Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012-2013
Validatie van een analytische methode gebruik makend van hoge-resolutie massaspectrometrie voor het meten van geneesmiddelenresidu’s in afvalwater
Ashley Haeck Promotoren: Prof. Dr. ir. Kristof Demeestere Prof. Dr. ir. Herman Van Langenhove Tutor: ir. Leendert Vergeynst
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: milieutechnologie
De auteur en promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopi¨eren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using from this thesis. Gent, juni 2013
De promotoren
Prof. Dr. ir. Kristof Demeestere
Prof. Dr. ir. Herman Van Langenhove
De tutor
De auteur
ir. Leendert Vergeynst
Ashley Haeck
iii
Woord vooraf
To get lost is to learn the way 330 dagen. Zo lang heb ik boven dit werk gezwoegd en gezweet. Maar het was het waard, absoluut. Met deze woorden leg ik de laatste hand aan mijn opleiding tot bio-ingenieur waarin ik veel heb bijgeleerd. Daarmee bedoel ik niet alleen de rugzak vol kennis, maar evenzeer een persoonlijk evolutie. Het werk dat op dit eigenste moment voor u ligt, zou nooit tot stand zijn gekomen zonder ontelbare helpende handen. Eerst en vooral wil ik ir. Leendert Vergeynst, mijn tutor bedanken. Omdat hij mij door de wereld van analyse en statistiek heeft geleid, mij bijstond met woord en daad en mij weer de moed gaf als ik het even niet zag zitten. Ook dankuwel aan mijn promotoren Prof. dr. ir. Kristof Demeestere en Prof. dr. ir. Herman Van Langenhove voor hun goede raad, bijsturing en kritische blik. Ing. Patrick De Wispelaere bedank ik graag voor de analyses en voor informatie over de toestellen. Eveneens bedankt aan Aquafin en in het bijzonder aan mevrouw Marleen Peereman voor de waterstalen en algemene gegevens van de RWZI van Schilde. Aan iedereen op EnVOC: dankuwel voor de activiteiten, de goede raad, de grappen en gesprekken die de thesis even deden vergeten. Dankuwel Niels, gewoon omdat je er bent. En tot slot dankuwel aan mijn ouders, voor de onvoorwaardelijke steun. Om me te leren vertrouwen in mijn kunnen, te durven dromen en door te bijten als het even tegen zit.
Ashley Haeck Gent, 5 juni 2013
iv
v
Samenvatting Titel: Validatie van een analytische methode gebruik makend van hoge-resolutie massaspectrometrie voor het meten van geneesmiddelenresidu’s in afvalwater Trefwoorden: milieu - organische micropolluenten - geneesmiddelen - analyse - methodevalidatie - waterzuivering Het gedrag en voorkomen van sporenconcentraties van geneesmiddelen (onder andere antibiotica, ontstekingsremmers, anti-depressiva en antivirale middelen) heeft recent wereldwijd wetenschappelijke belangstelling verworven omwille van de toenemende ongerustheid over de mogelijke effecten op de mens en het milieu (bijvoorbeeld antibioticaresistentie, toxiciteit, endocriene verstoring en bio-accumulatie). Recent onderzoek toont aan dat de farmaceutische stoffen reeds aanwezig zijn in het oppervlaktewater in concentraties tussen 10−3 en 102 µg.L−1 . In het kader van deze masterproef wordt een multi-residumethode voor het meten 43 farmaceutische stoffen (18 antibiotica, 9 antivirale middelen, 12 neuro-actieve stoffen en 4 ontstekingsremmers en pijnstillers) in RWZI-influent en -effluent ontwikkeld met als krachtlijnen vaste-fase extractie (SPE), hoge-performantie vloeistofchromatografie (HPLC) en hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS). Specifiek worden in dit werk de instrumentele validatie, de SPE-methodeoptimalisatie en de uiteindelijke methodevalidatie onderzocht en besproken. De intrumentele validatie van de HPLC-HRMS methode brengt de kruiscontaminatie, precisie (herhaalbaarheid), sensitiviteit en lineariteit in kaart. Voor alle 43 componenten komt de laagst detecteerbare concentratie (beslissingsgrens) overeen met de laagste geteste concentratie (20 µg.L−1 ). Het effect van zeven parameters van de vaste-fase extractie wordt onderzocht en geoptimaliseerd voor RWZI-effluent met als doelstelling een optimale proceseffici¨entie tussen 60 en 140% te bekomen. Een vernieuwend aspect hierbij is dat tevens rekening houdend wordt met de herhaalbaarheid van de SPE methode. Voor 36 van de 43 componenten wordt een globale processeffici¨entie tussen 60 en 140% bekomen; voor slecht zeven componenten is de processeffici¨entie < 60%. De geoptimaliseerde methode wordt gevalideerd op basis van de precisie, accuraatheid en sensitiviteit voor zowel RWZI-influent als effluent water voor een concentratiebereik van 20 ng.L−1 tot 12,5 µg.L−1 . Voor 34 van de 43 componenten wordt over het volledige concentratiebereik variatieco¨effici¨enten kleiner dan 20% bekomen onder reproduceerbaarheidscondities. Relevante detectie limiteten in de grootteorde van ng.L−1 tot µg.L−1 voor zowel RWZI-influent als effluent water worden bekomen voor de 43 componenten. Als proof-of-concept wordt de geoptimaliseerde methode toegepast op zowel het influent als het effluent van de RWZI van Schilde. Gedurende vier opeenvolgende dagen worden influent en effluent continu bemonsterd en zowel basisparameters als de concentraties van de 43 geneesmiddelen worden opgevolgd. Voor 26 geneesmiddelen worden concentraties gemeten tussen 1 ng.L−1 en 100 µg.L−1 en voor 11 componenten zijn voldoende data beschikbaar om verwijderingseffici¨enties te berekenen. Opvallend hierbij is dat de componenten met de hoogste influentconcentraties (tot > 50 µg.L−1 ), de hoogste verwijderingseffici¨enties vertonen (tussen 75 en > 99%). Hoewel de waterzuivering een duidelijke reductie van de meest abundante componenten veroorzaakt, kan besloten worden dat deze een belangrijke input van geneesmiddelen naar het milieu vormt met geobserveerde concentraties tusen 1 en 650 ng.L−1 .
vi
vii
Inhoudsopgave Woord vooraf
iv
Samenvatting
vi
Lijst van figuren
xii
Lijst van tabellen
xiv
Lijst van afkortingen
xvii
Inleiding
1
I
Literatuurstudie
3
1
Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu
4
1.1
Probleemstelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2
Bronnen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3
Fysisch-chemische eigenschappen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.4
Traject van farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.4.1
Farmaceutische stoffen in het lichaam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.4.2
Farmaceutische stoffen in het afvalwater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.4.3
Farmaceutische stoffen in oppervlaktewater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.4.4
Farmaceutische stoffen in drinkwater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.5 2
Risicobeheer en mitigerende maatregelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Analyse van farmaceutische residu’s in water 2.1
Vaste-fase extractie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2
Chromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3
Massaspectrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.3.1
Ionisatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.3.1.1
viii
11
Elektrospray ionisatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3.1.2 2.3.2
3
II
Andere ionisatiemethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Massa-analysers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.2.1
Magnetische sector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3.2.2
Dubbelfocuserende massa-analyser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.2.3
Andere massa-analysers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Validatie
21
3.1
Kruiscontaminatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.2
Lineariteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3
Precisie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.4
Accuraatheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.5
Specificiteit en selectiviteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6
Sensitiviteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.7
Stabiliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Experimenteel werk
25
4
Doelstelling
26
5
Methodologie
27
5.1
5.2
5.3
Farmaceutische stoffen, oplossingen en glaswerk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 5.1.1
Farmaceutische stoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
5.1.2
Andere oplossingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
5.1.3
Silanisatie van glaswerk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Staalname in RWZI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 5.2.1
Staalname voor methode-optimalisatie en -validatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
5.2.2
Staalname van influent en effluent van de RWZI te Schilde . . . . . . . . . . . . . . 28
Analytische procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 5.3.1
Staalbewaring en -voorbereiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
5.3.2
Vaste-fase extractie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5.3.3
Vloeistofchromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5.3.4
Hoge-resolutie massaspectrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5.3.5
Interne kalibratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
ix
5.4 6
Validatieparameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Resultaten en discussie 6.1
6.2
Instrumentele validatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 6.1.1
Kruiscontaminatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
6.1.2
Precisie: herhaalbaarheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
6.1.3
Sensitiviteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
6.1.4
Lineariteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Optimalisatie van de SPE-methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 6.2.1
Selectie van de te optimaliseren parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
6.2.2
Proefopzet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
6.2.3
Evaluatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
6.2.4
Resultaten en interpretatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
6.2.5
6.3
6.4
6.2.4.1
Gemiddelde proceseffici¨entie en herhaalbaarheid voor MID 1 . . . . . . . 37
6.2.4.2
Per component . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Evaluatie van de geoptimaliseerde SPE-methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 6.2.5.1
Reproduceerbaarheid van de proceseffici¨entie . . . . . . . . . . . . . . . 44
6.2.5.2
Uitbreiding van 16 naar 43 componenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Methodevalidatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 6.3.1
Proefopzet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
6.3.2
Precisie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6.3.3
Accuraatheid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 6.3.3.1
Proceseffici¨entie per concentratieniveau . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6.3.3.2
Onzekerheid op de proceseffici¨entie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.3.3.3
Matrixeffect en terugvinding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6.3.3.4
Globale proceseffici¨entie voor gehele concentratiebereik . . . . . . . . . . 51
6.3.3.5
Achtergrondconcentratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
6.3.4
Sensitiviteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
6.3.5
Algemene beoordeling van de multi-residumethode: performantielabel voor elke component . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Toepassing van de methode: analyse van het influent en effluent van de RWZI te Schilde . . 55 6.4.1
x
33
Basisparameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6.4.2
Proefopzet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.4.3
Concentratie, belading en verwijderingseffici¨entie van geneesmiddelenresidu’s in het RWZI te Schilde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 6.4.3.1
Concentratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.4.3.2
Belading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
6.4.3.3
Massabalans van de effluenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
6.4.3.4
Verwijderingseffici¨enties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
7
Conclusie
62
8
Suggesties voor verder onderzoek
63
III
Bibliografie
64
Bibliografie
65
IV
69
Bijlagen
A Methodologie
70
B Resultaten
72
B.1 Instrumentele validatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 B.2 Optimalisatie van de methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 B.3 Methodevalidatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 B.4 Toepassing van de methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 C CD met figuren
90
xi
Lijst van figuren 1.1
xii
Overzicht van gerapporteerde verwijderingseffici¨enties in RWZI’s. De componenten werden gerangschikt volgens stijgende mediaan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
2.1
Weergave van de staalvoorbereiding met behulp van vaste-fase extractie. . . . . . . . . . . . 11
2.2
Oasis HLB-hars: copolymeer van polydivinylbenzeen en N-vinylpyrrolidon. . . . . . . . . . 12
2.3
Chemische structuur van EDTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.4
Weergave van elektrospray ionisatie (Gaskell, 1997). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.5
De 10%-valley- en de full width at half maximum-weergaves van resolving power. . . . . . 17
2.6
Weergave van een dubbel focuserende analyser (Demeestere, 2011). . . . . . . . . . . . . . 18
5.1
Schematische weergave van de aanmaak van standaarden en oplossingen. . . . . . . . . . . 27
5.2
Silanisatiereactie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
5.3
Schematische weergave van de RWZI in Schilde met staalnameplaatsen (brede pijlen). . . . 29
5.4
Schematische weergave van de koppeling tussen HPLC en HRMS. . . . . . . . . . . . . . . 31
6.1
Vergelijking tussen de lineaire (lm) en de kwadratische regressiecurve (qm) voor flumequine op basis van 1/x-gewogen residuele fouten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
6.2
Schematische weergave van de optimalisatie-experimenten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
6.3
Indeling van een boxplot in het programma R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
6.4
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’pH van het staal’ (n = 2x16x3)(referentie = pH 3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
6.5
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Soort proefbuis’ (n = 16x2x3). PP staat voor polypropyleen, NS voor niet-gesilaniseerd en S voor gesilaniseerd (referentie = NS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
6.6
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Toevoeging van EDTA’, met al dan niet een toevoeging van 0,1% EDTA (n = 16x2x3)(referentie = ge. . . . . . . . . 39
6.7
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Wascondities’ (n = 16x2x3). 12 + 2,5 staat voor 12 mL gedistileerd water met 2,5% methanol, 0, 12 en 24 stellen 0 mL, 12 mL en 24 mL gedistileerd water voor (referentie = 0 mL). . . . . . . . . . . 40
6.8
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Elutiecondities’ (n = 16x2x3). 10 EAc staat voor 10 mL ethylacetaat, 5 M staat voor 5 mL methanol, 10 M staat voor 10 mL methanol en 5+5 staat voor een mengsel van 5 mL methanol en 5 mL ethylacetaat (referentie = 10 mL MeOH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
6.9
Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Tvap’ (n = 16x2x3). 25 en 40 staan respectievelijk voor 25°C en 40°C (referentie = 40°C). . . . . . . . . . . . . 41
6.10 Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Staalvolume’ (n = 16x2x3). 50, 100, 250 en 500 staan voor de overeenkomstige staalvolumes in mL referentie = 500 mL). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 6.11 Overzicht van de optimalisatie-experimenten op basis van de accuraatheid (proceseffici¨entie %) (n = 16x3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 6.12 Overzicht van de optimalisatie-experimenten op basis van de herhaalbaarheid van de methode (n = 3) (variatieco¨effici¨ent %) (n = 16x3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 6.13 Schematische weergave van de methodevalidatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 6.14 Het lineaire verband tussen de theoretische en berekende concentratie, op basis van een gewogen kwadratische regressie. De donkere curve stelt Vergelijking 6.17 voor, de lichtere curve Vergelijking 6.18. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 6.15 Verdeling van de performantielabels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
xiii
Lijst van tabellen
xiv
2.1
Overzicht van de SPE-methodes voor farmaceutische stoffen in de recente literatuur: methodes met Oasis HLB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.2
Overzicht van de SPE-methodes voor farmaceutische stoffen in de recente literatuur: methodes met andere sorbentia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.1
Richtlijnen omtrent de terugvinding en precisie van pesticiden in functie van hun concentratie in plantaardige en dierlijke matrices (Europese Commissie, 2010). . . . . . . . . . . . 22
5.1
PEG-ionen gebruikt voor de normalisering van de piekoppervlakken. . . . . . . . . . . . . . 32
5.2
Onderdelen van de methodevalidatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
6.1
Overzicht van de verschillende optimalisatie-experimenten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
6.2
Initi¨ele en ge¨optimaliseerde SPE-methode van de optimalisatie. . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6.3
Reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde methode voor MID 1. Deze tabel geeft de proceseffici¨enties weer van de vier herhalingen van de geoptimaliseerde SPE-methode, samen met de herhaalbaarheid (VCC (%)). Van de vier proceseffici¨enties wordt een gemiddelde (PE gemiddelde) en de reproduceerbaarheid (als variatieco¨effici¨ent VCP E (%)) weergegeven. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6.4
Resultaten van de finale methode na optimalisatie: proceseffici¨entie (%) en herhaalbaarheid, weergegeven als variatieco¨effici¨ent (%) (n = 3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
6.5
Stalen die werden getoetst bij de validatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
6.6
Gemiddelde proceseffici¨entie (%) over het bestudeerde kalibratiebereik en de onzekerheid deze waarde (als standaardafwijking (%) en als variatieco¨effici¨ent (%)), voor effluent en influent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
6.7
Fysisch-chemische parameters van de RWZI te Schilde op de staalnamedagen en de jaargemiddelde waarden voor 2012. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
6.8
Gemiddelde verwijderingseffici¨entie (%) van de basisparameters in de waterzuivering van Schilde voor de vier staalnamedagen (Totaal, MBR, CAS) en jaargemiddelde (Totaal gemiddeld) (CZV = chemische zuurstofvraag, ZS = zwevende stoffen). . . . . . . . . . . . . . 57
6.9
Samenvatting van de resultaten voor de RWZI-stalen uit Schilde, met weergave van de gemiddelde concentratie (ng.L−1 ), de variabiliteit hierop (%, met n = aantal kwantificaties), het aantal detecties (D) en het aantal kwantificaties (K) per component en per soort staal. . . 59
6.10 Massabalans voor de effluenten van de RWZI-stalen uit Schilde met de gemiddelde totale belading (mg.dag−1 ), de afwijking hierop (∆) en het aantal kwantificaties (n) voor elk effluenttype (Totaal/CAS/MBR). Een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak dat werd gebruikt voor deze berekening buiten het kalibratiegebied ligt. . . . 60 6.11 Gemiddelde verwijderingseffici¨enties van de RWZI-stalen uit Schilde. De vetgedrukte waarden geven aan dat het resultaat buiten het kalibratiegebied valt, maar wel kwantificeerbaar is (S/N > 10). N geeft weer hoeveel waarden voor de belading in het effluent werden meegenomen bij de berekening. Een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak dat werd gebruikt voor deze berekening buiten het kalibratiegebied ligt. . . . 61 A.1 Overzicht van de 43 beschouwde componenten en hun relevante eigenschappen (Van Rompu, 2012). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 A.2 Overzicht van de beschouwde componenten met hun ATC-classificatie en hun gebruik en de aanduiding of het een humaan (H) of veterinair (V) geneesmiddel is (Van Rompu, 2012).
71
B.1 Een overzicht van de instrumentele detectie- en kwantificatielimieten. . . . . . . . . . . . . 72 B.2 Resultaten van de verschillende optimalisatie-experimenten: proceseffici¨enties (%). . . . . . 74 B.3 Resultaten van de verschillende optimalisatie-experimenten: variatieco¨effici¨enten (%). . . . 75 B.4 Groepsindeling van de componenten op basis van de S/N-verhouding bij injectie van een standaard van 10 µg.l−1 en de proceseffici¨entie bepaald bij de geoptimaliseerde methode. . . 76 B.5 Resultaten van de reproduceerbaarheid (variatieco¨effici¨ent, VCC (%)) per concentratieniveau voor effluent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 B.6 Resultaten van de reproduceerbaarheid (variatieco¨effici¨ent, VCC (%)) per concentratieniveau voor influent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 B.7 Resultaten van de proceseffici¨entie (%) per concentratieniveau voor effluent. . . . . . . . . . 79 B.8 Resultaten van de proceseffici¨entie (%) per concentratieniveau voor influent. . . . . . . . . . 80 B.9 Onzekerheid op de proceseffici¨entie, weergegeven in variatieco¨effici¨enten (VCP E , %) per concentratieniveau voor effluent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 B.10 Onzekerheid op de proceseffici¨entie, weergegeven in variatieco¨effici¨enten (VCP E , %) per concentratieniveau voor influent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 B.11 Verklaring van de proceseffici¨entie met behulp van matrixeffecten en terugvinding voor effluent bij 500 ng.L−1 (? 100 ng.L−1 ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 B.12 Verklaring van de proceseffici¨entie met behulp van matrixeffecten en terugvinding voor influent bij 12 500 ng.L−1 (? 2 500 ng.L−1 ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 B.13 Achtergrondconcentratie (x0 ) voor componenten met S/N > 10, methodebeslissingsgrens (CCα ) en -detectievermogen (CCβ ) en de overeenkomstige S/N-waarden voor influent en effluent. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
xv
B.14 Berekende concentraties (ng.L−1 ) voor de RWZI-stalen uit Schilde. De x staat voor een piek met S/N lager dan 10, een leeg vakje voor een S/N lager dan 3 en een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak buiten het kalibratiegebied ligt, en dat de concentratie aldus werd berekend aan de hand van extrapolatie (Sectie 6.4). . . . . . . . . . 87 B.15 Berekende beladingen (mg.dag−1 )voor de RWZI-stalen uit Schilde. De x staat voor een piek met S/N lager dan 10, een leeg vakje voor een S/N lager dan 3 en een vetgedrukte waarde betekent dat het genormailseerd piekoppervlak buiten het kalibratiegebied ligt, en dat de concentratie aldus werd berekend aan de hand van extrapolatie (Sectie 6.4). . . . . . . 88 B.16 Samenvatting van de resultaten voor de RWZI-stalen uit Schilde, met de gemiddelde belading (mg.dag−1 ), de variabiliteit op de belading (%, met n = K), het aantal detecties (D) en het aantal kwantificaties (K). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
xvi
Lijst van afkortingen A
ACN
Acetonitril
API
Atmospheric pressure ionisation
APCI
Atmospheric pressure chemical ionisation
APPI
Atmospheric pressure photo-ionisation
CAS
Conventioneel actief-slibsysteem
CZV
Chemische zuurstofvraag
D
DDD
Gedefinieerde dagdosis, Defined daily dose
E
EAc
Ethylacetaat
EC50
Effectconcentratie 50%
EDTA
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
ESI
Elektrospray ionisatie
FA
Mierenzuur
FT-ICR
Fourier-getransformeerde ion cyclotron resonantie
FWHM
Full width at half maximum
HLB
Hydrofiele-lipofiele balans
HPLC
Hoge-performantie vloeistofchromatografie
HRMS
Hoge-resolutie massaspectrometrie
HRT
Hydraulische retentietijd
IDL
Instrumentele detectielimiet
IQL
Instrumentele kwantificatielimiet
LC
Vloeistofchromatografie
LC50
Letale concentratie 50%
LOD
Detectielimiet
LOEC
Laagste geobserveerde effectconcentratie
LOQ
Kwantificatielimiet
m/z
Massa/lading-verhouding
MAX
Mixed-mode anion exchange
MBR
Membraanbioreactor
C
F
H
I L
M
xvii
M
MCX
Mixed-mode cation exchange
MDL
Methodedetectielimiet
ME
Matrixeffect
MeOH
Methanol
MID
Multiple ion detection
MQL
Methodekwantificatielimiet
MS
Massaspectrometer
MTBE
Methyl-tertiairbutylether
MTBSTFA
N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide
PE
Proceseffici¨entie
PPM
parts per million
RE
Terugvinding
RWZI
Rioolwaterzuiveringsinstallatie
S/N
Signaal/ruis-verhouding
SPE
Vaste-fase extractie
SRT
Slibretentietijd
T
TOF
Time-of-flight
Z
ZS
Zwevende stoffen
P R S
xviii
xix
Inleiding Het gedrag en voorkomen van sporenconcentraties van geneesmiddelen (onder andere antibiotica, ontstekingsremmers, antidepressiva en antivirale middelen) heeft recent wereldwijd wetenschappelijke belangstelling verworven. Niet in het minst omwille van de toenemende ongerustheid over de mogelijke effecten op de mens en het milieu (bijvoorbeeld antibioticaresistentie, toxiciteit, endocriene verstoring en bio-accumulatie). Recent onderzoek toont aan dat geneesmiddelen en hun residu’s wijdverspreid voorkomen in afvalwater, oppervlaktewater en zelfs drinkwater bij concentraties in de orde van ng.L−1 tot µg.L−1 . Het detecteren en kwantitatief bepalen van dergelijke sporenconcentraties is uitdagend en vergt geavanceerde analytische technieken. Deze thesis focust op het ontwikkelen, valideren en toepassen van een analytische methode gebaseerd op vaste-fase extractie (SPE), hoge-performantie vloeistofchromatografie (HPLC) en hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS) voor een selectie van 43 farmaceutische stoffen uit verschillende therapeutische klassen. Het opstellen van deze methode is van cruciaal belang voor het verwerven van nieuwe kennis omtrent het voorkomen en het gedrag van deze nieuwe groep micropolluenten in het (Vlaamse) aquatisch milieu. Vanuit analytisch oogpunt is de ontwikkelde methode vernieuwend daar het gebruik maakt van HRMS in plaats van de meer state-of-the-art tandem massaspectrometrie. De literatuurstudie leidt de problematiek omtrent het voorkomen van geneesmiddelen in het aquatisch milieu in en geeft een overzicht van de relevante literatuur over het voorkomen van geneesmiddelen in de waterige fase, de analytische methodes voor het meten van geneesmiddelen in afvalwater, en de validatie van de analysemethode. Hierbij wordt vooral gefocust op de methodes die gebruikt worden in het experimentele werk en de 43 geselecteerde farmaceutische stoffen. Voor het experimenteel werk werden vier doelstellingen vooropgesteld. In de daaropvolgende hoofdstukken (methodologie, resultaten en discussie) wordt stap voor stap naar deze doelstellingen toegewerkt. In de conclusies wordt teruggeblikt op de doelstellingen en worden de voornaamste bevindingen van dit onderzoek besproken.
1
2
Deel I
Literatuurstudie
3
Hoofdstuk 1 1.1
Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu
Probleemstelling
Farmaceutische stoffen zijn aan een opmars bezig als onderwerp in studies naar waterkwaliteit (O‘Brien en Dietrich, 2004). Hun continue introductie in het milieu en het risico op ecotoxische effecten zijn zorgwekkend. Deze contaminanten zijn hoogstwaarschijnlijk reeds lang aanwezig in het milieu, maar pas recent wordt aandacht besteed aan hun aanwezigheid en belang (NORMAN, 2006). Kennis omtrent het gedrag en de ecotoxiciteit van deze componenten is relatief beperkt. Het toegenomen onderzoek naar de aanwezigheid van farmaceutische stoffen in het milieu is derhalve nodig omwille van een aantal redenen. Zo leidt de toegenomen bevolking en de bijhorende urbanisatie tot meer en sterker geconcentreerde afvalstromen (O‘Brien en Dietrich, 2004). Verder zijn waterzuiveringsinstallaties niet ontworpen voor de verwijdering van farmaceutische stoffen (O‘Brien en Dietrich, 2004). Bijgevolg komen deze farmaceutische stoffen op een continue basis vanuit de afvalwaterzuiveringsinstallatie in het oppervlaktewater terecht. Daarom worden deze stoffen ook vaak pseudopersistent genoemd (Zhou et al., 2012). Ratola et al. (2012) voegen daar nog een reden aan toe, namelijk dat de wetenschappelijke gemeenschap tot enkele jaren geleden aannam dat de beschouwde componenten sterk biodegradeerbaar zijn. Volgens Kosma et al. (2010) is dit bijvoorbeeld voor diclofenac en carbamazepine niet zo. Ten slotte leidt de continue verbetering van de meettechnieken en -toestellen tot steeds lagere detectielimieten. Met deze technieken is het mogelijk om te bepalen welke organische contaminanten aanwezig zijn, waar ze vandaan komen en in hoeverre ze verwijderd worden uit het afvalwater (Pal et al., 2010). Meer recent rees ook de vraag naar de invloed van antimicrobi¨ele stoffen in het afvalwater op de bacteri¨ele resistentie. Van de Sande-Bruinsma et al. (2008) leggen een verband tussen het gebruik van antibiotica door poliklinische pati¨enten en het voorkomen van resistente pathogenen in 21 Europese landen. Belgi¨e bevindt zich volgens deze gegevens op een zesde plaats wat betreft de jaarlijkse consumptie van antibiotica, maar ook wat betreft het voorkomen van resistente bacteri¨en. Volgens de data kan daarenboven de Europese variatie wat betreft consumptie van antibiotica gelinkt worden aan het voorkomen van resistentie op nationaal niveau. Noch in de Kaderrichtlijn Water (2000/60/EC) (Europese Commissie, 2000), de dochterrichtlijn rond grondwater (2006/118/EC) (Europese Commissie, 2006), en de lijst van prioritaire substanties in oppervlaktewater (2008/105/EC) (Europese Commissie, 2008) worden richtlijnen voor farmaceutische stoffen aangegeven. Echter, in een ontwerpbijlage van de Kaderrichtlijn Water van januari 2012 wordt dit voor het eerst wel gedaan, met name voor de hormonaal actieve stoffen 17 α-ethinylestradiol en 17 β-estradiol en voor diclofenac (Europese Commissie, 2012). De voorgestelde jaargemiddelde milieukwaliteitsstandaarden (AA-EQS) hiervoor zijn respectievelijk 0,035; 0,4 en 100 ng.L−1 in oppervlaktewater.
1.2
Bronnen
Over de herkomst van farmaceutische stoffen in het milieu is heel wat beschrijvende informatie voorhanden. K¨ummerer (2009) geeft de volgende mogelijke bronnen van farmaceutische stoffen in water weer: emissie van productieplaatsen van farmaceutische stoffen, het gebruik als humane en veterinaire geneesmiddelen, en
4
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu het gebruik als beschermingsmiddelen bij landbouwgewassen. Volgens Fent et al. (2006) is de voornaamste route die farmaceutische stoffen volgen de excretie door mens en dier na inname. Ook worden vaak ongebruikte en verlopen medicijnen door de afvoer of het toilet gespoeld. Via het rioolnetwerk komen deze in een rioolwaterzuiveringsinstallatie (RWZI) terecht, waar de afbraak niet altijd volledig doorgaat. Vervolgens komen ze in meren, rivieren en zeewater, en van hieruit kunnen ze ook het grond- en drinkwater contamineren. Het RWZI-effluent wordt bijgevolg beschouwd als de grootste bron/route van farmaceutische stoffen in het milieu. Daarnaast kunnen bijvoorbeeld ook het percolaat van stortplaatsen en het afvalwater van ziekenhuizen optreden als bronnen van farmaceutische stoffen (Fent et al., 2006). Het gebruik van rioolslib op landbouwgrond (verboden in Vlaanderen) kan eveneens leiden tot contaminatie van het bodemwater. Ook de directe toepassing van geneesmiddelen in de aquacultuur draagt bij tot deze problematiek (Fent et al., 2006). Het zou nuttig zijn om het belang van deze verscheidenheid aan bronnen te duiden. Kwantitatieve informatie hierover is echter schaars beschikbaar. Meestal gaat het dan om cijfers over specifieke groepen of bronnen. In de Europese Unie worden naar schatting 3000 verschillende substanties gebruikt in humane geneesmiddelen (Fent et al., 2006). Daarnaast zijn er nog een groot aantal farmaceutische stoffen die gebruikt worden in veterinaire geneesmiddelen, zoals antibiotica en ontstekingsremmers. Verkoopcijfers die worden gepubliceerd omvatten niet altijd dezelfde gegevens. Soms gaat het om de voorgeschreven hoeveelheden, soms ook de aantallen van geneesmiddelen die vrij verkrijgbaar zijn. Er wordt ook niet altijd rekening gehouden met de geneesmiddelen verkocht via internet (Fent et al., 2006). Men kan dus aannemen dat de werkelijke consumptie hoger ligt dan wordt aangegeven. Volgens Daughton en Ternes (1999) worden pesticiden veel beter gecontroleerd en gedocumenteerd dan geneesmiddelen, ondanks de hoge productieaantallen, consumptie en de fysiologische effecten die medicijnen tot doel hebben. De literatuur besteedt heel veel aandacht aan e´ e´ n groep van farmaceutische stoffen in het bijzonder, namelijk de antimicrobi¨ele middelen, omwille van de problematiek van bacteri¨ele resistentie. Deze groep omvat alle farmaceutische stoffen die micro-organismen doden of de groei ervan verhinderen. Dergelijke middelen worden gebruikt als geneesmiddel bij mens en dier, als groeibevorderaar en als ziektepreventiemiddel bij vee. Verder worden ze ook gebruikt als pesticide bij groententeelt en in boomgaarden en als desinfectant in consumptiemiddelen (Mellon et al., 2001). Naar schatting werden in de Verenigde Staten in 2001 11,2 miljoen kg antimicrobi¨ele middelen gebruikt voor niet-therapeutische doeleinden (bij afwezigheid van ziekte). In humane medicatie zou volgens de farmaceutische industrie 1,4 miljoen kg antimicrobi¨ele middelen vervat zijn (Mellon et al., 2001).
