Gymnázium Jana Nerudy Hellichova 3, Praha 1
Závěrečná práce studentského projektu Spektrofotometrie
Evropský sociální fond Praha a EU – Investujeme do vaší budoucnosti
Adéla Novanská Nikola Káchová Eva Pechová Maria Gorbatová Bára Spudilová 2014
Prohlašujeme, že předložená práce je naším původním dílem, které jsme vypracovaly samostatně. Veškerou literaturu a další zdroje, z nichž jsme při zpracování čerpaly, v práci řádně citujeme a jsou uvedeny v seznamu použité literatury.
Dne 30.5.2014 v Praze
Poděkování Chtěly bychom poděkovat Mgr. Jiřímu Vozkovi za vedení naší seminární práce, cenné rady a odborný dohled. Děkujeme také RNDr. Blance Zikánové za odborné konzultace a za zapůjčení pomůcek k experimentální části. V neposlední řadě děkujeme také RNDr. Květě Kalíkové Ph.D. za pomoc při experimentální části naší práce.
Abstrakt Seminární práce je zaměřena na spektrofotometrii, moderní analytickou metodu, a její praktické využití v mikrobiologii. Teoretická část práce obsahuje stručný historický přehled o vývoji této metody, dále obsahuje vysvětlení jejích základních fyzikálně chemických principů. V rámci praktické části byla spektrofotometrie využita ke stanovení růstu kvasinek (Saccharomyces cerevisae). Byly použity dva postupy. Prvním postupem se stanovila růstová křivka a to přímým měřením absorbance živného roztoku obsahujícího kvasinky. Druhý postup byl založen na úbytku škrobu, který kvasinky metabolizovaly. Oběma postupy byl prokázán růst kvasinek a také byla jasně demonstrována aplikovatelnost spektrofotometrie v biochemické praxi.
Abstract The final thesis focuses on spectrophotometry, modern analytic method, and its practical use in microbiology. The theoretical part of the thesis contains brief historical overview about the development of this method, furthermore it contains explonation of its elementary physicochemical principles. In the practical part the spectrophotometry was used to determine the growth of the yeasts (Saccharomyces cerevisae). There were used two methods. The first method determined the growth curve with the use of the direct measurement of the absorbance of a basic solution containing yeasts. The second method was based on the loss of starch which yeasts metabolized. Both methods have proven the growth of the yeasts and also the applicability of the spectrophotometry in biochemical practice was clearly demonstrated.
1
Obsah Abstrakt............................................................................................................................................ 1 Abstract................................................................................................................................1 1. Úvod............................................................................................................................3 2. Teoretická část 2.1 Historie spetrofotometrie.............................................................................................. 4 2.2 Teoretické principy spektrofotometrie......................................................................... 4 2.3 Spektrofotometr............................................................................................................ 5 2.3.1 Princip spektrofotometru................................................................................ 5 2.3.2 Popis spektrofotometru.................................................................................. 6 3. Kvasinky............................................................................................................................... 6 3.1 Historie kvasinek......................................................................................................... 7 3.2 Druhy kvasinek............................................................................................................. 7 3.2.1
Pivovarské kvasinky.........................................................................................7
3.2.2
Vinařské kvasinky.............................................................................................7
4. Experimentální část 4.1. Vlastní experiment..................................................................................................... 8 5. Závěr.................................................................................................................................... 8 6. Reference.............................................................................................................................9 7. Přílohy..................................................................................................................................10
7.1 Naměřené závislosti…………………………………………………………...10 7.2 Fotografická dokumentace……………………………………………………11
2
1. Úvod Spektrofotometrie je základní analytická metoda, která se běžně používá v chemické, fyzikální i medicínské praxi. Naším cílem bylo pochopit základní principy této metody a ověřit si její aplikovatelost v mikrobiologii. Jako modelový organismus jsme si vybraly kvasinky (Saccharomyces cerevisase), jejichž růst jsme ověřovaly dvěma přístupy – standardní růstovou křivkou a měřením úbytku metabolizovaného škrobu.
2.
