VZV-IgM-ELA Test PKS medac
Magyar
)
101-PKS-VPU/010708
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg
FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Telefon: Fax:
++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359
RENDELÉSI CÍM Telefon: Fax:
++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113
101-PKS-VPU/010708
VZV-IgM-ELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel Varizella-Zoster virus (VZV) elleni IgM antitestek kimutatására szérumból Katalógusszám: 101-PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS A Varicella-Zoster virus (VZV) a Herpesviridae családba tartozik. Duplaszálú DNS genomból, nukleokapszidból, burokból és külső burkolatból áll. Az elsődleges fertőzés leginkább gyerekkorban fordul elő (varicella). Immunkompetens egyénekben a tünetek rendszerint enyhék. Immunszuppresszált betegekben a fertőzés komoly komplikációkat okozhat (központi idegrendszeri befolyás, tüdőgyulladás, másodlagos bakteriális fertőzések). A fertőzés előfordulása felnőttekben kb. 95 %. A VZV-re jellemző, hogy egész életen keresztül perzisztál a hátgerinc idegdúcaiban megalapozva ezzel a neuronok latens fertőzését. A vírus endogén reaktivációja okozhatja a herpes zoster másodlagos betegséget. A Varicella oltással megelőzhető. A kereskedelmi oltóanyagok nagyon hatékonyak a betegség megelőzésében. A Varicella-t és a herpes zostert rendszerint a tipikus klinikai tünetek alapján diagnosztizálják. A laboratóriumi diagnosztika alapvetővé válik atípusos betegségnél, illetve terhesség alatt. A VZV elleni antitestek kimutatása nagyrészt az immunitás, vagy az oltás sikerességének megerősítésére szolgál. Hasznos továbbá VZV betegség gyanúja esetén. A VZV-specifikus intrathecalis antitest szintézis kimutatása a szérum-CSF párban része a központi idegrendszer akut, vagy krónikus fertőzésének differenciál diagnosztikájának. Pozitív VZV IgM eredmény megerősíti az elsődleges fertőzést, vagy a latensen perzisztáló VZV endogén reaktivációja okozza. A VZV-IgM eredményt mindig a VZV IgG, IgA eredményekkel és a klinikai tünetekkel összhangban kell értékelni. A VZV-IgM-ELA Test PKS medac IgM VZV antitesteket mutat ki szérumból. A teszt gyorsan és könnyen kivitelezhető. A µ-capture és az ELA elv specifikus és érzékeny diagnosztikai értékelést tesz lehetővé.
101-PKS-VPU/010708
1
TEST PRINCIPLE
A lemezt anti-humán IgM immunoglobulinnal vonták be.
A mintákban levő IgM szelektíven kötődik a lyukakhoz.
A VZV-specifikus IgM antitestek kötődnek a peroxidázzal jelzett VZV-IgM-ELA-hoz (AG = antigén, P = peroxidáz).
Inkubáció a TMB-szubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le.
Advantages of the test ) A rheumatoid faktorok által okozott nem-specifikus és álpozitív reakciók nem jelentkeznek. ) A magas IgG titer nem gátolja az IgM antitesteket. ) A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetővé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. ) A törhető csíkok lehetővé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. ) Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerű ELISA készülékeken. 101-PKS-VPU/010708
2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 101-PKS 1.
MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk, (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhető, U-alakú, kecske anti-humán IgM immunglobulinnal bevont, BSA és pH indikátor, felhasználásra kész.
2.
CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
3.
CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCS-t, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
4.
WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10 x), pH 7,2 – 7,4, ProClinTM 300 tartalmú.
5.
VIR-DIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
pH
7,2
–
7,4,
6.
ANTIGEN-DIL Antigén hígító: 1 flakon, 14 ml, Tris/NaCl/Tween, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
7.
ANTIGEN VZV-IgM-ELA (Enzimjelzett antigén): liofilizált, FCS tartalmú.
4
flakon,
mindegyik
3,0
ml,
8.
TMB TMB-szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész.
9.
STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H2SO4), felhasználásra kész.
101-PKS-VPU/010708
3
1.
TÁROLÁS ÉS STABILITÁS
ANYAG/REAGENS Teszt kit
ÁLLAPOT bontatlan
Mikrotiterlemez
bontott
Kontrollok Mosó puffer Mintahígító Antigénhígító VZV-IgM-ELA TMB-szubsztrát Leállító oldat
TÁROLÁS 2...8 °C
2...8 °C zacskóban szárítószerrel bontott 2...8 °C hígított 2...8 °C bontott 2...8 °C bontott 2...8 °C felhasználásr 2...8 °C a kész < -18 °C *
bontott bontott
STABILITÁS lejárati idő végéig 6 hét 6 6 6 6 7 6
hét hét hét hét nap hét
2...8 °C 2...8 °C
6 hét lejárati idő végéig * Aliquot részekben osszuk le és felengedés után ne fagyasszuk újra. Ne használjuk a reagenseket a lejárati időn túl. 2.
SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK
2.1. Víz injekcióhoz (H2O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, hígításához.
vagy
műanyag
edények
a
mosó
puffer
és
a
minták
2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. 37 °C-os inkubátor. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 - 650 nm szűrőkkel. 3.
A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE
A mérés megkezdése előtt az összes komponenst szobahőmérsékletűre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát.
101-PKS-VPU/010708
4
3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiterlemez lyukai halvány zöld színűek. A lyukakban időnként előforduló zöldes-barna elszíneződést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítőképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minőségű vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10 x) előforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 °C) és/vagy szobahőmérsékleten keveréssel. 3.3. VZV-IgM-ELA Oldjuk fel a liofilizált antigént 3,0 ml antigén hígítóval 60 perccel a felhasználás előtt. Óvatosan keverjük meg, ügyelve arra, hogy a kupakba tapadt részecskék is feloldódjanak. Feloldás után a VZV-IgM-ELA piros lesz és felhasználásra kész. A felhasználásra kész VZV-IgM-ELA 2 < -18 °C-on 6 hétig tárolható (ld. 1.).
8
°C-on
7
napig,
vagy
Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, VZV-IgM-ELA, antigén hígító) a különböző gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a mintahígító, a mosó puffer, a TMB-szubsztrát és a leállító oldat általában cserélhető az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények pontos betartása esetén nyerhetők.
101-PKS-VPU/010708
csak
a
használati
utasítás
5
4.
MINTÁK
4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. 4.2. A szérumok előkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:100 arányban hígítjuk a mintahígítóval. meghatározáshoz további hígításokat készíthetünk.
Titer
5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, előmosás nem szükséges. 5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 μl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kék/zöld-re változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahőmérsékleten 30 percig tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on (± 1
o
C) nedves
5.4. Készítsük elő a VZV-IgM-ELA-t (ld. 3.3.). 5.5. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 μl mosó pufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szűrőpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel!
101-PKS-VPU/010708
6
5.6. Adjunk a VZV-IgM-ELA-t(piros színű) minden lyukba (kivétel A1). 50 μl VZV-IgM-ELA-t dolgozzuk fel.
pipettázzunk
a
lyukakba,
ha
manuálisan
Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 μl VZV-IgM-ELA-t pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában előforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerősítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban működő automatával való kompatibilitást ellenőrizzük. 5.7. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 nedves kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on (± 1
o
C)
5.8. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.5.). 5.9. Adjunk 50 μl TMB-szubsztrát oldatot minden lyukba (A1-be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 oC-on (± 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 5.10.Állítsuk le a reakciót 100 μl leállító oldattal minden lyukba (A1-be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás előtt tisztítsuk meg a mikrotiterlemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegőbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni.
101-PKS-VPU/010708
7
5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN
Neg. kontroll Poz. kontroll Minta
Háttér (A1) -
Negatív kontroll 50 μl -
Pozitív kontroll 50 μl -
Minta 50 μl
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal VZV-IgM-ELA
-
50/60 μl*)
50/60 μl*)
50/60 μl*)
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal TMB-szubsztrát
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
Inkubáljuk 30 percig 37 °C-on sötétben Leállító oldat 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Fotometrikus leolvasás 450 nm-en (ref. 620 - 650 nm) *) Manuális/automatikus módszer (ld. 5.6.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) ∗
Olvassuk le az OD értékeket 450 nm-en (referencia hullámhossz 620 - 650 nm).
∗
Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékből.
∗
A negatív kontrollok átlag OD értéke < 0,150.
∗
A pozitív kontrollok átlag OD értéke > 0,600.
∗
A cut-off = negatív kontrollok átlag OD értéke + 0,140 Szürke zóna = cut-off ± 10 %. Ismételjük meg az eljárást, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak.
101-PKS-VPU/010708
8
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE /A MÓDSZER KORLÁTAI ∗
A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékű minták NEGATÍV-nak tekintendők.
∗
A szürke zónába eső OD értékű minták KÉTES-nek tekintendők. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal később friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében.
∗
A szürke zóna felső határánál nagyobb OD értékű minták POZITÍVnak tekintendők.
∗
Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal, a VZV IgG és IgA eredményekkel és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. Terhesség alatti gyanított elsődleges VZV fertőzés és negatív VZV IgM eredmény esetén további diagnosztika, pl. PCR szükséges.
∗
Egyedi esetekben más herpeszvírusok elleni antitestekkel, ANA-val és heterofil antitestekkel történő keresztreakció nem zárható ki.
∗
A nagyon magas lipid koncentráció zavaró hatása nem zárható ki.
∗
A hemoglobin eredményeket.
magas
koncentrációja
101-PKS-VPU/010708
nem
zavarja
a
mérési
9
7.
TELJESÍTŐKÉPESSÉGI JELLEMZŐK
Az alábbi teljesítőképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS SPECIFICITÁS 150 szérumot vizsgáltak a diagnosztikus kiértékelés során. Az eredmények jól korreláltak a Prof. Dr. Enders és kollégái, Stuttgart, által meghatározott klinikai jellemzőkkel. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük:
VZV-IgM-ELA Test PKS medac
negatív kétes pozitív
Előzetes definíció (Prof. Enders) negatív cut-off pozitív 99 0 4 0 0 1 1* 0 45
*megerősített akut VZV fertőzésű beteg mintája
Érzékenység Specificitás Egyezés:
= =
90,0 % 99,0 % 96,0 %
7.B. PONTOSSÁG Minta NC BC PC N° N° N° N° N°
1 2 3 4 5
Teszten belüli szórás átlag SD CV (%) OD 0,048 0,003 6,3 0,556 0,021 3,8 0,995 0,029 2,9 0,081 0,004 4,9 0,309 0,018 5,8 0,406 0,019 4,7 0,767 0,039 5,1 1,426 0,087 6,1
Minta n 22 22 22 22 22 22 22 22
NC BC PC N° 6 N° 7 N° 8 N° 9 N° 10
Tesztek közötti szórás átlag SD CV OD (%) 0,094 0,017 18,1 0,621 0,045 7,2 1,083 0,051 4,7 0,104 0,014 13,5 0,370 0,030 8,1 0,567 0,033 5,8 0,889 0,058 6,5 1,542 0,062 4,0
n 11 11 11 11 11 11 11 11
NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll
101-PKS-VPU/010708
10
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK ∗
A kereszt szennyezés elkerülése fiolákat és kupakjaikat.
∗
A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében.
∗
Használat után a reagenseket az előírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében.
∗
Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekből, illetve gyártásból származó reagensekkel történő felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is).
érdekében
ne
cseréljük
fel
a
EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK ∗
A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani.
∗
Az emberi eredetű reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAg-ra, HIV-1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erősen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredetű reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertőzőként kezeljük és az összes szükséges elővigyázatossággal használjuk.
MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendők. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és előírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelő cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: 2008.07.01.
101-PKS-VPU/010708
11
IRODALOM de Ory, F. et al.: European seroepidemiology network 2; Standardisation of assays for seroepidemiology of varicella zoster virus. J. Clin. Virol. 36, 111-118 (2006) Gross, G., Doerr, H. W. (Hrsg.): Herpes Zoster. Monogr. Virol. Vol. 26, 13-19, Karger Basel (2006) Heininger, U., Seward, J.F.: Varicella. Lancet 368, 1365-1376 (2006) Mertens, Th., Haller, O., Klenk, H.-D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 289-298, Urban & Fischer Verlag (2004) Sauerbrei, A., Wutzler, P.: Herpes simplex and varicella zoster virus infections during pregnancy: Current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 2: Varicella-zoster virus infections. J. Clin. Microbiol. 44 (9), 3094-3097 (2006) Wutzler, P., Färber, J., Wagenpfeil, S. Bisanz, H., Tischer, A.: Seroprevalence of varicella-zoster virus in the German population. Vaccine 21, 121-124 (2002)
101-PKS-VPU/010708
12