1.3
Fysisch-chemische eigenschappen
Farmaceutische stoffen hebben een brede waaier aan eigenschappen die relevant zijn bij hun interactie met de omgeving. Voor bepaalde eigenschappen vormen farmaceutische stoffen een vrij heterogene groep. Zo varieert hun moleculair gewicht tussen de 100 en 1000 Dalton. Ze kunnen neutraal, kationisch, anionisch of zwitterionisch zijn (Cunningham, 2004). Vele actieve farmaceutische componenten bestaan als zouten met de neiging tot polymorfisme (Cunningham, 2004). Polymorfe vormen zijn molecules van dezelfde stof die op een verschillende wijze uitkristalliseren. Deze vormen kunnen zeer variabele eigenschappen vertonen, bijvoorbeeld wat betreft biobeschikbaarheid, oplosbaarheid, oplossnelheid, chemische en fysische stabiliteit, smeltpunt, kleur, filtreerbaarheid, dichtheid en viscositeit. Wat de meeste farmaceutische stoffen wel gemeen hebben, is hun lage vluchtigheid. Dit geeft aan dat de verspreiding ervan in het milieu voonamelijk via de waterige en gesorbeerde fase plaatsvindt (Fent et al., 2006).
5
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu De Kow -waarde is een belangrijke parameter die gebruikt kan worden voor het inschatten van de verdeling van chemische stoffen in het milieu. Het geeft aan hoe de stof zich verdeelt over een mengsel van 1-octanol (lipofiel) en water (hydrofiel) (zie Vergelijking 1.1). Coctanol geeft de evenwichtsconcentratie weer van de stof in 1-octanol, Cwater in water. Farmaceutische stoffen vertonen Kow -waarden die 7 tot 8 grootteordes kunnen verschillen (Ratola et al., 2012). Een hoge waarde geeft aan dat de component preferentieel adsorbeert aan zwevende stoffen en uiteindelijk in het slib terechtkomt. Lage waarden geven dan weer aan dat de component grotendeels in de vloeistoffase blijft. Ook de Ka -waarde is een belangrijke parameter, en be¨ınvloedt onder andere de sorptie (Sectie 1.4.2). Deze is de evenwichtsconstante van de dissociatiereactie van een zwak zuur opgelost in water (Zumdahl, 2005). Vaker wordt echter de pKa -waarde gerapporteerd, die het negatieve logaritme van Ka is (Vergelijking 1.2). Naarmate de component een sterker zuur is, daalt de pKa . De pKb -waarde is analoog aan de pKa -waarde, maar dan toegepast op basen (Vergelijking 1.3) (Zumdahl, 2005). HZ staat voor het zuur, Z− voor het gedeprotoneerde zuur, BH+ voor de geprotoneerde base en B voor de base.
Kow (−) = −log(
Coctanol ) Cwater [H3 O+ ][Z − ] ) [HZ]
(1.2)
[BH + ][OH − ] ) [B]
(1.3)
pKa (−) = −log(Ka ) = −log(
pKb (−) = −log(Kb ) = −log(
1.4
(1.1)
Traject van farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu
Het voornaamste traject dat farmaceutische stoffen afleggen, begint bij de inname van het geneesmiddel door mens en/of dier. De stof ondergaat een gehele of gedeeltelijke omzetting in het lichaam en wordt ge¨excreteerd. Het excretieproduct komt via de riolen terecht in zuiveringsinstallaties. Gezuiverd afvalwater komt terecht in het oppervlaktewater. Dit oppervlaktewater kan samen met grondwater gebruikt worden om drinkwater te produceren. Bovenstaand traject wordt verder uitgediept in de Secties 1.4.1 tot 1.4.4.
1.4.1
Farmaceutische stoffen in het lichaam
De beweging van de actieve stoffen doorheen het lichaam wordt bepaald door vier karakteristieken: lipofiliciteit, capaciteit tot het vormen van waterstofbruggen, lading en grootte (Fatta-Kassinos et al., 2011). Veel farmaceutische stoffen worden in het lichaam gebiotransformeerd, meestal in de lever (Debska et al., 2004). Dit geeft aanleiding tot een wijziging in hun fysisch-chemische en farmaceutische eigenschappen, zoals een hogere wateroplosbaarheid of een lagere activiteit (Cunningham, 2004). Soms wordt het toegediende product eerst in het lichaam omgezet tot een actieve metaboliet, zoals bij paracetamol (Debska et al., 2004). Er zijn twee fasen in de metabolisatie (Cunningham, 2004). De eerste fase beslaat de modificatie van de component op zich door hydrolyse, oxidatie, reductie, alkylatie en/of dealkylatie. Tijdens deze stap worden de lipofiele molecules meer wateroplosbaar gemaakt (Celiz et al., 2009). De tweede fase omvat de glucuronatie of sulfatatie van de metabolieten uit de eerste fase. Deze stap wordt ook vaak conjugatie genoemd. De metabolisatiegraad is vaak incompleet, waardoor een deel van de farmaceutische stof ongewijzigd ge¨excreteerd wordt. Deze fractie kan zich tussen 0 en 100% bevinden (Cunningham, 2004). Bij toediening van paraceta-
6
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu mol bijvoorbeeld, verlaat slechts 3% ongewijzigd het lichaam en 93% als hydrolyseerbare conjugaten; voor amoxicilline is dit respectievelijk 68% en 0% (Khan en Ongerth, 2004). De metabolieten kunnen op zich ook schadelijk of actief zijn, zoals norfluoxetine, een metaboliet van fluoxetine (Celiz et al., 2009).
1.4.2
Farmaceutische stoffen in het afvalwater
Collectieve RWZI’s zijn ontworpen en opgewaardeerd om voornamelijk organisch materiaal, stikstof en fosfor te verwijderen, die aanwezig zijn in grootte-ordes van mg.L−1 (Verlicchi et al., 2012b). Tot nu toe heeft de afvalwaterzuivering zich niet toegespitst op het verwijderen van organische micropolluenten. Deze gedragen zich namelijk zeer individueel en vertegenwoordigen maar een kleine fractie (ng.L−1 tot µg.L−1 ) van de belading van het afvalwater (Larsen et al., 2004). Er worden evenwel jaarlijks duizenden tonnen aan geneesmiddelen geproduceerd en gebruikt, en komen zo terecht in het afvalwater (Ternes et al., 2004). In de waterzuivering komen twee belangrijke eliminatieprocessen voor farmaceutische stoffen voor: adsorptie en biodegradatie (Fent et al., 2006; Barret et al., 2010). Adsorptie is afhankelijk van hydrofobe en elektrostatische interacties tussen de farmaceutische stof en het slib. Negatief geladen componenten adsorberen minder goed dan neutrale en positief geladen componenten (Fent et al., 2006), omdat organisch materiaal negatief geladen functionele groepen bevat. Biodegradatie wordt door Duffus et al. (2007) gedefinieerd als de afbraak van een component met behulp van enzymes. Dezelfde definitie geeft twee vormen weer: primaire biodegradatie, waarbij de chemische structuur wordt gewijzigd, zodat ze een specifieke eigenschap verliest. Een tweede vorm is de volledige afbraak (mineralisatie) van een component tot eenvoudige basismolecules, zoals CO2 , CH4 , NH3 , H2 O. Vaak wordt naast biodegradatie ook gesproken over biotransformatie of conjugatie. Biotransformatie is de chemische omzetting van een component door levende organismen (Duffus et al., 2007). Conjugatie is de vorming van een component door twee chemische constituenten van verschillende bronnen covalent te binden (Duffus et al., 2007). Glucose is zeer wijd verspreid in biologische systemen. Hierdoor is glucuronidevorming een vaak voorkomende conjugatie (Cunningham, 2004). Geconjugeerde metabolieten kunnen in de waterzuivering ook weer gesplitst worden (deconjugatie). Dit resulteert in het vrijkomen van de actieve basismolecule (Cunningham, 2004). Meer onderzoek is nodig naar de verwijderingsprocessen van farmaceutische stoffen in RWZI’s, zodat hun gedrag en voorkomen beter verklaard kunnen worden (Onesios et al., 2009). Belangrijke karakteristieken zijn onder andere de eigenschappen van de component, de zuiveringsmethode, de temperatuur, de slibleeftijd en de hydraulische retentietijd (Ratola et al., 2012). Verschillende studies hieromtrent zijn moeilijk te vergelijken omdat er meerdere parameters van belang zijn. Resultaten uit een labo-omgeving zijn niet vanzelfsprekend geldig in praktijkinstallaties. Ook dient er omtrent de definitie van verwijdering tot een zekere consensus gekomen te worden. In nauwe zin betekent verwijdering de eliminatie van de oorspronkelijke molecule (mineralisatie). In de brede zin kan verwijdering ook het verdwijnen van de oorspronkelijke molecule inhouden (primaire biodegradatie, biotransformatie of conjugatie). Om het onderscheid te kunnen maken, kan gefocust worden op het verschijnen van metabolieten of eindproducten (Onesios et al., 2009). Algemeen kan gesteld worden dat een farmaceutische component zelden volledig wordt verwijderd in de RWZI. De graad van verwijdering neemt echter toe naargelang de hydraulische retentietijd en de slibleeftijd toenemen (Fent et al., 2006). Volgens Verlicchi et al. (2012b) gaat de verwijdering beter door in membraanbioreactoren (MBR) dan in conventionele actief-slibsystemen (Verlicchi et al., 2012b). Ternes et al. (2004) weerleggen dit echter en geven aan dat beide zuiveringstechnieken een vergelijkbare verwijderingseffici¨entie behalen. De laatste jaren wordt steeds meer belang gehecht aan geavanceerdere waterzuiveringstechnieken, zoals oxidatie. Het gebruik van deze technieken zorgt echter voor intermediaire degradatieproducten, die mogelijk toxischer kunnen zijn dan de moedermolecules (Ratola et al., 2012).
7
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu In Figuur 1.1 is een overzicht weergegeven van de verwijderingseffici¨enties van farmaceutische stoffen in RWZI’s. De figuur is opgebouwd met gegevens die terug te vinden zijn in Fent et al. (2006); Onesios et al. (2009); Verlicchi et al. (2012a); Ratola et al. (2012). Deze publicaties zijn recente reviews die kwantitatieve gegevens bevatten over de verwijdering van farmaceutische stoffen in RWZI’s. Enkel de componenten die worden belicht in het experimentele werk (Sectie 5.1.1), werden hierbij in beschouwing genomen. De verwijderingseffici¨enties werden rechtstreeks overgenomen, of werden berekend uit gegevens over de concentraties in influent en effluent. Volgens Figuur 1.1 komen er effici¨enties over de hele range van 0 tot 100% voor. Zeven componenten halen een mediane verwijderingseffici¨entie van 80% of meer. Ook de verwijderingseffici¨enties voor e´ e´ n bepaalde component kunnen sterk verschillen. De verklaring hiervoor is niet eenduidig te bepalen. Verder kan uit de figuur afgeleid worden dat de maximale waargenomen verwijderingseffici¨enties voor de meeste componenten vrij goed zijn. Dit betekent dat er wel een potentieel is om deze componenten te verwijderen, maar dat de waterzuivering daarvoor niet geoptimaliseerd is. Er komen eveneens negatieve verwijderingseffici¨enties voor, bijvoorbeeld bij diclofenac (Zorita et al., 2009), carbamazepine (Reif et al., 2011), sulfamethoxazole, trimethoprim en tetracycline (Verlicchi et al., 2012b). Mogelijk is dit te wijten aan deconjugatie of aan het desorberen van de componenten tijdens de afvalwaterbehandeling (Verlicchi et al., 2012a). Ook kan er door de lage concentraties een meetfout optreden, waardoor het lijkt alsof er componenten worden vrijgesteld (Verlicchi et al., 2012a). Echter is het ook mogelijk dat de staalname van het influent- en het effluentstaal niet goed op elkaar zijn afgestemd (Verlicchi et al., 2012a). Hiermee wordt bedoeld dat de tijd tussen de staalname van het influent en het effluent niet volledig overeenkomt met de hydraulische retentietijd.
Figuur 1.1: Overzicht van gerapporteerde verwijderingseffici¨enties in RWZI’s. De componenten werden gerangschikt volgens stijgende mediaan.
8
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu
1.4.3
Farmaceutische stoffen in oppervlaktewater
Het effluent van de meeste RWZI’s komt terecht in het oppervlaktewater. Verlicchi et al. (2012b) geven aan dat vele farmaceutische stoffen in het oppervlaktewater voorkomen met een concentratie tussen de 10−3 en de 102 µg.L−1 . Volgens Fent et al. (2006) stellen deze concentraties slechts een beperkt risico voor acute toxiciteit, omdat ze een factor 103 tot 107 lager zijn dan de EC50 of LC50. EC50 staat voor de concentratie waarbij 50% van de geteste individuen een effect vertoont, LC50 staat voor de concentratie waarbij 50% van de geteste individuen sterft. Echter zijn er recent concentraties aan sommige farmaceutische stoffen geobserveerd in effluent- en oppervlaktewater die de laagste geobserveerde effectconcentratie (LOEC) voor chronische effecten benaderen. Dergelijke observaties werden gedaan voor bijvoorbeeld diclofenac, carbamazepine en fluoxetine (Richardson en Ternes, 2011). Er is echter nog steeds een tekort aan chronische toxiciteitsdata, zowel voor individuele farmaceutische stoffen als voor mengsels (Fent et al., 2006). Idealiter worden toxiciteitstesten uitgevoerd die de volledige levenscyclus van een organisme beslaan, en dat voor meerdere generaties (Fent et al., 2006). Aquatische organismen staan continu bloot aan contaminanten in water, en dat gedurende de volledige levenscyclus (Daughton en Ternes, 1999). Subtiele verstoringen kunnen een effect hebben op het individu zelf. Echter, van zodra verstoringen optreden in het hormoon- en reproductiesysteem of het afweersysteem, kan dit gevolgen hebben voor de gehele populatie (Fent et al., 2006). Naast een tekort aan data over chronische effecten, is er ook weinig bekend over de toxiciteit van transformatieproducten en de effecten op niet-doelorganismen (Richardson en Ternes, 2011; Fent et al., 2006). Zolang er geen consensus bestaat over de concentraties, blootstelling en impacten kunnen er geen RWZI-normen worden vastgelegd (Pal et al., 2010).
Farmaceutische stoffen kunnen in het oppervlaktewater verder gebiodegradeerd worden, maar ook abiotische transformaties kunnen optreden. De meest relevante abiotische pathways van farmaceutische stoffen in hun wisselwerking met het milieu zijn sorptie op bodem en sediment, complexatie met metalen en organische stoffen, en chemische oxidatie (Fatta-Kassinos et al., 2011). Hydrolyse wordt als verwaarloosbaar beschouwd. Fotodegradatie van farmaceutische stoffen kan ook voorkomen, zoals bijvoorbeeld bij diclofenac en sulfamethoxazole (Andreozzi et al., 2003). Wegens deze verschillende pathways zijn de fysischchemische eigenschappen van de stoffen, zoals partitie- en dissociatieconstanten, belangrijk in het begrijpen van hun gedrag (Fatta-Kassinos et al., 2011).
1.4.4
Farmaceutische stoffen in drinkwater
Vulliet et al. (2011) tonen aan dat meerdere farmaceutische stoffen aanwezig kunnen zijn in drinkwater, waaronder salicylzuur en carbamazepine. Tot 2009 werden in Europa en de Verenigde Staten 17 farmaceutische stoffen gekwantificeerd in drinkwater, met concentraties tussen 1 en 1 350 ng.L−1 (Mompelat et al., 2009). Leidt elke detectie van een dergelijke component ook tot het risico op een toxisch effect? Webb et al. (2003) zetten de geobserveerde concentratie van de farmaceutische stoffen uit ten opzichte van de dagelijkse therapeutische dosis. De hoeveelheid die dagelijks via drinkwater ingenomen wordt, op basis van een drinkwaterinname van 2 L per dag, is volgens deze gegevens een factor 103 keer kleiner dan de therapeutische dosis; voor 90% van de componenten bedroeg die marge zelfs 105 . Hieruit leidden de onderzoekers af dat er geen substanti¨ele risico’s verbonden zijn aan het consumeren van drinkwater. Kumar et al. (2010) geven een overzicht van verschillende studies over kwantitatieve risicoschatting van farmaceutische stoffen. Ook hieruit volgt dat geen enkele studie een risico voor de mens kon vaststellen, maar dat er nog onzekerheden bestaan, zeker wat betreft chronische effecten en effecten van mengsels.
9
HOOFDSTUK 1. Farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu
1.5
Risicobeheer en mitigerende maatregelen
Wat betreft farmaceutische stoffen in het aquatisch milieu focussen overheden zich tot nu toe vooral op onderzoek en wetgeving omtrent risicobeheer (Doerr-MacEwen en Haight, 2006). Hierbij ligt de nadruk vooral op curatieve maatregelen, namelijk het verwijderen van farmaceutische stoffen uit het afvalwater. In Europa, de Verenigde Staten en Canada hebben de overheden de modernisering van RWZI’s gefinancierd (Doerr-MacEwen en Haight, 2006). In alle lidstaten van Europa is secundaire afvalwaterbehandeling verplicht (Doerr-MacEwen en Haight, 2006). Vaak wordt ook het huishoudelijk afval en het afvalwaterslib verbrand, en niet gestort, om uitloging tegen te gaan (Doerr-MacEwen en Haight, 2006). Er wordt echter ook onderzoek gedaan naar preventieve oplossingen. Enkele voorbeelden van zulke strategie¨en zijn de classificatie van medicijnen op basis van milieu-effecten, het produceren van groene (beter afbreekbare) geneesmiddelen, terugnameprogramma’s voor vervallen geneesmiddelen en het reduceren van de consumptie door het bewust maken van de gebruiker (Doerr-MacEwen en Haight, 2006). In de winter van 2000-2001 is in Belgi¨e bijvoorbeeld een publieke campagne gestart om het gebruik van antimicrobi¨ele middelen te beperken. Dit leverde een jaarlijkse daling van 6% op sinds 2006 (ESAC, 2010). Binnen de farmaceutische sector heerst echter terughoudendheid omdat gevreesd wordt voor ongepaste restricties op geneesmiddelen. Fatta-Kassinos et al. (2011) verwijzen naar het gescheiden houden van gecontamineerd afvalwater, zoals dat van ziekenhuizen. Larsen et al. (2004) richten zich op het gescheiden houden en het apart behandelen van urine. Zo wordt een meer geconcentreerde afvalstroom bekomen die via conventionele en/of innovatieve technieken effici¨enter behandeld kan worden.
10
Hoofdstuk 2
Analyse van farmaceutische residu’s in water
Het analyseproces bestaat uit een sequentie van verschillende handelingen. Een eerste stap omvat de staalname, het transport en de opslag van het staal. Hierbij is het belangrijk dat het staal representatief is en dat tijdens de bewaring zo min mogelijk wijzigingen optreden. Een tweede stap is de staalvoorbereiding. Hierbij worden zoveel mogelijk ongewenste componenten in het staal afgescheiden en worden de gewenste analieten naar een geschikt concentratieniveau gebracht. Vaste-fase extractie is hierbij een veel gebruikte techniek, die verder uitgediept wordt in Sectie 2.1. Hierbij worden de componenten vanuit de waterfase op een sorbens weerhouden en vervolgens ge¨elueerd met behulp van een geschikt solvent, zie ook Figuur 2.1. Een derde stap is de scheiding (Sectie 2.2), die het staal opdeelt in zijn verschillende componenten. Vervolgens vindt detectie plaats (Sectie 2.3), gevolgd door de interpretatie van de resultaten. Om de betrouwbaarheid, de juistheid en de herhaalbaarheid van de gebruikte methode te evalueren, is validatie nodig (Sectie 3).
Figuur 2.1: Weergave van de staalvoorbereiding met behulp van vaste-fase extractie.
2.1
Vaste-fase extractie
In de literatuur zijn heel wat referenties terug te vinden die vaste-fase extractie (Solid-Phase Extraction, SPE) toepassen voor de staalvoorbereiding. In het overzicht dat hieronder gegeven wordt, is een onderscheid gemaakt tussen de toegepaste methodes op basis van Oasis HLB-kolommen (Hydrophilic-Lipophilic Balance) (Tabel 2.1), die ook worden gebruikt in het eigen experimentele werk, en andere types van kolommen. De Oasis HLB-kolom bevat een copolymeer van polydivinylbenzeen en N-vinylpyrrolidon (Figuur 2.2) (Ye et al., 2007). Tabel 2.2 handelt over toegepaste methodes met andere soorten kolommen. Deze zijn bijvoorbeeld MCX (Mixed-mode Cation-eXchange), een polymeer met kationuitwisselingsgroepen; MAX (Mixed-mode Anion-eXchange), een polymeer met anionuitwisselingsgroepen; Strata-X, een polymeer van polydivinylbenzeen met piperidongroepen (hydrofiel-lipofiel gebalanceerd) en Isolute ENV+, een apolair, 11
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water hydrofoob polystyreensorbens. Op basis van Tabellen 2.1 en 2.2 kunnen enkele algemene richtlijnen opgesteld worden. De conditionering van de kolommen gebeurt telkens met een organisch solvent (meestal methanol), gevolgd door gedistilleerd water. Meestal wordt 50-500 mL staal aangebracht op de kolom, bij een zure of neutrale pH en aan een debiet van 1 a` 10 mL.min−1 . In sommige methodes wordt EDTA toegevoegd (Figuur 2.3). Na2 -EDTA wordt gebruikt om te voorkomen dat de tetracyclines complexeren met Ca2+ - en Mg2+ -ionen of andere residuele metalen. Complexatie kan namelijk de performantie van de extractie van tetracyclines bemoeilijken. Iets meer dan de helft van de procedures past een wasstap toe, doorgaans met water of methanol. Hierbij wordt 1 a` 10 mL wasvolume toegediend. De droogtijd bedraagt gemiddeld 5 a` 30 min. Voor elutie van de doelverbindingen wordt tussen 1 en 12 mL solvent gebruikt (voornamelijk methanol). Op drie gevallen na wordt het eluens ingedampt, meestal bij een temperatuur boven de 35°C. Het solventmengsel voor reconstitutie is zeer variabel over de verschillende procedures (Zuccato et al., 2006).
Figuur 2.2: Oasis HLB-hars: copolymeer van polydivinylbenzeen en Nvinylpyrrolidon.
2.2
Figuur 2.3: Chemische structuur van EDTA.
Chromatografie
Zowel gas- als vloeistofchromatografie worden toegepast bij de scheiding van farmaceutische stoffen. Vloeistofchromatografie (LC) is geschikter voor polaire, niet-vluchtige en thermolabiele stoffen (Zhou et al., 2012; Al-Odaini et al., 2010), en wordt voor farmaceutische stoffen vaker toegepast dan gaschromatografie. In de meeste gevallen wordt omgekeerde-fase chromatografie gebruikt (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Hierbij is de stationaire fase van de kolom apolair en de mobiele fase polair. In deze kolommen komen voornamelijk zwakke intermoleculaire krachten voor. Zo kan een verschil gemaakt worden tussen interacties met een kleiner energieverschil, dus tussen nauw verwante componenten (Kazakevich en LoBrutto, 2007).
2.3 2.3.1
Massaspectrometrie Ionisatie
In combinatie met vloeistofchromatografie wordt voor farmaceutische stoffen atmospheric pressure ionisation (API) toegepast (Van Bramer, 1998a). Via deze techniek worden de gescheiden analieten ge¨ıoniseerd op atmosferische druk en dit direct vanuit het eluens van de LC. Vervolgens worden de gevormde ionen naar de massa-analyser geleid. Omdat de ionisatie gebeurt op atmosferische druk en de analyser een vacu¨um vereist, 12
6 mL MeOH, 5 mL H2 O 5 mL MeOH, 5 mL H2 O
5 mL MeOH, 5 mL H2 O 3 mL MeOH, 3 mL H2 O 6 mL MeOH, 3 mL MeOH zuur, 2 x 6 mL H2 O 10 mL MeOH, 3 x 5 mL H2 O 5 mL MeOH, 5 mL H2 O
5 mL MeOH, 5 mL H2 O
2 x 0,5 mL MeOH + 4 x 0,5 mL H2 O 2 mL MeOH, 5 mL H2 O pH 2,5 2 mL MeOH + 2 mL H2 O 4 mL MeOH + 2 x 4 mL H2 O 3 mL MeOH, 3 mL H2 O 2 mL MeOH + 2 mL H2 O
10 mL MeOH + 3 x 5 mL H2 O
16
27
73
19
10
1L
100 mL
100 mL
100-500 mL
2,5 mL
20-200 mL
100 mL
100-500 mL
100 mL
1L
500 mL
120 mL
400 mL
100-500 mL
100 mL
250 mL
n.g.
8,2 7-8 3
n.g.
3
2,53
5 mL.min−1
5 mL.min−1
2 mL.min−1
5 mL.min−1
5-10 mL.min−1
5 mL.min−1
5 mL.min−1
2
2
5 mL.min−1
1-20 mL.min−1
6,87,2
15 mL.min−1
n.g.
n.g.
1 mL.min−1
n.g.
2,5
n.g.
b
3 en 7,5
7
10 mL.min−1
n.g.
6
pH
10 mL.min−1
Belading debiet
Aantal farmaceutische componenten niet gegeven c N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide
a
10
47
25
74
42
15
11
24
19
29
5 mL ACN, 5 mL H2 O
Conditionering Belading volume
5
a
n
g.L−1
-
-
n.g.
-
n.g.
0,2 mL van 0,1 M Na2 -EDTA
-
0,1% in staal
-
n.g.
0,25 EDTA
-
2 g Na2 -EDTA
5% EDTA
n.g.
n.g.b
EDTA
n.g.
n.g.
n.g.
2 x 1,5 mL H2 O
1 mL H2 O
n.g.
n.g.
5 mL H2 O
n.g.
n.g.
2 x 6 mL
9 mL H2 O
5 mL 5% MeOH
5 mL H2 O
5 mL H2 O
10 mL H2 O
Wassen
30 min
n.g.
n.g.
30 min
n.g.
1,5 u
5 min
15-20 min
n.g.
30 min
5 min
n.g.
n.g.
15-20 min
10 min
n.g.
Drogen
10 mL MeOH
2mL MeOH
5 mL MeOH
2 x 2 mL MeOH + 2 x 2 mL EAc
Online
8 mL aceton
2 x 0,5 mL MeOH
2 x 4 mL MeOH
10 mL MeOH
10 mL MeOH
4 x 2 mL MeOH
5 mL MeOH
5 mL MeOH
2 x 4 mL MeOH
1 mL 10 mM NH4 -acetaat/ACN (50/50) 2 x 4 mL MeOH
Elueren
Tot 0,2 mL, < 40°C
Tot droog, 40°C Tot droog, 35°C
40°C
n.g.
Tot droog, 40°C
Tot droog
Tot droog
Tot droog
< 40°C, tot 200 µL
50°C tot 50 µL Tot 0,1 mL 45°C
Tot droog
Tot droog
Tot droog
n.g.
Verdampen
1 mL van 5 mM NH4 -acetaat met 4% methanol 1mL H2 O/MeOH (80/20) 900 µL EAc + 100 µL MTBSTFAc n.g.
1 mL (H2 O/MeOH) (90/10) -
500 µL H2 O/ACN (50/50) 1 mL H2 O/MeOH (75/25) 1 mL MeOH
n.g.
70 µl H2 O/FA (99,9/0,1) 0,15 mL H2 O/MeOH (90/10)
1 mL MeOH + 1 mL H2 O 1 mL H2 O/MeOH (75/25) 100 µL H2 O
n.g.
Reconstitutie
Tabel 2.1: Overzicht van de SPE-methodes voor farmaceutische stoffen in de recente literatuur: methodes met Oasis HLB.
Zhou et al. (2012)
Gracia-Lor et al. (2011) Yu en Wu (2011)
L´opez-Serna et al. (2010) N¨odler et al. (2010)
Ib´an˜ ez et al. (2009)
Gruji´c et al. (2009)
Gros et al. (2009)
Nageswara Rao et al. (2008)
Zhang en Zhou (2007)
Kim en Carlson (2007) Ye et al. (2007)
Hao et al. (2006)
Gros et al. (2006)
G´omez et al. (2006)
Abuin et al. (2006)
Referentie
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water
13
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water
Oasis MCX
Oasis MCX
Isolute ENV+
SPE
15
15
12
10
na 1 x 2 mL nheptaan, 1 x 2 mL aceton, 3 x 2 mL MeOH, 4 x 2 mL H2 O 6 mL MeOH, 10 mL H2 O
Conditionering
Wassen
Drogen
Elueren
Tot µL
Verdampen
1 mL H2 O 5 mM NH4 -formaat
Reconstitutie
Prasse et al. (2010)
Referentie
pH
Belading volume
5 x 2 mL MeOH/aceton (50/50) + 0.2% FAd
100
n.g.
Lav´en et al. (2009)
Lav´en et al. (2009)
Lee et al. (2007)
-c
8
Belading debiet 5 mL.min−1
100 mL H2 O, 6 mL MeOH
n.g.b
3
n.g.
Tot droog, 40°C
10 a` 15 mL.min−1 2 mL H2 O/FA (98/2)
10 min
250 mL
2
Tot droog, 35°C
n.g.
8 mL DCM/2propanol/NH4 OH (78/20/2) 2 mL MeOH (B), 2 mL MeOH/NH4 OH (98/2)
25 mL + 25 mL H2 O
2mL
Tot droog, 35°C
n.g.
2mL MeOH, MeOH/FA (98/2)
n.g.
5 min
eluens van MCX (vorige)
Baker en KasprzykHordern (2011b)
al.
