2. gyakorlat Témák: 1. Vírustitrálás (hemagglutinációs próba) az előző gyakorlaton fertőzött tojás allantois folyadékából 2. Citopatogén hatások (Cytopathic effects [CPE]) 3. Vírusok azonosítása
1. Vírus titrálás Cél: vírusok mennyiségi meghatározása a vírusszuszpenzióban A vírustitrálás célja:
-Szerológiai diagnosztikában: a vérsavó ellenanyag-tartalmának meghatározásához standard mennyiségű vírusra van szükség. -Vakcinák vírustartalmának megállapításához. -Kísérleti állatfertőzésnél. (Vakcina hatékonysági vizsgálat során.) →Mennyiségi
meghatározást
előzetesen
izolált
és
szövettenyészeten/tojásban
elszaporított vírusszuszpenzióból szokás végezni.
Módszerek:
-Elektronmikroszkópos kép alapján (fizikai módszer) a térfogategységre jutó virionok megszámlálása. Hátrányai: Nagy számú partikula – a számolás nehézkes, illetve az inkomplett virionok nem különíthetők el. Költséges eljárás, ezért csak elvi lehetőségként áll fenn. - A vírus infektív titerének meghatározása szövettenyészeten – biológiai módszer (a 4. és 5. gyakorlatok anyaga lesz): a vírusszuszpenzióból 10-es alapú hígítási sort készítünk, a hígításokat a szövettenyészetre oltjuk, majd az egyes hígításokban megjelenő citopatogén hatások, specifikus esetben lokális sejtkárosító hatások (plakkok) alapján kiszámoljuk a vírus infektív titerét. Nem citopatogén vírusok esetében a vizsgálatokat antigén-kimutató eljárással kell kiegészíteni, pl. immunperoxidáz-, vagy immunfluoreszcens tesztek.
- Hemagglutináló vírusok esetében hemagglutinációs teszttel a vírusszuszpenzió hemagglutinációs titeréből következtethetünk a szuszpenzióban levő vírusok mennyiségére.
Hemagglutinációs teszt: Bizonyos vírusok (pl. Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Coronaviridae, Parvoviridae) Parvoviridae olyan felületi
fehérjéket
vörösvérsejtjeinek
(hemagglutinineket hemagglutinineket)) felületi
receptoraihoz
tartalmaznak, kapcsolódni.
amelyek Az
képesek
egyes
összekapcsolódó
állatfajok vörösvérsejt
konglomerátumoknak megváltozik az ülepedési sebességük és ezért a reakciócső reakciócső alján zegzugos szélű, szél szétterülő üledéket alkotnak. Ha az agglutináció nem alakul ki, ki a vörösvérsejtek a cső cs aljára szabályos korong alakban ülepednek le.. Nagy víruskoncentráció esetén egyszerű egyszerű és gyors eljárás, kisebb mennyiségű vírus esetén a teszt elvégzése nehézkesebb nehézkesebb. Vírusszuszpenzió szpenzió hemagglutinációs titere: az a legnagyobb hígítási fok, ahol még létrejön az agglutináció. Ez a hígítás 1 HA (hemagglutinációs egységnyi) vírusszuszpenziót tartalmaz. Meghatározása: −
A vírusszuszpenzióból kettesalapú hígítási sort készítünk az alábbi alábbi módon:
−
Megfelelő fajból származó 0.5 0.5-1%-os os mosott vörösvérsejt szuszpenziót adunk a hígításokhoz.
−
A keveréket ezután a reakció számára optimális hőfokon h fokon és ideig inkubáljuk, majd pedig meghatározzuk a vírusszuszpenzió hemagglutinációs titerét:
→ 1:16 HA
Titer (hígítás):
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
Hemagglutináció gátlási próbában 4-8 4 HA egységű vírusszuszpenziót kell használni.
