Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
FAKULTA VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE FAKULTA FARMACEUTICKÁ
Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2013
Sborník příspěvků z výsledků řešení projektů IGA VFU Brno 2013 financovaných z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT na rok 2013
11. prosince 2013
BRNO
1
Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2013 Fakulta veterinárního lékařství Fakulta veterinární hygieny a ekologie Fakulta farmaceutická
Editace:
prof. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. prof. MVDr. Jiří Pikula, Ph.D. doc. RNDr. Bc. Jiří Pazourek, Ph.D.
Za věcnou a jazykovou správnost odpovídají autoři.
Vydání: první Copyright © 2013 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
2
Vážení kolegové,
Předkládáme vám již čtvrtý Sborník konference Interní grantové agentury VFU Brno. Je hmatatelným dokladem aktivity fakult v rámci specifického výzkumu, zapojení mladých vědeckých pracovníků do týmů ústavů a klinik. Přírodní vědy jsou v posledních letech neuvěřitelně rozvíjeny nejen v základním výzkumu, experimentálním vývoji ale i realizovány v řadě patentů a inovací. Držet krok se světovým vývojem je stále těžší. Čas od nápadu přes jeho realizaci pokusů a publikaci se stále zkracuje, náročnost na vědecké pracovníky stále stoupá. Je důležité, že Veterinární a farmaceutická univerzita Brno s rozvojem poznatků ve vědách veterinárních a farmaceutických dlouhodobě nejen drží krok, ale patří mezi nejlepší. Jsem přesvědčena, že i výsledky výzkumu na naší univerzitě dosažené v tomto roce budou mít vysokou kvalitu. Děkuji Vám všem za práci, kterou jste v této oblasti odvedli.
Prof. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. Prorektorka pro vědu, výzkum a zahraniční vztahy
V Brně, 11. 12. 2013
3
4
Obsah
FVL Využití zátěžového trenažéru v diagnostice etiologických faktorů a v terapii dorzální dislokace měkkého patra u koní. ........................................................................................................................ 11 Ověření vhodnosti SPA ("single port access") laparoskopie při preventivní gonadektomii a gastropexi u malých zvířat; zhodnocení pooperační bolesti po SPA v porovnání s minilaparotomií. .................. 14 Tvorba spojení zub-kost u plazů a její klinický význam ....................................................................... 17 Srovnání biomechanických podmínek v kolenním kloubu s rupturou LCC v závislosti na typu jeho stabilizace: ex vivo studie .................................................................................................................... 20 Vliv přítomnosti přechodového obratle v lumbosakrální oblasti na velikost acetabulárního úhlu u psů ............................................................................................................................................................. 23 Dynamika hojení parodontálních defektů v závislosti na užité antibiotické terapii ........................... 26 Stanovení vlivu antibiotické léčby na složení gastrointestinální mikroflory u volně žijících goril nížinných.............................................................................................................................................. 30 Využití ergometrinu a ceftiofuru v průběhu puerperia u dojnic ......................................................... 33 Prevalence a genotypizace anellovirů afrických primátů .................................................................... 36 Studium syndromu „headshaking“ u koní ........................................................................................... 39 Standardizace rentgenologického vyšetření drobných savců pomocí zubního rentgenu .................. 42 Dlouhodobá suprese pohlavní aktivity kocourů za použití implantátu s GnRH agonistou deslorelinem ............................................................................................................................................................. 45 Parazitofauna volně žijících habituovaných mangabejů štíhlých (Cercocebus agilis) s důrazem na mezidruhové přenosy .......................................................................................................................... 48 Diversita a hostitelská specifita parazitických prvoků rodu Hepatozoon u masožravců .................... 51 Vybrané biochemické parametry semenné plazmy hřebců a jejich korelace s kvalitou semene a jeho mrazitelností ........................................................................................................................................ 54 Stanovení regulačních cytokinů a subpopulací lymfocytů u psů s atopickou dermatitidou ............... 57 Porovnání aktivátorů a inhibitorů koagulace a fibrinolýzy u onemocnění asociovaných s výskytem diseminované intravaskulární koagulace ............................................................................................ 60 FVHE Aplikace mikrobiologických a molekulárně genetických metod pro detekci, izolaci a typizaci Helicobacter pullorum ......................................................................................................................... 65 Fenotypizace leukocytů u sivenů amerických (Salvelinus fontinalis) s využitím průtokové cytometrie68 Stanovení tetracyklinových, sulfonamidových a fluorochinolonových antibiotik v biologických matricích s využitím online extrakce na pevné fázi přímo spojené s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií.............................................................................................. 71 Využití β-estradiolového liposomu s enkapsulovanou antisense sekvencí pro genovou terapii ........ 74 Využití kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA) při terapii intoxikace olovem u ptačích embryí 77 Využití biogenních aminů pro určení hygienické kvality zvěřiny zaječí zvěře ..................................... 80 Srovnání profilu mastných kyselin ve svalovině bažantů a orebic ...................................................... 83
7
Sledování dynamiky růstu vybraných mikroorganismů v potravinách určených k přímé spotřebě při použití různých konzervačních prostředků a způsobů balení ............................................................. 86 Prioritní organické polutanty na bázi organohalogenovaných sloučenin a jejich distribuce ve vodním ekosystému ......................................................................................................................................... 89 Identifikace parciální sekvence genu kódujícího alergenní protein parvalbumin tresky aljašské (Theragra chalcogramma) metodou real-time PCR ............................................................................ 92 Transkriptomická analýza reakce netopýrů na infekci Geomyces destructans .................................. 95 Syntetické vonné látky a jejich distribuce do složek životního prostředí ............................................ 98 Hodnocení vlivu deoxynivalenolu na vybrané ukazatele imunitního systému ryb Chyba! Záložka není definována.1 Kapr obecný (Cyprinus carpio) jako modelový organismus pro hodnocení vlivu moderních pesticidů na vznik oxidativního stresu .............................................................................................................. 104 Identifikace masa zvěřiny pomocí PCR a PCR-RFLP metody ............................................................. 107 Využití metody RT-PCR v diagnostice genové exprese u dania pruhovaného (Danio rerio) vystaveného účinku norfloxacinu ........................................................................................................................... 110 Vliv oxichloridu měďnatého na vývojová stádia vodních organizmů ................................................ 113 Výskyt baktérií čeledi Enterobacteriaceae s produkcí ESBL v syrovém mléce a mechanismy jejich rezistence .......................................................................................................................................... 117 Sledování dopadu působení stresu v důsledku předtransportní manipulace na hladinu stresových ukazatelů v krvi brojlerových kuřat ................................................................................................... 120 FaF Vliv geranylovaných flavonoidů na experimentálně indukovanou kolitidu ...................................... 125 Vplyv ZnO nanočastíc na rastlinnú modelovú kultúru BY-2 .............................................................. 128 Vliv singletového kyslíku na expresi a transkripci antioxidačních enzymů ....................................... 131 Izolace obsahových látek z rostliny Nasa triphylla ............................................................................ 134 Vliv plniv a rozvolňovadel na vlastnosti a disoluční profil liquisolid systémů ................................... 137 Moderní léková forma pro lokální antimykotickou terapii ............................................................... 140 Využití modifikátorů pH pro dosažení pH-nezávislého disolučního profilu slabě bazického léčiva z matricových tablet ............................................................................................................................ 143 Farmakologický screening antihypertenzivního a negativně chronotropního efektu nových derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolu ...................................................................................................... 146 Polymorfismy v genech pro TNFRSF1A a TNFRSF1B, jejich asociace s fenotypem Crohnovy choroby a efektivitou biologické léčby infliximabem. ........................................................................................ 149 Příprava, charakterizace a in vitro a in silico hodnocení aktivity nových inhibitorů polymerace mikrotubulů jako potenciálních antineoplastik................................................................................. 152 Příprava nových 4-arylaminochinolinů a určení spektra jejich biologické aktivity ........................... 155 Vliv rodiny p53 na působení cytostatik u lidských glioblastom ......................................................... 158 Návrh a syntéza nových inhibitorů HDAC jako potenciálních terapeutik ......................................... 161 Práva k duševnímu vlastnictví ve farmacii: právní úprava a jeho ochrana v EU ............................... 164
8
Příspěvky Fakulty veterinárního lékařství
9
10
Využití zátěžového trenažéru v diagnostice etiologických faktorů a v terapii dorzální dislokace měkkého patra u koní. Michaela Kovářová, Štěpán Bodeček Veterinární a Farmaceutická univerzita v Brno, Fakulta veterinárního lékařství, Klinika chorob koní
Úvod Poruchy horních cest dýchacích (HCD) jsou častou příčinou intolerance zátěže u dostihových a sportovních koní. Endoskopické vyšetření HCD v klidu umožní diagnostikovat pouze část těchto patologických stavů (např. idiopatická levostranná hemiplegie hrtanu). Dynamické poruchy horních cest dýchacích (dorzální dislokace měkkého patra, faryngeální kolaps, axiální deviace aryepiglotických řas, retroverze epiglottis…) lze diagnostikovat pouze v zátěži, přičemž jednou z nejčastějších příčin zátěžové intolerance u dostihových koní je dorzální dislokace měkkého patra (DDSP) (Tan a kol. 2005, Jahn a kol. 2010). Zátěžovou endoskopii lze provádět v terénu pod jezdcem nebo na vysokorychlostním trenažéru. Po zavedení zátěžového testu s využitím vysokorychlostního trenažéru jako rutinní diagnostické metody na Klinice chorob koní VFU Brno byla DDSP diagnostikována jako nejčastější příčina intolerance zátěže i v našich podmínkách (Melková a kol. 2011). Příčina vzniku DDSP není dosud spolehlivě objasněna. V etiologii se předpokládá podíl zánětů horních a dolních cest dýchacích, neuropatie n. vagus a n.glossopharyngeus, které zapříčiňují nedostatečnou tenzi měkkého patra a nadměrný pohyb hrtanu v kraniokaudálním směru během cvalového skoku (Holcombe and Durchame 2007). Materiál a metodika Samotnému vyšetření na vysokorychlostním trenažéru předcházel odběr anamnézy, klinické vyšetření pacienta, biochemické vyšetření krve, klidová endoskopie, bronchoalveolární laváž (BAL), mikrobiologické vyšetření odebraných vzorků z dýchacích cest. Aby mohla být zátěžová endoskopie bezpečně provedena, musel být kůň postupně navykán na pohyb na trenažéru (Sato AB, Švédsko). Před samotným vyšetřením byly pacientům připevněny elektrody pro snímání srdeční frekvence a EKG křivky a zavedena kanyla do v. jugularis pro odebírání krve během zátěže pro stanovení hladiny laktátu a pro biochemické vyšetření krve po zátěži. Poté byl pacient podroben standardnímu zátěžovému testu na vysokorychlostním trenažéru (krok, klus, cval). V poslední fázi zátěže byl do ventrálního nosního průchodu
11
zaveden flexibilní endoskop (Storz, Německo) a byla provedena dynamická endoskopie HCD. Výsledky endoskopického vyšetření byly zaznamenány a spolu s ostatními výsledky použity ke stanovení příčiny intolerance zátěže. Pokud byla u pacienta prokázána DDSP, byly další terapeutické kroky provedeny podle výsledků vyšetření. Zhodnocení efektu terapie bylo provedeno na základě dotazníku, rozeslaného chovatelům a trenérům, pomocí porovnání sportovních výsledků před a po terapii a výpočtu performance indexu (King a kol. 2001). Výpočet performace indexu: po zákroku [(závod 1 body x scalar) + (závod 2 body x scalar) + závod 3 body x scalar)] před zákrokem [(závod 1 body x scalar) + (závod 2 body x scalar) + (závod 3 body x scalar)] Body: 1. místo – 5 bodů
Scalar: I. Kategorie – 1
2.místo – 4 body
II. Kategorie – 0,8
3. místo – 3 body
III. Kategorie – 0,6
4. místo – 2 body
IV. Kategorie – 0,4
5. místo – 1 bod Performance index > 1, koně se zlepšenou výkonností. Performance index ≤ 1, koně se zhoršenou výkonností. Výsledky Zátěžový test byl proveden u 22 koní, dynamická porucha v horních cestách dýchacích byla prokázaná u desíti koní. Z toho se jednalo o devět koní s DDSP a o dva koně s vibrací aryepiglotických řas (ADAF; u jednoho pacienta byly obě poruchy). Na základě vyšetření dolních dýchacích cest pomocí BAL po zátěži a vyšetření krve (ABR, biochemie) byla jako příčina intolerance zátěže určena myopatie u dvou koní a zánět dolních cest dýchacích (IAD, intersticiální pneumonie) u pěti koní. U šesti koní byla během klidové endoskopie prokázána idiopatická levostranná hemiplegie laryngu (IHL), u 12 faryngeální lymfoidní hyperplazie (PLH). U 14 pacientů byla zjištěna během vyšetření jedna porucha, u pěti byla kombinace poruch a tří pacientů bylo vyšetření bez nálezu. U devíti koní během zátěžové endoskopie byla zjištěna DDSP, z nich u čtyř případů byla současně jako možná příčina pozorována PLH, u jednoho pacienta byla kombinace DDSP, PLH a IHL, v jednom případě DDSP a ADAF a u tří koní byla DDSP pozorována bez jiné zjevné příčiny. Dorsální dislokace měkkého patra je jednou z hlavních příčin intolerance zátěže u dostihových koní. V rámci našeho projektu bylo sledováno retrospektivně 36 koní, u kterých byla stanovena diagnóza DDSP na základě anamnézy a klidové nebo zátěžové endoskopie (9 koní) a byli následně ošetřeni transendoskopickou laserovou kauterizací. Efektivnost terapie
12
byla vyhodnocena na základě dotazníků rozeslaných trenérům koní, na základě sledování nárůstu výher v dostizích a podle výpočtu performance indexu (PI). Na základě sledování nárůstu výher došlo ke zlepšení u 50 % koní, dle PI u 40 % koní a na základě hodnocení trenérů bylo pozorováno zlepšení u 55 % koní (viz Tab. 1). Tabulka 1 celkový počet koní pohlaví
věk koní výsledek ošetření
nárůst výher
performance index
dotazníky
-
14
20
20
klisny hřebci valaši průměrný věk nejmladší/nejstarší zlepšení zhoršení beze změny
2 5 7 5 let 2/9 let 7 koní 7 koní -
5 6 8 4, 5 let 2/9 let 8 koní 12 koní -
4 7 9 4 roky 2/9 let 11 koní 1 kůň 8 koní
Seznam literatury: Holcombe S.J., Durchame N.G.(2007): Disorders of the Nasopharynx and Soft Palate. In Mc Gorum et al. Equine Respiratory Medicine and Surgery. Saunders, 437-457. Jahn P., Žert Z., Dobešová O., Bodeček Š. (2010): Dorzální dislokace měkkého patra u koní. Veterinářství, 60:102-106. King D.S., Tulleners E., Martin B.B. Jr., Parente E.J., Boston R. (2001): Clinical experiences with axial deviation of aryepiglottic folds in 52 racehorses. Veterinary Surgery, 30:151160. Melková P., Dobešová O., Jahn P., Hanák J. (2011): Zavedení zátěžového testu u koní s využitím vysokorychlostního trenažéru. Sborník fakultní studentské vědecké konference IGA VFU Brno 2011. VFU Brno, 30-32. Tan R.H.H., Dowling B.A., Dart A.J. (2005): High-speed treadmill videoendoscopic examination of the upper respiratory tract in the horse: The results of 291 clinical cases. The Veterinary Journal, 170:243-248.
13
Ověření vhodnosti SPA (single port access) laparoskopie při preventivní gonadektomii a gastropexi u malých zvířat Michal Crha, Veronika Šimerdová, Agáta Sívková, Petra Kišová, Miloš Vávra, Jana Lorenzová, Alois Nečas Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Modifikací standardní laparoskopické techniky, která v závislosti na charakteru chirurgického zákroku vyžaduje zavedení dvou a více portů do břišní dutiny, je nedávno představená technika SPA (single port access) laparoskopie neboli SPLS (single port laparoscopic surgery) (Parkinson 2012). Přínos této metody spočívá v omezení traumatizace břišní stěny snížením počtu zaváděných portů (Markar a kol. 2012). Ve veterinární chirurgii se tomuto tématu věnuje pouze několik v nedávné době publikovaných klinických prací zaměřených na užití SPA laparoskopie při preventivní gonadektomii fen (Dupré a kol. 2009, Runge a kol. 2012) a koček (Kim a kol. 2011). Většina dosud publikovaných prací na toto téma hodnotí techniku provedení vlastního zákroku s ohledem na délku trvání chirurgického zákroku a výskyt perioperačních či pooperačních komplikací. Doposud však nebyla publikována studie zaměřena na hodnocení míry pooperační bolesti u koček kastrovaných technikou SPA laparoskopie v porovnání se střední minilaparotomií. Dle našich informací taktéž nebyla doposud publikována klinická studie hodnotící využití SPA laparoskopie při preventivní gonadektomii v porovnání s preventivní gonadektomií a gastropexí fen. Materiál a metodika Srovnání SPA laparoskopie s minilaparotomií při ovariektomii u koček Do studie bylo zařazeno 12 koček, které byly rozděleny do dvou skupin. U jedné skupiny koček (A=6) byla provedena laparoskopicky "single port access ovariektomie" (SPAOE) pomocí teleskopu s vestavěným pracovním kanálem (Karl Storz, Germany). Pro vlastní odstranění vaječníků byly použity bipolární kleště (EnSealTM, Ethicon, Inc., Johnson&Johnson,U.S.). U druhé skupiny (B=6) byla provedena standardní laparotomická ovariektomie (LOE). U všech koček byl zaznamenán věk, hmotnost, tělesná kondice (BCS, body condition score), předoperačně bylo provedeno hematologické a biochemické vyšetření krve. Celková anestezie byla ve všech případech vedena stejným protokolem. Perioperačně bylo zaznamenáno množství tuku kolem vaječníku (skóre 0-3; 0=žádný, 1=minimální, 2=střední množství, 3= velké množství) a krvácení z mezovaria během zákroku (skóre 0-3; 0=žádné, 1=minimální bez nutnosti ošetření, 2= malé (několik kapek) řešitelné laparoskopicky, 3=krvácení vyžadující konverzi v laparotomii). Zaznamenáván byl celkový čas (min) trvání chirurgického zákroku (od první kožní incize po dokončení sutury kůže), délka incize stěny břišní (cm), čas potřebný k nalezení pravostranného/levostranného vaječníku (s)
14
a čas potřebný k odstranění pravostranného/levostranného vaječníku (s). Míra pooperační bolesti byla hodnocena 2, 4, 8, 12 resp. 24 hod po operaci dle Brondani a kol. (2011) a metodikou Colorado State University (feline pain scale). Případné komplikace v hojení operační rány byly sledovány do doby vytažení kožních stehů (tj. 10-14 dnů od operace). Srovnání laparoskopické SPA ovariektomie s laparoskopickou ovariektomií a gastropexí u fen Do studie bylo zařazeno 14 fen. U jedné skupiny fen (A=7) predisponovaných k onemocnění GDV (gastric dilatation-volvulus) syndromem byla provedena laparoskopicky preventivní ovariektomie současně s preventivní gastropexí (GP). U druhé skupiny (B=7) byla provedena laparoskopicky preventivní SPAOE obdobným způsobem jako u koček. U fen byly sledovány a zaznamenávány obdobné parametry jako u koček, při hodnocení intenzity bolesti v pooperačním obdobní byla použita metodika UMPS (University of Melbourne pain scale) a VAS (visual analogue score) dle Holtona a kol. (2001). Statistické metody Pro sumarizaci sledovaných spojitých charakteristik (věk, hmotnost, BCS, apod.) byla použita popisná statistika (průměr, medián, minimum a maximum). Pro srovnání jednotlivých spojitých charakteristik mezi skupinami pacientů dle typu operace byl použit Mannův-Whitneyův test, případně Fisherův exaktní test. Pro párové hodnocení doby nutné k lokalizaci a odstranění pravého a levého vaječníku v rámci jednotlivých skupin pacientů dle typu operace byl použit párový Wilcoxonův test. Výsledky Analýza chirurgického zákroku - laparoskopické vs. laparotomické ovariektomie u koček. Laparotomický zákrok
Laparoskopický zákrok
N
Průměr
Medián (min;max)
N
Průměr
Medián (min;max)
p-hodnota*
Lokalizace pravého vaječníku (s)
6
17
14 (4;33)
6
24
12 (5;76)
0.873
Excize pravého vaječníku (s)
6
163
160 (136;195)
6
150
131 (85;266)
0.337
Lokalizace levého vaječníku (s)
6
60
59 (9;119)
6
121
21 (3;621)
0.337
Excize levého vaječníku (s)
6
160
187 (86;210)
6
78
50 (44;198)
0.025
Délka zákroku (min)
6
17
17 (13;21)
6
27
24 (20;47)
0.008
Délka incize (cm)
6
4.9
5.0 (3.9;5.5)
6
1.7
1.6 (1.4;2.3)
0.004
* Mannův-Whitneyův test
Srovnání intenzity pooperační bolesti u fen podle provedeného chirurgického zákroku. Laparoskopická sterilizace VAS
Laparoskopická sterilizace + gastropexe Průměr Medián (min;max)
Doba po operaci
N
Průměr
Medián (min;max)
N
2 hod
7
4.4
4.7 (2.5;5.8)
7
4.0
4.7 (1.0;6.7)
0.748
4 hod
7
4.4
4.5 (1.9;6.0)
7
3.7
4.5 (1.3;5.3)
0.607
8 hod
7
1.2
1.0 (0.0;3.5)
7
1.8
1.5 (0.0;4.5)
0.437
12 hod
7
0.4
0.0 (0.0;1.8)
7
0.7
0.0 (0.0;2.9)
0.831
24 hod
7
0.0
0.0 (0.0;0.3)
7
0.7
0.0 (0.0;2.9)
0.749
15
*p-hodnota
UMPS
2 hod
6
3.8
4.3 (2.0;4.5)
7
4.0
3.0 (1.0;11.5)
0.311
4 hod
6
3.7
3.5 (2.0;5.0)
7
3.2
3.0 (0.5;5.0)
0.610
8 hod
6
2.2
2.0 (1.0;5.0)
7
2.0
2.0 (0.0;6.0)
0.703
12 hod
6
1.3
0.8 (0.0;3.0)
7
1.4
1.0 (0.0;7.0)
0.820
24 hod
6
0.3
0.0 (0.0;1.0)
7
1.2
0.0 (0.0;5.5)
0.463
* Mannův-Whitneyův test, VAS (visual analoge score), UMPS (Universtity of Melbourne pain scale)
Závěr Prokázali jsme statisticky významný rozdíl v délce kožní incize mezi laparotomicky a laparoskopicky ošetřenou skupinou koček. Nebyl však prokázán statisticky významný rozdíl v intenzitě pooperační bolesti, stejně jako ve výskytu peri/po-operačních komplikací mezi těmito skupinami. Laparoskopická SPAOE trvala u koček oproti LOE v průměru o 10 min déle a nebyla spojena s rychlejší lokalizací vaječníků v břišní dutině. Nebyl prokázán statistický významný rozdíl ve výskytu peri/po-operačních komplikací a v intenzitě pooperační bolesti mezi skupinami fen po laparoskopické SPAOE a laparoskopické OE v kombinaci s GP. Provedení laparoskopicky asistované gastropexe vedlo k prodloužení délky chirurgického zákroku v průměru o 26 min. Seznam literatury: Brondani, JT, Luna SPL, Padovani CR. Refinement and initial validation of a multidimensional composite scale for use in assessing acute postoperative pain in cats. Am J Vet Res 2011; 72: 174183. Dupré G, Fiorbianco V, Skalicky M, Gültiken N, Ay SS, Findik M. Laparoscopic ovariectomy in dogs: comparison between single portal and two-portal access. Vet Surg 2009; 38: 818-824. Holton L, Reid J, Scott E M, Pawson P, Nolan A. Development of a behaviour-based scale to measure acute pain in dogs. Veterinary Record 2001; 148: 525-531. Kim YK, Lee SY, Park SJ, Lee SS, Lee HC, Lee HJ, Yeon SC. Feasibility of single-portal access laparoscopic ovariectomy in 17 cats. Vet Rec 2011; 169: 179. Markar SR, Karthikesalingam A, Thrumurthy S, Muirhead L, Kinross J, Paraskeva P. Singleincision laparoscopic surgery (SILS) vs. conventional multiport cholecystectomy: systematic review and meta-analysis. Surg Endosc. 2012; 26: 1205-1213. Parkinson TJ: Progress towards less invasive veterinary surgery. Vet Rec 2012; 171: 67-68. Runge JJ, Curcillo PG 2nd, King SA, Podolsky ER, Holt DE, Davidson J, Agnello KA. Initial application of reduced port surgery using the single port access technique for laparoscopic canine ovariectomy. Vet Surg 2012; 41: 803-806.
16
Tvorba spojení zub-kost u plazů a její klinický význam Hana Dosedělová1, Barbora Putnová1, Kristýna Glocová1, Kateřina Štěpánková2, Jozef Kaiser3, Tomáš Zikmund3, František Tichý1, Marcela Buchtová1 1
Ústav anatomie, histologie a embryologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2
Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno
3Centrum nanotechnologií a mikrotechnologií, Vysoké učení technické, Brno Úvod Morfologie dentice recentních Amniot je velice rozmanitá. Variabilita se projevuje jednak v celkovém počtu zubů a jejich tvaru, jakož i způsobem upevnění zubů v čelisti. Ačkoliv je embryonální základ těchto tkání univerzální, právě výsledná rozmanitost dentice obratlovců nás utvrzuje v nutnosti hledání alternativních modelových druhů pro studium jejího vývoje. Je nezbytné podrobněji porozumět procesům iniciace a diferenciace zubu. Akrodontní ankylóza, tedy pevné spojení zubu s čelistní kostí prostřednictvím mineralizovaných tkání, není u vyšších obratlovců běžným jevem. Spojení se začíná vytvářet již během embryonálního vývoje zástupců třídy Acrodonta a v závislosti na jejich věku se postupně zpevňuje. Protikladem tohoto fyziologického vývojového procesu u chameleona je vznik ankylózy zubu v čelisti u savců, zejména po replantacích nebo poruchách erupce zubů. Buněčné a molekulární procesy tohoto onemocnění stále nejsou objasněny.
Materiál a metodika Histologická analýza: V první fázi jsme použili embrya chameleona jemenského a krajty tmavé, která byla součástí sbírky našeho ústavu. Hlavy embryí fixovaných ve 4% formaldehydu byly po zpracování zality do parafínu a krájeny v transverzální a sagitální rovině. Část získaných řezů byla obarvena hematoxylin eosinem a vyfotografována fotoaparátem Leica. Alternativní řezy byly využity k imunohistochemické analýze.
Imunohistochemická analýza: Vybrané histologické řezy byly deparafinovány xylenem a rehydratovány sestupnou alkoholovou řadou. Odhalení epitopů bylo provedeno v citrátovém pufru při teplotě 97° C po dobu 15 minut následované deaktivací peroxidáz 3% peroxidem vodíku po dobu 10 minut.
17
K imunofluorescenční detekci jsme použili protilátku F-spondin (1:50, kat. č.: ABIN954936, Antibodies). Sérum bylo aplikováno po 20 minut při pokojové teplotě a následované sekundární králičí protilátkou (Vectastain ABC Kit Peroxidase Rabbit IgG, PK-4001, Vector Laboratories). Fluorescenční detekce byla provedena využitím Streptavidin FITC (1:250, kat.č. 554060, BD Pharmingen). K detekci proliferujících buněk byl využit PCNA Staining Kit (kat.č.: 93-1143, Invitrogen). Detekce apoptotických buněk byla provedena pomocí ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (kat.č.: S7100, Merk). Pozitivní buňky byly obarveny Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System (kat.č.: K3468, Dako).
µCT analýza: Hlavu juvenilního chameleona (délka mandibuly 1,4 cm) a dvou adultních chameleonů (délka mandibuly 3,6 a 4,0 cm) jsme získali z Kliniky chorob ptáků, plazů a malých savců a přechovávali je při teplotě - 20° C. Mikropočítačová tomografie byla provedena po rozmrazení hlav na pokojovou teplotu na přístroji GE phoenix v|tome|x L 240. Použili jsme následující nastavení parametrů: velikosti voxelu 2, 5, 11 a 29,2 µm; voltáž 50, 60 a 80 kV; proud 80, 100, 110 µA. Pomocí programu VG Studio jsme provedli počítačovou rekonstrukci snímků do 3D obrazu.
LIBS - Spektroskopie laserem buzeného plazmatu Mechanicky očištěné mandibuly byly zality do epoxidové pryskyřice a vyleštěny diamantovou pastou. Sledování signálů vybraných prvků byla provedena na LIBS systému v SP (single pulse) režimu vzhledem k dobré citlivosti vybraných spektrální atomových a iontových čar. K ablaci vzorku byl použit ablační systém UP 266 MACRO (New Wave, USA), který obsahuje laser Q-switched Nd:YAG pracující na čtvrté harmonické frekvenci emitující záření o vlnové délce 266 nm. Doba trvání jednoho pulsu je 4,2 ns. K analýze plasmového záření posloužil monochromátor
(Triax
320,
Jobin
Yvon,
Francie)
s ICCD
detektorem
PI
Max3
(Princeton Instruments). V programu GRAMS byla vytvořena intenzitní mapa výskytu 3 základních prvků obsažených ve vzorcích podle narůstající intenzity.
Výsledky K fúzi zubních tkání a kostních lamel dochází u embryí plazů již v průběhu jejich embryonálního vývoje, během kterého se odontoblasty vnitřního sklovinného epitelu shlukují kolem cervikální smyčky zubu a produkují tak predentin i do okolí báze zubu. Po přiblížení
18
kostěných pediklů čelistní kosti k bázi zubu dochází mineralizací predentinu ke vzniku akrodontní ankylózy. Na přehledných histologických snímcích zubu chameleona není zřetelný přechod mezi oběma typy fúzovaných tkání (obr. 1). Rovněž µCT analýza odpovídající oblasti neodhalila změnu denzity na hranici obou tkání. Pouze na základě výskytu lakun osteocytů lze usuzovat na rozsah kostní tkáně (obr. 1).
Obr.1:
Transverzální
řez
hematoxylin-eosinem (vlevo)
barvený a
průřez
čelistí pořízený počítačovou tomografií (vpravo) U mladších embryonálních stádií chameleona jsme v oblasti vznikající akrodontní ankylózy pozorovali pozitivitu buněk na F-Spondin. Pozitivní byla rovněž souvislá vrstva buněk pokrývající vnitřní stranu skloviny a povrchová strana kosti v místech, kde dochází k jejímu kontaktu se sklovinou. Analýzou intenzitních map LIBS jsme zjistili, že přímo úměrně na věku jedince stoupá intenzitní distribuce prvků vápníku a fosforu jak v oblasti připojení zubu ke kosti, tak v oblasti samotného zubu i kosti. Intenzitní mapy prvku hořčíku odhalují, že ucelený okrsek s nejvyšší intenzitou distribuce hořčíku lokalizovaný v oblasti zubu se postupně v závislosti na věku jedince fragmentuje a rozpadá a intenzita hořčíku zde klesá. V oblasti připojení zubu ke kosti a v oblasti kosti se intenzita hořčíku zvyšuje a u adultního jedince dosahuje středních hodnot (obr. 2). Obr.2: Mapy intenzitní distribuce hořčíku I 285,21 nm - rozdílný stupeň vývoje Seznam literatury: • Buchtová M., Zahradníček O., Balková S., Tucker A.S. (2013): Odontogenesis in the Veiled Chameleon (Chamaeleo calyptratus). Arch Oral Biol, 58: 118-133. •
Gaenger P., Metzler R. (1992): The periodontal differentiation in the phylogeny of teeth – an overview. J Periodont Res, 27(3): 214-225.
19
Srovnání biomechanických podmínek v kolenním kloubu s rupturou LCC v závislosti na typu jeho stabilizace: ex vivo studie Petra Fedorová, Alois Nečas, Robert Srnec, Lucie Urbanová, Robert Snášil, Jan Krhut, Eliška Horáčková Oddělení chirurgie a ortopedie, Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Poškození předního zkříženého vazu (LCC) zaujímá vedoucí postavení v seznamu příčin kulhání vycházejícího z kolenního kloubu u velkých plemen psů1. Moderní léčba ruptury LCC je téměř výhradně chirurgická. Používané techniky zahrnují jeho primární rekonstrukci, intraartikulární techniky, pasivní extraartikulární stabilizaci kolenního kloubu nebo osteotomické metody upravující síly působící při zatížení končetiny2. V současné době se výzkum v oblasti hojení defektů tkání muskuloskeletálního systému zaměřuje na možnosti využití biomateriálů a mezenchymových kmenových buněk (MSCs) 3 a léčba ruptury LCC by neměla v tomto trendu zaostávat. Materiál a metodika První část projektu byla provedena na ex vivo preparátech kolenního kloubu získaných z kadáverů prasat (Steinhauser s.r.o.). Z kolenního kloubu byl vytvořen testovací preparát typu kost-vaz (LCC)-kost, který byl ošetřen jednak intraartikulární stabilizací dle techniky vyvinuté v předchozím projektu (IGA VFU 39/2012/FVL) inovován novým typem splétaného biomateriálu a jednak technikou extrakapsulární stabilizace ruptury LCC a podroben ex vivo mechanickým testům maximální zátěže střižných sil v postojovém úhlu kolenního kloubu (trhací zařízení Zwick/Roell, VUT Brno). Kontrolní skupinou pro testování byl samotný preparát a preparát s iatrogenním parciálním poškozením LCC. U první sledované skupiny byla iatrogenně vytvořená totální ruptura LCC ošetřena intraartikulární implantací biomateriálu (UHMPWE- Ultra-high-molecular-weight polyethylene). Syntetizovaný materiál byl vyvinut ve spolupráci s Ústavem chemie materiálu Chemické fakulty VUT Brno (prof. RNDr. Josef Jančář, CSc.). Ukotvení této náhrady LCC do kostního podkladu tibie a femuru bylo provedeno biodegradabilním ACL/PCL šroubem (HexalonTm, Inion Ltd., Finsko). U druhé skupiny byly otestovány mechanické vlastnosti v kolenním kloubu po ošetření technikou extrakapsulární stabilizace ruptury LCC pomocí systému kotvy, svorek a
monofilamentného vlákna (Securos). Druhá část studie zahrnovala ověření biokompatibility syntetizovaného materiálu s MSCs. Pro testování byly použity mezenchymální kmenové buňky izolované z tukové tkáně, mezenchymální kmenové buňky izolované z kostní dřeně, a také diferencované primokultivované fibroblasty. Testovaným materiálem byl UHMPWEUltra-high-molecular-weight polyethylene. Tato část studie byla provedena s využitím laboratorního vybavení a ve spolupráci s Národním tkáňovým centrem (Mgr. Štrajtová). Výsledky Mechanickým testům jsme podrobili celkem 2 skupiny po 10 testovacích preparátech a srovnali je s kontrolními skupinami s předchozí studie. Kontrolní skupina S1 byla se zcela nepoškozeným LCC, kontrolní skupina S2 byla s iatrogenně vytvořenou parciální rupturou LCC. Testovací skupina EC byla s náhradou vazu pomocí nevstřebatelného monofilamentného nylonu (OrthoFiber, SECUROS) a skupina IA byla s náhradou vazu nově syntetizovaným biomateriálem. Grafy 1-4 zobrazují hodnoty sil potřebných k porušení integrity vazu, nebo k selhání uchycení v kostním podkladu. K selhávaní fixace u skupiny IA docházelo ve všech případech přetržením materiálu v míste uchycení do kosti stehenní. U skupiny EC docházelo nejčastěji k vytažení ukotvení z kosti stehenní, v méně případech pak k selhání svorek nebo k přetržení vlastní náhrady vazu. Na testovaném materiálu (UHMPWE) byl prokázán růst buněk. Materiál vykazuje dobré vlastnosti pro adherenci všech testovaných typů buněk. Nejprogresivněji došlo k osídlení materiálu fibroblasty, méně progresivně pak oběma typy mezenchymálních kmenových buněk.
Graf 1. Hodnoty sil potřebných k porušení
Graf 2. Hodnoty sil potřebných k porušení
integrity vazu, nebo k selhání uchycení
integrity vazu, nebo k selhání uchycení
v kostním podkladu skupiny S1.
v kostním podkladu skupiny S2.
Graf 3. Hodnoty sil potřebných k porušení
Graf 4. Hodnoty sil potřebných k porušení
integrity náhrady vazu, nebo k selhání
integrity náhrady vazu, nebo k selhání
uchycení v kostním podkladu skupiny EC.
uchycení v kostním podkladu skupiny IA.
Seznam literatury: 1. Ragetly CA, Griffon DJ, Klump LM, et al: Pelvic Limb Kinetic and Kinematic Analysis in Labrador Retrievers Predisposed or at a Low Risk for Cranial Cruciate Ligament Disease. Veterinary Surgery 2012;41:973-982 2. Nečas A. Chirurgická léčba ruptury předního zkříženého vazu. Veterinářství 2011;12:718-722 3. Necas A. Surgical treatment of cranial crucial ligament rupture. In Proceeding of Annual Purdue Veterinary Medicine 2011 Fall Conference, West Lafayette, Indiana, USA: Purdue University School of Veterinary Medicine, 2011, 167-176
Tato práce vznikla za laskavé podpory Grantové agentury VFU Brno (IGA VFU Brno 43/2013/FVL).
Vliv přítomnosti přechodového obratle v lumbosakrální oblasti na velikost acetabulárního úhlu u psů.
Iva Fialová1, Pavel Proks2, Michaela Paninárová2, Nikola Ďurišová Oddělení chirurgie a ortopedie1, Oddělení zobrazovacích metod 2 Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Dysplazie kyčelního kloubu je nejčastějším vývojovým onemocněním skeletu u psů.1,2 Acetabulární úhel a úhel dorzálního okraje acetabula jsou jedním z kritérií, které se používají u kyčelních kloubů k vyjádření míry překrytí hlavice stehenní kosti s kloubní jamkou.3,4,5 Počítačová tomografie umožňuje měření těchto parametrů v místě nosného dorzálního okraje acetabula bez superpozice kostních struktur. U dysplastických kyčelních kloubů je ve srovnání s normálními kyčelními klouby acetabulární úhel větší a úhel dorzálního okraje acetabula menší.3,5 Přechodový obratel je abnormálně utvářený obratel, který nese morfologické znaky dvou sousedících úseků páteře. Přechodový obratel v lumbosakrální oblasti zvyšuje pravděpodobnost výskytu syndromu cauda equina, asymetricky utvářené přechodové obratle ovlivňují utváření pánve a mohou vést k chybnému vývoji kyčelních kloubů.1 Dosavadní studie věnující se výskytu dysplazie kyčelních kloubů a přítomnosti přechodového obratle v lumbosakrální oblasti byly hodnoceny pouze na rentgenogramech. Acetabulární úhel a úhel dorzálního okraje acetabula byl podle znalostí řešitelů měřen pomocí počítačové tomografie u zdravých jedinců a jedinců s dysplazií kyčelních kloubů.5 Problematika současného výskytu přechodových obratlů a jejich vliv na měření velikosti acetabulárního úhlu a úhlu dorzálního okraje acetabula nebyla podle znalostí řešitelů doposud publikována.
Materiál a metodika Populace Do studie byli zařazeni pacienti rentgenologicky vyšetřovaní na přítomnost dysplazie kyčelních kloubů. Celkem bylo vyšetřeno 31 psů (18 fen a 13 psů) s přítomností LTV, z toho 16 psů mělo přechodový obratel LTV typu II a 15 psů přechodový obratel LTV typu III. Kontrolní skupinu tvořilo 30 psů (15 fen a 15 psů) bez přechodového obratle. Vlastní metodika
23
Rentgenologické vyšetření a vyšetření počítačovou tomografií bylo prováděno v sedaci nebo celkové anestezii. U psů byly zhotoveny rentgenogramy kyčelních kloubů ve ventrodorzální extenzní projekci a laterolaterální projekce lumbosakrálního úseku páteře. Dále bylo provedeno vyšetření lumbosakrálního úseku páteře a pánve počítačovou tomografií (CT LighSpeed, GE). Rentgenogramy i CT skeny byly zhotoveny v digitální podobě ve formátu DICOM a byly archivovány v PACS. Z rentgenových snímků byl zaznamenán typ přechodového obratle. Z CT skenů byl změřen v programu JiveX acetabulární úhel a úhel dorzálního okraje acetabula (obr. 1, obr. 2). Velikosti acetabulárního úhlu a úhlu dorzálního okraje acetabula byly porovnány s kontrolní skupinou psů bez přechodového obratle. Dále byla porovnána velikost acetabulárního úhlu a úhlu dorzálního okraje acetabula u dvou různých typů přechodového obratle (LTV II a LTV III). U asymetrických typů přechodového obratle byl porovnáván úhel dorzálního okraje acetabula s kontralaterální končetinou. Analýza dat Ke statistické analýze dat byl použit dvou výběrový t- test a párový t-test. Obr. 1:
Obr. 2:
Obrázek 1: Metodika měření acetabulárního úhlu. Obrázek 2: Metodika měření úhlu dorzálního okraje acetabula. Výsledky Průměrné velikosti acetabulárního úhlu a dorzálního úhlu acetabula jsou uvedeny v tabulce 1. Mezi skupinou psů s přítomností LTV a kontrolní skupinou psů bez přítomnosti LTV nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl (P>0,05) ve velikosti acetabulárního úhlu a dorzálního úhlu acetabula. Rovněž nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl (P>0,05) ve velikosti acetabulárního úhlu a dorzálního úhlu acetabula mezi skupinou se symetrickým typem LTV (typ II) a asymetrickým
24
typem LTV (typ III). Taktéž nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl (P>0,05) ve velikosti dorzálního úhlu acetabula pravé a levé končetiny u asymetrického typu LTV (stupeň III). Acetabulární úhel
Dorzální úhel
Dorzální úhel
acetabula (dx.)
acetabula (sin.)
Kontrolní skupina
62,8°
13,7°
13,8°
LTV
62,6°
13,6°
13,6°
LTV II
64°
13,3°
13,6°
LTV III
61,4°
13,7°
13,4°
Tabulka1. Průměrné velikosti acetabulárního úhlu a dorzálního úhlu acetabula. Závěr Přítomnost lumbosakrálního přechodového obratle statisticky významně neovlivňuje velikost acetabulárního úhlu a dorzálního úhlu acetabula. Tyto poznatky lze využít při plánování korektivních osteotomií u psů s dysplazií kyčelních kloubů a současným výskytem lumbosakrálního přechodového obratle. Seznam literatury: 1. FLÜCKIGER MA, DAMUR-DJURIC N, HASSIG M, MORGAN JP, STEFFEN A. Lumbosacral transitional vertebra in the dog predisposes to cauda equina syndrome. Vet Radiol Ultrasound, 2006, 47: 39-44. 2. LARSEN JS. Lumbosacral trasitional vertebrae in the dog, Vet Radiol Ultrasound, 1977, 18: 76- 79. 3. WANG SI., MATHEWS K., ROBERTSON I, STEBBINS M, TRUMPATORI BJ. The effects of patient positioning and slice selection on canine acetabular angle assessment with computed tomography. Vet Radiol Ultrasound,2005, 46: 39-43. 4. DAMUR-DJURIC A, STEFFEN F, HÄSSING M, MORGAN JP, FLÜCKIGER MA. Lumbosacral transitional vertebrae in dogs: classification, prevalence, and association with sacroiliac morphology. Vet Radiol Ultrasound, 2006, 47: 32-38. 5. FARESE JP, TODHUNTER RJ, LUST G, WILLIAMS AJ, DYKES NL. Dorsolateral subluxation of hip joints in dogs measured in a weight-bearing position with radiography and computed tomography. Vet Surg, 1998, 27: 393–405.
25
Dynamika hojení parodontálních defektů v závislosti na užité antibiotické terapii Tomáš Fichtel, Petr Janalík, Hana Hlávková, Eliška Vitásková Oddělení chirurgie a ortopedie, Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Parodontologie představuje progresivně se rozvíjející obor ve veterinární medicíně malých zvířat. Údaje z České republiky hovoří o postižení asi 60% psů, kteří z různých důvodů navštíví soukromou veterinární praxi (Kyllar a Witter 2005). Etiopatogeneze parodontitidy není dosud do všech detailů vysvětlena a stále je předmětem výzkumu. V současné době je parodontitida považována za multifaktoriální onemocnění, které vzniká na základě interakce imunitního systému hostitele a mikroorganismů obsažených v zubním plaku. Základem terapie parodontitidy je proto důkladné odstranění zubního plaku (Wiggs a Lobprise 1997, Bellows 2004). Konzervativní i chirurgické metody ošetření parodontu jsou pak kombinovány s doplňující krátkodobou antibiotickou terapií. Pozornost mnoha stomatologů nyní upíná k léčivým látkám s potenciálním antiinflamatorním účinkem. Mezi tyto látky patří i tetracyklinová antibiotika, především doxycyklin (Sreenivasan a Gaffar 2007).
Materiál a metody Studie je založena na měření hloubky parodontálních defektů. Do sledované skupiny byli vybráni pacienti s postižením parodontu ruzsahu, který neindikuje extrakci zubu. Tomuto pořadavku vyhovovali pacienti s PDI 2. a 3. stupně. U pacientů sledované skupiny jsme před ošetřením změřili hloubku parodontálních kapes pomocí jemně kalibrované dentální sondy zaváděné paralelně s povrchem zubu pod mírným tlakem. Hloubku kapsy jsme měřili od okraje gingivy až do nejhlubšího místa defektu. Hodnoty jsme zaznamenali do protokolů i s vyznačením přesného místa výskytu parodontálních defektů u jednotlivých zubů. Poté jsme provedli standardní ošetření parodontu, spočívající v odstranění zubního kamene, supragingiválního i subgingiválního zubního plaku, uzavřené kyretáži parodontálních kapes a následné depuraci povrchu klinických korunek. Ke kyretáži jsme standardně užívali Graceyho kyrety 7/8. Před ošetřením ani po něm nebyly na ošetřované tkáně aplikovány žádné léčivé přípravky či dezinfekční látky. Následně byli pacienti rozděleni do dvou skupin a medikovány antibiotiky. První skupina byla medikována antibiotikem ze skupiny tetracyklinů druhé
26
generace, doxycyklinem. Druhá skupina pacientů byla medikována beta-laktamovým antibiotikem
amoxicilinem
potencovaným
inhibitorem
beta-laktamáz
klavulanátem.
Doxycyklin byl podáván v dávce 10 mg/kg jedenkrát denně per os po 7 dní, amoxicilin klavulanát v dávce 20 mg/kg dvakrát denně per os taktéž 7 dní. Za čtyři týdny byla opětovně změřena hloubka parodontálních kapes v místech vyznačených v protokolech. Hodnoty byly zaznamenány a statisticky vyhodnoceny. Do statistického hodnocení bylo zařazeno po 5 pacientech z obou skupin. Všichni pacienti byli starší 8 let, hmotnostní rozložení bylo v obou skupinách přibližně stejné. Od každého pacienta byla použita hloubka 2 nebo 3 parodontálních kapes, oba soubory tedy obsahují 12 jednotek. Při statistickém hodnocení jsme nejprve porovnávali u obou skupin naměřené hodnoty před ošetřením a 4 týdny po ošetření pomocí dvouvýběrového párového t-testu. Poté byly porovnány hodnoty po ošetření mezi oběma soubory neparametrickým Mann-Whitneyův testem.
Výsledky
DOXYCYKLIN ČÍSLO ZUBU
HLOUBKA KAPSY
HLOUBKA KAPSY
PŘED OŠETŘENÍM (MM) PO 4 TÝDNECH(MM)
1.
104
3
3
2.
404
3
1
3.
304
4
1
4.
104
3
1
5.
404
4
3
6.
204
3
1
7.
304
3
2
8.
202
4
2
9.
303
8
3
10.