500µL H2 O/MeOH/ CH3 COOH (94.7/5/0.3)
Sousa et al. (2011)
et
Tot droog, 40°C
200 µL MeOH
Al-Odaini (2010)
15 min
3 x 2 mL MeOH, 2mL MeOH/MTBE (90/10), 2mL MeOH/NH4 OH (98/2), 2mL MeOH/NaOH (99.8/0.2) 3 mL MeOH/NH4 OH (93/7)
Tot droog
Busetti et al. (2009)
2mL H2 O/NH4 OH (99.5/0.5) 3mL H2 O
2 x 3 mL MeOH
500 µL H2 O/MeOH (70/30)
Babi´c et al. (2010)
Tot droog, 45°C
30 min
Tot bijna droog, 38°C
1 mL ACN/H2 O (50/50)
n.g.
20-30 min
4 mL ACN, 4 mL MeOH, 3 mL EAC, 1,5 mL ACN (A); 6 mL ACN, 6 mL MeOH, 1 mL ACN (B)
Tot droog, 40°C
2
<7
4,5 mL H2 O/MeOH (95/5) + 12 mL H2 O
2 mL H2 O/HCOOH (98/2) opslag - 2 mL MeOH/HCOOH (99.4/0.6) n.g. 3,5 en 7
n.g.
n.g.
4
2 x 5 mL MeOH
1 mL.min−1
6 mL.min−1
10 mL.min−1 3-5 mL.min−1
<4mL.min−1
5 min
100-200 mL H2 O
100-500 mL
50-100 mL 500 mL
100 mL
1 mL H2 O/ACN/FA (94.5/5.0/0.5) 500 µL H2 O/ACN/FA (79.1/20/0.1) 500 µL H2 O/ACN/FA (79.1/20/0.1) FA 200 µL H2 O/MeOH (75/25)
Tabel 2.2: Overzicht van de SPE-methodes voor farmaceutische stoffen in de recente literatuur: methodes met andere sorbentia.
Oasis MAX 23
3mL MTBEe , 3mL MeOH, 6mL H2 O
2 mL MeOH, 2 mL H2 O/FA (98/2) 2 mL MeOH, 2 mL H2 O
Oasis MCX
65
Oasis MCX
23 3 mL MeOH, 3 mL H2 O 18, 6 mL EAC, 6 groep mL ACN, 6 mL A MeOH, 12 mL en H2 O (A); 4,5 mL B ACN, 4,5 mL MeOH, 12 mL H2 O pH 3,5 (B) 5 mL H2 O, 5 mL MeOH 12
2 mL MeOH, 2 mL H2 O/HCOOH (98/2)
Oasis MAX Strata-X
Strata-X
a aantal farmaceutische componenten b niet gegeven c niet toegepast mierenzuur Methyl-tert-butylether e
d
14
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water moet een drukverschil overwonnen worden. Daarnaast is ook een drooggas vereist om clusters te breken die onstaan door het verdampen van het solvent. Er zijn drie vormen van API: elektrospray ionisatie (ESI), atmospheric pressure chemical ionisation (APCI), en meer recent atmospheric pressure photo-ionization (APPI) (Himmelsbach et al., 2009). In het experimentele werk wordt ESI toegepast, bijgevolg wordt deze techniek iets verder uitgewerkt dan de andere technieken. De meerderheid van alle LC-MS-systemen werken op basis van ESI, soms in combinatie met APCI voor minder polaire componenten (Holˇcapek et al., 2012). 2.3.1.1
Elektrospray ionisatie
Elektrospray ionisatie wordt voornamelijk toegepast op polaire, thermisch onstabiele componenten en componenten met een hoge moleculaire massa (Van Bramer, 1998a). Er zijn verschillende theorie¨en over hoe de ionisatie werkt. Kebarle (2000) zet de volgende theorie uiteen (Figuur 2.4). Een elektrisch veld zorgt ervoor dat de druppels die de injectienaald verlaten, geladen zijn. Naarmate het solvent uit de druppel verdampt, wordt de ladingsdensiteit aan het oppervlak van de druppels groter. Wanneer de repulsiekracht tussen de ladingen aan het oppervlak groter wordt dan de oppervlaktespanning (Rayleigh stabiliteitslimiet), explodeert de druppel en vormt kleinere druppels. Na enkele cycli van Rayleigh-druppelfragmentatie worden aparte analietionen bekomen. Omdat de meeste farmaceutische stoffen basische functionele groepen hebben, wordt in de meeste gevallen de positieve ionisatie toegepast (Peters, 2011). Dit betekent dat aan het staal een kleine hoeveelheid zuur wordt toegevoegd, zodat protonatie van de componenten plaatsvindt. ESI heeft drie belangrijke kenmerken (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Een eerste is dat er een zachte ionisatie plaatsvindt. Dit betekent dat de moleculaire ionen slechts beperkte fragmentatie ondergaan. Een tweede karakteristiek is dat ESI, door zijn werking op atmosferische druk, eenvoudig gekoppeld kan worden aan een HPLC. Een vereiste hierbij is dat het debiet laag blijft om een stabiele spray te bekomen. Daarom wordt vaak gebruik gemaakt van debietsplitsers. Een derde karakteristiek is dat er meervoudig geladen ionen kunnen ontstaan. Aangezien de massapectrometer de m/z-verhouding meet, komen de componenten in het spectrum voor als fracties van de molecuulmassa. 2.3.1.2
Andere ionisatiemethoden
Bij APCI wordt de injectienaald niet op een hoge elektrische potentiaal gezet (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Eerst wordt het solvent verdampt met behulp van een vernevelgas (N2 ) op een temperatuur van 400 a` 500°C. De solventdamp wordt vervolgens ge¨ıoniseerd met behulp van een corona discharge needle. Deze ionen reageren op hun beurt met de analietmolecules, waardoor analietionen ontstaan. In tegenstelling tot ESI vormt APCI geen meervoudig geladen ionen (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Bij APPI vindt de ionisatie van de molecule plaats door de absorptie van een foton. Als de energie van het foton de ionisatiepotentiaal van de molecule overschrijdt, wordt een elektron afgesplitst en blijft het radicalair kation achter (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De solventen en permanente gassen worden niet ge¨ıoniseerd, waardoor het massaspectrum een relatief lage ruis vertoont (Kazakevich en LoBrutto, 2007).
15
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water
Taylorkegel
1
2
3
[M+nH]n+
1. Solventevaporatie 2. Druppelfissie bij het bereiken van de Rayleighlimiet 3. Vorming van vrije ionen door verdere druppelfissie en/of solventevaporatie
Figuur 2.4: Weergave van elektrospray ionisatie (Gaskell, 1997).
2.3.2
Massa-analysers
Nadat ionen zijn gevormd door bovenstaande technieken, moeten deze worden gescheiden. Dit gebeurt op basis van de verhouding tussen hun massa en lading (m/z-verhouding). Er kan gekozen worden tussen verschillende analysers op basis van hun resolutie en gevoeligheid. In het experimentele werk wordt de dubbel focuserende massa-analyser toegepast, bijgevolg wordt deze techniek verder uitgewerkt dan de andere analysers. Er zijn twee belangrijke criteria waarmee de performantie van een massa-analyser gekarakteriseerd kan worden: (i) de resolutie (R) of de resolving power (RP) en (ii) de massa-accuraatheid (MA) (Holˇcapek et al., 2012). De resolving power heeft twee verschillende definities (Gross, 2011a). Op basis van de Full width at half maximum-definitie (FWHM) wordt de RP berekend als de verhouding van de breedte van de piek bij halve hoogte (∆m/z) ten opzichte van de m/z-verhouding (Vergelijking 2.1). Conventioneel echter wordt de 10%-valley-definitie gebruikt, waarbij RP wordt bepaald op basis van twee even hoge pieken die slechts 10% overlappen (Figuur 2.5). De resolutie is de breedte van de piek bij een bepaalde piekhoogte (Gross, 2011a). Een hogere resolving power en bijgevolg een lagere resolutie geeft aan dat de analyser van hogere kwaliteit is. De massa-accuraatheid is het relatieve verschil tussen de theoretische (m/z)th en gemeten waarde van m/z (m/z)exp , voorgesteld in parts per million (ppm, Vergelijking 2.2). De meest accurate resultaten zijn het gevolg van interne kalibratie. Hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS) bewerkstelligt zowel een hoge resolving power als een hoge massa-accuraatheid.
16
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water
m/z ∆(m/z) (m/z)th − (m/z)exp 6 M A(ppm) = .10 (m/z)th RP (−) =
(2.1) (2.2)
Relatieve abundantie (%) ∆m10% 100%
50%
FWHM ∆mFWHM 10%-valley
10% 5%
mFWHM
m10%
m/z (-)
Figuur 2.5: De 10%-valley- en de full width at half maximum-weergaves van resolving power.
2.3.2.1
Magnetische sector
Bij deze techniek wordt een magnetisch veld toegepast op de ionenpuls. De ionen worden eerst versneld in een elektrisch veld, waarbij hun kinetische energie (Ekin ) afhangt van de opgelegde spanning (U). Wanneer de ionen na de versnelling in het magnetische veld terechtkomen, wordt hun pad afgebogen. Hierbij wordt de straal (rm ) van het pad bepaald door de kinetische energie en de lading (q) van het ion, en de sterkte van het magnetische veld (B). Vergelijking 2.3 geeft de kinetische energie van het ion weer na de versnelling. Vergelijking 2.5 toont aan dat het ion een cirkelbeweging beschrijft als de centrifugale en centripetale kracht in evenwicht zijn. Door beiden te schrijven in functie van de snelheid (Vergelijkingen 2.4 en 2.6) en deze te combineren, wordt Vergelijking 2.7 bekomen (Gross, 2011a). De fysische interpretatie van deze vergelijking is dat enkel de ionen met de geschikte m/z-verhouding dit cirkelvormige pad kunnen beschrijven, en bijgevolg de detector kunnen bereiken. Fl staat voor Lorenzkracht (veroorzaakt door de magneet), Fc voor centripetaalkracht van de cirkelvormige beweging, z is het ladingsgetal of valentie en e is de elementaire lading. Door Vergelijking 2.7 te schrijven in functie van de spanning van de initi¨ele versnelling, wordt Vergelijking 2.8 bekomen (Gross, 2011a).
17
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water 2.3.2.2
Dubbelfocuserende massa-analyser
Wanneer alle ionen dezelfde kinetische energie bezitten, is de magnetische sector een goede massa-analyser (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Dit is echter geen realistische situatie, ionen zullen in de ionenbron namelijk steeds een distributie aan kinetische energie vertonen. Daardoor wordt de magnetische sector vaak in combinatie met een elektrostatische analyser toegepast (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Deze verbetert de resolutie van de magnetische sector door een reductie in de variatie van kinetische energie. De elektrostatische sector bestaat uit twee gebogen platen waarover een spanningsverschil (E) wordt opgelegd. Dit resulteert in een afbuiging van de ionenstraal. De straal (re ) van het pad is afhankelijk van de kinetische energie en de lading van het ion. De ionen worden hier niet gescheiden op basis van de m/z-verhouding, maar op basis van hun kinetische energie. De gecombineerde techniek van de magnetische en elektrostatische sector wordt double focusing genoemd (Kazakevich en LoBrutto, 2007) (Figuur 2.6). Vergelijking 2.10 geeft de straal van de afbuiging in de elektrostatische sector. Fe staat voor elektrostatische kracht (veroorzaakt door de elektrostatische analyser), Fc voor centripetaalkracht van de cirkelvormige beweging. Door deze vergelijking te schrijven in functie van de opgelegde spanning, en deze te combineren met Vergelijking 2.3, wordt Vergelijking 2.11 bekomen (Gross, 2011a). Deze vergelijking geeft aan dat de scheiding van ionen in de elektrostatische analyser enkel afhankelijk is van de opgelegde veldsterktes U en E, en dus onafhankelijk van de m/z-verhouding. In de praktijk wordt voor het selecteren van een welbepaald ion (m/z) in een eerste stap B vastgelegd. Vervolgens kunnen ionen met een massa/lading-verhouding tussen m/z en 1,2x e´ e´ n voor e´ e´ n geanalyseerd worden door zowel de spanningen van de elektrostatische sector (E) als van het elektrisch veld voor de versnelling (U) te vari¨eren 2.4. De magneet kan hysterese ondervinden, zodat eenzelfde stroomsterkte niet altijd aanleiding geeft tot eenzelfde magnetisch veld. Daarnaast is het verband tussen stroomsterkte en magnetische sterkte niet lineair en bijgevolg niet eenvoudig te automatiseren. Daarom wordt initieel B vastgelegd en dienen tevens interne standaarden gebruikt te worden voor massakalibratie.
Figuur 2.6: Weergave van een dubbel focuserende analyser (Demeestere, 2011).
mv 2 = zeU 2 2zeU v2 = m
Ekin =
18
(2.3) (2.4)
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water
Fl =
mv 2 = zevB = Fc rm mv rm = zeB 2 e m B 2 rm = z 2U
U=
Fe =
mv 2 r2 eB = 1m 2ze 2z
mv 2 = zeE = Fc re mv 2 re = zeE
re =
2.3.2.3
2U E
(2.5) (2.6)
(2.7)
(2.8)
(2.9) (2.10)
(2.11)
Andere massa-analysers
De quadrupool is een toestel waarbij twee paren van parallelle metalen staven of elektroden een verschillende gelijkspanning en radiofrequentie ondervinden (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De gelijkspanning en de radiofrequentie worden gevarieerd, maar in een constante verhouding en met een constante frequentie (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De ionen die door de quadrupool bewegen, ondervinden zo een oscillerend veld en wordt geforceerd in een driedimensionale golfbeweging (Van Bramer, 1998b). Enkel die ionen die stabiel blijven in de analyser kunnen de detector bereiken. De ion-trap is een soort driedimensionale versie van de quadrupool (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Twee hyperbole eindkappen en e´ e´ n ringelektrode vormen de basis van deze analyser (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De radiofrequentie wordt toegepast op de ring, de grondpotentiaal op de eindkappen. Ionen die stabiel zijn in dit veld, worden gevangen gehouden in de analyser (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De onstabiele ionen worden uitgestoten via een opening in de eindkap elektrode, waarna ze gedetecteerd worden (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De quadrupool en de ion-trap kunnen enkel voor toepassingen met een lage RP worden gebruikt. Met een time-of-flight (TOF) analyser worden de ionen door een gekende potentiaal (2-25 kV) (Van Bramer, 1998b) versneld. Via een straalbuis komen ze terecht bij de detector. Hun snelheid en hun vluchttijd wordt dan gelinkt aan de m/z-verhouding (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De orbitrap houdt ionen gevangen op basis van een elektrostatisch veld. De orbitap bestaat uit een holle cilinder met toelopende uiteinden. Binnenin bevindt zich een draad. De ionen worden tangentieel aan de draad ge¨ınjecteerd en worden zo gevangen in een cirkelvormige beweging. Hun traject is afhankelijk van de centrifugaalkracht en de elektrostatische kracht tussen de draad en de cilinder (Gross, 2011b). Bij Fourier transformatie-ion cyclotron resonantie (FT-ICR) is de centrale component van de analyser een cilindrische cel binnenin een sterk magnetisch veld. De ionen die hierin gevangen zijn, maken een cirkelbeweging loodrecht op het vlak van het magnetische veld. De frequentie van deze beweging is afhankelijk van de m/z-verhouding. De stroom die ontstaat wordt geregistreerd in het tijdsdomein. Via een Fouriertransformatie wordt deze omgezet tot het
19
HOOFDSTUK 2. Analyse van farmaceutische residu’s in water frequentiedomein, dat op zijn beurt wordt omgezet tot het massaspectrum (Kazakevich en LoBrutto, 2007). De orbitrap, de TOF en FT-ICR kunnen worden gebruikt voor toepassingen met een hoge RP. Tandem MS (MS/MS) is een combinatie van twee of meer analysers, zoals hierboven beschreven. De eerste analyser wordt gebruikt om een ion te selecteren. In een botsingscel kan dit ion reageren of uiteenvallen. De productionen worden dan gescheiden in de tweede analyser. Deze methode wordt toegepast om structurele informatie te verkrijgen over de molecule of om een bijkomende selectiviteit te bekomen. Voorbeelden van een tandem MS zijn de triple quadrupool of de quadrupool-TOF.
20
Hoofdstuk 3
Validatie
Een validatieprocedure bestaat uit twee onderdelen: de instrumentele validatie en de volledige methodevalidatie. De instrumentele validatie omvat het bepalen van de precisie, de lineariteit, de sensitiviteit en de kruiscontaminatie bij de scheiding en de detectie (HPLC-HRMS). De methodevalidatie bekijkt het hele proces van opslag tot detectie van verbindingen in re¨ele matrices. Hiervoor wordt gefocust op de precisie, de accuraatheid, de specificiteit en selectiviteit, de sensitiviteit en de stabiliteit.
3.1
Kruiscontaminatie
Als twee stalen opeenvolgend geanalyseerd worden met eenzelfde toestel, kan er contaminatie optreden. Dit gebeurt als componenten uit het eerste staal achterblijven op een onderdeel van het toestel en worden gedesorbeerd bij het analyseren van een volgend staal. Kruiscontaminatie wordt gecontroleerd in de instrumentele validatie. Hierbij worden de doelverbindingen opgelost in zuiver solvent en ge¨ınjecteerd in het analytisch toestel. Als in een daaropvolgende analyse van zuiver solvent ook doelverbindingen worden opgemerkt, treedt er kruiscontaminatie op. Hierbij kunnen doelverbindingen bijvoorbeeld blijven plakken op de injectienaald of achterblijven in dode volumes van de analytische apparatuur.
3.2
Lineariteit
De lineariteit geeft weer in hoeverre de respons van de analyse lineair proportioneel is met de aanwezige concentratie of massa van het analiet in het staal (Rosing et al., 2000). De validatie van de instrumentele lineariteit vereist de injectie van een aantal standaardoplossingen bij verschillende concentraties. De concentraties van de standaarden moeten gelijk verdeeld zijn over het concentratiebereik. Drie verschillende methodes om de lineariteit te bepalen worden toegepast: een visuele methode, de kleinste-kwadratenmethode en de F-test. De visuele methode zet de verhouding van het signaal op de concentratie uit in functie van de concentratie (beiden in logaritmische schaal) (Schwesig et al., 2009). De zo bekomen curve is een horizontale rechte als de relatie tussen signaal en concentratie lineair is (Schwesig et al., 2009). Bij de kleinste-kwadratenmethode wordt gekozen om de som van de kwadraten van de residuele fouten te minimaliseren (Mulholland en Hibbert, 1997). De correlatieco¨effici¨ent r geeft aan welke fractie van de variatie van het piekoppervlak wordt verklaard door het lineaire model (Mulholland en Hibbert, 1997). Deze methode gaat er echter van uit dat de variabiliteit onafhankelijk is van de concentratie aan analiet (Rosing et al., 2000). Een alternatieve methode vergelijkt de kalibratie aan de hand van een lineair model met de kalibratie aan de hand van een kwadratisch model. Met een F-test wordt daaropvolgend bepaald of de kwadratische functie tot een significant beter model leidt (OVAM, 2005). Als na deze stappen de regressie over het gewenste bereik niet lineair is, kan de lineariteit worden bepaald over meerdere, kleinere ranges (Rosing et al., 2000).
3.3
Precisie
Volgens ISO 3534-1 is precisie de maat van overeenstemming tussen twee onafhankelijke testresultaten, verkregen onder bepaalde omstandigheden (Gabet et al., 2007). Precisie wordt uitgedrukt op twee niveaus: 21
HOOFDSTUK 3. Validatie herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid, die beiden worden gerapporteerd als standaardafwijkingen of als variatieco¨effici¨enten (relatieve standaardafwijkingen) (OVAM, 2005). Herhaalbaarheid bepaalt de precisie van stalen die onder beperkt vari¨erende omstandigheden worden geanalyseerd, in een kort tijdsbestek. Reproduceerbaarheid is de precisie van stalen die onder sterk vari¨erende omstandigheden worden geanalyseerd (Rosing et al., 2000). Sterk vari¨erende omstandigheden zijn bijvoorbeeld andere toestellen, een andere persoon die de experimenten uitvoert of experimenten op verschillende dagen. Idealiter wordt precisie bepaald op alle bestudeerde matrices, bij concentratieniveaus die voorkomen in re¨ele stalen, en dit voor de volledige methode, dus niet enkel voor de instrumentele stap. De gerapporteerde waarden liggen meestal onder 20% (Gabet et al., 2007). Deze waarde wordt eveneens door Pihlstr¨om et al. (2009) aangeduid als de richtlijn voor relatieve standaardafwijkingen.
3.4
Accuraatheid
Accuraatheid is de mate van conformiteit van het gemiddelde van een reeks meetwaarden tot de werkelijke waarde (OVAM, 2005). Accuraatheid bepaalt samen met de precisie de fout van de analyse (Rosing et al., 2000). Idealiter wordt de accuraatheid bepaald door het gebruik van standaarden, referentiematerialen of gedeutereerde surrogaten (Gabet et al., 2007). Het probleem hierbij is dat deze standaarden niet altijd beschikbaar zijn, of heel duur (Gros et al., 2006). Als alternatief wordt in plaats daarvan de terugvinding (recovery) berekend. Deze geeft aan welke fractie van een component bij analyse wordt teruggevonden na toediening van een gekende hoeveelheid van die component (OVAM, 2005). In waterige matrices wordt deze berekend als de verhouding van het signaal verkregen na analyse van een gespiket staal tot het signaal van een standaardoplossing. Het probleem hierbij is dat andere parameters en componenten in de matrix kunnen interfereren met de toegediende spike en bijgevolg een hoger of lager signaal teweegbrengen (Schwesig et al., 2009). Door deze matrixeffecten gebeurt het dat in de literatuur vaak waarden voor de terugvinding voorkomen die hoger zijn dan 100%. Matuszewski et al. (2003) houden hier wel rekening mee, en stellen de berekening van de proceseffici¨entie voor, die zowel terugvinding als effecten van de matrix omvat (zie Sectie 6.3). Voor elke matrix die wordt onderzocht, moet de terugvinding worden bepaald, en dit bij verschillende spikeconcentraties (Gabet et al., 2007). Voor pesticiden in waterstalen moet de terugvinding tussen 60-140% liggen bij multi-residumethodes, en tussen 70-120% als algemene richtlijn (Pihlstr¨om et al., 2009). Tabel 3.1 geeft de richtlijnen weer voor de terugvinding en precisie van pesticiden in functie van hun concentratie in plantaardige en dierlijke matrices. Voor andere groepen van organische micropolluenten, zoals bijvoorbeeld geneesmiddelenresidu’s, worden dergelijke richtlijnen niet teruggevonden. Tabel 3.1: Richtlijnen omtrent de terugvinding en precisie van pesticiden in functie van hun concentratie in plantaardige en dierlijke matrices (Europese Commissie, 2010).
Concentratie component 1-10 µg.kg−1 10-100 µg.kg−1 100-1000 µg.kg−1 > 1 mg.kg−1
22
Gemiddelde terugvinding (%) 60-120 70-120 70-110 70-110
Relatieve standaardafwijking (%) ≤ 30 ≤ 20 ≤ 15 ≤ 10
HOOFDSTUK 3. Validatie
3.5
Specificiteit en selectiviteit
Een methode is specifiek als ze een respons geeft voor e´ e´ n enkele analiet (Rosing et al., 2000). Selectiviteit is het vermogen van een methode om een respons te geven voor een analiet dat te onderscheiden is van de responsen van andere componenten, en is dus minder strikt dan specificiteit (OVAM, 2005). Selectiviteit is bijvoorbeeld meer toepasbaar als het gaat om chromatografische scheiding, omdat het onmogelijk is op deze manier slechts e´ e´ n component af te scheiden (Rosing et al., 2000). Selectiviteit verwijst naar de mate waarin men via een methode een bepaalde component kan bepalen in een mengsel of matrix, zonder be¨ınvloed te worden door andere componenten met een gelijkaardig gedrag (Vessman et al., 2001). Experimenten hieromtrent spelen zich vaak af bij de ontwikkeling van een analysemethode, en niet zozeer in de validatie (OVAM, 2005).
3.6
Sensitiviteit
De detectielimiet (LOD) of aantoonbaarheidsgrens is de kleinste hoeveelheid component waarvan met een bepaald niveau van betrouwbaarheid gezegd kan worden dat het aanwezig is in het geanalyseerde staal (OVAM, 2005). De kwantificatielimiet (LOQ) is de kleinste hoeveelheid van een component die met een bepaald niveau van betrouwbaarheid gekwantificeerd kan worden (OVAM, 2005). Voor de LOD en LOQ wordt een onderscheid gemaakt tussen de instumentele- en methodedetectielimiet, respectievelijk kwantificatielimiet (IDL, MDL, IQL, MQL). Het bepalen van de LOD en LOQ maakt bij een chromatografische methode vaak gebruik van de signaal/ruis-verhouding (signal/noise, S/N). De gemiddelde hoogte van de ruis in een blanco staal wordt gemeten. De LOD komt dan overeen met een hoeveelheid component die een S/N-verhouding heeft van 3, de LOQ een hoeveelheid met een S/N van 10 (Vial en Jardy, 1999). Een alternatieve methode voor het weergeven van de sensitiviteit is via de beslissingsgrens (CCα ) en het detectievermogen (CCβ ) (Europese Commissie, 2002). CCα geeft de concentratie weer vanaf dewelke met een zekerheid 1-α (95%) besloten kan worden dat de component in het staal aanwezig is (Europese Commissie, 2002). CCβ is de laagste concentratie die met een zekerheid van 1-β (95%) de beslissingslimiet overschrijdt (Europese Commissie, 2002). Voor het bepalen van CCα en CCβ zijn twee verschillende methodes beschikbaar. Volgens Antignac et al. (2003) moeten hiervoor 20 blanco stalen worden geanalyseerd. CCα is dan de gemiddelde respons van die 20 stalen, vermeerderd met 2,33 keer de standaardafwijking van de achtergrondruis. Dit is echter niet zo eenvoudig omdat de analyse van 20 stalen veel tijd vergt. Bovendien zijn blanco stalen niet altijd makkelijk te vinden. Kaufmann (2009) geeft aan dat CCα en CCβ ook berekend kunnen worden door de analyse van ongespikete en gespikete stalen met een concentratie van dezelfde grootteorde als CCα en CCβ . Hieruit kunnen met behulp van Vergelijkingen 3.1 en 3.2 CCα en CCβ ¯ 0 de gemiddelde concentratie van berekend worden. Deze zijn gebaseerd op een eenzijdige t-test, waarbij X ¯ i en σi de gemiddelde concentratie, respectievelijk de standaardafwijking van de de ongespikete stalen is, X gespikete stalen bij concentratieniveau i.
¯i ≥ X ¯ 0 + t1−α,n −1 .σi CCα = X i ¯ CCβ = Xi ≥ CCα + t1−β,n −1 .σi i
(3.1) (3.2)
Deze formules kunnen vereenvoudigd worden tot Vergelijkingen 3.3 en 3.4, uitgaande van een Gaussiaanse ¯ 0 =0 (Vial en Jardy, verdeling, een constante standaardafwijking over het gemeten concentratiebereik en X 1999).
23
HOOFDSTUK 3. Validatie
3.7
CCα ' 3.σi
(3.3)
CCβ ' 10.σi
(3.4)
Stabiliteit
Stabiliteit geeft aan dat de respons van een staal niet significant wijzigt met de tijd (Rosing et al., 2000). Het is belangrijk dat het analiet stabiel blijft in de matrix, en niet degradeert of sorbeert tijdens de opslag. Data over de stabiliteit moeten verkregen worden voor twee a` drie verschillende concentraties, over verschillende tijdsintervallen (Rosing et al., 2000).
24
Deel II
Experimenteel werk
25
Hoofdstuk 4
Doelstelling
Het doel van deze masterproef is het ontwikkelen en valideren van een analytische methode voor het meten van 43 verschillende farmaceutische componenten in influent en effluent van een RWZI. De gebruikte methode combineert vaste-fase extractie (SPE), hoge-performantie vloeistofchromatografie (HPLC) en hogeresolutie massaspectrometrie (HRMS). Deze methode is vernieuwend omwille van de selectie van de verbindingen. Antivirale middelen en chinolonen werden bijvoorbeeld nog niet vaak opgenomen in een dergelijke multi-residumethode. Ook het type HRMS dat in deze studie wordt aangewend is vernieuwend voor wateranalyses. De vaste-fase extractie is een cruciale stap voor het opstellen van de methode en de optimalisatie daarvan. De algemene stappen van een SPE-procedure zijn algemeen bekend. Er zijn in dit proces echter nog heel wat parameters die geoptimaliseerd kunnen worden voor de specifieke componenten in het staal. De bedoeling van deze optimalisatie is om een zo goed mogelijke performantie te verkrijgen over alle componenten heen. Daarnaast moet de procedure ook herhaalbaar zijn. De laatste stap is de validatie van de methode voor influent en effluent. Er worden onder andere proceseffici¨enties bepaald, samen met de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid, lineariteit, detectie- en kwantificatielimieten. Het uiteindelijke doel is de toepassing van de geoptimaliseerde en gevalideerde methode op het influent en effluent van de afvalwaterzuiveringsinstallatie (RWZI) te Schilde. Enerzijds wordt zo de toepasbaarheid van de ontwikkelde methode getoetst, anderzijds worden zo unieke data voor Vlaanderen gegenereerd. In de RWZI te Schilde worden twee verschillende types van secundaire zuivering aangewend, namelijk het conventioneel actief slibsysteem (CAS) en membraanbioreactoren (MBR). Door de ontwikkelde methode kan bepaald worden wat de concentraties aan de 43 componenten in deze RWZI zijn en hoe goed deze uit het water verwijderd kunnen worden. De specifieke doelstellingen van deze masterproef zijn: 1. 2. 3. 4.