2. Citopatogén hatások (CPE) A citopatogén hatások a sejtek vírusfertőzés hatására kialakuló morfológiai elváltozásai, melyek többnyire szövettenyészeten figyelhetők meg, általában degeneratív folyamatok következményei. Többségük nem fixált, festetlen szövettenyészetben is megfigyelhető, azonban a sejttenyészetek fixálásával és festésével (haematoxylin-eosin, Giemsa) részletesebb vizsgálatra van lehetőség. A citopatogén hatások okai: • a vírusok közvetlen sejtkárosító hatása •
toxikus hatás kifejtése az adszorpció során (Adenovírusok)
•
a vírusfehérjék gátolják a sejt saját transzlációját (herpes-, pox-, togav.)
•
vírusok korai fehérjéi gátolják a sejt eredetű DNS és RNS szintézist
•
vírusfehérjék kiszorítják a sejtalkotókat a sejtből → zárványképződés
•
burkos vírusok a sejt burkába ágyazott fehérjéikkel megváltoztatják a membrán permeabilitását → ozmotikus viszonyok felborulása
•
Cytosceleton depolimerizációja → sejtlekerekedés (herpesz, CDV)
•
Fúziós proteinek óriássejt képződést váltanak ki (herpesz, paramyxo)
A különböző vírusok hasonló sejtkárosító hatásokat tudnak kialakítani, ezért a citopatogén hatás megjelenése és formája nem kórjelző értékű, azonban segítséget jelent a vírusok azonosítása során. A citopatogén hatások típusai: Zárványképződés: A zárványok a nukleokapszid összeépülésének a helyén jönnek létre, tulajdonképpen a nukleokapszidok tömegéből álló ”vírusraktárak”. Festett készítményekben figyelhetők meg, homogén festődésűek, és a fixálás miatti zsugorodás következtében kialakuló jellegzetes, világos udvar, ún. „halo” veszi körül őket. Magzárványok:
sejtmagban
szaporodó
DNS-
(parvo-,
papilloma-,
polyoma-,
adenoma-,
herpeszvírusok), ritkábban RNS vírusok is okozhatják (pl. orthomyxo-,paramyxo-, arteri-, bornavírusok). A magzárványokat alakjuk és festődésük alapján különíthetők el: a Cowdry-A, Cowdry-B típusú magzárványok kialakulása a makromolekulák szintézisének stádiumától függ. Festődésük alapján lehetnek bazofil (pl. parvo-), amfofil (pl. adeno-), vagy eozinofil (pl. herpeszvírusok) festődésű zárványok. Nagyszámú, vagy nagyméretű zárványok esetén caryomegalia és/vagy periscromasia jelensége figyelhető meg. Citoplazma-zárványokat általában RNS vírusok alakítanak ki, illetve a DNS genommal rendelkező, azonban a citoplazmában szaporodó poxvírusok, és az afrikai sertéspestis vírusa. Festődésük alapján
megkülönböztethetünk eozinofil és bazofil (ritkább, poxvírusok) zárványokat. Kórjelző értékkel bíró citoplazma zárványok a Negri-testek (veszettség), illetve a Guarnieri-féle testek (poxvírusok). A sejtlekerekedés a leggyakoribb sejtkárosító hatás, amely azt jelzi, hogy a sejtek nem érzik jól magukat a környezetükben. A sejtek lekerekedését az ozmotikus viszonyok megváltozása és az elektrolit-veszteség okozza. Festetlen sejtkultúrában a kettős fénytörésű, kerek sejtek jelzik a lekerekedésben megnyilvánuló citopatogén hatást. Ezek a sejtek viszonylag hamar kiszabadulnak a szöveti kötelékből és leválnak a tenyésztőedény aljáról. Festett kultúrákban a lekerekedett sejtek intenzívebben festődnek. A syncytiumképzés kizárólag a burokkal rendelkező vírusokra jellemző (alphaherpesz-, paramxyo-, pneumo-, coronavírusok). A vírus felszínén található fúziós proteinek (F) elsősorban a penetráció folyamatához szükségesek, azonban szaporodásuk során a fertőzött sejtek sejtmembránján is kifejeződnek. A sejtfelszíni fúziós proteinek a szomszédos sejtek közötti