MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Výskyt polymorfizmu C677T genu pro MTHFR v české populaci Bakalářská práce
Zuzana Slezáková
Brno 2011
VEDOUCÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE: doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D.
Bibliografický záznam
Autor:
Zuzana Slezáková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Výskyt polymorfizmu C677T genu pro MTHFR v české populaci
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D.
Rok obhajoby:
2011
Klíčová slova:
MTHFR,
homocystein,
polymorfizmus, C677T, A1298C
hyperhomocysteinemie,
Bibliographic entry
Author:
Zuzana Slezáková Faculty of Science, Masaryk University Department of biochemistry
Title of thesis:
C677T polymorphism of MTHFR gene in Czech population
Degree programme:
Biochemistry
Field of study:
Biochemistry
Supervisor:
doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D.
Year of defence:
2011
Keywords:
MTHFR,
homocysteine,
polymorphism, C677T, A1298C
hyperhomocysteinemia,
Poděkování
Na tomto místě bych ráda poděkovala panu doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D. za jeho čas, odborné znalosti a korektury, bez kterých by tato práce nemohla vzniknout.
Prohlášení
Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně, s pouţitím odborné literatury uvedené ke konci práce.
V Brně dne 11. května 2011
..................................... podpis
Abstrakt Metyhlentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR) je klíčový regulační enzym ve folátovém cyklu. Je zodpovědný za redukci 5,10-methylentetrahydrofolátu na 5methyltetrahydrofolát, který je nezbytný pro remethylaci homocysteinu na methionin. Polymorfizmy genu pro MTHFR mohou způsobit nedostatečnou funkci tohoto enzymu a tím tedy zvýšit celkovou hladinu homocysteinu v plazmě. Nejběţnějšími jednonukleotidovými polymorfizmy genu pro MTHFR jsou C677T a A1298C. Cílem této práce bylo zjistit výskyt těchto dvou polymorfizmů v české populaci. Z celkového počtu 106 testovaných osob byly frekvence genotypů následující: 38,7% (CC), 47,2% (CT) a 14,1% (TT) pro polymorfizmus C677T a 37,7% (AA), 54,7% (AC), 7,6% (CC) pro polymorfizmus A1298C.
Abstract Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is a key regulatory enzyme in folate cycle. It is responsible for reduction of 5,10-methylenetetrahydrofolate to 5methyltetrahydrofolate which is essential for homocysteine remethylation to methionin. Polymorphisms of the MTHFR gene may lead to lack of the enzym function and therefore to increase total plasma homocysteine. The most common single nucleotide polymorphisms of MTHFR gene are C677T and A1298C. The aim of this study was to determine incidence of theese polymorphisms in Czech population. 106 subjects were tested and genotype frequencies were as follows: 38,7% (CC), 47,2% (CT) a 14,1% (TT) for the polymorphism C677T and 37,7% (AA), 54,7% (AC), 7,6% (CC) for the polymorphism A1298C.
Obsah 1
ÚVOD ....................................................................................................................... 1
2
HOMOCYSTEIN A JEHO METABOLISMUS .................................................. 2 2.1
REMETHYLACE HOMOCYSTEINU NA METHIONIN ................................................. 3
2.1.1 Methioninový cyklus ....................................................................................... 4 2.1.2 Folátový cyklus ............................................................................................... 4
3
2.2
TRANSSULFURACE .............................................................................................. 5
2.3
REGULACE A PORUCHY METABOLISMU ............................................................... 5
STRUKTURA A FUNKCE ENZYMU MTHFR.................................................. 6 3.1
ÚLOHA VE FOLÁTOVÉM CYKLU ........................................................................... 7
3.2
GEN PRO MTHFR ............................................................................................... 9
3.2.1 Polymorfizmy .................................................................................................. 9 3.2.1.1 Polymorfizmus C677T .......................................................................... 10 3.2.1.2 Polymorfizmus A1298C........................................................................ 13 4
CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 14
5
METODIKA .......................................................................................................... 15 5.1
SOUBOR TESTOVANÝCH OSOB ........................................................................... 15
5.2
IZOLACE DNA .................................................................................................. 15
5.3
PCR .................................................................................................................. 16
5.4
RESTRIKČNÍ ANALÝZA ...................................................................................... 17
6
VÝSLEDKY ........................................................................................................... 20
7
DISKUZE ............................................................................................................... 23
8
ZÁVĚR ................................................................................................................... 25
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ................................................................. 26
vi
1
ÚVOD Genetické polymorfizmy se běţně vyskytují v přírodě a jsou její nedílnou součástí.
Úzce souvisejí s biologickou rozmanitostí, genetickou variabilitou a adaptací. Jedná se o výskyt dvou nebo více geneticky podmíněných fenotypů ve stejné druhové populaci. Ve srovnání s mutací se jako polymorfizmus povaţuje případ, kdy frekvence výskytu vzácnější alely v populaci převyšuje 1%. Polymorfizmy genu pro MTHFR (methylentetrahydrofolát reduktáza) mohou způsobit nesprávnou funkci tohoto enzymu, coţ můţe mít dopad například na špatný metabolismus kyseliny listové a také na nesprávné odbourávání homocysteinu. Enzym MTHFR hraje důleţitou roli ve folátovém cyklu, kde katalyzuje přeměnu 5,10methylentetrahydrofolátu na 5-methyltetrahydrofolát. Ten slouţí jako donor methylové skupiny při remethylaci homocysteinu. Dříve, neţ se v této práci budu věnovat polymorfizmům genu pro MTHFR, změnám v tomto enzymu a také defektům, které můţe způsobit jeho nesprávná funkce, krátce popíšu metabolismus homocysteinu, který s příslušným enzymem úzce souvisí. Folátový cyklus, ve kterém se uplatňuje enzym MTHFR, je také nedílnou součástí metabolismu homocysteinu.
1
2
HOMOCYSTEIN A JEHO METABOLISMUS Homocystein
(Hcy),
2-amino-4-sulfanylbutanová
kyselina,
je
neesenciální
aminokyselina patřící do skupiny látek s volnou skupinou –SH (thiolátky). Není přijímán potravou, protoţe se nepodílí na výstavbě bílkovin a vzniká tedy aţ v buňkách z proteinogenní aminokyseliny methioninu (Přistoupilová et al., 2002). V plazmě se Hcy rychle oxiduje a tak spíše existuje v redukované formě. Součet všech jeho forem v plazmě se označuje jako tHcy, neboli celkový plazmatický homocystein. Nejvíce se v plazmě vyskytuje vázaný na protein albumin nebo můţe mít formu sloţeného disulfidu Hcy-Hcy nebo Hcy-Cystein (Refsum et al., 2004).