26
Instrumentele validatie (Sectie 6.1) Optimalisatie van de vaste-fase extractie (Sectie 6.2) Methodevalidatie van influent en effluent van RWZI (Sectie 6.3) Toepassing op RWZI en vergelijking tussen CAS en MBR (Sectie 6.4)
Hoofdstuk 5 5.1 5.1.1
Methodologie
Farmaceutische stoffen, oplossingen en glaswerk Farmaceutische stoffen
In dit onderzoek worden 43 farmaceutische stoffen geanalyseerd. Deze zijn reeds op voorhand vastgelegd in het doctoraatsonderzoek van ir. Leendert Vergeynst. De lijst bestaat uit 22 prioritair gerangschikte farmaceutische stoffen op basis van de risico’s voor mens en milieu, geselecteerd uit Cooper et al. (2008), Coutu et al. (2012) en Kumar en Xagoraraki (2010), aangevuld met 21 componenten (antibiotica en antivirale middelen) die uit wetenschappelijk oogpunt interessant of vernieuwend zijn. Deze componenten worden, samen met hun belangrijkste eigenschappen, weergegeven in Tabel A.1, hun ATC-classificatie en hun beoogde effecten worden weergegeven in Tabel A.2. Van elk van de 43 componenten wordt een moederoplossing gemaakt van 1 g.L−1 . Hiervoor wordt 10 mg van de stof afgewogen en opgelost in 10 mL solvent (water, methanol of acetonitril naargelang de oplosbaarheid van de component, Tabel A.1). De oplossingen worden bewaard in gesilaniseerde, amberkleurige flesjes bij een temperatuur van -18°C. Hieruit wordt een standaardmengsel met 2 mg.L−1 aan elke component aangemaakt door 100 µL van de moederoplossingen in een 50 mL-kolf te brengen en aan te vullen met een 10/90-oplossing van methanol/water. Uit deze standaard worden dan de nodige verdunningen gemaakt voor de kalibratie. Voor de ESI+ -analyse wordt 0,1% mierenzuur toegevoegd. Deze standaardmengsels worden in de koelkast bewaard. Op dezelfde wijze wordt een stockoplossing aangemaakt voor het spiken van de waterstalen. Figuur 5.1 geeft de aanmaak van standaarden en oplossingen schematisch weer. 43 individuele moederoplossingen: 1 g.L-1
1 stockoplossing met 43 componenten in 90/10 H2O/MeOH: 100 mL, 2 mg.L-1
Verdunningen voor het aanmaken van standaarden voor kalibratie: 2-1250 µg.L-1
Verdunningen voor het aanmaken van standaarden voor spiking: 20-12500 ng.L-1
Figuur 5.1: Schematische weergave van de aanmaak van standaarden en oplossingen.
5.1.2
Andere oplossingen
Voor de SPE zijn een 5% (m/v) EDTA-, een 5M NaOH- en een mierenzuuroplossing vereist. De oplossing van 5% (m/v) EDTA wordt bereid door 5 g Na2 EDTA in 100 mL gedistilleerd water op te lossen en eventueel
27
HOOFDSTUK 5. Methodologie te verwarmen om volledige oplossing te bekomen. Voor het reinigen van het gebruikte glaswerk worden respectievelijk een 0,1%-oplossing van mierenzuur, een 0,1%-oplossing van NH4 OH, gedistilleerd water en methanol gebruikt. Hierna wordt het glaswerk gedroogd.
5.1.3
Silanisatie van glaswerk
Glaswerk bevat silanolgroepen die componenten kunnen adsorberen. Het is mogelijk om het glas te desactiveren door middel van silanisatie. Deze techniek bestaat erin de silanolgroepen te maskeren door er chemisch een alkoxysilaanlaag aan te binden (Figuur 5.2) (Baker en Kasprzyk-Hordern, 2011a). Hiervoor wordt het droge glaswerk minstens 15 seconden gespoeld met dimethyldichloorsilaan. Vervolgens wordt het glaswerk gespoeld met tolueen en methanol.
Figuur 5.2: Silanisatiereactie.
5.2 5.2.1
Staalname in RWZI Staalname voor methode-optimalisatie en -validatie
Voor de methodeontwikkeling worden schepmonsters genomen van het effluent van de RWZI te Lede, met 14 400 inwonersequivalenten. De validatie wordt toegepast op influent en effluent van dezelfde RWZI.
5.2.2
Staalname van influent en effluent van de RWZI te Schilde
De uiteindelijke methode wordt toegepast op de waterzuiveringsinstallatie van huishoudelijk afvalwater te Schilde (Antwerpen), met 28 000 inwonersequivalenten (Marleen Peereman, Projectleider Analyses Aquafin, persoonlijke communicatie). Deze infrastructuur is eigendom van de NV Aquafin, die ons de nodige waterstalen ter beschikking stelt. Oorspronkelijk werd in Schilde een conventioneel actief slibinstallatie (CAS) gebruikt voor de zuivering. Een uitbreiding van deze techniek was niet mogelijk wegens plaatsgebrek, daarom werd bijkomend een membraanbioreactor (MBR) gebouwd. De influentstroom wordt verdeeld over beide technieken. Figuur 5.3 geeft een schematisch overzicht weer van de RWZI in Schilde, met aanduiding van de staalnameplaatsen doorheen het zuiveringsproces. Volgens Baker en Kasprzyk-Hordern (2011b) worden afvalwaterstalen gewoonlijk gecollecteerd als 24-uurs, tijdsproportionele mengmonsters. Hiervoor wordt een automatisch monsternametoestel gebruikt, waarbij om de 20 minuten 50 mL wordt weerhouden. Een aanzuigleiding wordt in het influent/effluent geplaatst. Met behulp van onderdruk wordt een maattrechter gevuld met water. Het volume wordt bepaald door een elektrische geleider zodat het vullen stopt als deze het waterniveau raakt. Vervolgens wordt het volume in de trechter teruggebracht tot de ingestelde waarde door het opdrijven van de druk in de kolf tot atmosfeerdruk. Ten slotte wordt de afvoerleiding onderaan de trechter geopend en komt het staal in een verzamelrecipi¨ent terecht. Effluentstalen worden 24 uur na het overeenkomstige influentstaal genomen, omdat deze periode ongeveer overeenstemt met de hydraulische
28
HOOFDSTUK 5. Methodologie retentietijd (HRT) (Van De Steene et al., 2010). De staalname vond plaats op 24-27/03/2013 voor het influent en op 25-28/03/2013 voor het effluent. Binnen de 24u werden deze stalen aangezuurd tot een pH-waarde van 3 met behulp van mierenzuur. De vaste-fase extractie werd uitgevoerd op 28/03/2013 voor de stalen van de eerste drie dagen en op 29/03/2013 voor de laatste twee dagen. Op deze manier werd de bewaartijd tot een minimum beperkt. In afwachting van de analyse werden de stalen gekoeld bewaard. De analyses vonden plaats gedurende 3-9/04/2013. Rioleringstelsel Primaire zuivering (rooster, zandvang) Influent Trommelzeef Secundaire zuivering: MBR
Secundaire zuivering: CAS
Anoxisch bekken
Voorbezinkingsbekken
Aeroob bekken
Beluchtingsbekkens
MBR
Nabezinkingsbekkens Effluent CAS
Effluent MBR
Effluent totaal Afvoergoot Zwanebeek
Figuur 5.3: Schematische weergave van de RWZI in Schilde met staalnameplaatsen (brede pijlen).
5.3 5.3.1
Analytische procedure Staalbewaring en -voorbereiding
Om te voorkomen dat de samenstelling van het staal wijzigt gedurende de bewaring, wordt het aangezuurd. Een lage pH (3) zorgt ervoor dat de microbi¨ele activiteit wordt verhinderd (Prasse et al., 2010). Vervolgens wordt het staal in amberkleurige flessen van 5 L bewaard bij een temperatuur van 4°C. De bewaartijd wordt zo kort mogelijk gehouden (enkele dagen). Het staal wordt met behulp van een B¨uchnerfilter gefilterd over een Whatman glasvezelfilter (90 mm diameter, Whatman, Buckinghamshire, Verenigd Koninkrijk) met een pori¨engrootte van 1 µm en vervolgens over een Whatman nylonfilter (90 mm diameter, Whatman, Buckinghamshire, Verenigd Koninkrijk) met een pori¨engrootte van 0,45 µm. De pH van het gefilterde water wordt aangepast tot 7,0 ± 0,1 met een oplossing van 5M NaOH en 10% mierenzuur. Vervolgens wordt 0,1% EDTA toegevoegd.
29
HOOFDSTUK 5. Methodologie
5.3.2
Vaste-fase extractie
De vaste-fase extractie wordt uitgevoerd met een IST VacMaster-10, met plaats voor 10 SPE-kolommen. Deze VacMaster is verbonden met een vacu¨umpomp (Neuberger Type N 026.1.2 AN.18.) om het solvent makkelijker doorheen het sorbens te leiden en het vervolgens onderaan in het glazen recipi¨ent af te voeren. De gebruikte kolommen zijn Oasis HLB SPE-kolommen (hydrofiel-lipofiel gebalanceerd; 200 mg sorbens; pori¨engrootte 30 µm; kolomvolume 6 ml) van Waters (Manchester, Verenigd Koninkrijk). HLB-kolommen worden vaak gebruikt (zie Tabel 2.1) en er wordt verwacht dat ze een goede proceseffici¨entie behalen voor een breed spectrum aan componenten. De initi¨ele, te optimaliseren methode bestaat uit volgende stappen: 1. Bevochtiging en conditionering van het sorbens: er wordt 6 mL methanol en 6 mL water over de kolom gebracht met een doorloopsnelheid lager dan 4 mL.min−1 (druppelsgewijs). 2. Staaladditie: 100 mL van het staal wordt over de kolom gebracht aan een doorloopsnelheid lager dan 4 mL.min−1 . 3. Wassen: 12 mL gede¨ıoniseerd water met een pH overeenkomstig aan die van het staal wordt aan de kolom toegevoegd, waarna het sorbens wordt gedroogd onder vacu¨um. 4. Elutie: 10 mL methanol wordt over het sorbens gebracht en het eluens wordt opgevangen in een niet-gesilaniseerde glazen proefbuis. 5. Indampen eluens: de proefbuizen worden onder een lichte N2 -stroom drooggedampt, waarbij de wanden van de proefbuis tweemaal met methanol worden afgespoeld. Er wordt gespoeld met 1 mL wanneer het staal tot 1 mL werd drooggedampt, en met 0,5 mL als de proefbuis bijna droog is. 6. Reconstitutie: het drooggedampte staal wordt gereconstitueerd met 1 mL van een 90/10-oplossing van gedistilleerd water en methanol. Om het heroplossen te bevorderen wordt gedurende 20 seconden gevortexed. Om partikels te vermijden wordt ook gedurende 2 minuten gecentrifugeerd aan 1 000 toeren per minuut. Voor een ESI− -analyse wordt 500 µL van het staal in een vial gebracht, voor een ESI+ -analyse wordt samen met 500 µL staal ook nog 0,1% mierenzuur toegevoegd aan een vial. 7. Staalbewaring: in afwachting van de analyse worden de stalen bewaard bij -18°C. Deze bewaartijd wordt zo kort mogelijk gehouden, maximaal enkele dagen.
5.3.3
Vloeistofchromatografie
Deze methode werd geoptimaliseerd in een voorgaand onderzoek (Van Rompu, 2012). Voor de chromatografische scheiding wordt gebruik gemaakt van een Surveyor HPLC-systeem (Thermo Finnigan) met een Phenomenex Luna C18(2)-kolom (150 mm x 2,0 mm, deeltjesdiameter 3 µm) voor omgekeerde-fase chromatografie. De injectie verloopt via een no waste-lus. Reiniging van de loop, injector, injectienaald en -spuit wordt bekomen met 800 µL water met 1% NH4 OH en met 1 mL methanol aan een debiet van 50 µL.s−1 voor de injectie en met 1 mL methanol (50 µL.s−1 ) na de injectie. Chromatografische scheiding met ESI+ wordt uitgevoerd met een binaire mobiele-fase gradi¨ent met solvent A (methanol + 0,1% mierenzuur) en solvent B (H2 O + 0,1% mierenzuur). Chromatografische scheiding met ESI− wordt uitgevoerd met een binaire mobiele-fase gradi¨ent met solvent C (acetonitril) en solvent D (H2 O). De kolom heeft een temperatuur van 35°C. Het HPLC-eluens wordt opgesplitst om de belasting van de ionisatiebron te verminderen. Na de split wordt een referentieoplossing toegevoegd voor de massakalibratie en voor het reduceren van de analyse-tot-analysevariabiliteit. Figuur 5.4 geeft schematisch de koppeling tussen HPLC en HRMS weer. De retentietijd van de 43 componenten onder deze omstandigheden, wordt weergegeven in Tabel A.1.
30
HOOFDSTUK 5. Methodologie
5.3.4
Hoge-resolutie massaspectrometrie
De massaspectrometer is een Thermo Finnigan MAT95XP-TRAP, uitgerust met een ESI-ionisatiebron (API 2 TSQ/SSO 7 000, Thermo Finnigan). Een eerste beslissing die genomen moet worden met betrekking tot analyse is de ionisatievorm: positief of negatief. In de positieve vorm worden basische componenten geprotoneerd. In de negatieve vorm worden zure componenten gedeprotoneerd (Kazakevich en LoBrutto, 2007). Deze laatste is meer selectief, omdat slechts een beperkt aantal componenten zo kunnen worden ge¨ıoniseerd. Er wordt een potentiaalverschil van 3kV aangelegd, het capillair wordt verwarmd tot 250°C en de N2 -gasdruk bedraagt 4 bar. Deze methode werd geoptimaliseerd door Van Rompu (2012). De massaspectrometer maakt gebruik van een dubbelfocuserende massa-analyser bij een hoge resolving power (RP = ± 10 000). Er wordt gewerkt in de multiple ion detection-modus (MID). Hierbij wordt niet het volledige spectrum geanalyseerd, maar wordt er specifiek gezocht in een m/z-interval ± 50 ppm rondom de exacte massa van de verschillende doelverbindingen. De onderzochte componenten worden verdeeld over vier MID-groepen, drie voor positieve en e´ e´ n voor negatieve ionisatie. Het aantal componenten dat in e´ e´ n MID-groep kan voorkomen is namelijk beperkt door het gekozen m/z-interval. In Tabel A.1 wordt per component het nummer van de MID weergegeven. De massakalibratie gebeurt voor de positieve ionisatie door middel van drie mengsels van polyethyleenglycol (PEG): PEG 200, PEG 300 en PEG 400. Voor de negatieve ionisatie worden het PEG 200-mengsel, ketoprofen en 4-hydroxy-2,3-dimethoxybenzo¨ezuur toegediend. Voor elk ion wordt dan een massa van dit mengsel geselecteerd die net hoger is dan het beschouwde ion, evenals een massa die net lager is. De vier MID’s worden op verschillende, opeenvolgende dagen geanalyseerd. Staal 130 µL.min-1
10 µL
170 µL.min-1
HPLC
Spuifractie
170 µL.min-1
50 µL.min-1
HRMS
10 µL.min-1
Referentieoplossing
Figuur 5.4: Schematische weergave van de koppeling tussen HPLC en HRMS.
5.3.5
Interne kalibratie
Voor de piekintegratie met behulp van het programma XCalibur, worden extracted ion chromatograms (XIC) afgeleid vanuit het MID. De MID geeft namelijk een brede range van meerdere gedetecteerde massa’s weer. Hieruit kan een specifiek ion worden geselecteerd, met een bepaalde massatolerantie. De totale intensiteit binnen het geselecteerde m/z-bereik wordt uitgezet in een XIC. In een XIC kan de gewenste piek in meer detail worden geanalyseerd. De piekoppervlakken worden verkregen door het integreren van de pieken in de XIC. Deze piekoppervlakken worden genormaliseerd met het signaal van de interne standaarden om voor
31
HOOFDSTUK 5. Methodologie verschillen in gevoeligheid van de HRMS te compenseren van analyse tot analyse. Het genormaliseerde piekoppervlak (S) wordt berekend als de verhouding van het oppervlak onder de piek (A) gedeeld door de intensiteit van het PEG-ion (PEG) (Vergelijking 5.1, Tabel 5.1).
S=
A P EG
(5.1)
Tabel 5.1: PEG-ionen gebruikt voor de normalisering van de piekoppervlakken.
MID 1 2 3 4
5.4
PEG-ion (m/z) 283,1751 239,1486 283,1751 253,0870
Retentietijd (min) 19 - 22 13 - 30 11,5 - 19 8 - 11
Validatieparameters
De validatie is een belangrijke stap in de methodeontwikkeling. In Sectie 3 werden de verschillende onderdelen van een dergelijke validatie besproken. In Tabel 5.2 wordt weergegeven welke parameters bepaald worden voor de SPE-HPLC-HRMS-methode die in dit werk bestudeerd wordt. Tabel 5.2: Onderdelen van de methodevalidatie.
Instrumentele validatie Kruiscontaminatie Precisie: herhaalbaarheid (n = 3) Sensitiviteit: CCα en CCβ Lineariteit
32
Methodevalidatie Precisie: reproduceerbaarheid (n = 3) Accuraatheid: Proceseffici¨entie per concentratieniveau Onzekerheid op proceseffici¨entie per concentratieniveau Matrixeffect en terugvinding Globale proceseffici¨entie voor gehele concentratiebereik Achtergrondconcentratie Sensitiviteit: CCα en CCβ
Hoofdstuk 6 6.1
Resultaten en discussie
Instrumentele validatie
In een eerste stap wordt het instrumentele gedeelte (HPLC-HRMS) van de methode gevalideerd. De instrumentele validatie bestaat uit de controle op kruiscontaminatie, lineariteit, herhaalbaarheid en sensitiviteit. De basis hiervoor werd reeds gelegd in Van Rompu (2012). Een standaardoplossing werd ge¨ınjecteerd bij vier verschillende concentraties (20-100-500-2000 µg.L−1 ), met drie herhalingen per concentratieniveau. Hieruit resulteerden piekoppervlakken voor elke component, die werden gecorrigeerd voor de interne standaard (Sectie 5.3.5).
6.1.1
Kruiscontaminatie
Voor elke reeks stalen die wordt geanalyseerd, is het eerste staal een blanco oplossing. Als hierin pieken worden gedetecteerd, betekent dit dat er kruiscontaminatie optreedt. Van Rompu (2012) nam kruiscontaminatie waar voor 14 van de 43 doelverbindingen. In navolging hiervan werden de reinigingsstappen voor de HPLC geoptimaliseerd. Concreet werd een extra reiniging met behulp van 800 µL water met 1% NH4 OH toegevoegd aan het reinigingsprogramma. Gebruik makend van deze reinigingsstappen wordt slechts sporadisch nog kruiscontaminatie gedetecteerd. Om dit toch op een systematische manier na te gaan, wordt voorafgaand aan elke analysereeks een blanco analyse uitgevoerd. Een tweede maatregel die wordt genomen is het analyseren van stalen in toenemende concentratie, zodat stalen met een grotere hoeveelheid farmaceutische stoffen een staal met een kleinere hoeveelheid niet kunnen contamineren.
6.1.2
Precisie: herhaalbaarheid
Van elk concentratieniveau werden drie stalen ge¨ınjecteerd op dezelfde dag. Over deze drie herhalingen kan de herhaalbaarheid worden berekend (n = 3), uitgedrukt als variatieco¨effici¨enten. Hiertoe wordt Vergelijking ¯ i voor de gemiddelde concentratie en σi voor 6.1 toegepast, waarbij i staat voor het concentratieniveau, X de standaardafwijking op drie herhalingen. De resultaten van deze berekeningen kunnen teruggevonden worden in Tabel B.1, alsook de CCα en CCβ , die in Sectie 6.1.3 worden berekend. Een eerste conclusie die uit deze resultaten getrokken kan worden, is dat de precisie stijgt naarmate de ge¨ınjecteerde concentratie stijgt. Dit is niet altijd zo op componentniveau, maar eerder een globale trend over de 43 componenten heen. Een tweede besluit is dat op elk concentratieniveau de variatieco¨effici¨enten lager zijn 20%, op enkele uitzonderingen na, en in een meerderheid van de gevallen zelfs lager dan 10%. σi V Ci (%) = ¯ .100 Xi
6.1.3
(6.1)
Sensitiviteit
Op basis van deze resultaten kunnen de beslissingsgrens CCα en het detectievermogen CCβ van het instrumentele deel van de methode worden bepaald. Vergelijkingen 6.2, 6.3 en 6.4 geven de gebruikte formules
33
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie weer en zijn gebaseerd op de Vergelijkingen 3.1 en 3.2 in Sectie 3.6. Voor elke standaard worden drie herhalingen (n = 3) geanalyseerd, en zijn er dus drie piekoppervlakken beschikbaar. Hierop wordt de stan¯ i berekend. X ¯ 0 heeft hier de waarde nul, omdat de ge¨ınjecteerde daardafwijking σi en het gemiddelde X blanco enkel gedemineraliseerd water bevat. De α- en β-waarden worden ingesteld op 5%. Is het linkerlid van de vergelijking groter dan de toetsingswaarde in het rechterlid, dan is de component detecteerbaar, respectievelijk kwantificeerbaar.
¯i ≥ X ¯ 0 + t1−α,n−1 .σi CCα = X ¯ i ≥ CCα + t1−β,n−1 .σi CCβ = X
(6.2)
t1−α,n−1 = t1−β,n−1 = t0.95,2 = 2.92
(6.4)
(6.3)
De resultaten van CCα en CCβ kunnen worden teruggevonden in Bijlage B.1. Voor alle 43 componenten komt de detectielimiet overeen met de concentratie van de laagste standaard (20 µg.L−1 ). Voor 36 van de 43 componenten bedraagt de IQL eveneens 20 µg.L−1 . Voor de overige zeven componenten correspondeert de kwantificatielmiet met het tweede concentratieniveau, de IQL bedraagt dan 100 µg.L−1 . Merk op dat de CCα en CCβ lager kunnen zijn dan de laagste toegepaste concentratie. Om hierover uitsluitsel te kunnen geven, zouden ook lagere concentraties geanalyseerd moeten worden.
6.1.4
Lineariteit
Met behulp van het statistisch rekenprogramma R wordt aan de genormaliseerde piekoppervlakken een lineair en een kwadratisch model gefit in functie van de concentratie. De gewogen kleinste-kwadratenmethode (sum of squared residuals, SSR) wordt toegepast voor het minimaliseren van de afwijking (e) tussen de meetpunten en de regressiecurve voor zowel de lineaire als de kwadratische regressiecurve. Hierbij wordt de wegingsfactor w in acht genomen, zie Vergelijking 6.6, om te corrigeren voor de toenemende variabiliteit met het toenemende concentratieniveau (i). Er kan namelijk van uitgegaan worden dat de fout lineair toeneemt met de concentratie (xi ). Merk op dat hier in feite de relatieve fout (wi ej ) wordt geminimaliseerd. Met behulp van een F-test wordt ge¨evalueerd of het lineaire model j (met pj = 2 parameters) een significant kleinere SSR oplevert dan het kwadratische model k (met pk = 3 parameters) (Vergelijking 6.7). De berekende waarde voor F wordt vergeleken met de Fpk −pj ,n−pk -verdeling op het 5%-significantieniveau. De parameter n staat hierbij voor het aantal datapunten. In dit geval is n gelijk aan 12 (4 concentratieniveaus met elk 3 herhalingen).
X
(wi ej )2
(6.5)
1 xi
(6.6)
SSRj −SSRk pk −pj SSRk n−pk
(6.7)
SSR =
wi = F =
Voor 29 van de 43 componenten kan op basis van de F-test geen significante afwijking van lineariteit gedetecteerd worden (p > 0,05). Voor de overige 14 componenten is het lineaire model significant minder goed dan het kwadratische model (p < 0,05). Daarom wordt ge¨opteerd voor een kwadratische regressie voor alle componenten. De curves van de lineaire regressie, alsook curves met een vergelijking tussen de lineaire en
34
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie kwadratische regressie zijn beschikbaar in Bijlage C (elektronisch). Figuur 6.1 geeft ter illustratie een voorbeeld weer voor de component flumequine (p < 0,05). Op deze figuur is te zien dat de gewogen residuelen van het kwadratische model meer homogeen verdeeld zijn dan deze van het lineaire model. Hierdoor is de fit van het kwadratische model beter dan van het lineaire model.
Figuur 6.1: Vergelijking tussen de lineaire (lm) en de kwadratische regressiecurve (qm) voor flumequine op basis van 1/x-gewogen residuele fouten.
6.2
Optimalisatie van de SPE-methode
Voorafgaand aan de HPLC-HRMS-analyse van de waterstalen, vindt een staalvoorbereiding plaats. In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van vaste-fase extractie om een opconcentratie te bekomen voor de 43 componenten en om interfererende componenten te verwijderen uit het staal. De procedure van deze staalvoorbereiding omvat meerdere parameters die kunnen worden gevarieerd naargelang de eigenschappen van het staal en zijn componenten. De optimalisatie heeft als doel de ideale combinatie van parameterwaarden te vinden, zodat een goede gemiddelde proceseffici¨entie (60-140%) en goede herhaalbaarheid worden bekomen. Aangezien het hier gaat om een multi-residumethode, ligt de focus in eerste instantie op de performantie over de volledige set van de 43 farmaceutische stoffen, eerder dan een optimalisatie gericht op e´ e´ n of enkele specifieke verbindingen.
6.2.1
Selectie van de te optimaliseren parameters
Vaste-fase extractie omvat verschillende stappen en parameters, zoals reeds vermeld in Sectie 2.1. De parameters van de basisprocedure die in dit onderzoek worden gevarieerd en getoetst, zijn: • pH van het staal: 3 of 7 (experimenten 11 en 12).
35
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie • Soort proefbuis: hierbij worden zowel gesilaniseerd glas (S), niet-gesilaniseerd glas (NS) en polypropyleen (PP) getest (experimenten 3, 5 en 7). Het glaswerk wordt gedeactiveerd om te vermijden dat polaire componenten adsorberen aan de OH-groepen op het glasoppervlak (Baker en KasprzykHordern, 2011b); • Toedienen van EDTA: 0 of 0,1% EDTA (experimenten 5 en 9); • Wascondities: 0, 12 of 24 mL gedistilleerd water of 12 mL water met 2,5% MeOH met een pH overeenkomstig het staal (experimenten 1-4); • Elutiecondities: 5 mL methanol, 10 mL methanol, 10 mL ethylacetaat of een mengsel van 5 mL methanol en 5 mL ethylacetaat (experimenten 5, 6, 8 en 10). • Temperatuur bij het droogdampen (Tvap): 25°C of 40°C (experimenten 13 en 14). • Staalvolume: 50, 100, 250, 500 mL (experimenten 16-19). Deze parameter werd pas getoetst nadat de overige parameters geoptimaliseerd waren. De verschillende experimenten worden weergegeven in Tabel 6.1.
Tabel 6.1: Overzicht van de verschillende optimalisatie-experimenten.
6.2.2
Nr.
Proefbuis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
NS NS NS NS S S PP S S S S S S S S S S S S
EDTA (%) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Wassen (mL) 0 12 24 10 + 2,5% MeOH 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24
Elutie (mL) 10 MeOH 10 MeOH 10 MeOH 10 MeOH 10 MeOH 10 EAc 10 MeOH 5 MeOH 10 MeOH 5 MeOH + 5 EAc 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH 5 MeOH
Tvap (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 40 40 40 25 25 25 25 25 25
pH 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 7 7 7 7 7 7 7 7
Volume (mL) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 500 250 100 50
Proefopzet
Het doel van de SPE-optimalisatie is een optimale proceseffici¨entie (60-140%) te bekomen over alle componenten, die daarenboven herhaalbaar is (minimale variatieco¨effici¨ent). De experimenten worden uitgevoerd op 16 componenten (MID 1) om het aantal analyses praktisch haalbaar te houden. Deze MID-groep bevat de meeste componenten, zowel componenten met een hoge als een lage proceseffici¨entie, en is dus het meest representatief voor de multi-residumethode. Alle optimalisatie-experimenten worden uitgevoerd op het effluent van de RWZI te Lede. Figuur 6.2 geeft een overzicht van de verschillende stalen die worden gebruikt en de stappen die deze stalen doorlopen tijdens de berekeningen. Er worden zowel stalen met een spike van 500 ng.L−1 als stalen zonder spike gebruikt, telkens in drievoud (n = 3). Deze stalen ondergaan SPE alvorens de analyse in HPLC-HRMS. Door middel van e´ e´ npuntskalibratie met behulp van standaard A, kunnen de piekoppervlakken in de stalen worden omgezet naar concentraties B en C.
36
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
StandaardhA
Staalh
50hµg.L‐1
Spike 500hng.L‐1
SPE Genormaliseerdhpiekoppervlakh+HPLC‐HRMSh=hpiekintegratie) Eénpuntskalibratie
ConcentratiehB
ConcentratiehC
+nh=h3)
+nh=h3)
Procesefficiëntie HerhaalbaarheidhvanhC Reproduceerbaarheidhvanhdehprocesefficiëntieh
Figuur 6.2: Schematische weergave van de optimalisatie-experimenten.
6.2.3
Evaluatie
Op basis van concentratie B (niet-gespiket staal) en concentratie C (gespiket staal) kan de proceseffici¨entie (PE) worden bepaald door middel van Vergelijking 6.8. Hierbij staat A voor de concentratie die theoretisch teruggevonden kan worden na SPE bij een spike-concentratie van 500 ng.L−1 en een opconcentratiefactor van 100. Dit is tevens de concentratie van de externe standaard.
P E(%) =
C −B A
(6.8)
Elk staal wordt op dezelfde dag in drievoud (n = 3) geanalyseerd. Op het gespikete staal (C) wordt de herhaalbaarheid bepaald als variatieco¨effici¨ent (%). Dit kan door standaardafwijking over herhaalde metingen ¯ (Vergelijking 6.9). te bepalen (σC ), en deze waarde te delen door het gemiddelde van die metingen (C) σC V CC (%) = ¯ C
6.2.4 6.2.4.1
(6.9)
Resultaten en interpretatie Gemiddelde proceseffici¨entie en herhaalbaarheid voor MID 1
In eerste instantie ligt de focus op de gemiddelde performantie over de 16 componenten van MID 1 heen. Hiertoe worden de proceseffici¨entie en de herhaalbaarheid van de verschillende condities vergeleken relatief ten opzichte van e´ e´ n geselecteerde referentieconditie. De resultaten worden visueel uitgezet in de vorm van een boxplot (Figuur 6.3). Deze boxplots worden geconstrueerd op basis van 96 punten (n = 2x16x3): twee condities worden vergeleken voor 16 componenten, waarbij elke conditie drie keer werd herhaald. In deze boxplots betekent een positieve waarde voor de proceseffici¨entie dat de gekozen conditie een hogere gemiddelde proceseffici¨entie heeft dan de referentie en dus volgens onze doelstelling beter scoort. Een negatieve waarde bij de variatieco¨effici¨ent betekent dat de gekozen conditie een lagere gemiddelde variatieco¨effici¨ent heeft dan de referentieconditie en volgens onze doelstelling beter scoort.
37
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie o
Uitschieter Maximale waarde of 1,5x interkwartielafstand (ten opzichte van het derde kwartiel) in geval van uitschieters Derde kwartiel
Mediaan
Interkwartielafstand
Eerste kwartiel
Minimale waarde of 1,5x interkwartielafstand (ten opzicht van het eerste kwartiel) in geval van uitschieters
Figuur 6.3: Indeling van een boxplot in het programma R.
pH van het staal Omdat de HLB-kolom componenten weerhoudt op basis van hydrofiliciteit en niet op basis van lading, wordt verwacht dat de proceseffici¨entie bij pH 7 beter is dan bij pH 3. In Figuur 6.4 is er echter weinig verschil tussen beiden voor de componenten in MID 1, de boxplot voor proceseffici¨entie bevindt zich namelijk rond de waarde 0. Ook de variabiliteit is vrij gelijkaardig voor beiden, met een verschil van slechts 5% voor de mediaan. De methode is op basis van deze data vrij ongevoelig voor een vari¨erende pH. Er wordt verder gewerkt met pH 7.