Teoretická část
2.1 Historie spektrofotometrie Spektrofotometrie patří k nejstarším fyzikálně-chemickým metodám. Její počátky se prolínají s vývojem a objevem spektroskopie ve druhé polovině 17. století. Za zakladatele spektroskopie a optiky jako vědy je považován český lékař, fyzik, astronom a matematik Jan Marcus Marci, který se zabýval fenoménem lomu a odrazu světla ještě dřív než anglický fyzik Isaac Newton. [1] Ten po několika letech poté představil svou teorii o lomu světla v díle Optiks z roku 1704 [2], které vědci uznávali až do počátku 19. století. S použitím optického hranolu dokázal, že sluneční světlo lze rozložit na jednotlivé barevné složky (červená, oranžová, žlutá, zelená, modrá, bílá a fialová) [1]. Samotná spektrofotometrie však byla popsána až v roce 1845 a její vývoj ovlivnil zvláště objev spektrofotometrů. Jako jeden z prvních začal s výrobou spektrofotometru Arnold O. Beckman v roce 1940. Předtím byl proces chemické analýzy dlouhodobý s minimální přesností, tento objev tedy zjednodušil analýzu na několik minut a zvýšil přesnost výsledku. Na začátku 20. století byly spektrofotometry vyráběny v omezeném množství a zacházení s nimi nebylo ještě zdaleka tak snadné[2]. Po druhé světové válce však zaznamenal trh s analytickými přístroji velký rozkvět a spektrofotometry se rychle rozšířily, navíc se rozvíjely nové techniky a s nimi vybavení přístrojů např. automatické snímání pomocí monochromátoru. Od roku 1976 se začaly běžně používat v klinikách, laboratořích, v chemii i biochemii a dnes nachází stále větší uplatnění v soudní medicíně[1].
2.2 Teoretické principy spektrofotometrie Spektrofotometrie je jedna ze základních analytických metod, díky níž lze měřit množství světla propuštěného nebo pohlceného jistou látkou v závislosti na vlnové délce. Míra, do jaké vzorek absorbuje světlo, silně závisí právě na jeho vlnové délce. Přičemž viditelné záření tvoří pouze malý úsek z oblasti elektromagnetického vlnění v rozmezí vlnových délek 400–700nm. Elektromagnetické spektrum vlnových délek v rozmezí 200–400nm se nazývá ultrafialové, 700– 2000nm potom infračervené. Spektrální veličiny můžeme měřit pomocí přístrojů tzv. spektrofotometrů [4]. Interakcí záření s atomy a molekulami dochází k pohlcení části spektra. Tato absorpce je právě viditelná na spektru v závislosti množství pohlceného záření na jeho vlnové délce. Tento vztah absorbance na vlnové délce se nazývá absorpční spektrum, které je tvořeno jednotlivými
3
absorpčními pásy, které má většina barevných látek ve spektru 200 – 700nm. Absorpční pásy jsou pro danou látku charakteristické (polohou maxima, tvarem) Podle vlastností jednotlivého absorpčního pásu ve spektru lze totiž identifikovat organické sloučeniny. Díky těmto poznatkům lze stanovit koncentraci látek na základě jejich charakteristických spektrálních vlastností. (1) Absorbanci, veličinu používanou ve spektrofotometrii a fotometrii, určující množství světla, které bylo pohlceno zkoumaným vzorkem.(5) Můžeme tedy definovat podle vztahu: A = – log T, kde A je absorbance a T je transmitance (tj. propustnost) měřeného vzorku za stejných podmínek. Podle definice jsou vztahy mezi transmitancí a absorbancí: A= -log T = log I0/I, kde I0 je intenzita vstupujícího paprsku a I intenzita paprsku po průchodu absorbujícím prostředím[6]. Z čehož vyplývá, že pokud prochází světelný paprsek prostředím, které je schopno absorbovat, intenzita vstupujícího paprsku je vyšší než intenzita paprsku vystupujícího (tj. který už prošel prostředím). Poprvé byl tento jev popsán Pierrem Bouguerem a v roce 1729 znovu objeven J. H. Lambertem[7]. V r. 1852 August Beer dokázal, že u roztoků vzniklých rozpuštěním látek schopných absorbovat světlo, je výsledný koeficient A přímo úměrný koncentraci c rozpuštěné látky, jinak řečeno absorbance je přímo úměrná koncentraci absorbující látky: A= ε ·c ·l Kde hlavní veličiny jsou: A…absorbance, bezrozměrná veličina l…délka kyvety, ve které se měří (obvykle 1 cm) c…koncentrace látky v mol /dm3 ε…konstanta úměrnosti, molární absorpční koeficient v cm2/mol Spojením Lambertových a Beerových poznatků je popsán monochromatické světlo, který je základem metod chemické analýzy:
vztah
platný
pro
A = ε · c · l = -log T = log I0 /I Při měření koncentrací látek se porovnává intenzita paprsku před absorpcí (tj. referenční vzorek) a poté toho, co prošel kyvetou se vzorkem[8].
