Vlastnosti a funkce

1) Vznik vyšších proteinových struktur 2) Nekovalentní vazby v polypeptidovém řetězci 3) Sbalování proteinů pomocí chaperonů 4) Vlastnosti a funkce vybraných chaperonů 5) Co je to proteostáza a jaká je její funkce 6) Terapeutické chaperony 7) Proteozóm 8) Další mechanismy úpravy proteinů 9) Tvorba disulfidických můstků 10) Posttranslační modifikace proteinů 2

Je pro vytvoření funkčních molekul rozhodující Zahrnuje následující procesy  Vlastní vytvoření 3D konformace  Připojení kofaktorů  Modifikace kinázami nebo jinými proteinmodifikujícími enzymy

3

Především nekovalentní interakce

iontová vazba

vodíkový můstek

van der Waalsova síla

4

… je pro tvorbu 3D ta nejdůležitější polární nepolární postranní řetězec postranní řetězec

hydrofobní vnitřek polypeptidu obsahuje nepolární AA

nesbalený polypeptid

vodíkové můstky se tvoří mezi polárními AA

sbalený polypeptid ve vodě

5

nascentní polypeptidový řetězec Sbalování a vazba kofaktoru (nekovalentní interakce) Glykosylace, fosforylace, acetylace (kovalentní modifikace)

P

P

Vazba k dalším proteinovým podjednotkám

maturovaný funkční protein

6

 Existují ale i kovalentní modifikace ve specifických aminokyselinách  Nejčastěji glykosylace nebo fosforylace  Celkem bylo popsáno více než 100 typů kovalentních modifikací polypeptidových řetězců 7

Pochopení samotné struktury proteinů a procesů její tvorby je důležité pro design léčiv, protože léčiva často působí na úrovni vazebného nebo alosterického místa enzymů.

8

Databáze sekvencí proteinů Databáze SWISS-PROT založená na Univerzitě v Ženevě v roce 1986 Spravuje Švýcarský institut pro bioinformatiku (SIB) www.expasy.org Obsahuje automaticky doplňované překlady sekvencí genů z EMBL (www.ebi.ac.uk)

Databáze PDB (The Protein Databank) Archivuje a analyzuje proteinové struktury a komplexy informačních biomakromolekul http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 9

www.ncbi.nlm.nih.gov

10

www.ncbi.nlm.nih.gov/protein

11

12

1) Heslo „Homo sapiens chemokine receptor 5 “ 2) V listopadu 2012 jich bylo 5, všechny získané z krystalografických dat prostřednictvím paprsků X, žádná NMR

13

14

 autonomní proces nevyžadující žádné dodatečné faktory ani přísun energie  Christian Anfinsen 1972 Nobelova cena  experimenty in vitro  terciární struktura po opuštění ribozómu in vivo  nativní konformace do okamžiku degradace

15

16

17

 Rychle (sekundy) tvorba kompaktní struktury zhruba výsledné = dynamické a flexibilní nestabilní stadium skoro nativní konformace (molten globule)

 je výchozím strukturou pro relativně pomalý proces (minuty), při kterém dochází k řadě postranních interakcí, jež nakonec, pokud celý proces proběhne správně, vytvoří funkční terciární strukturu. 18

 Sbalování jednotlivých domén začíná od N konce

 U některých proteinů je proces sbalování dokončen současně s tím, jak se z ribozomu uvolní C konec polypeptidového řetězce 19

postranní řetězce aminokyselin

nesbalený protein SBALOVÁNÍ vazebné místo enzymu

sbalený protein Alberts et al 2008: Figure 3-37a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

20

 sbalování in vitro je „snadné“

 in vivo agregace - koncentrace proteinu - teplota - postranní interakce  agregace je proces patologický daný nespecifickými interakcemi polypeptidových řetězců 21

 fyziologicky vlastní syntézou  nefyziologicky nebo přítomnost chemikálií  rozbalení, denaturace Reakce buňky  tvorba zvýšeného množství ochranných proteinů (heat shock response, stress response) 22

 Rozpoznáním hydrofobních aminokyselin na povrchu již sbaleného proteinu  Existence hydrofobních aminokyselin na povrchu proteinu je varovným signálem, že s proteinem není něco v pořádku  Nesprávně strukturovaný protein nejenže nemusí být v buňce funkční, ale jeho přítomnost může i škodit 23

nově syntetizovaný protein

agregované struktury

správně sbalený bez pomoci správně sbalený s pomocí chaperonů

nesprávně sbalený rozložený proteazómem 24

 selekce proteinů na základě biologických vlastností  na základě schopnosti se účinně sbalovat

25

nevhodné podmínky = proč buňky neobsahují samé agregované struktury?