109
5
1
11.
209
4
1
12.
310
5
1
Tab. č. 1: Hloubka parodontálních kapes jednotlivých zubů před ošetřením a za 4 týdny po ošetření při 7 denní systémové aplikaci doxycyklinu
27
Hodnoty naměřené před ošetřením parodontu a po 4 týdnech se statisticky významně liší s hladinou významnosti 0,000119. K vyhodnocení jsme použili dvouvýběrový párový t-test na střední hodnotu.
AMOXICILIN KLAVULANÁT
ČÍSLO ZUBU
HLOUBKA KAPSY
HLOUBKA KAPSY
PŘED OŠETŘENÍM (MM) PO 4 TÝDNECH(MM)
1.
103
3
2
2.
404
4
2
3.
204
3
2
4.
304
4
2
5.
108
3
3
6.
208
4
3
7.
104
3
2
8.
404
3
3
9.
204
2
1
10.
304
3
2
11.
104
6
3
12.
204
10
6
Tab. č. 2: Hloubka parodontálních kapes jednotlivých zubů před ošetřením a za 4 týdny po ošetření při 7 denní systémové aplikaci amoxicilin klavulanátu Hodnoty naměřené před ošetřením parodontu a po 4 týdnech se statisticky významně liší s hladinou významnosti 0,00145. K vyhodnocení jsme použili dvouvýběrový párový t-test na střední hodnotu. Mann-Whitneyovým U testem jsme ověřili, že neexistuje statisticky významný rozdíl (p = 0,44) v hloubce parodontálních kapes před ošetřením mezi souborem medikovaným doxycyklinem a souborem medikovaným amoxicilin klavulanátem. Průměrná hloubka defektu před ošetřením je u skupiny medikované doxycyklinem 4,08 mm, u skupiny medikované amoxicilin klavulanátem 4,0 mm. Stejným neparametrickým testem jsme prokázali statistický významný rozdíl (p < 0,05) mezi oběma soubory v hloubce parodontálních defektů 4 týdny po ošetření. Průměrná hloubka defektu po ošetření u skupiny medikované doxycyklinem je 1,66 mm, zatímco u skupiny medikované amoxicilin klavulanátem činí tato hodnota 2,58 mm.
28
Seznam literatury: AKALIN, F. A. a kol. 2004: A comparative evaluation of the clinical effects of systemic and local doxycycline in the treatment of chronic periodontitis. Journal of Oral Science 46(1), s. 25-35. ALBUQUERQUE, C., MORINHA, F., REQUICHA, J. a kol. 2012: Canine periodontitis: The dog as an important model for periodontal studies. The Veterinary Journal 191, s. 299-305. BAKER, P. J., EVANS, R. T., COBUM, R. A. a GENCO, R. J. 1983: Tetracycline and its derivatives strongly bind to and are released from the tooth surface in an active form. Journal of Periodontology 54(10), s. 580-585. CAIAFA, A. 2007: Canine infectious, inflammatory and immune-mediated oral conditions. In: BSAVA Manual of Canine anf Feline Dentistry. 3rd edition. Gloucester: BSAVA, s. 96115. ISBN 09-052-1487-0. CUMMINGS, G. R. a TORABINEJAD, M. 2000: Effect of systemic doxycycline on alveolar bone loss after periradicular surgery. Journal od Endodontics 26(6), s. 325-328. GORDON, J. M., WALKER, C. B., MURPHY, J. C., GOODSON, J. M. a SOCRANSKY, S. 1981: Concentration of tetracycline in human gingival fluid after single doses. Journal of Clinical Periodontology 8, s. 117-121. GREVSTAT, H. J. 1993: Doxycycline prevents root resorption and alveolar bone loss after periodontal surgery in rats. Scandinavian Journal of Dental Research 101(5), s. 287-291. HARVEY, C. E. 2005: Management of periodontal disease: understanding the options. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 35(4), s. 819-836. HARVEY, C. E., THORNSBERRY, C., MILLER, B. R. a SHOFER, F. S. 1995: Antimicrobial susceptibility of subgingival bacterial flora in dogs with gingivitis. Journal of Veterinary Dentistry 12(4), s. 151-155. POLSON, A. M., SOUTHARD, G. L., DUNN, R. L. a kol. 1996: Periodontal pocket treatment in beagle dogs using subgingival doxycycline from a biodegradable system. I. Initial clinical responses. Journal of Periodontology 67(11), s. 1176-1184. SEYMOUR, R. A. a
HEASMAN, P. A. 1995: Tetracyclines in the management of
periodontal diseases: a review. Journal of Clinical Periodontology 22(1), s. 22-35. ZETNER, K. a ROTHMUELLER, G. 2002: Treatment of periodontal pockets with doxycycline in beagles. Veterinary Therapeutics 3(4), s. 441-453.
29
Stanovení vlivu antibiotické léčby na složení gastrointestinální mikroflóry u volně žijících goril nížinných Lada Hofmannová, Klára Vlčková Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Z důvodu závažné epidemie respiračního onemocnění (únor 2012) u skupiny plně habituovaných goril nížinných v chráněných oblastech Dzanga Sangha (DSPA) ve Středoafrické republice (SAR) byla gorilám v březnu 2012 nastřelena antibiotika (ATB) - Ceftriaxon. Obecně jsou ATB běžně používána pro léčbu bakteriálních infekcí u lidí a zvířat, včetně lidoopů žijících v zajetí. Ve výjimečných případech jsou ATB podávána i volně žijícím habituovaným lidoopům (1, 2). Případné vedlejší účinky ATB jsou dobře známy u lidí a laboratorních zvířat, např. snížení mikrobiální diverzity a změny složení mikroflóry s následnou invazí patogenních mikroorganismů (např. Clostridium difficile) způsobujících průjmy, záněty a akutní infekce střeva (3, 4, 5). Doposud však nebyly zkoumány vedlejší účinky a případný vliv léčby na celkový stav lidoopů z dlouhodobého hlediska a to ani u jedinců v zajetí. Cílem naší práce bylo porovnat složení gastrointestinální (GI) mikroflóry před a po podání ATB a ohodnotit tak případný vliv ATB na její celkové složení. Materiál a metodika Sběr a fixace vzorků Celkem bylo zpracováno 40 vzorků trusu od devíti habituovaných goril nížinných (zahrnující vzorky před a po aplikaci antibiotik; únor-duben 2012) ze skupiny Makumba v DSPA, SAR. Vzorky byly fixovány pomocí RNAlater (RNA Stabilization Reagent, Qiagen, Germany) a skladovány při -20°C. Molekulární analýzy Celková DNA byla izolována pomocí Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, USA). Získaná DNA byla dále použita na Nested PCR (25 cyklů: 15s při 98°C, 30s při 65°C, 30s při 72°C), kdy byly naamplifikovány V3 a V5 regiony 16S rRNA za použití primerů 349f a 806r (1-58 označenými identifikačními barkódy). Sekvenování PCR produktů byly provedeno na Illumina Miseq platformě. Získané sekvence byly analyzovány v TORNADO pipeline. Operační
30
taxonomické jednotky (OTU) byly definovány na základě podobnosti více jak 97% sekvencí 16S rRNA. Statistické analýzy Pro stanovení rozdílnosti/podobnosti mikrobiálních profilů goril před a po aplikaci antibiotik byly použity nemetrické mnohorozměrné škálování (NMDS) a permutační test pro analýzu variance (PERMANOVA) za použití PRIMER v6 for Windows (6). Statistické výpočty byly provedeny z relativních abundancí všech OTU na základě Bray-Curtis matic podobností (7). Taxonomické profily GI mikroflóry byly vytvořeny v QIIME v1.6.0 (8). Výsledky NMDS ukázalo, že složení GI mikroflóry jednotlivých goril bylo před aplikací ATB jednotné, oproti tomu po aplikaci ATB došlo k značné disperzi ve složení GI mikroflóry mezi jedinci (Graf 1). Statisticky signifikantní rozdíly ve složení mikroflóry před a po aplikaci ATB byly prokázány pomocí PERMANOVA (Pseudo-t=1,802 df=26 , p=0,001), průměrná podobnost bakteriálních profilů mezi jedinci byla před ATB 49,3% zatímco po ATB pouze 34,8%. Změny složení GI mikroflóry jsou patrné i na procentuálním zastoupení jednotlivých bakteriálních kmenů (Graf 2). Téměř u všech jedinců se po podání ATB zvýšily počty bakterií z kmenů Chloroflexi, Firmicutes a Actinobacteria a snížily u kmene Bacteroidetes.
Graf 1. NMDS graf složení GI mikroflóry habituovaných goril nížinných před a po aplikaci ATB Graf 2. Procentuální zastoupení bakteriálních kmenů před (červeně) a po (černě) aplikaci ATB Závěry Studie je součástí našeho dlouhodobého výzkumu týkajícího se vlivu různých faktorů na GI mikroflóru volně žijících goril v DSPA, SAR a navazuje především na práci (9) zabývající se
31
vlivem habituace. Z našich výsledků vyplývá, že ATB ovlivňují složení GI mikroflóry habituovaných goril nížinných. GI mikroflóra po aplikaci ATB byla mnohem méně uniformní a jsou patrné individuální rozdíly mezi jedinci. Byly zaznamenány změny jak v počtech, tak v zastoupení různých bakteriálních kmenů. U studovaných goril nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky po aplikaci ATB, jako např. průjem. Stanovení celkové doby potřebné pro navrácení GI mikroflóry do stavu před léčbou je předmětem dalšího zkoumání. Seznam literatury 1. HASTINGS, B.E. The veterinary management of a laryngeal air sac infection in a free-ranging mountain gorila. Journal of Medical Primatology. 1991, 20(7): 361-364. ISSN 0047-2565. 2. ZIMMERMAN, Dawn. Respiratory Disease Outbreak Continues In Sabyinyo Group. In: Gorilla Doctors [online]. 26.1.2013 [cit. 20.11.2013]. Dostupné z http://gorilladoctorsblog.org/fieldblog/2013/1/26/respiratory-disease-outbreak-continues-in-sabyinyo-group.html 3. JERNBERG, Cecilia, LÖFMARK, Sonia, EDUND, Charlotta a JANSSON, K. Janet. Long-term ecological impacts of antibiotic administration on the human intestinal microbiota. ISME Journal. 2007, 1: 56-66. ISSN 1751-7362. 4. WILLING, P. Benjamin, RUSSELL, L. Shannon a FINLAY B. Brett. Shifting the balance: antibiotic effects on host–microbiota mutualism. Nature Reviews. Microbiology. 2011, 9: 233243. ISSN 1740-1526. 5. EDLUND, Charlotta a NORD, E. Carl. Effect on the human normal microflora of oral antibiotics for treatment of urinary tract infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2000, 46(1), 41-48. ISSN 0305-7453. 6. CLARKE, K. Robert a GORLEY, N. Raymond, 2006. PRIMER v6: User Manual/Tutorial. PRIMER-E, Plymouth. 7. CLARKE, K. Robert. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Australian Journal of Ecology. 1993, 18: 117-143. ISSN 0307-692X. 8. CAPORASO, J. Gregory, KUCZYNSKI, Justin, STOMBAUGH, Jesse, BITTINGER, Kyle, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 2010, 7: 335–336. ISSN 1548-7091. 9. GOMEZ,
Andres,
PETRZELKOVA,
Klara,
YEOMAN,
Carl,
VLCKOVA,
Klara,
CARBONERO, Franck, MODRY, David, TODD, Angelique, MRAZEK, Jakub, KOPPOVA, Ingrid et al. The gastrointestinal microbiota of wild Western Lowland Gorillas mirrors macroecological patterns. Odesláno do tisku. 2013.
32
Využitie ergometrínu a ceftiofuru v priebehu puerpéria u dojníc MVDr. Katarína Holičková, MVDr. Eva Indrová, Doc. MVDr. Svatopluk Čech, Ph.D.
Klinika chorob přežvýkavců a prasat, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Postpartálne patologické stavy maternice majú zásadný význam pre následnú reprodukčnú výkonnosť mliečnych kráv (2), preto sú stále predmetom rady klinických štúdií (1). Okrem využitia uterotonického efektu oxytocínu (4) a prostaglandínov (5) sa však takmer nevyskytujú údaje o použití, v minulosti používaných a vysoko účinných, námelových preparátov. Terapia zadržaného lôžka a klinickej metritídy aplikáciou ceftiofuru je najmodernejšou cestou ošetrenia (3), avšak v našich podmienkach sa doposiaľ nerozšírila, čiastočne aj pre ešte nedávno platné obmedzenie registrácie dostupného prípravku. Preto je predmetom tohto projektu zhodnotenie efektu plošnej preventívnej aplikácie ergometrínu po pôrode, použitie ergometrínu a ceftiofuru v prevencii a terapii retencie sekundín a použitie ergometrínu v terapii klinickej endometritídy u mliečnych kráv. Materiál a metodika Experiment 1: Zhodnocovali sme vplyv preventívnej plošnej aplikácie ergometrínu v ranom puerpériu na stav pohlavného aparátu kráv v pozdnom puerpériu. Použili sme celkom 217 kráv bez retencie sekundín a bez klinických príznakov iných ochorení. Prvá skupina (E, n = 59) bola ošetrená v deň 1 (D1) a D2 po pôrode (p. p.) oxytocínom (30 UI i. m.), v D7 p. p. ergometrínom (15 mg i. m.), druhá skupina (D, n = 52) bola ošetrená v D1 a D2 p. p. oxytocínom (30 UI i. m.), v D7 p. p. dinoprostom (5 mg i. m.), tretia skupina (K, n = 106) bola kontrolná. Hodnotili sme charakter výtoku z maternice (bodová stupnica 1 – 5, fyziologický nález = 1) a obsah v maternici (1 – 3, maternica bez obsahu = 1) v D14 – D21 p. p. a ďalej počet terapeutických zákrokov potrebných na ošetrenie klinickej endometritídy. Experiment 2: Hodnotili sme účinnosť ceftiofuru v terapii retencie sekundín a klinickej metritídy na 40 kravách. Prvej skupine (n = 21) sme aplikovali pri zistení retencie jednorázovo ceftiofur v dávke 6,6 mg/kg ž. hm. a bola ošetrená uterotonikami podľa schémy skupiny E v experimente 1. U druhej skupiny (n = 19) bolo použité tradičné intrauterínne ošetrenie antibiotickými čípkami a rovnaká schéma ošetrenia oxytocínom a ergometrínom. Hodnotené kritéria sú totožné s experimentom 1.
33
Experiment 3: Hodnotili sme účinnosť terapeutickej aplikácie ergometrínu v pozdnom puerpériu u 105 kráv s preukázanou klinickou endometritídou v D15 – 21 p. p. (hnisavý výtok z maternicového krčku, fluktuácia maternice, n = 105). Prvej skupine (n = 64) sme aplikovali ergometrín v dávke 15 mg i. m., druhej skupine (n = 41) bol aplikovaný dinoprost 5 mg i. m. Za týždeň bola učinená kontrola zdravotného stavu maternice a prípadné intrauterínne ošetrenie. Hodnotili sme stupeň fluktuácie maternice (1 – 3) a počet terapeutických zákrokov potrebných na ošetrenie klinickej endometritídy. Výsledky Experiment 1: Tab. 1: Priemerný výtok a náplň maternice u kráv medzi 14. a 21. dňom po pôrode E 2,00 1,63
Priemerný výtok Priemerná náplň
D 2,27 1,41
K 2,02 1,58
Tab. 2: Počet ošetrení potrebných pre vyliečenie klinickej endometritídy u jednotlivých skupín
E D K
0 20 24 46
% 42,55 53,33 50
1 15 10 20
% 31,91 22,22 21,74
2 5 5 16
% 10,64 11,11 17,39
3 a viac % 7 14,89 6 13,33 10 10,87
celkom 47 45 92
Experiment 2: Tab. 3: Priemerný výtok a náplň u kráv s retenciou sekundín vyšetrených medzi 14. a 21. dňom po pôrode Priemerný výtok Priemerná náplň
Ceftiofur 3,37 1,95
ATB čípky 3,72 1,94
Tab. 4: Počet ošetrení potrebných pre vyliečenie klinickej endometritis u kráv s retenciou sekundín ATB čípky Ceftiofur
0 0 2
% 0 10,52
1 6 4
% 33,33 21,05
2 6 5
34
% 33,33 26,32
3 a viac % 6 33,33 7 36,84
celkom 18 19
Experiment 3: Tab. 5: Počty potrebných ošetrení u kráv s klinickou endometritídou Počet intervencií
Ergometrín
1 17
% 40,48
2 16
% 38,1
3 9
% 21,43
Dinoprost
16
45,71
9
25,71
10
28,57
(1 - krava ošetrená jednou dávkou uterotoník a následne zdravá, 2 - krava ošetrená jednou dávkou uterotoník a následne nutné ošetrenie intrauterínnym antibiotikom, 3 - nutné opakované použitie uterotoník pre vyprázdnenie maternice) Záver V žiadnom experimente sme nezistili štatisticky signifikantný rozdiel medzi skupinami. Niektoré tendencie v rozdieloch medzi skupinami (v prospech ošetrenia dinoprostom alebo ceftiofurom) by pre štatistickú významnosť vyžadovali vyššiu početnosť skupín. Je nutné podotknúť, že výsledky uvádzané v tejto práci sú zatiaľ iba predbežné. S ohľadom na dĺžku reprodukčného kolobehu v stáde mliečneho dobytka experimenty stále pokračujú. Definitívne výsledky sledovania budeme schopní zhodnotiť až za 6 mesiacov po ukončení zberu údajov, kedy bude vyhodnotená aj úroveň základných reprodukčných parametrov a vyraďovania kráv zo stáda.
1. Dolezel R., Palenik T., Cech S., Kohoutova L., Vyskocil M. (2010): Bacterial contamination of the uterus in cows with various clinical types of metritis and endometritis and use of hydrogen peroxide for intrauterine treatment. Veterinarni Medicina, 55, 504–511 2. LeBlanc S. J. (2008): Postpartum uterine disease and dairy herd reproductive performance: A review. Vet. J., 176, 102–114 3. McLaughlin C. L., Stanisiewski E., Lucas M. J., Cornell C. P., Watkins J., Bryson L., Tena J. K., Hallberg J., Chenault J. R. (2012): Evaluation of two doses of ceftiofur crystalline free acid sterile suspension for treatment of metritis in lactating dairy cows. J Dairy Sci. , 95, 4363-4371. 4. Mollo A., Veronesi M. C., Cairoli F., Soldano F. (1997): The use of oxytocin for the reduction of cow placental retention, and subsequent endometritis. Anim Reprod Sci. , 48, 47-51. 5. Salasel B., Mokhtari A. (2011): Effect of early postpartum PGF2α treatment on reproductive performance in dairy cows with calving and puerperal traits. Theriogenology, 76, 1723–1729.
35
Prevalence a genotypizace anellovirů afrických primátů Kristýna Hrazdilová, Eva Slaninková, Kristýna Brožová Ústav infekčních chorob a mikrobiologie, Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Torque teno virus (TTV) byl poprvé popsán v roce 1997 u pacienta s kryptogenní, posttransfúzní hepatitidou. V nedávné době byly identifikovány další malé, neobalené viry s cirkulární jednořetězcovou DNA s obdobnou organizací genomu a byly proto dle kratší genomové DNA označeny jako Torque teno mini viry (TTMV) a Torque teno midi viry (TTMDV). Oficiálně byly klasifikovány jako nová, nezařazená čeleď Anelloviridae. V současné době bylo popsáno více než 39 genotypů TTV, které se od sebe liší více než 30 % nukleotidové sekvence. Infekce TTV není omezena jen na lidskou populaci, ale byla charakterizována v rozmanitém spektru druhů, jako jsou primáti (šimpanzi, makakové, tamaríni), kočky, psi, rejsci a prasata; u dalších druhů (skot či další druhy primátů) byla detekována částečná sekvence virové DNA.1 Prevalence anellovirové infekce u člověka dosahuje 90 % u zdravé populace s celoživotně trvající virémií, velmi častá je koinfekce několika genotypy již u dětí kojeneckého věku.2 Doposud nebyla spolehlivě prokázána souvislost s žádným onemocněním (některé práce prokazují souvislost TTV infekce s onemocněním jater, respiračními chorobami či nádorovým onemocněním, jiné tyto souvislosti vyvrací), na druhou stranu je možné, že anelloviry jsou pro svého hostitele oportunním patogenem, jejichž vliv se projeví pouze za určitých okolností (snížená imunita, koinfekce jiným agens apod.). Studium anellovirových infekcí primátů je vzhledem vzrůstajícímu kontaktu divoce žijících primátů s člověkem (lov, habituované skupiny, …) i kontaktu člověka s primáty v zajetí a vzhledem k prokázanému mezidruhovému přenosu zcela nezbytné pro objasnění původu a případné patogenity této skupiny virů. Materiál a metodika Soubor vzorků Celkem jsme stanovili přítomnost anellovirů u 56 vzorků volně žijících šimpanzů a u 153 vzorků afrických primátů chovaných v českých a slovenských zoologických zahradách (vzorky trusu v konzervačním roztoku RNAlater®). Dále jsme měli k dispozici jediný vzorek plné, zamražené krve gorily chované v české zoologické zahradě.
36
Ze vzorků trusu byla izolována DNA pomocí komerčního kitu PSP® Spin Stool DNA Kit (StraTec), v případě krve pomocí komerčního kitu NucleoSpin® Blood (Macherey-Nagel) a následně použita pro detekci virové DNA metodou semi-nested PCR. Semi-nested PCR Přítomnost anellovirů ve vzorcích byla stanovena pomocí semi-nested PCR dle Thom et al., 2OO3.3 Výsledky prevalence anellovirů jednotlivých druhů afrických primátů jsou shrnuty v tabulce 1. LR PCR Ke stanovení sekvence celého genomu anellovirů afrických primátů byla využita DNA izolovaná z krve gorilího samce Tadaa (ZOO Dvůr Králové). K amplifikaci metodou long-range PCR byly použity primery reverzně komplementární k primerům detekčním za použití LA DNA Polymerases Mix (Top-Bio) vhodného k amplifikaci dlouhých fragmentů s nízkým výskytem mutací. Produkt této PCR byl klonován do vektoru pGEM®-T Easy Vector (Promega) a vybrané klony následně sekvenovány (Macrogen). Fylogenetická analýza K fylogenetické analýze gorilích anellovirových sekvencí byla využita aminokyselinová sekvence kódující oblasti ORF1 (o délce 664 a 675 aminokyselin). K alignementu sekvencí byl vyžit algoritmus DIALIGN-TX4 a následné fylogenetické analýze program PhyML 3.05 využívající metodu maximum likelihood (nejvhodnější evoluční model VT+I+G+F stanoven programem ProtTest 3.06). Výsledky Výsledky semi-nested PCR stanovující prevalenci anellovirů u jednotlivých druhů afrických primátů chovaných v českých a slovenských zoologických zahradách a také u volně žijících šimpanzů v oblasti Ugalla (Tanzanie) v letech 2009 a 2012 jsou uvedeny v tabulce 1. Sekvenací 4 klonů nesoucích amplikon celého genomu gorilích anellovirů byl potvrzen výskyt dvou odlišných genotypů odpovídajících délkou genomu (cca 2800 nt) TT mini virům (TTMV). Toto zařazení bylo následně potvrzeno i fylogenetickou analýzou aminokyselinové sekvence kódující oblasti ORF1 obou klonů (značených klon 3 a 4), viz obrázek 1. Závěr V naší studii jsme poprvé popsali vysokou prevalenci infekce anelloviry u afrických primátů (s výjimkou mandrilů) jak v zajetí, tak ve volné přírodě odpovídající 90% prevalenci u lidí. Dále jsme získali první kompletní sekvence gorilích TTMV s potvrzením koinfekce dvěma genotypy u gorilího samce Tadaa.
37
Tabulka 1: Prevalence anellovirů ve vzorcích afrických primátů
Obrázek 1. Fylogenetický strom znázorňující postavení gorilích TTMV v porovnání se známými lidskými a šimpanzími (CPZ) sekvencemi ORF1 (ty jsou značeny tzv. accession numbers NCBI databáze). Seznam literatury: 1
TT Viruses The Still Elusive Human Pathogens. Editors: Ethel-Michele de Villiers, Harald zur Hausen. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, 331, 35-52. ISSN 0070-217X. 2 NINOMIYA, Masashi et al. Development of PCR Assays with Nested Primers Specific for Differential Detection of Three Human Anelloviruses and Early Acquisition of Dual or Triple Infection during Infancy. Journal of Clinical Microbiology. 2008, 46(2), 507-514. ISSN 0095-1137. 3 THOM, K. et al. Distribution of TT virus (TTV), TTV-like minivirus, and related viruses in humans and nonhuman primates. Virology. 2003, 306(2), 324–333. ISSN 0042-6822 4 AMARENDRAN, R. et al. DIALIGN-T: An improved algorithm for segment-based multiple sequence alignment. BMC Bioinformatics. 2005, 6(66), ISSN 1471-2105. 5 GUINDON, Stéphane et al. New Algorithms and Methods to Estimate Maximum-Likelihood Phylogenies: Assessing the Performance of PhyML 3.0. Systematic Biology. 2010, 59(3), 307-21. ISSN 1063-5157 6 DARRIBA, Diego et al. ProtTest 3: fast selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics. 2011, 27(8), 1164-1165. ISSN 1367-4803
38
Syndrom „headshaking“ u koní Veronika Matějičná, Petr Jahn Klinika chorob koní, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno Úvod Pojem „headshaking“ (HS) označuje nekontrolovatelné, perzistentní nebo intermitentní, sezónní nebo nesezónní, spontánní a často opakované vertikální, horizontální nebo rotační pohyby hlavy a krku u koní. Další příznaky zahrnují tření nosu, hrabání hrudní končetinou směrem k nosu, tlačení hlavou proti nějakému předmětu nebo aktivní vyhýbání se působení světla, tepla nebo větru na tvář. Nejčastěji se objevuje při zátěži (Lane a Mair, 1987; Mair a Lane 1990). Jako možné příčiny byly zvažovány nebo potvrzeny následující patologické stavy: parciální asfyxie (Cook 1992), optická-trigeminální sumace (tzv. „photic headshaking“) (Madigan et al. 1995) infraorbitální neuritida (Lane a Mair 1987), vazomotorická rinitida (McGorum a Dixon 1990), progresivní ethmoidální hematom, alergická rinitida nebo sinusitida (Cook 1979, Lane a Mair 1987), parazitární infestace zvukovodů (Mair 1994). U většiny případů však není prokázána etiologie a ty se označují jako idiopatické (Mayhew 2009). Předpokládanou příčinou některých z nich je neuralgie nebo zánět n. trigeminus (Newton et al. 2000). Cílem studie bylo: 1.) Zjistit prevalenci syndromu HS na území ČR, 2.) zjistit a vyhodnotit podrobnou anamnézu u koní trpících tímto syndromem s využitím podrobného dotazníku, 3.) část koní postiženým tímto syndromem vyšetřit s cílem identifikovat jeho příčinu. Metodika Do studie byli zahrnuti koně vyšetření na Klinice chorob koní VFU Brno v období leden 2000 – listopad 2013 a dále koně majitelů, kteří byli osloveni prostřednictvím internetu, inzerce v tisku a osobních kontaktů. Všem majitelům koní se syndromem HS byly rozeslány nebo předány dotazníky zahrnující nacionále, údaje o využití koně, prostředí, v němž se kůň pohybuje, způsobu ustájení a informace o zdravotním stavu koně. Poslední část dotazníku se zabývala podrobnou anamnézou syndromu a zjišťovala okolnosti jeho vzniku, projevy, frekvenci a intenzitu výskytu. Čtyřicet čtyři koní se syndromem HS bylo vyšetřeno na KCHK VFU Brno nebo ve stáji. Vyšetření sestávalo z posouzení koně v pohybu (na lonži, pod sedlem nebo ve volnosti) a
39
základního klinického vyšetření. Poté bylo v sedaci (detomidin 0,015 mg/kg ž. hm. IV., butorphanol 0,025 mg/kg ž. hm. IV) provedeno rentgenologické vyšetření hlavy (v terénu laterolaterální a dorzoventrální projekce, u koní vyšetřených na KCH byly zhotoveny i šikmé projekce), endoskopie horních cest dýchacích a průdušnice. Dále byla u koní vyšetřena dutina ústní a zevní zvukovod, z nějž byl odebrán vzorek ušního mazu. Ten byl vyšetřen mikroskopicky pro průkaz přítomnosti zevních parazitů. Výsledky Celkem bylo kontaktováno 82 majitelů koní se syndromem HS. Z toho bylo na Klinice chorob koní VFU Brno a v terénu za sledované období vyšetřeno 44 koní (0,28 % všech ošetřených pacientů). Dotazníky byly získány od 49 majitelů koní se syndromem HS - 16 klisen (32,6 %) a 33 valachů (67,3 %). Plemenné zastoupení bylo následující: český teplokrevník 23 koní (46,9 %), anglický plnokrevník 9 koní (18,3 %), ostatní teplokrevná plemena 8 koní (16,3 %), quarter horse 2 koně (4 %), hafling 2 koně (4 %), kříženec, mérenský kůň, shagya arab, welsh pony, appaloosa po jednom koni (2 %). Průměrný věk při nástupu příznaků byl 9,7 let (2-18 let). Jezdecké využití bylo následující: rekreační 28 koní (57,1 %), parkur 17 koní (34,6 %), drezúra 14 koní (28,5 %), všestrannost 6 koní (12,2 %), dostihy 1 kůň (2 %), vytrvalost 1 kůň (2 %), bez zátěže 1 kůň (2%). Příznaky se objevují u všech koní při zátěži, u 64,5 % i v klidu. U 68,7 % koní byl nástup příznaku náhlý. Nejčastějším projevem je házení hlavou ve vertikálním směru (73,4 % koní), otírání hřbetu nosu (65,3 %) a frkání (61,2 %). Méně časté projevy jsou: pohyby hlavy ze strany na stranu (24,4 %), hrabání hrudní končetinou (12,2 %), flémování (2 %), stav, který majitel označuje jako „zahleděný do sebe“ (2 %). U 70,8 % se syndrom projevuje v teplejších obdobích roku (jaro-podzim), u 18,7 % koní celoročně. U 8,3 % koní nebyla zatím sezónnost vypozorována. Intenzita byla hodnocena stupněm I (mírné projevy, kůň jezdecky využitelný bez omezení) u 14,8 % koní, stupněm II (pohazování hlavou každých pár kroků, kůň obtížně jezdecky využitelný) u 53,1 %, stupněm III (kůň není pod kontrolou a není jezdecky využitelný) u 21,2 %, stupněm IV (kůň není jezdecky využitelný, nebezpečný) u 10,6 %. Intenzitu projevů vyvolávají nebo zhoršují následující faktory nebo jejich kombinace: slunce (67,3 %), hmyz (51 %), prach (30,6 %), suchý vzduch (18,3 %), kvetoucí porost a přítomnost pylu ve vzduchu (16,3 %), vítr (16,3 %), sníh (14,2 %), déšť (12,2 %). 8,1 % majitelů nevypozorovalo závislost na žádném z uvedených faktorů. Mezi další faktory patří nervozita, stres a psychické rozrušení (6,1 %), chlad (4 %) a vlhký vzduch (2%).
40
Soubor 44 koní, kteří byli vyšetřeni na klinice nebo v terénu byl zastoupen 14 klisnami (31,8 %) a 30 valachy (68,2 %). Plemenné zastoupení bylo následující: český teplokrevník 72,7 %, ostatní teplokrevná plemena 9,0 %, anglický plnokrevník 9,0 %, quarter horse 4,5 %, kříženec 2,2 %. Průměrný věk koní byl 7,9 roku (3 – 18 let). Na základě klinického vyšetření, endoskopie dýchacích cest a rentgenologického vyšetření hlavy byly zjištěny následující nálezy: Otitis media sinistra u jednoho koně, idiopatická levostranná rekurentní neuropatie (ILLRN) II. stupně u 7 koní, ILLRN III. stupně u 1 koně a ILLRN IV. stupně u 1 koně, faryngální lymfoidní hyperplazie u 4 koní, zvýšené množství sekretu v průdušnici u 10 koní, deviace nosního septa u 1 koně, subepiglotická cysta u 1 koně a zánět maxilárního sinu u 1 koně. U žádného z vyšetřených pacientů nebyla na základě anamnézy a provedených vyšetření zjištěna příčina syndromu HS. Uvedené výsledky považujeme za předběžné. Počítá se s dalším doplňováním souboru vyšetřených koní, sbíráním anamnestických údajů a u koní se syndromem HS provedením dalších diagnostických kroků, jako je odpověď na medikaci antihistaminiky (cyproheptadin) a karbamazepinem.
Seznam použité literatury Cook W.R.: Hedshaking in horses Part I. Equne Pract. I, 1979, 9-17. Cook W.R.: Hedshaking in horses: An Afterword. Compendium Continuing Education for Practicing Veterinarian 1992, 14: 1369-1376. Lane J.G., Mair T.S.: Observations on headshaking in the horse. Equine Veterinary Journal 1987, 19: 331-336. Madigan J.E., Kortz G., Murphy C., Rodger L.: Photic headshaking in the horse: 7 cases. Equine Veterinary Journal 1995, 27: 306-311. Mair T.S.: Headshaking associated with trombicula autumnalis larval infestation in two horses. Equine Veterinary Journal 1994, 26: 244-245. Mair T.S., Lane J.G.: Hedshaking in horses. In Practice 1990, 12: 183-186. Mayhew I.G.J.: Large Animal Neurology. Willey-Blackwell 2009, 453 s. McGorum B.C., Dixon P.M.: Vasomotor rhinitis with headshaking in a pony. Equine Veterinary Journal 1990, 22: 220-222. Newton S.A., Knottenbelt D.C., Eldridge P.R.: Headshaking in horses: possible aetiopathogenesis suggested by the result of diagnostic tests and several treatment regimes used in 20 cases. Equine Veterinary Journal 2000, 32: 208-216.
41
Standardizace rentgenologického vyšetření drobných savců pomocí zubního rentgenu Mináriková Andrea, DVM; Jekl Vladimir, DVM, PhD, Dip. ECZM (Small Mammal) Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Klinický syndrom onemocnění dentice u herbivorních druhů drobných savců patří mezi jedny z nejčastěji prezentovaných problémů ve veterinární praxi (1,2,3,4). Ke stanovení správné diagnózy i prognózy je třeba velmi pečlivé vyšetření dutiny ústní a využití zobrazovacích metod. Cílem projektu IGA 114/2013/FVL bylo vypracovat metodiku optimálního polohování pacienta a zajištění potřebných množství projekcí pro daný druh. Materiál a metodika Pro prezentaci na této konferenci byl vybrán druh morče domácí (Cavia porcellus), u kterého jsme se zaměřili na rentgenologické posouzení premolárů a molárů. U jednotlivých zubů jsme posuzovali možnost vizualizace celé klinické korunky, okluzní plochy, apexy zubů. U každého pacienta bylo provedeno celkové klinické vyšetření, vyšetření dutiny ústní pomocí pediatrického laryngoskopu, endoskopické vyšetření dutiny ústní pomocí a vyšetření pomocí zubního RTG s nepřímou digitalizací. Do této studie bylo zahrnuto 10 zdravých morčat ve věku od 6 měsíců do 2 let o hmotnosti 530g až 1,08 kg. Morčata byla uvedena do celkové anestezie směsí isofluranu s kyslíkem a byla umístěna na tepelnou podložku (39 °C) do laterální polohy. Hlava
každého
morčete
byla
polohována
tak,
aby
byla
podélná
osa
rovnoběžná
s rentgenologickým filmem (senzorem). Nejdříve byla provedena levopravá laterální projekce tak, aby se tympanické buly, spodní okraj ramus mandibulae a řezáky na výsledném rentgenogramu překrývaly. S pacientem již dále nebylo manipulováno, ale pohybovalo se se zubní rentgenkou (intraorální rentgen Gendex expert® DC, 65 kV, 250mA, trubkové ohnisko modelu 0,4 mm). Rentgenologické vyšetření probíhalo v 6 osách (Obr. 1). Rentgenologický obraz byl zhodnocen po naskenování do speciálního skeneru (CR 7 VET automatic image plate scanner, Dürr Medical). Výsledky Výsledná kvalita rentgenogramů převyšovala rozlišení konvenčně používaného digitálního rentgenologického vyšetření. Bylo možno vizualizovat a posoudit celé zuby nebo jejich jednotlivé části včetně alveolární kosti a sklovinných hřebenů.
42
V první ose (LL1) pod úhlem 50˚ bylo možno nejlépe vizualizovat okluzní plochy maxilárních i mandibulárních premolárů a molárů. V první ose (LL1) pod úhlem 70˚ byly nejlépe vizualizovány apexy maxilárních premolárů a molárů. Ve druhé ose (LL3) pod úhlem 70˚ byly vizualizovány apexy mandibulárních premolárů a molárů, šířka jednotlivých zubů. V této projekci bylo možno odečíst pět zubů, kde první premolár je z protilehlé zubní arkády. Ve čtvrté ose (LL5) pod úhlem 50˚ byly dobře odečitatelné okluzní plochy premolárů a molárů, šířka jednotlivých zubů, mandibulární apexy a třetí molár. Závěr Radiografické vyšetření lebky a dentice jsou základní diagnostický nástroj v případě předpokládaných onemocnění zubů u králíků i hlodavců (5). Vzhledem k fyziologickému zauhlení premolárů a molárů, nelze u morčat okluzní plochy těchto zubů na latero-laterální projekci posoudit (6). Výsledkem studie je popis nejvhodnějších projekcí pro posouzení dentice u morčete domácího, která má významný dopad na optimální diagnostiku onemocnění a zhodnocení fyziologické dentice morčete domácího nejen jako zvířete chovaného ze záliby, ale také jako experimentálního humánního modelu onemocnění dentice. Poděkování Tato práce vznikla za podpory grantu IGA 114/2013/FVL.
Seznam literatury 1) Minarikova, A., Kohutova, S., Hauptman, K., Jekl, V. 2013 Disease in guinea pigs – preliminary study in 400 animals. 31st World Veterinary Congress, 17- 20 September 2013, Prague, Czech Republic, 72 – 73 (supported by IGA 114/2013/FVL) 2) Jekl, V., Minarikova, A., Hauptman, K. 2013 Dental disease in chinchillas – diagnosis and treatment. Proceedings of 12th World Veterinary Dental Congress and 22nd European Congress of Veterinary Dentistry, 23.5.-26.5., Prague, 168-171 (supported by IGA 114/2013/FVL) 3) Minarikova, A., Hauptman, K., Knotek, Z., Jekl, V. 2013 Periodontal microflora associated with odontogenic abscesses in rabbits and its possible zoonotic potential. 31st World Veterinary Congress, 17-20 September 2013, Prague, Czech Republic, 70-71 (supported by IGA 114/2013/FVL)
43
4) Jekl, V., Hauptman, K., Handschuh, S., Glösmann, M., Gumpenberger, M., Knotek, Z. 2013 Respiratory disease and dental problems in rabbits and rodents. Proceedings of 12th World Veterinary Dental Congress and 22nd European Congress of Veterinary Dentistry, 23.5.-26.5., Prague, 183 (supported by IGA 114/2013/FVL) 5) Capello, V., Gracis, M., Lennox, A.M. Rabbits and rodent dentistry handbook. Zoological education network, 65-100, 2005 6) Gracis, M. Clinical technique: Normal dental radiography of rabbits, guinea pigs and chinchillas. Journal of Exotic Pet Medicine, 2008, 17, 78 – 86
Obr. 1: Znázornění použitých os při rentgenologickém vyšetření dentice u morčete domácího (Cavia porcellus). Průsečík všech os znázorňuje místo, kde byl zaměřen fokus rentgenky. Osy L1 a L2 jsou latero-laterální. Osy L3 a L4 jsou rostro-kaudální. Osa L5 je šikmá kaudální a osa L6 je šikmá rostrální.
44
Dlouhodobá suprese pohlavní aktivity kocourů za použití implantátu s GnRH agonistou deslorelinem Robert Novotný, Roman Vitásek Klinika chorob psů a koček, Oddělení reprodukce, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Standardem v potlačení pohlavní aktivity kocourů je v současnosti chirurgické odnětí varlat – kastrace. Definitivní charakter zákroku ale omezuje jeho použití pouze na zvířata dále nepoužívaná v chovu. U samců, u kterých se předpokládá pozdější využití v reprodukci je snahou použít spolehlivé kontraceptivum, které po ukončení podávání umožní návrat pohlavní činnosti a neovlivňuje negativně zdravotní stav zvířete. Použitelnost GnRH agonisty ve formě implantátu s dlouhodobým uvolňováním pro účinné a reversibilní potlačení pohlavní aktivity byla potvrzena u psů vyšetřením ejakulátu a histologickým posouzením varlat zvířat se zavedeným implantátem a po jeho vyjmutí. Klinický efekt implantátu s obsahem GnRH agonisty deslorelinu u kocourů se projevil, podobně jako u psů, poklesem hladiny testosteronu, snížením libida a zmenšením objemu varlat. Informace o průběhu nástupu účinku a reverzibilitě potlačení pohlavní aktivity u kocourů, potvrzené výsledky spermatologického, endokrinologického a histologického vyšetření byly publikovány Novotným a kol. v roce 2012 jako výsledek projektu IGA 49/2010/FVL.
Materiál a metodika Pro ověření dlouhodobé účinnosti GnRH agonisty bylo využito celkem dvacet dva zvířat. Do sledování bylo zařazeno dvanáct pohlavně dospělých kocourů ve stáří 12 – 18 měsíců, kteří se již projevili charakteristickým samčím chováním (značkování močí s typickým samčím zápachem). Všechna zvířata byla při první návštěvě klinicky vyšetřena, byla odebrána krev pro stanovení koncentrace testosteronu před (T0) a čtyři hodiny po aplikaci (T4) humánního choriového gonadotropinu. Byl odebrán ejakulát k posouzení úrovně spermatogeneze. Na závěr návštěvy byl sledovaným zvířatům zaveden subkutánní implantát s deslorelinem. Sledovaní kocouři byli znovu vyšetřeni pět (n=4), šest (n=4) a sedm (n=4) měsíců po úvodní návštěvě, kdy mimo výše uvedené procedury byla provedena kastrace a fixace varlat pro následné histologické vyšetření. Do kontrolních skupin bylo zařazeno deset zvířat. Do první kontrolní skupiny (n = 5) byli vybráni pohlavně dospělí kocouři ve věku jeden až čtyři roky, u kterých se již projevilo samčí pohlavní chování, a odběr ejakulátu prokázal probíhající spermatogenezi. Do druhé kontrolní
45
skupiny byli zařazení juvenilní jedinci ve věku 14 - 16 týdnů, kteří ještě nevykazovali samčí chování a při vyšetření penisu nebyly přítomny penilní papily, svědčící o produkci testosteronu. Varlata získaná orchiektomií těchto juvenilních samců byla použita pro zjišťování, zda dlouhodobá suprese pohlavní aktivity dospělých kocourů GnRH agonistou povede k potlačení spermatogeneze na úroveň spermatogonií a primárních spermatocytů, což odpovídá histologickému obrazu semenotvorných kanálků prepubertálních zvířat. Pro histologické posouzení úrovně spermatogeneze jsme zvolili metodu kategorizace příčných řezů stočenými semenotvornými kanálky podle nejdiferencovanější přítomné zárodečné buňky. Varlata byla fixována v roztoku formaldehydu okamžitě po orchiektomii a histologické preparáty byly zhotoveny z oblastí největší konvexity, margo cranialis a margo caudalis. Dvěstě příčných řezů semenotvornými tubuly jsme rozdělili na tubuly tt0 – nejdiferencovanější zárodečná buňka - spermatogonie, tt1 - spermatocyt, tt2 - okrouhlá spermatida, tt3 - elongující se spermatida, tt4 - elongovaná spermatida. Podle převažujícího typu semenotvorných kanálků jsme poté klasifikovali jednotlivá zvířata do skupin G0 až G4 (G0 - převaha tt0, G1 - tt1, G2 - tt2, G3 - tt3 a G4 - tt4). Výsledky Pět měsíců od zavedení implantátu s deslorelinem došlo u sledovaných kocourů k poklesu průměrné hodnoty T4 ze 7,76 ± 2,80 na 0,96 ± 0,56 ng/ml (P < 0,05; n = 4). Šest a sedm měsíců od implantace se hodnota T4 snížila z 11,07 ± 3,28 na 0,63 ± 0,99 ng/ml (P < 0,01; n = 4), respektive z 6,28 ± 2,95 na 0,84 ± 0,42 ng/ml (P < 0,05; n = 4). Výsledky měření průměrné hodnoty absolutní velikosti varlat prokázaly po pěti měsících její zmenšení o 46,8 %, z 213,5 ± 29,9 na 113,6 ± 14,95 mm2 (P < 0,01; n = 4). Po šesti a sedmi měsících od zavedení implantátu došlo ke snížení absolutní velikosti varlat o 55,9 %, z 252,1 ± 43,24 na 111,2 ± 14,15 mm2 (P < 0,01; n = 4), respektive o 53,8 %, z 218,9 ± 31,54 na 101,1 ± 26,20 mm2 (P < 0,01; n = 4). Vzhledem k nerovnoměrnému rozložení hodnot byl celkový počet spermií v ejakulátu hodnocen jako medián s minimální a maximální hodnotou. Po pěti měsících od zavedení implantátu došlo k poklesu celkového počtu spermií v ejakulátu z 11,875 (9,600 – 23,100) × 106 na 0,0 (0,0 – 0,676) × 106 (P < 0,05; n = 4). Šest a sedm měsíců od implantace nebyly ve získaném ejakulátu přítomny žádné spermie (pokles z výchozích hodnot 10,500 (8,400 – 18,375) × 106; P < 0,05; n = 4), respektive z 12,370 (7,700 – 24,750) × 106; P < 0,05; n = 4). Všichni pohlavně dospělí kocouři v Kontrolní skupině 1 byli na základě většiny tubulů s přítomnými elongovanými spermatidami coby nejdiferencovanějšími germinativními buňkami
46
zařazeni do skupiny G4. Juvenilní kocouři v Kontrolní skupině 2 byli všichni klasifikováni do skupiny G0, vzhledem k naprosté většině přítomných semenotvorných kanálků s přítomnými spermatogoniemi jako nejdiferencovanějšími zárodečnými buňkami. Ve skupině kocourů kastrovaných pět měsíců po zavedení implantátu byl jeden kocour klasifikován jako G0, další G1, třetí G2 a poslední G3. Stejná situace se opakovala i u kocourů kastrovaných šest a sedm měsíců po zavedení implantátu. Závěr Při dlouhodobém působení deslorelinu ve formě subkutánního implantátu nedošlo ani po sedmiměsíční expozici k potlačení spermatogeneze na úroveň spermatogonií a primárních spermatocytů u všech kocourů, jak bylo popsáno u psů a juvenilních jedinců. Ostatní vyšetření potvrdila infertilitu sledovaných zvířat. Pro zjištění, zda je možno u kocourů dosáhnout suprese spermatogeneze ve výše uvedené míře je nutno uskutečnit další sledování.
Seznam literatury MUNSON, L.. Contraception in felids. Theriogenology. 2006, 66(1), 126-134. JUNAIDI, A., WILLIAMSON, P. E., CUMMINS, J. M., MARTIN, G. B., BLACKBERRY, M. A. and TRIGG, T. E. Use of a new drug delivery formulation of the gonadotrophin-releasing hormone analogue Deslorelin for reversible long-term contraception in male dogs. Reprod Fertil Dev. 2003 15(6), 317-322. LUDWIG, C., DESMOULINS, P. O., DRIANCOURT, M. A., GOERICKE-PESCH, S. and HOFFMANN, B. Reversible downregulation of endocrine and germinative testicular function (hormonal castration) in the dog with the GnRH-agonist azagly-nafarelin as a removable implant "Gonazon"; a preclinical trial. Theriogenology. 2009, 71(7), 1037-1045. GOERICKE-PESCH, S., SPANG, A., SCHULZ, M., OZALP, G., BERGMANN, M., LUDWIG, C. and HOFFMANN, B. Recrudescence of spermatogenesis in the dog following downregulation using a slow release GnRH agonist implant. Reprod Domest Anim. 2009, 44 (Suppl 2), 302-308. NOVOTNY R., CIZEK P., VITASEK R., BARTOSKOVA A., PRINOSILOVA P., JANOSOVSKA M.. Reversible suppression of sexual activity in tomcats with deslorelin implant. Theriogenology. 2012, 78(4), 848-857.
47
Parazitofauna volně žijících habituovaných mangabejů štíhlých (Cercocebus agilis) s důrazem na mezidruhové přenosy Kateřina Pomajbíková, Mwanahamisi Issa, Zuzana Tehlárová Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Antropogenní tlak na populace volně žijících primátů a jejich přirozené prostředí má dopad na změny společenstev parazitů i na frekvence jejich zoonotických či mezidruhových přenosů. V popředí zájmu jsou díky své příbuznosti s člověkem zejména lidoopi, zatímco ostatní primáti jsou téměř opomíjeni. V zajetí však bylo prokázáno, že tito primáti mohou hrát významnou roli jako rezervoár parazitárních onemocnění. Naopak z volné přírody nejsou podobná data dostupná. Možnost, že ostatní primáti mohou být rezervoáry zoonotických parazitů i ve volné přírodě, byla například demonstrována na nejmalignějším lidském druhu malárie, jejíž izolát byl zachycen u kočkodana bělonosého (1). Přestože je tento případ ojedinělý, není pochyb, že by problematika studia parazitofauny u „ostatních primátů“ a jejich zoonotických přenosů, neměla být opomíjena. V našem projektu byla jako model vybrána skupina habituovaných mangabejů štíhlých (Cercocebus agilis) v národním parku Dzanga-Ndoki ve Středoafrické republice (SAR). Tato skupina mangabejů je ideální pro studium zoonotických či mezidruhových přenosů, jelikož je v úzkém kontaktu s lidmi - místními stopaři a asistenty, výzkumníky a turisty, a navíc žije sympatricky s gorilami nížinnými a šimpanzi učenlivými. Materiál a metodika Sběr a fixace vzorků trusu: vzorky trusu byly nasbírány od primátů a lidí v národním parku Dzanga-Ndoki ve Středoafrické republice (SAR) v průběhu let 2011-2012 a byly fixovány v 10% formalínu pro koproskopické analýzy a v RNAlater pro molekulární analýzy. Pro koproskopickou detekci parazitů bylo celkem vyšetřeno 140 vzorků trusu od mangabejů štíhlých. V rámci molekulární detekce krevních parazitů, bylo vyšetřeno 54 vzorků od mangabejů, 132 vzorků od goril nížinných, 5 vzorků od šimpanzů učenlivých a 96 vzorků od lidí. Koproskopická diagnostika: byly použity rutinní koproskopické metody a to Sheatherova flotace a Mertiolát-jód-formaldehydová sedimentace. Rodové zařazení roupa přítomného ve vzorcích
48
trusu mangabejů bylo provedeno ve spolupráci s prof. Hideem Hasegavou (Oita University, Japonsko). Molekulární a fylogenetické analýzy: celková DNA byla izolována komerčními kity (Qiagen). V této studii byli detekováni dva krevní parazité a to rodu Plasmodium a Hepatocystis. Pro diagnostické rodově specifické nested-PCR byly použity kombinace našich vlastních i opublikovaných primerů (2,3), jež amplifikují část genu cytochrom B (558-930 bp). Výsledné produkty byly extrahovány z gelu pomocí extrakčního kitu (Qiagen) a sekvenovány u komerční firmy (Macrogen, Korea). Získané sekvence byly porovnávány s dostupnými sekvencemi v databázi BLAST, alingnovány v programu BioEdit 7.0.9.1. a fylogenetické stromy byly konstruovány pomocí algoritmů Maximum likelihood (GTR model). Výsledky Koproskopickými metodami bylo detekováno kompletní spektrum gastrointestinálních parazitů u mangabejů a jejich prevalence a to i během jednotlivých roků (Tab 1). Byla diagnostikována jak protista spadající do 3 rodů - Entamoeba spp., Iodamoeba sp. a Buxtonella-like nálevníci, tak helminti a to blíže neidentifikované strongylidní a spiruridní hlístice, Subulura sp., Trichuris sp. a roup, jež byl na základě morfologických znaků zařazen do rodu Enterobius. V rámci molekulárních analýz pro detekcí výše uvedených krevních parazitů bylo zjištěno, že vzorky mangabejů byly negativní. Prvok rodu Hepatocystis nebyl zachycen ani ve vzorcích goril, šimpanzů a lidí. Naopak Plasmodium sp. bylo detekováno u goril, šimpanzů i u lidí (Tab 2). Závěry Během dosavadního tříletého výzkumu parazitofauny mangabejů štíhlých byly zaznamenány jak parazitární protista, tak i několik helmintů a jejich prevalence (Tab 1). Čtyři zástupci (améby, Buxtonella-like nálevník, strongylidní hlístice a Subulura sp.) byly detekovány každý rok a to ve vysokých prevalencích (Tab 1). Naopak spiruridní hlístice, Enterobius sp. a Trichuris sp. byly detekovány pouze jeden nebo dva roky a ve velmi nízkých prevalencích (Tab 1). Vysvětlení nízkých prevalencí či absence spiruridních hlístic může být vysvětleno jejich nepřímým vývojovým cyklem, kdy záleží na hojnosti mezihostitele (v tomto případě hmyz). Naopak ojedinělý výskyt dalších dvou hlístic může být dán blízkým kontaktem habituované skupiny mangabejů s člověkem. V předešlých studiích byl Enterobius sp a Trichuris sp. detekován u lidí
49
pracujících právě se skupinou mangabejů, nicméně k potvrzení této hypotézy bude nezbytné využití molekulárně-fylogenetických analýz. Je tedy možné, že lidé mohou být zdrojem parazitárních infekcí pro habituované mangabeje podobně jako u jiných populací mangabejů (4). Díky možnosti neinvazivní diagnostiky krevních parazitů, Plasmodium sp. a Hepatocystis sp., v trusu primátů jsme měli možnost detekovat jejich přítomnost u mangabejů i sympatricky žijících goril, šimpanzů a lidí. Zjistili jsme, že vzorky mangabejů byly naprosto negativní na oba druhy krevních parazitů, zatímco u goril, šimpanzů a lidí byli zaznamenány pouze plazmodia a to linie/druhy vždy specifické pro daného hostitele (Tab 2). Na základě těchto předběžných dat je možné usoudit, že mangabejové nesehrávají roli rezervoárové hostitele krevních parazitů pro lidi i jiné primáty v této lokalitě. Tabulka 1: Výskyt jednotlivých parazitů detekovaných ve vzorcích mangabejů štíhlých v NP Dzanga-Ndoki, SAR.
protista Entamoeba spp. Iodamoeba sp. Buxtonella sp. helminti strongylidní hlístice spiruridní hlístice Subulura sp. Enterobius sp. Trichuris sp.
prevalence (počet pozitivních vzorků/celkový počet vzorků) 2010 2011 2012 celkem 63 % (37/59) 97 % (29/30) 94 % (48/51) 81 % (114/140) 63% (37/59) 97 % (29/30) 91 % (46/51) 80 % (112/140) 19 % (11/59) 53 % (16/30) 65 % (33/51) 43 % (60/140) 73 % (43/59) 17 % (10/59) 46 % (27/59) 7 % (4/59) -
77 % (23/30) 7 % (23/30) -
71 % (36/51) 4 % (2/51) 27 % (14/51) 6 % (3/51)
72 % (102/140) 9 % (12/140) 46 % (64/140) 3 % (4/140) 2 % (3/140)
Tabulka 2: Výskyt linií a druhů plazmodií u jednotlivých primátů v NP Dzanga-Ndoki, SAR . hostitel mangabej štíhlý gorila nížinná šimpanz učenlivý člověk
detekované linie či druhy Plasmodium vivax-like, P. ovale-like, Plasmodium sp. clade G1, G2, G3 Plasmodium sp. C1 a C3 P. falciparum
prevalence 2 % (2/132) 40 % (2/5) 43 % (41/96)
Seznam literatury: 1.
PRUGNOLLE, Franck, DURAND, Patrick, NEEL, Cécile, a kol. African great apes are natural hosts of multiple related malaria species, including Plasmodium faciparum. PNAS, 2010, 107, 1458-1463.
2.
CHANG, Qiaocheng, SUN, Xiaodong, WANG, Jian, a kol. Indetification of Hepatocystis species in a macaque monkey in northern Myanmar. Research and Reports in Tropical Medicine, 2011, 2, 141-146.
3.
LIU, Weimin, LI, Yingying, LEARN, Gerald H., a kol. Origin of the human malaria parasite Plasmodium falciparum in gorillas. Nature, 2010, 467, 420-425.
4.
MBORA, David N., McPEEK, Mark A. Host density and human activities mediate increased parasite prevalence and richness in primates threatened by habitat loss and fragmentation. Journal of Animal Ecology, 2009, 78, 210-218.
50
Diverzita a hostitelská specifita rodu Hepatozoon u masožravců Barbora Mitková, David Modrý, Martina Gallusová Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Krevní paraziti rodu Hepatozoon u masožravců vykazují vysokou prevalenci zejména v oblasti Stredomoří, kde je hojný i jeho vektor, klíště Ripicephalus sanguineus. Nedávné studie potvrdily výskyt parazita i u domácích a volně žijících masožravců v oblastech, kde se jeho vektor nevyskytuje (1,2). Nejspolehlivější metodou detekce hepatozoonů v biologického materiálu je PCR, přičemž většina studií využívá 18S rRNA k detekci DNA parazita ve vzorcích krve nebo tkání. Nejčastěji využívané primery jsou HEP (3) a u koček lépe fungující BTHL (4). U domácích masožravců byly na základě molekulárních metod a fylogenetických analýz popsány tři druhyHepatozoon canis a Hepatozoon americanum u psů a Hepatozoon felis u koček (5). Dosavadní studie o rodu Hepatozoon u volně žijících masožravců ukazují na vysokou prevalenci parazita, avšak jeho přesné určení je zatím nejasné. V rámci naší práce byly vyšetřeny skupiny vzorků domácích i volně žijících šelem z různých lokalit v Evropě a Africe pomocí výše uvedených primerů. Materiál a metodika Vzorky a jejich zpracování V rámci práce jsme vyšetřili vzorky krve psů a koček z Rumunska (142 vzorků), dále krve koček z Keně (124 vzorků) a vzorky tkání z volně žijících psovitých šelem z Rumunska (lišky, šakali, vlci- 99 vzorků). Vzorky krve byly odebírány do zkumavek s EDTA nebo etanolem a následně zmražené. Na izolaci DNA jsme použili fenol-chloroformovou metodu. Vzorky tkání byly zmražené a DNA byla izolována pomocí komerčního kitu (Quiagen, DNeasy Blood&Tissue Kit). Molekulární analýzy a sekvenace DNA parazita jsme detekovali za využití metody PCR. V prvním kroku jsme použili nespecifické primery BTHL 1 a 2, které amplifikují DNA parazitů rodu Babesia, Theileria, Hepatozoon a Leishmania. Ve druhém kroku se vzorky vyšetřili primery HEP F a R, specifických pro rod Hepatozoon. Primery amplifikují různé úseky 18S rRNA, u BTHL primerů má produkt délku 450
51
bp, u HEP primerů je délka produktu 500-600 bp. Primery BTHL jsou vhodné na nespecifickou diagnostiku piroplasem a u koček též na diagnostiku rodu Hepatozoon. Rodově specifické primery HEP jsou často využívané především na diagnostické účely u psů a psovitých šelem. Produkty PCR reakce byly vizualizovány pomocí gelové elektroforézy. U vybraných, dostatečně pozitivních vzorků, se PCR produkty následně extrahovaly z gelu pomocí kitu (Quiagen Gel Extraction Kit) a byly zaslány na sekvenaci (Macrogen, Korea). U koček jsme pro sekvenaci použili produkty získané pomocí BTHL primerů, u psů a volně žijících masožravců pak produkty HEP primerů. Získané sekvence jsme porovnali s dostupnými sekvencemi v databázi GeneBank. Výsledky PCR diagnostikou jsme dokázali vysokou prevalenci hepatozoonů u psů a koček v oblastech endemického výskytu klíšťat rodu Rhipicephalus v Keni a v Rumunsku. Zároveň jsme ale zjistili přítomnost parazitů i u volně žijících masožravců v Rumunsku v lokalitách, kde se jeho výskyt nepředpokládal kvůli absenci jeho vektora (Tabulka 1). Tabulka 1: Prevalence parazita rodu Hepatozoon u masožravců z různých lokalit. Druh / Lokalita
Vzorky spolu
BTHL pozitivní
HEP pozitivní
Počet sekvencí
Kočky- Keňa
124
108 (87%)
X
10
Psy- Rumunsko
142
65 (46%)
53 (37%)
16
Kočky- Rumunsko
6
1 (17%)
X
0
Lišky- Rumunsko
99
59 (60%)
58 (59%)
9
Získané sekvence byly porovnány s dostupnými sekvencemi v GENEBANK. U koček z Keni byl v 6 případech parazit určen jako H. felis, ve dvou případech jako Hepatozoon sp. a v jednom případě jako H. canis. U psů a volně žijících psovitých šelem z Rumunska byl parazit ve všech případech identifikován jako H. canis. Závěr Naše práce navazovala na probíhající a doposud publikované studie o hepatozoonech u masožravců. Nejčastěji používanými primery ve většině studií jsou právě HEP primery. Tato metodika funguje dobře u psovitých šelem z různých typů vzorků (krev, tkáně). Nicméně se zdá, že jejich použití je vhodné hlavně k diagnostickým účelům. Jejich využití pro podrobnější fylogenetické analýzy je ale diskutabilní vzhledem k relativně krátkému amplifikovanému úseku a taky proto, že u kočkovitých šelem se lépe osvědčily jiné primery. Naše výsledky také poukazují na pravděpodobně složitější
52
epidemiologií u rodu Hepatozoon v případě domácích a volně žijících masožravců vzhledem k nálezu H. canis u hostitelů v oblastech bez jeho vektora. Širší hostitelskou specifitu naznačuje nález H. canis a blíže neurčeného Hepatozoon sp. u koček. Seznam literatury 1. HORNOK, S., TÁNCZOS, B., FERNÁNDEZ DE MERA, I.G., DE LA FUENTE, J., HOFMANNLEHMANN, R., FARKAS, R. High prevalence of Hepatozoon-infection among shepherd dogs in a region considered to be free of Rhipicephalus sanguineu. Veterinary Parasitology, 2013, 196, 189-193. 2. MAJLÁTHOVÁ, V., MAJLÁTH, I., VÍCHOVÁ, B., GUĽOVÁ, I., DERDÁKOVÁ, M.. SESZTÁKOVÁ, E., PEŤKO, B. Polymerase chain reaction confirmation of Babesia canis canis and Anaplasma phagocytophilum in dogs suspected of babesiosis in Slovakia. Vector-Borne and Zoonotic Disease, 2011, 11, 1447- 1451.
3. INOKUMA, H., OKUDA, M., OHNO, K., SHIMODA, K., ONISHI, T. Analysis of the 18S rRNA gene sequence of a Hepatozoon detected in two Japanese dogs. Veterinary Parasitology, 2002, 106, 265-271.
4. TABAR, M.D., ALTET, L., FRANCINO, O., SANCHEZ, A., FERRER, L., ROURA, X. Vector-borne infections in cats: Molecular study in Barcelona area (Spain). Veterinary Parasitology, 2008, 151, 332–336.
5. BANETH, G. Perspectives on canine and feline hepatozoonosis. Veterinary Parasitology, 2011, 181, 3-11.
53
Složení semenné plazmy hřebců a jeho korelace s jeho mrazitelností Miroslava Mráčková1, Martina Chromá, Eliška Horáčková, Markéta Sedlinská1 Klinika chorob koní, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Úvod Semenná plazma svým složením velmi významně ovlivňuje kvalitu ejakulátu. Velký vliv má především na metabolismus spermií, na jejich pohyblivost a schopnost oplodnit vajíčko. Dále je semenná plazma také nezbytná pro kapacitaci spermií, funkci a integritu buněčné membrány spermií. Některé předchozí studie ukazují na souvislost mezi objemem semene a jeho koncentrací s enzymy AST, GGT, AlP, AcP a LDH a s mikroprvky Fe a Zn (1). LDH také velmi úzce souvisí s motilitou spermií a poměrem živých a mrtvých spermií v ejakulátu, což ukazuje pravděpodobně na její vliv v ochraně membrán (1). Jiná studie zabývající se některými mikroprvky a jejich vztahem k mrazitelnosti žádnou souvislost nenašla (2), avšak nezabývala se kvalitativními parametry semene před jeho mrazením. Získaná data v oblasti složení semenné plazmy a jejího vlivu na spermie jsou však stále velmi roztříštěná a často až protichůdná, proto je nezbytný další výzkum v této oblasti (3). Materiál a metodika Sledování bylo provedeno u 7 licentovaných plemenných hřebců ve věkovém rozmezí 4 – 16 let. Odběry hřebců byly opět prováděny do umělé pochvy na fantomu za přítomnosti klisny. Hodnoceno bylo celkem 36 ejakulátů, které byly posouzeny jak makroskopicky, tak i mikroskopicky. Dále byly odstředěny, semenná plazma byla odebrána a zamrazena pro pozdější hodnocení. Sediment spermií byl resuspendován ve Francouzském ředidle, rozplněn do pejet a zamrazen. Vzorky semenné plazmy byly vyšetřeny v Klinické laboratoři pro velká zvířata VFU Brno. Kritériem pro zhodnocení mrazitelnosti ejakulátu byla vždy motilita spermií po rozmrazení. Ejakuláty s motilitou po rozmrazení 35 % a více, skupina A1 a ejakuláty s motilitou po rozmrazení pod 35 %, skupina B1. Pro vyhodnocení výsledků byl zvolen neparametrický Wilcoxonův (MannWhitneyův) test pro nepárová data. Výsledky Výsledky měření jednotlivých parametrů, které byly v semenné plazmě sledovány jsou pak seřazeny v tabulce č. 1. Z dalších parametrů byla dále sledována koncentrace cholesterolu a vitamínu A, které však byly ve všech vzorcích nulové. Při srovnání obou skupin pomocí statistických metod, byl významný rozdíl (p≤0,05) mezi skupinami pouze u koncentrace vitamínu E v semenné plazmě. U skupiny ejakulátů, kde spermie
54
vykazovaly po rozmrazení lepší motilitu (≥ 35 %) byla koncentrace vitaminu E významně nižší než u skupiny ejakulátů s horší motilitou po rozmrazení (< 35 %). Tabulka č. 1: Průměrné hodnoty vybraných biochemických parametrů pro skupiny A1 a B1 Skupina A1
Skupina B1
(ejakuláty s motilitou po rozmrazení ≥ 35 %)
(ejakuláty s motilitou po rozmrazení < 35 %)
n
průměr±SD
n
průměr±SD
Celkový protein (g/l)
18
5,9±2,99
14
7,7±4,67
Kreatinin (μmol/l)
18
54,3±19,42
13
53,2±21,23
Urea (mmol/l)
18
6,7±0,91
14
6,2±1,26
ALP (μkat/l)
13
65,9±28,96
8
56,4±38,29
ALT (μkat/l)
18
0,2±0,06
14
0,2±0,08
AST (μkat/l)
18
0,9±0,81
14
0,9±0,51
CK (μkat/l)
13
2,1±1,56
13
2,2±1,13
GMT (μkat/l)
11
54,6±14,61
6
47,7±18,74
LDH (μkat/l)
10
0,5±0,31
9
0,6±0,25
Na+ (mmol/l)
18
109,6±17,97
14
109,1±20,49
K+ (mmol/l)
18
21,9±5,77
14
24,5±10,55
Ca (mmol/l)
17
2,3±0,80
12
1,7±1,23
P (mmol/l)
18
0,7±0,44
13
0,8±0,45
Cl (mmol/l)
18
124,7±17,15
14
117,2±17,00
ZnS (μg/l)
18
4,8±2,02
12
4,9±2,29
Cu (μg/l)
17
4,1±2,17
12
5,2±3,11
Mg (μg/l)
18
1,8±0,94
14
1,3±0,63
Se (μg/l)
17
5,7±3,69
13
6,5±3,43
Vit E (mmol/l)
18
0,015±0,0269*
14
0,068±0,0720*
Sledovaný parametr
p≤0,05
55
Závěr Semenná plazma má velký vliv, ať už pozitivní, či negativní, na motilitu a přežívání spermií. U žádného ze zkoumaných enzymů, elektrolytů či mikroprvků se nám souvislost se schopností spermií přežít zmrazení a následné rozmrazení nepodařilo prokázat. Výjimkou byla koncentrace vitamínu E, kde byl prokázán statisticky významný (p≤0,05) rozdíl mezi koncentracemi ve skupině dobře mraz a špatně mrazitelných ejakulátů. Koncentrace vitamínu E jsou však v hřebčím semeni velmi nízké, proto by bylo vhodné tento výsledek ověřit na větším množství vzorků.
Seznam literatury 1. Pesch S. et al. (2006): Determination os some enzymes and macro- and microelements in stallion seminal plasma and their correlations to semen quality. Theriogenology 66:307-313 2. Barrier-Battut I. et al. (2002): Calcium, magnesium, cooper, and zinc in seminal plasma of fertile stallions, an their relationship with semen freezability. Theriogenology 58:229-232 3. Kareskoski M., Katila T. (2008): Components of stallion seminal plasma and the effects of seminal plasma on sperm longevity. Anim Reprod Sci 107: 249-256
56
Stanovení regulačních cytokinů a subpopulací lymfocytů u psů s atopickou dermatitidou Satinská Dora1, Hošková Zlata1, Matiašovic Ján2, Levá Lenka2, Osvaldová Alena2, Toman, Miroslav1,2 Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno
1
Úvod Atopická dermatitida psů (CAD) je definována jako geneticky predisponované zánětlivé a svědivé onemocnění kůže s charakteristickými příznaky a IgE protilátkami proti danému vnějšímu alergenu (1). Prevalence CAD popisují různí autoři v rozmezí 3 – 30 % (1, 2). CAD je spojena s Th2 typem odpovědi, ačkoliv v chronických lézích mohou být nalezeny cytokiny odpovídající Th1 odpovědi (3). Th1 cytokiny (INF-γ, IL-2, IL-12 a TNF-α) podporují buněčnou imunitu, zatímco Th2 cytokiny (IL-4, IL-5, IL-6 a IL 13) humorální složku imunity a produkci IgE (4). Aktivita těchto cytokinů v místě zánětu je přísně regulována transkripčními faktory - supresory cytokinové aktivity (SOCSs), signálními transduktory a aktivátory transkripce (STATs). Geny kódující STAT4, SOCS5 a T-bet jsou spojeny s Th1 buňkami, STAT6, GATA-3 a SOCS3 s Th2 buňkami, FOXP3 s regulačními T buňkami (2). Chemokiny jsou důležitými regulátory selektivního směrování buněk do místa zánětu. Výsledky exprese chemokinu CCL27 v kůži s lézemi byly nižší než v kůži bez lézí a zároveň exprese CCL28 byla v lézích nalezena vyšší než kůži bez lézí. Tyto výsledky naznačují, že CCL28 může hrát důležitou roli v imunopatogenezi CAD (5). Materiál a metodika Soubor zvířat a odběr vzorků Celkem jsme vyšetřili 19 psů, rozdělených na skupinu pacientů (psi trpící atopickou dermatitidou) a kontrolní skupinu (psi bez známek atopické dermatitidy). Kontrolní skupinu tvořilo 5 nekastrovaných psů, 4 kastrované a 1 nekastrovaná fena ve věku 5-12 let. Pacienti sestávali z 2 nekastrovaných psů, 6 nekastrovaných a 1 kastrovaná fena ve věku 2-7 let. Pro vyšetření subpopulací lymfocytů a stanovení genů pro cytokiny jsme odebrali 3 ml krve z vena jugularis a pro stanovení genů pro cytokiny i biopsii kůže z oblasti karpu. Hematologie a průtoková cytometrie Ze vzorků krve jsme odebrali po 0,5 ml pro hematologické stanovení celkového počtu a diferenciálního rozpočtu leukocytů a stanovení subpopulací lymfocytů. Lymfocytární subpopulace jsme sledovali pomocí průtokové cytometrie za použití metody dvojbarevné imunofluorescence. Do zkumavek jsme pipetovali po 50μl krve zbavené červených krvinek pomocí hemolýzy, ke které jsme přidávali ve dvojicích po 50 μl protilátek
57
(proti CD3, CD8, CD4, CD8, CD21, TCRγδ, CD45) a po 20 μl kozího séra k vyblokování nespecifické vazby sekundárních protilátek. Následně jsme přidali 50 μl sekundárních protilátek značených dvěma typy fluorochromů. Následné přidání 20 μl propidium jodidu umožnilo vyřadit z měření mrtvé buňky. Výsledky jsme vyhodnocovali na průtokovém cytometru BD LSR Fortessa. Zpracování vzorků pro stanovení genů pro cytokiny Vzorky kůže jsme po odběru umístili do roztoku RNA-later. Po 24 hodinách v chladničce při 4oC jsme je přemístili do mrazničky s teplotou -80oC. Z 2,5 ml krve jsme gradientovou centrifugací izolovali lymfocyty, z nichž jsme jednu část stimulovali směsí ionomycinu a forbolu a druhou část ponechali nestimulovanou. Obě části jsme inkubovali 4 hodiny při 37oC a 5% CO 2 . Buňky jsme zafixovali pomocí média Trireagent a uchovávali při -20oC. Po rozmražení vzorků jsme izolovali RNA, kterou jsme pomocí reverzní transkripce převedli na cDNA. Tu jsme zředili vodou prostou RNáz a následně stanovili expresi cytokinů pomocí kvantitativní metody polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR). Primery a RT-PCR Primery pro qPCR jsme navrhli pomocí http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast v délce 20 až 26 párů bází. Délka PCR produktů se pohybuje mezi 60 až 150 nukleotidy, teploty tání těchto produktů mezi 60 až 63oC. Primery jsme naředili na výslednou koncentraci 1μmol/μl v PCR reakci. Reakce probíhala v 384 jamkové desce po napipetování zpracovaných vzorků, primerů a Master mixu pipetovacím přístrojem Innovadyne Nanodrop NS-Stage v objemu 1 μl primeru, 0,5 μl vzorku a 1,5 μl Masterixu. Samotná qPCR se uskutečnila v přístroji LightCycler. Výsledky Počet leukocytů u pacientů i kontrol byl srovnatelný. U pacientů byl zaznamenán statisticky významně vyšší relativní počet neutrofilů (p=0,0451) a statisticky nižší relativní počet lymfocytů (p=0,0245). Pomocí průtokové cytometrie jsme prokázali statisticky významný rozdíl poměru T a B lymfocytů, kdy procento B lymfocytů u pacientů bylo významně nižší (p=0,0304) a procento T lymfocytů vyšší (p=0,0279) oproti kontrolám. Úbytek absolutního počtu B lymfocytů byl statisticky vysoce významný (p=0,003).
58
Pomocí RT-PCR stanovovali expresi 12 genů v krvi (HPRT, IFN-γ, IL-1β,TNFα, TGFβ, IL-10, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL10, IL-8, SOCS3) a 16 genů v kůži (HPRT, IFN-γ, IL-1β, IL-12p35, TNFα, TGFβ, IL-10, CCL4, CCL5, CCL25, CCL27, CCL28, IL-8, Tbet, GATA3, SOCS3), které jsme vybrali po vyhodnocení měřitelnosti exprese a účinnosti amplifikace primerů pro celkem 27 genů. Vlastní vyhodnocení exprese daného genu ve vzorcích jsme uskutečnili porovnáním jeho exprese a exprese house-keepingového genu HPRT. V nestimulované krvi jsme nezjistili statisticky významný rozdíl exprese sledovaných genů mezi skupinou kontrolních psů a pacientů. Po stimulaci krve došlo u většiny genů k nárůstu exprese, ale statisticky významné změny byly jen u genu pro IFNγ, a to u pacientů i kontrol (p=0,0056, p=0,0019), u TNFα jen u pacientů (p=0,0056), a naopak u genu IL-8 (p=0,0192) a SOCS3 (p=0,0142) pouze u kontrol. U genů pro SOCS3 a CXCL10 jsme po stimulaci zaznamenali útlum jejich exprese u pacientů i kontrol. Útlum genu pro SOCS3, který je významným regulátorem Th2 typu odpovědi, byl statisticky významně vyšší u pacientů než u kontrol (p=0,0281). V kůži jsme nezaznamenali statisticky významné rozdíly v expresi sledovaných genů mezi pacienty a kontrolami, což může být mimo jiné dáno i místem odběru bioptického vzorku. Seznam literatury: 1. Olivry, O., DeBoer D.J., Favrot C., Jackson H.A., Mueller R.S., Nuttall T. et Prélaud P. Treatment of canine atopic dermatitis: 2010 clinical practice guidelines from the International Task Force on Canine Atopic Dermatitis. Veterinary Dermatology 2010; vol.21: pp.233-248. 2. Schlotter , Y., Rutten, V., Riemers, F., Knoll, E. et Willemse, T.: Lesional skin in atopic dogs shows a mixed Type-1 and Type-2 immune responsiveness. Veterinary Immunology and Immunopathology 2011; vol.143: pp20–26. 3. Sinke, J.D., Rutten V.P.M.G. et Willemse, T.: Immune dysregulation in atopic dermatitis. Veterinary Immunology and Immunopathology 2002; vol.87: pp.351-356 4. Nuttal, T., Knight, P.A., McAleese, S. M., Lamb, J.R. et Hill, P.B.: Expression of Th1, Th2 and immunosuppressive cytokine gene transcripts in canine atopic dermatitis. Clin Exp Allergy 2002; vol.32: pp.789-785 5. Maeda, S, Tsuchida, H., Shibata, S., et al.: Expression Analysis of CCL27 and CCL28 mRNA in Lesional and Non-Lesional Skin of Dogs with Atopic Dermatitis. J. Vet. Med. Sci. 2008; vol. 70: pp. 51-55
59
Porovnání aktivátorů a inhibitorů koagulace a fibrinolýzy u onemocnění asociovaných s výskytem diseminované intravaskulární koagulace. Ivana Uhríková , Leona Raušerová2, Michal Bílek2 , Vendula Kuchařová3, Marie Rybová3 1
Ústav fyziologie1, Klinika chorob psů a koček2, studentka MSP3, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) je závažná komplikace řady onemocnění spojená s nadměrnou aktivitou koagulačního a fibrinolytického systému.1 Příčina vzniku DIC závisí od primárního onemocnění, v patogenezi je vždy prvním krokem aktivace koagulace. Ta může být způsobena zvýšenou expresí iniciátoru koagulace – tkáňového faktoru, úbytkem přirozených inhibitorů koagulace (antitrombin, protein C, inhibitor cesty tkáňového faktoru) nebo alterací fibrinolýzy (zvýšení inhibitoru aktivátoru plazminogenu).2 Předpokládá se, že způsob aktivace koagulace závisí na primárním onemocnění, např. u hemangiosarkomů se za iniciátora koagulace považuje zvýšená exprese tkáňového faktoru nádorově změněným endotelem, zatímco spouštěčem DIC doprovázející traumatické stavy se předpokládá deplece inhibitorů koagulace.3,4 Studie věnované problematice DIC ve veterinární medicíně jsou zaměřené především na diagnostické možnosti tohoto syndromu. Role jednotlivých složek hemokoagulačního systému pro iniciaci DIC u různých onemocnění není známá a tato studie si proto dává za cíl porovnat hladiny aktivátorů a inhibitorů koagulace a fibrinolýzy u různych skupin onemocnění.
Materiál a metodika Zvířata Celkem bylo do studie zahrnuto 40 psů (28 samic, 12 samců) patřících do 33 plemen s průměrnou hmotností 33 kg (min-max, 2,7-85 kg) a průměrným věkem 7,6 let (9 měsíců – 15,6 let). Zvířata byla podle onemocnění rozdělena do tří skupin: pacienti se septickým onemocněním („sepse“), traumatičtí pacienti („trauma“) a onkologičtí pacienti („onkologie“). Ve skupině sepse bylo 12 psů z toho 11 s pyometrou. Ve skupině traumat bylo 15 jedinců z toho 11 se syndromem dilatace a volvulu žaludku a 4 polytraumatičtí pacienti po úrazu. Skupinu onkologických pacientů tvořilo 8 jedinců, z toho 7 jedinců hemangiosarkomem. Skupinu kontrolních jedinců tvořilo 20 klinicky zdravých psů předvedených na VFU Brno z preventivních důvodů (průměrná hmotnost 29 kg, 16 49 kg, věk 3,5 let, 8 měsíců – 10,8 let). Odběr, zpracování vzorků a analýzy
60
Od všech probandů byla odebrána krev z vena jugularis nebo vena cephalica accessoria. Pro hematologické vyšetření byla použita EDTA krev a vyšetření bylo provedeno na automatickém impedančním analyzátoru do 10 minut po odběru krve. Sérum a citrátová plazma byly uchovávány při teplotě -70 °C do analýz. Ze vzorků citrátové plazmy byl stanoven aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT), protrombinový čas (PT), hladina fibrinogenu (FBG), koncentrace Ddimerů (D-di) a aktivita antitrombinu (AT). Stanovení tkáňového, plazminogenu a inhibitoru aktivátoru plazminogenu bylo provedeno ELISA metodou. Kritéria DIC a statistické zpracování Zvířata byla na základě hematologického a rutinního hemostazeologického vyšetření rozdělena na DIC pozitivní aDIC negativní. Zvířata byla považována za DIC pozitivní, pokud splnila minimálně 4 kritéria z: počet trombocytů < 200*109/l, PT > 13 s, aPTT > 19,5 s, FBG < 1,5 g/l, D-di > 0,3 mg/l nebo AT < 105 %. Pro vyhodnocení dat a výpočet ploch pod křivkou byl použit program Statistica 6.0 (Statsoft, Inc., Tulsa, USA) a MedCalc (MedCalc software bvba, Belgie). Hladina statistické významnosti byla stanovena na p<0,05.
Výsledky V tab. 1 jsou uvedeny mediány jednotlivých parametrů v skupinách pacientů. Tab. 1. Hodnoty (medián) hemostazeologických vyšetření v jednotlivých skupinách. Parametr
Jednotky
Kontrolní sk.
Trauma
Sepse
Onkologie
DIC pozitivní
%
0,0
20,0
8,0
50,0
Trombocyty
*109/l
266,6
209,0*
292,0
121,5
Protombin. čas
s
9,7
10,9*
10,6*
12,2*
aPTT
s
19,8
21,7*
22,0*
23,3*
Fibrinogen
g/l
1,4
1,4
4,3*,t
1,8s
D-dimery
mg/l
0,1
0,4*
1,3*,t
0,7*
Antitrombin
%
128
129
117
77*,t,s
Tkáňový faktor
pg/ml
0,0
32,6
113,6*
179,2
Plazminogen
ng/ml
37,6
11,6
47,1
19,6
PAI
pg/ml
31,6
43,9
*,t
140,0
33,2s
Vysvětlivky: DIC – diseminovaná intravaskulární koagulace, aPTT – aktivovaný parciální tromboplastinový čas, PAI – aktivátor inhibitoru plazminogenu, skupiny, t/s – signif. odlišné od skupiny trauma/sepse
61
*
- signif. odlišné od kontrolní
V tab. 2 jsou uvedeny diagnostické výpovědi parametrů pro přítomnost diseminované intravaskulární koagulace. Tab. 2. Diagnostická výpověď hemostatických parametrů. Trombs
PT
aPTT
FBG
D-di
≤179,0
>11,5
≥23,3
≤1,1
>0,3
*109/l
s
s
g/l
mg/l
Se %
100,0
100
75,0
75,0
Sp %
82,1
89,3
85,7
AUC
0,934
0,951
0,837
cut-off
AT
TF
Plazminogen
PAI
≤106,0 >143,0
>14,4
≤36,2
%
pg/ml
ng/ml
pg/ml
100,0
100,0
66.7
83,3
83,3
78,6
40,9
90,0
70,0
47,6
71,4
0,754
0,741
0,958
0,617
0,532
0,762
Vysvětlivky: Se – senzitivita, Sp – specifičnost, AUC – plocha pod křivkou, Trombs – počet trombocytů, PT – protrombinový čas, aPTT – aktivovaný parciální tromboplastinový čas, FBG – hladina fibrinogenu, D-di – D-dimery, AT – antitrombin, TF – tkáňový faktor, PAI – aktivátor inhibitoru plazminogenu. Závěr Ze sledovaných skupin byla nejvyšší incidence DIC u onkologických pacientů. Nejvyšší diagnostickou výpověď pro diagnostiku DIC má AT, PT a počet trombocytů. Septičtí pacienti mají signifikantně vyšší hladiny tkáňového faktoru a inhibitoru aktivátoru plasminogenu oproti kontrolním zvířatům. Seznam literatury: 1. Bruchim Y, Aroch I, Saragusty J, Waner T. Disseminated intravascular coagulation. Comp Cont Edu Pract Vet 2008, 30:1-16. 2. Petäjä J. Inflammation and coagulation. An overview. Throm Res 2011, 127:S34-37. 3. Levi MM. Disseminated intravascular coagulation. Online: http://misc.medscape.com/pi/ android/medscapeapp/html/A199627-business.html [11.1.2013] 4. Gando S, SawamuraA, Hayakawa M. Trauma, shock, and disseminated intravascular coagulation: lesson from the classical literature. Ann Surg 2011, 254:10-19.
62
Příspěvky Fakulty veterinární hygieny a ekologie
63
64
Aplikace mikrobiologických a molekulárně genetických metod pro detekci, izolaci a typizaci Helicobacter pullorum Renata Knoblochová1, Irena Svobodová1, Michaela Nesvadbová1, Eliška Hokeová1 a Gabriela Bořilová1 Ústav hygieny a technologie masa1, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Rod Helicobacter lze rozdělit dle výskytu na druhy žaludeční a enterohepatické (EHD). Některé EHD druhy vykazují významný zoonotický potenciál. Z enterohepatických druhů byl u drůbeže konkrétně prokázán výskyt Helicobacter pullorum (Stanley et al., 1994) a Helicobacter canadensis (Fox et al., 2000). Helicobacter pullorum je nový potencionální patogen, který je asociován s humánní
gastritidou,
chronickou
cholecystitidou,
cholelithiázou,
jaterními
chorobami,
nádorovými chorobami jater a žlučového měchýře a onemocněními imunitního systému. Společně s Helicobacter canadensis byl opakovaně identifikován jako nejčastější druh vyskytující se u pacientů s Crohnovou chorobou, u které není doposud objasněna jejich role v patogenezi onemocnění (Ceelen et al., 2006, Laharie et al., 2009, Hansen et al., 2011, Zanoni et al., 2011). Jelikož tyto dva významné druhy kolonizují gastrointestinální trakt drůbeže, odkud se nadále dostávají do vnějšího prostředí, je drůbež považována za hlavního rezervoárového hostitele představujícího zdroj infekce pro člověka. Materiál a metodika Výskyt Helicobacter spp. v chovech brojlerových kuřat byl sledován od začátku roku 2013 a bylo vyšetřeno 23 konvenčních farem z České republiky. Z trávicího traktu brojlerových kuřat (n=345) byl odebrán obsah slepých střev. Resuscitace subletálně poškozených buněk Helicobacter spp. byla provedena ve směsi glukózy s koňským sérem a BHI (Oxoid, UK). V dalším kroku byla použita technika membránové filtrace filtračním systémem Millipore®. Vzorky byly kultivovány na Brucella agaru s přídavkem 5 % beraní krve v mikroaerofilní atmosféře (5 % O2, 10 % CO2 a 85 % N2) při teplotě 37 oC po dobu 3 dnů. Narostlé kultury byly vizuálně kontrolovány vždy po 24 hodinách a byly izolovány suspektní kolonie. Po kultivaci byla izolována DNA (Qiagen Tissue kit, DE) a metodou PCR-RFLP (polymerázová řetězová reakce-polymorfismus délky restrikčních fragmentů) dle Foxe et al. (2000) s využitím restrikčního enzymu ApaLI byla provedena druhová identifikace. Pro přímou detekci a izolaci Helicobacter spp. z obsahu slepých
střev byla izolována směsná DNA pomocí QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, DE) a následně byla provedena PCR identifikace dle Foxe et al. (2000). Celkem 5 izolátů Helicobacter pullorum bylo podrobeno sekvenční analýze na přístroji 3500 Series Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA), kdy byla analyzována specifická oblast 16S rRNA (fragment 1200bp) s využitím primerů dle Foxe et al. (2000). Následně byly pomocí programu Oligo v4.0 (National Biosciences Inc.) navrženy dle dostupných sekvencí genu Hsp60 nové primery pro druhovou identifikaci (Hel_hsp60_1A a Hel_hsp60_1B). Získané PCR produkty o velikosti 722 bp byly dále analyzovány pomocí metody polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP).
Pro
identifikaci
12
druhů
Helicobacter
byla
navržena
esej
využívající
11 restrikčních enzymů (Acc16I, BsgI, Bsp1407I, NheI, EcoRI, HindIII, BstDEI, MboII, BstF5I, BclI, Eco57I). Pro optimalizaci kultivačních a molekulárně biologických metod byly použity sbírkové kmeny Helicobacter canadensis CCUG 47163, Helicobacter pullorum CCUG 33837, Helicobacter bilis CCUG 38995, Helicobacter canis CCUG 32756, Helicobacter cinaedi CCUG 18818, Campylobacter jejuni CCM 6214 (Culture Collection University of Göteborg, SVE; Česká sbírka mikroorganismů, ČR). Výsledky V období 2013 bylo kultivačně vyšetřeno 345 vzorků obsahu slepých střev kuřat pocházejících z 23 konvenčních farem pro výkrm brojlerů. Po optimalizaci kultivačního média, složení atmosféry a celkové revizi kultivačního postupu bylo získáno celkem 43 suspektních izolátů (12,5 %) Helicobacter pullorum.
V rámci optimalizace kultivační a izolační techniky se jako nejvíce
problematická jeví vysoká citlivost Helicobacter spp. a obtížné odlišení blízce příbuzných bakteriálních druhů (zejména termofilní Campylobacter spp.) v průběhu izolace. Z těchto důvodů byly všechny vzorky paralelně vyšetřovány přímou detekční PCR. Pozitivní záchyt byl potvrzen u 223 vzorků (64,6 %). Metodou PCR-RFLP bylo všech 223 pozitivních vzorků určeno jako Helicobacter pullorum. Následná sekvenční analýza vybraných kmenů potvrdila výsledky z PCRRFLP. Pro identifikaci dalších druhů Helicobacter spp. byla navržena a optimalizována PCR-RFLP esej umožňující identifikovat 12 druhů: H. salomonis, H. hepaticus, H. winghamensis, H. canis, H. fennelliae, H. billis, H. trogontum, H. felis, H. canadensis, H. bizzozeronii, H. cinaedi, H. pullorum. Výskyt sledovaného patogena byl potvrzen celkem v 16 chovech, kdy prevalence kolísala
od 0 – 100 %. V 10 chovech byli všechny vyšetřované kusy pozitivní. Zjištěné výsledky naznačují, že prevalence tohoto patogena je vysoká a je vhodné se dále zabývat optimalizací přímých detekčních a kvantifikačních metod. Závěr Cílem této studie bylo vyhodnocení primárních dat o prevalenci Helicobacter spp. u brojlerových kuřat v České republice a optimalizace kultivačních a molekulárně genetických technik pro detekci a identifikaci EHD Helicobacter spp. Výsledky potvrzují výskyt druhu Helicobacter pullorum v českých konvenčních chovech pro výkrm brojlerů. Míra prevalence (64,6 %) tohoto patogena naznačuje, že jeho výskyt v trávicím traktu drůbeže je velmi častý. Pokud by při jatečném zpracování došlo ke kontaminaci jatečně upravených těl, mohlo by být kontaminované syrové drůbeží maso zdrojem infekce pro člověka. Druhy Helicobacter spp., které kolonizují trávicí trakt drůbeže, by se takto mohly podílet na vzniku zánětlivých střevních onemocnění včetně Crohnovy choroby. Tato domněnka však vyžaduje podrobnější výzkum zahrnující především prozkoumání patogenity těchto druhů. Tato studie je finacována projektem IGA 7/2013/FVHE „Aplikace mikrobiologických a molekulárně genetických metod pro detekci, izolaci a typizaci Helicobacter pullorum“. Seznam literatury: CEELEN, L. M., DECOSTERE, A., VAN DEN BULCK, K., ON, S. L., BAELE, M., DUCATELLE, R., HAESEBROUCK, F. 2006. Helicobacter pullorum in chickens, Belgium. Emerg Infect Dis, vol. 12, p. 263-267. FOX, J. G., CHIEN, C. C., DEWHIRST, F. E., PASTER, B. J., SHEN, Z., MELITO, P. L., WOODWARD, D. L., RODGERS, F. G. 2000. Helicobacter canadensis sp. nov. isolated from humans with diarrhea as an example of an emerging pathogen. J Clin Microbiol, vol. 38, p. 2546-2549. HANSEN, R., THOMSON, J. M., FOX, J. G., EL-OMAR, E. M., HOLD, G. L. 2011. Could Helicobacter organisms cause inflammatory bowel disease? Immunol Med Microbiol, vol. 61, p. 1– 14. LAHARIE, D., ASENCIO, C., ASSELINEAU, J., BULOIS, P., BOURREILLE, A., MOREAU, J., BONJEAN, P., LAMARQUE, D., PARIENTE, A., SOUL´E, J. C. 2009. Association between entero-hepatic Helicobacter species and Crohn’s disease: a prospective cross-sectional study. Aliment Pharm Therap, vol. 30, p. 283–293. STANLEY, J., LINTON, D., BURNEN, A. P., DEWHIRST, F. E., ON, S. L. W., PORTER, A., OWEN, R. J., COSTAS, M. 1994. Helicobacter pullorum sp. nov.-genotype and phenotype of a new species isolated from poultry and from human patients with gastroenteritis. Microbiology, vol. 140, p. 3441-3449. ZANONI, R.G.,PIVA, S., ROSSI, M., PASQUALI, F., LUCCHI, A., DE CESARE, A., MANFREDA, G. 2011. Occurrence of Helicobacter pullorum in turkeys. Vet Microbiol, vol. 149, p. 492–496.
Fenotypizace leukocytů u sivenů amerických (Salvelinus fontinalis) s využitím průtokové cytometrie Zdeňka Cutáková , Zdeňka Soukupová1, Miroslava Palíková1 1
Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1 Úvod Imunitní systém ryb se může zdát z pohledu adaptivní imunity teplokrevných živočichů méně pokročilý, je však dostatečně funkční a plastický, aby umožnil rybám adaptivní radiaci ve vodním prostředí s přítomností velkého množství patogenů. Imunitní odpověď ryb ovlivňuje řada faktorů včetně sezónních změn a stresu, které rovněž ovlivňují neuroendokrinní aktivitu (1). Průtoková cytometrie umožňuje rychlé a reprodukovatelné metody pro analýzu subpopulací rybích leukocytů a buněčné imunitní funkce (2). Principem imunofenotypizační diagnostiky je kvantitativní i kvalitativní analýza zastoupení diagnosticky významných markerů (3). Fenotypizací leukocytárních subpopulací u pstruha duhového se zabývají ve Friedrich-Loeffler-Institutu v Německu za využití jedinečné sady monoklonálních protilátek (4). Hlavním cílem našeho projektu bylo optimalizovat metodu fenotypizace leukocytů u sivenů právě pomocí těchto protilátek. Následně byla metoda využita k vyhodnocení zastoupení sledovaných leukocytárních subpopulací u čisté formy sivena amerického (Salvelinus fontinalis) a u kříženců sivena amerického se sivenem alpským (Salvelinus fontinalis x Salvelinus alpinus).