4
2.3 Spektrofotometr 2.3.1 Princip spektrofotometru Spektrofotometr (nebo také spektrální fotometr) je nástroj pro fyzikální analýzu využívaný ve spektrofotometrii a to tedy k měření intenzity světla v různých vlnových délkách, množství světla absorbovaného zkoumaným vzorkem nebo ke stanovení neznámé koncentrace roztoku. Měří množství odraženého nebo absorbovaného světla díky systému tvořenému optickou mřížkou, která rozkládá bílé světlo na jednotlivé barvy ve spektru, a obvykle také vícenásobným senzorem. Spektrofotometr v podstatě vysílá elektromagnetické záření v určitém spektru vlnových délek a potom vyhodnocuje přijímaný signál, je schopen napodobit chování některých světelných zdrojů[9]. Přístroj měří paprsek světla, který prochází vzorkem a zároveň intenzitu světla dopadajícího na detektor. Paprsek světla se skládá z množství fotonů. Když tedy foton narazí na molekulu (studovaného vzorku) je jí pohlcen. Tato absorpce potom snižuje počet fotonů v paprsku světla, čímž se snižuje i jeho intenzita (právě v závislosti na množství pohlceného světla). Světlo procházející vzorkem je tedy méně intenzivní (na detektoru) než to vyzařované světelným zdrojem[10].
2.3.2 Popis spektrofotometru Obecně se spektrofotometr skládá ze čtyř částí: zdroje světla, monochromátoru, absorpčního prostředí a detektoru. Jako zdroj světla [1] se často využívá vhodná žárovka nebo výbojka. Polychromatické světlo následně prochází monochromátorem [2], který propouští jen určitou část spektra, jehož vlnovou délku lze změřit a zesiluje ji. Takovou funkci většinou zastává vhodný interferenční filtr schopný měřit určitou vlnovou délku ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Jako monochromátor se dnes často využívá právě optická mřížka, jejímž nakláněním lze měřit libovolnou vlnovou délku. Rozsah monochromátoru určuje štěrbina, která je pevně nastavená, anebo se dá podle potřeby nastavit. Čím je štěrbina větší, tím větší je intenzita propuštěného světla a měření není příliš přesné. O něco užší štěrbina zase zajistí přesnější dodržení požadované vlnové délky s menší intenzitou světla. Dále světlo prochází vzorkem umístěným v kyvetě [3], která se ukládá do kyvetátoru. Světlo procházející vzorkem nakonec dopadá na detektor [4], obvykle fotodiodu. Následně přístroj [5] vyhodnotí intenzitu světla a srovná ji s tou, které prochází slepým vzorkem (blank), tím se získá míra absorbance tj. množství pohlceného světla zkoumaným roztokem. Přesnost měření je ovlivněná dobou, během níž se absorbance měří. Čím je delší, tím bude zpravidla výsledek měření přesnější (pokud se nejedná o fotocitlivou látku, která může při dlouhodobém záření změnit barvu). [1]
5
schéma principu[11]
3. Kvasinky Řád kvasinky patří pod třídu vřeckovýtrusných hub. Jedná se o jednobuněčné houbové mikroorganismy s pravým jádrem nebo o vlákna se stejnými vlastnostmi. Tvary buněk se velmi liší napříč různými druhy. Tyto heterotrofní eukaryotní organismy, které se řadí mezi houby, nejsou schopny fotosyntézy a existují jako jednobuněčné organizmy s pevnou buněčnou stěnou. Význam těchto mikroorganismů je hlavně ve využití produktů kvašení. Kvasinky dokáží zkvašovat monosacharidy, některé disacharidy, zřídka i trisacharidy. Jedná se tedy o materiály, obsahující cukry (ovoce, cukernaté plodiny, ale i v půdě, vodě a střevním traktu.) Mohou se množit oběma způsoby, většinou je to nepohlavně – pučením. U kvasinek chybí houbová vlákna (hyfy), ze kterých se u ostatních hub vytváří podhoubí. Jsou všude přítomné, různé druhy se využívají například v potravinářství, biotechnologiích, buněčném výzkumu nebo se vyskytují jako patogeny v lidském těle.