Obr. 2.1 Formy homocysteinu v plazmě (Refsum et al., 2004, upraveno) Metabolismus Hcy závisí na přítomnosti mnoha enzymů a vitaminů jako kofaktorů (Ford et al., 2011). Za normálních podmínek se Hcy po jeho vzniku rychle remethyluje zpět na methionin nebo je dále metabolizován na cystein tzv. transsulfurací. V obou případech jde o sled reakcí, které jsou enzymaticky katalyzované a vyţadují přítomnost vitaminů skupiny B a kyseliny listové, jak je znázorněno na obr. 2.2. Nedostatečný příjem kyseliny listové, vitaminu B6 a B12 v potravě nebo jejich špatné vstřebávání, 2
mohou být příčinou hromadění Hcy v krvi. Také nedostatečná aktivita enzymu MTHFR vede ke zvýšení jeho hladiny (Refsum et al., 2004; Erben, 2004).
Obr. 2.2 Schéma metabolismu homocysteinu (Maron et al., 2009, upraveno) BHMT, betainhomocystein methyltransferáza; CBS, cystathionin-β-syntáza; CL, cystathionin lyáza; MAT,
methionin
adenosyltransferáza;
methyltetrahydrofolát-homocystein
MTHFR,
methylentetrahydrofolát
methyltransferáza;
MS,
methionin
reduktáza; syntáza;
MTR SAH,
5S-
adenosylhomocystein; SAM, S-adenosylmethionin; SHMT, serin hydroxymethyltransferáza; THF, tetrahydrofolát
2.1
Remethylace homocysteinu na methionin Jak bylo popsáno výše, Hcy vzniká v buňkách z esenciální aminokyseliny
methioninu. Methionin, který do těla přichází z bílkovinné části potravy, nestačí pokrýt veškeré poţadavky pro tělo nezbytné, proto je nutné, aby se znovu tvořil (Přistoupilová et al., 2002). Je důleţitou aminokyselinou pro syntézu bílkovin a jeho metabolismus ovlivňuje několik biochemických drah, jako například produkci ţivin nezbytných pro 3
optimální funkci cerebrovaskulárního, kosterního a nervového systému (Pandey et al., 2006). Proces obnovy methioninu se děje pomocí methioninového a folátového cyklu, které jsou navzájem propojeny. Úkolem obou cyklů je přenášení methylových skupin (Refsum et al., 2004).
2.1.1 Methioninový cyklus Univerzálním donorem aktivované methylové skupiny, je S-adenosylmethionin (SAM), který je syntetizován přenosem adenosylové skupiny z ATP na atom síry methioninu. Jakmile SAM předá methylovou skupinu vhodnému příjemci, vytvoří se Sadenosylhomocystein (SAH), jehoţ hydrolýzou vznikne adenosin a Hcy (Pandey et al., 2006). Vzniklý Hcy je remethylován na methionin přijetím methylové skupiny z 5methyltetrahydrofolátu.
Tato
reakce
je
katalyzovaná
5-methyltetrahydrofolát-
homocystein methyltransferázou (MTR) nebo methionin syntázou (MS). Tyto enzymy vyţadují přítomnost vitaminu B12 (kobalaminu) jako kofaktoru. Jedná se o poslední reakci methioninového cyklu, která ho spojuje s cyklem folátovým (Medina et al., 2001). Jako hlavní donor methylových skupin hraje SAM důleţitou roli v regulaci genové exprese, protoţe je zapojený do methylace DNA, proteinů, neurotransmiterů a fosfolipidů (Nazarenko et al., 2006) Jiný způsob remethylace Hcy na methionin nastává v některých tělních orgánech, kde můţe být Hcy remethylován při rozkladu betainu, který vzniká z cholinu a lecithinu (Přistoupilová et al., 2002).
2.1.2 Folátový cyklus Aktivní formou kyseliny listové je tetrahydrofolát (THF), který je schopen zachytit a vázat jednouhlíkové zbytky na N-5 nebo na N-10 atomy, případně na oba současně (Medina et al., 2001). Takto navázané zbytky C jsou upravovány tetrahydrofolátem tak, aby byly vyloučeny z těla ve formě CO2 nebo aby byly dále vyuţitelné pro stavbu nukleotidů či tvorbu methioninu (Přistoupilová et al., 2002). Při přenosu jednouhlíkového zbytku ze serinu vzniká glycin a 5,10-methylentetrahydrofolát (Medina et al., 2001). Právě redukce 5,10-methylenTHF na 5-methylTHF katalyzovaná 4
MTHFR je důleţitou reakcí folátového cyklu, protoţe 5-methylTHF slouţí jako donor methylové skupiny pro přeměnu Hcy na methionin (Prinz-Langenohl et al., 2009). Podrobnější popis cyklu folátu a jeho jednotlivých forem bude následovat dále v kapitole 3.1.
2.2
Transsulfurace Cystein je syntetizován z methioninu prostřednictvím metabolické dráhy, která se
nazývá transsulfurace. První tři kroky této dráhy, vedoucí ke tvorbě Hcy, jsou společné s methioninovým cyklem. Následuje kondenzace Hcy se serinem katalyzovaná enzymem cystathionin-β-syntázou (CBS), při níţ vzniká cystathionin. Ten je dále štěpen cystathionin lyázou (CL) za vzniku 2-oxoglutarátu a cysteinu. Kofaktorem obou enzymů je vitamin B6 (Medina et al., 2001; Pandey et al., 2006). Vzniklý cystein můţe dále slouţit jako stavební jednotka bílkovin (Přistoupilová et al., 2002) nebo je při nadbytku oxidován na taurin a anorganické sírany (Medina et al., 2001).
2.3
Regulace a poruchy metabolismu Pro koordinovanou regulaci metabolismu Hcy má zásadní význam SAM, který má
schopnost působit jako enzymatický efektor, je inhibitorem MTHFR a aktivátorem CBS. To znamená, ţe při nízké koncentraci buněčného SAM bude aktivní MTHFR a bude převaţovat cesta remethylace. Naopak při vysoké koncentraci SAM je Hcy odveden cestou transsulfurace, protoţe je stimulována aktivita CBS, zatímco aktivita MTHFR je potlačena (Medina et al., 2001). V případě, ţe dojde k narušení některé z metabolických drah, zvýší se hladina Hcy v krvi (Přistoupilová et al., 2002). Normální koncentrace tHcy by měla být v rozmezí 516 µmol/l-1. I kdyţ by moţná za vhodnou horní hranici měla být povaţována koncentrace 10 µmol.l-1, protoţe jí lze dosáhnout při optimální stravě s ohledem na kyselinu listovou a vitaminy B6 a B12. Nad 16 µmol.l-1 se jedná o hyperhomocysteinemii a jsou definovány tři druhy: mírná (16-30 µmol.l-1), střední (30-100 µmol.l-1) a těţká (>100 µmol.l-1) hyperhomocysteinemie (Medina et al., 2001). Hyperhomocysteinemie je odchylka, která je primárně vyvolána mutací genu pro CBS nebo genu pro MTHFR. Dysfunkce těchto enzymů vede k blokování metabolismu Hcy. Mezi další důleţité faktory hyperhomocysteinemie můţeme zařadit chronický 5
deficit vitaminů B6, B12 a kyseliny listové, způsobený jejich nedostatkem v potravě (Kvasnička, 2003), kouření, konzumaci kofeinu, fyzickou aktivitu a také vysoký příjem alkoholu (Aléssio et al., 2007). S hyperhomocysteinemií můţe souviset celá řada onemocnění a poruch. Například vývojové vady plodu, potrat, předčasný porod, také kardiovaskulární choroby, ale také Alzheimerova choroba, deprese, migrény a další (Erben, 2004). Popsat jednotlivě všechny faktory a jejich vlivy by bylo obsahově náročné, proto se ve své práci podrobněji zaměřím na gen pro MTHFR a dva nejběţnější polymorfizmy tohoto genu.
