PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
VALIDASI METODE ANALISIS TABLET LOSARTAN MERK® B YANG DITAMBAH PLASMA MANUSIA DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
Ika Yuni Astuti * , Wiranti Sri Rahayu, Dian Pratiwi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Jl. Raya Dukuhwaluh, PO Box 202, Purwokerto 53182
ABSTRAK
Losartan merupakan obat antihipertensi yang diwajibkan oleh BPOM untuk diteliti bioekivalensinya. Metode analisis yang valid dibutuhkan untuk pengujian bioekivalensi. Sebagai langkah awal dilakukan penelitian metode analisis losartan dengan menggunakan plasma darah secara in vitro. Metode yang dipilih adalah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) sistem isokratik dengan fase terbalik dengan detektor multiplayerchip sumber cahaya ultra violet pada panjang gelombang 220 nm dengan menggunakan metode adisi. Pemisahan dengan menggunakan kolom C-18 fase terbalik dan fase gerak menggunakan asetonitril 60 % dan dapar fosfat 0,015 M 40 % (sampai pH 2,4 dengan ditambah asam ortho fosfat). Hasil penelitian menunjukkan metode tersebut linear (r = 0,998 pada konsentrasi antara 5-30 μg/mL). Batas kuantitasi = 6,082 μg/mL, batas deteksi = 1,825 μg/mL. Uji presisi menunjukkan koevisien variasi 2,244 dan uji akurasi menunjukkan % perolehan kembali masing-masing = 85,639 %; 94,569 %; dan 103,278 %. Sedangkan % perolehan kembali kadar losartan dalam tablet B masing-masing adalah 95,479 %; 96,038 %; dan 99,783 %.
Kata kunci: losartan; validasi metode; KCKT.
Abstract
Losartan is an antihypertensive drug that should be studied for its bioequivalence. A valid method is needed to bioequivalence study. For this purpose, the method of losartan determination in human plasma was studied. The chosen method was High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using an isocratic elution on reversed phase HPLC with multiplayerchip detection at a single wavelength Uv (220 nm) with the addition standard method. Separation was achieved on a C-18 reversed phase column and the mobile phase consisted of 60 % acetonitrile and 40 % phosphate buffer (adjusted to pH 2. 4 with ortho phosphoric acid). The result showed that the method was linear (r = 0,998 over the range 5 – 30 μg/mL). The lower limit of quantitation was 6.082 µg/m whereas the limit of detection was 1.825 µg/mL. The precision study showed that coefficient of variation was 2.244 and the acuracy studies showed % recoveries were 1
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
85.639; 94.569; and 103.278 %. The determination of % recoveries losartan concentration from the tablet were 95,479; 96,038; and 99,783 % respectively.
Keywords: Losartan; Validation method; HPLC.
dicermati adanya metabolit dari obat
Pendahuluan Salah satu obat yang diwajibkan
induk, yang mempunyai struktur kimia
untuk diselidiki bioekivalensinya adalah
yang mirip dengan obat induk sehingga
losartan. Losartan merupakan obat
sukar
golongan
diperlukan
antihipertensi
yang
membedakannya. metode
yang
Maka, akurat,
mempunyai kerja terapetik sebagai
selektivitas tinggi sampai tingkat bagian
angiotensin II reseptor blocker yang
per juta (bpj), dan gangguan yang
bekerja
harus
sesedikit mungkin dari zat pengganggu.
agar
Salah satu cara yang banyak digunakan
memenuhi standar efikasi, keamanan,
adalah kromatografi cair kinerja tinggi
dan standar mutu yang dibutuhkan
(KCKT)
(Badan POM, 2004).
mendeteksi dan menetapkan kadar,
sistemik
dilakukan
uji
sehingga bioavaibilitas
karena
selain
mampu
juga mampu melakukan pemisahan Sebelum dilakukan analisis secara
(Hadjar, 2007).
in vivo maka terlebih dahulu dilakukan Dalam
analisis dengan menggunakan sampel
prosedur
validasi
darah secara in vitro sebagai langkah
terdapat beberapa parameter yang
awal
untuk
mengetahui
validitas
dievaluasi antara lain akurasi, presisi,
digunakan.