3.1 Historie kvasinek Kvasinky byly známé už starověkým národům, které jich využívaly při kynutí chleba a výrobě alkoholických nápojů. Pozorovány mohly být od roku 1676, kdy holandský přírodovědec jménem Antoni van Leeuwenhoek sestavil vlastní mikroskop s několikasetnásobným zvětšením a všiml si mikroorganismů v pivě, pivních kvasinek[12]. Louis Pasteur, francouzský vědec, který žil v 19. století, přispěl výzkumy týkajícími se mléčného, octového a alkoholového kvašení. Na základě těchto pokusů dokázal, že za proces fermentace mohou mikroorganismy, a že u různých druhů zaznamenáme různé výsledky. Jednobuněčné organismy, které svým metabolismem dokáží přeměňovat zkvasitelné cukry na oxid uhličitý a pro nás nejpodstatnější etanol. Vedlejší produkty tohoto procesu nazývajícího se kvašení vznikají estery, kyseliny a vyšší alkoholy. (Alifatické alkoholy (isoamylalkohol), estery (etylacetát, etylhexanoát, isoamylacetát), aldehydy a mastné kyseliny. Jako vedlejší produkty dotvářejí konečnou chuť a aroma tohoto nápoje.)
6
3.2 Druhy kvasinek Kvasinky se dále dělí na: Pivovarské Vinařské Pekařské Lihovarské
Patogenní
3.2.1 Pivovarské kvasinky (Kvasnice) Dle názvu těchto kvasinek odvodíme, že tyto organismy používáme k výrobě piva. Nyní si trochu podrobněji popíšeme proces kvašení. Během tohoto anaerobního kvašení využíváme spodních a svrchních kvasinek, které jsou schopné přeměnit jednoduché cukry (glukosu), disacharidy (maltosu) a vybraných trisacharidů (maltotriosu) na etanol a oxid uhličitý. Při tomto procesu se spodní kvasinky (Saccharomyces uvarum/ carlsbergensis) shlukují do jakýchsi vloček, které se usadí na kvasné nádoby. Shlukování spodních kvasinek se nazývá flokulace. Svrchní kvasinky (Scacharomyces cerevisiae) se po skončení kvašení projeví jako hustá bílá pěna, která odolává vyšším teplotám, než kvasinky spodní a to až o 13°C. Mohou tedy kvasit při 10-25 °C. Spodní kvasinky kvasí při 6-12 °C. Vedlejší produkty, které při kvašení vznikají a jsou nežádoucí, se nazývají diacetyly. Dokáží i v malém množství změnit chuť piva.
3.2.2 Vinařské kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) Buňky jsou protáhlé, elipsoidního tvaru. Tvoří velké kolonie. Fermentace (kvašení) je anaerobní proces (bez přístupu ke kyslíku), kdy dochází k přeměně sacharidů na alkoholy a kyseliny za působení kvasinek[13]. Díky této schopnosti se rod Saccaromyces označuje za reducenty (rozkladače). Velmi důležitou roli mají kvasinky ve vinařství. Bez jejich působení by ze šťávy z vinných hroznů nevzniklo víno. Právě tyto buňky produkují v průběhu fermentace alkohol a mnohé aromatické látky, které dodávají vínu charakteristikou vůni a chuť[14]. Obecný, zjednodušený vzorec pro vyjádření procesu kvašení: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 (Glukosa → ethanol + oxid uhličitý) V současnosti se při výrobě vína uplatňují spíše vyšlechtěné druhy kvasinek, člověk tak může sám ovlivnit vlastnosti vína. Před vynalezením této technologie se využívalo kvasinek přirozeně se vyskytujících na bobulích hroznového vína.
