Vývoj biomarkerů Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK
Proč potřebujeme laboratoř? Proč potřebujeme biomarkery? Časná diagnostika Správná diagnostika a stratifikace pacientů (určení rizika a
prognózy) – léčba šitá na míru Sledování léčby Odpověď:
Kvůli personalizované medicíně
Náš cíl Ideální biomarker 1. specifický pro dané onemocnění 2. negativní v nepřítomnosti daného onemocnění 3. koncentrace korelující s klinickým stádiem onemocnění 4. sensitivní – chceme léčit/klasifikovat všechny pacienty
Nesplňuje žádný jednotlivý biomarker Hledání nových biomarkerů Kombinace biomarkerů
nové analytické přístupy – „multiplex“
Celkové porozumění biol. procesům
Porozumění jednotlivým proteinům
Výběr technologie
Počet sledovaných proteinů
Elisa, RIA
xMAP etc.
Microarraye MS
Základní výzkum – objev biomarkeru Odlišná exprese u kontrol a u pacientů
kandidáti na biomarker Srovnávací (semi-kvantitativní) analýza - porovnání velkého množství
proteinů, jejich variace a modifikace v buňkách, tkáních a biologických tekutinách a jejich korelace se vznikem, progresí nebo remisí onemocnění • Semi-kvantitativní proteomika • Dvourozměrná gelová elektroforéza (2DGE) • Srovnávací přístupy se značením nebo bez
(e.g., Isotope Coded Affinity Tags, iTRAQ, Stable Isotope Labeling with AminoAcids in Cell Culture) • LC-MS
Citlivost (concentration sensitivity level = CSL) není nižší než 10 nM.
Základní výzkum 2D elektroforéza
MS v tandemu se sep. technologies ◦ HPLC / MS – ESI, MALDI, SELDI ◦ CZE / MS
Základní výzkum technologie proteinových čipů
Značení všech proteinů ve vzorku Přímé srovnání chorobné/zdravé b.m.
Protein microarrays and proteomics, Gavin MacBeath
Cyklus vzniku biomarkeru
Vývoj biomarkeru
Vývoj biomarkeru
Validace biomarkeru Požadavek: imunoesej nebo MS technika musí prokázat, že je
bezpečná a efektivní pro určený klinický účel sběr vzorků – minimalizace vstupního biasu
Přednostně: při stanovení by neměl být znám klinický výsledek
prospektivní Retrospektivně – pouze pokud je bias preanalytických podmínek, skladovacích podmínek a dalších relevantních faktorů kontrolován/monitorován Charakteristiky klinického využití testu musí být testovány na
dostatečně velkém počtu pacientů s onemocněním, pro které bude test používán Klinické testování markeru by mělo být vždy prováděné finální verzí analytické soupravy a přístroje, ve více laboratořích a pečlivě zhodnoceno analytickými a statistickými postupy
„Úzké hrdlo“ při vývoji biomarkerů Nové přístupy k identifikaci a kvantifikaci proteinů a jejich
vzájemných interakcí
Sekvenování velkého množství proteinů a peptidů na MS Proteinové mikročipy Multiplexové imunoeseje na mikrokuličkách
Pochopení molekulárních mechanismů nemocí vzrůstá
Konstantní množství schválených proteinových biomarkerů
FDA průměr ~1,5 proteinu/rok v posledních 15 letech Oproti více než 1,200 kandidátů na biomarkery publikovaných ve
vědecké literatuře (pouze pro onkologické aplikace)
Bariéry biomarkerů Třídění kandidátů
Analytické nástroje
Technologická variabilita
Nařízení, zákony
Sběr vzorků Kontrola kvality
Návrh experimentů
Reagencie Sady dat
Příčiny „Úzkého hrdla“ Technologická variabilita v rámci a mezi jednotlivými
proteomickými platformami Nesprávný sběr vzorků, skladování a zpracování Neschopnost vyselektovat „správné“ biomarkery již před časově a finančně náročnými klinickými testy Nedostatek znalostí vědců o požadavcích na biomarkery pro validační a „zákonný“ proces Nedostatečná dostupnost vysoce kvalitních reagencií a souborů dat v rámci vědeckého světa Nutnost zlepšit analýzu dat - porovnávání velkých souborů dat a vícerozměrná data Nesprávný návrh experimentálních studií biomarkerů na klinických vzorcích
The National Cancer Institute’s Clinical Proteomic Technologies for Cancer initiative NCI-CPTC
Rozhodující kroky při vývoji nové IVD založené na více proteinech (kombinaci) Přesné zjištění analytických vlastností metodiky Nezávislá klinická validace testu – tj. validace na nezávislém souboru vzorků Zajistit , aby vlastnosti metody byly popsány na základě analýzy nezatížené
vstupním biasem Preanalytika – vzrůstá význam aspektů spojených s odběrem vzorku, jeho transportem a skladováním a musí být součástí preklinického a kinického testování IVD interference a zkřížená reaktivita je velmi důležitá u proteinových esejí Kontroly (interní, externí, postupu atd.) musí být stanoveny pro metodiky před jeho uvedením na trh. Pro standardizaci využívat mezinárodní standardy a kontrolní materiály s návazností Studie stability reagencií, variace mezi šaržemi – nezbytné pro všechny soupravy
Verifikace biomarkerů Klinický bioanalytik verifikuje (ověřuje) metodiku předtím
validovanou výrobcem Post-marketingové analytické ověření probíhá rutinně jako součást kontroly kvality Cíl: ověřit zda IVD (přístroj, kontroly, reagencie…) splňují specifikace a podmínky na daném pracovišti Obvykle mezilehlá preciznost, opakovatelnost, linearita, bias, spodní limit detekce a kvantifikace Při hodnocení multiplexové proteinové metody je vhodné použití výpočtu „skóre“ pro jednotlivé pacienty ? Jak provádět studie pro validaci/verifikaci skóre? Jedním z přístupů je analýza dostatečného množství pacientů a kontrol (diagnóza stanovena na základě dalších vyšetření) a porovnání skóre s konečnou klinickou diagnózou
Podmínky pro přechod (multiplexových) biomarkerů do rutinní klinické praxe Proteomika a bioinformatika zaznamenala v posledním
desetiletí velký rozvoj platforem a technologií pro identifikace biomarkerů chorob Bez správného designu studií a využívání robustních analytických technik přijde očekávání a úsilí vložené do biomarkerů nazmar Panely analytů musí být optimalizovány na základě klinických požadavků Validace panelů analytů vyžaduje studie na rozsáhlých kohortách Plné využití biomarkerů pouze v kombinaci s multiparamatrickým hodnocením
Která cesta je ta správná? Multiplexing
?????
Najdi cestu k biomarkerům
Integrace genomiky a proteomiky
Nanodiagnostika založená na biosenzorech
Literatura
