Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra fyziky a fyzikální chemie

Oligosacharidy hyaluronanu a jejich biologická funkce Diplomová práce

Bc. Barbora Kučerová

. Vedoucí diplomové práce: Doc. Ing. Alice Lázníčková, CSc.

Hradec Králové

2009/2010

Ráda bych poděkovala své školitelce Doc. Alici Lázníčkové

za odborné

vedení, velkou trpělivost a ochotnou pomoc a spolupráci při vypracovávání diplomové práce.

-2-

PROHLÁŠENÍ

„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.“

-3-

Obsah

Abstrakt.................................................................................................................... 6 Abstract.................................................................................................................... 7 1. Úvod.....................................................................................................................8 2. Hyaluronan.......................................................................................................... 10 2.1. Chemická struktura................................................................................................. 10 2.2. Struktura v roztoku................................................................................................. 10 2.3. Polymerová struktura.............................................................................................. 11 2.4. Výskyt a význam HA organizmu........................................................................... 11 2.5. Biologická aktivita spojena s různou molekulovou hmotností HA....................... 12

3. Příprava a izolace hyaluronanových oligosacharidů...................................... 14 3.1. Degradace hyaluronanu.......................................................................................... 14 3.1.1. Štěpení HA volnými radikály..................................................................... 14 3.1.2. Štěpení HA za pomoci ultrazvukových vln................................................ 14 3.1.3. Štěpení HA hyaluronidázami......................................................................14 3.2. Metody separace a purifikace hyaluronanových oligosacharidů............................ 16 3.2.1. Gelová permeační chromatografie............................................................. 16 3.2.2. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie.................................................16 3.2.3. Separace radioaktivně značených oligosacharidů polyakrylamidovou gelovou elektroforézou............................................................................... 17

4. Metody analýzy a charakteristika oligosacharidů hyaluronanu.................... 19 4.1. Kapilární elektroforéza (CE)..................................................................................19 4.2. Fluorofory podporovaná elektroforéza sacharidů.................................................. 20 4.3. Analýza HA oligomerů hmotnostní spektrometrií ve spojení s ionizací elektrosprejem........................................................................................................ 22 4.4. Analýza oligomerů HA hmotnostní spektrometrií ve spojení s MALDI...............23 4.5. Spektroskopie nukleární magnetické rezonance.................................................... 24

5. Biodegradace hyaluronanu a s ní spojené signální molekuly......................... 26 5.1. Příjem HA buňkami za účasti receptoru CD44......................................................26 5.1.1. Struktura receptoru CD44 a jeho izoformy................................................26 5.1.2. Regulace pohlcování HA za účasti CD44..................................................28

-4-

5.2. Představení receptoru RHAMM............................................................................. 28 5.3. Obrat hyaluronanu v oběhu.................................................................................... 28 5.3.1. HA receptor pro endocytózu....................................................................... 29 5.3.2. Endoteliální HA receptor pro lymfatické cévy .......................................... 29 5.4. Degradace hyaluronanu hyaluronidázami................................................................30 5.4.1. Somatická hyaluronidáza navázaná na buněčném povrchu (HYAL2)....... 31 5.4.2. Sérová a lysozomální hyaluronidáza (HYAL1)......................................... 32 5.4.3. HYAL3....................................................................................................... 32 5.4.4. Testikulární hyaluronidáza (PH-20)........................................................... 33

6. Oligosacharidy hyaluronanu a jejich funkce při nádorovém bujení............. 34 6.1. Funkce CD44 během tumorgeneze........................................................................ 34 6.2. Oligosacharidy HA a rakovina kostí...................................................................... 36

7. Hyaluronanové oligosacharidy a jejich účinky na chondrocyty.................... 40 8. Účinky hyaluronanových fragmentů na syntézu hladkého kosterního svalstva............................................................................................................... 44 9. Hyaluronanové oligosacharidy a jejich působení na angiogenezi.................. 48 10. Souhrn................................................................................................................ 51 Seznam zkratek....................................................................................................... 53 Použitá literatura.................................................................................................... 55

-5-

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra fyziky a fyzikální chemie