7
4.
Experimentální část 4.1 Vlastní experiment
V experimentální části jsme pomocí spektrofotometru dokazovali růst kvasinek. Růst jsme dokazovali dvěma způsoby, přímým a nepřímým. První způsob, tedy přímý, se zakládal na měření růstu kvasinek. Druhý způsob se zakládal na měření nepřímém, kdy jsme měřili úbytek škrobu, který kvasinky požíraly. Pokus probíhal po dobu dvou dní. Růst jsme měřili každé dvě hodiny. Živné médium, ve kterém se kvasinky nacházely po dobu pokusu, se skládalo z vody, škrobu a aminokyselin. Toto živné médium jsme udržovali ve stálé pokojové teplotě a na tzv. třepačce, která nám pomáhala vytvořit ideální podmínky pro jejich růst. Při měření jsme roztok odstředili a naředili kyselinou chlorovodíkovou a jodným roztokem. Díky tomu jsme dokázali přítomnost škrobu, tedy že došlo k inkluzi trijodidového anionu do šroubovice amylosy. Celé jsme to vložili do spektrofotometru, kde jsme dané hodnoty naměřili. Naměřené hodnoty jsme posléze vynesli do grafu. Vybírali jsme data v určité vlnové délce. Hodnoty pro růst kvasinek byly měřeny ve vlnové délce 580 nm. A hodnoty pro úbytek škrobu ve vlnových délkách 620 nm. Získaná absorpční spektra jsou přiložena k práci, viz Přílohy.
5. Závěr Pro shrnutí naší seminární práce, spektrofotometrie je způsob měření, díky kterému můžeme zjistit obsah určité látky v roztoku pomocí vlnových délek. Přístroj, kterým toto měříme, je spektrofotometr. V experimentální části jsme měřili růst kvasinek pomocí spektrofotometru. U první kvasinky se nám pokus povedl, jenže díky vysoké absorbanci škrobu se nám u druhé kvasinky nepodařilo naměřit úbytek škrobu, daná kvasinka není tedy přiložena k naší seminární práci.
8
6. Reference [1]
http://is.muni.cz/th/211906/prif_b/Bakalarska_prace_2.txt, 2. 3. 2014 17:15 http://en.wikipedia.org/wiki/Opticks, 28. 4. 2014 20:36 [3] http://www.ehow.com/about_6595173_history-spectrophotometry.html, 27. 2. 2014 21:17 [4] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Spektrofotometrie, 28. 2. 2014 18:57 [5] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Absorbance, 28. 4. 2014 15:23 [6] http://amrita.vlab.co.in/?sub=2&brch=190&sim=338&cnt=1, 28. 2. 2014 19:06 [7] http://www.farm.ucl.ac.be/tpao/instrumentation/spectrophotometrie/theorie/theorie.htm, 27. 2. 2014 21:19 [8] http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/hypertext/200640/hypertext/AJBDN.htm, 27. 2. 201419:59 [9] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Spektrofotometrie, 28. 2. 2014 16:26 [10] http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Experimental_Deter mination_of_Kinetcs/Spectrophotometry, 21. 3. 2014 17:19 [11] http://www.tarleton.edu/Faculty/alow/1084exp2.htm, 19. 4. 2014 21:48 http://is.muni.cz/th/223187/prif_b/Bak_Jana_hotovo.pdf www.wikipedie.cz [12] http://is.muni.cz/th/223187/prif_b/Bak_Jana_hotovo.pdf, 16.4.2014 15:42 [13] https://is.muni.cz/do/ped/kat/biologie/pokusy/pages/kvasinky.html, 7.5.2014 18:26 [14] http://en.wikipedia.org/wiki/Yeast_in_winemaking, 27.4.2014 10:18 [2]
9
7. Přílohy 7.1 Naměřené závislosti
14
10
7.2 Fotografická dokumentace
(nalevo – jodový roztok, napravo – směs HCl, jodidového roztoku a roztoku s kvasinkami)
Pracovní prostředí
11 Saccharomyces cerevisae