Figuur 6.4: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’pH van het staal’ (n = 2x16x3)(referentie = pH 3).
Soort proefbuis Uit Figuur 6.5 kan worden afgelezen dat het polypropyleen ongeveer dezelfde proceseffici¨entie behaalt dan de niet-gesilaniseerde proefbuis (de mediaan is ongeveer 0). De variatie is echter 25 tot 90% groter. De gesilaniseerde proefbuis geeft grotere proceseffici¨enties dan de niet-gesilaniseerde (15% voor de mediaan), vooral bij de componenten met een lage proceseffici¨entie, zoals paroxetine en fluoxetine (zie Sectie 6.2.4.2). Op basis van deze resultaten wordt beslist om verder te werken met gesilaniseerde proefbuizen.
38
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
Figuur 6.5: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Soort proefbuis’ (n = 16x2x3). PP staat voor polypropyleen, NS voor niet-gesilaniseerd en S voor gesilaniseerd (referentie = NS).
Toedienen van EDTA De vergelijking wordt gemaakt tussen het al dan niet toevoegen van EDTA (experiment 5 ten opzichte van experiment 9). Volgens Figuur 6.6 zijn de proceseffici¨enties groter (8% voor de mediaan) als er wel EDTA werd toegevoegd, maar ook de variatie is groter (eveneens 8%). Net zoals bij de vorige parameter, is ook hier de performantie hoger bij componenten met een lage proceseffici¨entie, zoals de tetracyclines (zie Sectie 6.2.4.2). Er wordt verdergewerkt met toevoeging van 0,1% EDTA.
Figuur 6.6: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Toevoeging van EDTA’, met al dan niet een toevoeging van 0,1% EDTA (n = 16x2x3)(referentie = ge.
Wascondities De toegepaste wascondities zijn 0, 12, 24 mL gedistilleerd water en 12 mL gedistilleerd water met 2,5% MeOH (experimenten 1-4). In Figuur 6.7 is in de eerste twee boxplots (12 mL + 2,5% ten opzichte van 0 mL en 12 mL ten opzichte van 0 mL) de proceseffici¨entie ongeveer gelijk met de experimenten zonder wassen. Wassen met 24 mL water levert een hogere proceseffici¨entie op (8% voor de mediaan). Wat betreft de variatieco¨effici¨enten kan worden besloten dat deze 5 tot 35% groter is bij de 12 mL + 2,5%, in de andere gevallen is de herhaalbaarheid vergelijkbaar bij de verschillende volumes (mediaan rond 0). Er
39
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie wordt verdergewerkt met 24 mL gedistilleerd water.
Figuur 6.7: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Wascondities’ (n = 16x2x3). 12 + 2,5 staat voor 12 mL gedistileerd water met 2,5% methanol, 0, 12 en 24 stellen 0 mL, 12 mL en 24 mL gedistileerd water voor (referentie = 0 mL).
Elutiecondities Er worden twee verschillende solventen en twee verschillende volumes getest: 10 mL MeOH, 5 mL MeOH, 10 mL ethylacetaat (EAc) en een een combinatie van 5 mL van beide solventen (Figuur 6.8). Voor het ethylacetaat liggen de proceseffici¨enties tot 50% lager dan bij de overige solventen. Verder treedt er weinig verschil op tussen de vier experimenten. Aangezien de elutie met 5 mL MeOH goede resultaten oplevert en hiervoor het minst solvent vereist is, wordt ge¨opteerd voor deze elutieconditie.
Figuur 6.8: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Elutiecondities’ (n = 16x2x3). 10 EAc staat voor 10 mL ethylacetaat, 5 M staat voor 5 mL methanol, 10 M staat voor 10 mL methanol en 5+5 staat voor een mengsel van 5 mL methanol en 5 mL ethylacetaat (referentie = 10 mL MeOH).
Temperatuur bij het droogdampen Zoals in de literatuurstudie werd aangegeven (Sectie 2.1), gebruiken de meeste onderzoekers een temperatuur van 35°C of meer voor het droogdampen van het eluens. In dit onderzoek wordt de vergelijking gemaakt tussen een temperatuur van 25°C en 40°C. Volgens Figuur 6.9 treedt er zeer weinig verschil op tussen beide
40
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie temperaturen wat betreft de proceseffici¨entie, de herhaalbaarheid is 15% minder goed bij 40°C. Ondanks de geringe tijdswinst (ongeveer een uur) bij het droogdampen bij 40°C, wordt in de geoptimaliseerde methode toch drooggedampt bij 25°C.
Figuur 6.9: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Tvap’ (n = 16x2x3). 25 en 40 staan respectievelijk voor 25°C en 40°C (referentie = 40°C).
Staalvolume Vier verschillende staalvolumes werden getoetst: 50 mL, 100 mL, 250 mL en 500 mL. Door grotere stalen met dezelfde concentratie te gebruiken, kan een grotere hoeveelheid van de componenten worden beladen. Er is echter ook meer kans dat er doorbraak optreedt en de component uit de kolom wordt gespoeld. In Figuur 6.10 scoort de herhaalbaarheid (variatieco¨effici¨ent) ongeveer even goed bij de vier experimenten. De proceseffici¨entie is echter tot 100% hoger bij 50 mL en 100 mL dan bij de grotere volumes. Op het eerste zicht leveren stalen van 50 mL betere resultaten op (de mediaan is 45% bij 50 mL, en 40% bij 100 mL). Er moet echter rekening worden gehouden met de belading. Bij 100 mL is die dubbel zo groot, terwijl de globale proceseffici¨entie ongeveer even goed scoort. De optimalisatie werd uitgevoerd op effluentstalen, zodat ook enkel hiervoor een besluit kan worden getrokken uit deze resultaten. Voor effluentstalen wordt bijgevolg verder gewerkt met stalen van 100 mL. Voor het influent wordt verwacht dat de concentratie aan componenten en de matrixeffecten groter zullen zijn. Om de analytische apparatuur niet te belasten met een te hoge belading, wordt besloten om voor influent verder te werken met stalen van 50 mL.
41
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
Figuur 6.10: Vergelijking voor de verschillende experimenten voor de parameter ’Staalvolume’ (n = 16x2x3). 50, 100, 250 en 500 staan voor de overeenkomstige staalvolumes in mL referentie = 500 mL).
6.2.4.2
Per component
In Sectie 6.2.4.1 werd gefocust op de gemiddelde performantie over de 16 componenten van MID 1 heen. De resultaten van de optimalisatie kunnen in tweede instantie ook per component worden ge¨ınterpreteerd. De proceseffici¨entie en de herhaalbaarheid voor MID 1 kunnen teruggevonden worden in Tabellen B.2 en B.3. Deze resultaten worden ook visueel weergegeven in Figuren 6.11 en 6.12. In deze figuren wordt met behulp van een kleurcode een onderscheid gemaakt tussen componenten op basis van hun performantie. Hiervoor worden de normen uit Secties 3.3 (≤ 20% voor variatieco¨effici¨enten) en 3.4 (60-140% voor proceseffici¨entie) toegepast.
42
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
Figuur 6.11: Overzicht van de optimalisatie-experimenten op basis van de accuraatheid (proceseffici¨entie %) (n = 16x3).
Figuur 6.12: Overzicht van de optimalisatie-experimenten op basis van de herhaalbaarheid van de methode (n = 3) (variatieco¨effici¨ent %) (n = 16x3).
Figuur 6.11 geeft de resultaten weer voor de proceseffici¨entie. De trends per component (horizontaal) zijn minder uitgesproken, maar het is mogelijk om componenten met een lage proceseffici¨entie te identificeren, zoals acyclovir, paroxetine en fluoxetine. Deze componenten behalen consequent een lage proceseffici¨entie, ongeacht het optimalisatie-experiment. Acyclovir heeft een korte retentietijd en een lage Kow -waarde (Tabel A.1). Het is mogelijk dat acyclovir uit de SPE-kolom wordt gespoeld tijdens het wassen, omdat het een sterk 43
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie hydrofiele component is. Dit blijkt ook uit de retentietijd in de omgekeerde-fase kolom van de HPLC. Voor paroxetine en fluoxetine kan niet eenduidig worden bepaald wat hun lage proceseffici¨entie veroorzaakt. Het is mogelijk dat deze componenten een effect van de matrix ondervinden. Er zijn vrij veel experimenten (verticaal) die gelijkaardig presteren op vlak van proceseffici¨entie, bijvoorbeeld experimenten 10-15. Experiment 6 daarentegen (elutie met 10 mL EAc) presteert voor de meeste componenten duidelijk slechter dan de andere experimenten. Figuur 6.12 geeft de resultaten weer voor de herhaalbaarheid van de methode. Per component (horizontaal) zijn geen duidelijke trends waar te nemen. Per experiment (verticaal) zijn steeds e´ e´ n of meer componenten die een variatieco¨effici¨ent hoger dan 20% behalen. Het is het duidelijk dat bijvoorbeeld experiment 7 weinig herhaalbaar is. Dit is het experiment met de polypropyleen proefbuis, dat ook in de overeenkomstige boxplot een hoge variatieco¨effici¨ent had.
6.2.5
Evaluatie van de geoptimaliseerde SPE-methode
Tabel 6.2 vergelijkt kort de inti¨ele en de geoptimaliseerde methode. Algemeen kan hieruit worden besloten dat de initi¨ele methode niet sterk is gewijzigd door de optimalisatie, enkel voor de parameters proefbuis, wascondities en elutiecondities. De winst in termen van proceseffici¨entie bedraagt 22% (van 50% naar 72%) voor MID 1. De winst in termen van variatieco¨effici¨enten bedraagt 3% (van 14% naar 11%), eveneens voor MID 1. Tabel 6.2: Initi¨ele en ge¨optimaliseerde SPE-methode van de optimalisatie. Parameter pH van het staal Soort proefbuis Toedienen van EDTA Wascondities Elutiecondities Temperatuur bij het droogdampen Staalvolume effluent Staalvolume influent
6.2.5.1
Initi¨ele 7 NS 0,1% 12 mL water 10 mL MeOH 25°C 100 mL 50 mL
Ge¨optimaliseerde 7 S 0,1% 24 mL water 5 mL MeOH 25°C 100 mL 50 mL
Reproduceerbaarheid van de proceseffici¨entie
Gedurende de optimalisatie-experimenten werd de geoptimaliseerde SPE-methode enkele keren herhaald (experimenten 8, 14, 15 en 18). Deze analyses vonden plaats op verschillende dagen, waardoor met behulp van deze resultaten de reproduceerbaarheid van de methode over vier herhalingen getoetst kan worden (n = 4). In Tabel 6.3 worden de vier proceseffici¨enties en de herhaalbaarheid van de concentratie weergegeven, zoals berekend in Vergelijkingen 6.8 en 6.9. Daarnaast wordt het gemiddelde van de vier proceseffici¨enties weergegeven, alsook de reproduceerbaarheid van de proceseffici¨entie (VCP E ). Die laatste wordt berekend volgens Vergelijking 6.10. Hierbij staat σP E voor de standaardafwijking op de proceseffici¨entie, P¯E voor de gemiddelde waarde van de proceseffici¨entie, n voor het aantal datapunten, in dit geval n = 4.
V CP E (%) =
44
σP E P¯E
(6.10)
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Tabel 6.3: Reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde methode voor MID 1. Deze tabel geeft de proceseffici¨enties weer van de vier herhalingen van de geoptimaliseerde SPE-methode, samen met de herhaalbaarheid (VCC (%)). Van de vier proceseffici¨enties wordt een gemiddelde (PE gemiddelde) en de reproduceerbaarheid (als variatieco¨effici¨ent VCP E (%)) weergegeven. Component Lamivudine Acyclovir Metronidazol Paracetamol Tetracycline Oxytetracycline Sarafloxacine Gatifloxacine Moxifloxacine Risperidon Rimantadine Oseltamivir ethylester Paroxetine Fluoxetine Alprazolam Diclofenac
experiment 8 PE VCC 37 1 1 23 90 4 82 6 113 8 89 4 42 12 53 21 46 22 40 16 89 0 88 1 59 10 39 8 83 2 108 2
experiment 14 PE VCC 53 1 2 9 100 3 75 2 60 7 75 5 50 7 54 1 53 5 32 0 87 3 93 1 49 17 29 35 90 7 84 8
experiment 15 PE VCC 41 7 1 22 90 5 75 6 85 8 131 7 67 5 75 10 77 18 80 6 92 3 89 1 69 21 38 32 95 2 134 4
experiment 18 PE VCC 39 4 1 113 105 4 92 14 125 20 151 6 84 14 89 12 70 12 76 11 104 7 101 3 56 30 40 31 98 6 116 12
PE gemiddelde 42 2 97 81 96 111 61 68 61 57 93 93 58 36 92 110
VCP E 17 34 8 10 31 32 31 26 23 43 8 7 15 13 7 19
Volgens deze resultaten is de reproduceerbaarheid van de proceseffici¨entie voor negen componenten van de 16 componenten lager dan 20%. Voor de overige zeven componenten liggen de variatieco¨effici¨enten tussen 23 en 43%. Voor acyclovir behaalt ook de herhaalbaarheid van de concentratie C een hoge variatieco¨effici¨ent (tot 113%) en een lage PE (1 a` 2%), dus de hoge waarde voor VCP E is niet geheel onverwacht. Ook in de Figuur 6.11 komt terug dat de proceseffici¨entie voor deze componenten is gewijzigd gedurende de experimenten (overgang van blauw (<60%) naar groen (60-140%) of zelfs rood (> 140%)). Aangezien deze experimenten op dezelfde wijze werden uitgevoerd, kan een verklaring niet meteen worden aangewezen. Een mogelijkheid is dat de gevoeligheid van de HRMS voor deze componenten is gewijzigd. 6.2.5.2
Uitbreiding van 16 naar 43 componenten
De geoptimaliseerde methode werd toegepast op de gehele set van 43 componenten. In Tabel 6.4 worden de proceseffici¨entie en de herhaalbaarheid (VC %) weergegeven. 33 componenten voldoen aan de 60-140%norm voor een multi-residumethode, 26 componenten voldoen zelfs aan de 70-120%-norm (Sectie 3.4). Daarnaast hebben 37 componenten een variatieco¨effici¨ent ≤ 20%, waarvan 31 componenten zelfs lager dan 10%. Componenten met een lage proceseffici¨entie (< 60%) zijn acyclovir, amoxicilline, paroxetine, fluoxetine en pleconaril. Deze lage proceseffici¨enties gaan meestal ook gepaard met hoge variatieco¨effici¨enten (lage herhaalbaarheid). Voor acyclovir werd reeds een verklaring gevonden in Sectie 6.2.4.2. Amoxicilline heeft vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen als acyclovir (Tabel A.1). Voor pleconaril zijn niet alle fysisch-chemische eigenschappen gekend, maar volgens zijn retentietijd (Tabel A.1), is deze component eerder hydrofoob. Zowel onvolledige elutie als matrixeffecten kunnen een verklaring zijn voor de lage proceseffici¨entie van pleconaril.
45
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Tabel 6.4: Resultaten van de finale methode na optimalisatie: proceseffici¨entie (%) en herhaalbaarheid, weergegeven als variatieco¨effici¨ent (%) (n = 3). Component Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacine Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine
6.3
PE 1 95 86 68 8 62 70 95 52 87 134 71 56 80 38 75 93 87 60 41 58 90 80 59 12 99 82 89 131 75 69 7 92 77 67 78 80 79 119 85 87 102 86
VC 22 2 4 11 173 5 2 17 8 1 4 8 5 10 32 10 23 2 15 7 8 5 6 9 8 5 6 1 7 6 21 38 3 18 5 2 4 8 6 8 4 7 8
Methodevalidatie
De validatie is de laatste stap bij het ontwikkelen van een analysemethode. Het instrumentele gedeelte van de methode werd reeds getoetst in Sectie 6.1. In deze paragraaf worden de precisie, de accuraatheid en de sensitiviteit van de volledige methode besproken, zoals weergegeven in Tabel 5.2.
6.3.1
Proefopzet
Voor de methodevalidatie worden drie soorten stalen gebruikt: stalen zonder spike (B, n = 3); stalen met een pre-spike (C, spike v´oo´ r de SPE) bij vier verschillende concentraties (n = 4x3) en stalen met een post-spike (D, spike na de SPE, v´oo´ r de HPLC-HRMS) bij e´ e´ n concentratie (n = 3) om de matrixeffecten te kunnen bepalen. Voor de externe kalibratie worden standaarden (A) gebruikt. De concentraties van deze standaarden zijn gelijk aan de theoretische concentraties teruggevonden kunnen worden na SPE bij de overeenkomstige spike-concentraties en de opconcentratiefactor van de SPE (100 voor effluent, 50 voor influent). De proefopzet voor de methodevalidatie wordt schematisch weergegeven in Figuur 6.13.
46
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Voor het selecteren van het concentratiebereik dat bestudeerd zal worden, moet rekening worden gehouden met twee voorwaarden. Ten eerste is het de bedoeling de re¨ele concentraties van farmaceutische residu’s in oppervlaktewater na te bootsen. Verlicchi et al. (2012b) geven aan dat de re¨ele concentraties zich tussen 1 ng.L−1 en 100 µg.L−1 bevinden. Ten tweede moet de toegepaste concentraties na opconcentratie door de SPE (100x voor effluent, 50x voor influent) meetbaar zijn door de massaspectrometer. Dit heeft te maken met zowel de hoogte van de piek ten opzichte van de ruis (aangegeven door de S/N-verhouding), als met de proceseffici¨entie voor die component. Om dit na te gaan wordt voor elke component een standaard van 10 µg.L−1 ge¨ınjecteerd. Voor elke component wordt de S/N-verhouding van de piek vermenigvuldigd met de proceseffici¨entie (Tabel 6.4). Is dit product kleiner dan 100, dan komt de overeenkomstige component in een eerste groep terecht. Is het product echter groter dan 100, dan kan voor deze component gevoeliger gemeten worden, en komt de component in een tweede groep terecht. Deze groepsverdeling kan worden teruggevonden in Tabel B.4. In Tabellen B.5 tot B.13 zullen deze componenten worden aangeduid met een asterix. Op basis van de twee bovenstaande voorwaarden worden voor het effluent voor groep 1 de spikingconcentraties 100-500-2 500-12 500 ng.L−1 geselecteerd. Merk op dat het concentratiebereik een factor 125 omvat, waarin de gekozen concentraties gelijkmatig zijn verdeeld. Voor groep 2 wordt vijf keer lager gespiket, namelijk met de concentraties 20-100-500-2 500 ng.L−1 . Voor het influent is het staalvolume maar half zo groot als dat van het effluent, en dus is ook de opconcentratiefactor maar half zo groot. Om dezelfde standaarden te kunnen gebruiken, wordt de spikeconcentratie verdubbeld ten opzichte van het effluent (2001000-5 000-25 000 ng.L−1 voor groep 1, 40-200-1000-5 000 ng.L−1 voor groep 2). De overeenkomstige standaarden (A) zijn dan 2-10-50-250 µg.L−1 voor groep 1 en 10-50-250-1 250 µg.L−1 voor groep 2. Voor de stalen met post-spike werd voor het effluent een concentratie van 500 ng.L−1 toegepast voor groep 1 en een concentratie van 100 ng.L−1 voor groep 2. Voor het influent gekozen voor een hogere concentratie, namelijk 25 000 ng.L−1 voor groep 1 en 12 500 ng.L−1 voor groep 2. Tabel 6.5 geeft een overzicht van de verschillende stalen die vereist zijn voor de validatie. Tabel 6.5: Stalen die werden getoetst bij de validatie. Effluent
Geen spike Pre-spike Post-spike Standaard
Influent
Geen spike Pre-spike Post-spike Standaard
Geen spike x Groep 1 Groep 2 Groep 1 Groep 2 Groep 1 Groep 2 Geen spike x Groep 1 Groep 2 Groep 1 Groep 2 Groep 1 Groep 2
20 ng.L−1
100 ng.L−1
500 ng.L−1
2500 ng.L−1
12500 ng.L−1
x x
x x x
x x
x
x
x x 1000 ng.L−1
x x 5000 ng.L−1
x
x 40 ng.L−1
x x x 200 ng.L−1
x
x x
x x
x x
x x
x x x
25000 ng.L−1 x x
x
x x
x
47
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Standaard A
Staal (effluent/influent)
2-10-50-250-1250 µg.L-1
Pre-spike 20-100-500-2500-12500 ng.L-1 (effluent) 40-200-1000-5000-25000 ng.L-1 (influent)
SPE Post-spike 10/50 µg.L-1 (effluent) 250/1250 µg.L-1 (influent)
Piekoppervlak (HPLC-HRMS + piekintegratie) Kalibratie
Concentratie B
Concentratie D
Concentratie C
(n = 3)
(n = 3)
(n = 3)
• Reproduceerbaarheid van C • Procesefficiëntie per concentratieniveau • Onzekerheid op de procesefficiëntie • Matrixeffect en terugvinding • Globale procesefficiëntie • Achtergrondconcentratie • Sensitiviteit
Figuur 6.13: Schematische weergave van de methodevalidatie.
6.3.2
Precisie
Bij de validatie-experimenten wordt elk staal met pre-spike (C) drie keer herhaald op drie verschillende dagen (n = 3). De stalen worden wel op dezelfde dag geanalyseerd (injectie in HPLC-HRMS), zoals dat ook bij de toepassing zal gebeuren. Bijgevolg kan hier de reproduceerbaarheid van de verschillende stalen over drie dagen worden bepaald. De reproduceerbaarheid wordt berekend volgens Vergelijking 6.11, en wordt uitgedrukt als variatieco¨effici¨ent. Tabellen B.5 en B.6 bespreken de reproduceerbaarheid, uitgedrukt als VC (%) voor respectievelijk effluent en influent. Over het algemeen dalen de variatieco¨effici¨enten (en verbetert de reproduceerbaarheid) naarmate de concentratie stijgt. Het merendeel van de componenten behaalt een variatieco¨effici¨ent ≤ 20%, zoals wordt voorgeschreven door Pihlstr¨om et al. (2009) (Sectie 3.3). Bij het hoogste concentratieniveau (12500 ng.L−1 , ? 2500 ng.L−1 voor effluent en 25000 ng.L−1 , ? 5000 ng.L−1 voor influent) zijn er slechts drie componenten met een variatieco¨effici¨ent hoger dan 20%, namelijk acyclovir, amoxicilline en pleconaril. σC V CC (%) = ¯ C
(6.11)
σC staat voor de standaardafwijking, C¯ staat voor de gemiddelde waarde van C, n staat voor het aantal meetpunten, in dit geval n = 3.
6.3.3 6.3.3.1
Accuraatheid Proceseffici¨entie per concentratieniveau
Een eerste stap bij het bepalen van de accuraatheid van de methode is het evalueren van de proceseffici¨entie per concentratieniveau. Hiervoor worden de genormaliseerde piekoppervlakken met behulp van een e´ e´ npuntskalibratie van de overeenkomstige standaard omgezet naar concentraties. Tabellen B.7 en B.8
48
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie geven deze proceseffici¨enties weer, berekend op basis van Vergelijking 6.8 (Sectie 6.2). De meerderheid aan componenten (37 van de 43 voor effluent, 38 van de 43 voor influent) heeft een proceseffici¨entie tussen 60-140%. Wat ook opvalt is dat het aantal componenten die zich in dit bereik bevinden, toeneemt met de concentratie. Er zijn echter enkele uitschieters. Bijvoorbeeld voor acyclovir, amoxicilline en pleconaril wordt een lage proceseffici¨entie teruggevonden. Deze componenten vertoonden in Sectie 6.3.2 een lage reproduceerbaarheid. Temazepam daarentegen vertoont een zeer hoge proceseffici¨entie. Daarnaast zijn er ook negatieve waarden terug te vinden voor de proceseffici¨entie. Om deze fenomenen te verklaren, gaan we in de volgende secties dieper in op zowel de onzekerheid op de proceseffici¨entie (Sectie 6.3.3.2), het matrixeffect en de terugvinding (Sectie 6.3.3.3) en de achtergrondconcentratie in het staal (Sectie 6.3.3.5). 6.3.3.2
Onzekerheid op de proceseffici¨entie
Aangezien de proceseffici¨entie het resultaat is van een verschil, is de absolute fout op PE de kwadratische som van de onzekerheid van zijn termen, zoals weergegeven in Vergelijking 6.12. Die termen zijn de concentratie in het niet-gespikete staal gedeeld door de standaard ( B A ) en de concentratie in het staal met C pre-spike gedeeld door de standaard ( A ). De concentratie van de standaard (A) kent geen onzekerheid, omdat wordt gerekend met de theoretische waarde. σP E geeft echter de absolute fout weer op PE. Door deze standaardafwijking te delen door de gemiddelde waarde van PE (P¯E), wordt de relatieve fout verkregen. Deze relatieve fout wordt berekend volgens Vergelijking 6.12, en wordt weergegeven als variatieco¨effici¨ent.
V CP E (%) =
σP E = P¯E
q σ 2B + σ 2C A
A
¯ σ B staat voor de standaardafwijking en B A voor de gemiddelde waarde van A ¯ voor de gemiddelde waarde van C . afwijking en C A
(6.12)
PE B A.
σ C staat voor de standaardA
A
De onzekerheden worden weergegeven in Tabellen B.9 en B.10. Merk op dat de onzekerheid op de proceseffici¨entie groter is dan de reproduceerbaarheid, bepaald in Sectie 6.3.2. De onzekerheid op de niet-gespikete stalen B wordt er namelijk nog bij opgeteld. Ook hier zijn de trends dat de onzekerheid daalt met toenemende concentratie, en dat een meerderheid van de componenten een onzekerheid kleiner dan 20% heeft. Twee redenen voor de grote onzekerheid op de proceseffici¨entie (VC > 10%) kunnen gevonden worden. Ten eerste vertonen de componenten waarvoor in Sectie 6.3.3.1 een lage proceseffici¨entie werd bekomen, zoals acyclovir, ook een grotere onzekerheid op die waarde. Ten tweede wordt de onzekerheid op de berekende proceseffici¨entie groter indien de concentratie van de component in het niet-gespikete staal relatief groot is ten opzichte van de gespikete concentratie. In Sectie 6.3.3.5 wordt de achtergrondconcentratie bepaald en daaruit blijkt dat voor bijvoorbeeld carbamazepine, diclofenac, venlafaxine en paracetamol reeds hoge concentraties in het staal aanwezig zijn. De componenten met een negatieve proceseffici¨entie hebben in Tabellen B.9 en B.10 ook een negatieve waarde voor de onzekerheid. Dit is voor de hand liggend, aangezien in Vergelijking 6.12 gedeeld wordt door de proceseffici¨entie. 6.3.3.3
Matrixeffect en terugvinding
De proceseffici¨entie resulteert uit de combinatie van de matrixeffecten en de terugvinding. Door de matrixeffecten is het mogelijk dat een signaal voor een bepaalde component onderdrukt of versterkt wordt. Hierdoor kunnen proceseffici¨enties van meer dan 100% teruggevonden worden. Matuszewski et al. (2003) ontwikkelden een methode die toelaat de matrixeffecten en de terugvinding te berekenen. Hiervoor zijn vier
49
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie verschillende soorten stalen nodig: de gewone standaardoplossing (A), stalen die zonder spike de procedure doorliepen (B), stalen met een pre-spike (C) en stalen met een post-spike (D). Hieruit kunnen de proceseffici¨entie (PE) (Vergelijking 6.13), de matrixeffecten (ME) (Vergelijking 6.14) en de terugvinding (RE) (Vergelijking 6.15) berekend worden.