Materiál a metodika Modelovým druhem byl siven americký (Salvelinus fontinalis), kříženci sivena amerického se sivenem alpským (Salvelinus fontinalis x Salvelinus alpinus) a pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss). Všechny ryby pocházely z rybochovu Pravíkov v okr. Pelhřimov. Celkem bylo vyšetřeno 48 ryb, z čehož bylo 19 sivenů amerických, 18 kříženců sivena amerického se sivenem alpským a 11 pstruhů duhových. Do pokusu byli zařazeni jedinci ve věku 6-12 měsíců o hmotnosti 120-250g. V rámci zohlednění sezónnosti sledovaných ukazatelů pokusných zvířat jsme provedly 3 fáze odběru (T1-duben, T2-září a T3-listopad). U všech jedinců jsme zaznamenaly pohlaví a délkohmotnostní parametry. Pomocí heparizované stříkačky jsme z ocasních cév odebraly 1 ml krve pro cytometrické vyšetření. Pokusná zvířata byla zákonným způsobem usmrcena a poté byla uskladněna v chladničkové teplotě a převezena na VÚVeL v Brně, kde byla rybám odebrána slezina a hlavová ledvina pro další analýzu. Tyto orgány byly homogenizovány a buněčná suspenze byla navrstvena, podobně jako periferní krev, na dělící médium. Leukocyty z periferní krve, z ledvin a ze sleziny byly tedy získány
68
gradientovou centrifugací s použitím dělícího média Lympholyte. Monoklonální protilátky byly získány z Friedrich-Loefflerova Institutu (4).
Výsledky Seznam testovaných monoklonálních protilátek (MAb) uvádí tabulka č. 1. Protilátky proti granulocytům (21) a proti monocytům (30) značily stejnou populaci. Protilátky proti B lymfocytům (N2B9D7, N3-1) se váží na krátký řetězec imunoglobulinu, značí pouze subpopulaci B lymfocytů. Protilátky proti T lymfocytům (Darm 13, 33, 89, D 11-2, D 30-1) vykazovaly nespecifickou vazbu, neboť se vázaly i na jiné typy buněk. Seznam testovaných protilátek Trombocyty 28-1 Trombocyty 15-2 Trombocyty Darm 8 B lymfocyty 4C10 B lymfocyty 10C11
+/+ + + +
B lymfocyty N2B9D7 B lymfocyty N3-1 Granulocyty 21 Monocyty 30 T lymfocyty Darm 13, 33, 89, D 11-2, D 30-1
+ + + + -
Tabulka č. 1: Seznam testovaných protilátek. +/- znamená funkčnost testované protilátky V čase T1 jsme provedly testování krve, sleziny a ledviny u sivena a křížence. Použily jsme MAb proti B lymfocytům (4C10). Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2. Separaci buněk z periferní krve je třeba provést bezprostředně po odběru, neboť časová prodleva vzniklá transportem znemožňovala řádné oddělení leukocytů. Krev
Slezina
Ledvina
siven
MAb B lymfocyty 4C10
36,01 ± 30,79
52,11 ± 36,27
39,28 ± 45,51
kříženec
23,37 ± 10,23
61,47 ± 39,42
13,97 ± 21,68
Tabulka č. 2: Zastoupení B lymfocytů u sivenů a kříženců v čase T1 (průměr ± SD) V čase T2 jsme provedly fenotypizaci leukocytů z periferní krve a ledviny u sivena, křížence a pstruha. Použily jsme MAb proti B lymfocytům (4C10) a granulocytům (21) Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3. MAb B lymfocyty 4C10 siven kříženec pstruh
Krev 50,36 ± 8,69 61,66 ± 7,54 34,46 ± 6
Ledvina 15,54 ± 6,24 25,24 ± 6,78 19,9 ± 6,41
MAb granulocyty 21 siven kříženec pstruh
Krev 9,22 ± 5,11 5,74 ± 1,39 9,24 ± 1,52
Ledvina 47,5 ± 15,67 30,8 ± 9,76 59,62 ± 7,61
Tabulka č. 3: Zastoupení B lymfocytů a granulocytů u sivenů, kříženců a pstruhů v čase T2 (průměr ± SD)
69
V čase T3 jsme provedly fenotypizaci leukocytů periferní krve, sleziny a ledviny u sivena, křížence a pstruha. Použily jsme MAb proti B lymfocytům (4C10), trombocytům (28-1), lehkému řetězci imunoglobulinu (N2 – FITC) a myeloidním buňkám (Myelo 21). Výsledky jsou uvedeny v tab. č. 4. MAb B lymfocyty 4C10 siven kříženec pstruh MAb trombocyty 28-1 siven kříženec pstruh MAb N2 - FITC siven kříženec pstruh MAb Myelo 21 siven kříženec pstruh
Krev 28,4 ± 8,54 39,22 ± 12,19 26,76 ± 10,01 Krev 15,98 ± 8,84 4,55 ± 0,97 2,22 ± 1,2 Krev 8,2 ± 2,48 11,26 ± 1,8 23,32 ± 9,46 Krev 31,4 ± 25,78 13,6 ± 7,88 15,1 ± 6,92
Slezina 25,78 ± 11,08 7,98 ± 4,28 48,06 ± 12,72 Slezina 10,78 ± 3,66 13,12 ± 9,86 3,9 ± 2,39 Slezina 5,4 ± 1,94 1,26 ± 0,63 43,7 ± 6,04 Slezina 28,56 ± 22,75 32,8 ± 14,3 32,88 ± 9,53
Ledvina 8,28 ± 5,28 2,78 ± 1,87 14,7 ± 5,47 Ledvina 1,83 ± 0,63 1,13 ± 0,6 1,3 ± 0,69 Ledvina 2,36 ± 1,12 0,63 ± 0,35 10,42 ± 2,86 Ledvina 69,56 ± 10,11 52,43 ± 10,68 61,9 ± 2,44
Tabulka č. 4: Zastoupení B lymfocytů, trombocytů, lehkého řetězce imunoglobulinu a myeloidních buněk u sivenů, kříženců a pstruhů v čase T3 (průměr ± SD) Závěr Naším cílem bylo zoptimalizovat metodu fenotypizace leukocytů u sivenů a její následné využití při hodnocení imunitní odpovědi v závislosti na původu ryb. Na základě řady měření jsme vytipovaly vhodné protilátky a následně jich využily pro fenotypizaci leukocytárních subpopulací v periferní krvi, slezině a v hlavové ledvině u sivena amerického, hybridů a pstruha duhového. Na základě získaných výsledků jsou patrné rozdíly v zastoupení jednotlivých sledovaných subpopulací jak v závislosti na druhu ryb, tak v závislosti na ročním období. Seznam literatury 1. TOMAN M et al. (2009) Veterinární imunologie. 2nd ed. Praha: Grada. p: 392. ISBN: 97880-247-2464-5. 2. CHILMONCZYK S, MONGE D (1999) Flow cytometry as a tool for assessment of the fish cellular immune response to pathogens. Fish & Shellfish Immunology 9: 319-333. 3. ADAM Z, VORLÍČEK J, VANÍČEK J (2004) Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob. 2nd ed. Praha: Grada Publishing. p: 648. ISBN: 80-247-0896-5. 4. KORYTÁŘ T, DANG THI H, TAKIZAWA F, KöLLNER B (2013) A multicolour flow cytometry identifying defined leukocyte subsets of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish & Shellfish Immunology 1-3.
70
Stanovení tetracyklinových, sulfonamidových a fluorochinolonových antibiotik v biologických matricích s využitím online extrakce na pevné fázi přímo spojené s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií. Lenka Divišová1, Petr Maršálek1, Zdeňka Svobodová1, Lenka Zelníčková1 Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinárního hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Multikomponentní stanovení stopových množství léčiv různého druhu v biologických matricích jako jsou tkáně nebo krev patří v dnešní době k důležitým analytickým tématům, jak v oblasti
hygieny
potravin,
tak
v lékařských
oborech.
Mezi
dnes
nejprogresivnější
a nejpreferovanější techniky patří spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie (LC/MS) s tandemovou hmotnostní spektrometrií poskytující vysokou selektivitu a citlivost. Přímé začlenění extrakce na pevné fázi do chromatografické instrumentace s využitím trapovacích (záchytných) kolon patří mezi moderní trendy vývoje metod v oblasti kapalinové chromatografie. Toto řešení umožňuje plně automatizovat SPE proceduru, zkrátit dobu přípravy vzorku a výrazně snížit spotřebu rozpouštědel a množství potřebného vzorku. Zároveň při malém množství vzorku umožňuje provést dostatečnou prekoncentraci k dosažení požadovaných detekčních limitů. Toto řešení je v případě analýz reziduí léčiv v současné době uplatňováno zejména u environmentálních matric, jako jsou vody. V případě biologických matric, jako jsou tkáně, krev nebo její deriváty není vzhledem k jejich větší komplexnosti tak široce uplatňováno a je dnes využíváno zejména ke stanovení různých biomolekul v krvi, jako jsou např. hormony. Nicméně, zejména u krve a jejich derivátů, kde jsou často požadavky na nízké detekční limity a zároveň je často k dispozici malé množství vzorku v řádech stovek mikrolitrů může toto řešení nabídnout rychlou, automatizovanou a citlivou metodu. Cílem této práce bylo vyvinout novou metodu využívající instrumentace kapalinové chromatografie k provedení online SPE spojené s hmotnostní spektrometrií. Materiál a metodika
Analýza byla provedena na kapalinovém chromatografu Thermo Scientific Accela 1250 a Accela 600 spojených s hmotnostním spektrometrem Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX (Thermo, San Jose, USA) vybaveném ionizací elektrosprejem. První dimenze chromatografické eluce (online SPE) byla provedena na koloně Optimize Technologies C18 (2,1 mm×5 mm; 1,9 μm).
71
Druhá dimenze, chromatografická eluce byla provedena na koloně Thermo Scientific Hypersil C18 (2,1 mm×100 mm; 1,9 μm) při konstantním průtoku 300 μL.min-1. Výsledky Pro vývoj metody byly využity tkáně zakoupené v komerční síti. Nově vyvinutá metoda využívá dvou čtyřkanálových chromatografických pump k provedení online SPE. Před samotným provedením online SPE jsou vzorky extrahovány pomocí 5% kyseliny trichloroctové, odstředěny a filtrovány přes stříkačkové filtry (0,22 µm, PTFE). První pumpa slouží k injektování vzorku do proudu mobilní fáze a zachycení analytů na první (záchytné) koloně, na které proběhne SPE. Druhá pumpa slouží k eluci analytů ze záchytné kolony a jejich separaci na druhé (analytické koloně). Eluce ze záchytné kolony probíhá zpětným tokem. Celý proces je znázorněn na schématu v obrázcích 1 a 2. Na záchytné koloně dojde tedy k odseparování určitého spektra látek, které jsou odvedeny do odpadu a dále nejdou na analytickou kolonu, zároveň je na záchytné koloně provedeno zkoncentrování analytů. Tímto krokem je dosaženo snížení detekčních limitů díky snížení hodnoty šumu, snížení iontové suprese na iontovém zdroji a díky zkoncentrování vzorku. Na obrázcích 1 a 2 je znázorněno schéma zapojení chromatografických kolon pro provedení online SPE s využitím dvourozměrné kapalinové chromatografie. Mobilní fáze na pumpě 1 se skládala z vody (A) a acetonitrilu (B). V první fázi (0–4,5 min 0 % B) došlo k nanesení analytů na kolonu 1; v další fázi došlo ke změně obsahu složení mobilní fáze tak, aby došlo k dostatečnému promytí kolony (4,5–5,2 min lineární gradient z 0 na 70 % B, 5,2–6,5 min drženo na 70 % B); nakonec došlo opět k ustálení složení mobilní fáze ve složení 100 % A, tak aby mohla být zahájena další analýza (6,5–7 min ze 70 na 0 % B a 7–7,6 min drženo na 0 % B). Mobilní fáze na pumpě 2 se skládala z vody obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí (A) a acetonitrilu (B). Byl použit program s následujícími parametry: 0–3,2 min lineární gradient z 50 na 95 % B; 3,2–5,4 min drženo na 95 % B; 5,4–5,8 min z 95 na 50 % B a 5,8–7,6 min drženo na 50 % B. Vyvinutá metoda umožňuje analyty lineárně zakoncentrovat až 100násobně. Detekční limity se pohybují v rozmezí 0,5–50 ng.kg-1.
72
Obrázek 1. Krok 1 - záchyt analytů na záchytné koloně.
Obrázek 2. Krok 2 - eluce analytů ze záchytné kolony. Práce byla financována za pomocí IGA 18/2013/FVHE Seznam literatury: Garcia MDG, Gallegos AB, Valverde RS, Galera MM. 2012. Determination of (fluoro)quinolones in environmental water using online preconcentration with column switching linked to large sample volumes and fluorescence detection. Journal of Separation Science 35(7):823-831.
73
VYUŽITÍ β-ESTRADIOLOVÉHO LIPOSOMU S ENKAPSULOVANOU ANTISENSE SEKVENCÍ PRO GENOVOU TERAPII
Zbyněk Heger , Barbora Němcová , Hana Mikulášková1, Kateřina Járová1, Ondřej Zítka1,2, 1,2
1
Miroslava Beklová1 Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita Brno2
Úvod Rakovina prsu je celosvětově nejčastější nádorové onemocnění a druhé nejčastější úmrtí způsobené rakovinou u žen [1]. Nejčastěji diagnostikované molekulární subtypy rakoviny prsu jsou luminální nádory typu A a B [2, 3], dohromady definované jako estrogen receptor pozitivní. βestradiol (E2) hraje v rozvoji nádorů prsu významnou roli. Mechanismy účinku hormonu lze rozdělit na genomické a non-genomické. Non-genomických mechanismů je předpokládáno několik, nicméně stále nejsou uspokojivě objasněny [4]. Jednou z hypotéz by mohlo být i přímé ovlivnění dsDNA hormonem, vstupujícím do jádra buněk. Cílem práce bylo provést multiinstrumentální interakční studii mezi β-estradiolem a různě dlouhými fragmenty dsDNA. Dále jsme se zaměřili na využití těchto vědomostí pro sestavení liposomového konstruktu, nesoucího antisense sekvence pro estrogenní receptory a byla sledována genová exprese rakovinné linie MCF-7.
Materiál a metodika Chemikálie Chemikálie použité pro studii byly pořízeny od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), stejně jako sekvence použité pro interakční studii, jež byly následující: ERE1: 5´-CTGGTCACTCTGACCGG-3´, ERE2: 5´-CCAGGTCAGAGTGACCTGAG-3´, ERE3: 5´-TCAGGTCAGAGTGACCTGAGCTAA-3´, ERE4: 5´-TCAGGTCAGAGTGACCTGAGCTAAAATAACACATTCAG-3´ dsDNA byla získána jednoduchou hybridizací.
Spektrofotometrické metody Pro interakční studii byly použity spektrofotometrické metody, a to jak pro sledování interakcí mezi hormonem (0; 0.625; 1.25; 2.5; 5; 10; 20 a 40 µM) s DNA fragmenty (5 µM) (Specord 210, Analytik Jena, Německo), tak pro sledování denaturačního fenoménu DNA po interakci, který byl determinován v rozmezí 25 - 99 oC pomocí přístroje Specord S600 (Analytik Jena, Německo).
74
Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF/TOF Bruker Ultraflextreme (Bruker Daltonik GmbH, Německo) byl použit pro sledování tvorby komplexu mezi E2 a DNA. 5 µM DNA bylo zjišťováno po hodinové interakci s 5 µM E2. Jako matrice byla použita kyselina 3-hydroxypikolinová, připravená v 30% acetonitrilu s 0,1% přídavkem trifluoroctové kyseliny. Antisense sekvence v liposomech Znalostí z interakční studie jsme využili pro sestavení liposomů, obsahujících 10 nM E2, nesoucích antisense sekvence. Antisense α: 5´-AACGCCGCAGCCTCAGAC-3´ a Antisense β: 5´AGATGGTGAGTTTTTTAT-3´. Sestaveny byly 4 typy liposomů – L1 obsahující 10 nM E2, L2: 10 nM E2 a 1 µM antisense α, L3: 10 nM E2 a 1 µM antisense β a L4: 10 nM E2, nesoucí 0.5 µM antisense α a β. Buněčná linie MCF-7 buněčná linie byla inkubována s titrační řadou liposomů (0, 90 a 900 µl na 6 ml média) po dobu 24 hodin a byla sledována genová exprese genů MT-1, TFF-1, NF-Kb-1 a kRAs metodou qRTPCR.
qRT-PCR mRNA byla izolována pomocí RNeasy Mini kit (Qiagen, Germany). RNA byla reverzně transkribována pomocí kitu Reverse transcriptase (Sileks, Russia). Množství mRNA bylo analyzováno pomocí StepOne Plus (Applied Biosystems). PCR produkty byly analyzovány na PAGE pro potvrzení velikosti.
Stanovení oxidativního stresu Jako indikátory oxidativního stresu po aplikaci liposomů byly zvoleny: metalothionein (analyzován přímo pomocí diferenční pulzní voltametrie), glutathion (analyzován přímo pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí) a malondialdehyd (analyzován nepřímo spektrofotometricky za pomocí kitu).
Výsledky Jak lze vidět na Obr. 1A-D delší fragment DNA ochotněji interaguje s E2 a vykazuje větší posuny v molekulové hmotnosti. Je pravděpodobné, že E2 tvoří s DNA komplex s vyšší hmotností, jak jsme detekovali pomocí MALDI-TOF/TOF. Lze tedy usoudit, že DNA obsažená v nativní lidské
75
buňce může být ovlivněna vysokými koncentracemi estradiolu, či jeho analogů obsažených v kontraceptivech, a tím může být spuštěn jeden z non-genomických mechanismů aktivace nádorového bujení. Z výsledků vyplývá, že velmi nízké hladiny E2 nemají přílišný vliv na krátké řetězce DNA. Toho jsme využili pro sestavení liposomu, nesoucího antisense sekvence. Nízká hladina E2 v liposomech má schopnost cíleně řídit liposom k estrogením receptorům, a tím dostávat antisense sekvence do jádra postižených buněk (Obr. 1E-H). Bylo zjištěno, že liposom L4, s antisense α a β způsoboval regulaci exprese všech genů vyjma TFF-1 (Obr. 1H). Zároveň byl po aplikaci liposomu L4 sledován úbytek markerů oxidativního stresu. Z toho důvodu je zřejmé, že námi navržený konstrukt má slibný potenciál pro aplikaci v genové terapii rakoviny prsu.
Obrázek 1. MALDI-TOF/TOF spektra samotného DNA fragmentu (5 µM) – vždy horní spektrum v porovnání s komplexem E2 (5 µM) + DNA (5 µM) – vždy dole. Spektra (A) ERE1 s 17 páry bazí, (B) ERE2 s 20 páry, (C) ERE3 s 24 páry a (D) ERE4 s 38 páry. Vyjádření genové exprese genů MT-1, NF-kB-1, kRAs a TFF-1 po aplikaci (E) liposomu bez antisense sekvence, (F) liposomu s antisense α, (G) liposomu s antisense β a (H) liposomu s antisense α i β. Seznam literatury:
1. 2.
3.
4.
Siegel, R., D. Naishadham, and A. Jemal, Cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2013. 63(1): p. 11-30. Carey, L.A., et al., Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study. Jama-Journal of the American Medical Association, 2006. 295(21): p. 24922502. Yang, X.R., et al., Associations of Breast Cancer Risk Factors With Tumor Subtypes: A Pooled Analysis From the Breast Cancer Association Consortium Studies. J. Natl. Cancer Inst., 2011. 103(3): p. 250-263. Abbondanza, C., et al., Identification of a functional estrogen-responsive enhancer element in the promoter 2 of PRDM2 gene in breast cancer cell lines. Journal of Cellular Physiology, 2012. 227(3): p. 964-975.
76
Využití kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA) při terapii intoxikace olovem u ptačích embryí Hana Hrubá (Škochová), Karel Ondráček, Jiří Pikula, Hana Banďouchová, Jitka Osičková, Miroslava Mikšíková Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta Veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Environmentální polutanty a pesticidy mohou mít nepříznivý vliv na reprodukci ptáků v důsledku narušení fyziologických procesů na mnoha úrovních (Damkova et al. 2009). Dochází k přímým účinkům jak na rodičovské ptáky, tak na vyvíjející se embryo a fétus. Embryotoxicita může například vést k embryonální mortalitě, snížené líhnivosti, teratogenitě či líhnutí neživotaschopných kuřat. U dospělých ptáků se negativní účinky polutantů projevují akutní mortalitou, subletálním stresem, sníženou plodností a schopností tvorby vejce, produkcí vejce se ztenčenou skořápkou a behaviorálními poruchami při inkubaci (Fry, 1995). Samice jsou schopné eliminovat těžké kovy do obsahu produkovaných vajec, což může ohrozit ptačí zárodek a plod (Burger, 1994). Mezi hlavní zástupce těžkých kovů, které nacházíme ve vaječném obsahu, patří olovo, kadmium, rtuť, selen, mangan a chrom (Burger, 1994). Olovo je důležitý environmentální kontaminant a je často příčinou otrav u ptáků. Rizikovou skupinou jsou především dravci a mrchožraví ptáci, kteří jsou ohroženi při konzumaci potravy kontaminované olověnými střelami (Pain et al. 2007). Navzdory své relativní nerozpustnosti je olovo částečně absorbováno v trávícím aparátu díky žaludečním kyselinám, což má za následek vznik chronických otrav s nespecifickými příznaky (Thompson, 2007). V terapii intoxikace olovem je často využívána kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA), která patří mezi významná chelatační činidla a s kovy vytváří stabilní komplexy rozpustné ve vodě, které se následně vyloučí močí. Hypotézou tohoto projektu je, že je možné využít chelatační terapii ke snížení toxické zátěže ptačího vejce olovem a tak zajistit úspěšný vývoj kuřete při inkubaci. Materiál a metodika Do pokusu byla zařazena oplozená vejce kura domácího, která již byla ve fázi vývoje. Pro daný experiment byla rozdělena do sedmi experimentálních skupin včetně kontrol. První experimentální skupině byl aplikován roztok iontů olova ve čtyřech koncentracích do vajec. Druhé skupině byl aplikován roztok iontů olova vázaného na liposom v pěti různých koncentracích, u třetí skupiny byla provedena aplikace kyseliny ethylendiaminotetraoctové ve čtyřech koncentracích. Čtvrtá kontrolní skupina zůstala vždy bez zkoumané látky, páté kontrolní skupině byl aplikován fyziologický roztok použitý pro ředění, šestá kontrolní skupina byla navrtána a proběhla u ní
77
simulace aplikace toxikantu do vajíčka. U sedmé skupiny byla provedena aplikace obou zkoumaných látek olovo i EDTA. Před aplikací látek byl povrch vajec v místě aplikace ošetřen 70% etanolem, aby bylo zabráněno infekci při aplikaci. Následně byl do vajíčka v oblasti vzduchové komůrky vyvrtán malý otvor, přes který byly sterilně aplikovány jednotlivé roztoky do žloutku dle standardní metodiky, která již byla na našem pracovišti odzkoušena. Po uzavření otvoru ve skořápce parafinem byla vejce umístěna do inkubátoru s automatickým režimem udržování teploty, vlhkosti a obracení vajec. Vejce byla prosvěcována za účelem kontroly vývoje a každý den byla monitorována srdeční frekvence vyvíjejícího se kuřete (monitor Buddy Egg, Avitronics). Měřeny byly koncentrace aplikovaných látek (olovo, CaNa2EDTA), antioxidanty a parametry oxidativního stresu. Ve vzorcích krve byl měřen hematokrit a hemoglobin a vybrané biomarkery intoxikace olovem (těžkými kovy). Souběžně byly odebírány také vzorky na histopatologii. Výsledky Příkladem výsledků získaných při řešení projektu je embryonální srdeční frekvence u kura domácího po expozici různým dávkám olova ve srovnání s kontrolou (expoziční skupiny 50/100/250/500 μg Pb na vejce průměrné hmotnosti 60 g, ** = p<0,01, n=84).
78
Embryonální srdeční frekvence u kura domácího po expozici různým dávkám EDTA ve srovnání s kontrolou znázorňuje následující graf (expoziční skupiny 50/100/250/500 μg CaNa2EDTA na vejce průměrné hmotnosti 60 g, ** = p<0,01, n=79).
Závěr a souhrn Experimentálně jsme testovali vliv intravitelinní aplikace CaNa2EDTA na vývoj ptačího embrya. Chelatační terapie ptačího vejce se jeví jako přijatelná metoda ke snížení toxické zátěže ptačího vejce olovem a zajištění úspěšného vývoje kuřete při inkubaci. Předpokládáme, že výsledky studie budou publikovány v časopise BMC Veterinary Research. Seznam literatury 1. Burger J (1994). Heavy metals in avian eggshells: Another excretion metohod. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 41: 207-220. 2. Damkova V, Sedlackova J, Bandouchova H, Peckova L, Vitula F, Hilscherova K, Paskova V, Kohoutek J, Pohanka M, Pikula J (2009). Effects of cyanobacterial biomass on avian reproduction: a Japanese quail model. Neuroendocrinology Letters, 30: 205-210. 3. Fry DM (1995). Reproductive effects in birds exposed to pesticides and industrial chemicals. Environmental Health Perspectives, 103: 165–171. 4. Pain DJ, Carter I., Sainsbury AW, SHore RF, Eden P, Taggart MA, Konstantinos S, Walker LA, Meharg AA, Raab A (2007). Lead contamination and associated disease in captive and reintroduced red kites Milvus milvus in England. Sci Total Environ. 376: 116–127. 5. Thompson LJ (2007). Lead. In Veterinary toxicology. Basic and clinical principles. First edition. Edited by Gupta RC. New York: Academic Press, 438–441.
79
Využití biogenních aminů pro určení hygienické kvality zvěřiny zaječí zvěře Zdeňka Hutařová1, Vladimír Večerek1, Petr Maršálek1 Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Zvěřina se stává stále více vyhledávanou surovinou (Atanassova et al., 2008). Způsob získávání zvěřiny a následné manipulace v průběhu zpracování se podstatně liší od způsobů zavedených pro zisk masa hospodářských zvířat. Vzhledem ke zvyšující se poptávce po této surovině, se problematika zajištění hygienické nezávadnosti zvěřiny a její kontroly stává velmi důležitou. Za fáze, které jsou z pohledu zajištění hygienické kvality zvěřiny klíčové, lze mimo jiné označit zajištění vhodných podmínek pro skladování těl ulovené zvěře (zejména teplota a doba skladování). Dle Nařízení EP a Rady č. 853/2004 musí být po usmrcení v přiměřené době zahájeno chlazení ulovené zvěře tak, aby bylo ve všech částech masa dosaženo teploty nepřekračující 7 °C v případě velké volně žijící a 4 °C u drobné zvěře (zajícovci a pernatá zvěř). Dalšími právními předpisy upravujícími doby a teploty skladování ulovené zvěře je zákon č. 166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon), ve znění pozdějších předpisů a prováděcí vyhláška k tomuto zákonu č. 289/2007 Sb. Ve zmíněných právních předpisech jsou stanoveny následující teploty a doby skladování těl zvěře pro případy jejich prodeje v malých množstvích přímo konečnému spotřebiteli, do místní maloobchodní prodejny či maloobchodního zařízení: při teplotě 0 - 7 °C po dobu nejdéle 7 dnů od data ulovení, při teplotě 0 - 1 °C po dobu nejdéle 15 dnů od data ulovení. Vzhledem k sezónnímu charakteru získávání zvěřiny, může být z důvodu přeplněnosti skladovacích zařízení v určitých částech roku zajištění odpovídajících skladovacích podmínek velmi nesnadné. Hledání způsobů, které by mohly být využity k hodnocení čerstvosti a hygienické kvality zvěřiny a tím i k zajištění kvality a bezpečnosti potravin je tedy velmi důležité. Jedním z možných ukazatelů hygienické kvality syrového masa může být koncentrace biogenních aminů, jejichž zvýšené koncentrace v potravinách jsou dávány do souvislosti mikrobiální kontaminací a kažením potravin (Bóka et al., 2012)
Materiál a metodika Pro účely studie byli použiti zajíci střelení brokovou střelou na honu na drobnou zvěř v podzimních měsících v roce 2012. Ke sledování bylo použito 12 zajíců. Po ulovení byli zajíci v kůži zavěšeni bez eviscerace do skladovacích prostor s nastavenou teplotou 0°C (6 zajíců) a 7°C (6 zajíců) a skladováni po dobu 21 dní. Teplota 0°C vychází z teploty určené pro skladování
80
potravin živočišného původu nařízením 853/2004 EC a teplota 7°C vychází z národní legislativy, která v souladu s předpisy EU umožňuje pro tuto zvěřinu odlišný režim skladování. 1. den a následně 7., 14., a 21. den po ulovení byly odebrány vždy od 6 kusů zajíce polního vzorky ze svaloviny hrudní končetiny – plece (6x4) a vzorky svaloviny pánevní končetiny – kýty (6x4). V odebraných vzorcích byly stanoveny biogenní aminy (putrescin, kadaverin, tyramin, histamin, tryptamin a phenylethylamin) prostřednictvím kapalinové chromatografie s tandemovou hmotností spektrometrií. Statistické vyhodnocení bylo provedeno za použití Kruskal-Wallisova testu statistického programu Unistat 5.6. Hladina významnosti P ˂ 0.05 byla považována za statisticky významnou. Výsledky Stanovené hodnoty biogenních aminů jsou uvedeny v tabulkách č. 1 a č. 2. Tabulka č. 1: Koncentrace biogenních aminů (mg/kg) ve svalovině plece zajíce polního v průběhu skladování po dobu 21 dní při teplotách 0 a 7°C (výsledky jsou prezentovány jako PRŮMĚR ± SD). Den skladování 1 7 14 21
0°C
PLEC putrescin
kadaverin
histamin
tyramin
1.38±0.60 1.28±0.59 1.84±0.77 3.18±0.71
0.10±0.00 0.10±0.00 0.10±0.00 1.48±1.23
0.14±0.14 0.13±0.09 0.90±0.08 0.12±0.11
0.09±0.0 0.10±0.0 0.09±0.0 0.09±0.0
1 1.83±0.65 0.10±0.00 7 1.79±0.46 0.10±0.00 7°C 14 2.30±1.21 0.10±0.00 21 9.07±2.66 13.24±9.66 Tabulka č. 2: Koncentrace biogenních aminů
0.15±0.12 0.13±0.08 0.26±0.15 0.35±0.23 (mg/kg) ve
phenylethyl amin 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
tryptamin 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
0.09±0.0 0.00±0.00 0.01±0.00 0.09±0.0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.09±0.0 0.00±0.00 0.01±0.00 0.53±0.6 0.03±0.03 0.01±0.00 svalovině kýty zajíce polního v průběhu
skladování po dobu 21 dní při teplotách 0 a 7°C (výsledky jsou prezentovány jako PRŮMĚR ± SD). Den skladování 1 7 14 21 1 7 14 21
KÝTA
0.09±0.00 0.09±0.00 0.09±0.00 0.09±0.00
phenylethy almin 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
tryptamin 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00
0.09±0.00 0.09±0.00 0.09±0.00 0.09±0.00
0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
0.00±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00
putrescin
kadaverin
histamin
tyramin
0°C
0.81±0.62 0.78±0.46 1.91±0.93 1.94±0.85
0.10±0.00 0.10±0.00 0.10±0.00 0.10±0.00
0.08±0.10 0.07±0.09 0.01±0.00 0.10±0.10
7°C
0.80±0.35 1.05±0.23 1.45±0.61 2.02±1.63
0.1±0.00 0.10±0.00 0.1±0.00 0.1±0.00
0.04±0.05 0.07±0.09 0.19±0.20 0.25±0.19
81
Dle získaných výsledků je patrné, že vyšší koncentrace biogenních aminů obsahovala svalovina plece v porovnání se svalovinou kýty. Porovnáním součtu stanovených koncentrací biogenních aminů jsme zjistili významný rozdíl (P ˂ 0.05) obsahu biogenních aminů pro teplotu 0°C mezi svalovinou kýty a svalovinou plece 21. den a pro teplotu 7°C a mezi svalovinou kýty a svalovinou plece1., 7. a 21. den skladování. Dále byl sledován rozdíl v obsahu biogenních aminů ve svalovině zajíce polního při skladování při 0°C ve srovnání se skladováním při 7°C s cílem zjistit vliv skladovací teploty na množství biogenních aminů. Z výsledků vyplývá, že obsah biogenních aminů je při teplotě 7°C vyšší než při teplotě skladování 0°C. Statisticky významný rozdíl (P ˂ 0.05) obsahu biogenních aminů mezi teplotu 0°C a 7°C byl pro svalovinu plece zjištěn 21. den skladování. Ve svalovině kýty statisticky významný rozdíl obsahu biogenních aminů zjištěn nebyl. Získané výsledky jsou v souladu s již dříve popsanou závislostí koncentrací biogenních aminů na výši skladovací teploty (Shalaby, 1996). Za nejvýznamnější biogenní aminy z pohledu posouzení hygienické kvality zvěřiny zajíců lze označit putrescin a kadaverin, jejichž koncentrace se v průběhu skladování zvýšily nejvíce. Polyaminy spermin a spermidin nebyly zahrnuty do celkového výpočtu koncentrace, jelikož z důvodu přirozeného výskytu v syrovém mase ve vyšších koncentracích nejsou spojovány s procesem kažení (Hernández-Jover et al., 1997). Seznam literatury: Atanassova V, Apelt J, Reich F, Klein G 2008: Microbiological quality of freshly shot game in Germany. Meat Sci 78:414-419 Bóka B, Adányi N, Virág D, Sebela M, Kiss, A (2012): Spoilage detection with biogenic amine biosensor of different enzyme electrodes. Electroanal 24:181-186 Hernández-Jover T, Izquierdo-Pulido M, Veciana-Nogués MT, Mariné-Font A, Vidal-Carou MC 1997: Biogenic Amine and Polyamine Contents in Meat and Meat products. J Agric Food Chem 45: 2098-2102 Shalaby AR 1996: Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Res Int 29:675-690
82
Srovnání profilu mastných kyselin ve svalovině bažantů a orebic Petra Jakešová1, Radovan Jůzl1, David Zapletal1, Eva Straková2, Lucie Rusníková2, Pavel Suchý1 Ústav zootechniky a zoohygieny1, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno; Ústav výživy zvířat2, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod V posledních letech se v potraninách sleduje obsah nasycených a nenasycených mastných kyselin, a to jak jejich vzájemný poměr, tak i konkrétní množství jednotlivých mastných kyselin (Zevenbergen et al., 2009). Maso zvěřiny tvoří součást lidské výživy, přičemž se uvádí, že jde o potravinu s příznivými dietetickými účinky. Pro toto tvrzení však v současné době existuje jen málo vědeckých podkladů. Chemickým složením masa pernaté zvěře se ve své studii zabývali např. Suchý et al. (2009). Nuernberg et al. (2009) uvádí, že maso volně žijících zvířat je dobrým zdrojem bílkovin, mastných kyselin, vitamínů a stopových prvků. Podle Adamski and Kuzniacka (2006) představuje bažantí maso, zejména díky vysokému obsahu některých proteinů a nízkému obsahu tuku s vyšším zastoupením esenciálních mastných kyselin, velmi ceněnou potravinu, která díky své nutriční hodnotě předčí i maso brojlerových kuřat. Cílem naší práce bylo stanovit obsah mastných kyselin ve svalovině bažantů a orebic a srovnání jejich zastoupení mezi prsní a stehenní svalovinou. Materiál a metodika Do pokusného sledování bylo vybráno 10 kusů bažanta obecného (Phasianus colchicus) a 10 kusů orebice chukar (Alectoris Chukar). Vybraná pernatá zvěř byla odchována za identických podmínek prostředí a krmena běžnými krmnými směsmi v Odchovně pernaté zvěře VFU Brno v Jinačovicích u Brna. Ve věku 90. dnů bylo náhodným výběrem vybráno 10 kusů bažanta obecného a orebice chukar pro následnou analýzu mastných kyselin v prsní a stehenní svalovině. Koncentrace mastných kyselin byla stanovena na plynovém chromatografu GC 2010 - fy Shimadzu. Obsahy jednotlivých mastných kyselin jsou vyjádřeny v %.
83
Výsledky Obsah nejvíce zastoupených mastných kyselin v tuku prsní a stehenní svaloviny u vybraných druhů pernaté zvěře je uveden v tabulce 1. Tabulka 1. Obsahy nejvíce zastoupených mastných kyselin v tuku prsní a stehenní svaloviny v %
Bažant Mastná kyselina Prso (%) Stehno (%) 25,46 26,00 C16:0 7,61 6,47 C18:0 7,59 8,87 C16:1 41,25 44,49 C18:1n9t+C18:1n9c 12,32 10,86 C18:2n6c 2,00 0,53 C20:4n6 0,58 0,08 C22:6n3
Orebice Prso (%) Stehno (%) 24,47 24,65 9,88 9,50 4,24 5,25 32,25 35,61 14,25 16,80 7,95 3,46 2,34 0,81
Z uvedené tabulky vyplývá, že mezi sledovanými druhy pernaté zvěře existují rozdíly ve složení tuku, jak u prsní, tak i u stehenní svaloviny. Obsahem mastných kyselin ve svalovině bažantů a jiné pernaté zvěře se zabývali např. Nuernberg et al. (2011). Tito autoři pak zjistili, že obsah mastných kyselin mezi volně žijícími a farmově chovanými bažanty se výrazně lišil. Výsledky srovnání obsahu jednotlivých skupin mastných kyselin v tuku prsní a stehenní svaloviny u vybraných druhů pernaté zvěře jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2. Obsahy jednotlivých skupin mastných kyselin v tuku prsní a stehenní svaloviny v %
Bažant Orebice Skupina mastných kyselin Prso (%) Stehno (%) Prso (%) Stehno (%) 34,18 33,69 35,51 35,44 SFA 49,44 54,00 37,12 41,54 MUFA 16,38 12,31 27,37 23,02 PUFA 65,82 66,31 64,49 64,56 UFA 0,48 0,37 0,77 0,65 PUFA/SFA 15,00 11,66 23,27 21,07 n6 1,38 0,65 4,10 1,95 n3 10,87 17,94 5,67 10,81 n6/n3 (SFA – nasycené mastné kyseliny; MUFA – mononenasycené mastné kyseliny; PUFA – polynenasycené mastné kyseliny; UFA – nenasycených mastných kyselin; n6 – PUFA n6, n3 – PUFA n3)
84
Z uvedené tabulky je zřejmé, že tuk stehenní svaloviny vykazuje obecně vyšší obsah MUFA a nižší obsah SFA a PUFA ve srovnání s tukem prsní svaloviny. Což je v rozporu s výsledky Nuernberg et al. (2011), kteří zjistili, že vyšší obsah SFA i PUFA byl naopak v tuku stehenní svaloviny. Vyšší obsah PUFA v tuku prsní svaloviny bažantů a orebic byl pak v našem hodnocení dán především výrazně vyšším obsahem n6 PUFA. Obsahem mastných kyselin ve svalovině pernaté zvěře se zabývali také např. Straková et al. (2010). Tito autoři nalezli vyšší zastoupení SFA a MUFA ve stehenní svalovině vůči prsní. V tuku prsní svaloviny pak bylo v jejich hodnocení prokázáno vyšší množství PUFA, a to jak n6, tak i n3. Mimoto, na obecně vyšší podíl UFA v bažantím mase upozorňují Zapletal et al. (2010). Závěr Z našich výsledků vyplývá, že tuk stehenní svaloviny jak bažantů, tak i orebic vykazoval obecně vyšší obsah MUFA ve srovnání s tukem prsní svaloviny. Naopak vyšší obsah PUFA byl zjištěn v tuku prsní svaloviny, a to opět u obou druhů pernaté zvěře. Dosažené výsledky tak mohou přispět k bližšímu poznání kvality a využitelnosti masa pernaté zvěře z hlediska lidské výživy. Práce vznikla za finanční podpory projektu IGA 31/2013/FVHE. Seznam literatury ADAMSKI, M., KUZNIACKA, J. The effect of age and sex on slaughter traits of pheasants (Phasianus colchicus L.). Animal Science Papers and Reports, 2006, vol. 24, p. 11 – 18. NUERNBERG, K., NUMBERG, G., DANNENBERGER, D. Nutrient and lipid composition of muscle in wild animals. Fleischwirtschaft, 2009, vol. 89, p. 99 – 102. NUERNBERG, K., SLAMEČKA, J., MOJTO, J., GAŠPARÍK, J., NUERNBERG, G. Musle fat composition of pheasants (Phasianus colchicus), wild ducks (Anas platyrhynchos) and black coots (Fulica atra). European Journal of Wildlife Research, 2011, vol. 57, p. 795 – 803. STRAKOVÁ, E., ŠERMAN, V., SUCHÝ, P., MAS, N., VITULA, F., VEČEREK, V. Fatty acids in the tissue of feathered game. Krmiva, 2010, vol. 52, p. 63 – 69. SUCHÝ, P., MAS, N., VITULA, F., STRAKOVÁ, E., ŠERMAN, V., STEINHAUSER, L., VEČEREK, V. Difference in meat nutritional composition of six wildfowl varieties. Krmiva, 2009, vol. 51, p. 63 – 74. ZAPLETAL, D., STRAKOVÁ, E., VITULA, F., KROUPA, L., SUCHÝ, P. Výkrm bažantích kuřat. Farmář, 2010, vol. 1, p. 22 – 24. ZEVENBERGER, H., DE BREE, A., ZEELENBERG M., LAITINEN, K., VAN DUIJN, G., FLÖTER, E. Foods with a High Fat Quality Are Essential for Healthy Diets. Annals of Nutrition and Metabolism, 2009, vol. 54, p. 15 – 24.
85
Sledování dynamiky růstu vybraných mikroorganismů v potravinách určených k přímé spotřebě při použití různých konzervačních prostředků a způsobů balení Bohdana Janštová, Lenka Necidová, Jitka Langová, Václav Vlášek, Danijela Jovanovic, Bohumíra Janštová, Jiří Štencl Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Mnoho potravin určených k přímé spotřebě, tedy potravin bez nutnosti tepelné úpravy před jejich konzumací, představuje z hlediska výskytu mikroorganismů rizikové potraviny. V souladu s kritérii uvedenými v nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických požadavcích pro potraviny, ve znění pozdějších předpisů, se jedná především o výskyt patogenních mikroorganismů Listeria monocytogenes a v případě sýrů také o Staphylococcus aureus. V současnosti jsou požadavky tržní sítě kladeny nejen na bezpečnost potravin, ale také na prodlužování jejich doby použitelnosti. Jako vhodné bariéry růstu nežádoucích bakterií, jak patogenních, tak bakterií způsobujících kažení potravin, se jeví především použití antimikrobiálních látek (konzervantů) a dále vytvoření prostředí ochranné atmosféry při balení výrobků (modifikace atmosféry v mikroklimatu mezi potravinou a obalem plyny O2, CO2, N2 a jejich směsí). Takové balení potravin v modifikované atmosféře či ve vakuu prodlužuje trvanlivost potravin o několik dnů až týdnů, přičemž chuť, aroma ani kvalita potravin nejsou změněny. Antimikrobiální vlastnosti balicích plynů potvrdilo mnoho studií (Nyati, 2000). Prováděné studie trvanlivosti u potravin určených k přímé spotřebě jsou zaměřeny především na sledování dynamiky růstu L. monocytogenes v dané potravině. Ačkoli je prevalence listeriózy v populaci relativně nízká, její závažnost je vzhledem k vysoké mortalitě postižených osob vysoká. Většina humánních listerióz je způsobena konzumací lahůdkových výrobků kontaminovaných L. monocytogenes (Chan and Wiedmann, 2009).
Materiál a metodika Ke studiím trvanlivosti (A) byly použity potraviny určené k přímé spotřebě, dodané přímo od výrobce z ČR (vaječná tlačenka, šunkový aspik, kuřecí aspik s brokolicí, pečené koleno, vlašský salát, sýrová pomazánka, matjesový salát, nakládaný camembert, líčka v aspiku, bramborový salát a těstovinový salát). Jako konzervanty byly použity Defence JB (inovační přírodní bioprotektor získávaný se přírodním fermentačním procesem za využití bakteriálních kultur mléčného kvašení a kvasných kultur), benzoan sodný ve směsi se sorbanem draselným (chemické konzervační látky označované jako E 211 a E 202) a Bacstat BG (disiřičitan draselný - E 224, octan sodný - E 262,
86
sůl, citrát sodný - E 331, kyselina citrónová - E 330 a kyseliny askorbové - E 300). Vzorky byly v laboratoři záměrně sekundárně kontaminovány směsí 3 kmenů patogenní bakterie Listeria monocytogenes. Další část pokusu (Vliv balení na kažení potravin - B) byla zaměřena na vyšetření tradičních kozích a ovčích sýrů pocházejících ze Srbska (např. Kajmak). Tyto vzorky byly v laboratoři balení potravin našeho ústavu zabaleny v různě modifikovaných atmosferických podmínkách (balení prosté, vakuové, CO2, N2). Testované potraviny byly skladovány (inkubovány) po dobu 28 dnů. V průběhu skladování byly odebírány dílčí vzorky, u kterých se za použití referenčních metod řady ČSN EN ISO sledovala dynamika růstu patogenních mikroorganismů v závislosti na vlivu přídavku různých konzervačních - antimikrobiálních látek a v závislosti na použití odlišných podmínek balení a skladování. Výsledky Studie trvanlivosti (A) Ve všech testovaných potravinách určených k přímé spotřebě, s výjimkou pečeného kolena, ukazují růstové křivky pokles počtu Listeria monocytogenes (Lm) ve srovnání s počty na začátku doby jejich skladování. Nutnost použití konzervačních prostředků Defence, směsi Benzoan-sorban nebo Bacstat BG z důvodu potlačení růstu Lm nebyla u většiny testovaných potravin studií prokázána. Význam použití konzervačních prostředků je patrný u šunkového aspiku, vlašského salátu a sýrové pomazánky. Pečené koleno bylo v naší studii vyhodnoceno jako nejpříznivější potravina pro množení Lm. V případě kontaminace Lm z hlediska dlouhodobé údržnosti je tedy rizikovou potravinou a zvolení vhodného konzervačního prostředku je nezbytné. Grafy č. 1-3 ukazují růstové křivky Lm pro potraviny, kde byl účinek konzervačního prostředku prokázán jako statisticky významný. Graf č. 1
Graf č. 2
Graf č. 3
Graf č. 1: Růstová křivka L. monocytogenes během skladování při 6 °C - vlašský salát bez konzervantů (VS), s konzervanty Defence (VS Def), Bacstat (VS Bac) a směsí Benzoan sodný a sorban draselný (VS Ben). Graf č. 2: Růstová křivka L. monocytogenes během skladování při 6 °C - šunkový aspik (ŠA), s konzervanty Defence (ŠA Def), Bacstat (ŠA Bac) a směsí Benzoan sodný a sorban draselný (ŠA Ben).
87
Graf č. 3: Růstová křivka L. monocytogenes během skladování při 6 °C - sýrová pomazánka bez konzervantů (SP), s konzervanty Defence (SP Def), Bacstat (SP Bac) a směsí Benzoan sodný a sorban draselný (SP Ben).