1) agregované struktury jsou rychle odbourávány - proč tolik vynaložené energie? 2) strategie minimalizace vzniku agregovaných struktur

26

27

 neposkytují sterickou informaci  inhibují neproduktivní interakce  nacházejí se ve všech kompartmentech  sbalování proteinů

 konformační přestavby

28

vysoce afinitní chaperon

U agregáty

Iuc

málo afinitní chaperon

Ic

N 29

 chaperon navozuje konformační změnu ve struktuře proteinu  např. kontrolované rozbalení proteinu  nová příležitost pro nesbalené nebo špatně sbalené proteiny  chaperon kontrolovaně uvolňuje protein  přesmyknutí afinitního stavu chaperonu nízce afinitní - substrát

vysoce afinitní + substrát + ATP

30

GroES,

7 domén, 75A

GroEL 2x7 podjednotek

3 domény - ekvatoriální - apikální

průměr 45A

- střední 31

druhá strukturální změna

zachycení proteinu transkomplex

ciskomplex

snížení afinity k substrátu

strukturální změna 32

 jak sbalit „mis-folding“ proteiny?

 GroE je schopen je rozbalit  váže se na hydrofobní povrchy

 neváže se na správně sbalené proteiny

33

Anfinsenova klec

Doba cyklu v chaperonu je kratší než doba sbalení proteinu -

část proteinů dosáhne nativní konformace

-

část proteinů podstoupí další cyklus v chaperonu 34

 eukaryota, eubakterie, archea  DnaK u E. coli Princip působení

 vazba na krátké hydrofobní segmenty proteinů, zabránění agregaci, zastavení sbalování  spoluúčast ko-chaperonů a dalších proteinů 35

ATPázová doména N-konec Mg2+

ADP

vazebná doména C-konec heptapeptid

36

vazba substrátu na DnaJ asociace s DnaK hydrolýza ATP

výměna ADP za ATP

přenos substrátu

37

 nebyl podán důkaz aktivního působení na konformaci proteinů

 nemá mikroprostředí pro sbalování  pravděpodobně akceptor nesbalených a rozbalených proteinů  předává je dalším systémům

38

 eukaryotický chaperon  v posledních fázích je jeho součástí Hsp70  spoluúčast více kofaktorů

 široké spektrum závislých proteinů  src kináza  regulace buněčného cyklu – terapeutický cíl (inhibice ansymycinem, geldanamycinem)  inhibuje Hsp90 a vazbou na Hsp90 se snižuje její množství v buňce

39

40

zachycení SHR – steroid hormone receptor

časný komplex přenos SHR na Hsp90

zralý komplex

hormon kaskáda intermediární

náhrad

komplex 41

 nalezeny téměř u všech studovaných organismů  v jednom buněčném kompartmentu více rodin

 různé funkce, heterogenní skupina  společný rys = konzervativní C-koncová doména tvořená A-krystalinem

42

Methanococcus jannaschii 12-24 podjednotek ve formě β-listů, které vytvářejí dutou kouli o vnějším průměru 120A a vnitřním průměru 65A

43

44

45

 homeostáza proteinů

 popsána u eukaryot (eukaryotic protein homeostasis)

Jedná se o soubor interakcí, které udržují „optimální“ (zdravý) stav proteomu v organismu

Proteostasu zajišťují malé regulační molekuly, které ovlivňují koncentraci, konformaci, kvartérní strukturu nebo lokalizaci proteinů v buňce W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

46

 udržuje buňky ve zdravém stavu  umožňuje vývoj organismu a jeho vyzrávání

 chrání proti onemocnění

Poruchy proteostázy vedou k mnoha metabolickým, onkologickým, neurodegenerativním a kardiovaskulárním onemocněním

W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

47

ribonukleasa A

W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

48

W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

49

W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

50

W. E. Balch et al., Science 319, 916 -919 (2008)

51

Malé molekuly, které se váží k nesprávně sbaleným proteinům a stabilizují je nebo zajišťují jejich správné sbalení Slouží například k léčbě    

lysozomálního onemocnění ze střádání familiární amyloidní polyneuropatie fenylketonurie a dalších onemocnění spojených se sbalováním proteinů

52

gonadotrophin-releasing hormone (GnRH)  mutace, která způsobuje špatné sbalení receptoru pro GnHR  lze vyřešit působením farmakologického chaperonu  jedná se o první úspěšnou aplikaci na myším modelu onemocnění

J.A. Janovick et al. (2013): “Restoration of testis function in hypogonadotropic hypogonadal mice harboring a misfolded GnRHR mutant by pharmacoperone drug therapy,” PNAS, doi:10.1073/pnas.1315194110, 2013.

