Virologie - obecná
MUDr. Drahomíra Rottenbornová
Vlastnosti virů Jsou nejmenší mikroorganismy (20-300 nm) Nerostou, nedělí se, nemetabolizují • Jejich metabolismus je plně závislý na hostitelské buňce • Viry se nemnoží, ale jsou pomnožovány hostitelskou buňkou - patří proto k obligátním intracelulárním parazitům a nelze je běžně kultivovat v prostředí bez buněk
Morfologie (struktura) virů Je velmi jednoduchá. Virová částice (virová partikule) je označována jako virion. Obsahuje: • nukleovou kyselinu, která obsahuje genetické informace nezbytné pro realizaci reprodukce viru • nukleová kyselina je v ochranném proteinovém obalu (kapsida) - komplex nukleové kyseliny a obalu se nazývá nukleokapsida U řady virů tvoří nukleokapsida kompletní virion (tzv. neobalené viry).
Některé viry mají kromě kapsidy ještě další lipoproteinový obal. Je tvořen lipidy membrán hostitelské buňky (tzv. obalené viry). Genetická informace virů je zapsána vždy jen v jediném druhu nukleové kyseliny - dělení na DNA a RNA viry.
Viry neobalené
Viry obalené
Rezistentní k éteru a tukovým rozpouštědlům
Poškozují je tuková rozpouštědla
Odolné k vlivům zevního prostředí
Citlivější vůči chemickým a fyzikálním vlivům Déle mohou vydržet v zaschlých sekretech a tkáních
Nejsou větš. inaktivovány kyselým pH Inaktivovány kyselým pH žaludku žaludku-pronikají snadno do dolních partií trávicího traktu, jsou vylučovány stolicí, přetrvávají dlouho v zevním prostředí (odpadní, povrchové vody) Přenos: přímý kontakt, kontaminované předměty, voda, potrava
Přenos: přímý styk (kapénková nákaza, pohlavně přenosné nemoci)
Snáze adherují k buňkám a pronikají do nich Např. Poliovirus, HAV, HEV, rotaviry, coxsackie viry, ECHO viry
Např. Virus KE, zarděnek, HBV, HCV, HIV, viry chřipky, herpetické viry
Replikace virů • •
• • • • • • •
Je principem reprodukce virů Jedná se o "přepis" genetické informace z virové nukleové kyseliny do nukleové kyseliny hostitelské buňky a tvorbu nových virových partikulí. U DNA virů probíhá replikace v jádře hostitelské buňky, u RNA virů probíhá v cytoplazmě. Schéma replikace virů představuje několik na sebe navazujících fází: adsorbce virionu na povrch vnímavé buňky průnik viru do buňky obnažení genomu (destrukce virových proteinových obalů) replikace virového genomu (přepis genetické informace z virové NK do DNA hostitelské buňky tvorba virových strukturálních proteinů dozrávání a uvolnění virových partikulí z hostitelské buňky (mezibuněčými kanálky, pučením, do sousední buňky po splynutí cytoplasmatických membrán, po buněčné smrti a lýze buňky)
Replikace viru chřipky A - popis na dalším snímku
• • • • • • • • •
Virus se na buňku naváže prostřednictvím hemaglutininu (HA) na cukry s kyselinou sialovou na povrchu epitelu v plicích a hrdle (krok 1). Buňka poté virus transportuje do endozómu prostřednictvím endocytózy. Část HA sfůzuje s membránou a uvolní tak virovou RNA (vRNA), příslušné proteiny a RNA dependentní RNA polymerázy do cytoplasmy (krok 2). Následně se z těchto jednotek vytvoří komplex, který je transportován do jádra, kde RNA dependentní RNA polymeráza vytvoří komplementární pozitivní cRNA (krok 3a a 3b). cRNA je buď exportována do cytoplasmy a následně translatována (krok 4) nebo zůstane v jádře. Nově syntetizované proteiny jsou buďto díky Golgiho aparátu přeneseny na povrch buňky (jako v případě HA a NA (krok 5b), nebo přeneseny do jádra, kde se váží na vRNA a vytvoří nové virové genové částice (krok 5a). Další virové proteiny mají mnoho funkcí, například štěpí buněčnou mRNA, aby vir získal dostatek nukleotidů k syntéze vRNA, nebo k inhibici translace hostitelských mRNA. Negativní vRNA tvořící genom budoucích virů, polymerázy a další virové proteiny utvoří virion. HA a NA se na povrchu buňky shluknou v bouli, virové jádro opustí buněčné jádro a vstoupí do tohoto výběžku (krok 6). Dospělý virus vypučí z buňky obalen lipoproteinovou membránou buňky obohacenou o HA a NA (krok 7). Cyklus znovu začíná navázáním HA na hostitelskou buňku, přičemž NA vyčistí novou membránu od receptorů vázající HA. Po uvolnění nové generace dochází ke smrti buňky.