3
Struktura a funkce enzymu MTHFR Enzym methylentetrahydrofolát reduktáza je flavoprotein, který je u lidí tvořen
dimery, z nichţ kaţdý je nekovalentně vázán na FAD (flavin adenin dinukleotid). Kaţdý monomer obsahuje N-koncovou katalytickou doménu, která se váţe na FAD kofaktor a C-koncovou regulační doménu, která se váţe na alosterický inhibitor SAM. Katalytická doména kaţdého monomeru se nachází na pozici 677 a regulační doména na pozici 1298 (Martínez-Frías, 2008). MTHFR je zodpovědný za redukci 5,10-methylentetrahydrofolátu, jeţ je důleţitý pro DNA syntézu, na 5-methyltetrahydrofolát, který je nezbytnou sloţkou pro remethylaci Hcy. Redukčním činidlem pro tuto reakci, která je součástí folátového cyklu, je zde koenzym NADPH (Kim, 2005; Rosenblatt, 2001).
Obr. 3.1 Redukce 5,10-methylentetrahydrofolátu na 5-methyltetrahydrofolát
6
Úloha ve folátovém cyklu
3.1
Folát je ve vodě rozpustný B vitamin, běţně přítomný v potravinách, a jeho stabilní syntetickou formou je kyselina listová, která je uţívána prostřednictvím obohacených potravin, léků a doplňků stravy. Tyto formy vitaminů potřebují být redukovány uvnitř buněk na THF, přes dihydrofolát (DHF), aby se staly metabolicky aktivní. Folát (kyselina listová) je biologicky důleţitou molekulou, např. pro správný vývoj plodu. Mnohé studie prokázaly, ţe doplňování stravy kyselinou listovou před početím a také v průběhu těhotenství, sniţuje riziko jak vzniku vrozených vad, tak jejich opakovaného výskytu (Prinz-Langenohl et al., 2009; Rosenblatt, 2001). Jak jsem jiţ zmínila, enzym MTHFR je důleţitou součástí folátového cyklu, ve kterém katalyzuje přeměnu 5,10-methylenTHF na 5-methylTHF. Jelikoţ se jedná o ireverzibilní reakci, způsob obnovy tetrahydrofolátu z 5-methylTHF se děje prostřednictvím vitamin B12-dependentní MS či MTR (Medina et al., 2001; Rosenblatt, 2001). Substrát 5,10-methylenTHF, intracelulární folátová forma koenzymu, je rozhodující pro DNA syntézu, jak je znázorněno na obr. 3.2. Na obrázku lze také vidět propojení folátového cyklu s methioninovým, které sice bylo patrné jiţ z obr. 2.2, ale pro ilustraci přenosu methylové skupiny jsou zde klíčové reakce znázorněny včetně strukturních vzorců. Donorem methylové skupiny nezbytné pro syntézu methioninu, ke které dochází při remethylaci Hcy, je 5-methylTHF. Po syntéze je methionin opět přeměněn na SAM (Nazarenko et al., 2006). Nedostatečná funkce MTHFR můţe sníţit dostupnost 5-methylTHF, coţ způsobí pokles v přeměně Hcy na methionin. To můţe mít za následek DNA hypomethylaci, která můţe ovlivnit buněčný vývoj a funkce (Taioli et al., 2009). Vzhledem k tomu, ţe ţivotně důleţité procesy, jako proliferace a diferenciace, jsou závislé na folátu a vitaminu B12, je normální folátový metabolismus důleţitý zejména během embryogeneze, kdy buňky aktivně proliferují a diferencují se (Nazarenko et al., 2006).
7
Obr. 3.2 Schéma folátového cyklu Kyselina listová je dvojnásobně redukována na její aktivní formu THF. 5,10-methylenTHF slouţí jako donor methylové skupiny pro methylaci deoxyuridin-5-monofosfátu (dUMP) na deoxythymidin-5monofosfát (dTMP), coţ je prekurzor pro DNA syntézu. Syntéza dTMP způsobuje, ţe se 5,10methylenTHF oxiduje na inaktivní DHF, který je opět přeměněn na THF prostřednictvím dihydrofolát reduktázy. 5,10-methylenTHF můţe být také oxidován na 10-formyltetrahydrofolát pro de novo syntézu purinů. Enzym MTHFR katalyzuje ireverzibilní redukci 5,10-methylenTHF na 5-methylTHF, hlavní formu folátu v krvi. 5-methylTHF je zpátky přeměněn na THF za účasti B12-dependentním MTR (MS) a zároveň tak slouţí jako donor methylu remethylaci Hcy (Kim, 2005).
8
3.2
Gen pro MTHFR Lidský gen pro MTHFR je lokalizován na chromozomu 1p36.3 (p raménko
chromozomu 1 v pozici 36.3). Pro tento lokus bylo popsáno několik desítek mutací, z nichţ většina vede k výrazným nedostatkům MTHFR. Gen se skládá z 11 exonů, jejichţ délka je od 102 do 432 bp. Velikost intronů je v rozmezí 250 aţ 1500 bp, s výjimkou jednoho 4200 bp dlouhého intronu (Nazarenko et al., 2006). Mutacemi tohoto genu vzniká enzym se zvýšenou termolabilitou a se sníţenou aktivitou, coţ můţe mít za následek zvýšení hladiny tHcy (Pandey et al., 2006). Zvýšená hladina tHcy byla navrţena jako nezávislý rizikový faktor mnoha nemocí, jako je ischemická choroba srdeční1, mrtvice, demence a Alzheimerova choroba, komplikace v těhotenství (Ruiz et al., 2007) a další.
Obr. 3.2 Umístění genu pro MTHFR – 1p36.3 (http://ghr.nlm.nih.gov/gene=MTHFR)
3.2.1 Polymorfizmy Je prokázané, ţe genetické polymorfizmy genů, které kódují enzymy zapojené do metabolismu Hcy, zejména MTHFR, jsou běţnou příčinou zvýšení hladiny tHcy. Mezi nejběţnější polymorfizmy tohoto genu patří C677T a A1298C (Kölling et al., 2004). Substituce cytosinu za thymin v pozici 677 (C677T) má za následek nahrazení alaninu za valin v peptidickém řetězci (Prinz-Langenohl et al., 2009). T alela tohoto polymorfizmu, jejíţ frekvence je v populaci okolo 30%, způsobuje termolabilitu enzymu, aţ o 2/3 sniţuje jeho aktivitu (Rosenblatt, 2001) a inhibuje tvorbu 5methylTHF. To vysvětluje, proč se vyšší koncentrace tHcy projevují častěji u homozygotů TT, neţ u heterozygotů CT a homozygotů CC (Ilhan et al., 2008). 1
nedokrevnost srdce díky zužování srdečních tepen
9
Termolabilní forma enzymu byla uznána jako nejběţnější genetická příčina hyperhomocysteinemie. V Evropské populaci je aţ 12% homozygotů TT, 43% heterozygotů CT a 45% homozygotů CC pro tento polymorfizmus (Prinz-Langenohl et al., 2009). Druhým běţným polymorfizmem tohoto genu je A1298C. Záměna adenosinu za cytosin na místě 1298 způsobuje nahrazení glutaminu za alanin. Tento typ polymorfizmu mírně sniţuje aktivitu enzymu (Nazarenko et al., 2006), ale sám o sobě významně neovlivňuje hladinu Hcy v plazmě (Kölling et al., 2004).