(C − B) .100 A (D − B) M E(%) = .100 A PE .100 RE(%) = ME P E(%) =
(6.13) (6.14) (6.15)
Voor de componenten die geen verklaring vonden voor hun extreme proceseffici¨entie in Sectie 6.3.3.2, kan het opsplitsen van de proceseffici¨entie misschien meer antwoorden opleveren. De waarde van het matrixeffect ligt in theorie tussen 0 en +∞. Een matrixeffect van 100% geeft aan dat de matrix geen effect uitoefent op deze component. Een waarde hoger dan 100% geeft aan dat er versterking van het signaal optreedt door de matrix, een waarde lager dan 100% geeft een onderdrukking van het signaal weer. De terugvinding ligt in theorie tussen 0 en 100%. Een waarde van 100% geeft aan dat alles wat op de SPE-kolom werd gebracht ook ge¨elueerd en gemeten werd. Hoe lager de waarde van de terugvinding, hoe groter de hoeveelheid van de component die verloren gaat tijdens de analyse. Voor het effluent kunnen de Vergelijkingen 6.13, 6.14 en 6.15 worden toegepast op het tweede concentratieniveau (500 ng.L−1 , ? 100 ng.L−1 ). De resultaten hiervan worden weergegeven in Tabel B.11. Er zijn 15 componenten die een proceseffici¨entie buiten de range van 60-140% behalen. • Amoxicilline werd bij een pre-spikeconcentratie van 500 ng.L−1 niet gedetecteerd. • Acyclovir, lamivudine: bij deze componenten is de terugvinding laag (respectievelijk 1 en 30%). Dit kan worden gelinkt aan de lage retentietijd (Tabel A.1), en bijgevolg de hoge hydrofiliciteit. Het kan dat beide componenten worden meegespoeld bij het wassen van de SPE-kolom. Voor oxytetracycline is de terugvinding ook vrij laag (60%). • Chlooramfenicol, fluoxetine, moxifloxacine, paroxetine, pleconaril, risperidon en sarafloxacine hebben een laag matrixeffect (sterke onderdrukking). • Temazepam: deze component vertoont een grote proceseffici¨entie (170%), die wordt ge¨ınduceerd door het versterkende effect van de matrix (190%). • Venlafaxine: de lage proceseffici¨entie wordt verkregen door zowel een lage terugvinding als een lage waarde voor de matrixeffecten (respectievelijk 33 en 48%). • Diclofenac, carbamazepine: hier zijn negatieve waarden terug te vinden voor zowel de proceseffici¨entie als de matrixeffecten. Dit is mogelijk indien de gespikete concentratie relatief laag is ten opzichte van de achtergrondconcentratie (Sectie 6.3.3.5), waardoor de onzekerheid op de berekende proceseffici¨entie toeneemt. Aangezien in de vorige Secties 6.3.2 tot 6.3.3.2 telkens kon worden besloten dat de perfomantie toeneemt met de concentratie, werd de post-spike hier misschien bij een te lage concentratie uitgevoerd. De onzekerheid bij dit concentratieniveau zet zich namelijk ook door in de matrixeffecten en de terugvinding. De validatie van het influent werd pas uitgevoerd nadat de resultaten voor het effluent al gekend waren. Om die reden werd besloten om voor het influent de post-spike uit te voeren bij het hoogste concentratieniveau (25 000 ng.L−1 , ? 5 000 ng.L−1 ). Voor het influent zijn er vier componenten die zich buiten de range van
50
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie 60-140% bevinden: • Lamivudine: zowel de terugvinding (70%) als de matrixeffecten (71%) zijn laag, resulterend in een proceseffici¨entie van 50%. • Acyclovir: de terugvinding is zeer laag (1%). • Amoxicilline: hoewel de matrixeffecten zeer hoog zijn (687%), weegt dit niet op tegen de zeer lage terugvinding (6%)resulterend in een proceseffici¨entie van 38%. • Temazepam: Het matrixeffect (352%) is de bepalend factor voor de hoge proceseffici¨entie (332%) 6.3.3.4
Globale proceseffici¨entie voor gehele concentratiebereik
Tot nu toe werd de proceseffici¨entie per concentratieniveau bepaald (Sectie 6.3.3.1). Wanneer de geoptimaliseerde en gevalideerde methode toegepast zal worden op een RWZI, is de concentratie in het water echter een onbekende (er wordt niet gespiket). Het is eenvoudiger om te werken met een proceseffici¨entie die geldig is over het gehele bestudeerde concentratiebereik. Hiertoe worden stapsgewijs de volgende handelingen uitgevoerd in het statistische programma R: 1. Schatten van de parameters van de kwadratische regressievergelijking voor externe kalibratie van standaarden geanalyseerd op dezelfde dag. 2. Voor concentraties lager dan het kalibratiebereik wordt een assumptie gemaakt: bij lage concentraties is het verband tussen piekoppervlak en concentratie lineair. Er wordt een lineaire regressie toegepast van het laagste punt van kwadratische regressievergelijking tot (0,0). 3. Voor concentraties hoger dan het kalibratiebereik wordt eveneens een assumptie gemaakt. Hier wordt een lineaire regressie toegepast van het hoogste punt van de kwadratische regressievergelijking door (0,0). 4. Met behulp van deze samengestelde regressievergelijking worden de genormaliseerde piekoppervlakken van de componenten omgezet tot concentraties (µg.L−1 ). 5. Als de berekende concentraties (y) worden uitgezet ten opzichte van de theoretische concentraties (x, toegediend via spike), wordt in theorie een rechte bekomen (Figuur 6.14 en Vergelijkingen 6.16). De richtingsco¨effici¨ent van deze rechte is de proceseffici¨entie, deze wordt constant verondersteld over het hele kalibratiebereik. Het snijpunt van deze rechte met de y-as is y0 , de concentratie die na SPE aanwezig was, gecorrigeerd voor de opconcentratiefactor, maar niet voor de proceseffici¨entie. x0 is de effectieve concentratie die in het niet-gespikete staal aanwezig was.
y − y0 x y = P E.x + y0
(6.17)
y = P E.(x + x0 )
(6.18)
y0 = P E.x0
(6.19)
P E(%) =
(6.16)
6. De proceseffici¨entie kan eenvoudig worden opgevraagd als de richtingsco¨effici¨ent van de lineaire. 7. Het is ook nuttig om de onzekerheid op de proceseffici¨entie te kennen. De standaardafwijking kan worden opgevraagd met behulp van een eenvoudig commando in R. Vergelijking 6.20 geeft de berekeningswijze van deze standaardafwijking weer. Hierbij staat n voor het aantal datapunten per 51
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie component (n = 4x3), p voor het aantal parameters (p = 2) en i voor het ie datapunt. Merk de gelijkenis op met Vergelijking 6.5. De variatieco¨effici¨ent kan daaropvolgend worden berekend door de standaardafwijking te delen door de waarde van de proceseffici¨entie.
σP E
v u u =t
n
1 X ((wi .ei )2 ) n−p
(6.20)
y = concentratie in het staal
i=1
PE y
y0
x
x0
x0 + x
x = theoretische concentratie
Figuur 6.14: Het lineaire verband tussen de theoretische en berekende concentratie, op basis van een gewogen kwadratische regressie. De donkere curve stelt Vergelijking 6.17 voor, de lichtere curve Vergelijking 6.18.
Tabel 6.6 geeft de bekomen proceseffici¨enties weer, alsook de onzekerheid op die waarde, weergegeven als standaardafwijking en variatieco¨effici¨ent. Voor het effluent vallen 38 componenten binnen het bereik van 60-140%, voor het influent bedraagt dit aantal 35. Voor het merendeel van de componenten die buiten deze range vallen (bijvoorbeeld acyclovir, amoxicilline, pleconaril en temazepam), werd reeds een verklaring gezocht voor hun minder goede performanties. Wanneer we de onzekerheid op deze waarden bekijken, weergegeven als variatieco¨effici¨ent, dan zijn deze kleiner dan 20% voor 38 componenten in effluent en voor 39 componenten in influent. Ook hier vallen acyclovir, amoxicilline en pleconaril uit de boot. Dit geldt echter ook voor enkele andere componenten, zoals diclofenac, carbamazepine, paracetamol en venlafaxine. Voor deze componenten veroorzaakt de relatief hoge achtergrondconcentratie ten opzichte van de gespikete concentratie een grotere onzekerheid op de berekende proceseffici¨entie. Volgens Vergelijking 6.20 zijn de onzekerheden op de verschillende concentraties additief, zoals ook blijkt uit Sectie 6.3.3.5 6.3.3.5
Achtergrondconcentratie
In Secties 6.3.3.2 en 6.3.3.3 werden de meeste extreme proceseffici¨enties uit de Tabellen B.7 en B.8 reeds verklaard. Voor enkele extreme waarden, waaronder de negatieve proceseffici¨enties, en de bijhorende grote
52
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
Tabel 6.6: Gemiddelde proceseffici¨entie (%) over het bestudeerde kalibratiebereik en de onzekerheid deze waarde (als standaardafwijking (%) en als variatieco¨effici¨ent (%)), voor effluent en influent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxine Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
Effluent PE±σP E VCP E 0,4±0 36 84±2 2 88±1 1 83±4 5 8±1 10 85±5 6 107±30 28 42±1 3 90±7 8 93±3 3 62±19 31 72±2 3 89±5 6 103±3 3 63±4 6 92±5 5 98±3 3 73±2 3 58±5 9 26±1 6 91±5 5 94±3 3 76±10 14 78±6 7 90±4 4 97±3 3 90±11 13 87±2 2 97±9 9 87±2 3 65±4 7 10±11 107 84±3 3 72±5 7 85±6 7 78±2 2 75±4 6 77±4 5 162±5 3 111±4 3 95±2 3 92±32 35 87±2 2
Influent PE±σP E VCP E 1±1 83 87±4 4 101±6 5 95±4 4 9±117 1303 101±4 4 101±7 7 63±2 3 92±4 4 99±4 4 90±8 8 86±5 5 99±4 4 115±7 7 74±5 6 102±5 5 90±50 56 91±5 5 62±1 2 55±5 8 104±5 5 88±6 6 89±9 10 115±8 7 84±16 19 101±5 5 105±5 5 78±6 7 90±11 13 72±109 151 78±5 6 70±11 15 82±5 6 105±6 6 93±4 5 94±4 4 85±6 7 85±4 5 368±18 5 124±14 11 104±5 5 93±14 15 87±3 4
Label D A A A D A A C A A B A A A A A B A C C A A A A A A A A A B A C A A A A A A C A A B A
53
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie onzekerheid kon nog niet eenduidig een verklaring worden geformuleerd. Op basis van Vergelijking 6.8 wordt een lage proceseffici¨entie bekomen als de concentratie in het staal zonder spike (B) groter is dan in het staal met een pre-spike (C). Dit kan voorkomen als de toegediende spike veel lager is dan de achtergrondconcentratie in het staal. Als hierbij een meetfout of een matrixeffecten optreedt, kan het zijn dat de concentratie in het staal zonder spike hoger is dan in het staal met pre-spike, en dus resulteert in een negatieve proceseffici¨entie. Om dit na te gaan wordt de concentratie van alle componenten berekend in het niet-gespikete staal. Door de regressie en de daaropvolgende stappen in Sectie 6.3.3.4, kunnen de genormaliseerde piekoppervlakken van de componenten in het niet-gespikete staal worden omgezet tot een concentratie. Deze concentratie wordt vervolgens gecorrigeerd voor de globale proceseffici¨entie en de opconcentratiefactor om de initi¨ele concentratie te bepalen. Aangezien niet werd bijgespiket in deze stalen, geldt deze concentratie als de achtergrondconcentratie in het staal. Enkel de componenten met een S/N-waarde groter dan 10 worden weerhouden. De resultaten hiervan worden weergegeven in Bijlage B.13. Volgens deze resultaten zijn paracetamol en ibuprofen sterk aanwezig in het influent, net als carbamazepine, venlafaxine en diclofenac in het effluent.
6.3.4
Sensitiviteit
De beslissingsgrens CCα en het detectievermogen CCβ worden berekend op basis van de genormaliseerde piekoppervlakken. De berekeningen gebeuren op dezelfde manier als in Sectie 6.1.3 (Vergelijkingen 6.2 en 6.3), alleen worden de bekomen concentraties nog gecorrigeerd voor de proceseffici¨entie en de opconcentratiefactor van de SPE (100x voor effluent, 50x voor influent). De resultaten van deze berekeningen kunnen worden teruggevonden in Tabel B.13. In het effluent kunnen 39 componenten gedetecteerd (CCα ) worden bij een concentratie lager dan 1µg.L−1 , voor 18 componenten daarvan kan dit zelfs bij een concentratie lager dan 100 ng.L−1 . In het influent kunnen 36 componenten gedetecteerd worden bij een concentratie lager dan 1µg.L−1 en 9 componenten bij 100 ng.L−1 . De CCα is minstens de concentratie in het niet-gespikete staal, vermeerderd met de concentratie van de laagste spike. Vooral voor stoffen met een relatief hoge achtergrondconcentratie, zoals voor paracetamol en carbamazepine, is de CCα een overschatting. Om in de verdere berekeningen en resultaten toch uitspraken te kunnen doen over kwalitatieve en kwantitatieve detectie, is het ook mogelijk gebruik te maken van signaal/ruis. Pieken met een S/N-verhouding van 3 kunnen niet worden gedetecteerd, pieken met een verhouding tussen 3 en 10 kunnen niet worden gekwantificeerd (zie Sectie 3.6). In Tabel B.13 zijn ook de S/N-waarden weergegeven ter illustratie. Voor bijvoorbeeld carbamazepine in het effluent, is het duidelijk dat deze component sterk aanwezig was in het effluent van de RWZI te Lede. Bijgevolg is de laagste concentratie die voor deze component gedetecteerd kan worden ongeveer 3 µg.L−1 . De overeenkomstige S/N-verhouding is echter 1500, wat aangeeft dat van deze component nauwkeuriger gemeten kan worden in andere stalen met een lagere achtergrondconcentratie. Aangezien het de bedoeling is dat deze gevalideerde methode toegepast kan worden op stalen van andere RWZI’s, die eventueel lagere concentraties aan deze componenten kunnen bevatten, wordt besloten om de benaderende methode op basis van de S/N-verhouding toe te passen.
54
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
6.3.5
Algemene beoordeling van de multi-residumethode: performantielabel voor elke component
Op basis van de waarden voor de proceseffici¨entie over het hele concentratiebereik en de onzekerheid op die waarden, kunnen de componenten worden opgedeeld in vier ‘performantielabels’. De groepsverdeling kan teruggevonden worden in Tabel 6.6, alsook in Figuur 6.15. A Voor deze componenten ligt de proceseffici¨entie tussen 60 en 140% (32 componenten). B Voor deze componenten ligt de proceseffici¨entie ook steeds tussen 60 en 140%, maar de standaardafwijking op deze waarde bedraagt meer dan 20% (4 componenten). C Voor deze componenten liggen de proceseffici¨enties tussen 10-60% of zijn ze hoger dan 140% (5 componenten). D Voor deze componenten is de proceseffici¨entie kleiner dan 10% (2 componenten: acyclovir en amoxicilline).
60% ≤ PE ≤ 140%
10 ≤ PE < 60%
PE < 10%
140% ≤ PE VC ≤ 20% A Alprazolam Amandatine Amitriptline Besifloxacine Carbamazepine Ciprofloxacine Diazepam Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Indomethacine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine
Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paroxetine Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Tetracycline Trimethoprim Zidovudine
VC > 20% B
C
D
Diclofenac Ibuprofen Paracetamol Venlafaxine
Chlooramfenicol Irgasan Lamivudine Pleconaril Temazepam
Acyclovir Amoxicilline
Figuur 6.15: Verdeling van de performantielabels
6.4
6.4.1
Toepassing van de methode: analyse van het influent en effluent van de RWZI te Schilde Basisparameters
De automatische staalname vindt plaats zoals in de methodologie beschreven wordt (Sectie 5.2.2). Naast de waterstalen zelf, stelde Aquafin NV ook data ter beschikking van fysisch-chemische parameters van het
55
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie influent en effluent gedurende de staalnames, alsook de jaargemiddelde bedrijfsparameters (Tabel 6.7). De debieten werden niet voor elke stroom afzonderlijk berekend. Enkel het debiet van het totale effluent (QE ) en het debiet van het MBR-effluent (QM BR ) werden rechtstreeks gemeten. Op basis hiervan werden het totale influentdebiet (QI ) en het debiet van het CAS-effluent (QCAS ) berekend (Vergelijking 6.21).
QE = QI = QCAS + QM BR
(6.21)
Tabel 6.7: Fysisch-chemische parameters van de RWZI te Schilde op de staalnamedagen en de jaargemiddelde waarden voor 2012. Stalen Influent totaal 1 Influent totaal 2 Influent totaal 3 Influent totaal 4 Influent gemiddeld Effluent totaal 2 Effluent totaal 3 Effluent totaal 4 Effluent totaal 5 Effluent MBR 2 Effluent MBR 3 Effluent MBR 4 Effluent MBR 5 Effluent CAS 2 Effluent CAS 3 Effluent CAS 4 Effluent CAS 5 Effluent gemiddeld
CZV (mg O2 .L−1 ) 189 188 179 189 154 31 24 20 27 28 19 21 22 38 40 35 34 26
N totaal (mg N.L−1 ) 33 29 29,1 31 25,4 15,4 14,8 14,6 15,6 4,4 4,4 6,9 7,4 22,1 20,1 22,1 21,6 10,7
pH 7,4 7,3 7,4 7,4 7,5 7,7 7,6 7,7 7,5 7,6 7,5 7,7 7,6 7,6 6,7 7,6
P totaal (mg.L−1 ) 3,7 3,7 3,6 4,1 3,3 0,4 0,2 0,4 0,4 0,7 0,2 0,8 0,7 0,2 < 0,2 0,2 < 0,2 0,5
ZS (mg.L−1 ) 85 83 77 193 92 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 <4 9 5 6 7
Debiet (m3 .dag−1 ) 14 084 13 808 12 088 12 120 15 340 13 808 12 088 12 120 11 776 7 221 7 220 7 153 7 221 6 587 4 868 4 967 4 555 15 340
Op basis van deze gegevens kan worden gesteld dat de chemische zuurstofvraag (CZV) in het influent een stuk hoger is dan de jaargemiddelde waarden voor 2012. Ook de concentratie aan stikstof is voor zowel influent als voor effluent hoger dan gemiddeld. De overige waarden volgen de trend van de jaargemiddelde waarden. De stalen werden genomen eind maart 2013, in een droge vorstperiode. Dit kan het iets lagere debiet en de hogere vuilvracht verklaren. In deze periode werd ook veelvuldig zout gestrooid tegen ijsplekken. Door het gebruik van zout en de lage temperaturen zou de zuivering niet optimaal verlopen (Rudy Embrechts, Operator RWZI Schilde, persoonlijke communicatie). Voor de basisparameters werd de verwijderingseffici¨entie bepaald op basis van Vergelijking 6.22, waarbij c staat voor de gemiddelde concentratie voor de verschillende soorten stalen (influent totaal, effluent totaal, effluent MBR en effluent CAS), I voor influent en E voor effluent. In Tabel 6.8 komt niet meteen naar voren dat de verwijdering gedurende de staalname slechter is dan gewoonlijk. Voor de chemische zuurstofvraag, stikstof (Kjeldahl-N, nitriet en nitraat), fosfor en zwevende stoffen ligt de gemiddelde verwijderingseffici¨entie over de vier staalnamedagen in de lijn van de jaargemiddelde verwijdering. De stikstofverwijdering in MBR scoort volgens deze resultaten wel een stuk beter dan in CAS (dit werd ook aangegeven door Rudy Embrechts, Operator RWZI Schilde, persoonlijke communicatie). Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de MBR zich te Schilde in een afgesloten ruimte bevindt, waar de temperatuur eventueel iets hoger is. Wanneer de temperatuur te laag wordt, kan de stikstofverwijdering namelijk stilvallen.
V E(%) =
56
cI − cE cI
(6.22)
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Tabel 6.8: Gemiddelde verwijderingseffici¨entie (%) van de basisparameters in de waterzuivering van Schilde voor de vier staalnamedagen (Totaal, MBR, CAS) en jaargemiddelde (Totaal gemiddeld) (CZV = chemische zuurstofvraag, ZS = zwevende stoffen). Totaal MBR CAS Totaal gemiddeld
6.4.2
CZV 86 88 80 83
N 51 81 30 58
P 91 84 95 87
ZS 96 96 95 93
Proefopzet
De berekeningen die worden uitgevoerd op de analyseresultaten van de geneesmiddelenresidu’s in de RWZIstalen, worden hieronder stapsgewijs weergegeven: 1. Schatten van de parameters van de kwadratische regressievergelijking op basis van externe kalibratie, uitgevoerd op dezelfde dag als de analyse van de RWZI-stalen. 2. Met behulp van deze regressievergelijking worden de genormaliseerde piekoppervlakken van de componenten in de waterstalen omgezet tot concentraties (µg.L−1 ). 3. De bekomen concentraties worden gecorrigeerd met de proceseffici¨entie die tijdens de validatie bepaald werd, en de concentratiefactor van de SPE. (a) Voor concentraties lager dan het kalibratiebereik wordt een assumptie gemaakt: bij lage concentraties is het verband tussen piekoppervlak en concentratie lineair. Er wordt een lineaire regressie toegepast van het laagste punt van kwadratische regressievergelijking tot (0,0). Dit betreft een extrapolatie, waardoor de foutenmarge toeneemt. (b) Voor concentraties hoger dan het kalibratiebereik wordt eveneens een assumptie gemaakt. Hier wordt een lineaire regressie toegepast van het hoogste punt van de kwadratische regressievergelijking door (0,0). Er is slechts e´ e´ n component waarvan de meetwaarden in het waterstaal hoger zijn dan het kalibratiebereik, namelijk paracetamol, en dit enkel in het influent. De concentraties die buiten het kalibratiebereik vallen worden vetgedrukt weergegeven. De waarde wordt behouden, maar er dient rekening mee gehouden te worden dat het gaat om een extrapolatie. 4.
(a) De benaderende methode van de S/N-verhouding wordt toegepast (Sectie 6.3.4). De concentraties overeenkomstig met pieken met een S/N lager dan 3 worden aangeduid als niet-detecteerbaar. (b) De concentraties overeenkomstig met pieken met een S/N-verhouding tussen 3 en 10 worden aangeduid als detecteerbaar, maar niet kwantificeerbaar.
6.4.3
6.4.3.1
Concentratie, belading en verwijderingseffici¨entie van geneesmiddelenresidu’s in het RWZI te Schilde Concentratie
De berekende concentraties worden weergegeven in Tabel B.14. Tabel 6.9 geeft daarnaast een samenvatting weer van de gemiddelde concentratie van elke stroom over de vier staalnamedagen, de varabiliteit over de vier dagen, het aantal detecties en het aantal kwantificaties. De berekende concentraties bevinden zich tussen 1-105 ng.L−1 voor het inkomende afvalwater. Voor het uitgaande, gezuiverde water is dit bereik gedaald tot 1-650 ng.L−1 . Deze waarden komen in dezelfde grootteorde voor als de concentraties in het RWZI-staal
57
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie van Lede (Bijlage B.13). Zes componenten kunnen in elk van de 16 stalen gekwantificeerd worden. Dit zijn amandatine, amitriptyline, carbamazepine, diclofenac, sulfamethoxazol en venlafaxine. Concentraties hoger dan 1 µg.L−1 zijn terug te vinden voor paracetamol, naproxen en ibuprofen in het influent. Deze drie componenten zijn ontstekingsremmers die eveneens als pijnstillend middel worden gebruikt. Ze zijn het actieve bestanddeel van bijvoorbeeld Dafalgan, Aleve en Nurofen. Ook Gardner et al. (2013) rapporteerden een dergelijke hoge concentratie in het influent van een RWZI voor ibuprofen (18 µg.L−1 ), maar ook voor diclofenac (1,7 µg.L−1 ) en voor antibiotica (0,18-3,6 µg.L−1 ). Andere componenten die abundant voorkomen zijn de humane antimicrobi¨ele middelen ciprofloxacine, moxifloxacine, sulfamethoxazol en trimethoprim, maar ook amantadine (een geneesmiddel tegen Parkinson), carbamazepine (een anti-epilepticum), diclofenac (een ontstekingsremmer) en venlafaxine (een antidepressivum). 6.4.3.2
Belading
De bekomen concentraties worden vermenigvuldigd met de overeenkomstige debieten van de vier staalnamedagen in de RWZI. Hierdoor worden dagbeladingen bekomen (mg.dag−1 ), weergegeven in Tabel B.15. Het dagelijkse debiet van de RWZI in Schilde bedraagt tussen de 10 000 en 15 000 m3 .dag−1 . Het product van dit debiet met de concentraties berekend in de vorige stap, bedraagt 102 tot 106 mg.dag−1 voor het inkomende afvalwater. Voor het gezuiverde water is deze belading gedaald tot 10-104 mg.dag−1 . Tabel B.16 geeft een samenvatting weer van de gemiddelde belading en de variabiliteit van de belading over de vier staalnamedagen. Daarnaast wordt ook weergegeven hoeveel detecties en kwantificaties beschikbaar zijn per component en per soort staal. Om deze cijfers te duiden wordt een voorbeeld verder uitgewerkt. Er komt bijvoorbeeld dagelijks 70 g ibuprofen terecht in de RWZI te Schilde. Voor bijvoorbeeld Nurofen, dat 200 mg ibuprofen als actieve component bevat per tablet, zou dit neerkomen op 350 tabletten per dag. Rekening houdend met het inwonersequivalent van RWZI Schilde, dat 28 000 bedraagt, komt dit overeen met 1 pil per 80 personen per dag. De RWZI ontvangt enkel afvalwater van huishoudens, de hoeveelheid farmaceutische componenten kan dus niet worden toegewezen aan een ziekenhuis (Marleen Peereman, Projectleider Analyses Aquafin, persoonlijke communicatie). Volgens Khan en Ongerth (2004) verlaat 10% van de ingenomen ibuprofen het lichaam onveranderd. Dit zou betekenen dat de hoeveelheid ibuprofen die in Schilde terechtkomt, slecht 10% is van de hoeveelheid ibuprofen die werkelijk wordt geconsumeerd. 6.4.3.3
Massabalans van de effluenten
Nu de beladingen gekend zijn, kan een massabalans worden opgesteld voor het effluent. De belading van het totale effluent wordt berekend, maar ook de effluenten van MBR en CAS worden afzonderlijk berekend. Het is nuttig om na te gaan hoe groot de afwijking is tussen de som van de effluenten van de afzonderlijke zuiveringen en het gemeten totaal. Voor elk effluent wordt een gemiddelde belading berekend over de vier dagen heen. Voor de componenten die bij elk van de drie effluenten een belading kan voorleggen, kan de massabalans worden uitgevoerd met behulp van Vergelijking 6.23. Hierbij staat mx voor de gemiddelde belading van het overeenkomstige effluent (totaal, CAS en MBR) over de vier staalnamedagen. ∆ staat voor de relatieve afwijking tussen het gemeten totale effluent en de som van de afzonderlijke effluenten. De resultaten van de massabalans kunnen worden teruggevonden in Tabel 6.10. Hierin wordt de gemiddelde belading (over 4 dagen) van het totale effluent weergegeven, met de relatieve afwijking in VC (%). Daarnaast wordt ook het aantal kwantificaties (n) weergegeven voor respectievelijk het totale effluent, het effluent van CAS en het effluent van MBR.
58
Label
D A A A D A A C A A B A A A A A B A C C A A A A A A A A A B A C A A A A A A C A A B A
Component
Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacine Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxine Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine 16 13 17
9
11 64
12
33 6
457 2 224 411
5678
142 1802
87133
15 226 1 109 149 310 10
17 18
IN VC
42 9 268
Gemiddelde
D 3 1 4 4 1 0 4 2 4 0 4 0 0 1 0 0 4 0 0 3 3 3 4 0 4 0 0 4 0 4 0 0 1 0 0 0 2 4 1 1 4 4 1
K 0 0 4 4 1 0 4 1 4 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 2 4 1 1 1 4 0 31
11 11
108 4 42 310
1
48
36 13 68 9 495 2
21
9
13
7
20 10 21
TOT VC
143
607
92
429
3 53 10
Gemiddelde
D 0 4 4 4 0 1 4 1 4 0 4 0 0 0 1 0 4 0 0 1 2 4 4 1 3 1 0 0 0 3 0 2 3 1 0 0 0 4 2 1 4 4 0
K 0 3 4 4 0 0 4 0 4 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 1 3 1 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 1 0 4 4 0 42 317
116 3
2
94
108
78 15
544 9
110
437
2 52 7
Gemiddelde
17 10
13 26
49
52
14
16
9
8 30
CAS VC D 0 2 4 4 0 0 4 0 4 1 4 1 0 0 1 0 3 1 0 1 4 4 4 0 3 1 0 1 0 3 0 1 4 0 0 1 0 4 3 0 4 4 0
K 0 1 4 4 0 0 4 0 3 0 4 1 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 1 0 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 3 0 4 4 0 46 305
104 2
111
73 9 288
192
66
528
93
449
2 54 10
Gemiddelde
3 8
18
17
62
41
14
12
8
33 11 27
MBR VC D 0 3 4 4 0 0 4 0 4 0 4 0 0 0 1 0 2 0 1 1 4 4 4 1 3 3 0 0 0 2 1 1 2 0 0 0 0 4 3 0 4 4
K 0 2 4 4 0 0 4 0 3 0 4 0 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 3 1 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 1 0 3 4
Tabel 6.9: Samenvatting van de resultaten voor de RWZI-stalen uit Schilde, met weergave van de gemiddelde concentratie (ng.L−1 ), de variabiliteit hierop (%, met n = aantal kwantificaties), het aantal detecties (D) en het aantal kwantificaties (K) per component en per soort staal.
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
59
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie
∆(%) =
(mM BR + mCAS ) − mT otaal mT otaal
(6.23)
Tabel 6.10: Massabalans voor de effluenten van de RWZI-stalen uit Schilde met de gemiddelde totale belading (mg.dag−1 ), de afwijking hierop (∆) en het aantal kwantificaties (n) voor elk effluenttype (Totaal/CAS/MBR). Een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak dat werd gebruikt voor deze berekening buiten het kalibratiegebied ligt. Component
Performantielabel
Alprazolam Amandatine Amitriptyline Carbamazepine Ciprofloxacin Diclofenac Ibuprofen Moxifloxacin Naproxen Sulfamethoxazole Temazepam Trimethoprim Venlafaxine
A A A C A C B A A A C A B
mT otaal mg.dag−1 22 671 131 5568 1180 6616 790 949 3442 1282 27 583 3816
∆ % -36 3 19 3 -8 -8 -56 -16 11 -8 -88 10 -3
n 2/3/1 4/4/4 4/4/4 4/4/4 3/4/3 4/4/4 2/2/2 3/3/1 2/3/3 4/4/4 1/1/3 3/4/4 4/4/4
Voor 10 van de 13 componenten in de massabalans is het relatieve verschil tussen het gemeten en berekende totale effluent kleiner dan 20%. Een negatieve afwijking geeft aan dat de som van de beladingen in de afzonderlijke effluenten groter is dan gemeten belading in het totale effluent. Voor alprazolam, ibuprofen en temazepam is het verschil groter dan 20%. Hiervoor zijn een aantal mogelijke verklaringen. Enerzijds is de berekening voor deze drie componenten gebaseerd op het minste aantal datapunten (n ≤ 6). Een tweede mogelijke verklaring voor ibuprofen en temazepam is dat gerekend werd met waarden die buiten het kalibratiegebied vallen. Voor alprazolam en temazepam kan de lage belading een derde verklaring zijn. Deze drie redenen duiden namelijk telkens op de grotere onzekerheid die in rekening gebracht moet worden. 6.4.3.4
Verwijderingseffici¨enties
Voor componenten met drie of vier kwantificeerbare metingen voor het influent, wordt de verwijderingseffici¨entie (VE, %) van de RWZI bepaald. De verwijdering wordt berekend aan de hand van de gemiddelde beladingsgegevens over de vier staalnamedagen heen. Vergelijking 6.24 wordt hiervoor toegepast, zowel voor het totale effluent als voor CAS en MBR afzonderlijk. Slechts 11 componenten voldoen aan de voorwaarde van drie of vier influentmetingen. 10 daarvan hebben ook telkens minstens e´ e´ n kwantificeerbare meting voor elk effluent. Enkel voor paracetamol zijn er geen waarden voor de effluentbelading, maar de component werd wel gedetecteerd. De detecties worden vervangen door de CCβ . Dit is een overschatting, waardoor de berekende effici¨entie een onderschatting zal zijn. De resultaten worden weergegeven in Tabel 6.11.