Klasifikace virů Čeleď
Podčeleď
Paramyxo- Paramyxoviridae virinae
Pneumovirinae
Rod
Druh
Respirovirus
Viry parainfluenzy 1 a 3
Morbillivirus
Virus spalniček
Rubulavirus
Virus příušnic Viry parachřipky 2 a 4
Megamyxovirus
Viry Hendra a Nipah
Pneumovirus
Respirační synciciální virus
Metapneumovirus
Lidský metapneumovirus
Laboratorní diagnostika ve virologii • Ve své podstatě je laboratorní průkaz virových infekcí stejný jako průkaz infekcí bakteriálních (průkaz přímý a nepřímý). • Ve srovnání s bakteriologií jsou virologické laboratorní metody většinou nákladnější, pracnější, zdlouhavější.
Odběr a zasílání vzorků • •
Krev na sérologii (nejméně 2 vzorky v odstupu 10-14 dnů) Krev k izolaci viru (nesmí se mrazit) Výtěry (zasílat ve speciálních transportních půdách určených pro virologii) Výplach z nosohltanu, z nosu (použ. se speciální odběrová média, kterým si nemocný vykloktá Sekret z nosohltanu (odběr sterilní cévkou) Stolice (do sterilní široké zkumavky) Likvor Pitevní materiál Sputum, sliny, moč Transport materiálu do virologické laboratoře musí být rychlý, aby nedošlo k inaktivaci virů. Tu lze omezit snížením teploty (zmrazení vzorku, zchlazení na tajícím ledu v termosce).
Přímý průkaz virů Mikroskopický průkaz • elektronový mikroskop (př. průkaz virů ve stolici) Průkaz virových antigenů • ELISA (př. průkaz HBsAg, viru chřipky A,B, parachřipky, RS-virů) • IF (př. dg chřipky, RS-virózy, herpetické encefalitidy) • latexaglutiance (př. průkaz rotavirových a adenovirových antigenů ve stolici) Průkaz virových NK • dg obtížně kultivovatelných virů:HIV, HBV, HCV, EBV, CMV aj • dg encefalitid a aseptických meningitid Izolace viru Viry se nemohou replikovat mimo hostitelskou buňku. Izolovat je můžeme na: • zvířatech • kuřecích zárodcích • buněčných (tkáňových) kulturách
Přímý průkaz virů Mikroskopický průkaz • elektronový mikroskop (př. průkaz virů ve stolici) Průkaz virových antigenů • ELISA (př. průkaz HBsAg, viru chřipky A,B, parachřipky, RS-virů) • IF (př. dg chřipky, RS-virózy, herpetické encefalitidy) • latexaglutiance (př. průkaz rotavirových a adenovirových antigenů ve stolici) Průkaz virových NK • dg obtížně kultivovatelných virů:HIV, HBV, HCV, EBV, CMV aj • dg encefalitid a aseptických meningitid Izolace viru Viry se nemohou replikovat mimo hostitelskou buňku. Izolovat je můžeme na: • zvířatech • kuřecích zárodcích • buněčných (tkáňových) kulturách
Mikroskopický průkaz • Elektronový mikroskop
Adenoviry
Rotaviry
Průkaz virových antigenů •
ELISA (př. průkaz HBsAg, viru chřipky A,B, parachřipky, RS-virů) (sérologická metoda, která se používá častěji k průkazu protilátek)
•
Imunofluorescence (př. dg chřipky, RS-virózy, herpetické encefalitidy)
• latexaglutiance (př. průkaz rotavirových a adenovirových antigenů ve stolici)
• Imunochromatografie (př. průkaz rotavirových a adenovirových antigenů ve stolici, antigenů respiračních patogenů)
Průkaz virových nukleových kyselin • •
dg obtížně kultivovatelných virů:HIV, HBV, HCV, EBV, CMV aj dg encefalitid a aseptických meningitid
Izolace viru Viry se nemohou replikovat mimo hostitelskou buňku. Izolovat je můžeme na: zvířatech kuřecích zárodcích (např. virus chřipky) buněčných (tkáňových kulturách)
buněčné (tkáňové kultury) •
př. buňky opičích ledvin, kuřecí embryonální fibroblasty, buňky králičích ledvin, buňky lidských embryonálních ledvin, (HeLa buňky z karcinomu děložního čípku), buňky z lidských embryonálních plic)
•
Naočkované tkáňové kultury se inkubují v termostatu a denně se prohlížejí pod mikroskopem. Buňky, v nichž se pomnožil virus, se většinou mění. Tomuto jevu říkáme cytopatický efekt (CPE). Některé viry mají tak typický CPE, že je podle něj můžeme určit. Viry, které nemají typický CPE, dourčujeme některými dalšími postupy (hemadsorpce, hemaglutinace, interference, el. mikroskopie, neutralizační test aj.)