3.2.1.1 Polymorfizmus C677T C677T polymorfizmus se nachází na katalytické doméně enzymu. Od doby, kdy byla T alela tohoto polymorfizmu biochemicky charakterizována (1991) a geneticky identifikována (1995), se dostala do zájmu mnoha vědců z celého světa. Je široké spektrum nepříznivých stavů spojených s touto alelou, které zahrnuje například vrozené vady, těhotenské komplikace, rakoviny, kardiovaskulární onemocnění, psychické poruchy, aj. (Wilcken et al., 2003). Bylo potvrzeno, ţe tento polymorfizmus je běţným genetickým determinantem plazmatického Hcy v obecné populaci (Ueland et al., 2001). Frekvence výskytu se liší mezi různými etnickými skupinami a je obzvláště nízká u lidí černé rasy (Rosenblatt, 2001). Výskyt tohoto polymorfizmu je také ovlivněn geografickými změnami. Frekvence genotypu TT se v Evropě zvyšuje od severu k jihu (Nazarenko et al., 2006). Studie z roku 2003 uvádí, ţe byl mírnější výskyt (4-7%) v severních státech (Finsko, Helsinky, severní Nizozemsko), střední hodnoty (8-10%) výskytu ve Francii a Maďarsku, vyšší hodnoty v jiţní Evropě (12-15% ve Španělsku a severní Itálii) a nejvyšší hodnoty (20-26%) náleţely jiţní Itálii (Wilcken et al., 2003).
Metabolické vlivy Několik studií prokázalo, ţe T alela je spojena s vysokými koncentracemi tHcy (Ueland et al., 2001). Vliv na jeho koncentraci je nejvýraznější u homozygotních jedinců TT, kteří mají nízké koncentrace folátu v krvi. Doplnění kyseliny listové ve stravě můţe u těchto jedinců sníţit hladinu tHcy (Nazarenko et al., 2006). Další vliv na koncentraci tHcy má vitamin B12. Hladina tohoto vitaminu v krvi je nepřímo úměrná
10
hladině tHcy. Negativní dopad tohoto vztahu byl také výrazněji zjištěn u jedinců TT, ve srovnání s CC a CT jedinci (Ueland et al., 2001). Mezi další faktory, které mají souvislost s tímto polymorfizmem, lze zařadit ţivotní styl. Součástí jedné studie (The Hordaland Homocystein Study) bylo vyšetřování pacientů se střední hyperhomocysteinemií (≥40 μmol.l−1). Více neţ 70% těchto pacientů mělo genotyp TT kombinovaný s nedostatkem folátu v krvi. Navíc, ve srovnání s CT nebo CC, byli tito jedinci častějšími kuřáky a konzumenty většího mnoţství kávy. Tyto výsledky naznačují, ţe také nezdravý způsob ţivota ovlivňuje genotyp TT a také podněcuje zvýšení hladiny tHcy. Běţně jsou však tyto faktory spojovány jen s mírnou hyperhomocysteinemií (Ueland et al., 2001).
Vztah k onemocněním: Vztah mezi polymorfizmem C677T a nemocemi zahrnuje dva aspekty. Za prvé, nemoc můţe mít vliv na koncentraci tHcy a to můţe být způsobeno změnami v polymorfizmu pro MTHFR. Za druhé, genotyp, pravděpodobně ovlivněný změnami v metabolismu folátu a Hcy, můţe souviset s rizikem onemocnění (Ueland et al., 2001). Existuje několik studií, které se zabývaly vztahem tohoto polymorfizmu k několika onemocněním. Asi největší spojitost s tímto polymorfizmem mají následující: Cévní onemocnění: Je prokázáno, ţe zvýšená hladina tHcy můţe vyvolávat akutní cévní příhody (Ueland et al., 2001). Genotyp TT polymorfizmu C677T se zdá být faktorem pro projev trombotických onemocnění. Je spojován se ţilní tromboembolií (onemocnění zahrnující jak ţilní trombózu, tak plicní embolii), arteriálními trombotickými onemocněními, ischemickou chorobou srdeční, ischemickou2 chorobou dolních končetin a těhotenskými komplikacemi (Sucker et al., 2009). Trombofilie, stav, kdy je v cévním systému zvýšena dispozice k tvorbě trombů (označení pro nitrocévní krevní sraţeninu), ke které však ještě nedošlo (Kvasnička, 2003), můţe být vrozená nebo získaná. Zatímco nejběţnější trombofilií je získaná, u zhruba 40% případů trombózy (stav, při němţ dochází k ucpání cévy sraţeninou) se jedná o vrozenou trombofilii. Ukázalo se, ţe vrozená trombofilie je rizikovým faktorem kardiovaskulárních onemocnění a také reprodukčních poruch, jako je opakovaný potrat, jeţ je definován jako dva nebo více po sobě následujících samovolných potratů (Coulam et al., 2008). 2
ischemie – místní nedokrevnost tkání nebo orgánů
11
Vrozené vady a těhotenské komplikace: Niţší mnoţství folátu a vyšší koncentrace tHcy jsou známými rizikovými faktory pro těhotenské komplikace, jako je potrat, ţilní tromboembolie, preeklapsie3, předčasné odlučování (abrupce) placenty, ale také mohou být rizikovými faktory pro několik vývojových poruch, jako jsou defekty neurální trubice, či Downův syndrom (Nazarenko et al., 2006). V prevenci vzniku vrozených vad má zásadní význam zjištění, ţe doplňování kyseliny listové před početím, a také v průběhu těhotenství, výrazně sniţuje vznik a opětovný výskyt defektů neurální trubice. Tyto defekty jsou důsledkem poruchy při uzavírání nervové trubice během vývoje plodu (Botto et al., 2000) a jsou spojeny s nízkou koncentrací folátu a se zvýšenou koncentrací tHcy u matek. Bylo zjištěno, ţe TT genotyp u matky i dítěte (ale ne u otce) má za následek aţ 2x větší riziko pro vznik defektů neurální trubice. Nízká koncentrace folátu v krvi matky a ţádné doplňování tohoto vitaminu před početím, zvyšuje rizika spojená s alelou T. Kombinace TT genotypu a nízké koncentrace folátu u matky zvyšuje koncentraci Hcy a znesnadňuje tak tvorbu methioninu u embrya, coţ způsobuje neúplné uzavření nervové trubice. Bylo také prokázáno, ţe TT genotyp matek přibliţně dvakrát zvyšuje riziko Downova syndromu (Ueland et al., 2001) Rakovina: Zdá se, ţe polymorfizmus C677T zvyšuje riziko rakoviny tlustého střeva, rakoviny jater, leukemie, rakoviny prsu, ţaludku, dělohy a dalších (Kim, 2005). Riziko rakoviny prsu je vyšší u nositelek genotypu TT (Langsenlehner et al., 2008). Riziko rakoviny tlustého střeva je spojeno s T alelou tohoto polymorfizmu, ale především s mnoţstvím folátu v plazmě. Dostatek folátu u jedinců s genotypem TT sniţuje aţ o 50% riziko vzniku rakoviny tlustého střeva oproti jedincům TT s nedostatkem folátu. To, ţe T alela u jedinců s dostatečným mnoţstvím folátu chrání před vznikem rakoviny, můţe být spojeno s velkým mnoţstvím purinů a pyrimidinů dostupných pro DNA syntézu vedoucí k účinným DNA opravám. Kombinace TT genotypu a nízké hladiny folátu v krvi, narušuje remethylaci Hcy na methionin. To můţe mít za následek hypomethylaci DNA, která je zapojená do karcinogeneze (Le Marchand et al., 2005; Taioli et al., 2009; Ueland et al., 2001).
3
onemocnění v těhotenství, kdy má žena vysoký krevní tlak a obsah bílkovin v moči
12
Onemocnění ledvin: Dalším onemocněním je také onemocnění ledvin, které je spojeno se zvýšeným rizikem kardiovaskulárních chorob a značně zvýšenou hladinou tHcy. U těchto pacientů s genotypem TT bylo zjištěno, ţe jsou náchylnější k hyperhomocysteinemii, neţ ti s genotypem CC. TT genotyp u pacientů s onemocněním ledvin můţe mít negativní vliv na klinický výsledek u ledvinového selhání a byl také spojen s nefropatií u diabetiků s nízkou koncentrací folátu (Ueland et al., 2001). Diabetická nefropatie je chronické onemocnění ledvin, které je způsobeno vlivem dlouhodobější hyperglykemie při diabetu typu 2, a je také primární příčinou selhání ledvin. Polymorfizmus C677T a A1298C spolu se zvýšenou hladinou tHcy jsou spojeny s predispozicí ke vzniku komplikací u diabetu typu 2, jako je diabetická nefropatie (Mtiraoui et al., 2007).
3.2.1.2 Polymorfizmus A1298C Tento MTHFR polymorfizmus, který je lokalizován na regulační doméně enzymu, na rozdíl od C677T, nemá za následek termolabilitu enzymu, ani zvýšenou hladinu tHcy. Je to polymorfizmus méně významný, protoţe mutantní C alela nemá tolik moţných negativních důsledků, jako tomu bylo u 677T alely. Nicméně určité kombinace obou dvou polymorfizmů můţou přispívat k různým abnormalitám. Například kombinace 677CT/1298AC vede ke sníţení enzymové aktivity, vyšším koncentracím tHcy a niţší hladině folátu, coţ je podobné genotypu 677TT. U nositelek genotypu 677TT a 1298AC bylo zjištěno vyšší riziko spontánního potratu (Kölling et al., 2004; Nazarenko et al., 2005). V jedné studii bylo také zjištěno, ţe polymorfizmus C677T a také A1298C by mohly být zapleteny do patogeneze schizofrenie a bipolární afektivní poruchy (BAP; psychická porucha charakterizovaná změnami nálad, které doprovází opakující se deprese). Jak u BAP pacientů, tak u schizofrenních pacientů byla zaznamenána vyšší frekvence genotypu 677TT, ale i vyšší frekvence 1298CC, neţ u pacientů zdravých. Tyto MTHFR polymorfizmy můţou být příčinou schizofrenie u pacientů s nízkou hladinou folátu v oběhu (Arinami et al., 1997; Kempisty et al., 2006).
13
4
CÍL PRÁCE Cílem
této
práce
bylo
zjistit
frekvence
genotypů
jednonukleotidových
polymorfizmů C677T a A1298C genu pro MTHFR za pomocí restrikční analýzy u náhodně vybraných osob v české populaci. V současné době existuje mnoho prací, které se zabývaly zmíněnými polymorfizmy, jejich výskytem, či vztahem k různým nemocem. Výskyt těchto polymorfizmů v české populaci byl srovnán s výskytem v jiných zemích a také se vztahem ke koncentraci tHcy a folátu v plazmě.
14
5
METODIKA
5.1
Soubor testovaných osob Testování pro výskyt polymorfizmu C677T a A1298C genu pro MTHFR bylo
prováděno anonymně na 106 náhodně vybraných osobách v České republice. Do tohoto souboru osob patřili muţi i ţeny ve věku 18 – 70 let nepříbuzenského vztahu.
5.2
Izolace DNA Genomická DNA byla izolována ze stěru z bukální sliznice. Tato izolace byla
prováděna pomocí izolačního kitu UltraCleanTM Blood Spin DNA (Mo-Bio). Postup izolace genomické DNA: Do připravených mikrozkumavek bylo napipetováno 400 µl roztoku B1 a 10 µl proteinázy K. Následně byla vloţena stěrovka do označené mikrozkumavky a nůţkami byl odstřihnut štěteček. Takto značené mikrozkumavky byly vloţeny do temperovačky (Biosan) vytemperované na 56°C s nastaveným třepáním na 700 rpm. Po 20 minutách inkubace byly mikrozkumavky krátce stočeny na centrifuze. Poté byl sterilní pinzetou vyjmut štěteček a vyhozen. Ke kaţdému lyzátu bylo přidáno 200 µl roztoku B2 a směs se jemně zvortexovala a zcentrifugovala. Veškerý obsah mikrozkumavky byl přenesen do kolonky a následně centrifugován 1 minutu při 14 000 x g. Kolonka byla přemístěna do nové mikrozkumavky a poté do ní bylo přidáno 500 µl roztoku B3. Následovala centrifugace po dobu 30 sekund při 14 000 x g. Poté byla kolonka vyjmuta z mikrozkumavky, obsah mikrozkumavky byl vylit do odpadu a kolonka do ní byla vrácena. Do kolonky bylo dále přidáno 500 µl roztoku B4 a centrifugovalo se 30 sekund při 14 000 x g. Následně byla kolonka vyjmuta z mikrozkumavky, obsah byl vylit a kolonka vrácena zpět. Opět následovala 30 sekund centrifugace při 14 000 x g. Aniţ bychom se dotkli roztoku B4 na dně zkumavky, byla kolonka opatrně vyjmuta a přenesena do nové mikrozkumavky. Na termotřepačce při 65°C byl asi 5 minut inkubován roztok B5 a následně bylo do středu kolonky napipetováno 70 µl takto předehřátého roztoku a 5 minut se nechalo stát. Následovala centrifugace 1 minutu při 14 000 x g, po které byla kolonka odstraněna a víčko mikrozkumavky uzavřeno. Takto izolovaná DNA mohla být dále pouţita pro různé aplikace.
