Woord vooraf. Verder gaat mijn dank uit naar Mevr. Dr. N. Kellner, die mijn eindwerk verbeterd heeft

Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne

Woord vooraf

Het verwezelijken van dit eindwerk heeft als doel het halen van het diploma professionele bachelor biomedische laboratoriumtechnologie, afstudeerrichting medische laboratoriumtechnologie. Deze werd gevolgd in Hogeschool West-Vlaanderen, departement Simon Stevin te Brugge. Vooreerst wil ik mijn mentors bedanken, Dr. D. Bernard en apotheker bioloog in opleiding E. Verhoye. Zij bezorgden mij veel nuttige informatie in verband met mijn eindwerk, lieten mij gebruik maken van de infrastructuur en toestellen en verbeterden mij eindwerk. Ook zou ik graag heel de groep medische laboranten van het laboratorium klinische scheikunde van het AZ Sint-Jan te Brugge bedanken voor de medewerking aan mijn eindwerk. Daarbij zou ik de groep neonatale screening specifiek willen bedanken voor de vele informatie in verband met de neonatale screening. Verder gaat mijn dank uit naar Mevr. Dr. N. Kellner, die mijn eindwerk verbeterd heeft. Ook wil ik alle lectoren bedanken voor de drie leerrijke jaren. Tot slot wil ik mijn familie bedanken voor hun steun.

1


Samenvatting

De ziekte van Duchenne is een ernstige, erfelijke X-gebonden recessief overgeërfde spierziekte, die hoofdzakelijk bij jongens voorkomt. Het gaat om een mutatie in het gen dat codeert voor het eiwit dystrofine, wat aanleiding geeft tot progressieve spierzwakte. Doordat deze patiënten geen dystrofine aanmaken, ontstaat er bij elke samentrekking van de spier, spiercelnecrose waarbij creatine kinase wordt vrijgesteld. Door deze continue beschadiging treedt er pseudohypertrofie op. In dit eindwerk werd een enzymatische creatine kinase bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne op punt gesteld. Hieruit is gebleken dat we betere resultaten bekomen met een 1/2de reagens/ethanol verhouding, 30 minuten op 30 °C incubatie, aflezen voor centrifugatie van de microtiterplaat, de test af te lezen door fluorescentie, een inhiberende 250 mmol/L NaF concentratie gebruiken voor adenylaatkinase, EDTA gewassen standaarden en ongespotte blanco’s te gebruiken. Ook werd de tweestapsreactie beter bevonden dan de eenstapsreactie. Op basis van de correlatie waarden die we uitkwamen bij de op punt stelling van de methode, werd er gekozen voor een definitief protocol: de tweestapsreactie met fluorometrische aflezing. Nadat de methode op punt gesteld werd, werd deze gevalideerd. Hieruit blijkt dat zowel de intra-run, between-run, juistheid, de eigen referentiewaarden, reproduceerbaarheid van de externe controles, meetbereik, lineariteit en stabiliteit onder de voorop gestelde waarden lagen. Als eindbesluit kunnen we stellen de methode voor het maken van de standaarden verder moet op punt gesteld worden of ideaal hiervoor zouden externe standaarden op de markt moeten komen. Zo is neonatale screening naar de ziekte van Duchenne te overwegen indien er een curatieve therapie komt.

2


Lijst met afkortingen en symbolen

ADP

adenosine difosfaat

AMP

adenosine monofosfaat

AON

antisenses oligonucleotiden

ATP

adenosine trifosfaat

cDNA

copy- of complement DNA

CK

creatine kinase

DG

dystoglycanen

DMD

Duchenne muscular dystrophy

DNA

desoxyribonucleïnezuur

EMG

elektromyografie

G6P-DH

glucose-6-fosfaat dehydrogenase

HK

hexokinase

MCAD

medium keten acyl-coA

MRI

magnetische resonantie beeldvorming

NAD+

nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH

nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

NaF

natriumfluoride

nm

nanometer

PCR

polymerase chain reaction of polymerase kettingreactie

QALY’s

quality adjusted life year

RNA

ribonucleïnezuur

SG

sarcoglycanen 3


Verklarende woordenlijst

antisenses oligonucleotiden

kleine stukjes synthetisch RNA (oligonucleotiden) die kunnen binden op complementaire delen van het gen.

Becker spierdystrofie (BMD)

is een spierziekte waarbij het dystrofine eiwit defect is maar wordt wel aangemaakt, in tegenstelling tot bij DMD patiënten.

cDNA

(Copy- of complement DNA). Stukjes DNA dat door reverse transcriptie uit mRNA is verkregen.

chorionvlokken

Stukjes placenta weefsel.

corticosteroïden

bijnierschorshormonen, zijn onstekingsremmend.

exonskipping

Het hechten van antisenses oligonucleotiden op het gen waardoor het aflezen van het defecte gen kan doorgaan.

PCR

(polymerase-kettingreactie). Dit is een techniek om uit een bepaalde DNA sequentie te vermenigvuldigen (amplificeren) (tot er genoeg is om te analyseren).

pseudohypertrofie

Vergroting van de spieren door toename van veten bindweefsel.

quality adjusted life years

Is een manier om de gezondhiedswinst te meten, met inbegrepende levenskwaliteit. Elk jaar in perfecte conditie heeft een waarde van 1.

scoliosis

Een zijdelingse verkromming van de ruggengraat.

Western blotting

Een methode voor het detecteren van een specifiek eiwit, door middel van gelelektroforese. 4


Lijst van tabellen en figuren Figurenlijst Figuur 2.1: Afname van bloed op kaart via de hielprik.29 ................................................... 10 Figuur 2.2: Handrugprik.36 ................................................................................................. 14 Figuur 2.3: De Franse neuroloog Guillaume Duchenne.30 ................................................. 15 Figuur 2.4: Lokalisatie van genlocus Xp21 op het X-chromosoom.31 ................................ 16 Figuur 2.5: Lokalisatie van het dystrofine eiwit.32 .............................................................. 17 Figuur 2.6: Overervingpatroon van DMD.25 ....................................................................... 18 Figuur 2.7: Het Gowers manoeuvre.33 ............................................................................... 19 Figuur 2.8: Gentherapie met virale vectoren.34 .................................................................. 21 Figuur 2.9: Histologisch preparaat van een spierbiopt met DMD waarvan vele spiercellen getransformeerd zijn naar bindweefsel of vetcellen.5 ................................................. 24 Figuur 2.10: De katalysatiereactie voor CK.2 ..................................................................... 25 Figuur 2.11: Reactie voor bepaling van CK.2 ..................................................................... 26 Figuur 2.12: Schematische voorstelling van de fluorimeter.2 ............................................. 27 Figuur 4.1: Grafiek juistheid. .............................................................................................. 40 Figuur 4.2: Histogram. ....................................................................................................... 41 Figuur 4.3: Grafiek controle referentiewaarden. ................................................................ 42 Figuur 4.4: Grafiek bovengrens. ........................................................................................ 43 Figuur 4.5: Grafiek lineariteit.............................................................................................. 44

5


Inhoudsopgave

Woord vooraf ..................................................................................................................... 1 Samenvatting ..................................................................................................................... 2 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 3 Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 4 Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................. 5 Figurenlijst ........................................................................................................................... 5 Inhoudsopgave .................................................................................................................. 6 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................... 9

2

Literatuurstudie ................................................................................................. 10

2.1

Neonatale screening ........................................................................................... 10 2.1.1

Algemene duiding ............................................................................................ 10

2.1.2

Opgespoorde aandoeningen ........................................................................... 11

2.1.3

Praktisch verloop bij en na afname staal ......................................................... 13

2.2

De ziekte van Duchenne ..................................................................................... 15 2.2.1

Inleiding ........................................................................................................... 15

2.2.2

Het dystrofine gen ............................................................................................ 15

2.2.3

Overerving ....................................................................................................... 18

2.2.4

Klinisch verloop van de ziekte van Duchenne ................................................. 19

2.2.5

Therapieën voor de ziekte van Duchenne ....................................................... 20

2.2.6

Psychologische en sociale aspecten bij de ziekte van Duchenne ................... 22

2.3

Opsporen van de ziekte van Duchenne in een neonataal screeningsprogramma......................................................................................... 23 2.3.1

Diagnose van Duchenne spierdystrofie ........................................................... 23

2.3.2

Testen voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne ................ 24

2.3.2.1

Algemeen .............................................................................................. 25

2.3.2.2

Creatine kinase bepaling ...................................................................... 25 6


2.3.2.3

Mogelijke interferenties ......................................................................... 27

2.3.3

Medico sociale discussie ................................................................................. 28

2.3.4

Besluit .............................................................................................................. 29

3

Materialen en methoden .................................................................................... 30

3.1

Materialen en reagentia....................................................................................... 30 3.1.1

Materialen ........................................................................................................ 30

3.1.2

Reagentia ........................................................................................................ 31

3.2

Methoden ............................................................................................................ 33 3.2.1

Methoden ......................................................................................................... 33

3.2.2

Standaarden en controlestalen ........................................................................ 34

3.2.3

Op punt stellen van de methode ..................................................................... 34

3.2.4

Validatie van de gekozen methode .................................................................. 34

4

Resultaten en discussie .................................................................................... 36

4.1

Op punt stellen van de methode ......................................................................... 36 4.1.1

Verschil in reagens/ethanol verhouding ........................................................... 36

4.1.2

Verschil in incubatieverschillen ........................................................................ 36

4.1.3

Centrifugeren ................................................................................................... 36

4.1.4

Fluorescentie versus UV aflezing .................................................................... 37

4.1.5

Verschil in natriumfluoride concentraties ......................................................... 37

4.1.6

Heparine standaarden versus EDTA standaarden .......................................... 38

4.1.7

Blanco’s vergelijken ......................................................................................... 38

4.1.8

Eenstapsreactie versus tweestapsreactie ....................................................... 38

4.1.9

Besluit .............................................................................................................. 39

4.2

Validatie van de gekozen methode ..................................................................... 39 4.2.1

Intra-run ........................................................................................................... 39

4.2.2

Between-run .................................................................................................... 39

4.2.3

Juistheid........................................................................................................... 40

4.2.4

Eigen referentiewaarden .................................................................................. 40

4.2.5

Reproduceerbaarheid van de externe controles .............................................. 41

4.2.6

Meetbereik ....................................................................................................... 42

4.2.7

Lineariteit ......................................................................................................... 43 7


5

4.2.8

Specificiteit en sensitiviteit van de screening ................................................... 44

4.2.9

Stabiliteit .......................................................................................................... 45 Conclusie ............................................................................................................ 46

Literatuurlijst .................................................................................................................... 47 Bijlagen ............................................................................................................................. 50 Bijlage 1 – Neonatale screeningskaarten .......................................................................... 52 Bijlage 2 – Testen bij neonatale screening ........................................................................ 53 Bijlage 3 – Bijsluiter CK reagens ....................................................................................... 54 Bijlage 4 – Aanmaak van standaarden .............................................................................. 55 Bijlage 5 – CDC quality control specimen certification ...................................................... 56 Bijlage 6 – Verhouding in reagens/ethanol volume ........................................................... 57 Bijlage 7 – Verschil in incubatietijden/temperaturen .......................................................... 57 Bijlage 8 – Centrifugeren ................................................................................................... 57 Bijlage 9 – Fluorescentie versus UV aflezing .................................................................... 57 Bijlage 10 – Verschil in natriumfluoride concentraties ....................................................... 57 Bijlage 11 – Heparine standaarden versus EDTA standaarden ........................................ 58 Bijlage 12 – Blanco’s vergelijken ....................................................................................... 58 Bijlage 13 – Eenstapsreactie versus tweestapsreactie...................................................... 58 Bijlage 14 – Intra-run ......................................................................................................... 59 Bijlage 15 – Between-run................................................................................................... 59 Bijlage 16 – Juistheid ......................................................................................................... 60 Bijlage 17 – Eigen referentiewaarden ................................................................................ 60 Bijlage 18 – Reproduceerbaarheid van externe controles ................................................. 61 Bijlage 19 – Meetbereik (bovengrens) ............................................................................... 62 Bijlage 20 – Lineariteit ....................................................................................................... 62 Bijlage 21 – Stabiliteit ........................................................................................................ 62 Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 65

8

Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Het eindwerk werd gemaakt in het AZ Sint-Jan AV te Brugge, dienst klinische scheikunde, afdeling neonatale screening onder leiding van Dr. D. Bernard en apotheker bioloog in opleiding E. Verhoye. Naar aanleiding van de periodieke revisie van de lijst met neonataal op te sporen ziekten wordt nagegaan of de screening naar Duchenne spierdystrofie analytisch haalbaar is indien er curatieve therapie ter beschikking zou komen. De doelstelling is het te verkrijgen van een enzymatische creatine kinase bepaling op neonatale screeningsstalen. Door een eenvoudige methode op punt te stellen en deze te valideren. De aanpak van dit eindwerk bestaat eruit de methode eerst op punt te stellen voor het bekomen van een definitieve methode. Die op zijn beurt wordt gevalideert, door de methode bepaalde prestatiekenmerken op te leggen.

9


2

Literatuurstudie

2.1

Neonatale screening

2.1.1

Algemene duiding

Neonatale screening (Fig. 2.1) is de opsporing van een aantal aangeboren aandoeningen bij pasgeborenen op bloedspotkaarten, afgenomen tussen de derde en vijfde levensdag door middel van een hiel- of handrug prik. Het aantal ziekten die worden opgespoord verschilt van land tot land. De klinische symptomen van deze aandoeningen komen pas met een wisselend interval na de geboorte tot uiting. Positieve screeningsresultaten dienen bevestigd te worden door verdere biochemische, endocrinologische of genetische onderzoeken. Figuur 2.1: Afname van bloed op kaart via de hielprik.29

Dankzij neonatale screening worden deze aandoeningen vroeger gediagnosticeerd, waardoor de therapie kan starten alvorens er ernstige schade ontstaat en bijgevolg de levenskwaliteit en levensverwachting van de patiënten verhoogt. De potentiële meerwaarde van de screening moet worden afgewogen tegenover de kostprijs en nadelen van de opsporing. Iedere aandoening die in een neonataal screeningprogramma opgenomen wordt, dient eerst aan de opgestelde voorwaarden getoetst te worden. Deze werden voor het eerst opgesteld door Wilson en Jungner in 1968 en later aangepast door DMB Hall en J-M Michel.36

De voornaamste voorwaarden zijn: -

De ziekte moet ernstig zijn (dwz. een motorische of mentale handicap met eventuele fatale afloop); 10


-

de stoornis kan niet tijdig klinisch herkend worden;

-

De prevalentie van de ziekte moet voldoende hoog zijn;

-

Er moet een betrouwbare, eenvoudige test beschikbaar zijn om de screening uit te voeren;

-

De test moet aanvaardbaar zijn voor de patiënt en/of zijn ouders;

-

Er moeten methoden beschikbaar zijn voor diagnose stelling;

-

Er moet een efficiënte behandeling beschikbaar zijn die een substantiële verandering in de levenskwaliteit en levensverwachting met zich meebrengt.15,17,22,36

2.1.2

Opgespoorde aandoeningen

De 11 opgespoorde aandoeningen die worden opgespoord in Vlaanderen zijn: 1

Fenylketonurie

Dit is een aandoening gekenmerkt door een verhoogde concentratie van fenylalanine in het bloed door deficiëntie van het enzym phenylalaninehydroxylase. Dit veroorzaakt huidaandoeningen (eczema) en neurologische symptomen, waaronder zware mentale achterstand, epilepsie en ernstige gedragsstoornissen. De therapie bestaat uit een streng, levenslang dieet dat arm is aan fenylalanine; 2

Congenitale hypothyreoïdie

Dit is een aandoening waarbij de productie van het schildklierhormoon thyroxine verstoord is en gaat bijna steeds gepaard met een verhoogde concentratie van het schildklierstimulerende hormoon (TSH). Het verstoort de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel met mentale achterstand tot gevolg. Baby’s zijn weinig actief, vertonen vaak een verlengde neonatale icterus, een uitpuilende tong en vertonen een progressieve groeiachterstand. De behandeling bestaat uit een levenslange medicamenteuze vervanging van de schildklierhormoon;

11


3

Congenitale bijnierschorshyperplasie (CAH of adrenogenitaal syndroom)

Deze ziekte wordt gekenmerkt door een verstoorde aanmaak van cortisol al dan niet in combinatie met aldosteron door deficiëntie van het enzym 21-hydrolase . Deze afwijking wordt gekenmerkt door een verhoogde concentratie van 17-OH progesteron, een voorlopermolecule van cortisol en aldosteron. Deze ziekte kan gepaard gaan met zoutverlies, ernstige uitdroging en shock wat kan leiden tot hersenbeschadiging. Bij meisjes kan de ziekte tot een vermannelijking van de uitwendige geslachtsorganen leiden. De behandeling bestaat uit een suppletie van cortisol en mineraalcorticoïden; 4

MCAD deficiëntie

Dit s een stoornis in de oxidatie van de middellange vetzuurketens. Het veroorzaakt hypoglycemie of suikertekort bij vasten met kans op hersenbeschadiging en plotse dood. De behandeling bestaat uit het voorkomen van vasten en snel opvangen van nuchtere toestanden door middel van een glucose-infuus; 5

MMA of methylmalonacidemie

Dit is een defect in het enzym methylmalonylcoA mutase. Het veroorzaakt een stoornis in de afbraak van bepaalde aminozuren (valine en isoleucine), die leidt tot coma, hersenbeschadiging met onder meer mentale achterstand, groeistoornissen en nieraantasting. De behandeling bestaat uit dieet, bijkomende suppletie met L-carnitine en een behandeling met medicamenten. Sommige vormen normaliseren bij vitamine B12- toediening; 6

Glutaaracidurie type 1

Dit is een defect in het mitochondriaal enzym glutarylcoA dehydrogenase, waardoor de afbraak van lysine, OH-lysine en tryptofaan verstoord is. Verhoogt risico op de ontwikkeling van een ernstig neurologische aantasting tijdens een infectie of koortsperiode. De behandeling bestaat uit een dieetbehandeling en suppletie met L-carnitine heeft een gunstig effect; 7

Maple syrup urine disease (of MSUD)

Dit is een verstoorde afbraak van (iso)leucine en valine. Het veroorzaakt ernstige, progressieve beschadiging van het centrale zenuwstelsel, neurologische stoornissen en

12


mentale achterstand. De behandeling bestaat uit een dieettherapie en toediening van het vitamine thiamine; 8

IVA of isovaleriaanzuuracidemie

Dit is een deficiëntie van het enzyme isovalerylcoA dehydrogenase. Wat leidt tot coma met hersenbeschadiging. De behandeling bestaat uit een dieettherapie en aanvullende behandeling met toediening van L-carnitine en glycine; 9

Biotinidasedeficiëntie

Dit is een autosomaal recessief overerfbare ziekte. De aandoening is te wijten aan een verlaagde activiteit van het enzyme biotinidase dat instaat voor de recyclage van het enzym biotine. De aandoening veroorzaakt huiduitslag, oogbindvliesontsteking, kaalheid, coördinatiestoornis van de spieren, schimmelziekte van de huid en slijmvliezen, ontwikkelingsachterstand, gewichts- en groeistoornissen en kans op een levensbedreigende coma. De behandeling is niet duur en bestaat door een eenvoudige suppletie van biotine; 10

Propionzuur acidemie

Dit is een deficiëntie van het enzym propionyl-CoA carboxylase zodat propionyl-CoA (afbraak product van valine en isoleucine) niet meer omgezet wordt naar methylmalonyl-CoA. Dit zorgt voor levensbedreigende episodes van ketose en acidose, gepaard gaande met fel braken. Biotinidase deficiëntie is ook een mogelijke oorzaak van milde toename van propionzuur daar biotinidase leidt tot multipele carboxylase deficiëntie (hoofdzakelijk 3methylcrotonyl CoA en propionyl CoA). De behandeling bestaat uit eiwitrestrictie; 11

MADD

MADD of glutaaracidurie type II. Dit is een accumulatie van korte-, middellange en lange keten acylcarnitines. De diagnose is niet evident daar de verhogingen meestal zeer matig zijn in vergelijking MCAD.22,36

2.1.3

Praktisch verloop bij en na afname staal

Tussen de derde en de vijfde levensdag wordt bloed afgenomen via hiel- of handrugprik, dat rechtstreeks gespot wordt op bloedkaarten (S&S 903) (Fig. 2.2). Bij voorkeur wordt de 13


bloedafname via een venepunctie op de handrug uitgevoerd, omdat het bij de hielprik moeilijker is om voldoende bloed te bekomen. Daarna worden deze bloedkaart afgeschermd van het licht gedroogd op kamertemperatuur en in een door het opsporingscentrum toegestuurde enveloppe verzonden (bijlage 1). Deze kaarten worden verstuurd naar één van de drie Vlaamse opsporingscentra. De drie Vlaamse opsporingscentra zijn het Provinciaal Centrum voor opsporing van Metabole Aandoeningen (PCMA) te Antwerpen, het centrum voor opsporing van congenitale metabole aandoeningen verbonden aan het AZ Sint-Jan AV en het Centrum voor de opsporing van congenitale metabole aandoeningen, verbonden aan de Kliniek voor Kinderziekten C. Hooft van het UZ Gent. Als de kaarten zijn aangekomen kunnen ze worden onderzocht op de verschillende aandoeningen. De meeste aandoeningen kunnen worden opgespoord met de tandem massaspectrometrie. Congenitale hypothyreoïdie en congenitale bijnierschorshyperplasie worden opgespoord met een immunologische techniek. Biotinidasedeficiëntie wordt opgespoord met een enzymatische test (bijlage 2). Jaarlijks worden er in het neonatale onderzoekingscentrum te Brugge ongeveer 10000 pasgeborenen gescreend. Dankzij de vooruitgang in de geneeskunde, kunnen steeds meer ziekten behandeld worden. Actueel wordt in Vlaanderen overwogen de screening uit te breiden met deze voor mucoviscidose en deze voor de ziekte van Duchenne.36

Figuur 2.2: Handrugprik.36

14


2.2

De ziekte van Duchenne

2.2.1

Inleiding

De ziekte van Duchenne dankt zijn naam aan de Franse neuroloog Guillaume Duchenne (1806 - 1875) die zich toelegde op het onderzoek naar spierziekten (Fig. 2.3). Hij was echter niet de eerste die deze ziekte beschreef. In 1838 en 1851 hadden 2 Italiaanse en één Britse arts de naar hem genoemde ziekte reeds beschreven.

Figuur 2.3: De Franse neuroloog Guillaume Duchenne.30

De ziekte van Duchenne of Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige, erfelijke Xgebonden recessief overgeërfde spierziekte en bijgevolg hoofdzakelijk bij jongens voorkomt. De ziekte kent een incidentie van 1 op 3500 tot 4000 pasgeborenen, zonder gekende etnische voorbeschikking. Het gaat om een mutatie in het gen dat codeert voor het eiwit dystrofine, wat aanleiding geeft tot progressieve spierzwakte.3,10,23,24,26,30,34

2.2.2

Het dystrofine gen

Het dystofine gen, gelokaliseerd op de korte arm van het X-chromosoom (genlocus Xp21), werd in 1986 geïdentificeerd (Fig. 2.4). Dit is het langste gen dat ooit beschreven is met zijn ongeveer 2,5 miljoen basenparen en 0,84 mm lengte. 13973 baseparen bevatten de genetische informatie die nodig is om het dystrofine eiwit te vormen. Binnen deze basenparen zijn er 79 afleesbare exonen.

15


Figuur 2.4: Lokalisatie van genlocus Xp21 op het X-chromosoom.31

Het dystrofine eiwit is opgebouwd uit 3685 aminozuren en is 125 nm lang. Dystrofine bevindt zich op de binnenkant van het celmembraan van de spiercel en vormt samen met de integrale membraaneiwitten sarcoglycanen en dystoglycanen, het dystrofineglycoproteïnecomplex (Fig. 2.5), dat de spiercel stabiliteit biedt via het cytoskelet en beschermt tegen schade bij spiercontracties. De C-terminus bindt aan dystrofineglycopreoteïnecomplex ter hoogte van het sarcolemma. De N-terminus van het dystrofine eiwit bindt aan F-actine. Dit eiwit komt tot expressie in de skeletspieren, hartspieren en de hersenen (in het cerebellum en de hersenschors). Patiënten met de ziekte van Duchenne kunnen geen dystrofine eiwit aanmaken waardoor de spiercellen schade kunnen oplopen bij samentrekkingen waardoor er spiercelnecrose ontstaat. Door deze continue beschadiging treedt er pseudohypertrofie op. Dit betekent de spiercellen vervangen worden door veten bindweefsel. Bij deze beschadiging van het spierweefsel komt het creatine kinase (CK) vrij, dat opgestapeld zit in de spiercellen.

16


Figuur 2.5: Lokalisatie van het dystrofine eiwit.32 DG: dystoglycanen, SG: sarcoglycanen

Bij 2/3 van de DMD patiënten is er een deletie in het dystrofine gen. Bij het groten deel van de overige patiënten wordt de ziekte veroorzaakt door een puntmutatie (die basensubstituties zijn). Bij de overige patiënten worden delen van het gen gedupliceerd. Door deze mutaties kan het leesraam voor het dystrofine gen verstoord zijn. Bij sommige mutaties kan het gen wel nog afgelezen worden maar is het leesraam gewijzigd (in-frame mutaties), waardoor het dystrofine langer of korter dan normaal of de hoeveelheid geproduceerd eiwit vermindert en daarom slechts deels functioneert. Dit leidt tot Becker spierdystrofie, de mildere vorm.1,9,10

17


2.2.3

Overerving

Duchenne spierdystrofie wordt overgeërfd op recessieve X-gebonden wijze. Het risico om de ziekte over te erven van een heterozygote moeder bedraagt 50% voor een jongen. De kans om ook draagster te worden is 50 % voor de meisjes (Fig. 2.6). Het risico verhoogt met ongeveer 7 % bij een moeder die al een zoon heeft met Duchenne spierdystrofie. Aangezien jongens hemizygoot zijn voor het X-chromosoom kan een beschadiging aan dit chromosoom niet worden gecompenseerd, waardoor hoofdzakelijk bij jongens deze ziekte tot expressie komt. Vrouwen daarentegen beschikken over twee X-chromosomen in al hun lichaamscellen. Het tweede X-chromosoom met het intacte dystrofine gen kan bij een heterozygote vrouw het defecte dystrofine-gen compenseren. Een mutatie in het X-chromosoom in de gameten van de vader, kan zowel door jongens als meisjes overgeërfd worden. Mogelijk kan tijdens de embryogenese een mutatie ontstaan waardoor bij zowel jongens als meisjes mosaïcisme voorkomt. Hierbij kunnen problemen van spierzwakte met wisselende ernst voorkomen.1,3,25,34

Figuur 2.6: Overervingpatroon van DMD.25

18


2.2.4

Klinisch verloop van de ziekte van Duchenne

Tot aan het 3de levensjaar, vertoont een DMD patiënt weinig klinische symptomen. Mogelijke, echter aspecifieke aanwijzingen zijn, moeilijkheden bij het beklimmen van de trap, opstaan via het Gowers manoeuvre en dikke kuitjes (Fig. 2.7). Deze symptomen manifesteren zich tijdens het 3de tot 5de levensjaar. Toch zijn dit geen typische DMD symptomen, waardoor het heel moeilijk is om in deze periode een juiste klinische diagnose te stellen. Vaak wordt in deze fase de diagnose gesteld door het vinden van een sterk gestegen creatine kinase spiegel bij een algemeen bloedonderzoek.

Figuur 2.7: Het Gowers manoeuvre.33

Tijdens de latere ontwikkeling van het kind is er een duidelijke vermindering van de spierkracht en begint de bewegingsbeperking. In de volgende periode van 6 tot 10 jaar men de spierkracht met toenemende snelheid afremmen. Deze periode wordt ook wel de overgangsperiode genoemd omdat de patiënt voor de eerste keer het verlies van zelfstandig lopen ervaart. Tijdens de volgende fase in het leven van een DMD patiënt is het sterke verlies van spierkracht dermate ernstig dat de patiënt in een rolstoel beland. Van 12 tot ongeveer 18 jaar is er een nog verdere toename van de spierzwakte. Dan beginnen de ademhalingsproblemen zich te manifesteren omdat ook de ademhalingsspieren worden aangetast. Doordat de patiënt constant in zijn rolstoel zit is er ernstige kans op scoliose. Men kan de DMD patiënt aansporen tot studies indien deze geen mentale achterstand heeft, want 20 tot 30 % van de DMD patiënten hebben een lichte mentale achterstand omdat het eiwit dystrofine ook in de hersenen deficiënt is. De laatste fase van hun leven wordt gekenmerkt door totaal verlies van loopvermogen en nood aan kunstmatig beademing doorheen een tracheostoma. Ook het eten en slikken verlopen steeds moeilijker door aantasting van de slikspieren. Meestal overlijden DMD patiënten aan ademhalingsproblemen of aan hartfalen. Ze sterven gemiddeld op een leeftijd van ongeveer 20 jaar, 19


afhankelijk van de aantal levensverlengende ingrepen gedurende hun levensjaren.3,10,23,34,35

2.2.5

Therapieën voor de ziekte van Duchenne

Ondanks het intense onderzoek naar een remedie tegen de ziekte van Duchenne, is er nog altijd geen echte, curatieve therapie. De behandelende arts kan alleen de levensduur van een DMD patiënt met enkele jaren verlengen dankzij een vroeg opgestartte supportieve behandeling. Zo is het aangewezen om bij een DMD kind de normale lichaamsactiviteiten zo lang mogelijk te behouden door het kind veel te laten bewegen onder leiding van een fysiotherapeut. Door nachtspalken te laten dragen is een vroege orthopedische behandeling uit te stellen. Ook een ontstekingsremmende behandeling met corticosteroïden wordt aangeraden om de achteruitgang van de spierfunctie enkele jaren uit te stellen. De bijwerkingen van corticosteroïden zijn wel een belangrijk aandachtspunt, zo moet men de DMD patiënt waarschuwen voor gewichtstoename en een aangepast dieet voorschrijven. Wanneer bij een latere leeftijd het lopen toch heel wat moeilijker wordt voor de DMD patiënt zijn operatieve ingrepen een optie (zoals ingrepen op de wervelkolom bij scoliose). Ook moet men opletten voor ademhalingsproblemen, gebitsontwikkelingsproblemen en aandoeningen aan de hartspier. Doordat de DMD patiënt in een rolstoel beland en toch zijn levenskwaliteit en verwachtingen wil verhogen, is het aangewezen om zelfs in dit stadium van de ziekte nog beroep te doen op een fysiotherapeut. Ondanks dit alles wordt de DMD patiënt toch aangeraden om in zijn leven normaal school te lopen.