Kandidát: Bc. Barbora Kučerová Školitel: Doc. Ing. Alice Lázníčková, CSc. Název diplomové práce: Oligosacharidy hyaluronanu a jejich biologická funkce

Ve své kompilační diplomové práci shromažďuji informace o oligosacharidech hyaluronanu. Přestože se hyaluronan v těle nachází většinou v dlouhých řetězcích, můžeme ho zde nalézt i ve formě malých fragmentů – oligosacharidů. Tyto oligosacharidy vykazují jiné vlastnosti než hyaluronanové polymery. Oligosacharidy hyaluronanu lze v laboratoři připravovat, separovat a analyzovat různými metodami. Velké molekuly lze rozbít na fragmenty chemickými, fyzikálními či enzymatickými způsoby. K následné separaci a purifikaci se využívají především chromatografické metody. Pro konečnou analýzu se jako nejvhodnější ukázaly elektroforetické metody či hmotnostní spektrometrie. V těle probíhá neustálý metabolizmus hyaluronanu. Syntézy se účastní hyaluronan syntáza a pro člověka důležitou biodegradaci obstarává několik druhů hyaluronidáz. Na interakci hyaluronanu s buňkami se podílí různé receptory. Specifický receptor pro hyaluronan je CD44, který váže jak velké polymery, tak oligosacharidy o více než čtyřech jednotkách. V těle jsou však přítomny i další receptory důležité pro obrat fragmentů hyaluronanu v oběhu. Oligosacharidy zatím nedostatečně objasněným mechanizmem ovlivňují tumorgenezi. Přestože u některých druhů nádorových buněk podporují migraci, u jiných inhibují migraci i proliferaci. Nejúčinnější léčebné efekty byly prokázány u oktasacharidů. Dalším důležitým místem působení oligosacharidů HA jsou chrupavky či hladké svalstvo. Důležitá je jejich účast během procesu angiogeneze, kterou stimulují.

-6-

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biophysic and Physical Chemistry

Candidate: Bc. Barbora Kučerová Supervisor: Doc. Ing. Alice Lázníčková, CSc. Title of diploma thesis: Hyaluronan oligosaccharides and their biological function

In my diploma thesis I compile informations about hyaluronan oligosaccharides. Although hyaluronan is in the body found mostly in a form of long chains, we can find it also as small fragments – the oligosaccharides. The oligosaccharides embody different properties than hyaluronan polymers. Hyaluronan oligosaccharides can be synthetised, separated and analysed in laborarory in a variety of ways. Large molecules can be broken into fragments chemically, physically or enzymatically. For thein subsequent separation and purification especially chromatographic methods are used. As the most suitable methods for their final analysis electrophoretic techniques or mass spectrometry were shown. Continous metabolism of hyaluronan proceeds inside the body . Hyaluronan synthase takes a part in synthesis, and the biodegradation important for human is supplyed by several hyaluronidases. Interaction of hyaluronan with cells is mediated by several receptors. Specific receptor for hyaluronan is CD44, which can bind either large polymers and oligosaccharides bigger then 4-mers. Another receptors important for the body turnover of hyaluronan are present in the system. Oligosaccharides influence tumorgenesis throuhgh yet unexplained mechanism. In some species of tumor cells it promote migration, in other inhibits migration and proliferation. Octasaccharides were shown to have the most effective treatment result. Another important site of HA oligosacharides action is cartilage or smooth muscle. Important is also their presence during angiogenesis. HA oligos stimulate it.