15
5.3
PCR Dalším krokem k detekci polymorfizmů byla amplifikační reakce, která byla
prováděna v termocykléru Veriti. Použité primery: MC677T1 (10 µM) MC677T2 (10 µM) MC1298A1 (10 µM) MC1298A4 (10 µM) Příprava reakčních směsí o celkovém objemu 15 µl: Reakční směs obsahující polymorfizmus C677T:
7,5 µl KAPA Mix
1 µl MC677T1
1 µl MC677T2
4 µl voda
1,5 µl DNA
Reakční směs obsahující polymorfizmus A1298C:
7,5 µl KAPA Mix
1 µl MC1298A1
1 µl MC1298A4
4 µl voda
1,5 µl DNA
KAPA Mix = KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (2x) – (0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2)
Amplifikace vybraných úseků DNA byla provedena v termocykléru Veriti. Počáteční denaturace při 95°C trvala 2,5 minut a následovalo 30 tříkrokových (denaturace, annealing, extenze) cyklů, během kterých byla DNA amplifikována.
16
Program: 95°C
2,5 min
95°C
20 s
55°C
30 s (ramp 50%)
72°C
30 s
72°C
30 min
10°C
hold
30x
Restrikční analýza
5.4
Po amplifikaci DNA následovala restrikční analýza. Sloţení pufru K (Promega): 100mM Tris-HCl, pH 7,4; 1,5 M KCL; 100mM MgCl2 Amplifikát polymorfizmu C677T:
15 µl PCR amplifikátu bylo smícháno s 1,3 µl pufru K (Promega) a dále s 5 U restrikčního enzymu TaqI (Fermentas), který štěpí DNA v následující sekvenci: 5´- T C G A - 3´, 3´- A G C T – 5´.
Poté následovala inkubace v termostatu při 65°C po dobu 1,5 hodin.
Z amplifikovaného PCR fragmentu o délce 135 bp standardně enzym odštěpí úsek o délce 41 bp, čímţ vznikne produkt o délce 94 bp.
Následně byla provedena gelová elektroforéza restrikčních fragmentů na 1,5% agarózovém gelu (EliPhore) barveném ethidium bromidem při 80 V po dobu 1,5 hodin. Výsledný gel byl prosvícen transiluminátorem a vyfotografován digitálním fotoaparátem Olympus (Nikon 8xZoom ED).
17
Obr. 5.1 Gelová elektroforéza restrikčních fragmentů polymorfizmu C677T
Byly detekovány následující fragmenty: neštěpený fragment o délce 135 bp, který značil genotyp CC; fragment o délce 94 bp charakterizoval genotyp TT; fragmenty o délce 135 bp a 94 bp identifikovaly genotyp CT.
Amplifikát polymorfizmu A1298C:
15 µl PCR amplifikátu bylo smícháno s 1,3 µl pufru K a dále s 5 U restrikčního enzymu Hsp92 (Promega), který štěpí DNA v následující sekvenci: 5´- C A T G - 3´, 3´- G T A C – 5´.
Poté následovala inkubace v termostatu při 37°C po dobu 1,5 hodin.
Z amplifikovaného PCR fragmentu o délce 177 bp standardně enzym odštěpí úsek o délce 20 bp, čímţ vznikne produkt o délce 157 bp.
Následně byla provedena gelová elektroforéza restrikčních fragmentů na 1,5% agarózovém gelu (EliPhore) barveném ethidium bromidem při 80 V po dobu 1,5 hodin. Výsledný gel byl prosvícen transiluminátorem a vyfotografován digitálním fotoaparátem Olympus (Nikon 8xZoom ED).
18
Obr. 5.2 Gelová elektroforéza restrikčních fragmentů polymorfizmu A1298C
Byly detekovány následující fragmenty: neštěpený fragment o délce 177 bp, který značil genotyp AA; fragment o délce 157 bp charakterizoval genotyp CC; fragmenty o délce 177 bp a 157 bp identifikovaly genotyp AC.
19
6
VÝSLEDKY
Výskyt polymorfizmu C677T genu pro MTHFR v české populaci Ze 106 testovaných osob byly genotypové frekvence následující: homozygotní kombinaci alel CC mělo 41 osob, 50 osob mělo heterozygotní kombinaci CT a u 15 osob byla nalezena homozygotní kombinace TT. Frekvence jednotlivých genotypů, a také frekvence alel u zkoumaných osob, jsou srovnány v grafech 1 a 2.
60 50 40 % 30 20 10 0 CC
CT
TT
Graf 1 Genotypové frekvence osob polymorfizmu C677T
80 70 60 50 % 40 30 20 10 0 C
T
Graf 2 Frekvence alel polymorfizmu C677T
20
Výskyt polymorfizmu A1298C genu pro MTHFR v české populaci Druhým polymorfizmem, který byl zjišťován u testovaných osob je A1298C. Homozygotní kombinace AA byla zjištěna u 40 osob, heterozygotních AC bylo 58 osob a homozygotních CC bylo 8 osob z celkového počtu testovaných. V grafu 3 je vidět srovnání jednotlivých genotypů a frekvence jednotlivých alel je znázorněna v grafu 4.
70 60 50 40 % 30 20 10 0 AA
AC
CC
Graf 3 Genotypové frekvence osob polymorfizmu A1298C
80 70 60 50 % 40 30 20 10 0 A
C
Graf 4 Alelické frekvence polymorfizmu A1298C
21
Kombinace polymorfizmů C677T/A1298C genu pro MTHFR v české populaci Ze souboru 106 testovaných osob měla kombinace polymorfizmů 677TT/1298CC nejniţší zastoupení, objevila se pouze u jedné osoby. Naopak nejvíce, u 31 osob, se objevila kombinace 677CC/1298AC. Ostatní kombinace byly následující: 8 osob mělo kombinaci 677CC/1298AA, 2 osoby 677CC/1298CC, 23 osob 677CT/1298AA, 22 osob 677CT/1298AC, 5 osob 677CT/1298CC, 9 osob 677TT/1298AA, a poslední kombinace 677TT/1298AC se objevila u 5 osob. V grafu 5 je znázorněno procentuelní zastoupení všech zmiňovaných kombinací.