Validasi
selektivitas, batas deteksi (limit of
losartan
detection), kelinearan batas deteksi,
metode
yang
metode
penetapan
kadar
dengan metode KCKT perlu dilakukan
kelinearan.
Dari
hasil
analisis
karena metode analisis losartan belum
selanjutnya diolah untuk memperoleh
tercantum dalam Farmakope Indonesia
nilai rataan, standar deviasi, persen
Edisi III.
standar deviasi relatif, dan perolehan kembali. Kriteria penerimaan untuk Dalam
menggunakan
analisis cairan
biologi
dengan
persen standar deviasi relatif adalah ≤
perlu
2,0 % (Snyder et al, 1997).
2
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
tertentu fase gerak yang telah dibuat
Metode Penelitian
untuk mendapatkan konsentrasi
100
Bahan: tablet Losartan paten µg/mL.
merk B; Losartan baku pembanding dari PT. Kalbe Farma; asam ortho fosfat pro
c.
analisis (Merck®); asetonitril pro HPLC
keseluruhan
yang
(Merck®); Membran filter 0,40-0,45 µm;
antikoagulan
dimasukkan
metanol
tabung sentrifuge dan divortek 30 detik,
pro
analisis
(Bratachem);
Pembuatan
plasma:
Darah
telah
diberi kedalam
aquabidestilata (Otsuka®), dan plasma
kemudian disentrifuge selama
manusia diambil di klinik UMP.
menit. Supernatan diambil, dimasukkan
15
ke tabung sentrifuge. Setiap 1 ml Alat:
seperangkat
alat supernatan ditambah 5 mL asam
kromatografi KCKT (Shimadzu LC- 10); trikloroasetat 10 %, lalu divortek selama ultrasonic batch (Bronson 1510); pompa 15 menit, dan diambil supernatannya vakum;
vakum
filter
0,45
µm; untuk analisis sampel plasma.
mikrosiringe 100 µm; kolom sim-pack C18; detektor uv 220 nm; alat-alat gelas
d. Pembuatan blangko: Sampel plasma
yang dipakai dalam laboratorium Kimia
diambil 0,5 mL dimasukkan ke dalam
Analisis, neraca analitik (®Shimadzu
tabung
A
mikro
kemudian
ditambah
asetonitril 1 mL, divortex selama 1
Y 220), pH meter (methrom 774).
menit, disentrifuge selama 5 menit Cara Kerja dengan kecepatan 14.000 rpm. 1. Pembuatan Berbagai Larutan e. Pembuatan larutan losartan baku a. Fase gerak campuran asam fosfat
dalam plasma: Larutan stok losartan
0,015 M: asetonitril (40:60 v/v): 4 mL
baku diencerkan dengan fase gerak
asam fosfat 0,015 M dicampur dengan
hingga didapat konsentrasi 5,0; 10,0;
asetonitril 6 mL
15,0;
kemudian disaring
20,0; 25,0; 30 µg/mL untuk
dengan filter berukuran 0,45 µm, cek
pembuatan kurva baku, dan 20 µg/mL,
pH 2,4.
60 µg/mL, dan 100 µg/mL untuk penentuan
b. Larutan stok losartan baku: Losartan
presisi
dan
akurasi.
Kemudian, sebanyak 0,5 mL masing-
ditimbang sesuai perhitungan kadar,
masing
kemudian dilarutkan dalam sejumlah
3
konsentrasi
tersebut
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
ditambahkan ke dalam 0,5 mL sampel
Laju alir
: 1 mL/menit
Volume injeksi
: 20 µL
plasma dalam tabung mikro, ditambah asetonitril 1 mL, dan diperlakukan sama seperti blangko.
3. Validasi Metode Analisis
f. Pembuatan larutan losartan sampel
a. Pembuatan kurva baku: larutan
dalam plasma: Sepuluh tablet yang
blangko, larutan losartan baku dalam
memenuhi persyaratan keseragaman
plasma dengan konsentrasi 5,0; 10,0;
bobot tablet digerus hingga halus dan
15,0; 20,0; 25,0; 30,0 µg/mL masing-
homogen. Serbuk yang setara dengan
masing disuntikkan ke KCKT sesuai
10 mg losartan ditimbang seksama,
dengan kondisi yang telah ditetapkan.
dilarutkan dalam 100 mL fase gerak.