Vliv balení na kažení potravin (B) Ve vyšetřovaných sýrech byl sledován výskyt patogenních bakterií. Bakterie Staphylococcus aureus a Listeria monocytogenes nebyly zaznamenány u žádného vzorku po celou dobu skladování. V kozím sýru byla prokázána bakterie E. coli (od 7. dne skladování) při balení do atmosféry CO2, N2 a vakuum (VAC). Nejvyšší počty E. coli byly stanoveny při balení v CO2 atmosféře (log 2,7 KTJ.g-1). U potravin zabalených bez ochranné atmosféry (FREE) nebyla bakterie E. coli prokázána. Dále byl kromě celkového počtu mikroorganismů a kvasinek sledován výskyt plísní, ty nebyly v kozím sýru detekovány vůbec. U ovčích sýrů (graf č. 3) byl výskyt plísní nejlépe potlačen balením potraviny v CO2 atmosféře, jako nejméně vhodný způsob balení se v tomto případě jevilo balení do vakua. Graf č. 3
Graf č. 3: Výskyt plísní v ovčím sýru skladovaném 28 dní, baleno do atmosfér CO2, N2 vakuum (VAC) a do prosté atmosféry (FREE). Závěr Výběr vhodného konzervačního prostředku a způsobu balení jsou specifické pro konkrétní potraviny. U většiny potravin určených k přímé spotřebě vyšetřovaných v naší studii nebyla prokázána účinnost použitých konzervačních prostředků na potlačení růstu Listeria monocytogenes s výjimkou vlašského salátu, sýrové pomazánky a šunkového aspiku.
Seznam literatury: Literatura dostupná u autorů. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Interní grantové agentury VFU Brno 16/2013/FVHE.
88
Prioritní organické polutanty na bázi organohalogenovaných sloučenin a jejich distribuce ve vodním ekosystému Alice Jírová, Kateřina Járová, Petra Komárková, Zuzana Králová, Milada Vávrová Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Znečištění povrchových vod perzistentními organickými polutanty (POPs) představuje stálý problém nejen v České republice. Mezi nejčastěji se vyskytující POPs patří polychlorované bifenyly (PCB), polybromované difenylethery (PBDE) a organochlorové pesticidy (OCHP). PCB se ve vodě vyskytují převážně sorbované na suspendovaný a dnový sediment, případně na fytoplankton a zooplankton. Vyšší výskyt PCB ve vodách souvisí s ekologickými haváriemi nebo s atmosférickou depozicí (Rutilio et al., 2010). Sledování PBDE se v posledních letech velmi rozšířilo, protože komerční směsi s obsahem těchto organických polutantů jsou obsaženy v řadě výrobků pro běžné používání, jelikož jsou účinnými látkami tzv. retardátorů hoření (Kelly et al., 2008). OCHP jsou lipofilní, chemicky stabilní a málo biodegradabilní. Převážně pocházejí ze starých zátěží, ze kterých se obtížně odstraňují (Tsai, 2010). Nejzávažnějším negativním dopadem všech těchto látek na životní prostředí je zejména jejich toxicita a vysoká perzistence. Zvýšenou pozornost je třeba věnovat sledování úrovně kontaminace vodního ekosystému, protože se jedná o prostředí velice citlivé, které spolehlivě odráží veškeré negativní změny. Tyto kontaminanty se navíc vyznačují vysokým stupněm akumulace v biologických systémech, což má za následek ohrožení zdraví nejen lidí, ale také zvířat (Jeong et al., 2001). Materiál a metodika Odběr vzorků: Vzorky vody, sedimentů a vodních rostlin byly odebrány ze 6 vybraných lokalit na řece Svratce a Svitavě v Brně a okolí v květnu 2013. Odebrané vzorky byly po transportu do laboratoře ihned zpracovány. Chemikálie: Použitá organická rozpouštědla, sorbenty, plyny a standardy byly v kvalitě pro stopovou analýzu. Cílové analyty:
•
PCB: 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180
•
PBDE: 28, 47, 99, 100, 153, 154, 183
•
OCHP: HCB, α-HCH, β-HCH, γ-HCH, p,p'-DDT, o,p'-DDT, p,p'-DDD, p,p'-DDE, dieldrin
Obrázek č. 1: Mapa odběrových míst
89
Příprava vzorků a extrakce: Voda: Ke vzorku vody o objemu 1000 mL bylo přidáno 20 mL hexanu a takto upravený vzorek byl extrahován 30 minut extrakcí za studena. Poté byl vzorek kvantitativně převeden do dělící nálevky, kde byl oddělením obou fází získán požadovaný extrakt. Extrakce vzorku vody byla stejným způsobem opakována celkem třikrát. Sediment a vodní rostliny: U vzorků sedimentu a vodních rostlin byla nejprve stanovena sušina, poté byly vzorky vysušeny do konstantní hmotnosti. Po vysušení bylo 30 g vzorku sedimentu převedeno do 250 mL baňky a převrstveno 50 mL hexanu. Vzorek byl extrahován za studena na třepačce 3 x 30 min, přičemž mezi každou extrakcí byl extrakt přefiltrován přes aktivovaný síran sodný bezvodý. Ze vzorků vysušených vodních rostlin bylo naváženo 10 g, které byly převedeny do 250 mL baňky a převrstveny 60 mL směsi hexan:aceton (3:2). Dále byly vzorky vodních rostlin extrahovány stejným způsobem jako vzorky sedimentů. Přečištění extraktů: Získané extrakty byly zahuštěny a následně zbaveny balastních látek pomocí kolonové chromatografie; vzorky vody a sedimentů na koloně naplněné florisilem, vzorky vodních rostlin na směsné koloně naplněné florisilem a oxidem hlinitým (1:1). Kolony byly postupně promývány 90 ml elučního činidla hexan a diethylether v poměru 94:6. Přečištěný extrakt byl odpařen do sucha, znovu rozpuštěn v 1 mL isooktanu a kvantitativně převeden do vialky. Analytické stanovení: Kvalitativní a kvantitativní analýza cílových analytů byla provedena plynovou chromatografií (GC) s detektorem elektronového záchytu (ECD). Tabulka č. 1: Podmínky GC analýzy GC systém I (HP 6890N Series II/2 µ-ECD) DB-5 (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm) Kolona 1 DB-17 (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm) Kolona 2 90 °C (2 min) 15 °C/min - 180 °C (0 min) Teplotní program (PCB+OCHP) Státní zdravotní ústav© 3 °C/min - 220 °C (0 min) 1 °C/min - 250 °C (1.67 min) GC systém II (HP 6890 Series/µ-ECD) Rxi-17 (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 µm) Kolona 1 100 °C (2 min) 30 °C/min - 200°C (3 min) Teplotní program (PBDE) 3 °C/min - 230 °C (10 min) 5 °C/min - 270°C (5 min) 10 °C/min - 300°C (15 min)
90
Výsledky
Graf č. 1: Suma PCB kongenerů ve vodních rostlinách
Graf č. 2: Suma PCB kongenerů
v sedimentech
Graf č. 3: Suma PBDE kongenerů ve vodních rostlinách
Graf č. 4: Suma PBDE kongenerů
v sedimentech Závěr Na základě interpretace výsledků lze říci, že u vod byla většina sledovaných analytů buď pod mezí detekce, nebo nebyly vůbec detekovány. Kromě dvou odběrových míst (A, E) byly ve vzorcích vodních rostlin prokázány vyšší koncentrace PCB, než ve vzorcích sedimentů. Protože v těchto vzorcích byl dominantní kongener CB 28 lze se domnívat,
že
zdrojem
znečištění
byla
sekundární
kontaminace pocházející z ovzduší. V případě PBDE byly
Graf č. 5: Suma skupin pesticidů v sedimentech
zjištěny vyšší hodnoty v sedimentu než ve vodních
rostlinách. Vyšší zátěž byla prokázána na odběrových místech E a F, které se nacházejí za Brnem. OCHP naopak dosahovaly velmi nízkých koncentrací i ve vzorcích rostlin; v sedimentech byly vyšší nálezy pouze u izomerů HCH, a to na odběrových místech A, B a E. Nejvyšší úroveň kontaminace byla zjištěna v případě kongenerů PBDE. Důvodem může být to, že jsou součástí komerčních výrobků, odkud se uvolňují do abiotických i biotických složek životního prostředí. Poděkování: Studie byla zpracována za finančního přispění projektu IGA VFU Brno č. 20/2013/FVHE. Seznam literatury: Literatura dostupná u autorů.
91
Identifikace parciální sekvence genu kódujícího alergenní protein parvalbumin tresky aljašské (Theragra chalcogramma) metodou real-time PCR 1,3
Mgr. Darina Kostelníková, 2 Mgr. Jitka Osičková, 2 Mgr. Karel Ondráček, 1,3 MVDr. Eva Renčová, Ph.D., 1 Doc. MVDr. Bohuslava Tremlová, Ph.D.
1
Ústav vegetabílií a rostlinné produkce, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno; 2Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno; 3Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno Úvod
Rybí maso je častou příčinou alergických reakcí a to přibližně u 0,4% populace.1 Hlavním alergenem ryb je bílkovina parvalbumin vyskytující se ve vysokém množství ve svalovině ryb a obojživelníků.2 Treska aljašská (Theragra chalcogramma) patří mezi celosvětově významný druh ryby z čeledi Gadidae.3 Do ČR se zamražená surovina dováží v podobě filet nebo filet slisovaných do bloku. V posledních letech byla publikována řada metod pro detekci parvalbuminu ryb zahrnujících PCR,4 cytochemickou detekci,5 imunoenzymatické metody jako immunoblotting6 a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7.
Cílem práce bylo vypracovat citlivou real-time PCR metodu pro detekci specifické sekvence genu kódujícího alergenní protein parvalbumin tresky aljašské (Theragra chalcogramma).
Materiál a metodika Příprava DNA Izolace DNA byla provedena pomocí komerčního kitu DNeasy Mericon Food Kit (Qiagen, Hilden, Germany) dle návodu výrobce.
Real-time PCR analýza Primery a próba byly navrženy a syntetizovány firmou Generi Biotech s.r.o., Hradec Kralové, Czech Republic (AY035586.1). Délka výsledného produktu je 88 bp. Amplifikace parvalbuminu byla provedena v přístroji LightCycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) v celkovém objemu 10 µl. Reakční směs obsahovala 5 µl QuantiTect Probe PCR Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), 1 µl směsi primerů a próby, 2 µl vody a 2 µl vzorku. Amplifikační program byl sestaven z počáteční aktivace při 50 °C/2 min, počáteční denaturace při 95 °C/15 min, pak následovalo 35 cyklů spočívajících v denaturaci při 95 °C/10 s, a annealing a extenze při 63
92
°C/60 s. Jako kontrola přítomnosti amplifikovatelné DNA byl použit gen pro eukaryota 18S rRNA a próba no. 66 (Universal ProbeLibrary, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Druhová identita tresky aljašské byla potvrzena sekvenováním.
Výsledky Bylo vyšetřeno 30 výrobků s deklarací tresky aljašské získané v tržní síti ČR. Jednalo se převážně o zamražené filety. Specificita metody byla ověřena na deseti vybraných úzce příbuzných druzích ryb (Obr. 1). Vzhledem k vysoké podobnosti vybraného úseku genu se nepodařilo od sebe odlišit tresku aljaškou (Theragra chalcogramma) a tresku obecnou (Gadus morhua). Detekční limit metody byl 100 pg/µl (Ct hodnota 30,97). Všechny výrobky s Ct nižší než 30,97 byly považovány za pozitivní. Ze 30 testovaných výrobků bylo 26 pozitivních (Tab. 1). U 4 výrobků č. 5, 16, 22 a 27 nebyla treska aljašská detekována. Přítomnost aditiv, nízké pH a tepelná úprava mohou zhoršovat průběh amplifikace a tím i detekci specifického parvalbuminu v těchto výrobcích. Vzhledem k tomu, že přítomnost DNA ve vzorcích byla prokázána pomocí amplifikační kontroly (gen pro eukaryota 18S r RNA), tyto vzorky pravděpodobně obsahovaly jiný druh ryby navzdory deklaraci na obalu výrobku. Amplifikační kontrola prokázala přítomnost DNA ve všech 30 vzorcích (Obr. 2).
Obr. 1. Testování specificity; A-Theragra chalcogramma, B-Gadus morhua, C-Thunnus thnynnus, D-Micromesistius merlangus, D-Oncorhynchus gorbuscha, E-Sparus aurata, F-Polachius virens.
93
Obr. 2. Výsledky real-time PCR vyšetření při použití amplifikační kontroly (částečná sekvence genu 18S rRNA pro průkaz eukaryot); A-Amplifikační křivky u 30 zakoupených výrobků; B, CAmplifikační křivky při použití negativní kontroly.
Název výrobku 1. Gratinované filety z tresky aljašské s mandlemi 2. Gratinované filety z tresky aljašské po provensálsku 3. Treska filé 4. Obalované filety 5. Zmrazené file porce treska 6. Aljašská treska filé 7. Filety z tresky aljašské 8. Aljašská treska file 9. Porce file z aljašské tresky 10. File porce z tresky 11. Filé porce 12. filé nemleté porce 13. Rybí porce filé
Φ Ct 25,54
Název výrobku 16. Surimi tyčinky -1
Φ Ct 35,00
25,52
17. Porce file z Aljašské tresky
27,89
26,75 23,02 33,26 22,35 27,05 26,70 26,65 25,93 26,85 27,04 26,65
27,76 28,04 27,99 29,17 35,00 31,79 27,76 28,78 29,68 35,00 25,79
14. Filety z Mintaja
26,31
15. Rybí prsty
22,25
18. Aljašská treska filety 19. Fish sticks 20. Filety z alj. tresky 21. Porce z aljašské tresky 22. Treska v majonéze 23. Norský salát s krabí příchutí 24. Aljašská treska file 25. Porce filé pro děti 26. Filety z mořských ryb 27. Surimi tyčinky -2 28. Alaska seelachsfilet/Alaska pollack fillet portion 29. Gourmet-Filet Fish bake a la bordelaise 30. Alaska pollack Fillets in a light golden breadcrum
Tab. 1. Výsledky real-time PCR vyšetření u 30 výrobků zakoupených v tržní síti
94
27,00 27,69
Závěr Vypracovaná real-time PCR metoda byla ověřena na 30 vzorcích rybích produktů s deklaraci tresky aljašské (Theragra chalcogramma) získaných v tržní síti ČR. Ve dvaceti šesti vzorcích byla přítomnost DNA tresky aljašské prokázána. Čtyři vzorky byly negativní a zřejmě obsahovaly jiný druh ryby navzdory deklaraci na obalu. Vzhledem k vysoké podobnosti vybraného úseku genu nebylo možné od sebe odlišit tresku aljaškou (Theragra chalcogramma) a tresku obecnou (Gadus morhua). Proto bude nutné následně vypracovat metodu sekvenování DNA pro ověření identity těchto blízce příbuzných druhů. Poděkování Studie byla zpracována za finančního přispění projektu IGA VFU Brno č. 27/2013/FVHE a grantu MZe 000 27 16 202).
Seznam literatury:
1. SICHERERER, S.H.; MUNOZ-FURLONG, A.; SAMPSON, H.A. Prevalence of seafood allergy in the United States determined by a random telephone survey. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2004, vol. 114, no. 1, s. 159-165. 2. KRETSINGER, R.H.; NOCKOLDS, C.E. Carp muscle calcium-binding protein. II. Structure determination and general description. Journal of Biological Chemistry. 1973, vol. 248, no. 9, s. 3313-3326. 3. DO, T. V., HORDVIK, I., ENDRESEN, C., ELSAYED, S. Characterization of parvalbumin, the major allergen in Alaska pollack, and comparison with codfish allergen. Mol Biol, 2005, 42, 345353. 4. HILDEBRANDT, S., GARBER, E.A.E. Effects of processing on detection and quantification of the parvalbumin gene in Atlantic salmon (Salmo salar). Food Chem, 2010, 119, 75-80. 5. HÄRTIG, W., BRÜCKNER, G., BRAUER, K., SEEGER, G., BIGL, V. Triple immunofluorescence labelling of parvalbumin, calbindin-D28k and calretinin in rat and monkey brain. J Neurosci Meth, 1996, 67, 89-95. 6. BEALE, J. E., JEEBHAY, M. F., LOPATA, A. L. Characterisation of purified parvalbumin from five fish species and nucleotide sequencing of this major allergen from Pacific pilchard, Sardinops sagax. Mol Immunol, 2009, 46, 2985-2993. 7. FAESTE, C. K., PLASSEN, C. Quantitative sandwich ELISA for the determination of fish in foods. J Immunol Meth, 2008, 329, 45-55.
95
Transkriptomická analýza reakce netopýrů na infekci Geomyces destructans Veronika Kováčová, Jiří Pikula, Hana Banďouchová, Jitka Osičková, Jiří Brichta, Karel Ondráček Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Syndrom bílého nosu (WNS) je onemocnění vyvolané psychrofilní houbou Pseudogymnoascus destructans (dříve Geomyces destructans), která infikuje kožní tkáně netopýrů během hibernace (Meteyer et al., 2009). První potvrzený případ infekce touto plísní byl pozorován v Severní Americe v roce 2006 a odhaduje se, že WNS syndrom způsobil úhyn více než 5 milionů netopýrů na rozsáhlém geografickém území států USA a provincií Kanady (Blehert et al. 2009, Frick et al. 2010). V České republice i v řadě dalších evropských zemí byl také prokázán výskyt plísně P. destructans u hibernujících netopýrů, avšak prozatím nebyl pozorován jejich hromadný úhyn (Puechmaille et al. 2011). Vzhledem k tomu, že patologické mechanismy vedoucí k úhynu hibernujících netopýrů a reakce jejich organismu na kožní plísňovou infekci jsou dosud na úrovni hypotéz a je pozorována rozdílná mortalita v Evropě a Severní Americe, cílem tohoto projektu je monitorovat obraz nemoci pomocí transkripční aktivity hostitele, patogena a vybraných imunologických parametrů. Materiál a metodika Odebírané vzorky Vzorky plísní Pseudogymnoascus destructans a tkání netopýrů byly získány v rámci monitoringu syndromu bílého nosu v zimovištích netopýrů České republiky (Moravský kras). Celkem bylo vyšetřeno 148 netopýrů (z 15 různých druhů), z toho 61 vzorků kůže bylo posláno na histopatologii. Bylo také odebráno 12 vzorků kůže na sekvenaci genomů z důvodu komparace exprese genů u zdravých a postihnutých netopýrů. Identifikace plísně byla prováděna přímou mikroskopií typických arthrokonidií, kultivací stěrů na Sabouradově agaru a PCR diagnostikou s využitím specifických primerů. Výběr kožních lézí pro analýzy byl založen na diagnostickém využití UV záření. Povrchově kolonizovaná kůže fluoreskuje modrozeleně, zatímco infikovaná kůže s typickými lézemi oranžově. Rozsah kožních lézí v kožních bioptátech byl posouzen histopatologicky. Negativní kontrolou pro analýzy byla laboratorní kultura plísně P.d. a biopsie létací blány zdravých netopýrů. Exprese genů byla studována subtraktivní komparací s 454 sekvenováním, což je metoda umožňující de novo sekvenaci celého genomu.
96
Výsledky Z výsledků vyplývá, že z celkově vyšetřených netopýrů (148) bylo histopatologicky pozitivních 40 netopýrů a po diagnostice UV záření bylo pozitivních 53 netopýrů (viz. Tabulka 1). Tento rozdíl je způsoben místem, ze kterého se odebíral vzorek pro histopatologii. Vzorky pro 454 sekvenaci byly zaslány k analýze. Tabulka č. 1: Počet netopýrů vyšetřených, bioptovaných a pozitivních při histopatologickém vyšetření. Pozitivní zvířata vykazovala kožní léze typické pro WNS (syndrom bílého nosu).
Year Species Myotis myotis Myotis daubentonii Myotis bechsteinii Myotis nattereri Myotis brandtii Myotis mystacinus Myotis emarginatus R. hipposideros Eptesicus nilssonii Plecotus auritus B. barbastellus Plecotus austriacus Eptesicus serotinus Pipistrellus pipistrellus Myotis dasycneme Total
2013 Screened Biopsied 34 26 3 1 8 2 11 1 4 2 2 9 6 27 5 3 23 11 17 3 3 1 2 1 1 1 1 1 148 61
Histo+ 21 1 2 1 0 5 1 5 3 0 0 0 1 40
UV + 30 1 3 3 1 0 3 0 0 10 1 0 0 0 1 53
Seznam literatury: 1. Blehert et al. 2009. Bat White-Nose Syndrome: An Emerging Fungal Pathogen? Science 323:227. 2. Frick et al. 2010. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science 329: 679-682. 3. Meteyer et al. 2009. Histopathologic criteria to confirm white-nose syndrome in bats. Journal of Veterinary Diagnostics and Investigation 21: 411-414. 4. Puechmaille et al. 2011. Pan-European Distribution of White-Nose Syndrome Fungus (Geomyces destructans) Not Associated with Mass Mortality. PLoS ONE 6(4): e19167.
97
Syntetické vonné látky a jejich distribuce do složek životního prostředí Zuzana Králová, Miroslava Beklová, Petra Komárková, Milada Vávrová Ústav ekologie a chorob zvěře, ryb a včel, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod V posledních letech se v rámci hodnocení úrovně kontaminace životního prostředí sledují také organické mikropolutanty, zejména farmaka a produkty osobní péče, mezi něž patří i syntetické vonné látky neboli musk sloučeniny [1]. Jedná se o lipofilní, perzistentní chemické látky se schopností bioakumulace ve vodním prostředí [2]. Díky rozsáhlému používání se syntetické musk sloučeniny vyskytují v životním prostředí ubikvitárně [3]. Většina z nich směřuje po použití do kanalizace, což má za následek jejich přítomnost v odpadních vodách, které představují konstantní expoziční zdroj těchto látek a jsou rovněž považovány za primární zdroj informací o možném znečištění vodních ekosystémů [1,4]. Musk sloučeniny jsou dále detekovány v povrchových vodách, kalech z čistíren odpadních vod, suspendovaných sedimentech a dnových sedimentech [5]. Prokázány byly také v biotě žijící v kontaminovaném vodním prostředí [3]. Materiál a metodika Tato studie byla zaměřena na sledování vybraných zástupců lineárních a polycyklických musk sloučenin v odpadní vodě (přítok a odtok) pocházející z čistírny odpadních vod Brno – Modřice (odběr od 4. 9. do 13. 9. 2013). Dále byly analyzovány vzorky povrchové vody, sedimentu a vodních rostlin odebrané ze dvou lokalit na řece Jihlavě (Jihlava, Třebíč) a ze dvou lokalit na řece Oslavě (Velké Meziříčí, Náměšť nad Oslavou). Sledované analyty lineární musk sloučeniny: dihydromyrcenol (DHM), cyclohexylethylacetat (CHEA), arofir (AR), cyclacet/jasmocyclen (CY) polycyklické musk sloučeniny: galaxolid (HHCB), tonalid (AHTN) Zpracování vzorků odpadní a povrchové vody Analyty ze vzorků vod byly extrahovány pomocí mikroextrakce na tuhou fázi (SPME). Postup práce byl následující: do vialek o objemu 22 ml byly naváženy 3 g chloridu sodného a bylo přidáno 14 ml neředěného a nefiltrovaného vzorku vody. Vialky byly uzavřeny septem a ponořeny do vodní lázně o teplotě 65 °C. Vzorky byly předmíchávány po dobu 5 min, potom bylo do head-space
98
prostoru vysunuto SPME vlákno (65 µm PDMS/DVB) a následně probíhala extrakce po dobu 30 min. Zpracování vzorků sedimentu a vodních rostlin Vzorky sedimentů i rostlin byly nejprve vysušeny v sušárně při teplotě 80 °C do konstantní hmotnosti. K dalšímu zpracování bylo odebíráno vždy 30 g sedimentu a 5 g rostlin. Extrakce obou matric probíhala za studena na třepačce 3 × 30 min; jako extrakční činidlo byl použit cyklohexan. Po každé dílčí extrakci byl extrakt přefiltrován přes bezvodý síran sodný. Výsledný extrakt byl z důvodu odstranění balastních látek přečištěn pomocí sloupcové chromatografie. Vzorky sedimentu byly nanášeny na kolonu naplněnou silikagelem a florisilem (1:1), vzorky rostlin na kolonu naplněnou silikagelem a oxidem hlinitým (1:1). Jako eluční činidlo byl použit ethylacetát (80 ml). Přečištěné vzorky byly na vakuové rotační odparce odpařeny do sucha a následně rozpuštěny v 1 ml cyklohexanu a převedeny do vialky. Analytické stanovení Kvalitativní a kvantitativní analýza musk sloučenin byla provedena plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí. Vlastní analýza proběhla za následujících podmínek: kolona DB-5MS (20 m x 180 μm x 0,18 μm), průtok nosného plynu 0,8 ml·min-1, teplotní program: počáteční teplota 50 °C po dobu 1 min (3 min pro SPME), 15 °C·min-1 do 110 °C, 5 °C·min-1 do 165 °C (zádrž 9 min), 30 °C·min-1 do 280 °C (zádrž 1 min); teplota iontového zdroje 230 °C, teplota kvadrupolu 150 °C.
Výsledky Analyt Dihydromyrcenol Cyclohexylethylacetat Arofir Cyclacet/Jasmocyclen Galaxolid Tonalid
Přítok
Odtok
[µg·l-1]
[µg·l-1]
Účinnost odstranění [%]
174,6 0,103 0,639 0,265 2,367 0,368
0,078 0,012 0,035 0,073 0,822 0,128
99,94 86,25 91,82 70,09 58,26 62,82
Tabulka1: Průměrné koncentrace analytů na přítoku a na odtoku z ČOV a účinnost jejich odstranění
99
Lokalita Matrice voda Jihlava sediment rostliny voda Třebíč sediment rostliny voda Velké Meziříčí sediment rostliny voda Náměšť nad Osl. sediment rostliny
-1
[µg·l ] [µg·kg-1 sušiny] [µg·l-1] [µg·kg-1 sušiny] [µg·l-1] [µg·kg-1 sušiny] [µg·l-1] [µg·kg-1 sušiny]
DHM 0,337 8,864 208,7 0,115 5,951 234,0 0,065 8,778 337,1 0,547
CHEA
AR 0,077 6,523 509,8 0,053 18,30 520,5 0,030 31,74 505,9 0,124
CY 0,062
HHCB 0,115 0,309 16,10 0,149 0,981 22,39 0,058 1,469 8,267 0,062
AHTN 0,018 0,034 2,013
18,04 632,9
0,610 8,591
18,73 577,7
0,622 13,68
0,100 1,649
Tabulka 2: Koncentrace musk sloučenin ve vodě, sedimentu a rostlinách z vybraných lokalit Závěr Vlivem antropogenní činnosti se musk sloučeniny dostávají prostřednictvím odpadních vod na ČOV, kde dochází k jejich metabolizaci, sorpci na kal, popřípadě beze změny putují do recipientu. Zde, vzhledem k jejich bioakumulačnímu potenciálu, dále dochází k přestupu do biotických složek vodního ekosystému. Výsledky práce potvrzují ubikvitární výskyt musk sloučenin v životním prostředí a také postupné nahrazování dříve používaných polycyklických vonných látek sloučeninami lineárními, které se vyznačují nižší toxicitou a vyšší biodegradabilitou. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory projektu IGA VFU Brno č. 21/2013/FVHE. [1]
[2]
[3] [4]
[5]
Seznam literatury DIFRANCESCO, A. M.; CHIU, P. C.; STANDLEY, L. J.; ALLEN, H. E.; SALVITO, D. T. Dissipation of Fragrance Materials in Sludge-Amended Soils. Environmental Science and Technology, 2004, vol. 38, pp. 194-201. HUTTER, H. P.; WALLNER, P.; MOSHAMMER, H.; HARTL, W.; SATTELBERGER, R.; LORBEER, G.; KUNDI, M. Synthetic musks in blood of healthy young adults: Relationship to cosmetics use. Science of the Total Environment. 2009, vol. 407, p. 48214825. SHEK, W. M.; MURPHY, M. B.; LAM, J. C. W.; LAM, P. K. S. Synthetic polycyclic musks in Hong Kong sewage sludge. Chemosphere, 2008, vol. 71, pp. 1241-1250. ZHANG, X.; YAO, Y.; ZENG, X.; QIAN, G.; GUO, Y.; WU, M.; SHENG, G.; FU, J. Synthetic musks in the aquatic environment and personal care products in Shanghai, China. Chemosphere, 2008, vol. 72, pp. 1553-1558. ZOUHAR, L.; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.; KUBÍČKOVÁ, K.; VEČEREK, V. Evaluation of wastewater contamination by musk compounds. Fresenius Environmental Bulletin, 2012, vol. 21, pp. 3352-3356.
100
Hodnocení vlivu deoxynivalenolu na vybrané ukazatele imunitního systému ryb Iveta Matejová1, Dana Živná1, Zdeňka Svobodová 1, Pavla Sehonová1, Martin Faldyna 2 1
Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno, 2Oddělení imunologie, Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno Úvod Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity plísní. Nejrozšířenější a nejvíce negativně
ovlivňující zdravotní stav ryb jsou zástupci trichotecenů - deoxynivalenol (DON) a T-2 toxin. Pstruh duhový je velmi citlivý k příjmu deoxynivalenolu (Hooft et al., 2011). Vzhledem k nárůstu používání obilovin a jejich vedlejších produktů do krmných směsí pro ryby dochází v poslední době ke zvýšenému výskytu mykotoxinů v těchto krmivech. I přes to, že pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) patří mezi karnivorní druhy, obsahuje také komerční krmivo pro tento druh část rostlinných komponentů (Manning and Abbas, 2012). Cílem studie je vyhodnocení účinku mykotoxinu deoxynivalenolu na organismus pstruha duhového (O. mykiss).
Materiál a metodika V pokusu bylo použito celkem 40 kusů ryb. Vlastní pokus byl zahájen po 14denní aklimatizaci. Ryby byly rozděleny na skupiny kontrolní (n = 20) a experimentální (n = 20). Skupiny kontrolní byly krmeny komerčním krmivem (EFICO Alpha 717, BioMar A/S, Dánsko), skupiny experimentální byly krmeny komerčním krmivem s přídavkem DON v dávce 2 mg/kg krmiva. Po 14dnech od počátku podávání deoxynivalenolu byla do vody aplikována vakcína (AQUAVAC ERM, SCHERING-PLOUGH ANIMAL HEALTH, USA) v dávce doporučené výrobcem. Na závěr pokusu byla 23. den od kontrolních a experimentálních ryb odebrána krev ke stanovení hematologických ukazatelů zahrnující hodnoty celkového počtu erytrocytů (RBC), hemoglobinu (Hb), hematokritu (PCV), středního objemu erytrocytu (MCV), středního obsahu hemoglobinu v erytrocytu (MCH), střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytech (MCHC) a celkový počet leukocytů (Leuko) a dále biochemických ukazatelů zahrnující hodnoty albuminu (ALB), celkové bílkoviny (TP), glukózy (GLU), amoniaku (NH3), triacylglycerolů (TRIG), laktátu (LACT), cholesterolu (CHOL), alkalické fosfatázy (ALP), alaninaminotransferázy (ALT), aspartátaminotransferázy (AST), laktátdehydrogenázy (LDH), vápníku (Ca2+) a anorganického fosforu (PHOS). Ve vzorcích plasmy byly dále pomocí ELISA testu stanoveny specifické protilátky proti antigenům použitým ve vakcíně.
101
Ryby byly po odběru krve omráčeny tupým úderem do hlavy a usmrceny přetětím prodloužené míchy. Poté byly odebrány vzorky kožního slizu ke stanovení obsahu lysozymu, stanoveny biometrické ukazatele ryb, odebrány vzorky tkání k histopatologickému vyšetření, ke stanovení vybraných markerů oxidativního stresu a vzorky tkání ke kvantitativní RT-PCR. Stanovení hematologických a biochemických ukazatelů: Vzorky krve byly odebrány z ocasních cév a stabilizovány heparinem sodným (50 IU na 1 ml krve). Pro biochemickou analýzu byla použita plazma z heparinizované krve. Histopatologické vyšetření: Vzorky žaber, kůže, jater, sleziny, kraniální a kaudální ledviny byly fixovány v 10 % formalínu, poté vysušeny a vloženy do parafinu. Řezy byly obarveny hematoxylin-eosinem. Biometrické ukazatele: Po usmrcení ryb byly stanoveny biometrické ukazatele (celková délka ryb, délka těla ryb, hmotnost ryb a hmotnost jater) a z těchto parametrů následně vypočítány Fultonův kondiční faktor a hepatosomatický index. Stanovení lysozymu v kožním mukusu: Koncentrace lysozymu byla stanovena in vitro radiální difúzí v agaróze. Vzorky kožního mukusu byly aplikovány na agarové plotny obsahující Micrococcus luteus a následně inkubováno ve vlhké komůrce při pokojové teplotě 24 hodin. Poté byly odečteny průměry difúzních zón a přepočítány podle kalibrační křivky na mg/ml vzorku. ELISA: Vzorky plazmy v ředění 10x byly použity ke stanovení titru specifických protilátek proti antigenům použitým ve vakcíně. Kvantitativní real-time PCR: Celková RNA byla izolována ze vzorků sleziny a přední ledviny a technikou reverzní transkripce převedena na cDNA. PCR byla provedena na přístroji LightCycler 480 (Roche). Byly použity primery specifické pro prozánětlivé (IL-1ß, IL-8, TNFα) a protizánětlivé (IL-10) cytokiny.
Výsledky Hematologické parametry: U experimentální skupiny bylo zjištěno statisticky významné snížení hodnoty MCH (P < 0.05). Výsledky jsou znázorněny v tabulce 1. Tabulka 1. Hodnoty hematologických ukazatelů 23 dní od zahájení pokusu Parametry Kontrolní skupina Experimentální skupina průměr ± SD (n = 20) průměr ± SD (n = 20) -1 RBC (T·l ) 1,41 ± 0,36 1,58 ± 0,41 Hb (g·l-1) 76,94 ± 12,78 69,49 ± 12,92 -1 PCV (l·l ) 0,30 ± 0,06 0,29 ± 0,05 MCV (fl) 228,14 ± 66,62 198,26 ± 53,05 MCH (pg) 57,86 ± 16,26 46,93 ± 14,12* MCHC (g·l-1) 250,31 ± 27,58 235,67 ± 22,97 -1 Leuko (G·l ) 12,13 ± 4,97 14,23 ± 3,58 Signifikantní rozdíl mezi kontrolní a experimentální skupinou (*P < 0.05)
102
Biochemické parametry: U experimentální skupiny bylo zjištěno statisticky významné snížení hodnot glukózy, cholesterolu (P < 0.05) a amoniaku (P < 0.01). Hodnoty jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2. Hodnoty biochemických ukazatelů 23 dní od zahájení pokusu Parametry Kontrolní skupina Experimentální skupina průměr ± SD (n = 20) průměr ± SD (n = 20) -l ALB (g·l ) 15,69 ± 2,90 15,25 ± 2,74 TP (g·l-l) 37,45 ± 5,77 36,38 ± 3,98 -1 GLU (mmol·l ) 4,84 ± 0,79 4,36 ± 0,48** NH3 (μmol·l-1) 398,14 ± 75,85 280,79 ± 57,99* TRIG (mmol·l-1) 1,90 ± 0,40 1,63 ± 0,68 -1 LACT (mmol·l ) 2,62 ± 0,98 2,10 ± 0,69 CHOL (mmol·l-1) 6,50 ± 1,43 5,54 ± 1,12** -1 ALP (μkat·l ) 1,64 ± 0,78 1,40 ± 0,69 ALT (μkat·l-1) 0,33 ± 0,12 0,42 ± 0,28 -1 AST (μkat·l ) 7,66 ± 2,35 7,71 ± 1,85 LDH-L (μkat·l-1) 16,57 ± 6,50 16,77 ± 6,81 2+ -1 Ca (mmol·l ) 2,32 ± 0,15 2,32 ± 0,16 PHOS (mmol·l-1) 3,49 ± 0,41 3,67 ± 0,42 Signifikantní rozdíl mezi kontrolní a experimentální skupinou (*P < 0.05; **P < 0.01) Histopatologické vyšetření: U skupiny ryb krmených krmivem s přídavkem deoxynivalenolu bylo zjištěno hyalinní zkapénkovatění v epiteliích tubulů kaudálních ledvin. Biometrické ukazatele ryb: Nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly biometrických ukazatelů ryb u experimentální skupiny v porovnání s kontrolní skupinou. Obsah lysozymu v kožním mukusu: Výsledné hodnoty obsahu lysozymu v kožním mukusu u experimentální skupiny v porovnání se skupinou kontrolní nebyly statisticky významné. ELISA: Nebyly zjištěny statisticky významné změny v množství specifických protilátek v plazmě proti antigenům použitým ve vakcíně u experimentální skupiny ryb. Kvantitativní real-time PCR: U pokusné skupiny ryb byl zjištěn statisticky významný vzestup cytokinu TNF-α (P < 0.05). U ostatních parametrů nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly. Závěr: Z uvedených výsledků naší studie o vlivu mykotoxinu deoxynivalenolu na pstruha duhového vyplývá, že tento mykotoxin má v dávce 2 mg/kg krmiva nepříznivý vliv na jeho organismus. Při pitvě byly zjištěny hemoragie v jaterní tkáni, střevní sliznici a na kůži a současně s těmito změnami byly zjištěny změny hodnot červeného krevního obrazu. Uvedené odchylky v hodnotách ostatních měřených parametrů potvrdily citlivost pstruha duhového k příjmu deoxynivalenolu v této dávce. Tato práce byla financována v rámci projektu IGA 34/2013/FVHE. Seznam literatury: Seznam použité literatury a citovaných zdrojů je k dispozici u autora.
103
Kapr obecný (Cyprinus carpio) jako modelový organismus pro hodnocení vlivu moderních pesticidů na vznik oxidativního stresu Helena Modrá, Jana Blahová, Andrea Slaninová, Martin Hostovský, Jaroslav Mikeš, Markéta Bednářová Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Pesticidy, které se používají v zemědělství, se dostávají do životního prostředí při aplikaci na plodiny, při nesprávné likvidaci nevyužitých zbytků a také splachem z ošetřených polí. Rezidua pesticidů pronikají do vodního prostředí, kde ovlivňují vodní organismy. Moderní pesticidy mají nízkou akutní toxicitu. O to větší je však jejich skryté riziko pro člověka, zvířata a životní prostředí, protože jejich účinky jsou na první pohled málo výrazné a nespecifické. Mezi nejzávažnější chronické účinky moderních pesticidů patří ovlivnění endokrinního systému a působení oxidativního stresu díky nerovnováze mezi produkcí reaktivních kyslíkových forem a systémy, které chrání buňky před působením těchto forem (Slaninová et al., 2009). Sledování primárních a sekundárních produktů poškození organismu volnými radikály může vypovídat o oxidačním poškození buněk a tkání. Pro hodnocení míry oxidativního stresu vyvolaného cizorodými látkami jsou vynikajícím modelem ryby (Di Giulio and Hinton., 2008). Ryby mohou být vystaveny přesně definované nízké koncentraci testované látky po dlouhou dobu. Tímto způsobem může být simulováno působení pesticidů v environmentálně relevantních koncentracích. Cílem práce bylo stanovení vybraných parametrů oxidativního stresu a zhodnocení míry vzniku oxidativního stresu po působení moderních pesticidů na kapra obecného. Materiál a metodika Ke stanovení jednotlivých biomarkerů oxidativního stresu byly využity zmražené vzorky tkání (játra, mozek, ledvina, žábra) a plazmy, získané při pokusech na kapru obecném s pesticidy (terbutylazin, propikonazol) a repelentem (N,N-diethyl-m-toluamid – DEET). Důvodem testování vybraných látek bylo jejich přetrvávání v povrchové vodě.
104
V jednotlivých tkáních bylo provedeno stanovení aktivity glutathion peroxidázy, glutathion reduktázy, superoxid dismutázy a obsahu malondialdehydu. Tyto parametry byly stanoveny spektrofotometricky s využitím multifunkčního readru Varioskan Flash. V plazmě byl stanoven obsah ceruloplasminu a redukční potenciál plazmy (FRAP). Stanovení bylo prováděno fotometricky s využitím multifunkčního readru Varioskan Flash (ceruloplasmin) a biochemického analyzátoru Konelab 20i (FRAP). Získané výsledky aktivit a obsahu sledovaných markerů oxidativního stresu byly statisticky vyhodnoceny pomocí programu Unistat 5.6.
Výsledky a diskuze Při stanovení parametrů oxidativního stresu v testu s terbutylazinem nebyly zjištěny statisticky významné změny oproti kontrole v koncentraci celkového glutationu (GSH), aktivitě glutation-S-transferázy (GST), glutationperoxidázy (GPx), glutation reduktázy (GR), ani v množství malonyldialdehydu (MDA) v játrech kaprů po 24 hodinách od zahájení testu. Za 7 dní od zahájení experimentu došlo ke zvýšení aktivity GST (p < 0.01). Tento výsledek ukazuje na schopnost ryb vyrovnat se s oxidačním stresem v krátkém časovém úseku. V testu s propikonazolem se ukázalo, že propikonazol neovlivňuje množství GSH v žádné testované koncentraci po 30-ti ani 44 dnech od zahájení pokusu. Teprve za tři týdny po přelovení ryb do čisté vody došlo ke statisticky signifikantnímu poklesu GSH v nejvyšší testované koncentraci (p ˂ 0.01) (graf 1). K nárůstu aktivity GST (p ˂ 0.05) došlo za 42 dní ve druhé nejvyšší testované koncentraci, a toto zvýšení přetrvávalo i po přelovení ryb do čisté vody (graf 2). Dlouhodobé působení tohoto fungicidu vede k vyčerpání glutationu a ke zvýšení aktivity biotransformačních enzymů. Tento obranný mechanismus však selhává při působení vysokých koncentrací. V testu s repelentem DEET došlo k poklesu koncentrace ceruloplasminu v koncentraci 0,1 mg/l. Při stanovení antioxidační aktivity metodou FRAP se neprojevily žádné změny u žádné z testovaných koncentrací. Z dalších markerů oxidativního stresu byl zjištěn signifikantní nárůst aktivity glutathion peroxidázy v ledvinách v nejvyšší testované koncentraci (1 mg/).
105
Graf 1: Koncentrace glutationu v játrech kaprů po působení propikonazolu ve vodě
Graf 2: Aktivita glutathion S-transferázy (GST) v játrech kaprů po působení propikonazolu ve vodě
Závěr Ukázalo se, že všechny z vybraných testovaných pesticidů ovlivňují parametry oxidativního stresu. Významnou roli při vzniku oxidativního poškození tkání hraje typ látky, její koncentrace, ale i délka působení. Poděkování: Projekt byl finančně podpořen grantem IGA VFU Brno 17/2013/FVHE. Seznam literatury: Di Giulio R.T., Hinton D.E., editors (2008): The Toxicology of Fishes. Boca Ranton: CRC Press, Taylor and Francis Group. pp. 1071. Slaninová, A., Smutná, M., Modrá, H., Svobodová, Z. (2009): A review: Oxidative stress in fish induced by pesticides. Neuroendocrinology Letters, 30 (Suppl 1): 2–12.
106
Identifikace masa zvěřiny pomocí PCR a PCR-RFLP metody Michaela Nesvadbová1, Gabriela Bořilová1, Zdeňka Hutařová2, Ladislav Kašpar1 a Vladimír Steinbauer1 Ústav hygieny a technologie masa1, Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare2, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Produkce a konzumace zvěřiny má vzrůstající trend v České republice i celosvětově, především díky jejím specifickým jakostním a nutričním vlastnostem. K úmyslné či neúmyslné záměně svaloviny různých druhů zvířat dochází v praxi jak u bouraného masa, tak u surovin v masných výrobcích. Výjimkou není ani zvěřina, jelikož cena tohoto masa je, ve většině případů, v porovnání s masem hospodářských zvířat, vyšší. Nalezení vhodných metod, pro jednoduchou identifikaci masné suroviny ve výrobcích, je proto důležitá součást ochrany práv spotřebitelů. Tato studie se zaměřuje na identifikaci zvěřiny, která je běžně dostupná v ČR pomocí metody PCR, za použití druhově specifických primerů a metody PCR-RFLP, kdy dochází ke štěpení PCR produktu restrikčními enzymy, MboII and AciI. Materiál a metodika Analyzované vzorky a izolace DNA V analýze byly použity vzorky svalové tkáně jelena evropského (Cervus elaphus) (n=54), jelena siky (Cervus nippon) (n=39), daňka skvrnitého (Dama dama) (n=27), srnce obecného (Capreolus capreolus) (n=124), muflona (Ovis musimon) (n=43), prasete divokého (Sus scrofa) (n=63), zajíce polního (Lepus europaeus) (n=19), a skotu (Bos taurus) (n=39). DNA byla extrahována ze syrového a tepelně upravené masa pomocí kitu NucleoSpin Food (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Duren, Germany) dle obvyklého protokolu výrobce. Sekvenační analýza Fragment mitochondriální DNA o velikosti 819 bp byl sekvenován na přístroji 3500 Series Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) u deseti náhodně vybraných vzorků každého analyzovaného druhu. Primery pro PCR byly navrženy dle sekvencí mitochondriální DNA druhů, které byly předmětem našeho zájmu, pomocí programu Oligo v4.0 (National Biosciences Inc.). PCR esej Specifické PCR primery byly navrženy podle dostupných sekvencí mitochondriální DNA analyzovaných druhů a výsledků sekvenační analýzy pomocí programu Oligo v4.0 (National Biosciences Inc.). Reakční směs o celkovém objemu 25 µl obsahovala 50 ng DNA, PPP Master Mix bez MgCl2 (Top-Bio, Prague, Czech Republic), 2,0 mM MgCl2 a 200 mM přímého a zpětného
107
primeru. Podmínky PCR reakce byly nastaveny dle doporučeného protokolu výrobce master mixu, připojení primerů probíhalo při teplotě 63 °C po dobu 15 s. PCR produkty byly následně elektroforeticky vizualizovány na 3% agarózovém gelu za použití TBE pufru. PCR-RFLP esej PCR primery byly opět navrženy dle dostupných sekvencí mitochondriální DNA a výsledků sekvenační analýzy pomocí programu Oligo v4.0 (National Biosciences Inc.). Rekční směs o objemu 25 µl obsahovala 50 ng DNA, 1 x FastStar PCR Master (Roche, Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) a 300 mM přímého a zpětného primeru. Teplotní profil PCR byl nastaven dle doporučeného protokolu výrobce master mixu, k připojení primerů docházelo při teplotě 50 °C po dobu 30 s. Získané PCR produkty byly štěpeny pomocí restrikčních enzymů MboII and AciI. Reakční směs o objemu 15 µl obsahující 5 µl PCR produktu a 2 U enzymu byla inkubována přes noc při 37°C. RFPL fragmenty byly následně elektroforeticky vizualizovány na 3% agarózovém gelu za použití TBE pufru. Výsledky PCR esej Polymerázová řetězová reakce (PCR) využívající druhově specifické primery umožňuje přímou a specifickou identifikaci určitých DNA fragmentů a je často využívána především k identifikaci masa hospodářských zvířat (Rojas et al., 2009; Mafra et al., 2008). Druhově specifické primery byly navrženy dle sekvencí mitochondriální DNA jelena siky, jelena evropského, srnce obecného, daňka skvrnitého a muflona. Primery byly designovány tak, aby velikost PCR produktů jednotlivých druhů byla odlišná – velikost PCR produktu identifikujícího jelena siku je 510 bp, jelena evropského 436 bp, srnce obecného 377 bp, muflona 256 bp a daňka skvrnitého 180 bp. Specifita a vhodnost použití navržených primerů byla ověřena při PCR amplifikaci DNA, která byla získána z masa dalších deseti druhů – prasete divokého, buvola indického, zajíce polního a masa hovězího, vepřového, kuřecího, králičího, skopového, koňského a kozího. Tato esej je vhodná jak pro identifikaci syrové svaloviny, tak pro identifikaci zvěřiny technologicky zpracované v masných výrobcích. PCR-RFLP esej Druhová identifikace pomocí metody polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) spočívá ve štěpení vybraných DNA fragmentů vhodnými restrikčními enzymy a je často využívána pro identifikaci původu masa (Girish et al., 2005). Specifický pár primerů byl navržen tak, aby bylo možné amplifikovat oblast mitochondriální DNA u jelena evropského, jelena siky, daňka skvrnitého, srnce obecného, muflona, prasete divokého, zajíce polního a skotu. Velikost PCR produktu byla 378 bp. Identifikace sledovaných druhů byla provedena pomocí metody RFLP, kdy
108
docházelo ke štěpení PCR produktu restrikčními enzymy, MboII and AciI. Restrikční enzym MboII generoval fragmenty o velikosti 195, 117 a 66 bp u jelena evropského; 154, 117, 66 a 41 bp u jelena siky; 378 bp u srnce obecného; 113, 89, 66, 64 a 46 bp u daňka skvrnitého; 195 a 183 bp u muflona a 243 and 135 bp u prasete divokého, zajíce polního a skotu. Hovězí maso je nejpravděpodobněji možné zaměnit za zvěřinu. Přestože RFLP vzory divokého prasete, zajíce a skotu jsou za použití enzymu MboII identické, lze je odlišit pomocí restrikčního enzymu AciI. Tento enzym generuje fragmenty 170 a 208 bp u divokého prasete, fragment o velikosti 378 bp u zajíce polního a fragmenty 280 a 98 bp u skotu. Tato esej je vhodná pro identifikaci zvěřiny v syrovém i tepelně opracovaném stavu. Závěry Povolení širší distribuce bourané zvěřiny je v poslední době stále více diskutováno, což vede k zásadním otázkám, jak v tomto případě ochránit a kontrolovat právo spotřebitelů na správnou deklaraci původu masa v tržní síti. Identifikace bourané svaloviny je vždy problematická, jak při posuzování základních anatomických znaků, tak sekundárních senzorických parametrů, které jsou jediné, jež může běžný konzument při nákupu posoudit. Proto je nezbytné vyvinout nové a účinné metody pro určení druhového původu zvěřiny. Tato studie se zaměřuje na identifikaci syrové
109
a tepelně opracované zvěřiny a odhalení možné záměny za maso hovězí, pomocí metody PCR za použití druhově specifických primerů a metody PCR-RFLP za použití dvou vhodných restrikčních enzymů. Tyto vysoce citlivé a specifické metody umožňují efektivně a rychle identifikovat zvěřinu, která je běžně dostupná v ČR a odhalit její možnou záměnu. Tato studie je finacována projektem IGA 8/2013/FVHE „Druhová identifikace masa volně žijící zvěře pomocí molekulárně genetických metod”. Seznam literatury: Girish P. S., Anjaneyulu A. S., Viswas K. N, Shivakumar B. M., Anand M., Patel M., Sharma B., 2005: Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of mitochondrial 12S rRNA gene. Meat Science, 70 (1): 107–112. Mafra I., Ferreira I. M. L. V. O., Oliveira M. B. P. P.O., 2008: Food authentication by PCR-based methods. European Food Research and Technology, 227 (3): 649–665. Rojas M., González I., Fajardo V., Martín I., Hernández P. E., García T., Martín R., 2008: Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism authentication of raw meats from game birds. Journal of AOAC International, 91 (6): 1416–1422.