35 30 25 20 % 15 10 5 0 CC/AA
CC/AC
CC/CC
CT/AA
CT/AC
CT/CC
TT/AA
TT/AC
TT/CC
Graf 5 Genotypové frekvence polymorfizmu C677T/A1298C
22
7
DISKUZE Pomocí restrikční analýzy byly v této práci zjišťovány dva polymorfizmy (C677T a
A1298C) genu pro MTHFR na souboru 106 osob české populace. U těchto osob nebyly zjišťovány koncentrace tHcy nebo folátu, či přítomnost onemocnění. V grafech 1 - 5 lze vidět, jaká byla frekvence genotypů a alelická frekvence dvou zmiňovaných polymorfizmů. Existuje mnoho studií na téma MTHFR, homocystein nebo MTHFR polymorfizmy. Jsou studie, které se zabývaly výskytem polymorfizmů pro MTHFR, nebo takové, ve kterých byl zjišťován vztah jednotlivých genotypů ke koncentraci
folátu či
homocysteinu v krvi, jiné práce se například zaměřovaly na spojitost mezi rizikem onemocnění a genotypy polymorfizmů pro MTHFR, a mnoho dalších. Jelikoţ naše práce byla zaměřena pouze na výskyt dvou zmíněných polymorfizmů, nemůţeme jasně říci, čím by mohly být genotypové a alelické frekvence ovlivněny. Frekvencí alely T a frekvencemi genotypů polymorfizmu C677T v souvislosti s etnickými a geografickými změnami se zabývali ve studii Wilcken et al. (2003). Testovali více neţ 7000 novorozenců z 16 oblastí celého světa. Zjistili, ţe frekvence alely T se v Evropě pohybovala od 25,5% (Finsko) aţ ke 46,0% (Itálie). Nejvyšší frekvenci alely T zaznamenali v Mexiku (57,0%), kde byla i největší frekvence genotypu TT (32,2%). Jelikoţ Wilcken et al. nezjišťovali frekvenci v České republice, ani v sousedních státech, nemůţeme tyto výsledky zkonfrontovat s našimi výsledky. V porovnání se studií Wilcken et al., byla však frekvence alely T (37,7%), kterou jsme zjistili pro českou populaci, nejvíce podobná frekvenci alely T ve Francii (35,7%). Veselá et al. (2005) ve své práci vyhodnocovali, zda alelické varianty čtyř genů zapojených do metabolismu folátu ovlivňují hladinu folátu v krvi u zdravých osob v české populaci. Jedním z genů byl také gen pro MTHFR. Celkový počet testovaných osob (591) zahrnoval 80 osob, které pravidelně uţívaly různé typy multivitaminů obsahující folát. Tito jedinci měli výrazně vyšší koncentrace folátu a vitaminu B12 v plazmě a naopak niţší koncentraci tHcy oproti jedincům, kteří neuţívali pravidelně folát. V této studii analyzovali celkem 5 jednonukleotidových polymorfizmů, včetně C677T i A1298C, a zjistili, ţe pouze 677TT genotyp má významný vztah ke sníţené hladině folátu v plazmě. Tento vztah byl také zjištěn ve studii Kölling et al. (2004), ve které se zabývali polymorfizmy C677T a A1298C genu pro MTHFR, hladinou tHcy, folátu a vitaminu 23
B12 a mírou ischemické choroby srdeční (ICHS). Zjistili také, ţe polymorfizmus C677T je nezávislým ukazatelem hladiny tHcy. Bylo testováno 2121 pacientů s ICHS a 617 kontrolních osob. Zjistili, ţe se koncentrace tHcy zvyšovala, jak u osob s ICHS, tak u kontrolních, od CC k TT genotypu polymorfizmu C677T, na rozdíl od koncentrace folátu v plazmě, která se naopak od CC k TT genotypu sniţovala. Ţádné významné rozdíly koncentrace vitaminu B12 nebyly pozorovány u jednotlivých genotypů. Co se týče A1298C, Kölling et al. nezjistili u tohoto polymorfizmu významné změny koncentrací tHcy, folátu nebo vitaminu B12. Zjistili také, ţe pacienti ICHS měli vyšší hladinu tHcy oproti kontrolní skupině. Vlivy jednotlivých genotypů na koncentraci folátu v plazmě by mohly být také spojeny s etnickými změnami. Příkladem je studie Gašparovič et al. (2004), ve které posuzovali hladiny tHcy a polymorfizmus C677T genu pro MTHFR u dvou etnických skupin na Slovensku, 149 příslušníků bylo romské menšiny a 351 příslušníků bílé rasy. Zjistili například, ţe hladiny tHcy byly významně niţší u romské populace. Vlivy jednotlivých genotypů na hladinu tHcy nebyly však u romské populace potvrzeny, na rozdíl od příslušníků bílé rasy, u kterých byl TT genotyp spojen s výrazně vyššími hladinami tHcy. Zastoupení jednotlivých genotypů CC, CT a TT bylo následující: u romské menšiny byly frekvence 40,4%, 46,6% a 13,0% a frekvence 47,7%, 41,7%, 10,6% byly zjištěny u bílé rasy. Je mnoho faktorů, které mohou ovlivňovat jak koncentrace folátu v plazmě, tak koncentrace tHcy a s tím spojená rizika onemocnění. Mezi tyto faktory lze zařadit také polymorfizmy v genu pro MTHFR, převáţně polymorfizmu C677T. Zmíněné studie a mnoho dalších naznačují, ţe TT genotyp tohoto polymorfizmu souvisí s vyššími hladinami tHcy a niţšími hladinami folátu v plazmě. Abychom mohli potvrdit tato zjištění, museli bychom u námi testovaných osob zjišťovat koncentrace folátu v plazmě nebo hladiny tHcy, ale také například věk, pohlaví, ţivotní styl, mnoţství přijímaného folátu ve stravě a další. Veškeré tyto faktory by mohly mít vliv na frekvenci genotypů MTHFR polymorfizmů. Nezávisle na těchto faktorech jsme zjistili, ţe v české populaci, jak u polymorfizmu C677T, tak u A1298C, byl heterozygotní genotyp tím nejčastějším.
24
8
ZÁVĚR V této práci bylo úkolem zjistit, jaké jsou frekvence genotypů polymorfizmu
C677T a A1298C genu pro MTHFR v české populaci. K dispozici jsme měli DNA 106 osob, kterou jsme izolovali z bukální sliznice. DNA byla dále amplifikována pomocí PCR, po které následovala restrikční analýza. Pomocí gelové elektroforézy byly detekovány jednotlivé fragmenty, z nichţ kaţdý značil určitý genotyp. Testování bylo anonymní a osoby nebyly vyšetřovány pro hladinu homocysteinu, ani folátu v plazmě. Nebyla prováděna také ţádná jiná vyšetření a zdravotní stav osob také nebyl znám. Moţné vztahy genotypů k jistým abnormalitám byly zjištěny pomocí dosavadních studií zaměřených převáţně na polymorfizmus C677T, který je díky jeho vlivům větším středem zájmu neţ A1298C.