Waktu retensi dan luas area ditentukan,
Larutan disonikasi dan disaring dengan
dilakukan pengulangan sebanyak 6 kali.
saringan berpori 0,45 µm. Selanjutnya,
Dari data tersebut kemudian dicari
diencerkan dengan fase gerak sampai
linearitasnya.
didapatkan konsentrasi 5,0; 15,0; dan
b. Penentuan batas deteksi dan batas
25,0 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL masingmasing
konsentrasi
kuantitasi: Batas deteksi dan kuantitasi
tersebut
dari metode penetapan kadar losartan
ditambahkan ke dalam 0,5 mL sampel
dengan metode KCKT dapat dihitung
plasma dalam tabung mikro, ditambah
secara statistik melalui garis linear dari
asetonitril 1 mL, dan diperlakukan sama kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan seperti blangko.
sama dengan nilai b pada garis linear Y = aX + b.
2. Penentuan Kondisi Analisis Optimum
c. Penentuan selektivitas: waktu retensi
Kondisi analisis optimum dibuat berdasarkan percobaan yang telah
analit
sampel
dilakukan, yaitu:
kromatogram
(losartan)
dibandingkan
dari dengan
waktu retensi baku eksternal. Pada Spesifikasi Kolom : sim-pack C-18 kromatogram tidak boleh ada gangguan Detektor
: UV 220 nm
Fase gerak
: asam fosfat 0,015
yang dapat dilihat dari kromatogram larutan blangko.
M: asetonitril (40:60 %)
4
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
d. Uji presisi: Larutan baku losartan 15,0 µg/mL
dalam
plasma
% recovery = C2-C1/ C* X 100 %
disuntikkan Keterangan: C1 = kadar blangko
sebanyak 20 μL ke KCKT, dicatat luas area
dan
waktu
retensi,
C2 = kadar sampel
diulang
sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung C* = kadar sebenarnya persentase koefisien variasinya. f. Penetapan Kadar Tablet Losartan: Penyiapan sampel untuk penetapan Larutan losartan sampel dalam plasma kadar, kemudian diperlakukan sama
dengan konsentrasi 5,0; 15,0; dan 25,0
seperti blangko dan di injeksikan ke
µg/mL
KCKT sebanyak 20 µL dan dicatat hasil yang
diperoleh.
Analisis
yang
sebelumnya
sudah
disiapkan, masing-masing disuntikkan
sampel
ke alat KCKT sebanyak 20 µL, kemudian
dilakukan dengan pembuatan larutan
ditentukan % recovery dengan cara
konsentrasi 20; 60; dan 100 µg/mL yang sama seperti di atas. masing-masing sebanyak 6 replikasi. Hasil dan Pembahasan e. Uji akurasi: Uji ini dilakukan dengan dihitung
Kondisi yang digunakan pada
persentase
analisis losartan dalam plasma adalah
recovery dari selisih plasma yang
dengan menggunakan fase gerak asam
ditambah dengan plasma blangko, dan
fosfat 0,015 M: asetonitril (40:60 %) dan
ditentukan persen kesalahannya.
pelarut yang digunakan adalah fase
metode dengan
adisi.
Ketepatan
menghitung
gerak. Detektor yang digunakan adalah Uji recovery dilakukan dengan
detektor UV pada panjang gelombang
menggunakan tiga konsentrasi baku
210 nm, laju alir 1 ml/menit dan volume
losartan dalam plasma yaitu 20; 60; 100 injeksi 20 µL µg/mL yang sebelumnya telah dibuat. Penentuan
Masing-masing disuntikkan ke alat KCKT
waktu
retensi
losartan dalam fase gerak pada kondisi
sebanyak 20 µL.
terpilih Selisih kadar sampel dan blangko digunakan untuk menentukan recovery. yaitu dengan rumus sebagai berikut:
5
adalah
sebagai
berikut.
PHARMACY,, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
Gambar 1. Kromatogram blangko
Gambar 2. Kromatogram baku konsentrasi 15 µg/mL
6
PHARMACY,, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
Gambar 3. Kromatogram sampel konsentrasi 15 µg/mL Validasi Metode Analisis Losartan dalam
adalah y = 83003,549 x + 55192,733
Plasma
dengan koefisien korelasi 0,998.
a. Linearitas (Linearity)
Harga (r) bisa diterima karena (r) tabel < (r)) hitung yaitu 0,811 < 0,998 sehingga
Persamaan garis yang diperoleh dari perhitungan
statistik
regresi
memenuhi
linear
uji
linearitas.
(y X 10 5) 30
L
25
u
20
a s
15 10 5 0 5
10
20
15
25
Konsentrasi losartan standar ( µg/mL)
Gambar 4 Kurva hubungan konsentrasi losartan (μg/mL) g/mL) dan luas area
7
3 0
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
b. Batas Deteksi (Limit of Detection:
mampu memberikan hasil yang akurat
LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit of
karena memberikan % recovery yang
Quantity: LOQ)
dapat diterima (80% - 120%).
Berdasarkan
perhitungan
statistik
terhadap kurva baku, didapatkan nilai f. Penetapan Kadar Losartan dalam LOD = 1,825 µg/mL dan nilai LOQ = Plasma secara In Vitro 6,082 µg/mL. Dari hasil uji keseragaman bobot c. Ketelitian (precision) Dari
diperoleh penyimpangan bobot rata-
hasil
perhitungan
ratanya sebesar 1,129 %. Dari hasil
didapatkan nilai standar deviasi (SD) =
tersebut dapat dikatakan keseragaman
0,011, dan koevisien variasi = 2,244 %.
bobotnya baik dan dapat digunakan
Sedangkan untuk nilai ketelitian alat
untuk analisis penetapan kadar tablet
sebesar 99,977 %. Pada ketentuan,
losartan.
kriteria seksama diberikan jika metode Pada penetapan kadar losartan memberikan
koefisien
variasi
(KV) dalam plasma secara in vitro, nilai
konsentrasi analit pada tingkat satu per perolehan kembali pada konsentrasi 5 sejuta (ppm) ≤ 3 %. Dengan demikian µg/m adalah 95,479%, pada konsentrasi maka uji ketelitian analisis losartan 15
µg/mL
96,038%,
dan
pada
dalam plasma memenuhi kriteria uji konsentrasi 25% adalah 99,783 %. Hasil presisi.
rata-rata % kadar diperoleh kadar yang baik
d. Ketepatan (Accuracy)
karena
konsentrasi Nilai
perolehan
kembali
dari
masing-masing
penyimpangannya
tidak
untuk lebih dari 20 % dari batas yang
konsentrasi 5 μg/mL adalah 85,639 %, ditetapkan.
untuk konsentrasi 15 μg/mL adalah 94,562 %, dan untuk konsentrasi 25 μg/mL adalah 103,278 %. Hal ini menunjukkan bahwa metode analisis penetapan
kadar
losartan
yang
ditambah plasma darah secara KCKT ini
8
PHARMACY, Vol.06 No. 01 Agustus 2011
ISSN 1693-3591
Snyder, L.R, Joseph, K., & Josephl, G. 1997. Practical HPLC Method Development Second Edition. New York USA: John and Wiley & Sons.
Kesimpulan Metode analisis tablet losartan dalam cairan biologis secara in vitro dengan metode KCKT fase terbalik ini valid karena hasil uji linearitas, uji selektivitas, LOD, LOQ, uji presisi, dan uji akurasi memenuhi syarat yang telah ditetapkan.
Hasil
penetapan
kadar
losartan tablet merk B dalam plasma secara in vitro menggunakan metode ini juga memenuhi persyaratan perolehan kembali yang ditentukan yaitu antara 80-120 %. Daftar Pustaka Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2004. Pedoman Uji Bioekivalensi. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. Hlm. 14. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Farmakope Indonesia Ed. III. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hadjar, M.M.I. 2007. Teknik analisis Obat dalam Cairan Biologis dengan GLC dan HPLC. Yogyakarta: Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada.
9
