CMV-IgA-ELA Test PKS medac
Magyar
0123
112-PKS-VPU/010708
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg
FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Tel./Phone: Fax:
++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359
RENDELÉSI CÍM Tel./Phone: Fax:
++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113
112-PKS-VPU/010708
CMV-IgA-ELA Test PKS medac ______________________________________________________________________ Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, cytomegalovirus (CMV) elleni IgA antitestek kimutatására
Katalógusszám: 112-PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS A Cytomegalovirus (CMV) a humán patogén Herpesviridae családba tartozik, melyet dupla szálú DNS genom jellemez. Ezekre a vírusokra jellemzı, hogy latensen perzisztál a szervezetben az elsıdleges fertızés után. Ezért a vírus reaktivációja bizonyos körülmények között elıfordulhat. A CMV fertızés immunokompetens egyénekben rendszerint tünetmentes. Azokban az egyénekben, akik immunszuppresszáltak (pl. transzplantáltak, HIV fertızöttek, tumoros betegek, újszülöttek) komoly tünetek variációja észlelhetı. A CMV egyike a leggyakoribb patogéneknek prenatális fertızésekben, mely komoly rendellenességeket okozhat, szintén beleértve a késıi károsodásokat olyan gyerekekben, melyek tünetek nélkül születtek. Specifikus CMV-IgA antitesteket mutattak ki transzplantált betegek szérumaiból és korreláltatták specifikus CMV IgM antitestekkel. Megállapították, hogy a CMV IgA az akut fertızés markere. A CMV specifikus IgA kimutatása kombinálva az antigen, illetve IgM kimutatással megnövekedett specificitáshoz vezet a transzplantált betegek CMV diagnózisában.
112-PKS-VPU/010708
1
A TESZT ELVE
A lemezt anti-humán IgA-val vonták be.
A mintában levı IgA szelektíven kötıdik a lemez falához.
A CMV IgA specifikus antitestek kötıdnek a peroxidázzal jelzett CMV antigénhez. (AG = antigen, P = peroxidáz).
Inkubáció a TMB-szubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le.
A teszt elınyei
Nincs nem-specifikus reakció okozott hamis pozitív reakció.
A magas IgG titer nem blokkolja az IgA antitesteket.
A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását.
A törhetı mikrotiter felhasználását.
Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken.
lemez
és
nincs
lehetıvé
112-PKS-VPU/010708
a
teszi
reuma
a
faktor
teszt
által
gazdaságos
2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 112-PKS 1.
MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, U-alakú, kecske anti-humán IgA-val bevont, BSA és pH indikátor, felhasználásra kész.
2.
KONTROLL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, kék színő, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
3.
KONTROLL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, kék színő, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
4.
WB Mosó puffer: 1 flakon, ProClinTM 300 tartalmú.
5.
100
ml,
PBS/Tween
(10x),
VIR-DIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
pH
pH
7,2 –
7,4,
7,2 –
7,4,
6.
ANTIGEN CMV-IgA-ELA (Enzim jelzett antigén): 4 fiola, mindegyik 5,0 ml, liofilizált, FCS-t tartalmaz, sárga színő, HRP-vel konjugált.
7.
TMB TMB-szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész.
8.
STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H2SO4), felhasználásra kész.
112-PKS-VPU/010708
3
1.
TÁROLÁS ÉS STABILITÁS
Anyag/Reagens Teszt kit Mikrotiterlemez
Állapot bontatlan bontott
Kontrollok Mosó puffer Minta hígító CMV-IgA-ELA TMB-szubsztrát Leállító oldat
bontott hígított bontott feloldott bontott bontott
Tárolás 2...8 °C 2...8 °C zacskóban szárítószerrel 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C
Stabilitás lejárati idı végéig 6 hét 6 hét 6 hét 6 hét 5 nap 6 hét lejárati idı végéig
Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2.
SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK
2.1. Víz injekcióhoz (H2O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosópuffer hígításához. 2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. Inkubátor, 37 ºC. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 - 650 nm szőrıkkel. 3.
A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE
A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni a kondenzáció elkerülése céljából. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát. 3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldes-barna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja.
112-PKS-VPU/010708
4
3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 °C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel. 3.3. CMV-IgA-ELA A liofilizált CMV-IgA-ELA konjugátumot oldjuk fel 5 ml minta hígítóban. Óvatosan keverjük és ügyeljünk arra, hogy a dugóba ragadt részecskék is feloldódjanak. A CMV-IgA-ELA feloldás után sárga színő és felhasználásra kész. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, CMV-IgA-ELA) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a minta hígító, a mosó puffer, a TMB-szubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények pontos betartása esetén nyerhetık. 4.
csak
a
használati
utasítás
MINTÁK
4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. 4.2. A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroroganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:100 arányban hígítsuk a mintahígítóval. meghatározáshoz további hígításokat készíthetünk.
Titer
5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a smítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges. 5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl hígítatlan mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba.
112-PKS-VPU/010708
5
A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kékre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában, illetve 60 percig 2 - 8 °C-on tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 vagy fóliával lezárva.
o
C-on nedves kamrában,
5.4. Oldjuk fel a CMV-IgA-ELA-t (ld. 3.3.). 5.5. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne hagyjuk a lyukakat kiszáradni! Azonnal dolgozzuk fel! 5.6. Adjunk a CMV-IgA-ELA-t (sárga színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl ELA-t pipettázzunk manuális felhasználás esetén. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 minden lyukba, a készülék inkubációs nagyobb párolgás miatt.
µl ELA-t pipettázzunk kamrájában elıforduló
A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük. 5.7. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on nedves
5.8. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.5.). 5.9. Adjunk 50 µl TMB-szubsztrát oldatot minden lyukba (A1-be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 oC-on (± 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 5.10.Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1-be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni.
112-PKS-VPU/010708
6
5.B.
AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN
Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta
Háttér (A1) -
Negatív kontroll 50 µl -
Pozitív kontroll 50 µl -
Minta 50 µl
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal CMV-IgA-ELA
-
50/60 µl*)
50/60 µl*)
50/60 µl*)
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal TMB-subsztrát
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
Inkubáljuk 30 percig 37 °C- sötétben Leállító oldat
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Fotometrikus leolvasás 450 nm-en (ref. 620 - 650 nm) *)Manuális/automatikus módszer (ld. 5.6.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) ∗
Olvassuk le az OD értékeket 450 nm-en (referencia hullámhossz 620 - 650 nm).
∗
Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl.
∗
Validitási kritériumok - A negatív kontroll átlagos OD értéke < 0,150 legyen. - A pozitív kontroll átlagos OD értéke > 0,600 legyen. Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak.
∗
Cut-off = negatív kontroll átlag OD értéke + 0,140
∗
Szürke zóna = Cut-off ± 10 %
112-PKS-VPU/010708
7
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ∗
A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékő minták NEGATÍV-nak tekintendık.
∗
A szürke zónába esı OD értékő minták KÉTES-nek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében.
∗
A szürke zóna felsı határánál nagyobb OD értékő minták POZITÍVnak tekintendık.
∗
Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal és diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni.
∗
59 potenciálisan keresztreagáló mintát vizsgáltak. Ezek a minták nem voltak reaktívak az IgA tesztben.
∗
A lipidek nagyon nagy koncentrációja bizonyos esetekben befolyásolhatja az eredményt. A Hemoglobin, vagy Bilirubin nagy koncentrációja nem befolyásolja az eredményeket.
7.
TELJESÍTİKÉPESSÉG
további
Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. FAJLAGOSSÁG 300, véradóktól származó szérum mintát vizsgáltak a CMV-IgA-ELA Test PKS medac teszttel. 296 mintát negatínak találtak. A többi 4 minta – három közülük kétes, egy gyengén IgA reaktív – erısen pozitív volt IgG-re és egyik közülük IgM-re is. Ugyanezt a 300 mintát megvizsgálták egy versenytárs IgA ELISA-val. A másik tesztben 284 negatív, 2 kétes és 14 pozitív volt. 7.B. ÉRZÉKENYSÉG 105 szérumot találtak pozitívnak a fent említett referencia teszttel. 101 szérum poziív, 2 kétes, 2 negatív volt a CMV-IgA-ELA Test PKS medac teszttel. A relatív érzékenység 96,2 %-nak adódott.
112-PKS-VPU/010708
8
7.C. PONTOSSÁG
Minta
NC BC PC N° 1 N° 2 N° 3
Teszten belüli szórás (n = 24) átlag SD VC (%) OD 0,047 0,007 15 0,341 0,014 4 1,601 0,047 3 0,047 0,006 13 0,223 0,010 4 2,473 0,052 2
Minta
NC BC PC N° 1 N° 2 N° 3
Tesztek közötti szórás (n = 11) átlag SD VC (%) OD 0,044 0,005 11 0,276 0,034 12 1,391 0,119 8 0,052 0,008 15 0,201 0,020 10 2,184 0,187 9
NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK ∗
A kereszt szennyezés elkerülése fiolákat és kupakjaikat.
∗
A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében.
∗
Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében.
∗
Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is).
érdekében
ne
cseréljük
fel
a
EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK ∗
A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani.
∗
Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAg-ra, HIV-1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk.
112-PKS-VPU/010708
9
MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében.
A kibocsátás dátuma: 01.07.2008
112-PKS-VPU/010708
10
IRODALOM Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDS-Forschung (AIFO), Heft 11, 634-638 (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A., Doerr, H. W.: Immunoglobulin A and M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virol. Methods 43, 65-76 (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, compartment. Thesis European Medical Press (1985).
its
vascular
Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV) diagnostic potential of IgA class and IgG subclass-specific antibodies. Infection 15, 93-98 (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G and M to cytomegalovirus during recurrent infection in recipients of allogenic bone marrow transplantation. J. Infect. Dis. 163, 628-630 (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg, H., Saah, A. J.: Cytomegalo-virus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in homosexual men. J. Med. Virol. 35, 174-179 (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et al.: Virus-specific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G and A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun. 42, 237-244 (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M., Negro Ponzi, A.: CMV-specific polymeric and monomeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., Vol. 33, Nr. 4, 173-179 (1991). Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H. K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A, and G in congenital primary, and secondary cytomegalovirus infection studied by antibody-captured enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26, 654-661 (1988). Porath, A., Hanuka, N., Keynan, A., Sarov, I.: Virus-specific IgG, IgM, and IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol. 22, 223-230 (1987).
112-PKS-VPU/010708
11
Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytomegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653-659 (1997). Sarov, I., Siqueira-Linhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J. P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cyto-megalovirus infection. Intervirology 15, 228-234 (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virol. Methods 6, 161-169 (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytomegalovirus infections. Arch. Virol. 82, 173-180 (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U., Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or long-term human cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Torfason, E. G., Källänder, C. and Halonen, P.: Solid-phase radioimmunoassay of serum IgG, IgM and IgA antibody to cytomegalovirus. J. Med. Virol. 7, 85-96 (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., Doerr, H. W. : Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects. Clin. Investig. 70, 503-507 (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol. 40, 28-34 (1993).
112-PKS-VPU/010708
12