25
9
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Aléssio ACM, Höehr NF, Siqueira LH, Bydlowski SP, Annichino-Bizzacchi JM. Polymorphism C776G in the transcobalamin II gene and homocysteine, folate and vitamin B12 concentrations. Association with MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G polymorphisms in healthy children. Thrombosis Research 119:571-577, 2008 Arinami T, Yamada N, Yamakawa-Kobayashi K, Hamaguchi H, Toru M. Methylenetetrahydrofolate Reductase Variant and Schizophrenia/Depression. Americal Journal of Medical Genetics 74:526-528, 1997 Botto LD, Yang Q. 5,10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Variants and Congenital Anomalies: A Huge Review. American Journal of Epidemiology 151:862877, 2000 Coulam CB, Wallis D, Weinstein J, DasGupta DS, Jeyendran RS. Comparison of Thrombophilic Gene Mutations Among Patients Experiencing Recurrent Miscarriage and Deep Vein Thrombosis. American Journal of Reproductive Immunology 60:426431, 2008 Erben K. Homocystein – podivuhodná molekula nebezpečná pro člověka. Vesmír 83:433-435, 2004 Ford AH, Flicker L, Hankey GJ, Norman P, van Bockxmeer FM, Almeida OP. Homocysteine,
methylenetetrahydrofolate
reductase
C677T
polymorphism
and
cognitive impairment: the health in men study. Molecular Psychiatry 1-8, 1 March 2011 Gašparovič J, Rašlová K, Bašistová Z, Zacharová M, Wsólová L, Avdičová M, Blažíček P, Lietava J, Siváková D. Effect of C677T Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism on Plasma Homocysteine Levels in Ethnic Groups. Physiol. Res. 53:215-218, 2004 Ilhan Nevin, Kucuksu M, Kaman D, Ilhan Necip, Ozbay Y. The 677 C/T MTHFR Polymorphism is Associated with Essential Hypertension, Coronary Artery Disease, and Higher Homocysteine Levels. Archives of Medical Research 39:125-130, 2008
26
Kempisty B, Bober A, Łuczak M, Czerski P, Szczepankiewicz A, Hauser J, Jagodziński PP. Distribution of 1298A>C polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase gene in patients with bipolar disorder and schizophrenia. European Psychiatry 22:39-43, 2007 Kim
YI.
5,10-Methylenetetrahydrofolate
Reductase
Polymorphism
and
Pharmacogenetics: A New Role of Single Nucleotide Polymorphism in the Folate Metabolic Pathway in Humam Health and Disease. Nutrition Reviews 63:398-407, 2005 Kölling K, Ndrepepa G, Koch W, Braun S, Mehilli J, Schömig A, Kastrati A. Methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T and A1298C polymorphisms, plasma homocysteine, folate, and vitamin B12 levels and the extent of coronary artery disease. The American Journal of Cardiology 93:1201-1206, 2004 Kvasnička J. Trombofilie a trombotické stavy v klinické praxi. GRADA Publishing (str. 57, 115), 2003 Langsenlehner
T,
Renner
W,
Yazdani-Biuki
B,
Langsenlehner
U.
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and breast cancer risk: a nested-casecontrol study and a pooled meta-analysis. Breast Cancer Res Treat 107:459-460, 2008 Le Marchand L, Wilkens LR, Kolonel LN, Henderson BE. The MTHFR C677T Polymorphism and Colorectal Cancer: The Multiethnic Cohort Study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 14:1198-1203, 2005 Maron BA, Loscalzo J. The Treatment of Hyperhomocysteinemia. Annual Review of Medicine 60:39-54, 2009 Martínez-Frías
ML.
The
Biochemical
Structure
and
Function
of
Methylenetetrahydrofolate Reductase Provide the Rationale to Interpret the Epidemiological Results on the Risk for Infants With Down Syndrome. American Journal of Medical Genetics 146A:1477-1482, 2008 Medina MÁ, Urdiales JL, Amores-Sánchez MI. Roles of homocysteine in cell metabolism. Eur. J. Biochem. 268:3871-3882, 2001
27
Mtiraoui N, Ezzidi I, Chaieb M, Marmouche H, Aouni Z, Chaieb A, Mahjoub T, Vaxillaire M, Almawi WY. MTHFR C677T and A1298C gene polymorphisms and hyperhomocysteinemia as risk factors of diabetic nephropathy in type 2 diabetes patients. Diabetes Research and Clinical Practice 75:99-106, 2007 Nazarenko MS, Puzyrev VP, Lebedev IN. Frequencies of C677T and A1298C polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase gene at the early stage of human individual development. Russian Journal of Genetics 42:578-583, 2006 Pandey P, Pradhan S. Homocysteine: a possible modifiable risk factor in vascular dementia. Annals of Neurosciences 13:12-17, 2006 Prinz-Langenohl R, Brämswig S, Tobolski O, Smulders YM, Smith DEC, Finglas PM, Pietrzik K. [6S]-5-methyltetrahydrofolate increases plasmafolate more effectively than folic acid in women with the homozygous or wild-type 677C→T polymorphism of methylenetetrahydrofolatereductase. British Journal of Pharmacology 158:2014-2021, 2009 Přistoupilová K, Přistoupil TI. Homocystein a civilizační choroby. Vesmír 81:624626, 2002 Refsum H, Smith AD, Ueland PM, Nexo E, Clarke R, McPartlin J, Johnston C, Engbaek F, Schneede J, McPartlin C, Scott JM. Facts and Recommendations about Total Homocysteine Determinations: An Expert Opinion. Clinical Chemistry 50:3-32, 2004 Rosenblatt DS. Methylenetetrahydrofolate reductase. Clinical and Investigative Medicine 24:56-59, 2001 Ruiz JR, Hurtig-Wennlöf A, Ortega FB, Patterson E, Nilsson TK, Castillo MJ, Sjöström M. Homocysteine levels in children and adolescents are associated with the methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T genotype, but not with physical activity, fitness or fatness: The European Youth Heart Study. British Journal of Nutrition 97:255262, 2007 Sucker C, Kurschat C, Farokhzad F, Hetzel GR, Grabensee B, Maruhn-Debowski B, Loncar R, Scharf RE, Zotz RB. The TT Genotype of the C677T Polymorphism in
28
the
Methylentetrahydrofolate
Reductaseas
a
Risk
Factor
in
Thrombotic
Microangiopathies: Results From a Pilot Study. 15:283-288, 2009 Taioli E, Garza MA, Ahn YO, Bishop DT, Bost J, Bundai B, Chen K, Gemignani F, Keku T, Lima CSP, Le Marchand L, Matsuo K, Moreno V, Plaschke J, Pufulete M, Thomas B, Toffoli G, Wolf CR, Moore CG, Little J. Meta- and Pooled Analyses of the Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) C677T Polymorphism and Colorectal Cancer: a Huge Review. American Journal of Epidemiology 15:, 2009 Ueland PM, Hustad S, Schneede J, Refsum H, Vollset SE. Biological and clinical implications of the MTHFR C677T polymorphism. TRENDS in Pharmacological Sciences 22:195-201, 2001 Veselá K, Pavlíková M, Janošíková B, Anděl M, Zvárová J, Hyánek J, Kožich V. Genetic Determinants of Folate Status in Central Bohemia. Physiol. Res. 54:295-303, 2005 Wilcken B, Bamforth F, Li Z, Zhu H, Ritvanen A, Renlund M, Stoll C, Alembik Y, Dott B, Czeizel AE, Gelman-Kohan Z, Scarano G, Bianca S, Ettore G, Tenconi R, Bellato
S, Scala
R, Joutchenko
I, Mutchinick
L, Kavteladze
OM,
L, Bermejo
López
MA, de
Walle
E, Martínez-Frías
H, Hofstra
ML, Gallagher
M, Erickson JD, Vollset SE, Mastroiacovo P, Andria G, Botto LD. Geographical and ethnic variation of the 677C>T allele of 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR): findings from over 7000 newborns from 16 areas world wide. Journal of Medical Genetics 40:619-625, 2003
Internetová stránka: http://ghr.nlm.nih.gov/gene=MTHFR
29