110
Využití metody RT-PCR v diagnostice genové exprese u dania pruhovaného (Danio rerio) vystaveného účinku norfloxacinu Ondřej Pána1, Radka Dobšíková1, Marta Bartošková1, Zuzana Široká1, Veronika Lesiuková2 1
Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno 2
Student, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno Úvod
Primárním zdrojem kontaminace životního (vodního) prostředí léčivy a jejich metabolity jsou pacienti. Léčiva jsou z organizmu vylučována v nezměněné formě, popř. ve formě svých metabolitů. Prostřednictvím splaškových vod jsou léčiva a jejich metabolity transportovány do čistíren odpadních vod, kde mnoho z nich není z důvodu své stability degradováno a dostává se přes tento systém čistíren odpadních vod dále do povrchových vod. Ve vodním prostředí tato xenobiotika nejen ovlivňují přirozená biospolečenstva a biosystémy, ale hlavně se díky vodním organizmům používaným v naší kuchyni vracejí ke člověku jakožto finálnímu článku potravního řetězce. Z hlediska odolnosti patří fluorochinolony mezi polutanty, které jsou v životním prostředí nesnadno biodegradovány mikroorganizmy. Rezidua léčiv v akvatickém prostředí mohou významně ovlivnit fyziologické funkce vodních živočichů (Kotyza a kol., 2009). Norfloxacin patří do skupiny farmakologicky aktivních látek hojně využívaných v humánní i veterinární medicíně jako chemoterapeutikum. Jedná se o léčivou látku patřící do skupiny fluorochinolonů 2. generace, která se používá při terapii infekcí a zánětů převážně močopohlavního ústrojí. Mechanizmus účinku norfloxacinu spočívá v inhibici DNA gyrázy bakterií (Šimůnek a Smola, 1998). Cílem studie je vyhodnocení účinku norfloxacinu na dánio pruhované. Vliv byl posuzován za pomocí stanovení vybraných biomarkerů oxidativního stresu a stanovením exprese specifických cílových genů za využití molekulárně biologické metody RT-PCR. Materiál a metodika V rámci studie byly provedeny dva pokusy na testovaném organizmu – rybě druhu dánio pruhované (Danio rerio). První pokus probíhal dle metodiky OECD 203 (test akutní toxicity). Doba trvání pokusu byla 96 hodin a test probíhal semistatickou metodou. Cílem pokusu bylo stanovení rozpětí koncentrací pro následný růstový test (OECD 215).
111
V testu dle metodiky OECD 215 (růstový test na juvenilních rybách) bylo celkem 636 (53 ks ryb/akvárium) kusů testovaných ryb vystaveno pěti vzrůstajícím koncentracím norfloxacinu (0.0001mg l-1; 0.1 mg l-1; 1 mg l-1; 10 mg l-1 a 30 mg l-1), jedna skupina byla kontrolní. Každá skupina byla testována duplicitně. Test probíhal průtočnou metodou ve dvanácti 30-ti litrových akváriích. Na konci testu (28. den) byly ryby usmrceny a z části z nich byl odebrán a při - 86 °C zamražen vzorek hepatopankreatu pro kvantitativní real-time PCR. Druhá část ryb byla zamražena při - 86 °C a poté použita pro stanovení biomarkerů oxidativního stresu. Stanovení biomarkerů oxidativního stresu Homogenizace zmražených vzorků proběhla ve fosfátovém pufru. Všechna spektrofotometrická měření byla provedena na mikrotitračních destičkách s použitím přístroje Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Ke stanovení malondialdehydu (MDA) je využíván TBARS test (thiobarbituricacid reactive substances). Principem metody je stanovení barevných adduktů, které vznikají reakcí produktů lipidní peroxidace s kyselinou thiobarbiturovou. Tyto produkty jsou následně spektrofotometricky kvantifikovány při 535 nm (Uchiyama and Mihara 1978, Livingstone et al. 1989, Surai et al. 1996). Metody měření aktivity glutation peroxidázy (GPx) a aktivity glutathion reduktázy (GR) jsou založeny na katalýze přeměny oxidovaného glutathionu (GSSG) na glutathion redukovaný (GSH) za spotřeby NADPH (Carlsberg a Mannervik 1985). Aktivita GR je stanovována dle úbytku množství NADPH v reakci spektrofotometricky při 340 nm. Katalytická koncentrace glutathion-S-transferázy (GST) byla měřena spektrofotometricky na základě detekce tvorby konjugátu mezi redukovaným glutathionem a substrátem 1-chlor-2,4dinitrobenzenem (Habig et al. 1974) při 340 nm. Katalytická aktivita katalázy byla měřena na základě poklesu H2O2 při 240 nm spektrofotometricky (Aebi, 1984).
Kvantitativní real-time PCR Vzorky hepatopankreatu zamražené pro real-time PCR byly zhomogenizovány a následně z nich byla pomocí komerčních kitů za použití přístroje MagMax™ (Applied Biosystems) izolována RNA. Vyizolovaná RNA byla technikou reverzní transkripce převedena na cDNA nutnou pro vlastní qRT-PCR. K PCR reakci byly jako primery použity vybrané cytochromy, které se účastní metabolizace xenobiotik u dánia pruhovaného (Goldstone et al. 2010), a sice CYP1A, CYP3C4 a jako
112
housekeeping gen byl použit B2M (beta-2-microglobulin). Výsledky kvantitativní real-time PCR se v současné době statisticky zpracovávají. Výsledky V tabulce 1 je uvedeno vyhodnocení výsledků parametrů oxidativního stresu u dánia pruhovaného (Danio rerio) vystaveného dlouhodobému účinku norfloxacinu. Tabulka1: Vybrané parametry oxidativního stresu u dánia pruhovaného
skupiny
GPx (nmol min-1 mg protein-1) ±SE
TBARS (nmol g-1 vzorku) ±SE
GR (nmol min-1 mg protein-1) ±SE
kontrola
17,16 ± 1,09
21,63 ± 1,19
10,59 ± 0,58
131,86 ± 4,41
107,36 ± 4,18
18,24 ± 1,25
32,22 ± 3,76
11,34 ± 0,74
163,16 ± 5,33 **
26,57 ± 4,35
12,96 ± 2,74
137,49 ± 7,00
28,01 ± 5,22
13,41 ± 1,65
147,64 ± 4,01
35,86 ± 3,68
10,42 ± 0,54
152,06 ± 6,81
22,54 ± 4,42
12,18 ± 0,58
145,03 ± 2,86
128,29 ± 5,67 ** 128,37 ± 5,24 ** 149,35 ± 5,95 ** 127,53 ± 3,28 ** 145,96 ± 4,72 **
0.0001 mg l1
0.1 mg l-1 1 mg l-1 10 mg l-1 30 mg l-1
45,86 ± 5,34 ** 39,92 ± 6,14 ** 32,12 ± 3,48 ** 30,24 ± 2,01 **
GST (nmol CAT (µmol min-1 mg min-1 mg -1 protein ) ±SE protein -1) ±SE
Závěr Z výsledků měření parametrů oxidativního stresu vyplývá, že norfloxacin neovlivnil aktivitu glutathion reduktázy (GR), rovněž nebyla ovlivněna hodnota TBARS. Byl prokázán statisticky vysoce významný nárůst aktivity GPx v koncentracích 0,1 mg l-1; 1 mg l-1; 10 mg l-1 a 30 mg l-1 (45.86, 39.92, 32.12 a 34.24 nmol min-1 mg protein-1) v porovnání se skupinou kontrolní (17.16 nmol min-1 mg protein-1). Dále byl prokázán signifikantní nárůst aktivity CAT, kdy aktivita v kontrolní skupině byla 107.36 µmol min-1 mg protein-1 a aktivita v testovaných koncentracích 0.0001 mg l-1; 0.1 mg l-1; 1 mg l-1; 10 mg l-1 a 30 mg l-1 byla 128.29, 128.37, 149.35, 127.53 a 145.96 µmol min-1 mg protein-1. Při sledování aktivity GST byl zjištěn signifikantní nárůst aktivity tohoto enzymu pouze v environmentální koncentraci (0.0001 mg l-1 – 163.16 nmol min-1 mg protein-1) v porovnání se skupinou kontrolní (131.86 nmol min-1 mg protein-1).
Práce byla financována v rámci projektu IGA 19/2013/FVHE. Literatura Seznam použité literatury a citovaných zdrojů je k dispozici u autorů.
113
Vliv oxichloridu měďnatého na vývojová stádia vodních organizmů Ševčíková Marie, Modrá Helena, Plhalová Lucie, Lenka Sedláčková, Tomáš Král Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Oxichlorid měďnatý je účinnou látkou řady fungicidních přípravků používaných na ochranu rostlin. Oxichlorid měďnatý představuje důležitý zdroj mědi v půdě i ve vodním prostředí (WHO, 1998). Měď je pro všechny vodní organizmy velmi toxická (Oliveira-Filho et al., 2004). Jedním z mechanizmů toxicity mědi je podíl na vzniku oxidativního stresu, prostřednictvím Fentonovi reakce (Di Giulio a Meyer, 2008). Cílem práce bylo posoudit vliv oxichloridu měďnatého na vybrané parametry oxidativního stresu, s přihlédnutím k rozdílné citlivosti vývojových stádií vodních organizmů. Materiál a metodika V rámci projektu byl proveden embryonální test toxicity (metodika OECD 212) a embryolarvální test toxicity (metodika OECD 210) na kapru obecném a embryonální test toxicity na drápatce vodní (metodika FETAX). V projektu byly využity vzorky hepatopankreatu z již proběhlého subchronického testu toxicity na kapru obecném. Ve všech zmíněných testech toxicity byl použit přípravek Kuprikol 50, který obsahuje 84 % oxichloridu měďnatého. V embryonálním a embryolarválním testu toxicity na kapru obecném byly použity koncentrace přípravku Kuprikol 50: 10, 40, 100, 200 a 400 µg/l a v subchronickém testu toxicity koncentrace 40 a 80 µg/l. V embryonálním testu toxicity na drápatce vodní byly použity koncentrace 0,5; 5; 10; 20 a 50 mg/l. Antioxidační enzymy (glutathion reduktáza, glutathion peroxidáza, kataláza), detoxikační enzym glutathion-S-transferáza a produkty lipoperoxidace (metoda TBARS) byly stanoveny spektrofotometrickými metodami. Pro stanovení byl použit celotělní homogenát z embryolarválního testu toxicity a homogenát hepatopankreatu ze subchronického testu toxicity na kapru obecném. Statistické zpracování dat bylo provedeno v programu Unistat 5.6.
Výsledky Embryonální test toxicity na kapru obecném a na drápatce vodní Žádná z testovaných koncentrací nevyvolala u embryí zvýšení mortality ani zvýšený výskyt malformací. Embryolarvální test toxicity na kapru obecném
114
V průběhu testu byl pozorován zvýšený výskyt vývojových abnormalit (Tabulka 1). Nejčastěji pozorované defekty byly osové deformity a edém žloutkového váčku. Vzrůstající výskyt vývojových abnormalit koresponduje se vzrůstající koncentrací testované látky. Výsledky parametrů oxidativního stresu jsou uvedeny v tabulce 2a. Míra lipidní peroxidace (TBARS) je statisticky významně (p˂0,01) zvýšena u koncentrací 40, 100, 200 a 400 µg/l Kuprikolu 50 v porovnání s kontrolou. Tabulka 1. Výskyt vývojových abnormalit u kapra obecného. Posuzováno 6. den průběhu embryolarválního testu, n=30. Koncentrace Kuprikol 50 (µg/l) Výskyt abnormalit (%)
Kontrola 0,0
10
40
100
200
400
3,2
0,0
6,7
10,3
27,6
Tabulka 2a. Výsledky parametrů oxidativního stresu – embryolarvální test na kapru obecném (n=10). Koncentrac e Kuprikol 50 0 10 40 100 200 400 ** p˂0,01
GR
GPx
CAT
GST
TBARS
7,31 ± 0,56 8,77 ± 0,76 18,23 ± 2,81 18,99 ± 3,01 17,04 ± 1,62 26,02 ± 4,09
35,54 ± 3,16 28,83 ± 2,38 24,02 ± 2,20** 26,39 ± 2,59 22,32 ± 1,90** 35,32 ± 4,24
23,89 ± 1,38 22,64 ± 1,13 20,87 ± 1,20 21,71 ± 0,95 21,17 ± 1,18 23,96 ± 2,06
90,17 ± 1,33 94,82 ± 6,02 85,81 ± 2,79 84,04 ± 2,89 78,40 ± 3,72 91,97 ± 7,28
7,31 ± 0,56 8,77 ± 0,76 18,23 ± 2,81** 18,99 ± 3,01** 17,04 ± 1,62** 26,02 ± 4,09**
Subchronický test toxicity na kapru obecném Výsledky parametrů oxidativního stresu jsou uvedeny v tabulce 2b. Aktivita detoxikačního enzymu glutathion-S-transferázy byla statisticky významně (p˂0,01) snížena v koncentraci 80 µg/l Kuprikolu 50, ve srovnání s kontrolou i druhou testovanou koncentrací. Míra lipidní peroxidace stoupá s koncentrací testované látky, se statisticky významným rozdílem mezi kontrolní skupinou a koncentrací 80 µg/l Kuprikolu 50. Tabulka 2b. Výsledky parametrů oxidativního stresu – subchronický test na kapru obecném (n=12); a,b označují statisticky významně ( p˂0,01) odlišné hodnoty.
115
Koncentrac e Kuprikol 50 0
GR
GPx
CAT
GST
TBARS
97.69 ± 6,66a 10,15 ± 1,79a 106,98 ± 40 7,13 ± 1,53 378,44 ± 56,34 251,97 ± 45,41 12,10 ± 2,55a,b 11,91a 80 6,23 ± 0,86 372,15 ± 6,05 236,98 ± 42,85 83,56 ± 11,22b 15,22 ± 5,74b Hodnoty v tabulce 2a a 2b jsou uvedeny jako průměr ± SE; Kuprikol 50 (µg/l); GR – glutathion 6,74 ± 1,20
318,59 ± 52,92 277,34 ± 63,22
reduktáza (nmol NADPH/min/mg proteinu); GPx – glutathion peroxidáza (nmol NADPH/min/mg proteinu); CAT – kataláza (µmol H202/min/mg proteinu); GST – glutathion-S-transferáza (nmol/min/mg proteinu); TBARS - Thiobarbituric Acid Reactive Substances (nmol/g tkáně). Závěr Na základě získaných výsledků lze potvrdit, že oxichlorid měďnatý je schopen vyvolat oxidativní poškození, lipidní peroxidaci, u různých vývojových stádií kapra obecného. Enzymy zapojené do antioxidativní obrany organizmu nejsou testovanou látkou jednoznačně ovlivněny. Antioxidativní enzymy se účastní především akutní fáze obrany organizmu. V našem případě byly enzymy analyzovaný po 30 dnech expozice. V té době již pravděpodobně mohlo dojít ke stabilizaci jejich aktivity. Zvýšený výskyt vývojových deformit 6. den vývoje kapra obecného souvisí s kritickým obdobím, přechodem z embryonálního stádia do larválního. Vzhledem k tomu, že jsme nepozorovali negativní vliv oxichloridu měďnatého na embrya, lze konstatovat, že citlivější vůči jeho působení jsou larvální a juvenilní stádia kapra obecného. Poděkování: Projekt byl finančně podpořen grantem IGA VFU Brno 22/2013/FVHE. Seznam literatury: DI GIULIO, R.T.; MEYER, D.E. Reactive oxygen species and oxidative stress. In The toxicology of fishes. 1st edition. Boca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group, 2008. Capitol 6, p. 273-324. OLIVEIRA-FILHO, E.C.; LOPES, R.M.; PAUMGARTTEN, P.M.J. Comparative study on the susceptibility of freshwater species to copper-based pesticides. Chemosphere, 2004, vol. 56, p. 369374. WHO (1998): Environmental health criteria, Copper. WHO, Geneva.
116
Výskyt baktérií čeledi Enterobacteriaceae s produkcí ESBL v syrovém mléce a mechanismy jejich rezistence Alena Skočková , Renáta Karpíšková , Kateřina Bogdanovičová1, Marta Dušková1, Ines Lačanin1 1
1
1,2
Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno 2
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Brno Úvod
V potravinářském průmyslu bývají baktérie z čeledi Enterobacteriaceae využívány zejména jako indikátorové mikroorganismy k posouzení hygienické kvality potravin a potravinových surovin. Zástupci některých rodů této čeledi jsou však i baktérie patogenní. Používání antimikrobiálních látek v živočišné produkci má za následek výrazný nárůst rezistentních kmenů (Ojer-Usoz et al., 2013), s čímž souvisí značný pokles v počtu antibiotik účinných při léčbě bakteriálních infekcí (Scaria et al., 2010). Jedním z nejdůležitějších mechanismů rezistence u baktérií z čeledi Enterobacteriaceae je produkce enzymů β-laktamáz hydrolyzující β-laktamová antibiotika. Významné jsou zejména širokospektré β-laktamázy (ESBL), které jsou schopny hydrolyzovat cefalosporiny třetí generace a monobaktamy. Geny kódující produkci ESBL jsou lokalizovány na plazmidu, a tím dochází k jejich snadnému přenosu na jiné baktérie (Kanamori et al., 2011). Nárůst rezistence mezi baktériemi z čeledi Enterobacteriaceae je významným problémem, který si žádá pozornost. Proto cílem této práce bylo zjistit, zda a v jaké míře může být syrové mléko zdrojem rezistentních baktérií čeledi Enterobacteriaceae s produkcí širokospektrých β-laktamáz (ESBL) a tudíž i potencionálním rezervoárem genů antibiotické rezistence. Materiál a metodika V roce 2013 bylo odebráno a vyšetřeno 74 vzorků syrového kravského mléka z 22 farem v České republice. Všechny vzorky byly odebírány v pravidelných časových intervalech v průběhu laktace. Mléko bylo odebíráno do sterilních vzorkovnic a převáženo v izotermických obalech do laboratoře k okamžitému zpracování. Vzorky mléka byly analyzovány na přítomnost baktérií čeledi Enterobacteriaceae za použití referenční metody ČSN ISO 21528-2 a stanovení počtu β-glukuronidázopozitivních Escherichia coli (E. coli) bylo provedeno metodou ČSN ISO 16649-2. Současně bylo provedeno i pomnožení vzorku v pufrované peptonové vodě (PPV, Oxoid, VB) při 37 °C po dobu 24 hodin aerobně, s následnou kultivací na TBX agaru a pro záchyt ESBL na půdě MacConkey s přídavkem cefotaximu (2 mg.l-1) (MCA+CTX). Jednotlivé kolonie byly konfirmovány pomocí detekce oxidázy (OXItest, Pliva-Lachema, ČR) a biochemicky identifikovány pomocí Enterotestu (Pliva-Lachema,
117
ČR). Konfirmace suspektních izolátů E. coli spočívala v detekci oxidázy (OXItest, Pliva-Lachema, ČR) a v posouzení tvorby indolu (COLItest, Pliva-Lachema, ČR). Diskovou
difúzní
metodou
byla
testována
rezistence
k
13
terapeuticky
významným
antimikrobiálním látkám: ampicillin - AMP, amoxicillin/clavulanic acid - AMC, cefotaxime - CTX, chloramphenicol - CMP, streptomycin - STR, kanamycin - KAN, gentamycin - GEN, sulfamethoxazole/trimethoprim - SXT, trimethoprim - TMP, tetracycline - TET, nalidixic acid NAL, ciprofloxacin - CIP, and colistin - COL. Stanovení bylo provedeno podle metodiky CLSI (2006a), antibiotické disky byly získány od firmy Oxoid (VB). Vyhodnocení bylo provedeno dle kritérií uvedených v CLSI (2006b). U izolátů rezistentních k β-laktamovým antibiotikům byla metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) zjišťována přítomnost genů blaTEM, blaSHV, blaCTX-M a byl proveden double disk synergy test (DDST) k průkazu produkce ESBL. Výsledky Baktérie z čeledi Enterobacteriaceae byly detekovány u 70 (94,6 %) vzorků syrového kravského mléka. Kromě E. coli, která byla detekována u všech pozitivních vzorků, byla zjištěna přítomnost i dalších zástupců této čeledi (Tab. 1). Počty baktérií čeledi Enterobacteriaceae v syrovém mléce se pohybovaly od <5 až >4,7.104 KTJ/ml. Tab. 1 Baktérie čeledi Enterobacteriaceae v syrovém kravském mléce
Baktérie
Zastoupení v syrovém mléce n % 70 94,6 4 5,4 11 14,9 1 1,4 2 2,7 3 4,1 2 2,7
Rezistentní k β-laktamům
Geny rezistence
n 11 1 6 2 3 1
blaTEM + (5) + (1) -
% 10,3* 25,0 54,5 100 100 50,0
E. coli Hafnia alvei Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes 2 2,7 1 50,0 Cronobacter sakazakii 3 4,1 2 66,6 Kluyvera ascorbata Yersinia spp. 5 2,7 3 60,0 8 11,0 6 75,0 Serratia odorifera 2 2,7 Serratia ficaria 3 4,1 3 100 Serratia marcescens 1 1,4 1 100 Morganella morganii * Z každého pozitivního vzorku odebrány 1-2 izoláty E. coli.
blaSHV blaCTX-m + (2) -
-
Celkem bylo získáno 107 izolátů E. coli a 47 izolátů dalších zástupců čeledi Enterobacteriaceae. Rezistence k minimálně jedné antimikrobiální látce (AML) byla zjištěna u 43 (27,9 %) izolátů,
118
přičemž nejméně často byla rezistence detekována u izolátů E. coli (12,2 %). U ostatních zástupců čeledi byla rezistence k nejméně jedné AML zjištěna u většiny izolátů (63,8 %). Rezistence k βlaktamovým antibiotikům byla potvrzena nejčastěji jak u izolátů E. coli (10,3 %), tak u ostatních zástupců čeledi Enterobacteriaceae (61,7 %). Častěji byla detekována také rezistence k tetracyklinu (9,1 %) a streptomycinu (7,1). Mezi získanými izoláty byly detekovány také multirezistentní izoláty (4,5 %), tj. izoláty rezistentní k 3 a více skupinám AML. Fenotypy rezistence těchto izolátů byly následující: AMP-AMC-CMP-STR-KAN-GEN-SXT-TMP-TET (E. coli), AMP-STR-KAN-GENSXT-TMP-TET (E. coli), AMP-STR-KAN-SXT-TMP-TET (E. coli, Klebsiella oxytoca), AMPSTR-TET (E. coli), AMP-STR-KAN-TET (E. coli), AMP-CMP-NAL (Klebsiella pneumoniae). Metodou PCR byla prokázána přítomnost genů blaTEM a blaSHV (Tab. 1). Gen blaCTX-m typický pro producenty ESBL nebyl detekován u žádného z izolátů. U žádného ze získaných izolátů také nedošlo k charakteristické deformaci zón při metodě DDST, takže produkce ESBL byla vyloučena. Závěr Z uvedených výsledků vyplývá, že rezistentní baktérie čeledi Enterobacteriaceae se v syrovém kravském mléce běžně vyskytují. Nejčastěji detekovaným zástupcem čeledi byla E. coli, u které se rezistence k AML vyskytovala méně často než u ostatních bakteriálních druhů, ale výskyt multirezistentních kmenů byl častější. Na žádné ze sledovaných farem nedocházelo k výrazné kumulaci rezistentních kmenů. U žádného ze získaných izolátů nebyla prokázána produkce ESBL, ale geny blaTEM a blaSHV zodpovědné za rezistenci k β-laktamům byly detekovány u několika izolátů. Tyto geny se mohou přenášet horizontálně i na další gramnegativní baktérie a proto představují potenciální riziko jejich dalšího šíření v potravinovém řetězci. Seznam literatury KANAMORI, H., NAVARRO, R.B., YANO, H. et al. Molecular characteristics of extendedspectrum β-lactamases in clinical isolates of Enterobacteriaceae from the Philippines. Acta Tropica. 2011, vol. 120, no. 1-2, p. 140-145. OJER-USOZ, E., GONZÁLEZ, D., VITAS, A.I. et al. Prevalence of extended-spectrum βlactamase-producing Enterobacteriaceae in meat products sold in Navarra, Spain. Meat science. 2013, vol. 93, no. 2, p. 316-321. SCARIA, J., WARNICK, L.D., KANEENE, J.B., MAY, K., TENG, C.H., CHANG, Y.F. Comparison of phenotypic and genotypic antimicrobial profiles in Escherichia coli and Salmonella enterica from the same dairy cattle farms. Molecular and Cellular Probes. 2010, vol. 24, no. 6, p. 325-345. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Interní grantové agentury VFU Brno 15/2013/FVHE.
119
Sledování dopadu působení stresu v důsledku předtransportní manipulace na hladinu stresových ukazatelů v krvi brojlerových kuřat Gabriela Želinská, Iveta Bedáňová, Eva Voslářová, Petra Hrabčáková, Zuzana Purmenská Ústav veřejného veterinářství, ochrany zvířat a welfare, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Brojlerová kuřata jsou během přepravy na jatka vystavena řadě stres vyvolávajících faktorů, které by mohly mít dopad na zdravotní stav i kvalitu masa. Výsledkem stresové reakce je produkce aktivních látek, jako jsou katecholaminy, adrenokortikotropní hormon (ACTH) a glukokortikoidy (von Borrell, 2001). Tyto látky jsou součástí adaptace na stres (Moynihan, 2003) a mohou být použity jako markery stresových situací (Möstl and Palme, 2002). Nedávné studie u prasat ukazují, že akutní stres může ovlivňovat i produkci neopterinu a biopterinu (Breineková et al., 2007). Podle Smutné et al. (2010), lze stanovení biopterinu a neopterinu využít také jako markery stresového zatížení organismu. Cílem této práce bylo posoudit vliv délky trvání umístění brojlerů do přepravních kontejnerů na plazmatickou hladinu biopterinu a neopterinu. Materiál a metodika V pokusu bylo použito 90 brojlerů typu HUBBARD, kteří byli přivezeni z komerčního chovu ve stáří 35 dnů. Byli ustájeni v podmínkách odpovídajících technologickému postupu pro výkrm daného hybridu a chováni na hluboké podestýlce v definovaných podmínkách (teplota, vlhkost, světelný režim) po dobu 7 dnů (aklimatizace). Krmeni byli komerční krmnou směsí (BR3) a napájeni zdravotně nezávadnou vodou. Ve 42. dnu stáří byli brojleři rozděleni do 3 skupin: 1 kontrolní (n = 30) a 2 pokusné (2 x n = 30). 15 brojlerům z kontrolní skupiny byla odebrána krev punkcí v. basilica pro stanovení pterinů, kortikosteronu a biochemických ukazatelů ihned po odchytu z kóje (Kontrola I) a dalším 15 až za 24 h (Kontrola II). První pokusná skupina v počtu 30 brojlerů byla po odchytu z kóje umístěna do transportních kontejnerů při hustotě min. 160 cm2/kg stanovenou v Nařízení Rady (ES) č. 1/2005. Zde byli brojleři ponecháni 2 hodiny. 2. pokusná skupina v počtu 30 brojlerů byla po odchytu z kóje umístěna do transportních kontejnerů při hustotě min. 160 cm2/kg, zde byli brojleři ponecháni 4 hodiny. U každé pokusné skupiny byla u 15 brojlerů odebrána krev ihned po uplynutí příslušné doby umístění v kontejnerech (Odběr I) a u zbývajících 15 brojlerů až po 24 hodinách (Odběr II). Krev byla odebírána na heparin punkcí v. basilica pro stanovení pterinů, kortikosteronu a biochemických ukazatelů. Ihned po odběru byla získána plasma odstředěním krve při 3000 rpm po dobu 15 minut. Vzorky plazmy byly zmraženy při -80°C. Koncentrace kortikosteronu v plasmě byla stanovena pomocí komerčních ELISA kitů (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI).
120
Biochemická analýza krve byla provedena biochemickým analyzátorem KONELAB 20i (ThermoScientific). Neopterin a biopterin byl stanoven pomocí HPLC s fluorometrickou detekcí (Carru et al., 2004). Všechny vzorky a standardy byly při manipulaci chráněny před světlem. HPLC analýza byla provedena na následující koloně: Zorbax Eclipse XBD – C 18 (150 x 4.6 mm), 5 – micron. Izokratická eluce byla provedena při průtoku 0,9 ml/min a složení mobilní fáze voda/acetonitril 98/2 (v/v) při 35°C. K detekci byl použit fluorescenční detektor s nastavenou excitační vlnovou délkou 353 nm a emisní vlnovou délkou 438 nm pro selektivní detekci pterinů. Výsledky byly analyzovány pomocí programu UNISTAT 5.1 (Unistad Ltd., GB). Byla použita dvoufaktorová ANOVA a následně Tukey test pro zjištění statistické významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých dvojic skupin. Pro zjištění závislostí byla počítána Pearsonova korelace. Výsledky Tabulka č. 1: Vybrané biochemické ukazatele u brojlerů (n = 90) umístěných v přepravních kontejnerech po různou dobu (0h, 2h, 4h) při odběru krve ihned a po 24 hodinách (Odběr I a II) Umístění brojlerů do přepravních kontejnerů mělo vliv na zvýšení hladiny kortikosteronu v plasmě, Faktor: Ukazatel CORT (ng/ml) Neopterin (nmol/l) Biopterin (nmol/l) GLU (mmol/l) CHOL (g/l) LACT (mmol/l) LDH (mkat/l) TG (mmol/l) TP (g/l) UA (mkat/l)
Odběr
Doba v kontejnerech
ANOVA Významnost (P) Odběr Doba OxD (O) (D)
0h
2h
4h
SEM
I.
II.
SEM
0,31b
0,72a
0,67a
0,07
0,82a
0,31b
0,05
<0,001
<0,001
<0,001
14,0a
13,2a
12,1a
1,07
15,6a
10,7b
0,72
<0,001
0,046
0,059
55,8a
58,2a
61,6a
2,54
59,3a
57,8a
2,12
N.S.
0,048
<0,001
16,9a
17,1a
17,3a
0,31
17,1a
17,1a
0,25
N.S.
N.S.
N.S.
3,21a
3,30a
3,15a
0,1
3,13b
3,32a
0,08
0,018
N.S.
N.S.
5,10a 4,70a,b 4,34b
0,02
4,85a
4,58a
0,02
N.S.
0,008
0,002
13,4b 17,4a,b 18,4a
2,04
14,9a
17,9a
1,68
N.S.
0,042
N.S.
0,96a
0,99a
0,39a
0,1
0,65b
1,20a
0,06
<0,001
0,042
<0,001
34,5a
32,9a
33,3a
0,95
32,1b
35,1a
0,72
<0,001
N.S.
N.S.
435,7a 378,7b 337,5b 21,8 337,2b 430,7a 16,9
<0,001
<0,001
N.S.
= různé indexy u průměrů ve stejném řádku a u stejného faktoru označují statisticky významný rozdíl (P < 0.05) přičemž nebyl zjištěn významný rozdíl mezi délkou pobytu brojlerů v kontejnerech. Na hladinu a,b
kortikosteronu v plasmě měla vliv doba odběru, po 24 hodinách hladina kortikosteronu významně
121
klesla v porovnání s odběrem provedeným okamžitě po uplynutí příslušné doby umístění v přepravních kontejnerech. Tabulka č. 2. Interakce doby umístění v přepravních kontejnerech a doby odběru pro plasmatický kortikosteron, neopterin, biopterin, laktát a triglyceridy u brojlerů (n = 90). Kortikosteron Neopterin Biopterin Odběr I.
II.
a,b
Doba v kontejnerech 0h (Kontr. I) 2h 4h 0h (Kontr. II) 2h 4h
(ng/ml)
Laktát
(nmol/ml) (nmol/ml) (mmol/l)
Triglyceridy (mmol/l)
0,31b,x 1,12a,x 1,04a,x
15,5a,x 15,9a,x 15,4a,x
51,1b,x 60,5a,b,x 66,4a,x
5,67a,x 4,37b,x 4,50b,x
0,87a,x 0,62a,b,y 0,46b,y
0,32a,x 0,33a,y 0,29a,y
12,9a,x 10,4a,b,y 8,77b,y
60,5a,x 55,9a,x 56,9a,x
4,53a,y 5,03a,x 4,19a,x
1,04b,x 1,37a,x 1,20a,b,x
0,048 0,442 1,056 0,113 0,043 SEM = různé indexy u průměrů ve stejném sloupci u jednotlivých odběrů (I., II.) označují statisticky
významný rozdíl (P < 0.05) x,y
= různé indexy u průměrů ve stejném sloupci u stejné doby umístění v přepravním kontejneru
(0h, 2h, 4h) označují statisticky významný rozdíl (P < 0.05) Hladina neopterinu v plasmě brojlerů se u pokusných skupin při odběru I nelišila od hladiny u kontrolní skupiny I. Po 24 hodinách však u obou pokusných skupin došlo k významnému poklesu hladiny neopterinu v porovnání s odběrem I. Nejnižší hladina neopterinu byla naměřena u pokusné skupiny, ponechané v přepravních kontejnerech 4 hodiny při odběru po 24 hodinách. Při odběru I byl zjištěn vliv délky doby umístění brojlerů v přepravních kontejnerech na hladinu biopterinu v plasmě ve smyslu významného zvýšení u pokusných skupin v porovnání s kontrolní skupinou I. U odběru po 24 hodinách se hladiny biopterinu u pokusných skupin nelišily v porovnání s kontrolní skupinou II. Nejvyšší hladina biopterinu byla naměřena při odběru I u pokusné skupiny umístěné v přepravních kontejnerech po dobu 4 hodiny. Byla zjištěna i vysoce významná korelace mezi hladinou kortikosteronu a biopterinu (r = 0,41; p < 0,001) i mezi hladinou kortikosteronu a neopterinu (r = 0,35; p < 0,001). Závěr Z výsledků vyplývá, že umístění do přepravních kontejnerů má vliv na okamžité zvýšení hladiny kortikosteronu a biopterinu v plasmě, proto lze uvažovat o biopterinu jako dalším možném indikátoru akutního stresu u drůbeže. Využití pterinů ke sledování hladiny stresové zátěže podporuje i zjištěná pozitivní korelace mezi kortikosteronem a hladinami sledovaných pterinů. Seznam literatury: Literatura je dostupná u autorů.
122
Příspěvky Fakulty farmaceutické
123
124
VLIV GERANYLOVANÝCH FLAVONOIDŮ NA EXPERIMENTÁLNĚ INDUKOVANOU KOLITIDU Zora Vochyánová1, Jan Hošek1, Alžběta Kružicová2 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Ústav humánní farmakologie a toxokologie2
Úvod Léčivé rostliny slouží již několik tisíc let jako prostředky léčby různých onemocnění. I když se jejich obliba historicky měnila, zájem o rostliny a jejich obsahové látky dnes opět vzrůstá. Rostliny jsou zdrojem objevů potenciálně účinných látek, které se v terapii uplatňují samostatně nebo jako doplňková léčba. V této práci jsme se zaměřili na studium geranylovaných flavonoidů. Flavonoidy jsou známé pro svou biologickou aktivitu, především antiflogistické [1] a antioxidační účinky [2]. Bohatým zdrojem geranylovaných flavonoidů je Paulownia tomentosa Steud. z čeledi Paulowniaceae. Různé části toho stromu jsou široce využívány v tradiční čínské medicíně v terapii bronchitid, ke snížení frekvence astmatických záchvatů, vykazuje hypotenzní a antibakteriální účinek [3]. Testované látky, diplakon a mimulon, byly izolovány z nezralých plodů pavlownie. V předchozích in vitro studiích byl potvrzen jejich vliv na expresi genů prozánětlivých cytokinů [4]. Cílem práce bylo zjistit účinnost těchto látek in vivo, na modelu dextran sulfátem (DSS) indukované kolitidy potkana. Materiál a metodika Uspořádání experimentu K pokusu byli použiti potkani kmene WISTAR Han® samčího pohlaví (AnLab, s.r.o.). Byly dodrženy standardní podmínky chovu stanovené vyhláškou č. 419/2012 Sb. Metodika pokusu byla schválená Odbornou komisí pro zajišťování dobrých životních podmínek pokusných zvířat VFU Brno. Zvířata byla rozdělena náhodným výběrem do pěti skupin. Zvířatům ve skupině A, B, C a D byla navozena kolitida perorální aplikací 10% (w/v) roztoku dextran sulfátu sodného v pitné vodě, ke které měli potkani neomezený přístup. DSS byl podáván po dobu 5 dní. Skupina E dostávala čistou pitnou vodu. Testované látky byly potkanům podávány profylakticky, a to 48 a 24 hodin před zahájením pětidenní aplikace DSS a v následujících dnech souběžně s DSS. Látky byly podávány perorálně gastrickou sondou pod slabou inhalační anestezií isofluranem. Zvířata ve skupině A a E dostávala pouze vehikulum, 4% gel z polyvinylpyrrolidonu (PVP K90). Skupině B byl podáván diplakon v dávce 25 mg/kg, skupině C mimulon (25 mg/kg) a skupině D sulfasalazin (25 mg/kg), léčivo běžně používané v terapii ulcerózní kolitidy.
125
V průběhu experimentu byla denně sledována váha zvířat, konzistence stolice a přítomnost krve ve stolici k určení indexu aktivity onemocnění. Experiment byl ukončen 8. den. Po uvedení zvířat do celkové anestezie jim byla odebrána krev z hrotu srdce. Zvířata byla usmrcena injekční aplikací přípravku T 61. Tlusté střevo bylo vyjmuto včetně caeca, očištěno fyziologickým roztokem, změřeno a zváženo k určení poměru váha/délka střeva. Byly odebrány vzorky pro histologické hodnocení. Zbytek střevní tkáně byl využit ke stanovení hladin proteinů spojených s antioxidační a protizánětlivou aktivitou. Histologie Pro histologické hodnocení byly odebrány vzorky z proximální a distální části tlustého střeva. Vzorky byly fixovány v 10% formalínu, zality do parafínových bloků. 1 µm řezy byly po obarvení hematoxylin-eosinem a dle van Giesona předány na Ústav patologické morfologie a parazitologie k vyhodnocení skóre [5], které zahrnovalo zhodnocení infiltrace zánětlivých buněk a rozsah ztráty krypt.
Analýza Western blot Lyzát střevní tkáně byl použit pro stanovení hladin superoxiddismutázy (SOD) 2 a katalázy (CAT). 80 µg proteinu bylo naneseno do jamek na SDS-PAGE, přeneseno na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla blokována 1 hodinu v 5% roztoku BSA v TBST. Inkubace s primární protilátkou probíhala při 4 °C přes noc (SOD2 1:1000, CAT 1:1000, ß-actin 1:5000), inkubace se sekundární peroxidázou značenou protilátkou 1 hodinu při laboratorní teplotě. Detekce byla provedena kolorimetricky (Bio-Rad, Opti-4CNTM Substrate Kit).
Statistická analýza Ke statistickému vyhodnocení byla použita ANOVA a Tukeyův nebo Bonferroniho post hoc test. Za statisticky významné byly považovány hodnoty p < 0,05.
Výsledky Podání DSS vyvolalo u zvířat výrazný váhový úbytek. Průjem se dostavil 3. den po podání DSS, krev ve stolici byla pozorována 4. den. Testované látky oddálily nástup příznaků a snížily váhový úbytek. Příznaky kolitidy byly nejvíce potlačeny u potkanů, kterým byl podáván diplakon. V neléčené skupině došlo 8. den pokusu ke dvěma úhynům, ve skupině léčené sulfasalzinem uhynulo jedno zvíře. Statisticky významné rozdíly v aktivitě onemocnění vykazovaly diplakon a mimulon ve srovnání s neléčenou skupinou 7. a 8. den pokusu.
126
Poměr váha/délka střeva se u neléčené skupiny statisticky významně zvýšil ve srovnání s intaktní skupinou, u testovaných látek nebylo mírné zvýšení poměru statisticky významné. Viditelné ulcerace střeva nebyly pozorovány v žádné skupině. Histologické změny po podání DSS zahrnovaly erozi povrchového epitelu, výrazné zkrácení krypt až jejich ložiskové chybění, zánětlivou infiltraci neutrofilů a makrofágů a výraznou fibroplazii. Projevy byly výraznější v distální části colon. Srovnání histologického skóre léčených skupin s neléčenou nepřineslo statisticky významné výsledky, mírnější změny byly zaznamenané u potkanů léčených diplakonem. Pomocí Western blotu byly stanoveny hladiny SOD2 a CAT, enzymů spojovaných s antioxidační aktivitou. Statisticky významně zvýšil expresi obou enzymů pouze mimulon. Závěr Zavedení a optimalizace metody DSS indukované kolitidy přináší možnost testování biologické aktivity látek in vivo. Diplakon a mimulon, látky, které prokázaly efekt na expresi prozánětlivých proteinů in vitro, dokázaly zmírnit symptomy kolitidy více než běžně používané léčivo sulfasalazin. Nejmenší nárůst indexu aktivity onemocnění vykazoval diplakon. U této látky byly rovněž mírnější histologické změny střevní tkáně. Expresi antioxidačních enzymů indukuje mimulon, čímž může zmírňovat oxidativní poškození střevní tkáně. Mechanismus účinku těchto flavonoidů je však ještě třeba objasnit dalšími testy. Seznam literatury: [1] GONZÁLEZ, R., BALLESTER, I., LÓPEZ-POSADAS, R., SUÁREZ, M. D., ZARZUELO, A., MARTÍNEZ-AUGUSTIN, O., SÁNCHEZ DE MEDINA, F.: Effects of Flavonoids and other Polyphenols on Inflammation. Food Science and Nutrition. 2011, 51, 331–362. [2] HAVSTEEN, B. H.: The biochemistry
and medical significance of the flavonoids.
Pharmacology &Therapeutics. 2002, 96, 67–202. [3] ŠMEJKAL, K., GRYCOVÁ, L., MAREK, R., LEMIERE, F., JANKOVSKÁ, D., FOREJTNÍKOVÁ, H., VANČO, J., SUCHÝ, V.: C-Geranyl Compounds from Paulownia tomentosa Fruits. Journal of Naturals Products. 2007, 70, 1244–1248. [4] HOŠEK, J., ZÁVALOVÁ, V., ŠMEJKAL, K., BARTOŠ, M.: Effect of Diplacone on LPSInduced Inflammatory Gene Expression in Macrophages. Folia Biologica (Praha). 2010, 56, 124–130. [5] TSUNE, I., IKEJIMA, K., HIROSE, M., YOSHIKAWA, M., ENOMOTO, N., TAKEI, Y., SATO, N.: Dietary Glycine Prevents Chemical-Induced Experimental Colitis in the Rat. Gastroenterology. 2003, 125, 775–785.
127
Vplyv ZnO nanočastíc na rastlinnú modelovú kultúru BY-2 Ballová Ľ1, , Kolovecká I1, Babula P1 1
Ústav přirodních léčiv, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod
Nanočastice sú látky, ktorých minimálne jeden rozmer je v rozmedzí 1-100 nanometrov. Nanočastice oxidu zinočnatého (ZnO NPs) sú vďaka svojim vlastnostiam široko používané v komerčných prípravkov (napr. UV ochranné filmy, elektronické zariadenia, stavebné materiály, kozmetické prípravky) (Wang 2004). Je dokázané, že ZnO NPs vykazujú závažnú toxicitu voči baktériám, riasam, ľudským bunkovým kultúram a myšiam (Heinlaan a kol. 2008; Kasemets a kol. 2009). Oblasť fytotoxikológie ZnO NPs je doteraz málo preskúmaná.
Materiál a metodika Bunková kultúra Nicotiana tabacum L. cv. Briliant Yellow-2 (BY-2) bola kultivovaná podľa protokolu v Murashige a Skoog médiu (MS) modifikovanom podľa Nagata (1992). Ku kultivačnému médiu MS boli pridané komerčne zakúpené ZnO NPs (<50 nm) (Sigma Aldrich, USA) v koncentráciách 0, 1, 10, 100 a 400 ng/ml. Paralelne bol použitý scavenger hydroxylových radikálov dimethylthiourea (DMTU).Vzorky boli zbierané v časových intervaloch 1, 2, 3 a 4 dni po pridaní ZnO NPs. Boli sledované parametre hodnotiace rast buniek a viabilitu buniek. Isoenzýmy vykazujúce peroxidázovú aktivitu boli separované na natívnom gély za nedenaturujúcich podmienok a detekované pomocou diaminobenzidínu ako substrátu. Množstvo enzýmu GR bolo stanovené analýzou Western Blot s imunodetekciou so sekundárnou protilátkou (AS06 181, anti rabbit, Agrisera, Švédsko). Stanovenie viability, množstva a lokalizácie ROS, RNS a Zn2+ v bunkách sa vykonávalo fluorescenčnou mikroskopiou (Babula 2012 a kol). Výsledky Predpokladá sa, že toxický účinok ZnO NPs spočíva v troch mechanizmoch. Prvý typ je založený na toxicite uvoľneného iónu Zn2+, čo vedie k porušeniu bunkovej homeostázy zinku a nakoniec k bunkovej smrti. Druhý spôsob spočíva v povrchovej interakcii, pri ktorej môže dochádzať k produkcii toxických substancií napr. reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a dusíka (RNS). ZnO NPs je navyše fotokatalyzátor a zvyšuje generovanie ROS po ožiarení.
128
Tretia možnosť spočíva v priamom vzájomnom pôsobení ZnO NPs na biologické systémy a ich následným poškodením (Ma a kol. 2013). V našej štúdii sme zistili, že schopnosť buniek prežívať a ich rast (sledovaný pomocou parametrov - čerstvá hmotnosť a objem sedimentovanej kultúry vzhľadom k celkovému objemu suspenzie) klesal zo zvyšujúcou sa koncentráciou ZnO NPs. V experimente sme vizualizovali 4 izoformy enzýmu peroxidázy. Zvýšená aktivita všetkých štyroch izoenzýmov bola zistená vo vzorke so 100 ng/ml a 400 ng/ml ZnO NPs v porovnaní s kontrolou (obr. 1). Hladina enzýmu GR v bunke bola zvýšená u všetkých vzoriek s ZnO NPs oproti kontrole. Vo vzorke s najvyššou koncentráciou ZnO NPs množstvo GR narástlo o 200 % oproti kontrole.
Relatívna kvantita %
Aktivita izoenzýmov peroxidázy 350 300 250
PER 1
200
PER 2
150 100
PER 3
50 0 0
1
10
100
400
PER 4
Nanočastice ZnO ng/ml
Obr. 1: Aktivita izoenzýmov peroxidázy u buniek BY-2 po expozícii 0, 1, 10, 100 a 400 ng/ml ZnO NPs na 4 deň..
Na overenie hypotézy, že ZnO NPs zvyšuje produkciu voľných radikálov kyslíka a dusíka, bola v experimentoch použitá modifikácia ich produkcie pridaním DMTU ako vychytávača hydroxylového radikálu. Úroveň viability a rastu buniek v kombinácii DMTU ZnO NPs bola porovnateľná s kontrolnou vzorkou bez nanočastíc. Vychytávanie voľných radikálov, pravdepodobne produkovaných ZnO NPs, eliminovalo negatívny vplyv ZnO NPs na bunkovú kultúru BY-2. Fluorescenčnou mikroskopickou vizualizáciou ROS a RNS bolo zistené ich zvýšené množstvo v bunkách kultivovaných s najvyššími koncentráciami ZnO NPs (100 a 400 ng/ml). Po pridaní DMTU ako scavengra hydroxylového radikálu ku vzorkám s ZnO NPs poklesla okrem hladiny ROS aj úroveň RNS. Ďalší predpoklad toxického účinku ZnO NPs je založený na uvoľnení iónu Zn2+. Metódou fluorescenčnej mikroskopie bolo pozorované zvýšenie voľných zinočnatých iónov po aplikácii ZnO NPs, a to v závislosti na aplikovanej koncentrácii.
129
Záver Výsledky našej štúdie po prvýkrát poskytujú informácie o negatívnom účinku ZnO NPs na bunkovú líniu tabaku BY-2. Fytotoxický účinok sa prejavil spomalením rastu, znížením viability, zvýšenou produkciou RNS a ROS, zvýšeným množstvom a aktiváciou enzýmov zúčastňujúcich sa oxidačno-redukčných procesov. Za pravdepodobný nežiaduci účinok ZnO NPs je zodpovedný oxidačný stres vyvolaný nanočasticami a zvýšené množstvo Zn2+ uvoľnených z ZnO NPs. Riešenie grantu IGA umožnilo optimalizovať nové mikroskopické techniky. Zaviedli sa individuálne postupy pre vizualizáciu ROS, RNS a voľných Zn2+, rovnako ako bunkových organel. Niektoré z týchto farbív boli v rastlinnej cytológii použité vôbec po prvýkrát. Ďalšou novozavedenou metodikou je stanovenie enzymatickej aktivity na gély. Po elektroforéze za nedenaturujúcich podmienok sa gél ofarbí špecifickými substrátmi, čím sa zistí aktivita izoenzýmov. Na rozdiel od spektrofotometrických stanovení, kde sa stanovuje celková aktivita, touto metódou je navyše možné stanoviť osobitne aktivitu jednotlivých izoenzýmov.
Zoznam literatúry HEINLAAN M. et al. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. In Chemosphere. ISSN: 0045-6535, 2008, vol. 71, no. 7, p. 1308-1316. BABULA et al. Effect of fluoranthene on plant cell model tobacco BY-2 suspension culture. In Environmental and Experimental Botany. ISSN 0098-8472, 2012, vol. 78, p. 117-126. KASEMETS Kasemets K, Ivask A, Dubourguier H.C., Kahru A. Toxicity of nanoparticles of ZnO, CuO and TiO2 to yeast Saccharomyces cerevisiae. In Toxicology in Vitro. ISSN: 08872333, 2009, vol. 23, no. 6, p. 1116-1122. MA, H., WILLIANS, P. L., DIAMOND, S. A. Ecotoxicity of manufactured ZnO nanoparticles - a review. In Environmental Pollution. ISSN: 0269-7491 , 2013, vol. 172, p. 76-85. NAGATA, T. NEMOTO, Y., HASEZAWA, S. Tobacco BY-2 cell-line as the hela-cell in the cell biology ofhigher-plants. Int. Rev. Cytol. ISBN 978-0-12-364532-6, 1992, vol. 132, p. 1– 30. WANG, Z. Zinc oxide nanostructures: growth, properties, and applications. Journal of Physics. ISSN 1361-648X (Online), 2004, vol. 16, p. R829-R858.
130
Vliv singletového kyslíku na expresi a transkripci antioxidačních enzymů Ondřej Neuwirth, Jakub Treml Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brn1 Úvod Oxidační stres je jev, při kterém není v rovnováze tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku (ROS/RNS) a obranný systém buňky. ROS/RNS tak mohou poškozovat okolní biomolekuly – nukleové kyseliny, proteiny a lipidy. Výzkum ukazuje, že s oxidačním stresem je spojen rozvoj mnoha nemocí (1). Existují in vitro řada antioxidačních metod založených na zhášení stabilního radikálu (DPPH, ABTS) nebo na reakcích s ROS či RNS (H 2 O 2 , HClO, NO.) (2). Ve výzkumu je ale snaha používat metody bližší reálným podmínkám v živé buňce. Na optimalizaci naší metody pro vyvolání oxidačního stresu byl zvolen peroxid vodíku (H 2 O 2 ), který je stabilní a přítomný i in vivo. Následně byl sledován vlivu látek na expresi antioxidačních enzymů: katalázy, superoxid dismutázy 1 a 2. Cílem práce byla syntéza endoperoxidů a optimalizace metodiky práce s buněčnou kulturou, vyvolání oxidačního stresu a měření exprese a aktivita antioxidačních enzymů. Materiál a metodika Syntéza endoperoxidů Endoperoxidy byly připraveny z derivátů naftalenpropionové kyseliny pomocí peroxidu vodíku za katalýzy molybdenanu sodného (viz schéma). COOH COOH
H2O2 Na2MO4 R
O O
1) R=H 2) R=CH3 3) R=CH2CH2COOH
R
Cytotoxicita k THP-1 buňkám Cytotoxicita endoperoxidů a jejich prekurzorů byla měřena pomocí kitu WST-1 od firmy Roche, postupovali jsme podle návodu výrobce. Inkubace látek s buňkami probíhala 24 hodin. Indukce exprese antioxidačních enzymů Prvním cílem naší práce bylo ověřit vliv samotného H 2 O 2 v koncentraci 0,5 mM na indukci antioxidačních enzymů. Po inkubaci jsme buňky z každé jamky (1,5×106 buněk) lyzovali pomocí 100 µl lyzačního pufru. Každý vzorek jsme poté rozdělili pomocí SDS-PAGE podle molekulové
131
hmotnosti. Vzorky z gelů jsme metodou Western blotu přenesli na PVDF membránu a vizualizovali použitím primárních a sekundárních protilátek. Antioxidační enzymy, u kterých jsme sledovali expresi, jsou kataláza, superoxid dismutáza 1 a 2 (SOD 1 a 2). Aktivita antioxidačních enzymů Vliv H 2 O 2 na aktivitu enzymu katalázy jsme měřili pomocí komerčně dostupného kitu od firmy CaymanPharma. Postupovali jsme dle návodu. Transkripce antioxidačních enzymů
Vliv H 2 O 2 na transkripci mRNA příslušného enzymu jsme testovaly pomocí techniky kvantitativní polymerázové řetězové reakce (q-PCR). Této metodě předcházela izolace mRNA z buněk a převedení na cDNA pomocí metody reverzní transkripce (RT).
Výsledky Cytotoxicita endoeperoxidů k THP-1 buňkám Testované endoperoxidy (E1-3) a jejich prekurzory (P1-3) jsme o koncentraci 1 mM. 120%
Viabilita
100% 80% 60% 40% 20% 0% Ctrl
P1
E1
P2
E2
P3
E3
Indukce exprese antioxidačních enzymů Výsledky Western blotu pro enzym katalázu jsou znázorněny na grafu 1. Je vidět mírný pokles při inkubaci 5 hodin. Množství exprimované katalázy ale roste a dosahuje maxima při 24 hodinové inkubaci. V grafu 2 a 3 je vidět mírný nárůst exprese SOD1 a pokles exprese SOD2 po 5 hodinách. 2,50
CAT
2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Ctrl
H2O2 5h
H2O2 12h
H2O2 24h
Graf č. 1 – Míra indukce exprese – enzym kataláza
132
3,00
1,60
SOD1
2,50
SOD2
1,40 1,20
2,00
1,00
1,50
0,80 0,60
1,00
0,40
0,50
0,20
0,00
0,00 ctrl
h2o2 5h
ctrl
h2o2 5h
Graf č. 2 a 3 – Míra indukce exprese – enzymy superoxid dismutáza 1 a 2 Aktivita antioxidačních enzymů Aktivita enzymu katalázy byla testována za stejných podmínek jako vliv na expresi toho to enzymu. Z výsledků vyplývá mírný nárůst aktivity enzymu po 5 a 24 hodinách. Jde však o statisticky nevýznamný nárůst. 120 100 80 60 40 20 0 Ctrl
H2O2 5h
H2O2 12h
H2O2 24h
nmol/min/ml
Graf č. 4 – Aktivita katalázy Seznam literatury: 1 COOKE M. S., OLINSKI R., EVANS M. D. Does measurement of oxidative damage to DNA have clinical significance? Clinica Chimica Acta, 2006, vol. 365, s. 30-49. 2 GOMES A et al. 2,3-Diarylxanthones as strong scavengers of reactive oxygen and nitrogen species: A structure–activity relationship study vivo. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, vol. 18, s. 67766784.
133
Izolace obsahových látek z rostliny Nasa triphylla PharmDr. Dagmar Jankovská, Ph.D., PharmDr. Daniela Veselá Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Nasa triphylla je rostlina z čeledi Loasaceae pocházející z jihu Severní Ameriky, Střední Ameriky a severní části Jižní Ameriky v podhůří And. Obsahové látky rostliny doposud nejsou podrobně prozkoumány, uvádí se však, že žahavé trichomy, pokrývající povrch celé rostliny, způsobují podobné podráždění jako trichomy kopřivy. [1] N. triphylla je v lidovém léčitelství Kostariky využívaná pro své protizánětlivé účinky. B. Badilla si ji proto vybrala ve své studii [2] pro zkoumání antiflogistické aktivity vodného extraktu, u něhož byla zjištěna antiflogistická aktivita srovnatelná s indomethacinem. Materiál a metodika Rostlinným materiálem byla celá sušená rostlina N. triphylla, sesbíraná roku 2012 v botanické zahradě v Teplicích. Identifikaci provedl Mgr. Filip Zpurný, Ph.D. (kurátor Botanické zahrady Teplice). Vzorek je pod názvem NT01 uchován v herbáriu Ústavu přírodních léčiv (FaF VFU). Rostlinný materiál (525 g) byl extrahován ethanolem a bylo získáno 15,2 g extraktu, který byl následně dělen na základě rozdílné polarity pomocí vytřepávání mezi nemísitelné kapaliny na podíl hexanový (3,95 g), chloroformový (3,89 g), ethylacetátový (0,22 g) a vodný (6,02 g). Pro další separaci byl vybrán hexanový a chloroformový podíl. Chloroformový podíl byl analyzován pomocí HPLC, která byla provedena na koloně SUPELCOSIL TM ABZ+Plus (15 cm × 4,6 mm, velikost částic 3 μm). Jako metoda byla použita gradientová eluce, složení mobilní fáze je zapsáno v tabulce č. 1, průtok byl 1 ml/min, teplota kolony 40 °C, DAD detekce byla prováděna při 254 a 280 nm (metoda 1). Hexanový podíl byl více lipofilní, proto bylo potřeba použít jinou kolonu a tedy i metodu. HPLC analýza byla provedena na koloně Ascentis® Express C8 (15 cm × 2,1 mm, velikost částic 2,7 μm) gradientovou elucí se složením mobilní fáze zapsaným v tabulce č. 2, s průtokem 0,3 ml/min, teplotou kolony 40 °C, DAD detekce proběhla při 254 a 280 nm (metoda 2). Chloroformový (NT-CH) a hexanový (NT-hex) podíl byly dále děleny pomocí sloupcové chromatografie. Jako stacionární fáze byl použit silikagel, složení mobilní fáze se lišilo dle separované frakce a bylo zvoleno na základě TLC analýzy. Pro NT-CH se mobilní fáze skládala z benzenu a ethylacetátu v poměru 5:3 (v/v), frakce byly sbírány přibližně po 100 ml a na závěr byl sloupec promyt methanolem. Získáno bylo 38 frakcí. V případě NT-hex byla mobilní fáze složena
134
z benzenu a ethylacetátu v poměru 25:2 (v/v), frakce byly opět odebírány přibližně po 100 ml a kolona byla promyta ethylacetátem a poté methanolem, výsledkem bylo 45 frakcí. Frakce byly analyzovány pomocí TLC a HPLC a spojeny na základě podobnosti. Sloupcovou chromatografií byla získána jedna čistá látka, NT-CH24-26, dále jsem se zabývala frakcí NT-CH1415. Tuto frakci jsem rozdělila na dvě části na základě rozdílné rozpustnosti v methanolu, takto byla získána čistá látka označená jako NT-CH14-15/B (v methanolu málo rozpustná). Získané látky byly identifikovány pomocí UV/Vis spektrometrie (měření spektra při HPLC analýze), IR spektrometrie (Nicolet Impact 400 D FT-IR), MS (Agilent HP 1100 LC/MSD Trap VL Series) a NMR (Bruker Avance 400 Ultrashield). Tabulka č. 1: Složení mobilní fáze
Tabulka č. 2: Složení mobilní fáze pro analýzu
pro analýzu chloroformové frakce
hexanové frakce
ACN
0,2%
MeOH
(%)
HCOOH (%)
(%)
0,00
62
23
15
0
25,00
90
0
10
0
25,01
100
0
0
29,00
100
0
0
ACN
0,2%
(%)
HCOOH (%)
0,00
10
90
36,00
100
40,00
100
Minuta
Minuta
Výsledky Ethanolický extrakt byl rozdělen pomocí vytřepávání mezi nemísitelné kapaliny na
c(TNFα) [pg/mL]
podíl hexanový (NT-hex), chloroformový (NT-CH), ethylacetátový (NT-EtAc) a vodný (NT-H 2 O). Jednotlivé podíly byly testovány na protizánětlivou aktivitu pomocí stanovení TNF-α metodou ELISA. Chloroformový a hexanový
podíl
vykazovaly
aktivitu
srovnatelnou s kontrolou prednisonem, díky čemuž byly vybrány pro další zpracování. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 1.
Obrázek č. 1: Výsledky měření TNF-α u jednotlivých podílů
Chloroformový a hexanový podíl byly podrobeny sloupcové chromatografii, byly získány frakce, které byly analyzovány a spojeny dle podobnosti. Dále jsem pracovala s frakcemi
135
chloroformového podílu, z něhož jsem získala dvě čisté látky: NT-CH14-15/B (v množství 32,1 mg) a NT-CH24-26 (v množství 113,1 mg). Frakce hexanového podílu budou předmětem dalšího zkoumání. Získané čisté látky byly identifikovány jako dvě známé sloučeniny: NT-CH14-15/B jako betulin, NT-CH24-26 jako skopoletin. Přesto, že obě látky byly dříve izolovány z početných rostlinných druhů, z N. triphylla dosud získány nebyly. Betulin (viz. obrázek č. 2) je látka původně izolovaná H
z kůry rodu Betula, byly u ní zjištěny účinky antivirotické, antibakteriální, antitumorové a antiflogistické [3], látku lze snadno oxidovat na kyselinu betulinovou, která vykazuje navíc i antimalarickou aktivitu a jejíž deriváty se v současné
OH
H H HO
H
Obrázek č. 2: Struktura betulinu
době intenzivně zkoumají. [4] O
U skopoletinu (viz obrázek č. 3) jsou známy například účinky
antioxidační,
protizánětlivé,
O
protinádorové,
antidepresivní či antihyperglykemické. [5] Obě získané látky mají protizánětlivou aktivitu,
OH O
Obrázek č. 3: Struktura skopoletinu
v chloroformovém extraktu byly majoritní a jejich přítomnost tak může vysvětlovat zjištěnou aktivitu chloroformového extraktu proti TNF-α, která je srovnatelná s prednisonem.
Seznam literatury: [1]
Plante: la loasa. 1jardin2plantes.info [online]. 2012 [cit. 2012-12-29]. Dostupné z: http://www.1jardin2plantes.info/fiches/450/loasa-triphylla.php
[2]
BADILLA, B., MORA, G., POVEDA, L. J. Anti-inflammatory activity of aqueous extracts of Ove Costa Rican medicinal plants in Sprague-Dawley rats. Revista de biología tropical, 1999, vol. 47, p. 723–727.
[3]
HAYEK, E. W. H., JORDIS, U., MOCHE, W., SAUTER, F. A bicentennial of betulin. Phytochemistry,1989, vol. 28, p. 2229–2242.
[4]
ALAKURTTIB, S., MÄKELÄA, T., KOSKIMIESA, S., YLI-KAUHALUOMA, J. Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, vol. 29, p. 1–13.
[5]
CAPRA, J. C. et al. Antidepressant-like effect of scopoletin, a coumarin isolated from Polygala sabulosa (Polygalaceae) in mice: Evidence for the involvement of monoaminergic systems. European Journal of Pharmacology, 2010, vol. 643, p. 232–238.
136
Vliv plniv a rozvolňovadel na vlastnosti a disoluční profil liquisolid systémů Jan Gajdziok, Barbora Vraníková, Aneta Faltýnková, Monika Fileková Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Jednou z inovativních metod farmaceutické technologie umožňující zlepšit nízkou biologickou dostupnost některých léčiv po perorálním podání (hypolipidemika, antiflogistika, antiepileptika, apod.), často související s jejich špatnou rozpustností, je formulace tzv. liquisolid systémů. Jde o moderní lékovou formu, jejíž princip přípravy spočívá v nanášení léčiva v kapalné fázi, prostým smísením nebo nástřikem, na suchý, nepřilnavý, volně tekoucí, vysoce sorpční nosič (magnesium alumino-metasilikáty, modifikovaná celulosa, atd.), který je následně obalen materiálem s velkým povrchem částic (koloidní oxid křemičitý)1,2,3). Biologickou dostupnost léčiva v kapalné fázi aplikovaného perorální cestou ve formě liquisolid systému je možné ovlivnit nejen metodou přípravy, ale do značné míry také typem použitých pomocných látek. Výzkum vlivu pomocných látek na chování liquisolid systémů byl doposud soustředěn na typ rozpouštědla, nosiče a obalovacího materiálu. Bylo zjištěno, že výběr rozpouštědla má výrazný vliv na rychlost uvolňování léčiva z lékové formy. Specifický měrný povrch nosiče a jeho schopnost absorbovat kapaliny ovlivňují množství léčiva v kapalné fázi, které může být zapracováno do liquisolid systémů, a tím také velikost finálního přípravku. Zatímco dobrá lisovací vlastnosti práškové směsi jsou zajišťovány obalovacím materiálem4). Tyto tři skupiny však nejsou jedinými pomocnými látkami používanými během formulace liquisolid systémů ve formě tablet. Důležitou roli hrají také typ a množství rozvolňovadla (sodná sůl kroskarmelosy, krospovidon, sodná sůl glykovaného škrobu, atd.) a plniva (laktosa, mikrokrystalická celulosa, fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, apod.), jež mají výrazný vliv na rychlost uvolnění léčiva a tím i na jeho biologickou dostupnost po podání do organismu. Cílem projektu bylo hodnocení vlivu různých typů a procentuálního zastoupení plniv a rozvolňovadel na vlastnosti liquisolid tablet obsahujících jako modelové léčivo rosuvastatin. Materiál a metodika Materiál: Jako modelové léčivo se použila vápenatá sůl rosuvastatinu (Jai Radhe Sales, Indie), která se rozpustila v polyethylenglykolu 400 (Dr. Kulich Pharma, Česká republika). Pro absorpci roztoku léčiva se jako nosič použil
magnesium alumino-metasilikát Neusilin® US2 (Fuji Chemicals,
Japonsko) a jako obalovací materiál koloidní oxid křemičitý Aerosil® 200 (Eurošarm spol. s.r.o., Česká republika). K přípravě tablet byly dále použity plniva: laktosa DCL 11 (DMV International
137
GmbH, Nizozemí), dihydrát hydrogenfosforačnanu vátenatého nebo dihdyrát síranu vápenatého (JRS Pharma, Německo) a rozvolňovadla: kroscarmelosa nebo sodná sůl glykovaného škrobu (JRS Pharma, Německo). Metodika: Rosuvastatin se rozpustil v polyethylenglykolu 400 (PEG 400) za vzniku 7,5% roztoku a následně se nasorboval pomocí nástřiku ve fluidní vrstvě (Glatt AG, Švýcarsko) na nosič. Směs kapalina/prášek se přesítovala přes síto o velikosti ok 1 mm a 10 min homogenizovala (T2C, TURBULA System Schatr, Švýcarsko). Následně byly částice Neusilinu® US2 s nasorbovaným léčivem obaleny obalovacím materiálem (Aerosil® 200). Vzniklý liquisolid prášek se opět přesítoval a 5 min homogenizoval. Poté se k této směsi přidalo jedno z rozvolňovadel (kroskarmelosa 1-4 %, sodná sůl glykovaného škrobu 2-4 %) a plnivo laktosa (popř. Ca(HPO4)2.2H2O, CaSO4.2H2O nebo jejich směs s laktosou) v proměnném zastoupení. Následně se celá tabletovací směs opět přesítovala a 10 minut homogenizovala. Vzniklé tabletoviny se hodnotily dle platného lékopisu. Stanovila se u nich pyknometrická hustota (Pycnomatic – ATC, POROTEC GmbH, Německo), sypnost (MEDIPO, Česká republika dle Eur. Ph.), sypný úhel, sypné a setřesné objemy a hustoty (SVM 102, ERWEKA GmbH, Německo), Hausnerův poměr a index stlačitelnosti. Navíc se u všech směsí stanovil tzv. úhel skluzu, jako další parametr hodnotící tokové vlastnosti prášků. Ze vzniklých směsí se na výstředníkovém lisu (EK 0, KORSCH, Německo) nalisovaly „oblong“ tablety (18 mm x 8 mm) o konstantní hmotnosti 650 mg. Výlisky se následně hodnotily dle ČL. Stanovila se u nich pyknometrická hustota, oděr (TAR 10, ERWEKA GmbH, Německo), hmotnostní (KERN 870 – 13, Gottl. KERN & Sohn, Německo) a obsahová stejnoměrnost (Lambda 25, PerkinElmer, USA), rozpad (ZT4, Erweka GmbH, Německo), výška (DS 150, Quantum Maschinen, Německo), pevnost (C 50 Tablet Hardness & Compression tester, Anglie) a disoluční profily (Sotax AT 7 Smart, Sotax, Švýcarsko).
Výsledky Z výsledků hodnocení je patrné, že všechny tablety, bez ohledu na typ a množství použitého rozvolňovadla, popř. plniva, splňují lékopisné požadavky. Dle očekávání bylo zjištěno, že zvyšující se množství rozvolňovadla urychluje rozpad tablet, přičemž kroskarmelosa rozpad tablet zrychluje výrazněji než glykovaný škrob. Stanovení disolučního profilu liquisolid tablet ukázalo, že tablety s obsahem glykovaného škrobu uvolní během prvních 30 min maximálně 25 % rosuvastatinu. Naopak u tablet s obsahem 2,5 – 4 % kroskarmelosy dojde během této doby k uvolnění 100 % léčiva, přičemž u tablet s 4 % karmelosy se více než 85 % rosuvastatinu uvolní již během prvních 15 minut (Obr. 1).
138
Hodnocení tablet s obsahem nerozpustných plniv ukázalo, že obě plniva (Ca(HPO 4 ) 2 .2H 2 O, CaSO 4 .2H 2 O) zvyšují pevnost tablet, mírně zpomalují rozpad a tím i disoluční profil léčiva. U těchto tablet nedochází k uvolnění více než 85 % rosuvastatinu během prvních 30 minut a nevyhovují tedy požadavku zrychleného uvolňování léčiva.
Obr. 1: Disoluční profil liquisolid tablet s obsahem 1 - 4 % rozvolňovadla kroskarmelosy
Závěr Na základě hodnocení tablet s rozdílným množstvím a typem použitého rozvolňovadla, byla jako nejvhodnější rozvolňovadlo vybrána kroskarmelosa. Jako nejvhodnější plnivo pro formulaci liquisolid systémů s obsahem rosuvastatinu je rozpustná laktosa. Seznam literatury: 1) NAZZAL S., KHAN M.A .: Controlled release of a self-emulsifying formulation from a tablet dosage form: Stability assessment and optimization of some processing parameters. International Journal of Pharmaceutics. 2006, 315 (1-2): 110-121. 2) NAGABANDI V.K., RAMARAO T., JAYAVEERA K.N.: Liquisolid Compacts: A Novel Approach to Enhance Bioavailability of Poorly Soluble Drugs. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 2011, 1 (3): 89-102. 3) KULKARNI A.S., ALOORKAR N.H., MANE M.S., GAJA J.B.: Liquisolid Systems: A Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology. 2010, 3 (1): 795-802. 4) JAVADZADEH Y., MUSAALREZAEI L., NOKHODCHI A.:. Liquisolid technique as a new approach to sustain propranolol hydrochloride release from tablet matrices. International Journal of Pharmaceutics. 2008, 362 (1-2): 102-108.
139
Moderní léková forma pro lokální antimykotickou terapii Markéta Valtusová, David Vetchý, Jan Gajdziok, Hana Landová, Petr Doležel Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Orální kandidóza je i dnes stálým aktuálním medicínským problémem. Původcem všech forem orální kandidózy je zejména C. albicans, méně často další. Klinický obraz slizničního postižení může být typický, tj. provázený tvorbou bělavých povlaků na zarudlé sliznici, nebo netypický, projevující se pouze erytémem ústní sliznice [1]. Možnosti lokální terapie jsou poměrně omezené. Používají se polotuhé, nebo kapalné lékové formy, jejichž nevýhodou je krátké setrvání v místě aplikace. V ČR je v současnosti na trhu jediný registrovaný přípravek - Loramyc 50mg (myconazol), bukální tablety, který se aplikuje 1x denně. Mukoadhezivní filmy nabízí řadu výhod oproti jiným lékovým formám díky svému tvaru, velikosti a tvarové flexibilitě, které snižují ústní diskomfort spojený s tabletou (omezení při mluvení, příjmu potravy, tekutin a pocitu cizího tělesa v ústech). Mukoadhezivní filmy mohou být využity i ke krytí lézí. Všechny výše zmíněné výhody vedou k vyššímu compliance pacienta. Nystatin je nejčastěji používaným antimykotikem k léčbě kandidóz. Je účinný hlavně proti Candida Albicans. Není absorbován v GIT a jeho terapeutický efekt je pouze lokální, a to ani tehdy, pokud se přijme perorálně. Díky velmi nízké toxicitě ve srovnání s jinými antifungálními léky se jeví nystatin jako dobrá alternativa [2]. Cílem
projektu
byla
formulace
perspektivního
antimykotika
nystatinu
do
bukálních
mukoadhezivních filmů obsahujících plošnou netkanou textilii o různém stupni substituce, která měla modifikovat uvolňování léčiva. Byla navržena nová in vitro metoda měření síly bioadheze filmů. Materiál a metodika Materiál: Základem připravovaných flexibilních filmů byl hydrofilní matricový systém složený z mukoadhezivních polymerů - sodné soli karmelosy (NaCMC) (Blanose 7LF-PH, Ashland Aqualon Functional Ingredients, USA) nebo polyethylenoxidu (Polyox™ WSR-1105, Dow Wolff Cellulosics, USA) a impregnační mřížky v podobě plošné netkané textilie z kyselé formy karmelosy
(Hcel HT, Holzbecher Medical, CZ) o vybraných stupních substituce (SB), které modifikovaly
140
uvolňování léčivé látky. Pro zvýšení flexibility filmů byl přidán glycerol (Kulich, CZ). Do vybraných matricových systémů byla zapracována léčivá látka nystatin (VUAB Pharma, CZ). Na přípravu filmů k měření adheze byl použit mucin z prasečího žaludku (typ II, Sigma-Aldrich, USA), jako látka zajišťující bioadhezi a Eudragit® NM 30D (Evonik, D) pro zvýšení flexibility systému. Metodika: Na základě předchozích experimentů byly v prvním kroku připraveny disperze o složení 4 % NaCMC s 3 % glycerolu (vz. 1), 2 % Polyoxu s 3 % glycerolu (vz. 2) a kombinace 2 % NaCMC, 1 % Polyoxu s 3 % glycerolu (vz. 3), do kterých se zapracovával nystatin v množství odpovídajícímu rozsahu jeho MIC. Léčivo se zkoušelo v různých fázích přípravy do směsi suspendovat nebo přidávat částečně rozpuštěné v 96% ethanolu. Jako optimální postup, z hlediska získání homogenní směsi, se jevilo přidání částečně rozpuštěného nystatinu v 96% ethanolu (1/3 použité kapalné fáze) k vymíchanému polymeru s glycerolem a daným množstvím destilované vody (2/3 kapalné fáze). Připravené homogenní směsi se pomocí automatické pipety nadávkovaly do kruhových forem (Ø 63 mm) v množství 18 ml. Rozpouštědlo se odpařovalo za pokojové teploty po dobu cca 48 hodin, do doby, kdy ještě nedošlo k úplnému zaschnutí filmů. Poté se na primární filmy přidalo dalších 9 ml disperze. Rozpouštědlo se nechalo za pokojové teploty zcela odpařit. Ze získaných filmů se vyrazily vzorky, které byly podrobeny dalšímu testování. Porovnávaly se mechanické vlastnosti jednotlivých formulací, disoluční profily, doba adheze a síla bioadheze. Na základě těchto výsledků se pro zapracování nystatinu s plošnou netkanou textilií vybrala směs: 4% NaCMC s 3 % glycerolu. Při přípravě filmů obsahujících plošnou netkanou textilii o různém stupni substituce (0,1895; 0,3005; 0,3820 a 0,4000) se postupovalo stejným způsobem jako při přípravě předchozích disperzí. Textilie upravená do tvaru kruhu (Ø 63 mm) byla vložena do plastové kruhové formy a impregnována takovým množstvím disperze, aby hmotnost a obsah léčiva výsledných filmů odpovídaly hmotnosti filmů připravených v předchozí fázi. Ze získaných filmů se vyrazily vzorky, které byly podrobeny dalšímu testování. Hodnocení se provedlo s využitím PLS-2 regrese (Unscrambler X, Camo). Analyzovala se závislost mezi hodnotami texturní analýzy (mechanické vlastnosti), dobou adheze (nezávisle proměnné) a závisle proměnnými koeficienty disoluce získanými modelem Krosmeyer-Peppas. Pro srovnávací in vitro metodu měření síly bioadheze byly připraveny tři sady vzorků smícháním zásobních disperzí 10% roztoku mucinu v destilované vodě a 30% Eudragitu® NM 30D v poměru 1:2 (vz. A), 1:1 (vz. B) a 2:1 (vz. C). Připravené homogenní směsi se pomocí automatické pipety nadávkovaly do kruhových forem (Ø 63 mm) v množství 18 ml. Rozpouštědlo se nechalo za
141
pokojové teploty zcela odpařit. Ze získaných filmů se vyrazily čtvercové vzorky o velikosti 25x25 mm, které se pomocí akrylátového lepidla připevnily na podložní desku Texture analyzeru. Poté se filmy 10 minut před začátkem měření navlhčily 5% roztokem mucinu ve fosfátovém pufru o ph 6,8 a přitiskl se k nim měřený vzorek o Ø 15 mm (zátěž 200g, doba kontaktu 20 s, rychlost oddalování 5 mm/s). Výsledky Obr. 1: Vliv stupně substituce na dobu adheze filmů
Obr. 2 Uvolňování nystatinu z finálních filmů.
Tab. 1: Síla bioadheze filmů z prvního kroku (N/cm2) vzorky
A
B
C
1 2 3
3,92 ± 0,15 3,62 ± 0,10 4,45 ± 0,30
6,12 ± 0,41 5,05 ± 0,26 5,46 ± 0,47
6,93 ± 0,21 6,78 ± 0,46 5,89 ± 0,40
Závěr Postupem popsaným v metodice se připravila řada formulací lišících se stupněm substituce použité netkané textilie. Optimalizovala se metoda zapracování nystatinu do lékové formy a vyvinula se metoda pro in vitro hodnocení síly bioadheze. Z tab. 1 vyplývá, že se zvyšujícím se množstvím mucinu stoupá i síla adheze měřených filmů. Přidání impregnační mřížky v podobě plošné netkané textilie z kyselé formy karmelosy vedlo k prodloužení uvolňování léčiva a zvýšení doby adheze z 50 až na 74 minut. Podařilo se prokázat souvislost mezi některými texturními parametry a regresními koeficienty disoluce. Vyšší stupeň substituce patrně podporuje supererozi matrice. Zároveň se projevuje také delší dobou adheze filmů a větší silou potřebnou k roztržení filmu (a naopak). Seznam literatury: 1. KRŇOULOVÁ J, VALENTOVÁ E, ZEMANOVÁ J. Orální kandidóza. Prakt. zub. lék. 2000, 48(2): 49-63. 2. http://www.vuab.cz/index/clanky/kategorie/nystatin, 15.1.2013
142
Využití modifikátorů pH pro dosažení pH-nezávislého disolučního profilu slabě bazického léčiva z matricových tablet Eliška Mašková, Kateřina Dvořáčková, Jan Muselík, Petr Doležel, Šimíčková Martina, Tkadlečková Veronika, Joudalová Martina Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Vzhledem k proměnlivé hodnotě pH v jednotlivých částech gastrointestinálního traktu (GIT) je velmi obtížné zajistit rovnoměrné vstřebávání léčiv povahy slabých kyselin, zásad nebo jejich solí, jejichž rozpustnost je závislá na pH disolučního prostředí. K zajištění vhodné rozpustnosti a konstantního uvolňování léčiv nezávisle na pH se mohou do lékových forem přidat tzv. pH modifikátory. Včleněním těchto látek dochází v matricové tabletě k vytvoření mikroprostředí s určitou hodnotou pH zajišťující rovnoměrnou rozpustnost léčivé látky bez ohledu na pH okolního prostředí. Výsledkem je pH nezávislý disoluční profil léčiva, zajišťující rovnoměrnou absorpci, optimální biologickou dostupnost a následně efektivní terapii. Příkladem kyselých pH modifikátorů pro zvýšení rozpustnosti léčiv charakteru slabých zásad a solí slabých zásad a silných kyselin v oblasti tenkého střeva jsou kyselina citrónová, fumarová, itakonová, jantarová, jablečná, askorbová, adipová, glutarová a sorbová1,2. Cílem tohoto projektu byla optimalizace přípravy hydrofilně-lipofilních matricových tablet s obsahem kyselých modifikátorů pH pro dosažení rovnoměrného uvolňování slabě bazického léčiva nezávisle na pH okolního prostředí. Materiál a metodika Matricové tablety byly připraveny lisováním granulátu připraveného termoplastickou granulací. Jako nosný hydrofilní polymer byla použita hypromelosa K4M (Colorcon Limited, Velká Británie) v kombinaci s lipofilním nosičem montanglykolovým voskem (Zentiva, Česká republika). Tablety obsahovaly jako modelové léčivo verapamil-hydrochlorid (Chemos, Německo), slabě bazickou léčivou látku s rozpustností výrazně závislou na pH prostředí. Jako kyselé pH modifikátory byly přidány do tablet organické kyseliny v množství 50 a 100 mg (kys. citrónová, fumarová, itakonová, jablečná a jantarová, Sigma-Aldrich, Německo). Pro zlepšení tokových a antiadhezivních vlastností bylo přidáno 2,5 % stearanu hořečnatého (Peter Greven, Německo) a 0,5 % Aerosilu 200 (Degussa, Itálie). Složení jednotlivých vzorků uvádí tab. I. Vylisované tablety byly hodnoceny dle ČL 2009. Stěžejní byla zkouška disoluce, která byla provedena míchadlovou metodou v podmínkách lépe simulující reálné prostředí GITu (Sotax AT 7
143
Smart, Švýcarsko). Jako výchozí médium se použila umělá žaludeční šťáva bez přídavku pepsinu, následně po dvou hodinách bylo pH upraveno na hodnotu 6,8, která odpovídá prostředí tenkého střeva. Za stejných podmínek jako disoluční test probíhalo měření pH gelové vrstvy (pH-metr spojený s kontaktní elektrodou, pH 210 Hanna Instruments, Mauritius). Byla sledována závislost vlivu typu a koncentrace přidaného pH modifikátoru na uvolňování léčiva a pH mikroprostředí matrice. Dále byl hodnocen mechanismus uvolňování verapamil-hydrochloridu pomocí řady kinetických modelů a pro posouzení vlivu typu a množství kyselých modifikátorů na uvolňování léčiva se porovnaly jednotlivé disoluční profily pomocí faktoru podobnosti. Pořízení snímků gelových vrstev bylo provedeno kryo-preparační technikou na skenovacím elektronovém mikroskopu, kde bylo možné pozorovat strukturu vytvořené gelové vrstvy (Hitachi SU8020, USA). Tabulka I.: vzorek R 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B
verapamilHCl [mg] 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
HPMC K4M [mg] 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
montanglykolový vosk [mg] 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1 82.1
MCC
kyselina (125-250 µm) [mg]
[mg] 100 50 50 50 50 50 -
citrónová fumarová itakonová jablečná jantarová 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100
Výsledky Zkouškou disoluce byl prokázán vliv kyselých pH modifikátorů na uvolněné množství léčiva z matrice. Zatímco u referenčního vzorku bez obsahu kyselých modifikátorů došlo k výraznému uvolnění léčiva na začátku zkoušky disoluce (37 % při hodnotách pH 1,2) a pouze dalších 16 % se uvolnilo v pH 6,8 (celkem 52,5 % za 12 hodin), přidání kyselých pH modifikátorů do tablet mělo za následek snížené množství uvolněného léčiva při nižších hodnotách pH a výraznější uvolnění při pH 6,8 (u všech vzorků více než 63,5 % za 12 hodin, obr. 1). Optimální formulací byl vzorek obsahující 100 mg kyseliny citrónové, kde se uvolnilo až 80,5 % verapamil-hydrochloridu za 12 hodin během zkoušky disoluce. Z měření pH gelové vrstvy je patrný rozdíl mezi referenčním vzorkem a vzorky s obsahem kyselých pH modifikátorů, kdy došlo k podstatnému snížení pH gelové vrstvy v prostředí pH 6,8 a tím k vytvoření vhodného mikroprostředí tablety k rovnoměrnému uvolňování slabě bazického léčiva (obr. 2).
144
Obr. 2: Změna pH gelové vrstvy tablet během zkoušky disoluce
Obr. 1: Množství uvolněného verapamil-hydrochloridu z tablet s obsahem kyselých pH modifikátorů během zkoušky disoluce ve srovnání s referenčním vzorkem R
Obr. 3: Struktura gelové vrstvy na elektronovém mikroskopu – průřez gelovou vrstvou (A), suché nehydratované jádro (B), povrch gelové vrstvy (C)
Závislost množství uvolněného léčiva a hodnot pH gelové vrstvy v čase na vlastnostech kyselin (koncentrace, pKa a rozpustnost) prokázala signifikantní vliv kyselých pH modifikátorů, významným se ukázal zejména vliv koncentrace kyseliny v matrici a její síla. Překvapivě vliv rozpustnosti kyseliny se neprokázal. Z hodnocení pomocí kinetických modelů vyplývá, že nejpravděpodobnějším mechanismem uvolňování verapamil-hydrochloridu z matricových tablet je difúze (vysoká míra korelace s difúzním Higuchiho a Baker-Lonsdale modelem), s nepatrným vlivem eroze (dle hodnoty exponentu n z Korsmeyer-Peppas kinetického modelu). Závěr V rámci projektu se připravily hydrofilně-lipofilní matricové tablety s obsahem kyselých modifikátorů pH (kyselina citrónová, fumarová, itakonová, jablečná a jantarová) pro dosažení rovnoměrného uvolňování slabě bazického léčiva verapamil-hydrochloridu nezávisle na pH okolního prostředí. Výsledky prokázaly signifikantní vliv kyselých modifikátorů inkorporovaných do systému, především koncentraci a sílu použité kyseliny. Seznam literatury: 1. DVOŘÁČKOVÁ K. Principy uvolňování léčiv z perorálních matricových tablet obsahujících hypromelosu. Chem. listy 2009, 103, 66-72. 2. MEHTA D.M., PAREJIYA P.B., BAROT B.S., SHELAT P.K.. Investigation of the drug release modulating effect of acidifiers in modified release oral formulation of cinnarizine. AJPS 2012, 7 (3), 193-201.
145
Farmakologický screening antihypertenzivního a negativně chronotropního efektu nových derivátů arylkarbonyloxyaminopropanolu Ondrej Baďo, Marek Frydrych Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Kardiovaskulární onemocnění se podílejí na příčinách úmrtí v České i Slovenské republice z více než poloviny. V důsledku rostoucího životního tempa se esenciální hypertenze, ischemická choroba srdeční, poruchy srdečního rytmu, srdeční insuficience a kardiomyopatie objevují u stále mladších pacientů. V terapii se osvědčila léčiva antagonizující účinky sympatické inervace, blokátory β-adrenergních receptorů.1 Farmaceutická fakulta VFU Brno má dlouhodobou tradici v řešení problematiky léčiv ovlivňujících kardiovaskulární systém. Ústav chemických léčiv je efektivním producentem kvalitních potenciálních látek s β antagonistickým účinkem.2 Předpovědět účinky nových látek na biologické systémy bez experimentů in vivo je nemožné. Proto jsme náš pokus zaměřili na testování potenciálních nově syntetizovaných ultra-krátce působících βsympatolytik na modelu laboratorního potkana.3 Materiál a metodika Na Ústavu chemických léčiv (PharmDr. Jan Tengler) Farmaceutické fakulty VFU Brno pod vedením Prof. RNDr. Jozefa Csölleie byly syntetizovány funkční analoga aryloxyaminopropanolu s karbamátovou substitucí aromatického jádra a esterovou vazbou inkorporovanou do spojovacího řetězce s pracovním názvem DMC2a-d, 2MC2a-d, 2FC2a-d, viz. obrázek č.1. Ultra-krátký účinek těchto látek v organizmu je dán přítomností esterové vazby, která je hydrolyzována plazmatickými cholinesterázami nebo esterázami v cytosolu, či na povrchu erytrocytů. Chemická struktura všech funkčních analogů obsahuje opticky aktivní centrum, díky němuž mohou všechna funkční analoga vyskytovat ve formě R a S izomeru. Látky byly připravené 4 stupňovou syntézou ve formě racemátů. Struktura i čistota připravených látek byla ověřená pomocí ¹H-NMR, ¹³C-NMR spektroskopie, kapilární zónové elektroforézy, tenkovrstevné chromatografie a teplot tání.
146
Experiment probíhal in vivo na 60 kusech laboratorních potkanech, které jsou dostačujícím modelem pro naše účely. Byli použiti normotenzní samčí potkani kmene Wistar, ve věku (60 -100 dní) o hmotnosti 250 – 350g, z chovu z Lékařské fakulty MU Brno. Potkanům byla v celkové anestézii (Zoletil®) vypreparovaná arteria carotis, která byla následně kanylována a kanyla byla napojena na univerzální perfusní systém UNIPER-UP100 (Harvard apparatus). Pomocí tohoto zařízení byl kontinuálně zaznamenáván systolický krevní tlak. Simultánně byl sledován i srdeční rytmus zvířete pomocí EKG Seiva Veterinary Praktik. Použity byly zesílené končetinové svody. Do vypreparované vena jugularis byla injekčně bolusově podána testovaná látka nebo placebo (fyziologický roztok) rozpuštěné v dimetylsulfoxidu o unifikovaném objemu 1ml. Měření probíhalo vždy po dobu 20 minut od intravenózního podání testované substance v dávce 3mg/kg.