membránkapcsolatokat oldják fel, ezáltal összeolvasztják a fertőzött és nem fertőzött sejteket, így hatalmas, közös plazmájú, sokmagvú óriássejtek jönnek létre. Ezek az óriássejtek membránalagutakon keresztül kapcsolatban vannak egymással, így lehetővé téve a vírusok intracelluláris terjedését, mely révén a vírusok rejtve maradnak az immunrendszer elől. Ezeket az óriássejteket nevezzük syncytiumnak, vagy polykaryocytának, melyek natív szövettenyészetben is jól elkülöníthetőek. Sejtmagok rögösödése a kromatinállomány tömörülése és átrendeződése miatt jön létre (pl. parvovírusok). Jellegzetes sejtmag-rögösödést mutat az EHV-1 vírus (herpeszvírus) csikómagzat májsejtjeiben, vagy az afrikai sertéspestis vírusa a nyirokszervekben. Sejtek vakuolizációja: a sejtekben apró vakuolumok keletkeznek a vírusok hatására. Előfordulhatnak a sejtmagban (pl. adenovírus fertőzés következtében), vagy a citoplazmában (pl. flavi-, herpesz-, és retrovírus hatására). Citolízis a sejt membránjának károsodása illetve lizoszomális enzimek hatására történik. A sejt szétesése a virionok kiszabadulása során is bekövetkezhet. Hemadszorpció: a virális hemagglutinin fehérje a fertőzött sejt membránján kifejeződik, ezáltal a sejt képes vörösvérsejteket megkötni (adszorbeálni) a felszínén. A hemadszopció nem kizárólag a hemagglutináló vírusokra jellemző, ez a tulajdonság egyes vírusok azonosításában alkalmazható diagnosztikai módszer: a paramyxovírusok hemadszorpciót és hemagglutinációt is mutatnak, az afrikai sertéspestis vírusa azonban csak hemadszorpciót mutat, hemagglutinációt nem. A sejtkárosító hatások a szövettenyészeten általában diffúzan alakulnak ki, néhány esetben azonban helyi (fokális) megjelenésük figyelhető meg. A CPE-nek ezt a formáját plakk-képződésnek nevezzük, ekkor a sejtkárosító hatás koncentrikusan, sejtről szomszédos sejtre terjed. A plakk közepén a CPE kifejezettebb (cytolízis), míg a plakkok szélén a közelmúltban megfertőződött, épp csak lekerekedett
sejtek láthatók. A syncytium szintén plakknak tekinthető. Plakk képződést mesterségesen is előidézhető: a sejtek felszínét félfolyékony, agarózt, vagy karboximetil-cellulózt tartalmazó tápfolyadékkal fedik le, ami meggátolja a sejtekből kiszabaduló virionok szabad mozgását, így azok csak a szomszédos sejteket képesek fertőzni, ami plakk-képződéshez vezet. A plakkozás a direkt és indirekt vírusdiagnosztikában is alkalmazható: a szövettenyészetből egy plakkot kiemelve genetikailag tiszta
víruspopulációt
(vírustörzs)
nyerhetünk,
szerológiai
vizsgálatokban
(plakk-redukciós
vírusneutralizáció) pedig a plakkok számából tudunk következtetni, a vírus-szuszpenzió vírus-, illetve a vizsgált savó ellenanyag-tartalmára. Nem minden vírus okoz sejtkárosító hatást, illetve vannak olyan vírusok, amelyek ugyan okoznak citopatogén hatásokat, de nem alakítanak ki megbetegedést: a klasszikus sertéspestis vírusa (Classical swine fever-CSF) a sertés patogén kórokozója, melyet szövettenyészetre oltva CPE-t nem figyelhetünk meg, míg a spumavírusok jól kifejezett CPE-t okoznak, annak ellenére, hogy orphan („árva”), betegséget nem okozó vírusok. A vírusok citopatogén hatást kialakító jellege a mutációk során is változhat (pl. szarvasmarhák fertőző hasmenésének vírusa- BVDV- [Bovine viral diarrhoea virus]). A nem citopatogén vírusok szövettenyészeten való szaporodásának igazolása immunperoxidáz-, illetve immunfluoreszcens
próbákkal
lehetséges.