53

 GnRH hraje klíčovou roli v řízení funkce reprodukčního systému  Molekula GnRH má podobnou stavbu u všech zvířat  Je to dekapeptid  Působí primárně na předním laloku hypofýzy, kde stimuluje syntézu a sekreci gonadotropinů - FSH a LH Gonadotropin či gonadotropní hormon je jakýkoliv savčí hormon (obvykle glykoproteinové povahy), který stimuluje vývoj pohlavních orgánů (gonád). Obecně tyto hormony navozují v těle vývoj pohlavních buněk a stimulují produkci dalších pohlavních hormonů (steroidů).

54

 Špatně sbalený GnRH receptor způsobuje ztrátu funkcí testes nebo ovarií.  Samci myší s mutací mají malá testes, produkují málo zralých spermií a abnormální množství testosteronu. Jsou sterilní.  Samice myší mají malá ovaria a neprodukují zralé folikuly, jsou sterilní.  Farmakologický chaperon IN3 je antagonistou GnRH receptoru, umožňuje jeho správné sbalení  receptor je pak transportován do plasmatické membrány a funguje normálně. 55

 Mutantním myším (s hypogonádotropním hypogonádismem) byla látka IN3 aplikována katetrem do krkavice  Aplikace po dobu 30 dnů, dávkování 6 hodin každé 3 dny

 Poté došlo k obnovení funkce a normální hmotnosti testes  Napravil se tvar spermií a jejich dozrávání

56

Komplex ATP dependentních proteáz, který odbourává nesprávně sbalené proteiny, jež pronikly z ER do cytosolu

aktivní místa

centrální válec (degradace proteinu) regulační částice (zachycení proteinu)

Proteázy na vnitřní straně válce štěpí na více místech, a proto degradují protein na malé peptidy

57

V závislosti na typu ubiquitinace získává modifikovaný protein specifickou funkci monoubiquitinace

multiubiquitinace

regulace histonů

endocytóza

polyubiquitinace

degradace v proteozómu

reparace DNA 58

 složkou proteozómu jsou tzv. „defoldázy“ – rozbalují proteinový řetězec tak, aby mohl prostupovat skrz válcovitou strukturu proteozómu  proces rozbalování proteinu vyžaduje energii ATP cílový protein s polyubiquitinovaným řetězcem

centrální válec

aktivní místa

regulační částice 59

Proteolytické mechanismy odstraňují 1) Špatně sbalené proteiny nebo abnormální proteinové struktury 2) Normální proteiny, které již nejsou zapotřebí K proteolytickým mechanismům patří 1) Ubiquitinylace 2) Fosforylace 3) Acetylace 4) Disociace podjednotek 5) Štěpení a vytvoření nového degradovatelného konce 60

Řada dědičných onemocnění je vyvolána mutacemi, které mají za následek špatné sbalení proteinu, resp. vytvoření abnormální struktury

 srpkovitá anémie  deficience α-1-antitrypsinu Poškozené kontrolní mechanismy umožňují vznik agregovaných struktur, které nejsou štěpeny proteázami     

Huntingtonova chorea, Alzheimerova nemoc Scrapie u ovcí Creutzfeld-Jakobova choroba BSE u dobytka

61

Součást procesu sbalování proteinů Membrána Cytoplasma

SYNTÉZA

Organela

SBALOVÁNÍ

J. Riemer et al., Science 324, 1284 -1287 (2009)

62

Bakterie

Eukaryota

Periplasma

ER Mechanismus oxidace v endoplasmatickém retikulu a mezi membránami mitochondrií je odlišný a nemá společný evoluční původ

IMS

J. Riemer et al., Science 324, 1284 -1287 (2009)

63

J. Riemer et al., Science 324, 1284 -1287 (2009)

64

65

Modifikace mění strukturu a biologickou aktivitu proteinů Některé procesy jsou kotranslační, jiné opravdu posttranslační Nejběžnější je glykosylace

66

Typ modifikace

Význam

Glykosylace

 solubilitu, ovlivňuje biologický poločas nebo biologickou aktivitu

Karboxylace

Důležitá pro vazbu některých krevních proteinů k Ca2+

Hydroxylace

Důležitá pro strukturální uspořádání

Sulfatace

Ovlivňuje biologickou aktivitu neuropeptidů a proteolytické úpravy polypeptidů

Amidace

Ovlivňuje biologickou aktivitu a stabilitu 67

 připojení cukerného zbytku k polypeptidovému řetězci  vyskytuje se hlavně u extracelulárních proteinů a proteinů vyskytujících se na povrchu buněk

Glykosylací vznikají glykoproteiny  U některých proteinů deglykosylace nemá vliv na biologickou aktivitu  Deglykosylované formy lze připravit účinkem inhibitorů glykosylace, např. antibiotikem tunicamycinem v růstovém médiu nebo enzymatickou degradací glycidické části preformovaného glykoproteinu glykosidázou. 68

      

Sbalování proteinů Transport/zacílení proteinů Rozpoznání/vazba ligandů Biologická aktivita Stabilita Reguluje biologický poločas proteinu Imunogenicita

69

 Vysoce glykosidovaný  Odstranění glycidické části má za následek ztrátu biologické aktivity, ačkoli se hormon stále váže na svůj receptor, někdy dokonce s vyšší afinitou

Jaká je funkce gonádotropního hormonu?

70

N-glykosylace  glykosid připojen k proteinu přes atom dusíku na asparaginu

manosa, galaktosa, glukosa, fukosa, Nacetylgalaktosamin, xylosa a kyselina sialová 71

O-glykosylace  glykosid připojen k proteinu přes kyslík hydroxylových skupin, zpravidla serinu a threoninu

manosa, galaktosa, glukosa, fukosa, Nacetylgalaktosamin, xylosa a kyselina sialová 72

 N-glykosylace je sekvenčně specifická  Mikroheterogenita glykosidovaných proteinů = přesné složení a struktura glykosidů se můžou u jednoho typu glykoproteinu mírně lišit (např. lidský interferon λ (M = 20 000 a 25 000) 73

74

 omezený počet proteinů, které se podílejí na hemostáze  γ-karboxylace = enzymatická konverze zbytků kyseliny glutamové za vzniku γ-karboxyglutamátu  hydroxylace kyseliny asparagové za vzniku β-hydroxyaspartátu

 obě modifikace umožňují vazbu iontů vápníku, což zabezpečuje efektivní funkci krevních faktorů VII, IX a X a taky aktivaci proteinu C a proteinu S antikoagulačního systému

 enzymatická konverze zbytků kyseliny glutamové za vzniku γ-karboxyglutamátu

kyselina karboxyglutamová

 při β-hydroxylaci dochází k hydroxylaci kyseliny asparagové za vzniku β-hydroxyaspartátu

k. hydroxyasparagová

hydroxyasparagin

 Malý počet biofarmak je sulfatován nebo amidován

 Sulfatace je připojení skupiny SO42- k cílovému polypeptidu v místě tyrozinu  Sulfatace má význam pro interakce protein-protein, ztráta sulfatace snižuje aktivitu polypeptidu  Terapeuticky významným proteinem, který je sulfatován, je antikoagulant hirudin a krevní faktory VIII a IX

 Chemokinový receptor CXCR3 (účastní se signalizace pro T buňky a NK) vyžaduje sulfataci tyrozinu, aby se k němu navázal ligand  Rekombinantní proteiny zpravidla nejsou sulfatovány, ale vykazují ještě terapeutický účinek

Popište strukturními vzorci sulfataci tyrozinu v molekule hirudinu

O -O

S

O

 Náhrada karboxylové skupiny na C-konci polypeptidu aminoskupinou (COOH  CONH2)  K této modifikaci dochází u krátkých peptidů  Amidace je málo prozkoumaná, ale je nezbytná pro funkci výsledného produktu

Popište strukturními vzorci amidaci C-koncového prolinu na molekule lidského kalcitoninu

NH2

1) Vznik vyšších proteinových struktur 2) Nekovalentní vazby v polypeptidovém řetězci 3) Sbalování proteinů pomocí chaperonů 4) Vlastnosti a funkce vybraných chaperonů 5) Co je to proteostáza a jaká je její funkce 6) Terapeutické chaperony 7) Proteozóm 8) Další mechanismy úpravy proteinů 9) Tvorba disulfidických můstků 10) Posttranslační modifikace proteinů 83

Může v bakteriální buňce E. coli vznikat kvartérní struktura proteinů?

84

Popište vznik inzulínu v rámci posttranslačních úprav pre-proinzulínu, kolik disulfidických můstků obsahuje inzulín?

85

Jakou látkou lze in vitro provést tzv. redukční štěpení, tj. vytvoření dvou samostatných skupin SH namísto jednoho disulfidického můstku?

86

1) Uveďte příklad glykosylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 2) Uveďte příklad fosforylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 3) Uveďte příklad ubiquitinovaného proteinu a jeho funkci v buňce

87