Vybrané problémy měření obsahu močoviny v mléce a možnosti využití obsahu močoviny ve šlechtění dojeného skotu Ing. Pavel Bucek, Českomoravská společnost chovatelů, a.s. Močovina je konečný produkt metabolismu bílkovin a je tvořena z amoniaku v játrech. Amoniak je produkován v průběhu rozkladu bílkovin během tkáňového metabolismu. Vedle jater hrají důležitou roli ledviny (syntéza močoviny probíhá v játrech a poté je krví transportována do ledvin a vyloučena močí). Přeměna amoniaku na močovinu je prevencí toxicity z amoniaku. Močovina je běžnou součástí mléka a krve. Do mléka proniká močovina z krve. Koncentrace močoviny v krvi kolísá v průběhu dne. Nejvyšších hodnot dosahuje 4 až 6 hodin po příjmu krmiva a nejnižší je před nakrmením. Podle celé řady výzkumných prací ovlivňuje obsah močoviny využívání směsné krmné dávky nebo odděleného podávání jadrného krmiva. Vyšší hodnoty obsahu močoviny jsou běžné při využívání tradičního systému krmení. Obecně lze konstatovat, že i při stejné dietě je u jednotlivých krav vykazován rozdílný obsah močoviny v krvi, v krevní plazmě a mléce. Hodnoty močoviny v krvi a mléce jsou podobné, když se vzorek odebere z mléka a krve ve stejnou dobu. V případě rozdílné doby odběru se výsledky liší. Monitorování močovinného dusíku nabízí možnost vyhodnotit koncentraci proteinu v krmné dávce, snížení nákladů a redukci zatížení životního prostředí. Mezi vlivy, které ovlivňují obsah močoviny v mléce patří: • příjem proteinu a energie (obecně lze konstatovat, že nadměrný obsah hrubého proteinu v krmné dávce zvyšuje obsah močoviny v krvi a mléce a vyšší příjem energie často snižuje koncentraci močoviny v krvi); • příjem proteinu degradovatelného a nedegradovatelného v bachoru; • příjem vody a sušiny v krmné dávce (při dehydrataci organismu lze očekávat vyšší hladinu močoviny v krvi a v mléce); • zdravotní stav a „funkčnost“ jater a ledvin; • některá onemocnění; • pastva (vyšší obsah močoviny v mléce krav na pastvě); • doba odběru vzorku. Příspěvek se zabývá vypovídací schopností metod využívaných pro stanovení obsahu močoviny v mléce, vztahem obsahu močoviny k reprodukci a vybraným produkčním vlastnostem a perspektivou stanovování plemenných hodnot pro obsah močoviny v mléce. Příspěvek vychází z jednání na posledních kongresech ICAR (Mezinárodního výboru pro kontrolu užitkovosti).
Vypovídací schopnost jednotlivých metod využívaných pro stanovení obsahu močoviny v mléce Močovina proniká z krve do mléka a existuje vztah mezi obsahem močoviny v mléce a v krvi. Pro praktické účely se jeví jako vhodnější využívání výsledků analýz obsahu močoviny v mléce. Při hodnocení výsledků je nutné vzít v úvahu, že se často používají rozdílné hodnoty a jednotky. V České republice je to obsah močoviny uváděný v mmol/l, popřípadě mg/100 ml mléka. V některých zemích se využívají hodnoty obsahu močovinného dusíku v mléce v mg/dl, popřípadě mg%. Běžně uváděné hodnoty močovinného dusíku v mléce kolísají v rozmezí 0,5 až 39,5 mg/dl (například u přístroje ChemSpec 150 je možné měřit močovinný dusík v rozsahu 0 až 40 mg/dl a obsah močoviny v rozmezí 0 až 86 mg/dl). V praxi by mělo být využito výsledků analýz na obsah močoviny minimálně od 8 krav, protože je vykazována významná variabilita obsahu močovinného dusíku mezi stády a jednotlivými kravami. Výsledky stanovení obsahu močoviny by měly být využívány s přihlédnutím k ostatním