V E(%) =
60
mI − mE mI
(6.24)
HOOFDSTUK 6. Resultaten en discussie Tabel 6.11: Gemiddelde verwijderingseffici¨enties van de RWZI-stalen uit Schilde. De vetgedrukte waarden geven aan dat het resultaat buiten het kalibratiegebied valt, maar wel kwantificeerbaar is (S/N > 10). N geeft weer hoeveel waarden voor de belading in het effluent werden meegenomen bij de berekening. Een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak dat werd gebruikt voor deze berekening buiten het kalibratiegebied ligt. Component
Label
Amandatine Amitriptyline Carbamazepine Ciprofloxacine Diclofenac Ibuprofen Moxifloxacine Naproxen Paracetamol Sulfamethoxazol Venlafaxine
A A A A B B A A B A B
TOT % n -22 4 -13 4 7 4 60 3 -23 4 99 2 50 3 86 2 > 99,9 n.v.t.1 56 4 6 4
CAS % n -18 4 -10 4 13 4 62 4 -38 4 98 2 61 3 77 3 > 99,9 n.v.t. 57 4 6 4
MBR % n -21 4 23 4 8 4 52 3 -28 4 99 2 28 1 95 3 > 99,9 n.v.t. 50 4 1 4
Globaal kunnen de componenten op basis van hun verwijderingseffici¨entie worden verdeeld in drie groepen. Een eerste groep bestaat uit de componenten ibuprofen, naproxen en paracetamol, met een verwijderingseffici¨entie van 75% of meer. Deze componenten kwamen ook het meest abundant voor in het influent van de RWZI. De componenten met een verwijderingseffici¨entie tussen 0-75% vormen een tweede groep. Deze componenten hebben een lagere concentratie in het RWZI-influent. Jia et al. (2012) rapporteerden een verwijderingseffici¨entie van ongeveer 60% voor ciprofloxacine en van 40% voor moxifloxacine in een RWZI in Peking. Een derde groep omvat de componenten met een negatieve verwijderingseffici¨entie, meer bepaald diclofenac, amitriptyline en amandatine. Er zijn verschillende verklaringen voor een negatieve verwijdering, zoals aan gegeven in Sectie 1.4.2. Voor diclofenac werd deconjugatie reeds gerapporteerd door Zorita et al. (2009), voor amandatine konden geen verwijderingsgegevens teruggevonden worden in de literatuur. Voor amitriptyline zijn de waarden vetgedrukt, wat aangeeft dat de gemeten concentraties zich buiten het kalibratiegebied bevinden. Daarom moet voor deze component voorzichtig worden omgesprongen bij het trekken van een conclusie. Zowel Verlicchi et al. (2012a) als Ratola et al. (2012) geven voor amitriptyline een vrij hoge verwijderingseffici¨entie aan (> 80%). Voor componenten die binnen het kalibratiebereik liggen, is er weinig verschil te merken tussen de verwijdering in MBR of in CAS. Ternes et al. (2004) kwamen tot dezelfde conclusie, terwijl volgens Verlicchi et al. (2012b) de waterzuivering beter doorgaat in een MBR.
1
n.v.t. = niet van toepassing
61
Hoofdstuk 7
Conclusie
In deze masterproef wordt een methode voor het meten van 43 geneesmiddelenresidu’s in influent en effluent van een afvalwaterzuiveringsinstallatie (RWZI) ontwikkeld en volledig gevalideerd. Deze methode is gebaseerd op vaste-fase extractie (SPE), gecombineerd met hoge-performantie vloeistofchromatografie (HPLC) en hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS). De instrumentele validatie toont aan dat voor 14 van de 43 componenten een kwadratische regressievergelijking significant beter is dan een lineaire regressievergelijking over een concentratiebereik van 20-2000 µg.L−1 . Voor alle 43 componenten komt de laagst detecteerbare concentratie (beslissingsgrens) overeen met de laagste geteste concentratie (20 µg.L−1 ). Zeven belangrijke parameters voor de vaste-fase extractie werden geidentificeerd en geoptimaliseerd met als doel een optimale proceseffici¨entie (tussen 60-140%) en een goede herhaalbaarheid (lage variatieco¨effici¨ent) te bekomen. Het toevoegen van EDTA, de elutieconditie en het staalvolume blijken parameters met een groot effect op de gemiddelde proceseffici¨entie. Daarnaast blijken vooral de wasconditie en het soort proefbuis de herhaalbaarheid te be¨ınvloeden. Voor de methodevalidatie werden de reproduceerbaarheid, de proceseffici¨entie en de sensitiviteit in kaart gebracht voor zowel RWZI-influent als effluent water voor een concentratiebereik van 20 ng.L−1 tot 12,5 µg.L−1 . Voor 34 van de 43 componenten wordt over het volledige concentratiebereik variatieco¨effici¨enten kleiner dan 20% bekomen onder reproduceerbaarheidscondities. Relevante detectielimieten (CCα ) in de grootte-orde van ng.L−1 tot µg.L−1 voor zowel RWZI-influent als effluent water worden bekomen voor de 43 componenten. De geoptimaliseerde en gevalideerde methode werd toegepast op influent en effluent van de RWZI in Schilde. Deze RWZI past twee processen toe, namelijk CAS en MBR. Een totaal van 26 componenten werden gekwantificeerd, waarvan er zes componenten in alle stalen voorkwamen. De concentratierange bedraagt 1-105 ng.L−1 voor het influent en 1-650 ng.L−1 voor het effluent. Op basis van de berekende verwijderingseffici¨enties kunnen de componten opgedeeld worden in drie groepen: componenten met een goede verwijdering (> 75%), componenten die een lage verwijdering vertonen (0-70%) en componenten met een negatieve verwijdering. De verwijdering is effici¨ent voor de componenten die sterk aanwezig zijn in het influent, namelijk paracetamol, ibuprofen en naproxen. Componenten met een lage verwijdering hebben typisch een lage influentconcentratie en blijken uit de literatuur persistent te zijn. De resultaten van de verwijdering vertonen weinig verschil voor beide waterzuiveringstechnieken (CAS en MBR).
62
Hoofdstuk 8
Suggesties voor verder onderzoek
Het onderzoek naar micropolluenten en meer specifiek naar farmaceutische stoffen in afval-, oppervlakte- en drinkwater is relatief nieuw. Er bestaan nog heel veel onzekerheden over het voorkomen en de effecten van farmaceutische residu’s in het milieu, en elke wetenschappelijke vondst roept nieuwe (onderzoeks)vragen op. Hierbij worden enkele suggesties gegeven voor toekomstig onderzoek. Wat betreft de methodeontwikkeling en -validatie is de grootste uitdaging het omgaan met de hoge achtergrondconcentraties die typisch aanwezig zijn in afvalwater. Vooral het nauwkeurig inschatten van de proceseffici¨entie, de beslissingsgrens en het detectievermogen zijn in dit geval uitdagend. Voor deze masterproef wordt gebruik gemaakt van een selectieve en gevoelige MID-methode. Het uitbreiden van deze methode naar een full-scan analyse kan toelaten nog meer farmaceutische residu’s simultaan te meten. Het meten van geneesmiddelen in meerdere RWZI’s bij verschillende procescondities is nodig, zodat een meer algemeen beeld wordt verkregen van de aanwezigheid, concentratie en verwijderingseffici¨entie van de verschillende componenten in afvalwater. De methode kan worden toegepast op de verschillende deelprocessen van een RWZI (primaire, secundaire en tertiaire waterzuivering). Dit is nuttig om na te gaan waar de grootste verwijdering van farmaceutische residu’s plaatsvindt en waar die eventueel geoptimaliseerd kan worden. Er gaat recent veel aandacht uit naar de ecotoxische effecten van farmaceutische componenten in het milieu. Omwille van de lage milieuconcentraties van deze micropolluenten, hun gezamenlijk voorkomen en hun grote verscheidenheid aan componenten, is er nood aan meer kennis op gebied van antibioticaresistentie en toxiciteit (mengseltoxiciteit, chronische effecten) van deze stoffen.
63
Deel III
Bibliografie
64
Bibliografie Abuin, S., Codony, R., Compano, R., Granados, M., en Prat, M. (2006). Analysis of macrolide antibiotics in river water by solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1114(1), 73–81. Al-Odaini, N. A., Zakaria, M. P., Yaziz, M. I., en Surif, S. (2010). Multi-residue analytical method for human pharmaceuticals and synthetic hormones in river water and sewage effluents by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1217(44), 6791–6806. Andreozzi, R., Marotta, R., en Paxeus, N. (2003). Pharmaceuticals in STP effluents and their solar photodegradation in aquatic environment. Chemosphere, 50(10), 1319–1330. Antignac, J., Le Bizec, B., Monteau, F., en Andre, F. (2003). Validation of analytical methods based on mass spectrometric detection according to the “2002/657/EC” European decision: guideline and application. Analytica Chimica Acta, 483(1-2), 325–334. Babi´c, S., Mutavdzi´c Pavlovi´c, D., Asperger, D., Perisa, M., Zrnci´c, M., Horvat, A. J. M., en Kastelan-Macan, M. (2010). Determination of multi-class pharmaceuticals in wastewater by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398(3), 1185–1194. Baker, D. R. en Kasprzyk-Hordern, B. (2011a). Critical evaluation of methodology commonly used in sample collection, storage and preparation for the analysis of pharmaceuticals and illicit drugs in surface water and wastewater by solid phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1218(44), 8036–8059. Baker, D. R. en Kasprzyk-Hordern, B. (2011b). Multi-residue analysis of drugs of abuse in wastewater and surface water by solid-phase extraction and liquid chromatography-positive electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1218(12), 1620–31. Barret, M., Patureau, D., Latrille, E., en Carrere, H. (2010). A three-compartment model for micropollutants sorption in sludge: Methodological approach and insights. Water research, 44(2), 616–624. Busetti, F., Linge, K. L., en Heitz, A. (2009). Analysis of pharmaceuticals in indirect potable reuse systems using solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216(31), 5807–5818. Celiz, M. D., Tso, J., en Aga, D. S. (2009). Pharmaceutical metabolites in the environment: analytical challenges and ecological risks. Environmental Toxicology and Chemistry, 28(12), 2473–2484. Cooper, E. R., Siewicki, T. C., en Phillips, K. (2008). Preliminary risk assessment database and risk ranking of pharmaceuticals in the environment. Science of the Total Environment, 398(1-3), 26–33. Coutu, S., Rossi, L., Barry, D. A., en Chevre, N. (2012). Methodology to account for uncertainties and tradeoffs in pharmaceutical environmental hazard assessment. Journal of Environmental Management, 98, 183–190. Cunningham, V. (2004). Pharmaceuticals in the environment. Sources, Fate, Effects and Risks, Springer, hoofdstuk Special Characteristics of Pharmaceuticals Related to Environmental Fate, pagina’s 13–24. Daughton, C. G. en Ternes, T. A. (1999). Pharmaceuticals and personal care products in the environment: Agents of subtle change? Environmental Health Perspectives, 107(6), 907–938. Debska, J., Kot-Wasik, A., en Namiesnik, J. (2004). Fate and analysis of pharmaceutical residues in the aquatic environment. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 34(1), 51–67. Demeestere, K. (2011). Cursusnota’s: Analyse van organische micropolluenten, Universiteit Gent, hoofdstuk 6: Detection, pagina’s 110–152. Doerr-MacEwen, N. A. en Haight, M. E. (2006). Expert stakeholders’ views on the management of human pharmaceuticals in the environment. Environmental Management, 38(5), 853–866. Duffus, J. H., Nordberg, M., en Templeton, D. M. (2007). Glossary of terms used in toxicology, 2nd edition - (IUPAC recommendations 2007). Pure and Applied Chemistry, 79(7), 1153–1344. ESAC (2010). What is the burden of antibiotic use in Europe? http://app.esac.ua.ac.be/public/index.php/engb/home, (geraadpleegd in november 2012). Europese Commissie (2000). Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 establishing a framework for Community action in the field of water policy. Official Journal of the European Communities, (2000/60/EC), 1–72. Europese Commissie (2002). Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities, (2002/657/EC), 1–29. Europese Commissie (2006). Directive 2006/118/EC of the European Parliament and of the Council of 12 December 2006 on the protection of groundwater against pollution and deterioration. Official Journal of the European Communities, (2006/118/EC), 19–31. Europese Commissie (2008). Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on environmental quality standards in the field of water policy, amending and subsequently repealing Council Directives 82/176/EEC, 83/513/EEC, 84/156/EEC, 84/491/EEC, 86/280/EEC and amending Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Communities, (2008/105/EC), 84–97.
65
Bibliografie Europese Commissie (2010). Guidance document on pesticide residue analytical methods. SANCO/825/00, 1–28. Europese Commissie (2012). Proposal for a Directive of the European Parliament and of the Council amending Directives 2000/60/EC and 2008/105/EC as regards priority substances in the field of water policy. (2011/0429/COD), 1–35. Fatta-Kassinos, D., Meric, S., en Nikolaou, A. (2011). Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 399(1), 251–275. Fent, K., Weston, A., en Caminada, D. (2006). Ecotoxicology of human pharmaceuticals. Aquatic Toxicology, 76(2), 122–159. Gabet, V., Miege, C., Bados, P., en Coquery, M. (2007). Analysis of estrogens in environmental matrices. TRAC - Trends in Analytical Chemistry, 26(11), 1113–1131. Gardner, M., Jones, V., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Coello-Garcia, T., Cartmell, E., Lester, J., en Ellor, B. (2013). Performance of UK wastewater treatment works with respect to trace contaminants. Science of the Total Environment, 456-457(12), 359–369. Gaskell, S. (1997). Electrospray: Principles and practice. Journal of Mass Spectrometry, 32(7), 677–688. G´omez, M. J., Petrovi´c, M., Fern´andez-Alba, A. R., en Barcel´o, D. (2006). Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solidphase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters. Journal of Chromatography. A, (2), 224–233. Gracia-Lor, E., Sancho, J. V., en Hern´andez, F. (2011). Multi-class determination of around 50 pharmaceuticals, including 26 antibiotics, in environmental and wastewater samples by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1218(16), 2264–2275. Gros, M., Petrovi´c, M., en Barcel´o, D. (2006). Development of a multi-residue analytical methodology based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for screening and trace level determination of pharmaceuticals in surface and wastewaters. Talanta, 70(4), 678–690. Gros, M., Petrovi´c, M., en Barcel´o, D. (2009). Tracing pharmaceutical residues of different therapeutic classes in environmental waters by using liquid chromatography/quadrupole-linear ion trap mass spectrometry and automated library searching. Analytical Chemistry, 81(3), 898–912. Gross, J. H. (2011a). Mass Spectrometry 2nd Ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, hoofdstuk Instrumentation, pagina’s 117–210. Gross, J. H. (2011b). Mass Spectrometry 2nd Ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, hoofdstuk 3: Isotopic Composition and Accurate Mass, pagina’s 67–113. Gruji´c, S., Vasiljevi´c, T., en Lausevi´c, M. (2009). Determination of multiple pharmaceutical classes in surface and ground waters by liquid chromatography-ion trap-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216(25), 4989–5000. Hao, C., Lissemore, L., Nguyen, B., Kleywegt, S., Yang, P., en Solomon, K. (2006). Determination of pharmaceuticals in environmental waters by liquid chromatography/electrospray ionization/tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 384(2), 505–513. Himmelsbach, M., Buchberger, W., en Reingruber, E. (2009). Determination of polymer additives by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. A comparison of atmospheric pressure photoionization (APPI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), and electrospray ionization (ESI). Polymer Degradation and Stability, 94(8), 1213–1219. Holˇcapek, M., Jir´asko, R., en L´ısa, M. (2012). Recent developments in liquid chromatography-mass spectrometry and related techniques. Journal of Chromatography A, 1259, 3–15. Ib´an˜ ez, M., Guerrero, C., Sancho, J. V., en Hern´andez, F. (2009). Screening of antibiotics in surface and wastewater samples by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216(12), 2529–2539. Jia, A., Wan, Y., Xiao, Y., en Hu, J. (2012). Occurrence and fate of quinolone and fluoroquinolone antibiotics in a municipal sewage treatment plant. Water Research, 46(2), 387–394. Kaufmann, A. (2009). Validation of multiresidue methods for veterinary drug residues; related problems and possible solutions. Analytica Chimica Acta, 637(1-2), 144–155. Kazakevich, Y. en LoBrutto, R. (2007). HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley & Sons, Inc., hoofdstuk LC/MS: Theory, Instrumentation and Applications to Small Molecules, pagina’s 282–299. Kebarle, P. (2000). A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry, 35, 804–817. Khan, S. J. en Ongerth, J. E. (2004). Modelling of pharmaceutical residues in Australian sewage by quantities of use and fugacity calculations. Chemosphere, 54(3), 355–367. Kim, S.-C. en Carlson, K. (2007). Quantification of human and veterinary antibiotics in water and sediment using SPE/LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387(4), 1301–1315. K¨ummerer, K. (2009). Antibiotics in the aquatic environment - A review - Part I. Chemosphere, 75(4), 417–434. Kosma, C. I., Lambropoulou, D. A., en Albanis, T. A. (2010). Occurrence and removal of PPCPs in municipal and hospital wastewaters in Greece. Journal of Hazardous Materials, 179(1-3), 804–817. Kumar, A. en Xagoraraki, I. (2010). Pharmaceuticals, personal care products and endocrine-disrupting chemicals in U.S. surface and finished drinking waters: A proposed ranking system. Science of the Total Environment, 408(23), 5972–5989.
66
Bibliografie Kumar, A., Chang, B., en Xagoraraki, I. (2010). Human Health Risk Assessment of Pharmaceuticals in Water: Issues and Challenges Ahead. International Journal of Environmental Research and Public Health, 7(11), 3929–3953. Larsen, T. A., Lienert, J., Joss, A., en Siegrist, H. (2004). How to avoid pharmaceuticals in the aquatic environment. Journal of Biotechnology, 113(1-3), 295–304. Lav´en, M., Alsberg, T., Yu, Y., Adolfsson-Erici, M., en Sun, H. (2009). Serial mixed-mode cation- and anion-exchange solid-phase extraction for separation of basic, neutral and acidic pharmaceuticals in wastewater and analysis by high-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216(1), 49–62. Lee, H.-B., Sarafin, K., en Peart, T. E. (2007). Determination of beta-blockers and beta2-agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1148(2), 158–167. L´opez-Serna, R., P´erez, S., Ginebreda, A., Petrovi´c, M., en Barcel´o, D. D. (2010). Fully automated determination of 74 pharmaceuticals in environmental and waste waters by online solid phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Talanta, 83(2), 410–424. Matuszewski, B., Constanzer, M., en Chavez-Eng, C. (2003). Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Analytical Chemistry, 75(13), 3019–3030. Mellon, M., Benbrook, C., en Benbrook, K. (2001). Hogging it - Estimates of Antimicrobial Abuse in Livestock. Union of Concerned Scientists, pagina’s 1–112. Mompelat, S., Le Bot, B., en Thomas, O. (2009). Occurrence and fate of pharmaceutical products and by-products, from resource to drinking water. Environment International, 35(5, SI), 803–814. Mulholland, M. en Hibbert, D. (1997). Linearity and the limitations of least squares calibration. Journal of Chromatography A, 762(1-2), 73–82. Nageswara Rao, R., Venkateswarlu, N., en Narsimha, R. (2008). Determination of antibiotics in aquatic environment by solid-phase extraction followed by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1187(1-2), 151–164. N¨odler, K., Licha, T., Bester, K., en Sauter, M. (2010). Development of a multi-residue analytical method, based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry, for the simultaneous determination of 46 micro-contaminants in aqueous samples. Journal of Chromatography A, 1217(42), 6511–6521. NORMAN (2006). Network of reference laboratories for monitoring of emerging environmental pollutants. http://www.norman-network.net, (geraadpleegd in november 2012). O‘Brien, E. en Dietrich, D. (2004). Hindsight rather than foresight: reality versus the EU draft guideline on pharmaceuticals in the environment. Trends in Biotechnology, 22(7), 326–330. Onesios, K. M., Yu, J. T., en Bouwer, E. J. (2009). Biodegradation and removal of pharmaceuticals and personal care products in treatment systems: a review. Biodegradation, 20(4), 441–466. OVAM (2005). Compendium voor Monsterneming en Analyse: Prestatiekenmerken. Belgisch Staatsblad, 27/01/2012(CMA/6/A), 1–56. Pal, A., Gin, K. Y.-H., Lin, A. Y.-C., en Reinhard, M. (2010). Impacts of emerging organic contaminants on freshwater resources: Review of recent occurrences, sources, fate and effects. Science of the Total Environment, 408(24), 6062–6069. Peters, F. T. (2011). Recent advances of liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry in clinical and forensic toxicology. Clinical Biochemistry, 44(1), 54–65. Pihlstr¨om, T., Anastassiades, M., Andersson, A., de Kok, A., Poulsen, M. E., Fern´andez-Alba, A. R., Gam´on, M., Lippold, R., Malato, O., Medina, P., Masselter, S., Mol, H., Reynolds, S., en Valverde, A. (2009). Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. SANCO/10684/2009, 1–55. Prasse, C., Schl¨usener, M. P., Schulz, R., en Ternes, T. A. (2010). Antiviral drugs in wastewater and surface waters: a new pharmaceutical class of environmental relevance? Environmental Science & Technology, 44(5), 1728–1735. Ratola, N., Cincinelli, A., Alves, A., en Katsoyiannis, A. (2012). Occurrence of organic microcontaminants in the wastewater treatment process. A mini review. Journal of hazardous materials, 239-240, 1–18. Reif, R., Santos, A., Judd, S. J., Lema, J. M., en Omil, F. (2011). Occurrence and fate of pharmaceutical and personal care products in a sewage treatment works. Journal of Environmental Monitoring, 13(1), 137–144. Richardson, S. D. en Ternes, T. A. (2011). Water Analysis: Emerging Contaminants and Current Issues. Analytical Chemistry, 83(12), 4614–4648. Rosing, H., Man, W. Y., Doyle, E., Bult, a., en Beijnen, J. H. (2000). Bioanalytical Liquid Chromatographic Method Validation. a Review of Current Practices and Procedures. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 23(3), 329–354. Schwesig, D., Borchers, U., Chancerelle, L., Duffek, A., Eriksson, U., Goksøyr, A., Lamoree, M., Lepom, P., Leonards, P., Leverett, D., McLachlan, M., Poulsen, V., Robinson, R., Silharova, K., Tolgyessy, P., Wegener, J., en Westwood, D. (2009). Protocol for the validation of chemical and biological monitoring methods - Improved version. NORMAN, pagina’s 1–99. Sousa, M. a., Gonc¸alves, C., Cunha, E., Hajˇslov´a, J., en Alpendurada, M. F. (2011). Cleanup strategies and advantages in the determination of several therapeutic classes of pharmaceuticals in wastewater samples by SPE-LC-MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 399(2), 807–822.
67
BIJLAGE . Bibliografie Ternes, T., Janex-Habibi, M.-L., Knacker, T., Kreuzinger, N., en Siegrist, H. (2004). Assessment of Technologies for the Removal of Pharmaceuticals and Personal Care Products in Sewage and Drinking Water Facilities to Improve the Indirect Potable Water Reuse. Poseidon, pagina’s 1–61. Van Bramer, S. E. (1998a). An Introduction to Mass Spectrometry, Widener University, hoofdstuk 2: Ionization techniques, pagina’s 6–14. Van Bramer, S. E. (1998b). An Introduction to Mass Spectrometry, Widener University, hoofdstuk 3: Mass analyzers, pagina’s 14–23. Van de Sande-Bruinsma, N., Grundmann, H., Verloo, D., Tiemersma, E., Monen, J., Goossens, H., Ferech, M., the European Antimicrobial Resistance Surveillance System, en of Antimicrobial Consumption Project Groups, E. S. (2008). Antimicrobial Drug Use and Resistance in Europe. Emerging Infectious Diseases, 14(11), 1722–1730. Van De Steene, J. C., Stove, C. P., en Lambert, W. E. (2010). A field study on 8 pharmaceuticals and 1 pesticide in Belgium: Removal rates in waste water treatment plants and occurrence in surface water. Science of the Total Environment, 408(16), 3448–3453. Van Rompu, K. (2012). Ontwikkeling van een multi-residu methode voor het kwantificeren van milieurelevante geneesmiddelen in RWZI-effluent. Verlicchi, P., Al Aukidy, M., Galletti, A., Petrovic, M., en Barcel´o, D. (2012a). Hospital effluent: Investigation of the concentrations and distribution of pharmaceuticals and environmental risk assessment. Science of the Total Environment, 430, 109–118. Verlicchi, P., Al Aukidy, M., en Zambello, E. (2012b). Occurrence of pharmaceutical compounds in urban wastewater: Removal, mass load and environmental risk after a secondary treatment. A review. The Science of the Total Environment, 429, 123–155. Vessman, J., Stefan, R., Van Staden, J., Danzer, K., Lindner, W., Burns, D., Fajgelj, A., en Muller, H. (2001). Selectivity in analytical chemistry (IUPAC Recommendations 2001). Pure and Applied Chemistry, 73(8), 1381–1386. Vial, J. en Jardy, A. (1999). Experimental comparison of the different approaches to estimate LOD and LOQ of an HPLC method. Analytical Chemistry, 71(14), 2672–2677. Vulliet, E., Cren-Olive, C., en Grenier-Loustalot, M.-F. (2011). Occurrence of pharmaceuticals and hormones in drinking water treated from surface waters. Environmental Chemistry Letters, 9(1), 103–114. Webb, S., Ternes, T., Gibert, M., en Olejniczak, K. (2003). Indirect human exposure to pharmaceuticals via drinking water. Toxicology Letters, 142(3), 157–167. Ye, Z., Weinberg, H. S., en Meyer, M. T. (2007). Trace analysis of trimethoprim and sulfonamide, macrolide, quinolone, and tetracycline antibiotics in chlorinated drinking water using liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry, 79(3), 1135–1144. Yu, Y. en Wu, L. (2011). Comparison of four extraction methods for the analysis of pharmaceuticals in wastewater. Journal of Chromatography A, 1218(18), 2483–2489. Zhang, Z. L. en Zhou, J. L. (2007). Simultaneous determination of various pharmaceutical compounds in water by solid-phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1154(1-2), 205–213. Zhou, J. L., Maskaoui, K., en Lufadeju, A. (2012). Optimization of antibiotic analysis in water by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 731, 32–39. Zorita, S., Martensson, L., en Mathiasson, L. (2009). Occurrence and removal of pharmaceuticals in a municipal sewage treatment system in the south of Sweden. Science of the Total Environment, 407(8), 2760–2770. Zuccato, E., Castiglioni, S., Fanelli, R., Reitano, G., Bagnati, R., Chiabrando, C., Pomati, F., Rossetti, C., en Calamari, D. (2006). Pharmaceuticals in the environment in Italy: Causes, occurrence, effects and control. Environmental Science and Pollution Research, 13(1), 15–21. Zumdahl, S. (2005). Chemical Principles, Houghton Mifflin Company, hoofdstuk 7: Acids and Bases, pagina’s 226–275. Boston, USA, fifth edition.
68
Deel IV
Bijlagen
69
Hoofdstuk A
Methodologie
Deze bijlage bevat: • Een overzicht van de 43 beschouwde componenten met hun relevante fysisch-chemische eigenschappen en hun analyseparameter; • Een groepsindeling van de componenten op basis van hun ATC-classificatie en hun beoogde effecten.
Tabel A.1: Overzicht van de 43 beschouwde componenten en hun relevante eigenschappen (Van Rompu, 2012). Component
Formule
Acyclovir Alprazolam Amantadine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacine Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine
C8 H11 N5 O3 C17 H13 ClN4 C10 H17 N C20 H23 N C16 H19 N3 O5 S C19 H21 ClFN3 O3 C15 H12 N2 O C11 H12 Cl2 N2 O5 C17 H18 FN3 O3
Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxine Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine
C16 H13 ClN2 O C14 H11 Cl2 NO2 C14 H9 ClF3 NO2 C19 H22 FN3 O3 C14 H12 FNO3 C17 H18 F3 NO C19 H22 FN3 O4 C13 H18 O2 C19 H16 ClNO4 C12 H7 Cl3 O2 C8 H11 N3 O3 S C18 H20 FN3 O4 C6 H9 N3 O3 C21 H24 FN3 O4 C12 H12 N2 O3 C14 H14 O3 C15 H14 N4 O C14 H24 N2 O4 C16 H28 N2 O4 C22 H24 N2 O9 C8 H9 NO2 C19 H20 FNO3 C18 H18 F3 N3 O3 C12 H21 N C23 H27 FN4 O2 C20 H17 F2 N3 O3 C12 H14 N4 O4 S C12 H14 N4 O2 S C10 H11 N3 O3 S C16 H13 ClN2 O2 C22 H24 N2 O8 C14 H18 N4 O3 C17 H27 NO2 C10 H13 N5 O4
1
70
n.g. = niet gegeven
Fysisch-chemische parameters Massa log Kow pKa g.mol−1 226 -1,59 2,27; 9,25 309 3,9 n.g. 1 152 2,3 9 278 4,9 n.g. 366 0 2,8; 7,2 394 n.g. 5,65; 9,92 237 2,45 7 323 0,7 13,59 332 2,3 3,64; 5,05; 5,86-6,35; 8,24-8,95 285 2,7 3,4 296 3,9 4,2 316 4,7 9,1 360 1,1 6,27; 8,3 262 1,7 6,5 310 4,7 10,1 376 2,6 n.g. 206 3,6 4,4 358 3,4 4,18 288 4,8 8,14 230 0,06 4,3 362 0,35 5,5; 6,8; 8,0 172 -0,1 2,62 402 2,9 3,6; 5,0; 6,1; 9,29 233 2,1 n.g. 231 2,8 4,8 267 2,05 2,8 313 2,3 8,2 285 0,36 3,6; 8,9 461 -1,22 3,27; 7,32; 9,11 152 0 1,7; 9,9 330 4,7 10,3 381 n.g. n.g. 180 3,6 411 2,5 3,11; 8,24 386 1,07 n.g. 311 0,72 6,1 279 0,89 7,65 254 0,9 5,65 301 3 1,6 445 -1,19 3,3; 7,68; 9,69 291 0,79 7,2 278 2,8 9,4 268 -0,1 9,96
Analyseparameters tR min Dimethylsulfoxide 4,67 Methanol 31,52 Water 10,38 Water 24,05 Water 5,98 Water 20,26 Methanol 28,39 Acetonitril 4,69 Water 11,25 Solvent
Water Methanol Methanol Acetonitril Acetonitril Methanol Water + 0,1 1M NaOH Methanol Acetonitril Acetonitril Dimethylsulfoxide Acetonitril Acetonitril Water Acetonitril Methanol Methanol Water Water Water + 0,1 1M NaOH Methanol Methanol Dimethylsulfoxide Water Methanol Water + 0,1 1M NaOH Acetonitril Acetonitril Acetonitril Water Water + 0,1 1M NaOH Acetonitril Methanol Methanol
34,86 39,65 39,56 11,62 27,70 25,72 13,81 15,98 39,60 19,85 2,87 10,34 8,53 15,68 26,58 11,27 21,96 12,26 19,60 11,62 8,96 23,37 44,74 17,55 15,74 13,08 16,42 13,04 15,39 32,65 11,31 9,09 16,86 14,17
MID 1 1 3 2 2 3 3 4 2 3 1 2 2 2 1 1 4 3 4 1 2 1 1 3 4 2 3 1 1 1 1 3 1 1 1 3 3 2 2 1 3 2 2
BIJLAGE A. Methodologie Tabel A.2: Overzicht van de beschouwde componenten met hun ATC-classificatie en hun gebruik en de aanduiding of het een humaan (H) of veterinair (V) geneesmiddel is (Van Rompu, 2012). Component Acyclovir Alprazolam Amantadine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacine Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan, Triclosan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxine Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine
ATC-classificatie2 Antiviraal middel Psycholepticum Antiparkinsonmiddel Psycho-analepticum Antibioticum Antibioticum Anti-epilepticum Antibioticum Antibioticum Psycholepticum Anti-inflammatoir en anti-reumatisch middel Antiviraal middel Antibioticum Antibioticum Psycho-analepticum Antibioticum Anti-inflammatoir en anti-reumatisch middel Anti-inflammatoir en anti-reumatisch middel Desinfectans Antiviraal middel Antibioticum Antibioticum Antibioticum Antibioticum Anti-inflammatoir en anti-reumatisch middel Antiviraal middel Antiviraal middel Antiviraal middel Antibioticum Pijnstiller Psycho-analepticum Antiviraal middel Antiviraal middel Psycholepticum Antibioticum Antibioticum Antibioticum Antibioticum Psycholepticum Antibioticum Antibioticum Psycho-analepticum Antiviraal middel
Gebruik Herpesvirus Paniek- en angststoornissen Ziekte van Parkinson Antidepressivum Allerlei infecties (breed spectrum) Ooginfecties Epilepsie Ooginfecties Allerlei infecties (breed spectrum) Slaap- en kalmeringsmiddel Pijnstiller en ontstekingsremmer HIV Luchtweg- en spijsverteringsinfecties Luchtweg- en spijsverteringsinfecties Antidepressivum Luchtweg- en ooginfecties Pijnstiller en ontstekingsremmer Pijnstiller en ontstekingsremmer Bacteriedodende en schimmelwerende stof Hepatitis B en HIV Levensbedreigende infecties (reservemiddel) Specifieke infecties Luchtweginfecties Urineweginfecties Reuma, pijnstiller HIV Griep (actieve vorm) Griep (prodrug) Allerlei infecties (breed spectrum) Pijnstiller Antidepressivum Luchtweginfecties (Picornavirus) Griep Psychozen en onrust (bv. schizofrenie en agressie) Infecties (Salmonella spp., E. coli) bij gevogelte Malaria, allerlei infecties (breed spectrum) Allerlei infecties (breed spectrum) Allerlei infecties (breed spectrum) Angststoornissen en slapeloosheid Allerlei infecties (breed spectrum) Allerlei infecties (breed spectrum) Antidepressivum HIV
H/V H H H H H H H H H H H H V V H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H V H/V V H H H H H H
2
Het ATC-classificatie systeem voor farmaceutische stoffen wordt toegekend door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Een ATC-code voor een geneesmiddel bestaat uit 7 letters/cijfers, onderverdeeld in 5 niveaus. Het tweede niveau is weergegeven in de tabel en specifieert de therapeutische werking van de farmaceutische stof.
71
Hoofdstuk B B.1
Resultaten
Instrumentele validatie
Deze bijlage bevat: • Een overzicht van de herhaalbaarheid van de meting en de instrumentele detectie- en kwantificatielimieten. Tabel B.1: Een overzicht van de instrumentele detectie- en kwantificatielimieten. Component Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacine Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine
72
20 µg.L−1 19 8 9 39 14 13 3 18 11 10 12 5 15 6 10 13 5 4 4 9 20 4 3 16 6 42 8 5 3 5 6 6 9 11 6 9 26 10 23 8 15 13 10
VC (%), n = 3 100 µg.L−1 500 µg.L−1 10 1 2 1 6 7 5 3 8 9 4 2 9 3 2 2 3 8 11 1 2 1 4 4 7 6 4 3 4 5 14 9 5 7 3 5 8 6 3 2 13 6 9 11 10 2 6 2 8 4 23 5 6 2 4 2 14 7 4 6 10 11 1 2 10 5 6 10 14 5 1 4 17 2 0 3 13 3 11 6 8 3 1 2 5 11
2000 µg.L−1 16 2 7 10 12 2 2 2 2 2 1 6 8 6 4 10 6 3 8 1 9 10 7 3 2 2 5 4 4 6 8 3 7 4 2 6 6 5 6 8 5 1 8
CCα µg.L−1 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
CCβ µg.L−1 100 20 20 100 20 20 20 100 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 100 20 20 20 20 100 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 100 20 100 20 20 20 20
BIJLAGE B. Resultaten
B.2
Optimalisatie van de methode
Deze bijlage bevat: • De resultaten van de proceseffici¨entie voor elk optimalisatie-experiment. • De resultaten van de herhaalbaarheid in variatieco¨effici¨enten voor elk optimalisatie-experiment.
73
BIJLAGE B. Resultaten
1 15 74 105 12 34 13 106 16 68 19 108 12 60 92 21 26 49
2 8 74 109 11 34 74 101 17 68 13 97 16 60 77 19 18 50
3 4 87 115 19 46 72 84 35 74 26 80 22 68 82 29 31 55
4 3 85 116 20 27 71 77 18 70 14 74 16 42 92 17 22 48
5 1 90 103 40 51 51 102 47 91 59 96 62 109 47 44 47 65
6 2 50 49 2 7 30 89 4 2 47 74 0 1 4 2 36 25
7 1 72 93 40 46 34 82 33 76 71 76 43 83 24 36 68 55
8 1 83 108 39 53 37 90 46 88 89 82 59 89 40 42 113 66
9 0 92 129 26 37 73 100 52 88 8 97 32 80 26 24 25 56
10 1 69 83 47 60 25 90 55 87 90 87 48 83 42 54 82 63
11 1 76 93 50 53 3 90 50 86 89 79 51 89 37 50 134 65
12 1 78 62 43 56 37 104 47 86 63 95 48 98 43 51 109 64
13 4 86 106 31 58 54 110 54 89 64 87 41 96 58 52 59 66
14 2 90 84 29 54 53 100 53 93 75 75 49 87 32 50 60 62
15 1 95 134 38 75 41 90 77 89 131 75 69 92 80 67 85 77
16 0 55 53 17 53 11 35 27 73 51 31 22 71 41 35 38 38
Tabel B.2: Resultaten van de verschillende optimalisatie-experimenten: proceseffici¨enties (%). Component Acyclovir Alprazolam Diclofenac Fluoxetine Gatifloxacine Lamivudine Metronidazol Moxifloxacine Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Tetracycline Gemiddelde
17 1 63 74 23 53 19 78 32 76 57 71 31 76 40 40 46 49
18 1 98 116 40 89 39 105 70 101 151 92 56 104 76 84 125 84
19 4 101 121 46 96 74 116 51 105 153 108 66 100 81 87 212 95
74
Component Acyclovir Alprazolam Diclofenac Fluoxetine Gatifloxacine Lamivudine Metronidazol Moxifloxacine Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Tetracycline Gemiddelde
1 18 10 6 3 6 39 6 13 10 23 8 14 11 18 14 10 13
2 8 1 5 52 8 10 4 17 3 13 2 33 5 18 12 36 14
3 7 4 8 22 16 6 4 13 8 24 5 34 13 15 17 21 14
4 11 23 18 38 38 24 26 36 23 37 26 26 30 23 34 23 27
5 28 24 15 35 23 13 13 24 10 18 14 30 12 14 16 21 19 17 18 14 25 26
6 19 28 23 43 31 22 21 68 12 36 21
7 95 75 71 49 67 77 74 75 72 81 71 53 78 26 79 67 69
8 23 2 2 8 21 1 4 22 1 4 6 10 0 16 12 8 9
9 22 2 5 43 17 8 3 11 7 7 0 23 1 11 16 7 11
10 9 26 27 15 7 13 7 10 9 11 3 12 9 11 10 14 12 5 20 4 23 24 2 47 2 9 4 11 6 21 23 9 14
11
12 15 8 39 15 11 8 11 9 12 38 9 19 11 18 17 4 15
13 41 8 4 18 12 3 6 7 8 13 8 15 7 8 11 28 12
14 9 7 8 35 1 1 3 5 1 5 2 17 3 0 7 7 7
15 22 2 4 32 10 7 5 18 1 7 6 21 3 6 5 8 10
16 0 16 15 11 14 4 4 4 11 14 9 9 11 33 11 13 11
17 23 22 33 19 26 6 1 36 12 18 6 21 15 30 31 26 20
Tabel B.3: Resultaten van de verschillende optimalisatie-experimenten: variatieco¨effici¨enten (%). 18 113 6 12 31 12 4 4 12 3 6 14 30 7 11 14 20 19
19 9 4 5 2 5 8 7 24 7 10 7 10 6 17 2 31 10
BIJLAGE B. Resultaten
75
BIJLAGE B. Resultaten
B.3
Methodevalidatie
Deze bijlage bevat: • De groepsverdeling op basis van gevoeligheid. • De reproduceerbaarheid voor effluent. • De reproduceerbaarheid voor influent. • De proceseffici¨entie per concentratieniveau voor effluent. • De proceseffici¨entie per concentratieniveau voor influent. • De onzekerheid op de proceseffici¨entie per concentratieniveau voor effluent. • De onzekerheid op de proceseffici¨entie per concentratieniveau voor influent. • De verklaring van de proceseffici¨entie door matrixeffecten en terugvinding in effluent. • De verklaring van de proceseffici¨entie door matrixeffecten en terugvinding in influent. • De achtergrondconcentratie, de berekende methodedetectie- en kwantificatielimieten en de bijhorende S/N-waarden voor effluent. • De achtergrondconcentratie, de berekende methodedetectie- en kwantificatielimieten en de bijhorende S/N-waarden voor influent. Tabel B.4: Groepsindeling van de componenten op basis van de S/N-verhouding bij injectie van een standaard van 10 µg.l−1 en de proceseffici¨entie bepaald bij de geoptimaliseerde methode. Groep 1 Acyclovir Amoxicilline Besifloxacine Ciprofloxacine Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Temazepam Tetracycline Trimethoprim Zidovudine
76
Groep 2 Alprazolam Amandatine Amitriptyline Carbamazepine Chlooramfenicol Diazepam Diclofenac Nevirapine Rimantadine Sulfamethazine Sulfamethoxazol Venlafaxine
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.5: Resultaten van de reproduceerbaarheid (variatieco¨effici¨ent, VCC (%)) per concentratieniveau voor effluent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
1
100 ng.L−1 ? 20 ng.L−1 10 3 2 4 n.d.1 29 1 6 30 9 3 2 20 7 8 8 9 12 32 5 12 5 15 14 11 11 48 5 31 13 21 87 4 14 15 2 14 7 1 4 3 4 8
500 ng.L−1 ? 100 ng.L−1 20 4 2 15 n.d. 23 5 9 22 9 12 14 20 12 33 6 5 8 14 7 16 4 7 24 10 9 14 6 11 4 20 21 8 22 12 2 4 4 10 6 6 6 5
2 500 ng.L−1 ? 500 ng.L−1 45 2 8 7 12 8 5 1 4 5 10 8 4 8 6 5 8 7 19 3 4 3 4 12 4 3 12 1 15 4 8 11 2 10 6 12 9 6 7 6 7 4 2
12 500 ng.L−1 ? 2 500 ng.L−1 43 1 1 5 14 4 2 4 2 3 6 6 4 4 5 3 7 8 9 16 3 4 5 12 4 4 2 3 4 1 2 19 9 6 5 1 3 2 5 1 2 5 2
Amoxicilline werd niet gedetecteerd bij de laagste twee concentratieniveaus.
77
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.6: Resultaten van de reproduceerbaarheid (variatieco¨effici¨ent, VCC (%)) per concentratieniveau voor influent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
78
200 ng.L−1 ? 40 ng.L−1 42 4 12 5 70 5 4 11 6 10 5 5 4 18 6 7 16 14 1 15 5 17 19 11 13 13 8 3 33 3 13 48 11 13 9 10 47 21 6 9 9 5 13
1000 ng.L−1 ? 200 ng.L−1 52 15 17 12 99 15 6 11 5 7 12 7 6 14 12 9 9 12 8 24 11 18 10 14 14 21 17 36 46 7 26 49 13 13 8 17 23 5 12 4 16 10 13
5 000 ng.L−1 ? 1000 ng.L−1 51 17 26 7 30 14 15 9 8 11 11 6 12 5 22 11 5 9 2 26 9 26 21 17 6 8 20 16 10 14 4 16 26 15 7 18 15 8 8 13 18 9 12
25 000 ng.L−1 ? 5 000 ng.L−1 40 3 5 5 36 7 2 5 6 4 9 13 4 12 10 6 5 13 3 10 4 4 3 16 4 11 7 6 6 4 9 49 11 4 1 6 8 8 10 5 3 7 10
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.7: Resultaten van de proceseffici¨entie (%) per concentratieniveau voor effluent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine ? Zidovudine
100 ng.L−1 ? 20 ng.L−1 3 89 76 38 0 44 -254 29 69 80 208 48 78 119 39 77 84 70 49 23 80 89 68 78 129 66 137 94 1 85 36 38 86 73 70 77 56 101 168 68 88 -554 73
500 ng.L−1 ? 100 ng.L−1 1 85 87 74 0 71 -71 33 71 91 0 72 78 113 51 76 88 79 85 28 80 102 42 71 105 91 106 85 58 88 47 17 91 57 59 77 80 82 170 104 89 16 88
2 500 ng.L−1 ? 500 ng.L−1 0 87 88 86 12 84 78 3 92 95 69 69 88 102 69 98 26 71 11 29 92 94 94 88 22 95 92 95 95 83 70 16 88 68 94 82 72 75 169 110 97 68 82
12 500 ng.L−1 ? 2 500 ng.L−1 0 81 86 80 8 84 87 17 95 90 64 67 92 100 61 94 123 68 50 21 95 89 80 83 115 98 85 83 86 92 64 9 76 78 91 76 72 77 152 114 94 94 88
79
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.8: Resultaten van de proceseffici¨entie (%) per concentratieniveau voor influent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
80
200 ng.L−1 ? 40 ng.L−1 -2 65 79 57 115 58 97 56 94 73 75 82 105 83 74 93 380 75 48 62 92 75 107 91 151 38 84 78 46 -5179 102 3 74 151 84 69 -36 81 471 278 74 362 76
1000 ng.L−1 ? 200 ng.L−1 -1 93 102 94 74 108 123 59 107 103 110 106 124 121 93 122 133 107 71 71 132 96 132 172 112 95 107 85 119 -51 83 10 88 177 119 94 60 78 462 83 104 165 90
5 000 ng.L−1 ? 1000 ng.L−1 1 82 100 100 60 96 97 65 93 99 89 83 98 128 70 102 94 89 54 52 101 76 82 102 84 100 100 73 78 -70 81 53 79 97 86 88 73 83 452 109 108 110 82
25 000 ng.L−1 ? 5 000 ng.L−1 1 81 98 86 38 90 101 70 81 87 84 64 83 93 68 83 87 70 50 50 92 95 71 95 83 95 103 83 67 115 74 80 80 85 75 93 87 90 332 120 95 99 87
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.9: Onzekerheid op de proceseffici¨entie, weergegeven in variatieco¨effici¨enten (VCP E , %) per concentratieniveau voor effluent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicillin Besifloxacin Carbamazepine ? Chloramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacin Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazole Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidone Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazole ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
2
100 ng.L−1 ? 20 ng.L−1 70 15 3 17 n.d. 2 45 -114 8 45 12 72 3 29 8 11 12 9 20 47 27 20 5 99 20 11 106 48 5 2380 15 97 158 4 17 20 2 41 31 1 30 4 -124 52
500 ng.L−1 ? 100 ng.L−1 41 6 2 20 n.d. 24 -104 9 24 9 -18052 14 21 12 33 6 5 8 15 8 17 4 28 25 10 18 14 6 15 4 26 38 80 23 12 2 6 8 10 7 6 901 10
2 500 ng.L−1 ? 500 ng.L−1 58 2 8 8 12 8 33 1 4 5 31 8 4 9 6 5 8 7 20 3 4 3 5 12 4 4 12 1 16 4 8 13 2 10 6 12 9 7 7 6 7 43 2
12 500 ng.L−1 ? 2 500 ng.L−1 45 1 1 5 14 4 3 4 2 3 8 6 4 4 5 3 7 8 9 16 3 4 5 12 4 5 2 3 4 1 2 20 9 6 5 1 3 2 5 1 2 9 2
Amoxicilline werd niet gedetecteerd bij de laagste twee concentratieniveaus.
81
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.10: Onzekerheid op de proceseffici¨entie, weergegeven in variatieco¨effici¨enten (VCP E , %) per concentratieniveau voor influent. Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicillin Besifloxacin Carbamazepine ? Chloramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacin Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazole Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidone Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazole ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
82
200 ng.L−1 ? 40 ng.L−1 -507 6 12 13 107 16 99 14 15 11 49 5 4 21 6 8 107 16 10 15 23 19 44 13 87 94 8 11 58 -73 13 179 7 13 10 10 -87 36 7 82 16 211 16
1000 ng.L−1 ? 200 ng.L−1 -214 15 17 14 114 15 20 11 6 7 24 7 6 14 12 9 44 12 9 24 15 18 13 14 33 25 17 14 49 -1634 26 55 39 13 8 17 31 7 13 47 17 94 13
5 000 ng.L−1 ? 1000 ng.L−1 91 17 26 7 31 14 20 9 8 11 14 6 12 5 22 11 11 9 2 26 10 27 23 17 8 9 20 26 10 -300 4 16 16 15 8 18 15 9 8 20 18 30 12
25 000 ng.L−1 ? 5 000 ng.L−1 44 3 5 5 36 7 2 5 6 4 9 13 4 12 10 6 6 13 3 10 4 4 3 16 4 11 7 11 7 29 9 49 6 4 1 6 8 8 10 6 3 9 10
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.11: Verklaring van de proceseffici¨entie met behulp van matrixeffecten en terugvinding voor effluent bij 500 ng.L−1 (? 100 ng.L−1 ). Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
PE (%) 1 85 87 74 n.d.3 71 -71 33 71 91 -0,5 72 78 113 51 76 88 79 85 28 80 102 42 71 105 91 106 85 58 88 47 17 91 57 59 77 80 82 170 104 89 16 88
ME (%) 112 98 90 57 186 50 -113 32 50 96 -125 22 55 140 18 78 90 65 29 93 66 104 39 85 90 110 106 95 96 88 30 0 95 65 58 94 91 98 190 96 98 48 93
RE (%) 1 87 97 129 n.d. 141 62 102 141 95 0,4 329 141 81 286 98 99 122 295 30 121 97 107 83 116 83 100 90 60 100 154 9556 95 88 101 82 88 84 89 109 91 33 95
Amoxicilline werd niet gedetecteerd in het staal met de spike voor SPE bij 500 ng.L−1 , maar wel in het staal met de spike na SPE. 3
83
BIJLAGE B. Resultaten Tabel B.12: Verklaring van de proceseffici¨entie met behulp van matrixeffecten en terugvinding voor influent bij 12 500 ng.L−1 (? 2 500 ng.L−1 ). Component Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlaflaxine ? Zidovudine
84
PE (%) 1 81 98 86 38 90 101 70 81 87 84 64 83 93 68 83 96 70 75 50 92 95 71 95 91 95 103 83 67 115 74 80 80 85 75 93 87 90 332 120 95 99 87
ME (%) 70 79 82 97 687 92 94 70 91 83 87 85 96 118 71 84 87 85 50 71 101 80 75 96 83 100 89 74 61 89 81 86 67 78 76 86 77 97 352 116 84 106 91
RE (%) 1 102 118 89 6 98 108 99 89 105 96 75 86 79 95 99 110 83 150 70 91 118 95 99 109 95 116 112 111 129 91 93 121 109 98 109 113 93 94 103 113 94 96
a
11 176
1223
355
45
12
14 14
13 2325
29
4555
953
287
12
20 49
30 1086
S/N
11
ng.L−1
x0
Effluent CCα S/N ng.L−1 n.d. a n.d. 34 96 17 56 40 193 3275 2 402 171 2796 1546 14 10 116 12 23 25 1002 359 74 68 113 12 121 17 68 62 100 22 83 8 113 7 99 4 110 27 126 18 99 63 375 78 114 6 157 23 25 4 545 13 108 35 50 1 114 6 91 6 821 3 20 167 124 27 95 22 98 29 38 12 73 58 109 141 120 4 112 19 958 1836 117 26
n.d. = niet detecteerbaar en/of kwantificeerbaar binnen het toegepaste concentratiebereik.
Acyclovir Alprazolam ? Amandatine ? Amitriptyline ? Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine ? Chlooramfenicol ? Ciprofloxacine Diazepam ? Diclofenac ? Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine ? Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine ? Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine ? Sulfamethoxazol ? Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine ? Zidovudine
Component CCβ ng.L−1 n.d. 34 17 40 3275 402 2796 14 402 23 1002 74 409 121 68 100 83 113 612 110 126 99 564 548 157 25 545 108 214 114 373 3315 20 124 95 98 38 73 109 120 112 958 117 n.d. 96 56 193 2 171 1546 10 54 25 359 68 51 17 62 22 8 7 25 27 18 63 197 186 23 4 13 35 2 6 14 7 167 27 22 29 12 58 141 4 19 1836 26
S/N
136
190
550
40
642 211
24
5970
73744
20
16
12
21 15
24
1827
149 7
112
17 47 39 89
15 148 5 160 125
141
S/N
18
ng.L−1
x0
Influent CCα S/N ng.L−1 n.d. n.d. 33 56 32 111 70 220 37216 1 144 12 336 81 44 111 538 138 31 74 285 126 191 57 235 27 162 17 218 109 189 18 4355 32 180 49 223 4 222 71 578 171 184 101 525 30 179 3 1678 74 39 3 159 3 293 20 171 2 100246 2952 265 5 3764 39 35 141 259 25 195 10 148 125 23 24 52 34 265 187 1559 44 250 13 593 832 183 56 CCβ ng.L−1 n.d. 33 32 70 n.d. 144 336 44 538 31 285 191 235 944 218 189 4355 180 223 222 578 184 1429 179 1678 39 159 293 4898 100246 265 3764 35 259 195 148 5206 1027 265 1559 250 593 183 n.d. 56 111 220 n.d. 12 81 111 138 74 126 57 27 48 109 18 32 49 4 71 171 101 201 3 74 3 3 20 30 2952 5 39 141 25 10 125 2110 411 187 44 13 832 56
S/N
Tabel B.13: Achtergrondconcentratie (x0 ) voor componenten met S/N > 10, methodebeslissingsgrens (CCα ) en -detectievermogen (CCβ ) en de overeenkomstige S/N-waarden voor influent en effluent.
BIJLAGE B. Resultaten
85
BIJLAGE B. Resultaten
B.4
Toepassing van de methode
Deze bijlage bevat: • De berekende concentraties in de RWZI-stalen; • De berekende dagbeladingen van de RWZI; • Een samenvatting met de gemiddelde belading, de variatie hierop en het aantal detecties en kwantificaties per component.
86
Label
D A A A D A A C A A B A A A A A B A C C A A A A A A A A A B A C A A A A A A C A A B A
Component
Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine 1372
x 86650
x 154
3535
x
98503
149 334 x
212
x 291
18 219
x x
x x x 124
x
5007
5590
6187
x 276
11 229 1
73413
x
1101
149
x
379
513
109 x 338
243
89967
x
1203
x x x x
5926
368
266
201
384
432
50 10
Dag 4
370
491 x 218
Influent Dag 2 Dag 3 x x x 43 32 9 7
533 2 213
43 10 268
Dag 1 x
59 4 x 39 346
46 292
124 x
46 274
119
x
x 1 x
491 x
x 13 50
122
629
83
393
3 46 8
x x x
490
x 48
x
x
522
436 x 85
x 58 9
Effluent CAS Dag 2 Dag 3
x
36 x x 9
x
x
650
90
x 423
2 52 12
Dag 1
38 328
129
x
505
x 105
163
627
109
464
3 56 12
Dag 4
52 355
134 4
x 2
x
x x 108
49
x
106 x 603
414
57 8
Dag 1
43 301
112 3
x
x
39 283
99 3
x
x
92
49
x
x x x
x
457 9
95
414
x 48 6
x x x
15
503
x
423
51 5
Effluent MBR Dag 2 Dag 3
34 329
119
x
x
141 x
x x x x
106
614
129
495
2 53 9
Dag 4
45 342
77 x
x
x x
x x
x x x 125
x
629
98
421
0 53 12
Dag 1
46 293
116 x
111
x
x x 43 9 322
192
47
467
80
420
2 50 11
48 283
112 2
x
x x x
524
101
455
x 50 12
Effluent totaal Dag 2 Dag 3
x 304
112
x
254 x
x x 51
86
491
x
499
1 63 6
Dag 4
Tabel B.14: Berekende concentraties (ng.L−1 ) voor de RWZI-stalen uit Schilde. De x staat voor een piek met S/N lager dan 10, een leeg vakje voor een S/N lager dan 3 en een vetgedrukte waarde betekent dat het genormaliseerde piekoppervlak buiten het kalibratiegebied ligt, en dat de concentratie aldus werd berekend aan de hand van extrapolatie (Sectie 6.4).
BIJLAGE B. Resultaten
87
BIJLAGE B. Resultaten
Component
D A A A D A A C A A B A A A A A B A C C A A A A A A A A A B A C A A A A A A C A A B A
Label
Effluent CAS Dag 2 Dag 3 4868 4967
Dag 4 4555
412 61
Dag 1 7221
365 33
x 341 43
Effluent MBR Dag 2 Dag 3 7220 7153
17 386 66
Dag 4 7221
735 170
Dag 1 13808
28 602 138
5511
x 610 143
Effluent totaal Dag 2 Dag 3 12088 12120
5875
17 740 74
Dag 4 11776
Dag 1 6587
Influent Dag 2 13808 x
13 256 56
5076
Dag 4 12120
Dag 1 14048 x 13 229 42
5808
x 284 42
3571
13 344 81
2962
607 120
3056
Dag 3 12088 x x 392 79
2991
589 130
2114
605 136 3779
1952
x 2784
x
5240
1220
4478
964
414
1356
2124 x 413
930
594
682
3221
x
2424
498
6781 x 3005
5779
7510 33 3004
6348
x x x
x x x x
x x
x x x 1729
x
5649
x x x
1019 x
2325
x x 524 104 3893
x
x x x
2991 x
x x 595
1008
8686
2858
x 356
x x 780
656
573
4436
3125
x 480
356
768
3268 67
2541
x 64 249
2299
x
x
1318
x x
1352 27
x 3579
x
x
1398 x
577 3425
x
x
1059 x
557 3539
x
x
862
615 4721
x
x
3630
4280
x x 235
2436 x
744
4458
x x
235 x x 56
2385
x
707 20
248 2375
x
807 21
280 2027
1346
970 31
307 2171
x
588
372 2564
x 14
593
171 1494
x
603 x
230 1362
x
225 1423
x x
605
4578
x x x x
x x 8 x
386 27 x 255 2279
x
7077
1795
14578
71826
5410
x
60519
x x x 1714
13306
x
77191
x 2167
18940
x
87144
49781
x
x x
x
1324 x 4099
2943
1090395
134 2774 12
887417
248 3018
x 3336
1196464,984
x 4015
1387323
x
2982
2099 4709 x
105
763 x 4352
Tabel B.15: Berekende beladingen (mg.dag−1 )voor de RWZI-stalen uit Schilde. De x staat voor een piek met S/N lager dan 10, een leeg vakje voor een S/N lager dan 3 en een vetgedrukte waarde betekent dat het genormailseerd piekoppervlak buiten het kalibratiegebied ligt, en dat de concentratie aldus werd berekend aan de hand van extrapolatie (Sectie 6.4).
Debiet (m3 .dag−1 ) Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine
88
Label
D A A A D A A C A A B A A A A A B A C C A A A A A A A A A B A C A A A A A A C A A B A
Component
Acyclovir Alprazolam Amandatine Amitriptyline Amoxicilline Besifloxacin Carbamazepine Chlooramfenicol Ciprofloxacine Diazepam Diclofenac Efavirenz Enrofloxacine Flumequine Fluoxetine Gatifloxacine Ibuprofen Indomethacine Irgasan Lamivudine Levofloxacine Metronidazol Moxifloxacine Nalidixinezuur Naproxen Nevirapine Oseltamivir carboxylaat Oseltamivir ethylester Oxytetracycline Paracetamol Paroxetine Pleconaril Rimantadine Risperidon Sarafloxacine Sulfadoxin Sulfamethazine Sulfamethoxazol Temazepam Tetracycline Trimethoprim Venlafaxine Zidovudine 23 12 22
15
13 71
18
42 4
6002 33 2914 5381
74170
1892 24151
1140400
191 2929 12 1324 2099 4040 14
19 22
548 116 3779
Influent Gemiddelde VC D 3 1 4 4 1 0 4 2 4 0 4 0 0 1 0 0 4 0 0 3 3 3 4 0 4 0 0 4 0 4 0 0 1 0 0 0 2 4 1 1 4 4 1
K 0 0 4 4 1 0 4 1 4 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 2 4 1 1 1 4 0
Effluent totaal Gemiddelde VC D 0 13 2 4 278 18 4 55 34 4 0 1 2243 16 4 1 480 18 4 0 3201 24 4 0 0 0 1 0 674 15 4 0 0 1 235 2 64 4 321 43 4 56 1 2374 3 3 1 0 0 0 3 0 2 8 3 1 0 0 0 543 19 4 27 2 1 220 16 4 1639 26 4 0 K 0 3 4 4 0 0 4 0 4 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 1 3 1 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 1 0 4 4 0
Effluent CAS Gemiddelde VC D 0 17 2 376 8 4 51 30 4 0 0 3145 9 4 0 792 16 4 1 3921 14 4 67 1 0 0 1 0 562 52 3 105 1 0 1 4 4 780 4 0 677 49 3 1 0 1 0 3 0 1 14 4 0 0 1 0 837 13 4 24 27 3 0 302 17 4 2284 10 4 0 K 0 1 4 4 0 0 4 0 3 0 4 1 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 1 0 3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 3 0 4 4 0
Effluent MBR Gemiddelde VC D 0 22 35 3 671 11 4 131 31 4 0 0 5568 7 4 0 1180 17 4 0 6616 21 4 0 0 0 1 0 790 39 2 0 2325 1 1 4 4 949 71 4 104 1 3442 19 3 3 0 0 0 2 1 1346 1 2 0 0 0 0 1282 12 4 27 3 0 583 5 4 3816 16 4 K 0 2 4 4 0 0 4 0 3 0 4 0 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 3 1 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 1 0 3 4
Tabel B.16: Samenvatting van de resultaten voor de RWZI-stalen uit Schilde, met de gemiddelde belading (mg.dag−1 ), de variabiliteit op de belading (%, met n = K), het aantal detecties (D) en het aantal kwantificaties (K).
BIJLAGE B. Resultaten
89
Hoofdstuk C
CD met figuren
Deze bijlage bevat: • Figuren van de instrumentele lineariteit. • Figuren met de vergelijking tussen de lineaire en de kwadratische regressievergelijking. • Een digitale kopie van deze masterproef
90