Naast de levensverlengde en verbeterende behandelingen is er op medisch vlak al gedurende vele jaren onderzoek lopende naar een curatieve therapie. Dit begon met het transplanteren van spiercellen van een gezonde donor naar een DMD patiënt in de jaren tachtig. Deze transplantatie verliep niet zoals verhoopt want de meeste cellen necroseerden en verspreiden zich ook niet genoeg in de spieren. Ook tradt er een rejectie van de donorspiercellen op. Het huidig onderzoek naar spierceltransplantatie concentreert zich op transplantatie van cellen uit specifieke spiergroepen of met stamcellen. Om de immuunrespons te vermijden geeft men immuunsuppressieve medicijnen aan de DMD patiënt. 20


Een andere deel van het onderzoek richt zich op gentherapie. Deze is gebaseerd op het inbrengen van een vervangend DMD-gen in de spieren van de patiënt, om zo de productie van het dystrofine eiwit te herstellen. Dit blijkt heel moeilijk te zijn aangezien het dystrofine gen een van de grootste humane genen is. Als transporter om het gen ter plaatste te brengen, worden dikwijls virale vectoren gebruikt aangezien die zeer efficiënt zijn in het overbrengen van hun genetisch materiaal. Vaak zijn deze virussen afkomstig van de adenovirussengroep die ondermeer bekend zijn als veroorzakers van verkoudheden (Fig. 2.8).

Figuur 2.8: Gentherapie met virale vectoren.34

Aangezien ‘wild-type’ virussen maar een beperkte hoeveelheid genetisch materiaal kunnen dragen heeft men via biotechnologische middelen moeten sleutelen aan de virussen zodat ze de volledige genetische code van dystrofine kunnen bevatten. Andere nadelen met deze methode zijn de immuunrespons tegenover een adenovirus, beperkte verspreiding in het lichaam en weefselspecificiteit. Intussen hebben wetenschappers verbeterde vectoren (virusmantels) gevonden die geen immuunrespons uitlokken. Deze vectoren zijn klein waardoor ze heel gemakkelijk binnen kunnen dringen in het spierweefsels en hebben een voorliefde voor spierweefsel waar ze hun genetisch materiaal (cDNA) zullen overbrengen. Het enige nadeel is dat ze klein zijn en dat alleen aangepaste en verkorte versies van het DMD gen kunnen ingebracht worden. Het meest baanbrekend onderzoek tot nog toe werd uitgevoerd door de afdeling Humane Genetica van het LUMC in Leiden. Hier is men gestart met een volledig nieuwe therapie tegen de ziekte, exonskipping genoemd. Hierbij wordt gebruikt gemaakt van zogenaamde 21


antisense moleculen, kleine stukjes synthetisch RNA (antisenses oligonucleotiden (AON’s)) die zich kunnen hechten aan specifieke delen van het gen. Zo wordt het in elkaar zetten van de genetische code gemanipuleerd, door bepaalde exonen over te slaan. Daarmee kan men de genetische code beter aflezen tot productie van een grotendeels functionerend maar ingekort dystrofine in de patiënt. Hierdoor evolueert een Duchenne spierdystrofie naar een Becker spierdystrofie. Ook is uit onderzoek gebleken dat men geen dagelijkse inspuiting toe te dienen voor deze therapie. Een ander voordeel, zijn de carriers die de AON’s een betere binding induceren en efficiënter vervoeren doorheen de verschillende barrières van het spierweefsel. Om zoveel mogelijk spierweefsel te bereiken is het aangewezen om deze AON’s via intraveneuze inspuiting toe te dienen. Een nadeel van de intraveneuze toediening van AON’s is dat deze kunnen worden afgebroken worden in de bloedbaan alvorens ze de spieren bereikt hebben. Men hoopt dit probleem op te lossen door de ontwikkeling van meer beschermende carriers. Een tweede nadeel van deze therapie is dat de AON’s op maat van het genetische defect van de individuele patient dienen ontwikkeld te worden. Deze therapie dient nog uitgebreid getest te worden op efficiëntie en veiligheid alvorens zij algemeen toegepast kan worden.3,4,5,6,9,10,13,20,21,27,34

2.2.6

Psychologische en sociale aspecten bij de ziekte van Duchenne

Het psychologische aspect is voor een DMD patiënt zeer belangrijk aangezien dat ze geen volwaardig leven zullen hebben en iedereen die men kent zal moeten achterlaten. Als de DMD patiënt de leeftijd bereikt waarop hij bewust wordt van zijn ziekte is het aangewezen om een psycholoog te raadplegen. Ook de familie kan psychologische hulp gebruiken. Uit een psychologische studie is gebleken dat vele ouders hun reproductieve plannen zouden wijzigen en prenatale onderzoeken zouden ondergaan indien hun zoon een DMD patiënt zou zijn. Ouders waarvan bij hun zoon de diagnose Duchenne spierdystrofie wordt gesteld, zijn bijna steeds voorstander van een neonatale screening naar de ziekte van Duchenne. Belangrijk bij de organisatie van neonatale screening naar de ziekte van Duchenne is een goede informatie van de ouders doormiddel van folders, psychologische en medische ondersteuning. Bijzondere aandacht dient besteed te worden aan de moeder-kind relatie. Door een goede ondersteuning kan voorkomen worden dat een postieve screening de moeder-kind relatie verstoord. Tijdens pilootscreeningsprojec22


ten blijkt dat de moeder-kind relatie zelf versterkt kan worden en dit zonder negatieve invloed voor eventuele andere kinderen. Het financiële aspect bij de verzorging van een DMD patiënt speelt ook een belangrijke rol. Aangezien er veel medische en psychologische begeleiding is. Daarin tegen komt ook het financiële plaatje op aangezien dat er vele onderzoeken, supportieve therapieën nodig zijn en natuurlijk ook de hoge incidentie van DMD drijven de kosten op.15,17

2.3

Opsporen van de ziekte van Duchenne in een neonataal screeningsprogramma

2.3.1

Diagnose van Duchenne spierdystrofie

Bij prenatale diagnostiek zijn er twee soorten testen mogelijk. De vlokkentest, waarbij men via de buikwand of via de baarmoederhals foetale cellen uit de placenta haalt waarop men via moleculaier diagnostiek chromosoomafwijkingen kan bepalen. De test kan vanaf de 10de week van de zwangerschap worden uitgevoerd. Deze procedure heeft een risico van 1 tot 2 % op een miskraam. Eerst wordt het geslacht bepaald, indien het geslacht mannelijk is wordt de mutatie op het X-chromosoom opgespoord. Een andere prenatale test is de vruchtwaterpunctie. Dit kan vanaf de 14de tot 15de week. Het risico voor een miskraam is de helft lager dan bij de chorionvlokkentest. De prenatale screening is alleen mogelijk als men de in de familie voorkomende mutatie kent. Zij is dus alleen aangewezen in families met DMD patiënten. Na de prenatale diagnostiek komt de neonatale screening waarbij de creatine kinase (CK) wordt bepaald via een enzymatische methode. CK is bij DMD patiënt sterk verhoogd, doordat de spiercel kapot gaat door een deficiëntie van het eiwit dystrofine en waardoor CK vrijgesteld wordt. De CK bepaling dient bij een positieve screening gediagnostiseerd te worden via moleculaire diagnostiek (PCR of DNA-diagnostiek). Hierbij spoort men in het genlocus Xp21 deleties, duplicaties of frameshift mutaties op. Ook kan een Western Blotting uitgevoerd worden als immunobiochemisch onderzoek, men de verminderde aanwezigheid van het dystrofine eiwit in spiercellen van DMD patiënten kan aantonen.

23


Als er op latere leeftijd een klinisch vermoeden is van DMD, wordt eerst CK bepaald. Daarna gebruikt men elektromyogram (EMG) en magnetisch resonantie beeldvorming (MRI). Bij verdere diagnosticering wordt een spierbiopt genomen dat gekenmerkt wordt bij DMD patiënten door degenerende cellen en vervanging van spiervezels door veten bindweefsel (Fig. 2.9). Ook wordt op het spierbiopt dikwijls een immunohistochemische test uitgevoerd, waarbij met kleuring het dystrofine eiwit wordt opgespoord, die bij DMD patiënten ontbreekt. Als laatste wordt de moleculaire diagnostiek gebruikt. Naast de gerichte onderzoeken naar de ziekte van Duchenne bij een klinisch vermoeden is er ook een kans dat een DMD patiënt, die zich niet van zijn ziekte toestand bewust is, naar aanleiding van routineonderzoeken (CK bepaling) met de diagnose geconfronteerd wordt.3,10,23,26,34

Figuur 2.9: Histologisch preparaat van een spierbiopt met DMD waarvan vele spiercellen getransformeerd zijn naar bindweefsel of vetcellen.5

2.3.2

Testen voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne

De test bij de neonatale screening voor de ziekte van Duchenne is de enzymatische creatine kinase bepaling. Doordat bij DMD patiënten de spiercellen kapot gaan komt creatine kinase uit de spiercellen vrij in het bloed.

24


2.3.2.1

Algemeen

Creatine katalyseerd de omzetting van ATP en creatine naar ADP en fosfocreatine (en omgekeerd) (Fig. 2.10).

ATP + creatine ' ADP + fosfocreatine Figuur 2.10: De katalysatiereactie voor CK.2

Het enzym is dimerisch en bestaat als iso-enzymes: MM (spieren), MB (hart) en BB (hersenen). Naast de cytoplasmatische vorm van CK, bestaat er ook nog mitochondriaal CK. Het enzym is in staat om een fosfaatgroep van creatinefosfaat over te brengen naar ADP, waardoor ATP en creatine ontstaan, waarbij de ATP gebruikt wordt als energiebron voor de spieren. Het enzym komt overal in de spieren voor zodat het enzym een goede parameter is voor spierweefselbeschadiging zowel bij pathogene (hartinfarct, hersenletsel) situaties als bij niet-pathogene (arbeid, intramusculaire injectie) situaties. Het is van klinisch nut bij of hartziekten (waar CK een gevoelige en vroege marker is voor een myocardinfarct). Bij de ziekte van Duchenne is de CK concentratie in serum 20 tot 100 keer hoger dan bij normale individuen in de beginfase van de ziekte. Naarmate meer spierweefsel vervangen wordt door bindweefsel zal de plasmaspiegel van CK dalen.

2.3.2.2

Creatine kinase bepaling

De enzymatische bepaling van CK in neonatale screeningsstalen steunt op volgende reacties:

CK creatinefosfaat+ ADP ←⎯⎯→ creatine + ATP HK glucose + ATP ←⎯⎯→ glucose-6-P + ADP

G6P - DH glucose-6-P + NADP+ ←⎯ ⎯ ⎯ ⎯→ gluconate-6-P + NADPH + H+ 25


Figuur 2.11: Reactie voor bepaling van CK.2

Als starters van de reactie (Fig. 2.11) voegt men essentiële kationen zoals Mg2+, Ca2+ en Mn2+ toe. Doordat CK snel geinactiveerd wordt door oxidatie in het actieve centrum, kan men voor reactivatie gebruik maken van N-acetylcysteïne (NAC). Klassiek wordt de CK reactie gemeten door het opvolgen van de absorbantie bij 340 nm en 546 nm. Doordat NADPH ook fluorescerende eigenschappen heeft kan men de reactie ook opvolgende door meting van fluorescentie. De reactie wordt afgelezen bij een excitatiegolflengte van 355 nm en een emissiegolflengte van 460 nm door middel van fluorometrie. Bij sommige verbindingen kan de geabsorbeerde energie gebruikt worden om een elektron van een in een aangeslagen toestand te brengen (te exciteren). Wanneer het elektron terugvalt naar de grondtoestand, wordt licht van een andere langere golflengte uitgezonden. Dit noemen we fotoluminescentie. De verbinding gaat dan als een lichtbron fungerende die licht naar alle richtingen uitstraalt. Bij fotoluminescentie is de energie van het uitgestraalde licht kleiner dan de energie van het geabsorbeerde licht. Daarom is de golflengte van het uitgestraalde licht langer dan de golflengte van het geabsorbeerde licht. Naar de tijd verstrijkt totdat een gedeelte van het geabsorbeerde licht wordt uitgezonden, deelt men fotoluminescentie op in fosforescentie en fluorescentie. Bij fluorescentie is de tijd die verstrijkt totdat een gedeelte van het geabsorbeerde licht weer uitgezonden is erg kort (10-9 – 10-6 seconden). Een voorbeeld van een toepassing in de klinische chemie van fluorescentie is NADH en NADPH bepaling bij sommige enzymactiviteitsbepalingen. Deze bepaling wordt gemeten met de fluorometer. (Fig. 2.12).

26


LEGENDE: X: lichtbron (xenon lamp) Ex: excitatie-monochromator C: cupje S: spiegel Em: emissie-monochromator F: fotomultiplicator V: versterker

Figuur 2.12: Schematische voorstelling van de fluorimeter.2

De hoeveelheid of het signaal van NADPH is recht evenredig is aan de CK activiteit. Zo mag men zeggen dat de hoeveelheid NADPH die gemeten wordt, de activiteit is van CK. 2.3.2.3

Mogelijke interferenties

De mogelijk interferenties bij de CK bepaling zijn hemolyse, adenylaatkinase uit rode bloedcellen en quenching. Uit studies is gebleken dat hemolyse op zich geen invloed heeft op de CK bepaling. Adenylaatkinase uit de rode bloedcellen genereert ATP in de aanwezigheid van ADP (ADP ' ATP + AMP), wat een valse verhoogde CK activiteit kan simuleren. Daarom is het aangewezen om een adenylaatkinase inhiberende stof te gebruiken bij de CK bepaling. Hiervoor zijn AMP of NaF en diadenosine pentafosfaat geschikt. Ook kan er interferentie optreden in de cupjes tijdens de bepalingen, door quenching waarbij de fluorescentieopbrengst kan verminderen doordat een gedeelte van de energie aanwezig in de geëxciteerde moleculen niet omgezet wordt in fluorescentie. De aanwezigheid van andere stoffen (verontreiniging) zorgt voor verminderde fluorescentie. Quenching wordt vaak veroorzaakt door stoffen die het licht absorberen van golflengten waarbij de fluorescerende stof geëxciteerd kan worden of waarbij de stof fluoresceert. De fluorescentieopbrengst is door quenching nooit geheel constant. Daarom is een voorzuivering noodzakelijk.

27


Naast de interferenties op de bepaling zelf is het mogelijk dat het ontsmettingsmiddel dat bij de staalafname wordt gebruikt een mogelijke interferentie geeft door denaturatie van eiwitten (dus ook CK). Deze interferentie resulteert in vals lage waarden.2,7,8,11,12,14,16,18,19,28

2.3.3

Medico sociale discussie

Hoort het opsporen van de ziekte van Duchenne wel thuis in een neonataal screeningsprogramma? Dit is een discussiepunt. Voor we een standpunt kunnen innemen is het nodig om de pro- en contra discussiepunten even te overlopen. Ten eerste overlopen we de zeven voorwaarden die nodig zijn voor een aandoening om in een neonataal screeningsprogramma op genomen te worden: De eerste voorwaarde voldoet, aangezien een DMD patiënt maar 20 jaar leeft; De tweede voorwaarde voldoet eveneens aangezien de klinische symptomen maar op een leeftijd van ongeveer drie jaar worden ontdekt; De derde voorwaarde voldoet eveneens aangezien er een hoge prevalentie is van 1/3500 tot 1/4000 pasgeborenen; De vierde voorwaarde voldoet eveneens aangezien er een betrouwbare test is (creatine kinase bepaling); De test is aanvaardbaar voor de patiënt en/of zijn ouders en daarmee is de vijfde voorwaarde ook ingevuld; Er zijn genoeg methoden om de diagnose te stellen (DNA-diagnostiek), waarmee ook de zesde voorwaarde is ingevuld; De zevende en laatste voorwaarde gaat over efficïente behandeling. Aangezien er op dit moment alleen maar een supportieve therapie bestaat, die de levenskwaliteit van DMD patiënt matig kan verbeteren, maar er geen curatieve therapie bestaat die de levensverwachting zal doen stijgen, is de zevende voorwaarde niet ingevuld.

28


Ten tweede zijn ook de financiële aspecten in een neonataal screeningsprogramma belangrijk. Uit onderzoek is gebleken dat de kostprijs van een Duchenne spierdystrofie neonatale screening niet veel meer bedraagt dan de kosten voor andere metabole aandoening wat betreft de laboratoriumkosten. De globale kosten evaluatie van een screeningsprogramma wordt uitgedrukt in kost per gewonnen quality adjusted life year (QUALY’s). Gelet op de beperkte levensverwachting van de DMD patiënt en de beperkte inpact van de huidige therapie (maximale ziektestabilisatie) is een vroege, neonatale screening noodzakelijk om een optimaal resultaat te bekomen. Op dit ogenblik zijn er nog geen studies bekend die deze berekening uitgevoerd hebben. Een Canadese studie berekende in 1993 dat de kost ter detectie van een DMD patiënt op 83000 Canadese dollar kwam en dat de kost ter preventie van een tweede geboorte van een DMD patiënt in een familie op 172000 Canadese dollar kwam.15,17,36

2.3.4

Besluit

Als we de pro- en contra discussiepunten tegen over elkaar plaatsen, is het duidelijk dat een neonatale screening, met de huidige gekende medische therapieën, met overtuigende argumenten kan ingevoerd worden. Als er ooit een echte volwaardige curatieve therapie zou komen, zou de screening naar de ziekte van Duchenne in een neonataal screeningsprogramma

grondig

overwogen

moeten

worden.

29

Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Materialen en methoden

3

Materialen en methoden

3.1

Materialen en reagentia

3.1.1

Materialen

-

Millipore Multiscreen®-HV plates

Multiscreen®-HV plate For In-vitro Diagnostic use Cat. Num. MAHVN4550 LOT F6KN76148 -

Eppendorf Multipette® plus

-

Thermo Heraeus Megafuge 1.0R

-

Memmert incubator

-

Delfia® plateshake 1296-003

-

Thermo Finnpipette® 1-5 mL en thermo Finntip®

Thermo Finntip® LOT 7047MO Cat. No. 9402050 Volume Range 1-5 mL -

Pur-Zellin® watjes

Hartmann Celstofdeppers op rol 4 cm x 5 cm 2 x 500 PCS LOT 751210282 Ref 143 212 30


-

Re-sealable tape 1450-462

Perkin Elmer, Turku, Finland LOT 390913 -

Millipore vacuümmanifold en vacuümpomp

-

Cliniplates 96 wells

Thermo scientific 50 pcs LOT 7339CO Cat. No. 9502227 -

Fluorometer Wallac Victor2TM D 1420 multilabel counter

PE, Turku, Finland -

Modular

Analytics Roche® Diagnostics P-module -

Wallac DBS Puncher (Delfia® Dried Blood Spot Puncher)

PE, Turku, Finland -

Neonatale screeningskaarten

Schleicher & Schuell NV/SA, Gent, België S&S 903

3.1.2

-

Reagentia

Natriumfluoride (NaF) 1 kg

VWR international prolabo Batch 07F290005 31


Ref 27860.297 Pached 06.2007 Until 03.2012 Toxic (R: 25 - 32 - 36/38; S: 22 - 36 - 45) -

CK reagens kit

Reagens MR, Mannheim, BRD Roche/Hitachi cobas® LOT 696 834-01 Reagens 1: 6 x 60 mL Reagens 2: 6 x 15 mL (bijlage 3). -

Ethanol (absolute) 2,5 L

Merck, product MR (pro analysi) LOT K37 125 183 714 Licht ontvlambaar (R: 11, S: 7 -16) -

Creatine kinase

Standaard enzymatisch concentraat Roche® Diagnostics GmbH Creatine kinase from rabbit muscle 100 mg LOT 12881523 Ref 10 127 566 001

32


3.2

Methoden

3.2.1

Methoden

- Eenstapsreactie 1. Punchen van screeningskaarten, standaarden en controles in 96 wellplaat, 2.

bereiding werkreagens (18 mL R1 + 3,6 mL R2 + 2,1 mL 1,05 % NaF), verse bereiding en 5 minuten laten staan,

3.

75 µL CK werkreagens in elke well,

4.

afdekken met plate sealer,

5.

schudden op 30°C gedurende 30 minuten (900 RPM stand 3),

6.

150 µL EtOH bijvoegen in elke well,

7.

plaat 35 seconden op plaatschudder zetten,

8.

15 minuten laten staan,

9.

plaat aflezen met fluorometer,

10.

plaat centrifugeren,

11.

plaat aflezen met fluorometer.

- Tweestapsreactie 1. Punchen van screeningskaarten, standaarden en controles in 96 wellplaat, 2.

bereiding werkreagens A (9 mL R1 + 2,1 mL 250 mmol/L NaF), verse bereiding,

3.

50 µL CK werkreagens in elke well,

4.

afdekken met plate sealer,

5.

pre-incubatie door plaat schudden op 30°C gedurende 30 minuten,

6.

plaat afzuigen met millipore plaatafzuigsysteem,

7.

in tweede wellplaat word het tweede werkreagens B (R2) bijgevoegd (75 µL),

8.

incubatie op 30°C gedurende 25 minuten (zonder schudden), 33


9.

na incubatie, 150 µL EtOH in elke well,

10.

plaat 5 minuten schudden (uit incubator),

11.

plaat 15 minuten laten staan,

12.

plaat aflezen met fluorometer.

3.2.2

Standaarden en controlestalen

De standaarden werden handmatig aangemaakt door bloed met gekende CK concentratie op bloedkaarten te spotten (bijlage 4). De interne controles werden ook handmatig aangemaakt en dit door bloed met gekende CK concentraties op bloedkaarten te spotten. De externe controles werden verkregen bij het Newborn Screening Quality Assurance Program, CDC, Atlanta, USA (bijlage 5).

3.2.3

Op punt stellen van de methode

We starten met de eenvoudigste werkwijze, een eenstapsreactie. Bij de eerste proeven werd het al snel duidelijk dat we een andere methode dienden te zoeken, om de beperkingen die de eenstapsreactie hinderden op te lossen. We experimenteerden met een verschil in reagentia/ethanol verhouding, verschillende incubatietijden, eventueel centrifugeren na toevoeging van ethanol, verschillende natriumfluoride concentraties, blanco’s bereid uit heparinebloed, UV en fluorescentie aflezingen en de eenstapsreactie vergeleken met de tweestapsreactie.

3.2.4

Validatie van de gekozen methode

Na het onderzoek naar de meest optimale reactieomstandigheid besloten we dat de tweestapsreactie, de beste resultaten leverde. Deze methode werd gevalideerd aan vooropgestelde eisen, waaraan een gevalideerde methode moet voldoen.

De prestatiekenmerken waaraan een gevalideerde methode moet aan voldoen: 34


- Herhaalbaarheid (intra-run); De precisie die verkregen wordt bij de uitvoering van alle betreffende metingen door dezelfde analist, met dezlfde meetapparatuur, op zo dicht mogelijke tijdstippen. - Reproduceerbaarheid (between-run); De precisie die verkregen wordt bij uitvoeren van alle betreffende metingen onder variabele omstandigheden (bijvoorbeeld verschillende analist, met verschillende apparaten en batches reagentia/standaarden, op verschillende tijdstippen met grote tussenpozen). De minimale eis dat vooropgestelt wordt om de reproduceerbaarheid te bepalen is het variëren van de factor in tijd, m.a.w. dat betreffend analysen op verschillende dagen en in verschillende analysereeksen worden uitgevoerd. - Juistheid; De mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van een reeks meetwaarden en de werkelijk meetwaarde of de als werkelijk aangenomen waarde van een aangenomen grootheid. - Eigen referentiewaarden; - Meetbereik; - Lineariteit; De eigenschap dat binnen vastgestelde grenzen er een rechtlijnig verband bestaat tussen de respons en de hoeveelheid (concentratie) van de te bepalen component. - Stabiliteit.

35

Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Resultaten en discussie

4

Resultaten en discussie

4.1

Op punt stellen van de methode

4.1.1

Verschil in reagens/ethanol verhouding

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: 75/75 en 75/150.

Waarden:

(bijlage 6).

Interpretatie: De verhouding van 75/150 levert betere resultaten op. Ethanol wordt gebruikt voor de reactie te doen stoppen en om eiwitten neer te slaan.

4.1.2

Verschil in incubatieverschillen

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: 30 minuten op 30 °C en 20 minuten op 35 °C.

Waarden:

(bijlage 7).

Interpretatie: De langste durende van de 2 geteste verhoudingen is de betere, aangezien dat het creatine kinase eerst uit de bloedspot moet worden geëlueerd en hoe langer de bloedspot kan elueren hoe meer creatine kinase vrijkomt voor de bepaling. Waardoor de reproduceerbaarheid van de bepaling beter wordt.

4.1.3

Centrifugeren

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: centrifugeren voor aflezing en niet centrifugeren na alcoholprecipitatie.

Waarden:

(bijlage 8).

36


Interpretatie: Ondanks we na centrifugeren een beter resultaat zou kunnen bekomen door quenching, bleek na onderzoek dat de beste resultaten behaald werden zonder het centrifugeren. Dit is te verklaren door het langere wachten bij aflezing of door verdamping van ethanol.

4.1.4

Fluorescentie versus UV aflezing

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: aflezen met fluorometer en aflezen met UV-spectrofotometer.

Waarden:

(bijlage 9).

Interpretatie: De betere correlatie van aflezing met fluorometrie is vermoedelijk te danken aan de eliminatie van een pipeteerstap of doorzuigstap. Voor een fotometrische aflezing mag er namelijk geen bloedspot aanwezig zijn in de reactiewell (geen doorgang van licht). Een fotometrische bepaling is alleen mogelijk door het afpipetteren van het reactiemengsel in een nieuwe microtiterplaat. Het afpipetteren of isoleren van het reactiemengsel door doorzuiging is een belangrijke bron van bijkomende variabiliteit.

4.1.5

Verschil in natriumfluoride concentraties

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: 25 mmol/L, 125 mmol/L en 250 mmol/L.

Waarden:

(bijlage 10).

Interpretatie: De beste resultaten bekomen we met een 250 mmol/L concentratie van NaF. Het natriumfluoride inhibeerd adenylaatkinase, die een interferentie is bij de creatine kinase bepaling.

37


4.1.6

Heparine standaarden versus EDTA standaarden

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: Heparine standaarden en EDTA standaarden.

Waarden:

(bijlage 11).

Interpretatie: De EDTA standaarden zijn beter aangezien we hier werken met gewassen rode bloedcellen en eenzelfde hoeveelheid kunstmatig aangemaakt serum (fysiologisch water) met gekende CK concentratie. Bij het maken van de heparine standaarden mengen we een gekende hoeveelheid CK-oplossing in het vol bloed. Mogelijk wordt de oplossing niet optimaal verspreid ondanks het langdurig mengen van de standaarden of bevinden er zich inhiberende stoffen in het bloed.

4.1.7

Blanco’s vergelijken

Werkwijze:

In een eenstapsreactie, werden deze verhoudingen uitgetest: EDTA blanco spot en ongespotte bloedspot.

Waarden:

(bijlage 12).

Interpretatie: De ongespotte blanco’s zijn beter aangezien deze echt een blanco zijn en dus onmogelijk CK bevatten.

4.1.8

Eenstapsreactie versus tweestapsreactie

Werkwijze:

Hier werden de eenstapsreactie als de tweestapsreactie vergeleken met elkaar.

Waarden:

(bijlage 13).

38


Interpretatie: De tweestapsreactie is beter aangezien de bloedspot beter kan elueren in de eerste incubatiestap. Tijdens deze stap is ook reactivatie van CK mogelijk alvorens de kleurreactie te starten in stap twee.

4.1.9

Besluit

Op basis van de correlatie waarden die we uitkwamen bij het op punt stellen van de methode, werd er gekozen voor een definintief protocol. Deze is de tweestapsreactie die beschreven staat bij de methoden.

4.2

Validatie van de gekozen methode

4.2.1

Intra-run

Werkwijze:

één zelfde staal werd 21 maal in één run gemeten.

Waarden:

(bijlage 14)

Interpretatie: We besluiten dat de CV % die onder de 10 % ligt een aanvaardbare intra-run (herhaalbaarheid) levert.

4.2.2

Between-run

Werkwijze:

één zelfde staal werd 21 maal gemeten in evenveel runs.

Waarden:

(bijlage 15).

Interpretatie: We besluiten dat de CV % die onder de 10 % ligt een aanvaardbare between-run (reproduceerbaarheid) levert.

39


4.2.3

Juistheid

Werkwijze:

CDC waarden vergelijken met de zelf gemeten waarden.

Waarden:

(bijlage 16).

Figuur 4.1: Grafiek juistheid.

Interpretatie: De correlatie moet de 1 benaderen, de correlatie hier is 0,991 (Fig. 4.1) en dit is goed. We stellen wel vast dat we een belangrijke positieve bias vinden in de lagere concentraties. De zelf bereidde standaarden laten dus niet toe om kwantitatief te werken.

4.2.4

Eigen referentiewaarden

Werkwijze:

698 mannelijke pasgeborenen werden prospectief onderzocht. Daar onze

methode niet kwantitatief is, worden de waarden in ‘counts’ uitgedrukt. De bekomen resultaten zijn normaal verdeeld (Fig. 4.2). Waarden:

(bijlage 17)

40


180 160 140

Frequency

120 100 80 60 40 20 0 1000

1400

1800

2200

2600

3000

3400

3800

ck_neonat

Figuur 4.2: Histogram.

Resultaat: De 99ste percentieel bedraagt 3179 counts. Een andere frequente gebruikte cut-off is het som van het gemiddelde en drie keer de standaarddeviatie en deze bedraagt 4722 counts.

4.2.5

Reproduceerbaarheid van de externe controles

Werkwijze:

Waarden vergelijken van de externe controles (CDC) over 21 runs.

Waarden:

(bijlage 18).

41


counts uitgezet volgens bepaling van CDC 7000 6000

counts

5000 base low intermediate high

4000 3000 2000 1000 0 0

5

10

15

20

bepalingen Figuur 4.3: Grafiek controle referentiewaarden.

Interpretatie: We kunnen besluiten dat de CDC controles zich onder de 10 % van de varantiecoëfficient bevinden (Fig. 4.3).

4.2.6

Meetbereik

Werkwijze:

Door een reeks stalen met een zeer hoge gekende CK concentratie te meten, willen we een bovengrens bepalen.

Waarden:

(bijlage 19).

We bepalen voor deze bepaling enkel de bovengrens, omdat voor de test een verhoogde creatine kinase concentratie dient opgespoord te worden.

42


Meetbereik - BOVENGRENS BEPALING 12000

Counts

10000 8000 6000 4000 2000 0 0

2000

4000

6000

8000

10000

Concentratie verondersteld

Figuur 4.4: Grafiek bovengrens.

Interpretatie: We kunnen besluiten dat hogere concentraties aan creatine kinase de curve minder laat stijgen. We kunnen de bovengrens op 8000 counts situeren (Fig. 4.4).

4.2.7

Lineariteit

Werkwijze:

We hebben de gemeten concentraties van de standaarden uitgezet ten opzichte van de bekomen counts.

Waarden:

(bijlage 20).

43


y = 4,0244x + 2609,7 R2 = 0,9983

Counts

Lineariteit 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 0

125

250

375

500

625

750

875

1000

1125

1250

Concentratie CK (U/L)

Figuur 4.5: Grafiek lineariteit.

Interpretatie: We kunnen besluiten dat er een rechtlijnig verband is tussen de counts en de concentraties van creatine kinase in plasma (Fig. 4.5).

4.2.8

Specificiteit en sensitiviteit van de screening

We kunnen de specificteit en de sensitiviteit niet berekenen aangezien we niet beschikken over de diagnose van DMD bij pasgeborenen. Daarenboven kan de specificiteit en sensitiviteit slecht bepaald worden op een voldoende grote groep neonatie in functie van de frequentie van de aandoening. Hiervoor een een grootschalig prospectief onderzoek nodig.

44


4.2.9

Stabiliteit

Werkwijze:

We hebben drie verschillende stalen op drie verschillende dagen gemeten en elke van deze drie stalen opgeslagen in vier verschillende temperaturen (oven, kamertemperatuur, koelkast en diepvries).

Waarden:

(bijlage 21).

Interpretatie: We kunnen besluiten dat de creatine kinase in de oven, kamertemperatuur, koelkast en in de diepvries stabiel is aangezien de variantiecoëfficient steeds onder de 10 % ligt. De stabiliteit bij koelkasttemperatuur ligt onder een variantiecoëfficient van 15 % wat nog aanvaardbaar is. Door de beperkte tijdspanne kon de stabiliteit niet gevalideerd worden voor een langere periode. Dit verklaart mede de goede resultaten bij alle vier de temperaturen.

45

Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Conclusie

5

Conclusie

Een enzymatische creatine kinase bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne, werd op punt gesteld. Hieruit is gebleken dat we betere resultaten bekomen met een 1/2de reagens/ethanol verhouding, 30 minuten op 30 °C incubatie, aflezen voor centrifugatie van de microtiterplaat, de test af te lezen door fluorescentie, een inhiberende 250 mmol/L NaF concentratie gebruiken voor adenylaatkinase, EDTA gewassen standaarden en ongespotte blanco’s te gebruiken. Ook werd de tweestapsreactie beter bevonden dan de eenstapsreactie. Op basis van de correlatie waarden die we uitkwamen bij de op punt stelling van de methode, werd er gekozen voor een definitief protocol: de tweestapsreactie met fluorometrische aflezing. Nadat de methode op punt gesteld werd, werd deze gevalideerd. Hieruit blijkt dat zowel de intra-run, between-run, juistheid, de eigen referentiewaarden, reproduceerbaarheid van de externe controles, meetbereik, lineariteit en stabiliteit onder de voorop gestelde waarden lagen. De methode is niet kwantitatief aangezien we een positieve bias bij de zelf gemaakte standaarden bekomen. Ideaal zou dus externe standaarden zijn, al zijn deze niet beschikbaar. Dus is een verdere op punt stelling voor de aanmaak van standaarden nodig. Een te evalueren methode hierrond is dat men niet de theoretische creatine kinase concentratie moet gebruiken, maar wel de gemeten creatine kinase concentratie in het plasma van de standaarden. Als eindbesluit kunnen we stellen dat de methode voor het maken van de standaarden verder moet op punt gesteld worden. Ideaal hiervoor zouden externe standaarden op de markt moeten komen. Zo is neonatale screening naar de ziekte van Duchenne te overwegen indien er een curatieve therapie komt.

46


Literatuurlijst Boek 1

Carey, J., White, B. (2007). Medical Genetics, third edition. Mosby: Elsevier.

2

Dr. van Eerd, J. P. F. M. (1996). Klinische chemie voor analisten, Deel 1 en 2. Bohn Stafleu van Loghum.

3

Hauser, K., Longo, B., Jameson, F. (2007). Harrison’s, Principles of Internal Medicine. Mc Graw Hill: Medical.

Artikels 4

Aartsma-Rus, A., ea. (2003). Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscles cells from six differend DMD patients. Human Molecular Genetics, 12, 907 – 914.

5

Aartsma-Rus, A., ea. (2004). Antisense-Induced multi exon skipping for DMD. Makes more sense. Am. J. Hum. Genet., 74, 83 - 92.

6

Bertoni, C. (2008). Clinical approaches in the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) using oligonucleotides. Frontiers in Bioscience, 13, 517 - 527.

7

Bradley, D. M. (1993). Experience with screening newborns for Duchenne muscular dystrophy in Wales. BMJ, 306, 357 – 360.

8

Dellamonica, C. (1983). Screening for neonatal DMD bij bioluminescence measurment of creatine kinase in a blood sample spotted on paper. Clin. Chem., 29, 161 – 163.

9

De Winter, C. L. (2007). Minder is meer. Analyse, 9, 192 – 196.

10

Dr. Faber, C.G., ea. (2004). Klinische genetica (41): Duchenne-spierdystrofie. Patient Care, 31, 402 – 408.

11

Drousiotou, A. (1998). Neonatal screening for Duchenne Muscular Dystrophy: a novel semiquantitative application of the bioluminescence test for creatine kinase in a pilot national program in Cyprus. Genetic Testing, 2, 55 – 60.

12

Greenson, J. K. (1989). The effect of hemolysis on creatine kinase determination. Arch. Pathol. Lab. Med., 113, 184 – 185.

13

Keeson, J., ea. (2007). ‘Fietsen met een ingekorte ketting is beter dan helemaal niet te kunnen fietsen’. Contact, 10, 26 -28. 47


14

Orfanos, A. P. (1984). A rapid screening test for Duchenne muscular dystrophy using dried blood specimens. Clinica Chimica Acta, 138, 267 – 274.

15

Parsons E.P. (2002). Newborn screening for Duchenne muscular dystrophy: a psychosocial study. Arch. Dis Child Fetal Neonatal, 86, F91 – F95.

16

Rosano, T. G. (1976). Evaluation of Adenosine 5’-Monophosphate and Fluoride as Adenylate kinase inhibitors in the creatine kinase assay. Clin. Chem., 22 , 1078 – 1083.

17

Rosenberg, T. (1993). Cost-effectiveness of neonatal screening for Duchenne Muscular Dystrophy – How does this compare to existing neonatal screening for metabolic disorders? Soc. Sci. Med., 37, 541 – 547.

18

Scheuerbrandt, G. (1986). Screening for Duchenne Muscular dystrophy: an improved screening test for creatine kinase and its application in an infant screening program. Muscle & nerve, 9, 11 – 23.

19

Tippet, P. A. (1982). Creatine kinase activity in the detection of carriers of DMD: comparison of two methods. Clinica Chimica Acta, 121, 345 – 359.

20

Van den Eynde, H. (2007). Genpleister stopt spierziekte. De Standaard, donderdag 25 oktober 2007, Wetenschap/gezondheid.

21

Van Deutekom, C. T. (2003). Advances in Duchenne Muscular Dystrophy gene therapy. Nature, 4, 774 – 783.

22

Verweire, E. (2008). Preventieve geneeskunde van de bovenste plank. Eos Magazine, 3, 102 – 105.

Internet 23

Anoniem, Klinisch verloop van DMD [www], 2007, Duchenne parent project. URL: http://www.duchenne.nl/duchenne114.html Gezien d.d. 6 oktober 2007.

24

Anoniem, Duchenne Muscular Dystrophy [www], 2007, How stuff works. URL: http://healthguide.howstuffworks.com/duchenne_muscular_dystrophy_dictionary. htm Gezien d.d. 6 oktober 2007.

25

Anoniem, About X-Linked conditions [www], 2007, CDC. URL: http://www.cdc.gov/ncbddd/single_gene/X-link.htm 48


Gezien d.d. 6 oktober 2007. 26

Anoniem, Newborn screening for Duchenne muscular dystrophy Workgroup: Lay Report [www], CDC. URL: http://www.cdc.gov/ncbddd/duchenne/documents/NBS_lay_Report.pdf Gezien d.d. 6 oktober 2007.

27

Anoniem, Exon skipping, an example [www], 2006, Duchenne forschung. URL: http://www.duchenne-forschung.de/cincinnati-2006-UK.pdf Gezien d.d. 6 oktober 2007.

28

Anoniem, Two tier CK & CKMB Assay for Duchenne Muscular Dystrophy in dried blood spots by fluorometry [www], 2007, APHL. URL: http://www.aphl.org/conferences/2007-conferences/2007nbsgts/Documents/Muscular-Dystrophy.pdf Gezien d.d. 6 oktober 2007.

29

Anoniem, bioxys[www], 2007, Bioxys. URL: http://www.bioxys.com/images/7_59.jpg Gezien d.d. 6 oktober 2007.

30

Anoniem, Duchenne on Wikipedia [www], 2007, Wikipedia. URL: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bb/Duchenne_de_Boulo gne_3.jpg/433px-Duchenne_de_Boulogne_3.jpg Gezien d.d. 6 oktober 2007.

31

Anomiem, Genetic Home Reference [www], 2007, Genetic Home Reference. URL: http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/dmd.jpeg Gezien d.d. 6 oktober 2007.

32

Anoniem, Muscular dystrophy [www], 2007, Society for Neuroscience. URL: http://www.sfn.org/SiteObjects/published/0000BDF20016F63800FD712C3158BA 55/0000BDF200000625010EBEBCAE379706/file/bb_image_large.jpg Gezien d.d. 6 oktober 2007.

33

Anoniem, Medkaau [www], Medkaau. URL: http://www.baillement.com/image-bis/londe-duchenne.gif Gezien d.d. 6 oktober 2007. 49


34

Darras, T. B., Clinical features and diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy [www], August 2007, UpToDate®. URL: http://www.uptodateonline.com/utd/topic.do?TopicKey=ped_neur/11251&vie... Gezien d.d. 27 maart 2008.

35

Garcia, S., Duchenne Muscular Dystrophy [www], 2007, CDC. URL: http://www.cdc.gov/excite/ScienceAmbassador/ambassador_pgm/lessonplans/G arcia%20MD.ppt Gezien d.d. 6 oktober 2007.

36

Vlaamse neonatale werkgroep, Draaiboek: neonatale opsporing van hyperfenylalaninemie (PKU), congenitale hypothyreoidie (CHT) en congenitale bijnierhyperplasie (CAH) [www], 2007, Afdeling preventie en sociale gezondheidszorg. URL: http://www.zorg-engezondheid.be/UploadedFiles/Preventie/K...20november%202005%202.pdf Gezien d.d. 6 oktober 2007.

Bijlagen 50


51

Bijlage 1 – Neonatale screeningskaarten

52

Bijlage 2 – Testen bij neonatale screening

Aandoeningen

Opsporen van ... Neonataal hTSH

CHT (congenitale

hypo- (human

thyreoïdie)

Techniek

Incidentie

Immunologisch

1/3000 – 1/4000

thyroid

stimulating

hor-

moon) CAH

(congenitale Neonataal

bijnierhyperplasie)

17-OH- Immunologisch

1/12000 – 1/13000

progesterone

Biotinidase deficiën- Biotinidase

Enzymatisch

1/40000 – 1/100000

tie Fenylketonurie

Fenylalanine

MSUD

Leucine, valine

Vergelijken met in- 1/10000 – 1/20000 terne

standaarden

(bepaald met MCAD

C6, C8, C10:|

MADD

C8, C10 (C5, C14,

MSMS)

1/100000

LC1/18000 niet gekend

C14:|) PA MMA IVA Glutaaracidurie I

C3 C3 – CD3DC C5 C5DC

1/100000 1/40000 1/50000 1/50000

53

Bijlage 3 – Bijsluiter CK reagens

54

Bijlage 4 – Aanmaak van standaarden

Aanmaak van EDTA standaarden 5x wassen:

-

5 minuten centrifugeren

-

plasma verwijderen

-

5x wassen met FW

-

witte plak verwijderen

-

centrifugeren

-

FW verwijderen

Dubbele concentratie, vooraf gemaakte en gekende CK oplossingsreeks bij deze gewassen rode bloedcellen doen, want je verdunt ½ keer. Deze vol bloed oplossing spotten op bloedkaarten, door 50 µL van de vol bloed oplossing te spotten. Laat ze drogen op kamertemperatuur en uit het licht. Bewaar ze bij -20°C.

Aanmaak van heparine standaarden Op heparine afgenomen vol bloed hematocriet bepalen. Bereken hoeveel plasma af te halen voor Hct van 50 %. Maak een CK oplossingsreeks. Doe de uitgerekende hoeveelheid aan CK oplossing bij de stalen. Meng goed. Spot 50 µL op bloedkaarten. Laat ze drogen op kamertemperatuur en uit het licht. Bewaar ze bij -20°C.

55

Bijlage 5 – CDC quality control specimen certification

56

Bijlage 6 – Verhouding in reagens/ethanol volume

correlatie

75/75

75/150

0,930

0,986

Bijlage 7 – Verschil in incubatietijden/temperaturen

30 minuten op 30 °C

20 minuten op 35 °C

0,997

0,990

Voor centrifugeren

Na centrifugeren

correlatie

0,997

0,990

correlatie

0,986

0,973

correlatie

0,996

0,992

correlatie

Bijlage 8 – Centrifugeren

Bijlage 9 – Fluorescentie versus UV aflezing

Fluorescentie

UV

0,987

0,439

correlatie

Bijlage 10 – Verschil in natriumfluoride concentraties

correlatie

25 mmol/L

125 mmol/L

250 mmol/L

0,952

0,973

0,981

57

Bijlage 11 – Heparine standaarden versus EDTA standaarden

correlatie

EDTA

Heparine

0,995

0,742

EDTA blanco’s

Ongespotte blanco’s

0,977

0,999

Bijlage 12 – Blanco’s vergelijken

correlatie

Bijlage 13 – Eenstapsreactie versus tweestapsreactie

correlatie

Eenstapsreactie

Tweestapsreactie

0,996

0,982

58

Bijlage 14 – Intra-run staaln°

8030168

11/03/2008

N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Concentratie U/L 325 267 339 348 308 335 333 341 390 338 324 292 290 340 371 363 319 303 267 317 328

Counts 2503 2292 2551 2585 2439 2537 2531 2559 2738 2549 2499 2382 2375 2555 2666 2638 2480 2422 2291 2473 2513

gemiddelde SD CV %

325,619 31,017 9,526

2503,714 112,166 4,480

Bijlage 15 – Between-run standaard

Nummer run 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

500 U/L Concentratie U/L 448 611 480 531 460 495 504 454 463 548 435 513

Counts 3498 4089 3879 4544 4217 3492 4416 3604 3288 3543 4099 4214

datum correlatie 25/03/2008 0,997 25/03/2008 0,991 5/03/2008 0,999 26/03/2008 0,990 26/03/2008 0,991 7/03/2008 0,990 27/03/2008 0,990 10/03/2008 0,991 11/03/2008 0,996 11/03/2008 0,996 27/03/2008 0,990 12/03/2008 0,986

59

13 14 15 16 17 18 19 20 21 gemiddelde SD CV %

534 506 535 489 452 433 477 483 448

3769 3857 4868 4359 3960 4324 4052 3990 3947

490,429 44,238 9,0202

4000,429 390,206 9,7541

28/03/2008 13/03/2008 14/03/2008 14/03/2008 17/03/2008 18/03/2008 28/03/2008 19/03/2008 19/03/2008

0,990 0,994 0,989 0,998 0,991 0,993 0,991 0,995 0,995

Bijlage 16 – Juistheid CDC controles

N° 131 132 133 134

N° 131 132 133 134

targetwaarde U/L 123 437 726 1058 y = 0,7882x + 179,09 bepaalde conc 249 565 750 1000

bepaalde conc (U/L) 249 565 750 1000

CDC uitgerekend 88,70 489,61 724,32 1041,50 gemiddelde verschil

bepaalde counts 2649 3592 4147 4894

verschil 160,30 75,39 25,68 -41,50 54,97

Bijlage 17 – Eigen referentiewaarden

Counts

Aantal 698

Gemiddelde 2231

SD 356

99ste percentiel 3179

HISTOGRAM Sample size = 698 Lowest value = 1148,0000 Highest value = 3654,0000 Arithmetic mean = 2230,9026 95% CI for the mean = 2204,4267 to 2257,3784 Median = 2212,0000 95% CI for the median = 2190,0000 to 2250,0000 Variance = 126925,5859 Standard deviation = 356,2662 Relative standard deviation = 0,1597 (15,97%) Standard error of the mean = 13,4849 60

Kolmogorov-Smirnov test for Normal distribution : accept Normality (P=0,067) Percentiles : 2.5th = 1494,9000 5th = 1676,2000 10th = 1825,9000 25th = 2002,0000

97.5th = 2987,6496 95th = 2890,9999 90th = 2694,1002 75th = 2431,0000

Bijlage 18 – Reproduceerbaarheid van externe controles Range

Opgeven

Benaming

Staaln°

low

high

78

167

123

base

131

358

518

437

low

132

613

840

726

intermediate

133

936

1179

1058

high

134

base

low

123

counts 3006 2476 2901 2569 2392 2015 2560 2649 2690 3041 2920 2561 2621 2762 2659 3029 2750 3097 2650 2414 2384

gemiddelde SD CV%

2673,62 266,59 9,97

437

counts 4172 3552 4004 3543 3036 3574 3638 3592 3761 4013 4036 3424 3685 3798 3915 3874 3641 4077 3734 3318 3456 3706,81 279,5 7,54

intermediate high 726 counts 1058 counts 5337 5660 4514 5630 4549 5504 4249 4817 4068 4452 4288 4313 4180 4832 4147 4894 4139 5650 4662 5041 4396 6292 3530 5640 4367 5502 4444 5486 4969 5417 4798 6365 4887 5707 5183 5548 4520 5602 4444 5196 4420 5948 4480,52 405,02 9,04

5404,57 530,21 9,81

61

Bijlage 19 – Meetbereik (bovengrens) Conc. (U/L) 100 200 1000 2000 3000 9000 18000

Conc. spots (U/L) 50 100 500 1000 1500 4500 9000

Concentratie bepaald (U/L) 7 27 61 38 345 454 948 952 1280 1350 2030 2110 2380 2340

gem. 17 49,5 399,5 950 1315 2070 2360

Counts bepaald 2583 2655 2783 2696 4230 3828 6049 6063 7267 7516 10034 10341 11329 11173

gem. 2619 2739,5 4029 6056 7391,5 10187,5 11251

Bijlage 20 – Lineariteit Conc. (U/L) 125 250 500 1000

Conc. Modular (U/L) 96,5 203,5 534,5 1265

counts 3031 3118 3779 3621 4413 4712 6804 6491

gemiddelde 3074,5 3700 4562,5 6647,5

Bijlage 21 – Stabiliteit

donderdag vrijdag dinsdag

20/03/2008 21/03/2008 25/03/2008

staalnummer staalnummer staalnummer

8030501 8030502 8030504


correlatie 0,995 0,995 0,997

Dag 1 Dag 2 Dag 3 1 2 3

Oven

30°C 8030501 Counts

8030502 8030504 Counts Counts


1959 2071 1952

2032 2208 1989

2032 2208 1989

gemiddelde SD CV % MAX

2011,00 84,15 4,18 2070,50

2098,50 154,86 7,38 2208,00

2098,50 154,86 7,38 2208,00

voor bewaring

62

MIN MAX-MIN

1951,50 119,00

1989,00 219,00

1989,00 219,00

Kamertemperatuur 8030501 Counts

20°C 8030502 8030504 Counts Counts


1959 1999 1917

2032 2187 2050

2198 2201 1960

gemiddelde SD CV % MAX MIN MAX-MIN

1957,50 57,98 2,96 1998,50 1916,50 82,00

2118,50 96,87 4,57 2187,00 2050,00 137,00

2080,50 170,41 8,19 2201,00 1960,00 241,00

voor bewaring

Koelkast

- 5°C 8030501 Counts



1959 2209 1852

2032 2279 1869

2198 2146 1956

gemiddelde SD CV % MAX MIN MAX-MIN

2030,25 252,08 12,42 2208,50 1852,00 356,50

2073,50 289,91 13,98 2278,50 1868,50 410,00

2050,75 134,00 6,53 2145,50 1956,00 189,50

voor bewaring

Diepvries

- 20°C 8030501 Counts



1959 2104 2010

2032 2177 1952

2198 2179 2088

gemiddelde SD CV %

2056,50 66,47 3,23

2064,50 159,10 7,71

2133,00 64,35 3,02

voor bewaring

63

MAX MIN MAX-MIN

2103,50 2009,50 94,00

2177,00 1952,00 225,00

2178,50 2087,50 91,00

64

Voor akkoord verklaring

Naam Familienaam stagementor

Naam Familienaam stagebegeleider

65

Woord vooraf. Verder gaat mijn dank uit naar Mevr. Dr. N. Kellner, die mijn eindwerk verbeterd heeft

Recommend Documents