faktorům a ne izolovaně. Pro měření obsahu močoviny a močovinného dusíku v mléce se využívá několik metod: • modifikované Berthelotovy reakce ke stanovení obsahu močoviny nebo celkového obsahu močovinného dusíku, a to s enzymatickou přípravou a kolorimetrickou detekcí (společnost Bentley-přístroj Chemspec a Skalar); • měření změny pH způsobené změnou koncentrace čpavku (přístroj CL-10, Eurochem, 00040 Ardea, Rome Italy); • měření močoviny (nebo močovinného dusíku) nepřímo pomocí metody IRS (infrared spectroscopyspolečnost Foss Electric, Foss 4000 a Foss 6000. Pro stanovení objektivnosti a přesnosti existuje celá řada přístupů. První využil ve své studií například Peterson a kolektiv (2004), kteří analyzovali a porovnávali jednotlivé metody ve 14 nezávislých laboratořích ve Spojených státech a zabývali se: • přesností výsledků měření jednotlivých přístrojů;
•
identifikovali rozdíly vzorku s přesně definovaným obsahem močovinného dusíku (kontrola) se vzorkem, do kterého se přidalo přesně definované množství močoviny. Vzorky byly připraveny podle metodiky, kdy mléko od každé krávy (1,5 litru) bylo zamícháno a rozděleno do dvou 750 ml vzorků, každý ze vzorků byl přelit do Erlenmayerovi láhve. Do jedné láhve byl přidán jeden ml vody (vzorek nazvaný „kontrola“). Do další láhve byla přidána močovina (1 ml) tak, aby koncentrace byla o 4 mg/dl vyšší než u kontroly. Každá láhev byla 10 krát protřepaná, a poté rozdělena do 14 vzorků o objemu 50 ml s konzervantem a analyzována. Ukazatel nazývaný „recovery“ byl kalkulován, jako rozdíl analyzovaného močovinného dusíku mezi vzorkem kde byl dodán močovinný dusík a kontrolou. Výsledek byl vydělen 4 mg/dl (přidaná močovina). Výsledky lze interpretovat tak, že 100 znamená nejvyšší přesnost (hodnoty nad 100 nadhodnocují výsledky a pod 100 podhodnocují naměřené hodnoty). Výsledky porovnání jednotlivých metod jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1 Porovnání analytických metod podle ukazatele „recovery“1) Přístroj recovery (%)1) Bentley 92,1 CL-10 85,0 Foss 4000 47,1 Foss 6000 95,4 Skalar 95,1
SE (v %) 2,76 2,76 9,88 10,1 7,61
1) rozdíl analyzovaného močovinného dusíku mezi vzorkem kde byl dodán močovinný dusík a kontrolou, výsledek byl vydělen 4 mg/dl (přidaná močovina). Zdroj: Peterson a kolektiv (2004)
Z výsledků jsou patrné nevýznamné rozdíly v ukazateli „recovery“ mezi přístroji Bentley, Foss 6000 a Skalar. U přístroje Foss 6000 se u dvou přístrojů vyskytly výsledky přesahující hodnotu 100 a vyšší hodnoty ukazatele SE. U přístroje CL-10 byla významně nižší hodnota „recovery“ než u přístrojů firmy Bentley, Foss 6000 a Skalar, ale přístroj CL-10 dosáhl vyšší hodnoty než Foss 4000. Zajímavé je i porovnání mezi jednotlivými laboratořemi (tabulka 2). Z tabulky jsou patrné diference ve sledovaném ukazateli mezi laboratořemi využívajícími stejné metody. Vysoká variabilita byla zjištěná u přístroje Foss 4000 a 6000 (u ostatních přístrojů byla nižší). Tabulka 2 Porovnání analytických metod podle ukazatele „recovery“1) mezi laboratořemi recovery (%1)) SE (v %) Přístroj / laboratoř2) Bentley / A 97,6 1,41 Bentley / B 88,9 1,48 Bentley / C 89,9 1,57 CL-10 / A 86,7 1,33 CL-10 / B 88,7 1,44 CL-10 / C 79,6 1,07 Foss 4000 / A 46,7 5,90 Foss 4000 / B 30,4 1,50 Foss 4000 / C 64,2 1,58 Foss 6000 / A 105,3 3,87 Foss 6000 / B 105,8 2,39 Foss 6000 / C 75,3 1,39 Skalar / A 88,3 0,84 Skalar / B 101,8 7,72 1) rozdíl analyzovaného močovinného dusíku mezi vzorkem, kde byl dodán močovinný dusík a kontrolou, výsledek byl vydělen 4 mg/dl (přidaná močovina); 2) A, B, C rozdílné laboratoře využívající stejný typ přístroje. Zdroj: Peterson a kolektiv (2004)