Az
immunperoxidáz(IP/PLA)
próba
során
a
sejttenyészethez specifikusan a vírus ellen termelt, peroxidáz enzimmel jelölt ellenanyagot adunk. A jelölt ellenanyagok a fertőzött sejtek felszínén kifejeződött vírus antigénekhez kapcsolódnak. Az enzim szubsztrátjának sejttenyészethez adása után a színváltozás utal a vírus szövettenyészetben való jelenlétére és szaporodására. Az immunfluoreszcens (IF) eljárás hasonló elv szerint működik, itt a vírus ellen termelt ellenanyagokat fluoreszcens festékekkel jelölik és az elbíráláshoz fluoreszcens mikroszkópra van szükség. A fertőzött sejtek sárgászöld színben tűnnek fel a látótérben. A nem citopatogén vírusok vizsgálatához használt további módszerek (sejttenyészeten való elszaporítással vagy anélkül): −
kísérleti állatok mesterséges fertőzése: manapság állatvédelmi okok miatt ritkán használják
−
elektronmikroszkópos vizsgálatok (EM) – pl. nyulak hemorrhagiás megbetegedése (Rabbit hemorrhagic disease [RHD])
−
immun-elekronmikroszkópos vizsgálatok (IEM) – pl. rota- és parvovírusok kimutatása bélsár mintákból
−
komplement-kötési próba (KK)– pl. ragadós száj- és körömfájás vírusa
−
agargél-precipitáció (AGP, kétdimenziós gél diffúzió)
−
ellenáramú immun elektroforézis: parvo-, rota-, coronavírusok
−
ELISA, RIA
−
hemagglutináció
−
vírus nukleinsav kimutatása polimeráz láncreakcióval (3. gyakorlat anyaga)
3. Vírusok azonosítása −
Vírusok genusokba sorolása: −
fénymikroszkópos
vizsgálatokkal:
CPE,
szövetspecifikusság,
göbök
típusa,
hemadszorpció −
elektronmikroszkópos vizsgálatok: a virion méretének, alakjának, és szimmetriájának megállapítása, felszíni struktúra vizsgálata
−
a vegetatív vírusok fiziko-kémiai vizsgálatai: burkos vagy burok nélküli vírusok elkülönítése: ha a vírus a kloroformkezelés hatására elveszíti fertőzőképességét, akkor burkos vírus áll a fertőzés hátterében DNS/RNS vírusok azonosítása: a tápfolyadékhoz halogénezett deoxi-uridint adunk. Ez a replikácó során a deoxi-timidin helyére épül a DNS-be, ezáltal a DNS-replikációt meggátolja, az RNS vírusok szaporodását nem befolyásolja. szimpla/duplaszálú nukleinsav: akridinorange-kezelés után a szimpla szálú nukleinsavak pirosas-narancs színben fluoreszkálnak, míg a dupla szálú nukleinsavak zöldes-sárgás színben tűnnek fel (a zárványok festődéséből megállapíthatjuk, hogy szimpla-, vagy duplaszálú nukleinsav alkotja a vírus genomját).
−
csoportspecifikus antigének vizsgálata: AGP, KK, IF/indirekt IF, IEM, ellenáramú immunelektroforézis, ELISA, RIA, HA módszerekkel
−
szerotípusok azonosítása: vírusneutralizáció, hemagglutináció-gátlás
−
szubtípusok, variánsok megállapítása: −
tünetek alapján (különböző fajoknál)
−
nukleinsav vizsgálatok (heteroduplex technikák, hibridizáció, szekvenálás)
−
monoklonális ellenanyagokkal végzett vizsgálatok