Graf č.1: Porovnání testovaných β-lytik na snížení krevního tlaku
Graf č.2: Porovnání testovaných β-lytik na snížení tepové frekvence
147
Obrázek č.1: Struktura testovaných β-lytik H
OH H O
O
Cl
-
+
N
O
R2
O
HN
R1 O
Výsledky V experimentu byly testovány tři skupiny látek lišících se v poloze R 2 velikostí a sílou elektrofilního substituentu. V každé skupině byly čtyři látky lišící se délkou hydrofobního řetězce v poloze R 1 . Všechny látky byly testovány ve stejné dávce. Látky, které vykazovaly zajímavý efekt byly následně testovány i v dalších dávkách. Minimálně účinné deriváty byly znovu otestovány v dávkách vyšších. Na grafu č.1 jsou porovnány metyl deriváty látek s placebem z hlediska jejich vlivu na systolický krevní tlak. Na grafu č.2 jsou porovnány stejné deriváty z hlediska jejich vlivu na snížení srdeční frekvence oproti placebu. DMC2a derivát vykázal nejvyšší antihypertenzivní i negativně chronotropní účinek. Látka 2FC2a vykázala silný hypotenzní účinek, avšak téměř bez účinku na tepovou frekvenci. Minimální efekt vykázala látka 2MC2a. Její podání vedlo ke snížení krevního tlaku a srdeční frekvence pouze krátkodobě po dobu 4 minut od aplikace testovaného potenciálního léčiva. Seznam literatury: 1
- Tengler J., Mokrý P., Csöllei J.: Příprava funkčních analogů aryloxyaminopropanolu s duálnim
účinkem, 38. konference Syntéza a analýza léčiv, sborník Hradec Králové, 2009, p54: 116 2
- Tengler J., Račanská E., Baďo O., Kapustíková I., Jampílek J., Mokrý P., Stropnický O., Csöllei
J.: Synthesis, Physico-Chemical Characterization and Biological Evaluation of Novel Arylcarbonyloxyaminopropanols, Molecules, 2013, in revision 3
- Basgut B., Kayki G., Bartosova L., Ozakca I., Seymen A., Kandilci H., Ugur M., Turan B.,
Ozcelikay T.: Cardioprotective effects of 44Bu, a newly synthesized compound, in rat heart subjected to ischemia/reperfusion injury, European Journal of Pharmacology, 2010, vol 640: 117123
148
Polymorfismy v genech pro TNFRSF1A a TNFRSF1B, jejich asociace s fenotypem Crohnovy choroby a efektivitou biologické léčby infliximabem. PharmDr. Kateřina Wróblová Ph.D., Jana Mokráňová, Doc. RNDr. Ladislava Bartošová Ph.D., PharmDr. Michal Kolorz Ph.D. Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Biologická terapie je v dnešní době považována za nejefektivnější přístup k terapii řady onemocnění, jejichž patofyziologie se odvíjí od nadměrné imunitní aktivace a patologické prolongace zánětlivé reakce způsobené nadměrnou aktivací TNF-alfa. Proto se podání monoklonálních protilátek vázajících tento cytokin osvědčilo v terapii onemocnění jako je CD (Crohnova choroba), UC (ulcerózní kolitida) i RA (revmatoidní artritida). Jako první ze skupiny anti-TNF protilátek se do terapie CD dostal infliximab. Přes všechna pozitiva zůstává však asi 30 % pacientů k léčbě refrakterních[1]. Relativně vysoký výskyt jedinců neodpovídajících na terapii, medicínská rizika s ní související a také vysoké finanční náklady biologické léčby vedly v posledních letech k intenzivnímu výzkumu faktorů, které by umožnily identifikovat pacienty s nejvyšší nadějí na úspěch této terapie[2,3,4]. Kromě klinických parametrů nemoci a biochemických markerů je v poslední dekádě kladen důraz také na genetický profil pacienta[1,2]. Výzkum se intenzivně soustřeďuje na oblast genomu zahrnující geny pro TNF-alfa a jeho receptory TNFR1 (TNFRSF1A) a TNFR2 (TNFRSF1B), neboť právě tato oblast je považována za klíčovou jak pro pochopení vlastní patogeneze chronických zánětlivých onemocnění, tak pro studium mechanismů
účinků těchto monoklonálních protilátek. Dosavadní výsledky jsou však
nejednoznačné[5,6,7,8]. Materiál a metodika V této studii bylo genotypizováno 116 pacientů s diagnózou CD, u kterých byl indikován infliximab. Všichni jedinci vstupující do studie vyslovili svůj souhlas s genotypizací podpisem Informovaného souhlasu. Studie byla schválena etickou komisí (Nemocnice U milosrdných bratří Brno). Efektivita terapie byla hodnocena po deseti týdnech podávání infliximabu. Na základě klinických kriterií (změna CDAI, endoskopické vyšetření) byli pacienti rozděleni na skupinu primárních responderů (n=98) a skupinu primárních non-responderů (n=18). Mezi pacientyrespondery, byli dále rozlišováni pacienti s klinickou i morfologickou odpovědí (n=51) a pacienti s klinickou odpovědí, u kterých však nedošlo k morfologickému zhojení lézí (n=47). Vyhodnocovány byly také klinické projevy choroby (věk manifestace, lokalizace zánětu, aktivita onemocnění) ve
149
vztahu k efektivitě terapie infliximabem a genotypu. U vzorků DNA byla metodou PCR-RFLP detekována alelová varianta polymorfismů v genu pro TNFRSF1A (T4672G rs4149570; G3794C, rs4149569) a TNFRSF1B (T11695C, rs976881; T587G, rs1061622). Navrhli jsme sekvence primerů a po následné optimalizaci jsme vytvořili PCR metodiku pro amplifikaci genomové DNA v místě sledovaných polymorfismů. Produkty PCR byly následně inkubovány s příslušnou DNA restriktázou. Pro stanovení genotypu byly tyto produkty rozděleny na 2,5% agarózovém gelu s obsahem fluoroforu a vizualizovány pomocí transluminátoru. Výsledky byly statisticky hodnoceny Fisherovým testem a výpočtem Odds ratio. Hodnoty P<0,05 byly považovány za statisticky významné. Výsledky Z celkového počtu 116 pacientů bylo u 98 jedinců (84 %) dosaženo terapeutického efektu. Mezi skupinami responderů a non-responderů nebyla nalezena signifikantní souvislost mezi sledovanými klinickými parametry onemocnění a efektivitou terapie infliximabem ani mezi těmito parametry a výskytem sledovaných variantních alel. Frekvence variantních alel genu pro TNFRSF1A byly u obou skupin pacientů srovnatelné (38,8 % and 36,1 % pro TNFRSF1A 4672G alelu, 52,6 % a 52,8 % pro 3794C alelu). Variantní alela TNFRSF1B 11695C byla nesignifikantně častěji detekována u non-responderů (41,7 % vs. 30,1 %). Jedinci homozygotní pro tuto variantní alelu signifikantně častěji nereagovali na terapii infliximabem (P=0,013; OR 5,89, CI 95 % 1,622,1). Frekvence homozygotního genotypu byla signifikantně nejvyšší u non-responderů (n=5, 27,8 %) v porovnání s respondery s klinickou a zároveň morfologickou reakcí (n=4; 7,8 %, P=0,045; OR 4,52, CI 95 % 1,06-19,29), i respondery s pouze klinickou reakcí (n=2; 4,3 %, P=0,015; OR 8,65, CI 95 % 1,5-49,9). Podobně variantní alela TNFRSF1B 587G byla detekována u non-responderů s vyšší frekvencí než u responderů (33,3 % a 18,9 %). Výskyt této variantní alely byl signifikantně nejnižší u pacientů s klinickou a morfologickou odpovědí (15,7 %) při srovnání se skupinou nonresponderů (P=0,031; OR 2,68, CI95 % 1,12-6,44). Diskuze a závěr Frekvence výskytu variantních alel odpovídají výsledkům jiné studie mapující jejich výskyt u kavkazské populace[1]. Frekvence alely TNFRSF1B 11695A byla signifikantně vyšší u nonresponderů (41,7 %) v porovnání se skupinou responderů (30,1 %). Výskyt homozygotního genotypu pro tuto alelu byl asociován s nedostatečnou terapeutickou odpovědí (P=0,0132). Homozygoti pro variantní alelu se vyskytovali v 27,8 % u skupiny non-responderů oproti 6,1 % u skupiny responderů. Jelikož se tento polymorfismus nachází v sekvenci intronu 1 nabízí se vysvětlení, že jeho přítomnost narušuje posttranslační procesy. Distribuce variantní alely 587G byla 18,9 % u responderů a 33,3 % u non-responderů. Ačkoliv tento rozdíl frekvencí je značný a
150
odpovídá frekvencím zjištěným v jiných studiích[1,3,6] nebyl v naší studii potvrzen jako signifikantní (P=0,073). Výskyt této variantní alely G (15,7 %) byl však nejnižší u pacientů s klinickou reakcí a zároveň morfologickým zhojením (P=0,031) v porovnání s non-respondery. Přítomnost variantní alely vede k substituci Met196Arg kdy tato substituce narušuje funkce receptoru z pohledu jeho biologické aktivity. Změna primární sekvence proteinu vede k narušení schopnosti indukovat NF-κB, a především narušuje vzájemné regulační působení mezi TNFR1 a TNFR2, kdy TNFR2 figuruje jako inhibitor pro-inflammatorní exprese indukované TNFR1 a zároveň podporuje pro-apoptickou signalizaci via TNFR1[9]. Oba tyto mechanismy pak posunují rovnováhu mezi pro-inflammatorním a pro-apoptickým působením na stranu zánětu. V této oblasti jsou však výsledky jiných autorů nesourodé[1,6]. Pro jednoznačné vymezení možných genetických markerů účinnosti terapie infliximabem je bezesporu potřeba dalších studií na velkém počtu pacientů. Seznam literatury [1] STEENHOLDT, C., ENEVOLD, C., AINSWORTH, M.A., BRYNSKOV, J., THOMSEN, O., BENDTZEN, K.: Genetic polymorphisms of tumour necrosis factor receptor superfamily 1b and fas ligand are associated with clinical efficacy and/or acute severe infusion reactions to infliximab in Crohn’s disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2012, 36, 650-659. [2] JONES, J., KENYON, C., SEOW, C.H.: Predictors of response to anti-tumour necrosis factor therapy in patients with Crohn’s disease. European Gastroenterology & Hepatology Review. 2011, 7, 21–25. [3] PIERIK, M., VERMEIRE, S., STEEN, K.V., JOOSSENS, S., CLAESSENS, G., VLIETINCK, R., RUTGEERTS, P.: Tumour necrosis factor-a receptor 1 and 2 polymorphisms in inflammatory bowel disease and their association with response to infliximab. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2004, 20, 303– 310. [4] VERMEIRE, S., LOUIS, E., CARBONEZ, A., VAN ASSCHE, G., NOMAN, M., BELAICHE, J., DE VOS, M., VAN GOSSUM, A., PESCATORE, P., FIASSE, R., PELEKMANS, P., REYNAERT, H., D'HAENS, G., RUTGEERTS, R.: Demographic and clinical parameters influencing the short-term outcome of anti-tumor necrosis factor (infliximab) treatment in Crohn's disease. The American Journal of Gastroenterology. 2002, 97, 2357-2363. [5] COENEN, M., TOONEN, E., SCHEFFER, H., RADSTAKE, T., BARRERA, P., FRANKE, B.: Pharmacogenetics of anti-TNF treatment in patients with rheumatoid arthritis. Pharmacogenomics. 2007, 8, 761-773. [6] MATSUKURA, H., IKEDA, S., YOSHIMURA, N., TAKAZOE, M., MURAMATSU, M.: Genetic polymorphisms of tumour necrosis factor receptor superfamily 1A and 1B affect responses to infliximab in Japanese patients with Crohn's disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2008, 27, 765-770. [7] NIESS, J.H., KLAUS, J., STEPHANI, J., PFLÜGER, C., DEGENKOLB, N., SPANIO,L U., MAYER, B., LAHR, G., VON BOYEN, G.B.: NOD2 polymorphism predicts response to treatment in Crohn's diseasefirst steps to a personalized therapy. Digestive Diseases and Sciences. 2012, 57, 879-886. [8] BARREIRO-DE ACOSTA, M., OUBURG, S., MORRÉ, S.A., CRUSIUS, J.B., LORENZO, A., POTEL, J., SALVADOR-PEÑA, A., DOMÍNGUEZ-MUÑOZ, J.E.: NOD2, CD14 and TLR4 mutations do not influence response to adalimumab in patients with Crohn's disease: a preliminary report. Revista Española de Enfermedades Digestivas. 2010, 102, 591-595. [9] TILL, A., ROSENSTIEL, P., KRIPPNER-HEIDENREICH, A., MASCHERETTI-CROUCHER, S., CROUCHER, P.J., SCHÄFER, H., SCHEURICH, P., SEEGERT, D., SCHREIBER, S.: The Met-196 -> Arg variation of human tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) affects TNF-alpha-induced apoptosis by impaired NF-kappaB signaling and target gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 5994-6004.
151
Příprava, charakterizace a in vitro a in silico hodnocení aktivity nových inhibitorů polymerace mikrotubulů jako potenciálních antineoplastik Jana Želazková Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Úvod Dynamiky dělícího vřeténka představují významný cíl protinádorových léčiv. Řada malých přírodních a semisyntetických molekul má schopnost ovlivnit polymeraci tubulinu a vyvolat apoptózu u buněk s nadměrně častým dělením. Látky atakující kolchicinovou doménu tubulinu blokují jeho polymeraci [1]. Přesto tyto látky dosud nejsou využity v léčbě nádorových onemocnění buďto díky nadměrné toxicitě nebo nedostatečné aktivitě anebo špatné rozpustnosti. Strukturní rozmanitost molekul schopných vazby do kolchicinové domény poskytuje široké pole pro design a úpravy vedoucí k požadovaným vlastnostem [2]. Na základě vztahu mezi strukturou a aktivitou byly s cílem získat aktivní látky navrženy a připraveny molekuly aryltetralinového typu a „leadlike“ deriváty acetofenonu. Rovněž byla virtuálně prohledávána vybraná část databáze komerčně dostupných sloučenin ZINC [3], s cílem nalézt strukturně nové ligandy kolchicinové domény.
Materiál a metodika Chemikálie použité pro syntézu byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich. Identita připravených látek byla ověřována pomocí LC/MS, NMR, IČ a EA. Čistota látek byla zjištěna pomocí LC/MS a TLC. Optická aktivita byla stanovena pomocí polarimetru. LogP a další fyzikálně chemické vlastnosti byly predikovány s užitím volně dostupného softwaru [4-5]. Logaritmus P byl stanoven rovněž experimentálně extrapolací retenčních faktorů získaných pomocí RP-TLC. Výpočetní část byla provedena na stroji s dvoujádrovým procesorem Intel® Xeon® X5680, kde každé jádro o výkonu 3,33 GHz simuluje 6 jader, společně tak simulujíce 24 jader, pracujících pod linuxovým operačním systémem Xubuntu 12.04. Databáze ZINC byla nejprve redukována na nejvhodnější kandidáty pomocí filtrů vlastní databáze. Následně byla strukturní data vybraných molekul (celkem 13 000) transformována na vhodný formát pomocí programu Raccoon [6]. Struktura proteinu byla
152
získána z krystalografické databáze PDB [7] a upravena pro virtuální studii. Vlastní dokování bylo provedeno pomocí programu AutoDock Vina [8]. Parametry pro AutoDock Vina byly zadány skriptem napsaným v bashi. Schopnost interakce s kolchicinovou doménou byla posuzována porovnáním hodnot uvolněné vazebné energie. Seřazení ligandů podle této energie bylo provedeno pomocí skriptu psaného v bashi. Strojová náročnost výpočtů byla zvyšována, dokud nebyl vliv náhodného rozesetí ligandu do struktury proteinu probíhajícího při zahájení výpočtu zanedbatelný pro 50 nejlepších ligandů. Těchto 50 ligandů bylo dále podrobeno vícekrokovému dokování. Poté bylo vybráno 10 nejlepších ligandů. Tyto ligandy byly zakoupeny od firmy MolPort a budou otestovány in vitro.
Výsledky Bylo připraveno několik nových látek aryltetralinového typu modifikací lignanu β-peltatinu (viz schéma). Dále byly připraveny 2 deriváty podofylotoxinu (viz schéma), které jsou dosud zmiňovány v literatuře pouze jako syntetické intermediáty či vedlejší produkty izolace a jejichž vliv na dynamiky dělícího vřeténka dosud nebyl popsán. Byly rovněž připraveny 4 deriváty acetofenonu (viz schéma). Pro všechny připravené látky byly stanoveny základní charakteristiky a predikována řada dalších fyzikálně chemických vlastností ovlivňujících chování látek v organismu.
R
R
RO R
O R
RO
O
O
N
O
O
RO Me
H RO
MeO
OMe
R
R N H
R
OMe 1
2
3
Schéma: Základní struktura derivátů acetofenonu 1, β-peltatinu a podofylotoxinu 2 a hlavní strukturní rys predikovaných ligandů kolchicinové domény 3.
153
Virtuální prohledávání databáze poskytlo zcela nový typ struktury. Z databáze byly nejprve vybrány pouze struktury splňující Lipinskiho pravidla a struktury s „lead-like“ vlastnostmi. Tyto struktury byly poté dokovány do kolchicinové domény tubulinu. Na základě výsledků bylo vybráno a zakoupeno 10 sloučenin s nejvyšší vypočtenou vazebnou energií pro kolchicinovou doménu a jejich antitubulinová aktivita bude spolu s aktivitami připravených derivátů ověřena in vitro. Je pozoruhodné, že 8 z 10 potenciálních ligandů nese shodný strukturní rys, který může poskytnout základ pro přípravu dalších derivátů s požadovanými vlastnostmi (viz schéma).
Seznam literatury
1.
Jordan, M.; Wilson, L., Microtubules as a Target for Anticancer Drugs. Nature Reviews Cancer 2004, 4 (4), 253-265.
2.
Nguyen, T. L.; McGrath, C.; Hermone, A. R.; Burnett, J. C.; Zaharevitz, D. W.; Day, B. W.; Wimpf, P.; Hamel, E.; Gussio, R., A Common Pharmacophore for a Diverse Set of Colchcine Site Inhibitors Using a Structure-Based Approach. Journal of Medicinal Chemistry 2005, 48 (19), 6107-6116.
3.
Irwing, J. J.; Sterling, T.; Mysinger, M. M.; Bolstad, E. S.; Coleman, R. G., ZINC: A Free Tool to Discover Chemistry for Biology. Journal of Chemical Information and Modeling 2012, 52 (7), 1757-1768.
4.
Ertl, P., Molecular Structure Input on the Web. Journal of Cheminformatics 2010, 2, 1-9.
5.
Tetko, I. V.; Gasteiger, J.; Todeschini, R.; Mauri, A.; Livingstone, D.; Ertl, P.; Palyulin, A.; Radchenko, E. V.; Zefirov, N. S.; Makarenko, A. S.; Tanchuk, V. Y.; Prokopenko, V. V., Virtual Computational Chemistry Laboratory – Design and Description. Journal of Computer Aided Molecular Design 2005, 19 (6), 453-63.
6.
Forli, S., Raccoon/AutoDock VS: An Automated Tool for Preparing Virtual Screenings, http://autodock.scripps.edu/resources/raccoon, [cit. 17.11.2013].
7.
Bernstein, F. C.; Koetzle, T. F.; Wiliams, G. J.; Meyer Jr., E. E.; Brice, M. D.; Rodgers, J. R.; Kennard, O.; Shimanouchi, T.; Tasumi, M., The Protein Data Bank: A computer-based Archival File for Macromolecular Structures. Journal of Molecular Biology 1977, 112, 535542.
8.
Trott, O.; Olson, J. A., AutoDock Vina: Improving the Speed and Accuracy of Docking with a New Scoring Function, Efficient Optimization, and Multithreading. Journal of Computational Chemistry 2009, 31 (2), 455-461.
154
Příprava nových 4-arylaminochinolinů a určení spektra jejich biologické aktivity Jan Otevřel 1, Dobromila Mikošková, Pavel Bobáľ 1 Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 1 Úvod Chinolin je součástí struktury přírodního antimalarika chininu, alkaloidu izolovatelného z kůry r. Cinchona, který se stal strukturním vzorem pro celou řadu léčiv, např. chlorochinu, promachinu, meflochinu ad. Chimanin, alkaloid kůry r. Galipea, je účinným lékem leischmaniózy, cryptolepin, indolochinolinový alkaloid kořenů r. Cryptolepis, dynemicin, produkt r. Micromonospora a streptonigrin, produkt r. Streptomyces, jsou zástupci přírodních interkalačních cytotoxických látek, 8-(diethylaminohexylamino)-6-methoxy-4-methylcinolin je vysoce účinnou látkou proti Chagasově chorobě. Sloučeniny na bázi chinolinu působí také vůči r. Mycobacterium, což svědčí pro jejich použití jako potenciálních antituberkulotik, jsou účinné antifungálně a antibakteriálně proti r. Aspergillus, Bacillus, Candida, Chromobacterium, Epidermophyton, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus ad. Antivirotická aktivita chinolinů se ověřila u některých retrovirů a herpesvirů včetně cytomegaloviru. Chinoliny prokázaly svou antineoplastickou aktivitu u řady solidních tumorů. U chinolinových derivátů bylo objeveno také antikonvulzivní působení naznačující uplatnění při terapii epilepsie, protizánětlivá a analgetická aktivita se potvrdila též u celé skupiny derivátů, ze kterých můžeme jmenovat např. glafenin. Identifikovaná byla i schopnost několika chinolinových sloučenin blokovat napěťově řízené vápníkové kanály a inhibovat fosfodiesterázu III s možným uplatněním při léčbě kardiovaskulárních onemocnění. Některé sloučeniny s chinolinovým jádrem také působí jako nízkomolekulární antagonisté hormonu koncentrujícího melanin (MCH), což značí jejich potenciální antiobezitní aktivitu, u řady dalších se prokázala schopnost ovlivňovat tvorbu amyloidových plaků a příznivě působit na průběh Alzheimerovy choroby atd. Výčet všech biologických aktivit chinolinů není, a ani nemůže být úplný, co je ale na první pohled zřejmé, je fakt, že chinolinové deriváty jsou a budou velmi slibnou, významnou a zajisté dlouhou dobu ještě nevyčerpanou pokladnicí cenných potenciálních léčiv, která si zaslouží další důkladné studium farmaceutických chemiků a farmakologů Materiál a metodika Je známo, že chinoliny halogenované v poloze C-2 anebo C-4 snadno vstupují do reakcí s Schéma 1. Syntéza 4-arylamino-7-chlorchinolinium chloridů 1-9c.
nukleofilními činidly. Při řešení jednostupňové syntézy navrhovaných sloučenin přicházelo v
155
úvahu využití standardní nekatalyzované nukleofilní aromatické substituce 4-halogenchinolinu příslušným substituovaným anilinem nebo substituce akcelerované mikrovlnným zářením. Alternativně se dalo využít Buchwaldova-Hartwigova cross-couplingu nebo Ullmannovy kondenzace. I když standardní nukleofilní substituce obvykle nevede k tak vysokým výtěžkům jako reakce katalyzované přechodnými kovy nebo mikrovlnným zářením, vyžaduje dlouhodobější zahřívání a vyšší reakční teploty, tak jsme se, vzhledem k jednoduchosti, efektivnosti a Tab. 1. Struktura substituovaných 4-arylamino-7-chlorchinolinium chloridů 1-9c, hodnoty IC50 [μmol/L] odpovídají inhibici PET v chloroplastech špenátu ve srovnání s 3-(3,4-dichlorfenyl)1,1-dimethylmočovinou (DCMU) jako standardem, in vitro antimykobakteriální aktivita (MIC [μmol/L]) sloučenin 1-9c ve srovnání s isoniazidem (INH), pyrazinamidem (PZA), rifampicinem (RIF) and ciprofloxacinem (CPX) jako standardy a předběžné výsledky screeningu in vitro cytotoxicity (LD50) u vybraných sloučenin.
akceptovatelným výtěžkům produktů, rozhodli modifikovat vypracovanou metodiku Lawrence et al. (Schéma 1). Druhá část projektu se soustředila na testování
biologické
Herbicidní
aktivity.
sloučenin
aktivita
se
ověřila při inhibici elektronového transportu v chloroplastech Spinacia oleracea se standardem DCMU, a to spektrofotometricky
pomocí
2,6-
dichlorfenol-indofenolu (DCIPP) jako umělého
akceptoru
Antituberkulotická
elektronů. aktivita
se
testovala na Mycobacterium marinum, M.
avium
kansasii
a
paratuberculosis, M.
smegmatis
standardem
izoniazidem
mikrodiluční
metodou.
testy
M. se
(INH) Předběžné
antiproliferativního
účinku
sloučenin se provedly za použití kitu Strukt. = struktura, PV = procentuální výtěžek, PET = fotoelektronový transport, MIC = minimální inhibiční koncentrace, MM = M. marinum, MK = M. kansasii, MS = M. smegmatis, MAP = M. avium subsp. paratuberculosis, NS = nebylo stanoveno kvůli vysrážení z roztoku v průběhu experimentu.
WST-1
(Roche
Diagnostics,
Mannheim, Germany) na linii buněk THP-1 lidské akutní monocytické leukémie.
Výsledky Připravili jsem celkem 25 derivátů 4-arylaminochinolinu 1-9c izolovaných ve formě hydrochloridů. Sloučeniny byly charakterizovány pomocí teploty tání, infračervené spektrometrie, nukleární magnetické rezonance a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením.
156
Sloučeniny 1-9c obecně vykazovaly relativně špatnou rozpustnost ve vodě, což bylo limitujícím faktorem pro některé in vitro experimenty. Data z provedeného biologického hodnocení, která jsou shrnuta v Tab. 1., ukazují, že nejvyšší herbicidní aktivitu z testovaných sloučenin vykazovaly látky 7-chlor-4-[(3-trifluormethylfenyl)amino]chinolinium chlorid (8b) a 7-chlor-4-[(4-trifluormethylfenyl)amino]chinolinium chlorid (8c), u obou byla ale účinnost nižší než u standardu DCMU. 4-[(2-Bromfenyl)amino]-7-chlorchinolinium chlorid (7a) vykazoval vysokou antimykobakteriální aktivitu
vůči
M.
marinum,
M.
kansasii,
M.
smegmatis
a
7-chlor-
4-[(2-methylfenyl)amino]chinolinium chlorid (4a) působil silně proti M. smegmatis a M. avium paratuberculosis. Obě hodnocené sloučeniny byly srovnatelně nebo více účinné než isoniazid (INH) jako standard. Předběžné in vitro hodnocení cytotoxicity na THP-1 buněčné linii se ukázalo být problematické kvůli nízké rozpustností a vysrážení testovaných látek z roztoku při vyšších koncentracích (> 20 μmol/l) v průběhu experimentu. V nejvyšších dosažitelných koncentracích se nepodařilo prokázat cytotoxickou aktivitu žádné ze studovaných sloučenin. Tato práce byla financovaná grantem IGA č. 91/2013/FaF. Seznam literatury 1.
Kumar, S.; Bawa, S.; Gupta, H. Biological activities of quinoline derivates. Mini-Rev. Med.
Chem. 2009, 9, 1648-1654. 2.
Warshakoon, N. C.; Sheville, J.; Bhatt, R. T.; Ji, W.; Mendez-Andino, J. L.; Meyers, K. M.;
Kim, N.; Wos, J. A.; Mitchell, C.; Paris, J. L.; Pinney, B. B.; Reizes, O.; Hu, X. E. Design and synthesis of substituted quinolines as novel and selective melanin concentrating hormone antagonists as anti-obesity agents Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 5207. 3.
Musiol, R.; Serda, M.; Hensel-Bielowka, S.; Polanski, J. Quinoline-based antifungals. Curr.
Med. Chem. 2010, 17, 1960–1973. 4.
INSERM, 7-Chloro-quinolin-4-amine compounds and uses thereof for the prevention or
treatment of diseases involving formation of amyloid plaques and/or where a dysfunction of the app metabolism occurs, Inventor: Delacourte, A. at al. WO 2011/073322 A1. 2010-16-12. 5.
Lawrence, R.M.; Dennis, K.C.; O’Neill, P.M.; Hahn, D.U.; Roeder, M.; Struppe, C.
Development of a scalable synthetic route to GSK369796 (N-tert-butyl isoquine), a novel 4-aminoquinoline antimalarial drug. Org. Process. Res. Dev. 2008, 12, 294–297. 6.
Otevřel, J.; Bobáľ, P.; Zadražilová, I.; Govender, R.; Peško, M.; Keltošová, S.; Kolečkářová,
P.; Maršálek, P.; Imramovský, A.; Coffey, A.; O'Mahony, J.; Kollár, P.; Čížek, A.; Králová, K.; Jampílek, J. Antimycobacterial and Photosynthetic Electron Transport Inhibiting Activity of RingSubstituted 4-Arylamino-7-Chloroquinolinium Chlorides. Molecules 2013, 18, 10648-10670.
157
Vliv rodiny p53 na působení cytostatik u lidských glioblastom Lenka Hronešová1, Karolína Holacká1, Alena Polášková2, Matej Adámik2, Lucie Navrátilová2, Robert Helma2, Luďka Ballová3 a Marie Brázdová1 Ústav chemických léčiv, Fakulta farmaceutická, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Biofyzikální ústav AVČR v.v.i Brno2, Ústav přírodních léčiv, Fakulta farmaceutická, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno3 Úvod Nádorový supresorový protein p53 (wtp53), multifunkční transkripční faktor regulující osud buňky v reakci na cytotoxický stres zahrnující zástavu: buněčného cyklu, opravu poškozené DNA či apoptózu díky vazbě k promotorům cílových genů. Více než 50 % lidských nádorů obsahuje mutaci v genu TP53, což vede ke zvýšené odolnosti k chemoterapii a k progresi nádoru. Pro-onkogenní chování se projevuje neschopností regulovat cílové geny wtp53, aktivací pro-onkogenních cílových genů mutp53 a blokováním nádorových supresorových funkcí p63 a p73. Konformace metaloproteinu p53 je závislá na přítomnosti zinku. Mutp53 proteiny mají destabilizovanou konformaci a jsou velice náchylné ke ztrátě zinku. Jeden ze směrů protinádorových terapií je reaktivace p53, která vede ke změně mutp53 na wtp53. V poslední době se ukazuje, že suplementace zinkem může hrát v tomto procesu významnou roli. Mechanismus reaktivace stále ještě není plně objasněn (1). Cílem naší práce bylo posouzení vlivu mutace p53, role zinečnatých iontů a proteinů p63 a p73 na působení různých cytostatik u glioblastomových buněčných linií U87, Onda 10, Onda 11 a U251. Materiál a metodika Byly použity glioblastomové linie U251, U87, Onda10 a Onda11, u kterých byl zkontrolován status genu TP53 sekvenací cDNA. Buňky byly ovlivněny působením 1 µM cisplatiny, 0,1 µM doxorubicinu, 5 µM 5-FU a 1µM nutlinu v kombinaci s 100 µM ZnCl 2 dle (1). Detekce exprese p53 a cílových genů na proteinové úrovni byla provedena pomocí SDS-PAGE, WB s imunodetekcí pomocí monoklonálních protilátek proti p53, aktinu, MYC, VEGF, BAX, p21, MDM2, Kaspase-3 dle (1-3). Detekce exprese cílových genů na úrovni mRNA byla provedena pomocí RT-PCR dle (3). Buněčné přežívání a test MTT byl proveden dle (1). Výsledky Pro studium vlivu mutace TP53, proteinové rodiny p63 a p73 a především vlivu zinečnatých iontů na působení cytostatik byly použity glioblastomové linie U87 (wtp53), U251 (R273H), Onda10 (G245S) a Onda11 (R273C). Pomocí sekvenace cDNA byl status TP53 v těchto liniích ověřen a byl také detekován polymorfismus na AK 72 pomocí PCR a restrikčního štěpení (Van91).
158
Pozorovali jsme, že různá cytostatika (cisplatina, 5FU a doxorubicin) ovlivňují expresi p53 a cílových genů na proteinové i RNA úrovni různým způsobem v závislosti na testované linii a typu mutace p53. Vliv jednotlivých cytostatik na úroveň exprese p53 a jeho stabilizaci je znázorněn na obr. 1. Cisplatina stabilizuje p53 u U251 a Onda11, 5-FU u U251 a Onda10 a doxorubicin u všech. Regulace exprese p53 a příslušných cílových genů BAX, PUMA, p21, MSP a VEGF, MYC po působení cytostatiky na úrovni mRNA byla také závislá na typu
mutace.
Výsledek
RT-PCR
při
použití
cisplatiny u linií U87 (wtp53) a U251 (R273H) ukazuje obr. 2. Mutp53 R273H (U251) vykazuje částečně
zachovanou
schopnost
reagovat
na
cytotoxický stres, aktivaci p21 a PUMA, ale např. inhibuje
pro-apoptotický
BAX.
Z výsledků
vyplynulo, že studované buněčné linie jsou vhodné pro reaktivaci mutp53. Především nás zajímalo, zda by suplementace zinečnatými ionty mohla ovlivňovat proonkogenní chování buněk nesoucí mutp53. Při studiu vlivu zinečnatých iontů na buněčné přežívání v
reakci na
působení
doxorubicinem a
cisplatinou jsme pozorovali významné zvýšení buněčné smrti u linií U251 a Onda11, které byly před působením vlastním cytostatikem nejdříve
vystaveny
působení
ZnCl 2 ,
ve
srovnání s působením samotného cytostatika (obr. 3). Toto zjištění je v souladu s dříve publikovanými výsledky pro linii karcinomu prsu (SKBR3) exprimující R175H (1) a naznačuje, že suplementace zinkem může mít vliv na protinádorovou léčbu i námi zkoumané mutace p53 (R273H a R273C). Je zajímavé, že v případě mutace G245S linie Onda10 jsme tento jev nepozorovali. Dále jsme zjišťovali vliv suplementace zinečnatými ionty na buněčnou smrt vyvolanou cytostatiky v buňkách exprimujících mutatní p53. Prováděli jsme testy cytotoxicity pro samotná cytostatika a v kombinaci se suplementací ZnCl 2 . Výsledky testu MTT pro doxorubicin ukázaly, že 159
na všechny linie má suplementace pozitivní vliv. Ale v případě linií U87 (wtp53) a Onda10 (G245S) byl pozorován také inhibiční účinek samotného ZnCl 2 . Dále jsme zkoumali vliv zinečnatých iontů na interakce rodiny proteinů p53 s DNA in vitro a v buňkách pomocí EMSA, mikroskopickými technikami a luciferázovým reportérovým testem. V souladu s experimenty s p53 (4) jsme zjistili, že Zn2+ inhibuje vazbu purifikovaných proteinů p53, p63 a p73 k DNA, tato inhibice byla reverzibilní. Je zajímavé, že tento inhibiční efekt jsme nepozorovali přímo v buňkách, kde byla měřena interakce p53, p63 a p73 s DNA pomocí luciferázového reportérového testu. Jedním z možných mechanizmů onkogenního chování mutp53 je interakce s p63 a p73. Podařilo se nám detekovat tuto interakci pomocí imunoprecipitace
s anti-p63
a
anti-p73
protilátkami a detekcí mutp53 (DO1). U linie Onda11
(R273C)
jsme
pozorovali
snížení
interakce s p73 a p63 v důsledku působení cisplatiny. Naopak u linie U251 (R273H) se množství precipitovaného proteinu zvýšilo. Tedy opět reakce na působení cytostatik závisí na typu mutace p53 a buněčné linii. Při sledování aktivace apoptotických drah pomocí imunodetekce jsme zjistili, že suplementace zinkem pozitivně ovlivňuje aktivaci kaspáz (kaspázy-3) i proteolytické štěpení p53, které je spojeno s jeho rolí při apoptóze (obr. 4). Závěr Naše výsledky z testů buněčného přežívání, cytotoxicity, exprese cílových genů p53 spojených s indukcí apoptózy a zástavy buněčného cyklu ukazují, že suplementace zinečnatými ionty příznivě ovlivňuje účinek použitých chemoterapeutik u glioblastomových linií U251, Onda11 a Onda10 exprimujících mutantní proteiny p53, ale je závislá na typu mutace. Zároveň jsme pozorovali, že zinečnaté ionty mají relativně silný vliv např. na inhibici vazby izolovaných proteinů p53, p63 a p73 na DNA při exprimentech in vitro. Dále se podařilo detekovat interakci p63, p73 s mutp53 v liniích Onda11 a U251, v závislosti na působení cytostatik. Předpokládáme využití těchto poznatků při kombinační terapii cílené na léčbu nádorů s mutantní p53. Práce byla financována v rámci projektu IGA 103/2013/FAF Seznam literatury: (1) Puca, R.et al. Cell cycle 2011, 10, 1679-1689.; (2) Brazdova, M. et al. PloS one 2013, 8, e59567; (3) Brazdova, M. et al.: Nucleic acids research 2009, 37, 1486-1500. (4) Palecek et al. Oncogene 1999, 18(24):3617-25.
160
Návrh a syntéza nových inhibitorů HDAC jako potenciálních terapeutik Eva Charvátová, Pavel Janík, Kristýna Babejová, Jana Nygrýnová, Pavel Bobáľ Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Terapeutické využiti inhibitorů histondeacetylas (HDACi), prokázané v in vitro a také v in vivo testech, je skutečné široké. Patří k němu léčba nádorů na epigenetické úrovni, imunomodulační, antiflogistický, antifibrotický a antiprotozoální účinek, stimulační učinek na replikaci virů (HIV ad.), prevence neurodegenerativních onemocnění, metabolického syndromu, diabetu 2. typu atd.. Poměr účinnosti a toxicity první třídy inhibitorů HDACi, prokázaný během klinických zkoušek, je možné považovat za přijatelný. Jako nejčetnější se u pacientů v klinických studiích objevovaly gastrointestinální potíže a částečně i kardiotoxicita, a proto se může vývoj inhibitorů histondeacetylas s dobrou perorální dostupností jevit problematický i u látek, které mají výhodné farmakokinetické vlastnosti. Vývoj inhibítorů nové generace s vysokou selektivitou vůči jednotlivým izoformám HDAC je nadějí pro širší využití této skupiny jako potenciálních léčiv.1 Z chemického hlediska představují inhibitory histondeacetylas (HDACi) různorodou skupinu. Jedná se zejména o hydroxamové kyseliny, cyklické peptidy obsahující alifatický thiol nebo depsipeptidy, benzamidy, alifatické karboxylové kyseliny a jiné.2
Materiál a metodika Inhibiční aktivita většiny inhibitorů HDAC souvisí s jejich schopností vázat kationy zinku. Aktivní místo enzymu HDAC je úzká štěrbina s kationem zinku umístěným na dně této štěrbiny. Většina účinných inhibitorů proto obsahuje alifatický spojovací řetězec tvořený několika atomy uhlíku. Hydroxamová
funkční
skupina
slouží
k chelataci
zinku
a
tzv.
„hlavice“
interaguje
s aminokyselinami, které jsou na povrchu aktivního místa enzymu. O
H N
N H
O
OH
R3
Y
spojovací řetězec
R2
X
O
SAHA "hlavice"
R1
H N
X = NH, -(CH)2skupina vázající kov
"hlavice"
spojovací řetězec
H N OH O
Y = O, CH2 skupina vázající kov
Obrázek 1: Struktury SAHA a navržených potenciálních inhibitorů. Našim záměrem bylo připravit nové inhibitory HDAC, jako analogy již existujících a v praxi využívaných inhibitorů typu SAHA, s funkční skupinou hydroxamové kyseliny, jako skupiny vázající kov (obr. 1). Tato skupina vykazuje vynikající chelatační schopnosti, při zachování malých
161
rozměrů. To jí předurčuje pro volný průnik štěrbinou aktivního místa enzymu. Přítomnost nenasycených vazeb a aromatických nebo heteroaromatických jader zvyšuje vazebnou schopnost inhibitoru k enzymu. Při syntéze sloučenin obsahujících benzenové jádro byly použity dvě metody: klasická lineární 4 stupňová (metoda A) a pro zlepšení celkového výtežku také konvergentní 5 stupňová metoda (metoda B) založena na Mizoroki-Heckově reakci3 (schéma 2). První metoda (schéma 1) vycházela ze substituovaného anilinu, který byl převeden na chloracetanilid. Chloracetanilid reagoval v alkalickém prostředí s 4-hydroxybenzaldehydem za vzniku alkoxylovaného benzaldehydu, jenž posléze reagoval s methylesterem kyseliny dimethylfosfonooctové. Touto tzv. Horner-WadsworthEmmonsovou reakcí se vytvořil kondenzační produkt – ester, který vedl, reakcí s hydroxylaminem v silně bazickém prostředí, ke vzniku hydroxamové kyseliny. NH2
Cl
O
H N
Cl
O TEA, THF
Cl
HO
O
R3 O O P O
O N H
H N
O O
K2CO3 aceton
R3
R3
O
H N
O
DBU OCH3
O
OH H2NOH.HCl
O
CH3ONa CH3OH
O R3
OCH3
H N
O O
R3
Schéma 1: Lineární syntéza potenciálních inhibitorů s benzenovým jádrem – metoda A. Při druhé metodě byl N-(4-hydroxyfenyl)acetamid převeden na na 4-hydroxyfenyldiazonium tetrafluoroborát, který, po cross-couplingu s methyl-akrylátem katalyzovaným palladiem, poskytl ester 4-hydroxyskořicové kyseliny. Ester byl posléze alkylován chloracetanilidem a následně transformován na cílovou hydroxamovou kyselinu. O
H N
OCH3
2. NaNO2
O
HO
N2BF4
1. HBF4
O OCH3
Pd(OAc)2, AcONa CH3OH
HO
HO H N
R3
O N H
H N
O O
R3
O
Cl K2CO3 aceton
O
OH H2NOH.HCl CH3ONa CH3OH
OCH3
H N
O O
R3
Schéma 2: Konvergentní syntéza potenciálních inhibitorů s benzenovým jádrem – metoda B.
162
Při syntéze inhibitorů obsahujících pyrrolové jádro (schéma 3) se využila klasická syntéza pyrrolu. Připravený pyrrol byl následně oxidován na aldehyd4. Kondenzační produkt vzniklý reakcí aldehydu s benzylesterem kyseliny dimethylfosfonooctové se hydrogenoval s cílem odstranit esterovou funkci a posléze se převedl na anilid. Stávající esterová skupina na pyrrolovém jádře se hydrolyzovala v alkalickém prostředí. Po reakci s triethylorthoformiátem v prostředí trifluoroctové kyseliny poskytla získaná kyselina pyrrolkarbaldehyd. Sledem již známých krokú byly připraveny cílové hydroxamové kyseliny. O
O
O O P O
OEt O
1. Zn, AcOH O
O
NaNO2 AcOH
2. B2H6, THF
CAN
N H
EtO
CH3OH
O EtO
N H
O
O
DBU
OH
N
O EtO
N H
1. H2, Pd, THF 2. PhNH2, T3P AcOEt
OEt O
OBn
O OBn
O 1.
O O P O
O OCH3
DBU
H HO N
N H O
O
NHPh
1. LiOH, THF, H2O
2. H2NOH.HCl CH3ONa CH3OH
O
N H
O 2. TEOF, CF3COOH
O EtO
N H
NHPh
O
NHPh
Schéma 3: Příprava inhibitoru obsahující pyrrolový kruh. Výsledky Byly vypracovány postupy přípravy nových potenciálních inhibitorů HDAC obsahující aromatické a heteroaromatické (konkrétně pyrrolové) jádro. Připravené nové a v literatuře nepopsané látky se charakterizovaly pomocí spektrálních metod a budou podrobeny in vitro hodnocení jejich inhibiční aktivity. Tato práce byla financovaná grantem IGA č. 108/2013/FaF. Seznam literatury 1.
Monneret, C. Histone Deacetylase Inhibitors Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1-13.
2.
Dokmanovic, M.; Clarke, C.; Marks P.A. Histone Deacetylase Inhibitors: Overview and Perspectives. Mol. Cancer Res. 2007, 5, 981-989.
3.
Schmidt, B.; Holter, F.; Berger, R.; Jessel, S. Mizoroki–Heck Reactions with 4Phenoldiazonium Salts. Adv. Synth. Catal. 2010, 352, 2463-2473.
4.
Bobal P., Lightner D.A. An Inexpensive, Selective Procedure for Oxidizing α-Methyl to αFormyl Pyrroles. J. Het. Chem. 2001, 38, 1219-1221.
163
Práva k duševnímu vlastnictví ve farmacii: právní úprava a jeho ochrana v EU Intellectual Property Rights in Pharmacy: Protection and Enforcement in the European Union Valeryia Stukina Department of Applied Pharmacy, Faculty of Pharmacy, The University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno Brief Introduction
The problem of counterfeit medicines has become a global humanitarian catastrophe, harming public health, the reputation and earnings of pharmaceutical companies. Counterfeiting of medicines indicates a growing violation of intellectual property rights (IPRs) and unfair competition practices. In the 21th century international trade requires the protection of IPRs on a higher standard with the use of all modern legal instruments. The aim of this study was through analysis of the current IPRs legislation to give recommendations for its improvement and evaluate its main development trends in the pharmaceutical industry of the European Union (the EU).
Material and methodology
Subject matter The study was limited to current legislation on the protection of IPRs in the EU. During the study were examined basic international conventions, European law on IPRs1, competition law, criminal and administrative legislation of the Member States of the EU2, and its protection and enforcement3.
Methodology The main methods applied in the law that were used during the project are the methods of formal logic (analysis and synthesis, induction and deduction, comparison and analogy, hypothesis proven). During research were also used primarily comparative, systematic and historical methods. Method of comparative law is based on the study and use of legal regulation of similar relations in various national legal systems. Comparative analysis of legislation made possible to determine legislative gaps, identify possible options for overcoming the conflicts of laws in Europe.
164
Systematic method allowed considering IPRs as a complex institution. Historical method allowed considering the establishment and development of intellectual property law, to identify common trends in its evolution. There is an essential for scientific work - specific sociological research methods - used in law: analysis of statistical data, including data statistics litigation and arbitration. During the studies the legislation, statistical data and reports from pharmaceutical companies and international (the International Intellectual Property Organization, the World Health Organization, the International Labour Organization, the World Customs Organisation) and European organizations (associations), as well as court decisions were examined. Complex method of analysis: improvement of the legal regulation of intellectual property relations is obviously impossible without serious analysis of their economic nature.
Results The study provided an analysis of interdependence between counterfeit medicines and public health keeping in mind infringement of intellectual property rights and growing of unfair competition in the global pharmaceutical marketplace4. The right to health is solidly embedded in international, regional and national human rights instruments. Counterfeiting is a serious offence against the right to health and even right to life both of everyone and of nations. It is endangering public health and safety, in addition, hampering investment in research and development and creativity. International organisations and the EU, national governments and Pharma are showing increased cooperation and working together more via the International Medical Product AntiCounterfeiting Task Force (IMPACT) WHO and other initiatives. There are many problems in counterfeit fightingwith the organized crime networks: lack of appropriate medicine legislation and special national legislation on counterfeit medicines; corruption and conflict of interest; etc. Counterfeiters keep up with the latest technological developments. However, these technologies can make an effective contribution to building efficient anti-counterfeiting strategies, especially in the areas of physico-chemical methods of counterfeit medicines’ identification, authentication and traceability. One of the key quality characteristics of the pharmaceutical market is the presence of significant barriers, such as patents, to the entry of potential competitors. Also patents are one of the main instruments in the intellectual property protection. The patents, is one of the key instruments of the new active pharmaceutical ingredients or finished dosage forms protection in the very competitive and high cost pharmaceutical industry5.
165
Patenting alone does not guarantee a marketing success, the company must think about the commercialisation of patented inventions. The economic aspects must be taken into account at every stage of new medicines development as well as at every phase of patent receiving. The patents’ choice problem in pharmacy is complicated as there are many new types of patents and strategies of their using or misusing. Studying the problems and perspectives of the IPRs in the EU it became clear that the current coexistence of European and national rules are too complicated and should be modernised. The European Commission had adopted a comprehensive strategy to update the legal framework in which IPRs operate. The objective is to enable inventors, creators, users and consumers to adapt to the new circumstances and to enhance new business opportunities. The new rules have its advantages and disadvantages and the process of signing and ratification comes with a great difficulty. It will make a real difference to pharmaceutical industry (the simplified patent system could activate the troll infringement), so the main question is getting the balance and ensure the enforcement of rights. This will benefit the EU's growth and competitiveness which is delivered through the single market of IPRs. The planned establishment of the European Unitary patent system and the Unified Patent Court6, the reformation of trademarks system, increased interest in the less regulated but still very influences system of brand protection – that will be the new realities and challenges for the pharmaceutical industry. Last decades we saw the mergence of more powerful pharmacy companies with big patent pools which have to study to earn in new circumstances with new legal rules not only in the EU, but in the USA and Asia. Seznam literatury: 1. EUR-Lex: access to European Union. Europa.eu: [official website of the European Union] [online]. Brussels: European Union, ©1998–2013 [cit. 2013-11-28]. Available from: http://eurlex.europa.eu/en/index.htm 2. WIPO Lex. World Intellectual Property Organization [online]. Geneva: World Intellectual Property Organization, [20 September 2010] [cit. 2013-11-28]. Available from: http://www.wipo.int/wipolex/en/ 3. VRINS, Olivier a Marius SCHNEIDER. Enforcement of intellectual property rights through border measures: law and practice in the EU. Oxford: Oxford University Press, 2012. ISBN 9780199692934. 4. CAGGIANO, Giandonato, Gabriella MUSCOLO a Marina TAVASSI. Competition law and intellectual property: a European perspective. Alphen aan den Rijn: Kluwer Law International, 2012, xxiv, 402 s. ISBN 9789041134479. 5. GRUBB, Philip W. a Peter R. THOMSEN. Patents for chemicals, pharmaceuticals, and biotechnology: fundamentals of global law, practice, and strategy. Fifth ed. New York: Oxford University Press, 2010. ISBN 978-0-19-957523-7. 6. Communication from the Commission: A Single Market for Intellectual Property Rights Boosting creativity and innovation to provide economic growth, high quality jobs and first class products and services in Europe. In: Brussels, 24.5.2011, COM (2011) 287. Available from: http://ec.europa.eu/internal_market/copyright/docs/ipr_strategy/COM_2011_287_en.pdf
166