Nízká variabilita ukazatele recovery byla vykázána mezi jednotlivými laboratořemi u přístrojů firmy Bentley a CL-10, přičemž lepších výsledků dosáhla společnost Bentley. Ukazuje se, že modifikované Berthelotovy reakce ke stanovení močoviny nebo celkového obsahu močovinného dusíku, a to s enzymatickou přípravu a kolorimetrickou detekcí je opakovatelná metoda, která je spolehlivá pro analýzu močoviny v mléce. U přístroje společnosti Foss 6000 (2 laboratoře nad 100 %, třetí laboratoř pouze 75,3 %) byla vykázána nižší opakovatelnost metody a podhodnocené nebo nadhodnocené výsledky. Přístroj Foss 4000 vykázal ve všech laboratořích odlišné výsledky (podhodnocení, vysoké rozdíly mezi laboratořemi a méně přesné výsledky). Z jednotlivých složek má vliv na kvalitu výsledků velmi vysoký obsah tuku. Podle některých autorů dochází
u technologie IRS k nadhodnocení výsledků při nízkých koncentracích močoviny v mléce, a podhodnocení výsledků při vyšších koncentracích močoviny v mléce. Proto je vhodnější využívat IRS výsledky, když je analyzováno celé stádo a výsledky skupiny krav jsou zprůměrňované a na základě těchto výsledků přijmout opatření. Dalším přístupem je statistické porovnávání metody s referenční metodou. Tento přístup a jeho výsledky byly diskutovány na posledním kongresu ICAR v roce 2006. Broutin (2006) porovnával jednotlivé metody s využitím individuálních a bazénových vzorků mléka. Výsledky studie jsou shrnuty v tabulkách 3 a 4. Rovněž podle tohoto přístupu se ukázala jako nejpřesnější „enzymatická metoda“. Tabulka 3 Porovnání jednotlivých metod využívaných pro měření močoviny (bazénové vzorky) Přístroj, metoda N1) Sy, x2) referenční metoda/zdroj ChemSpec 150 10 0,17 Enzymatic + pH Differntial ChemSpec 150 10 0,19 AFNOR NF VO4-217 ChemSpec 150 10 0,21 DMAB ChemSpec 150 10 0,26 Enzymatic + Colorimetric ChemSpec 150 78 0,77 DMAB ChemSpec 150 30 0,88 Enzymatic + pH Differntial ChemSpec 150 233 0,96 Enzymatic + pH Differntial ChemSpec 150 96 0,74 Enzymatic + pH Differntial ChemSpec 150 49 1,58 Enzymatic AFNOR NF VO4-217 ChemSpec 150 x méně než 1 výrobce3) Enzymatic + ph Differential Filter IR x méně než 4,5 výrobce3) FTIR x méně než 3,0 výrobce3) 1) počet bazénových vzorků; 2) Sy,x = směrodatná odchylka přesnosti po provedení regrese, nižší hodnoty vyjadřují vyšší přesnost; 3) z materiálů výrobců přístrojů. Zdroj: Broutin (2006)
Tabulka 4 Porovnání jednotlivých metod využívaných pro měření močoviny (individuální vzorky) Přístroj, metoda N1) Sy, x2) referenční metoda/zdroj ChemSpec 150 129 0,82 Enzymatic + Conductivity ChemSpec 150 139 1,00 DMAB ChemSpec 150 158 1,26 Enzymatic + pH Differntial ChemSpec 150 98 2,10 Enzymatic AFNOR NF VO4-217 ChemSpec 150 x méně než 1,5 výrobce3) Enzymatic + ph Differential Filter IR x méně než 6 výrobce3) FTIR x méně než 3,5 výrobce3) 1) počet vzorků; 2) Sy,x = směrodatná odchylka přesnosti po provedení regrese, nižší hodnoty vyjadřují vyšší přesnost; 3) z materiálů výrobců přístrojů. Zdroj: Broutin (2006)
Vliv obsahu močoviny na reprodukci dojených krav V posledních letech dochází k nepřetržitému nárůstu dojivosti, ale na druhé straně k poklesu reprodukční výkonnosti a zvyšování výskytu zdravotních problémů ve stádech dojeného skotu. Řada studií uvádí vliv nadměrného obsahu hrubého proteinu v krmné dávce na výskyt reprodukčních problémů. Utilizace proteinu je závislá na příjmu energie. Koncentrace močoviny se může zvýšit při nadměrném množství proteinu degradovatelném a nedegradovatelném v bachoru, nebo když je v krmné dávce deficit energie. Z celé řady studií vyplývá, že zvýšená koncentrace močoviny v krvi je spojena se snížením reprodukční výkonnosti dojených krav. Většina autorů uvádí, že při zvýšení koncentrace hrubého proteinu v krmné dávce dochází ke snížení reprodukčních parametrů (zabřezávání, vyšší inseminační index, vyšší počet dnů do první ovulace). Často je uváděno, že při zvýšení obsahu hrubého proteinu z intervalu 13 až 17 % na 19 až 20 % dojde k poklesu zabřezávání. Na druhé straně se ve výsledcích některých autorů tento negativní efekt neprokázal. Výsledky vztahů reprodukčních ukazatelů k obsahu močoviny a hrubého proteinu uvádí tabulky 5 a 6.
Tabulka 5 Vliv obsahu hrubého proteinu na zabřezávání plemenic 13 až 17 % hrubého proteinu v krmné 19 až 21 % hrubého proteinu v krmné dávce dávce Zdroj procento koncentrace procento březosti koncentrace březosti (%) močoviny v krvi (%) močoviny v krvi (mg%) (mg%) Folman a kol., 1989 56 9 44 15 Carroll a kol.,1998 64 10 56 24 Bruckental a kol., 1989 65 25 52 32 Canfield, a kol., 1990 48 12 31 19 Barton a kol., 1996 41 9 44 21 McCormick a kol., 1999 75 20 53 25 Tabulka 6 Reprodukční výkonnost krav krmených krmnou dávkou s odlišným obsahem proteinu v krmné dávce obsah protein degradovatelný koncentrace počet dnů do první Zdroj hrubého v bachoru (% h.p.) močoviny v krvi ovulace a úroveň proteinu (mg%) zabřezávání v krmné plemenic dávce (%) Garcia-Bojalil, 20,5 54 17 25 dnů do první a kol, 1998 ovulace 20,7 76 22 39 dnů do první ovulace 20 60 20 34 dnů do první ovulace Westwood a kol., 20,7 67 23 zhoršení zabřezávání 1998 po první inseminaci se 19,3 63 x zvyšováním obsahu 19,3 85 x proteinu degradovatelného v bachoru v krmné dávce Z výsledků, kde byly analyzovány vztahy mezi obsahem močovinného dusíku v mléce a reprodukcí v jednotlivých chovech, popřípadě výsledky mezi farmami, odvodil například Ferguson a kol., 1993 pokles zabřezávání při hodnotě nad 20 mg/100 ml močovinného dusíku v krevním séru. Ve velké části studií byla uváděna vyšší citlivost farem s horšími výsledky reprodukce na vyšší obsah močovinného dusíku nad 20 mg/100 ml v krevním séru a následné vyšší problémy s reprodukcí. Elrod a Butler, 1993 dospěli k závěrům, že obsah močovinného dusíku v mléce nad 19 mg/100 ml negativně ovlivňuje inseminační interval a že zabřezávání bylo lepší u krav s hodnotou nižší než 19 mg/100 ml močovinného dusíku. Mechanizmus negativního působení vysokého obsahu močoviny na neuspokojivé výsledky reprodukce spočívá zejména ve změně děložního prostředí, vyšší spotřebě energie na detoxikaci amoniaku na močovinu (která chybí pro reprodukční procesy). V některých případech dochází ke kombinaci ztráty kondice po porodu a k překrmování bílkovinami, což rovněž vede k omezení reprodukční výkonnosti dojnic. Významný faktor je také „funkčnost“ jater, kdy při ztučnění může dojít k omezení detoxikace amoniaku. Problémy se projevují zejména při překrmování bílkovinami a deficitu energie a lze je zmírnit externím dodáním energie.
Možnosti využití močovinného dusíku pro odhad plemenných hodnot Genetická analýza močovinného dusíku a laktózy v podmínkách Kanady byla představena na kongresu ICAR ve Finsku v roce 2006 (Miglior a kol.). Vedle využití obsahu močovinného dusíku pro korekci výživy se jeví po provedení dalších analýz jako perspektivní využití močoviny pro šlechtitelské účely. Ve studii, kterou provedl Miglior a kol. byly odhadovány genetické vztahy k ukazatelům produkce, odhad dědivosti močovinného dusíku a analyzovány možnosti odhadu plemenných hodnot pro močovinný dusík v Kanadě (tabulka 7 až 11). Ve výzkumu byly využity pouze první tři laktace krav. Z tabulek jsou patrné nízké fenotypové korelace močovinného dusíku s dalšími vlastnostmi. Dědivost močovinného dusíku na prvních třech laktacích dosáhla hodnot v intervalu 0,394 až 0,414 (ve studii, kterou provedl Wood a kol., 2003 byla heritabilita pro močovinný dusík 0,44 až 0,59). Z genetických korelací je patrná negativní genetická korelace obsahu močovinného
dusíku se somatickými buňkami (–0,190) a negativní genetická korelace laktózy se somatickými buňkami (– 0,202). Tabulka 7 Fenotypové korelace mezi ukazateli produkce tuk protein tuk protein počet obsah laktóza Ukazatel (kg) (kg) (%) (%) somatických močovinného (kg) buněk dusíku mléko (kg) 0,787 0,936 -0,362 -0,520 -0,083 0,989 -0,031 tuk (kg) 0,805 0,260 -0,250 -0,058 0,771 0,083 protein (kg) -0,238 -0,205 -0,062 0,921 -0,011 tuk (%) 0,470 0,045 -0,370 0,182 protein (%) 0,093 -0,529 0,082 počet somatických -0,110 -0,100 buněk obsah -0,042 močovinného dusíku laktóza (kg)
laktóza (%) 0,252 0,161 0,208 -0,168 -0,248 -0,227 -0,072
0,382
Zdroj: Miglior a kol., 2006
Tabulka 8 Dědivost v jednotlivých laktacích Ukazatel mléko (kg) tuk (kg) protein (kg) tuk (%) protein (%) počet somatických buněk obsah močovinného dusíku laktóza (kg) laktóza (%)
první 0,518 0,369 0,423 0,555 0,576 0,189 0,394
laktace druhá 0,431 0,350 0,392 0,533 0,561 0,272 0,384
třetí 0,468 0,362 0,410 0,543 0,586 0,338 0,414
0,539 0,478
0,466 0,506
0,490 0,508
Zdroj: Miglior a kol., 2006
Tabulka 9 Genetické korelace mezi ukazateli produkce tuk protein tuk protein Ukazatel (kg) (kg) (%) (%) mléko (kg) tuk (kg) protein (kg) tuk (%) protein (%) počet somatických buněk obsah močovinného dusíku laktóza (kg)
0,566
0,894 0,684
-0,494
-0,538
0,659
počet obsah laktóza somatických močovinného (kg) buněk dusíku 0,001 -0,094 0,979 -0,045 0,014 -0,109 0,425 0,009 0,200 -0,190 -0,024
laktóza (%)
-0,092
-0,041
0,096
0,058 0,017 -0,202
Zdroj: Miglior a kol., 2006
Z dalších výzkumů jsou v pracích Izraelských autorů uváděny pozitivní korelace mezi obsahem močoviny v mléce a obsahem tuku v % (Hojman a kol., 2004). Důležitá je negativní genetická korelace mezi obsahem močoviny a počtem somatických buněk. Ve studiích Izraelských autorů je popsána vyšší hladina močoviny v letních měsících a u starších krav. Dalšími vztahy byly kladná závislost obsahu močoviny na obsahu hrubého proteinu, proteinu stravitelnému v bachoru a obsahu neutrálně detergentní vlákniny. Negativní závislosti obsahu močoviny byly zjištěny ve vztahu k obsahu energie v krmné dávce a obsahu nestrukturálních sacharidů a k zabřezávání krav.