Nepřímý průkaz viru (průkaz protilátek) Využívá se ve virologii častěji než průkaz přímý, protože je levnější, jednodušší, rychlejší. Ve virologické sérologii používáme • reakce běžné i v sérologii bakteriální (KFR, IF, ELISA) • reakce užívané výhradně ve virologii (neutralizační test, hemaglutinačně inhibiční test) Často potřeba 2 vzorky séra (akutní a rekonvalescentní) odebrané s odstupem 14 - 21 (i více) dnů . Stanovení dynamiky titru protilátek (tzn. vzestup titru protilátek, který prokazuje akutně probíhající onemocnění).
Protivirová chemoterapie Je těžké vyvinout antivirové chemoterapeutikum, které by současně nepoškozovalo hostitelskou buňku (vzhledem k naprosté závislosti množení virů na metabolismu hostitelské buňky). Současná antivirotika fungují na následujících principech:
1.inhibice adsorbce virů na vnímavou buňku 2.zábrana uvolnění virové NK (př. Amantadin, Rimantadin-terapie chřipky A)
3. zásah do transkripce a translace virových genů a) analoga nukleosidů (acyklovir (Herpesin, Zovirax/ -th infekce HSV, VZV gancyklovir-th CMV infekce) b) inhibitory DNA-polymeráz (Foscarnet-th HIV infekce) c) inhibitory RNA polymeráz (ribavirin-th infekce RSV, chřipky B, parachřipky, adenoviry, viry Lassa, Marburg, Ebola) d) inhibitory reverzní transkriptázy (azidothymidin aj. v th HIV infekce) 4. interferon alfa (th chronických hepatitid B,C) Většina antivirových preparátů má více či méně závažné nežádoucí vedlejší účinky. Ty se projeví zejména při dlouhodobé terapii HIV infekce. To se řeší kombinací virostatik různého typu a jejich střídáním .
Z praktického hlediska je výhodnější dělit antivirotika podle použití na: • protiherpesvirová • proticytomegalovirová • protichřipková • antiretrovirotika • interferony • ostatní: ribavirin (k léčbě VHC, hemoragických horeček, RSviru, chřipky A a B, parainfluenzy, splaniček)
protiherpesvirová
acyclovir valaciclovir famciclovir
Herpesin, Zovirax Valtrex Famvir
proticytomegalovirová
ganciclovir cidofovir foscarnet
Cymevene Vistide Foscavir
protichřipková
amantadin rimantadin zanamivir oseltamivir
PK-Merz, viregyt-K
antiretrovirotika
Viz další tabulka
Interferony
IFN-alfa IFN-beta
ostatní: ribavirin
lokální
Léčba herpes, genitálních bradavic
Relenza Tamiflu
(Alphaferon,Intron, Roferon, Welferon) (Betaferon, Rebif)
Antiretrovirotika Nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NRTI) zidovudin
Retrovir, Azitidin
didanosin
Videx
zalcitabin
Hivid
stavudin
Zerit
lamivudin abacavir
Ziagen
adefovir
Preveon
fenofovir Nenukleosidové ihibitory RT (NNTRI) nevirapin, delavirdin, efavirenz, lovirid Inhibitory virové proteinasy
saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinaviramprenavir
