010708

EBV VCA-IgG-ELISA PKS medac

Magyar

128-PKS-VPU/010708

GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg

FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:

++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359

RENDELÉSI CÍM Tel.: Fax:

++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113

128-PKS-VPU/010708

EBV VCA-IgG-ELISA PKS medac

Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, Epstein-Barr vírus-specifikus kapszid antigén (VCA) elleni IgG antitestek kvantitatív kimutatására szérumból

Katalógusszám: 128-PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS Az Epstein-Barr vírus (EBV) a Herpesviridae családba tartozik. Duplaszálú DNS-t, kapszidot, burkot és bevonatot tartalmaz. Az EBV-re jellemzı, hogy latensen élethosszig perzisztál a szervezetben a primer fertızés után. Az összes felnıtt 90 - 95 %-a EBV-vel fertızött világszerte. A lefolyás, EBV primer fertızés immunkompetens egyénekben korai gyermekkorban fordul elı, általában tünetmentes. Fiatal felnıttekben az EBV fertızés mirigyláz (Pfeiffer kór) formában jelentkezik. Kissé immunszuppresszált egyénekben klinikailag csendes reaktiváció elıfordulhat. Masszívan immunszuppresszált egyénekben EBV-asszociált poliklonális B-sejt limfoma fordul elı. A Hodgkin-limfomák 60 %-ában EBV DNS van jelen. Az endémiásan jelentıs EBV-asszociált tumor megbetegedések a Burkitt limfóma és a nasopharyngealis karcinoma. Az antitest kimutatáshoz szükséges releváns antigén komplexek az EBV specifikus nukleáris antigén (EBNA), a vírus kapszid antigén (VCA) és a korai antigén (EA). Immunkompetens egyénekben a antitestek kimutatása a primer és korábbi fertızések, illetve a szeronegativitás megkülönböztetése céljából az EBV diagnózis fókusza. Az EBV szerológia fontos lehet a lymphadenopathya és tisztázatlan neurológiás betegségek addicionális diagnosztikájában. A releváns EBV szerológia összefüggésében az EBNA-1 IgG meghatározás az elsı lépés. Pozitív eredmény korábbi fertızésre utal. Negatív EBNA-1 IgG esetén a VCA IgG és IgM meghatározás alapvetıen fontos a fertızés státuszának megkülönböztetésében. Az EBV VCA-IgG-ELISA PKS medac a vírus kapszid gp 125 fehérje elleni specifikus IgG antitesteket mutatja ki. A teszt gyorsan és könnyen kivitelezhetı. A kalibrációs görbe használatával lehetıvé válik az antitest koncentráció kimutatása, lehetıvé téve a megbízható nyomon követést.

128-PKS-VPU/010708

1

A TESZT ELVE

A lemezt EBV VCA gp 125 antigénnel vonták be.

vírus

A mintában levı VCA gp 125specifikus antitestek szelektíven kötıdnek az antigénhez.

Peroxidázzal konjugált anti-humán a VCA IgG antitestek kötıdnek gp 125-specifikus IgG antitestekhez (P = peroxidáz).

Inkubáció a TMB-szubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le.

A teszt elınyei
A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását.
A törhetı csíkok lehetıvé teszik a teszt gazdaságos felhasználását.
Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken.
Egypontos mennyiségi meghatározás, kalibrációs görbe nem szükséges. 128-PKS-VPU/010708

2

A KIT TARTALMA Katalógusszám: 128-PKS 1.

MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk, zöld színő (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, Ualakú, EBV VCA gp 125 antigénnel bevont, BSA és pH indikátor, felhasználásra kész.

2.

CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.

3.

CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCS-t, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.

4.

CAL Kalibrátor: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCSt, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.

5.

WB Mosó puffer: 1 flakon, ProClinTM 300 tartalmú.

6.

100

ml,

PBS/Tween

(10x),

VIR-DIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.

pH

pH

7,2

7,2

–

7,4,

–

7,4,

7.

CON Konjugátum: 3 fiola, mindegyik 4,5 ml, HRP-konjugált kecske antihumán IgG, felhasználásra kész, zöld színő, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.

8.

TMB TMB-szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész.

9.

STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H2SO4), felhasználásra kész.

128-PKS-VPU/010708

3

1.

TÁROLÁS ÉS STABILITÁS

Anyag/Reagens Teszt kit Mikrotiterlemez

Állapot bontatlan bontott bontott

Tárolás 2...8 °C 2...8 °C zacskóban szárítószerrel 2...8 °C

Kontrollok/ kalibrátor Mosó puffer Mintahígító Konjugátum TMB-szubsztrát Leállító oldat

6 hét

hígított bontott bontott bontott bontott

2...8 2...8 2...8 2...8 2...8

6 hét 6 hét 6 hét 6 hét lejárati idı végéig

°C °C °C °C °C

Stabilitás lejárati idı végéig 6 hét

Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2.

SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK

2.1. Víz injekcióhoz (H2O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosó puffer hígításához. 2.4. Mikrotiterlemezek mosására pipetta, vagy ELISA mosó).

alkalmas

készülék

(pl.

többcsatornás

2.5. 37 °C-os inkubátor. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 - 650 nm szőrıkkel. 3.

A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE

A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát. 3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a adatok az 1. pont alatt találhatóak.

128-PKS-VPU/010708

vissza a stabilitási

4

Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színőek. A elıforduló zöldes-barna elszínezıdést a lyukakban idınként gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 °C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, konjugátum, kalibrátor) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a mintahígító, a mosó puffer, a TMB-szubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetık. 4.

MINTÁK

4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. 4.2. A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:200 arányban hígítjuk a mintahígítóval. Javasoljuk, hogy készítsen egy kezdeti 1:50 hígítást (pl. 10 µl szérum + 490 µl mintahígító). A további 1:4 hígításhoz a szükséges mennyiséget készítse el. A mérési tartományon kívül esı mintákat tovább lehet hígítani. 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges.

128-PKS-VPU/010708

5

5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl negatív és pozitív kontrollt, hígított mintát egy-egy lyukba és 50 µl kalibrátort duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kék/zöld-re változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter nedves kamrában tarthatjuk.

lemezt

szobahımérsékleten

5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva.

30

percig

o

C-on (± 1 °C) nedves

5.4. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 5.5. Adjuk a konjugátumot (zöld színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl konjugátumot dolgozzuk fel.

pipettázzunk

a

lyukakba,

ha

manuálisan

Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl konjugátumot pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük. 5.6. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 nedves kamrában, vagy fóliával lezárva.

o

C-on (± 1

o

C)

5.7. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.4.). 5.8. Adjunk 50 µl TMB-szubsztrát oldatot minden lyukba (A1-be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 oC-on (± 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik.

128-PKS-VPU/010708

6

5.9. Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN

Neg. kontroll Poz. controll Kalibrátor Minta

Háttér (A1) -

Negatív kontroll 50 µl -

Pozitív kontroll 50 µl -

Kalibrátor

Minta

-

-

50 µl -

50 µl

Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal Konjugátum

-

50/60 µl*)

50/60 µl*) 50/60 µl*)

50/60 µl*)

Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal TMB-szubsztr.

50 µl

50 µl

50 µl

50 µl

50 µl

Inkubáljuk 30 percig 37 °C-on sötétben Leállító oldat

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

100 µl

Fotometrikus leolvasás 450 nm-en (ref. 620 - 650 nm) *) Manuális/automatikus módszer (ld. 5.5.)

6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) ∗

Olvassuk le az 620 - 650 nm).

∗

Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl.

∗

Gyártási tétel-specifikus adatok A kitben található gyártási tétel-specifikus adatlap az alábbi információkat tartalmazza: - Gyártási tétel-specifikus kalibrációs görbe - A és b görbe paraméterek - A kalibrátor névleges OD értéke - A kalibrátor alsó OD határértéke - A pozitív kontroll névleges koncentráció tartománya(AU/ml)

OD

értékeket

450

nm-en

128-PKS-VPU/010708

(referencia

hullámhossz

7

∗

Validitási kritériumok - A negatív kontroll OD értéke < 0,150. - A pozitív kontroll egységértéke a gyártási tétel-specifikus adatlapon megadott tartományon belül legyen. - A kalibrátor átlagos OD értéke a gyártási tétel-specifikus adatlapon megadott also határérték felett legyen. Ismételjük meg az eljárást, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak!

∗

Az eredmények korrekciója A pozitív kontroll és a szerint korrigáljuk:

minták

mért

OD

értékeit

az

alábbiak

kalibrátor névleges OD értéke ODkorrigált = ——————————————————————————————————————— x ODmért kalibrátor mért OD értéke ∗

Az eredmények kvantifikációja A korrigált OD értékhez tartozó koncentráció AU/ml-ben leolvasható a gyártási tétel-specifikus kalibrációs görbérıl (ld. gyártási tétel-specifikus adatlap). Alternatívaképpen, a koncentráció az alábbi képlettel is számolható: a   Koncentráció [AU/ml] = b/ − 1  OD korrigált  A legtöbb új ELISA leolvasó lehetıvé teszi a képlet programozását, megkönnyítve az automatikus adatfeldolgozást. A mérési tartomány 9-tıl 200 AU/ml-ig terjed. A tartomány alá esı mintákat < 9 AU/ml-ként, a fölé esıket > 200 AU/ml-ként kell értelmezni. Ezeket az értékeket nem szabad extrapolálni.

A cut-off 10 AU/ml. Szürke zóna = cut-off ± 10 % (= 9 - 11 AU/ml) Figyelem! Fontos megjegyzés! A kvantifikáció matematikai algoritmusa miatt negatív, vagy nem definiált AU értékeket kaphatunk az alábbi esetekben:

-

Az a-nál nagyobb korrigált OD értékő erısen pozitív mintákat negatívnak, vagy nem definiált AU értékőnek számoljuk (0-val osztás nem megengedett). Ezeket a mintákat nagyobb hígításokban újra kell vizsgálni, vagy > 200 AU/ml-ként kell értelmezni. 128-PKS-VPU/010708

8

6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE /A MÓDSZER KORLÁTAI ∗

A szürke zóna alsó határánál kisebb egység értékő minták NEGATÍVnak tekintendık.

∗

A szürke zónába esı egység értékő minták KÉTES-nek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében.

∗

A szürke zóna felsı határánál POZITÍV-nak tekintendık.

∗

Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal, továbbá az EBNA-1 IgG, a VCA IgM eredményekkel és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni.

∗

Egyedi esetekben más herpeszvírusok elleni antitestekkel történı keresztreakció nem zárható ki.

∗

A lipidek és a hemoglobin emelkedett koncentrációja a mintában nem befolyásolja a teszt eredményeket.

nagyobb

egység

értékő

minták

6.C. A MEDAC KITEKKEL VÉGZETT EBV-SZEROLÓGIA DIAGNOSZTIKUS ÉRTELMEZÉSE Az eredményeknek a fertızés státuszára vonatkozó alábbi értelmezése csak immunkompetens egyénekben végzett vizsgálatokra érvényes.

EBNA-1 IgG + -

VCA IgG +/±/+/±/-

VCA IgM +

Értelmezés szeronegatív régi fertızés elsıdleges fertızés

Minden más kombináció tisztázatlannak értelmezendı. Tisztázatlan eredmény esetén további differenciál diagnosztikai módszerek szükségesek az értelmezéshez. A tisztázatlan eredmények csökkentése érdekében a medac EBV ELISA panel használatát javasoljuk.

128-PKS-VPU/010708

9

7.

TELJESÍTİKÉPESSÉGI JELLEMZİK

Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során.

7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG 352 szérumot vizsgáltak a diagnosztikus kiértékelés során. Az eredményeket Prof. Dr. Enders és munkatársai, Stuttgart laboratóriumában és az Institute of Virology of the University Homburg/Saar intézményben értékelték ki. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük:

EBV VCA-IgG-ELISA PKS medac

Érzékenység Fajlagosság Egyezés:

negatív kétes pozitív

Elızetes definíció (IFA) negatív kétes pozitív 184 0 5 0 0 1 4 0 158

= 96,3 % = 97,9 % 97,2 %

7.B. PONTOSSÁG Minta PC N° N° N° N° N°

1 2 3 4 5

Teszten belüli szórás átlag AU SD CV (%) n 36,1 1,52 4 23 8,0 0,47 6 23 28,1 1,04 4 22 28,9 2,73 9 22 69,1 3,10 5 22 112,1 8,87 8 22

Minta PC N° 6 N° 7 N° 8 N° 9 N° 10 N° 11

Tesztek közötti szórás átlag AU SD CV (%) n 36,0 1,03 3 13 7,9 0,24 3 13 16,5 0,72 4 13 25,4 4,72 19*) 13 26,7 1,07 4 13 108,1 5,46 5 13 122,8 9,50 8 13

PC = pozitív kontroll; *)akut szérum (VCA IgM pozitív)

128-PKS-VPU/010708

10

ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK ∗

A kereszt szennyezés elkerülése fiolákat és kupakjaikat.

∗

A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében.

∗

Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében.

∗

Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is).

érdekében

ne

cseréljük

fel

a

EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK ∗

A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani.

∗

Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAg-ra, HIV-1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető erısen reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk.

MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében.

A kibocsátás dátuma: 2008.07.01.

128-PKS-VPU/010708

11

IRODALOM Bauer, G.: Epstein-Barr-Virus – Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik. Therapeutische Umschau 51(8), 558-562 (1994). Bauer, G.: The rational basis for efficient Epstein-Barr Virus (EBV) serology. Clin. Lab. 41(9), 623-634 (1995). Hille, A., Klein, K., Baumler, S., Grasser, F.A., Mueller-Lantzsch, N.: Expression of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1, 2A and 2B in the baculovirus expression system: serogical evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 39 (3), 233-241 (1993). Linde, A.: Diagnosis of Epstein-Barr Virus - related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100, 83-88 (1996). Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.-D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 65-70, Urban & Fischer Verlag (2004). Modrow, S., Falke, D. (Hrsg.): Molekulare Virologie. 454-460, Spektrum Akademischer Verlag (1997). Prang, N.S., Schwarzmann, F.: Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik Epstein-Barr-Virus assoziierter Erkrankungen. Immun. Infekt. 4, 144-151 (1997).

128-PKS-VPU/010708

12