Tabulka 10 Genetické korelace mezi jednotlivými laktacemi Ukazatel mléko (kg) tuk (kg) protein (kg) tuk (%) protein (%) počet somatických buněk obsah močovinného dusíku laktóza (kg) laktóza (%)
1. versus 2. 0,786 0,741 0,739 0,961 0,887 0,543 0,846
laktace 1. versus 3. 0,737 0,603 0,585 0,887 0,863 0,395 0,744
2. versus 3. 0,897 0,791 0,793 0,951 0,838 0,562 0,870
0,807 0,831
0,714 0,760
0,892 0,845
Zdroj: Miglior a kol., 2006
Tabulka 11 Korelace mezi plemennými hodnotami (vybrané pouze vyšší než 0,1) Plemenné hodnoty plemenná hodnota pro plemenné hodnoty plemenná hodnota pro obsah laktózy (%) obsah močovinného dusíku v mléce počet somatických buněk -0,164 mléko (kg) -0,106 mléko (kg) 0,101 protein (%) 0,144 hloubka vemene 0,128 tuk (kg) 0,208 persistence laktace 0,329 tuk (%) 0,287 Zdroj: Miglior a kol., 2006
Močovina a zdraví Hlavním přínosem stanovení obsahu močoviny je možnost optimalizace krmné dávky. Vezmeme-li v úvahu, že velká část zdravotních problémů ve stádech dojeného skotu vzniká chybným sestavením krmné dávky, můžeme považovat za perspektivní využití odhadu plemenných hodnot obsahu močoviny ve vztahu ke zdravotnímu stavu. Některé vybrané korelace jsou uvedeny v tabulkách 12 a 13 a pocházejí z výzkumu, který provedla Rissa G. Mitchel (2004). I přes poměrně nízké hodnoty korelací lze považovat výzkum vztahu močoviny k onemocněním, k reprodukčním a produkčním ukazatelům za perspektivní. Připravují se studie, které by objasnily vztah obsahu močoviny k onemocněním. Zajímavé jsou zejména negativní korelace obsahu močoviny k onemocněním reprodukčního traktu. Tabulka 12 Korelace a přibližné genetické korelace odhadnuté mezi plemennými hodnotami pro znaky zdraví a obsahem močovinného dusíku v mléce v Dánsku plemenné hodnoty Plemenné hodnoty močovinný dusík v mléce zjištěný močovinný dusík v mléce zjištěný infračervenou metodou (1. laktace) infračervenou metodou (2. laktace) korelace mezi plemennými hodnotami reprodukce -0,04 -0,25 metabolické a zažívací -0,06 -0,06 poruchy onemocnění končetin -0,11 -0,25 přibližné genetické korelace reprodukce -0,06 -0,35 metabolické a zažívací -0,09 -0,09 poruchy onemocnění končetin -0,17 -0,38 Zdroj: Rissa G. Mitchel (2004)
Tabulka 13 Korelace mezi Dánským indexem „zdraví“ a plemennými hodnotami pro obsah močovinného dusíku dánský index „zdraví“ Plemenná hodnota korelace přibližné genetické korelace močovinný dusík zjištěný IRS metodou 0,19 0,24 Zdroj: Rissa G. Mitchel (2004)