-7-

1. Úvod Hyaluronová kyselina je přirozenou součástí lidského těla. Lidské tělo o hmotnosti 70 kg obsahuje přibližně 15 g této látky, přičemž je neustále obnovována. Navzdory jednoduché primární struktuře vykazuje velmi rozdílné biologické účinky v závislosti na velikosti molekuly a jejím prostorovém uspořádání. Tvoří jednu z hlavních složek mezibuněčné hmoty. Je součástí pojivových, epiteliálních a nervových tkání. Ve velkém množství se nachází v očním sklivci, synoviální tekutině a díky své schopnosti na sebe vázat vodu zajišťuje dokonalou hydrataci pokožky a tkáně. Díky jejímu přirozenému výskytu v těle a nezbytné přítomnosti při určitých funkcích (např. pohyb kloubního aparátu) nachází mnohostranné uplatnění ve farmaceutickém průmyslu a především v medicíně. Hyaluronovou kyselinu poprvé izolovali Karl Meyer s kolegou Johnem Palmerem roku 1934 jako neznámou chemickou substanci ze sklivce kravského oka. Zjistili, že se tato sloučenina skládá ze dvou cukerných molekul, z nichž jedna byla uronová kyselina. Pro zjednodušení poté navrhli název hyaluronová kyselina, kde je první část názvu odvozena od řeckého slova „hyalos“, které znamená sklo. Hyaluronan byl poprvé komerčně využit roku 1942, když Endre Balazs zažádal o udělení patentu k užití této substance k náhradě vaječného bílku v pekařských produktech. U lidí se hyaluronan poprvé léčebně použil až ke konci padesátých let 20. století v oční chirurgii k náhradě sklivce. Používaný hyaluronan (HA) byl z počátku izolován z lidské pupeční šňůry a krátce na to i z hřebenu kohouta (Meyer and Palmer, 1934). Chemická struktura HA byla vyřešena během padesátých let Karlem Meyerem a jeho kolektivem. Nejprve se izolovala jako kyselina, ale za fyziologických podmínek se chovala spíše jako sůl – hyaluronát sodný. Termín hyaluronan byl představen v roce 1986, aby souhlasil s mezinárodním názvoslovím polysacharidů. HA byl postupně izolován z mnoha dalších zdrojů a jeho biologická role byla zkoumána v početných laboratořích. Hyaluronan je průběžně syntetizován a vylučován fibroblasty, keratinocyty, chondrocyty a dalšími specializovanými buňkami v těle. Stupeň syntézy se liší podle druhů tkáně. Nejvíce HA vzniká v kůži a v chrupavkách. Velikost izolovaných molekul z různých přírodních zdrojů je velmi heterogenní. Nejprve se hyaluronanu přisuzovala pouze strukturální či fyzikální funkce. Nyní již víme, že HA funguje i jako farmakologicky aktivní signální molekula.

-8-

Přestože má hyaluronan jednoduchou strukturu, ovlivňuje celou řadu buněčných funkcí, jakými jsou například buněčná migrace, diferenciace a fagocytóza. Pro jeho účinky hraje důležitou roli velikost molekuly. Některé buňky reagují pouze na přítomnost oligosacharidů. Oligosacharidy jsou složené z několika (2 až 10) monosacharidových podjednotek. Například angiogeneze je stimulována pouze malými fragmenty HA, stejně jako vystavování genů při odpovědi aktivovaných makrofágů. Malé fragmenty stimulují signální kaskády v cílových buňkách přes specifické povrchové receptory. Proto mají velké a malé molekuly hyaluronanu rozdílné fyziologické funkce. Cílem mé diplomové práce je popsat biologický význam malých hyaluronanových fragmentů – HA oligosacharidů, dále jejich přípravu, izolaci a metody analýzy.

-9-

2. Hyaluronan 2.1. Chemická struktura Hyaluronová kyselina je nevětvený glykosaminoglykan o vysoké molekulové hmotnosti, který se skládá z opakujících se disacharidových jednotek – (1→3)-β-Dglukuronové kyseliny a (1→4)-β-N-acetyl-D-glukosaminu – v poměru 1:1. Narozdíl od jiných glykosaminoglykanů obsažených v mezibuněčné hmotě (např. heparin, chondroitin) není sulfatován. V těle se za fyziologických podmínek vyskytuje ve formě sodné soli – viz. obr.1.

Obr. 1 – struktura hyaluronanu – opakující se disacharidová jednotka – oligosacharid o 4 jednotkách (http://www.cosmobio.co.jp/export_e/products/proteins_and_peptides/products_csr_ 20090914.asp?entry_id=5710 –11.1.2010)

Obě cukerné složky vycházejí prostorově z glukózy, která ve své beta konfiguraci umožňuje velkým skupinám (např. hydroxyly) být ve výhodnějším postavení ekvatoriální roviny, zatímco ostatní vodíkové atomy zabírají méně prostorově příznivé axiální pozice. Díky tomuto uspořádání je struktura tohoto disacharidu energeticky velice stabilní. Velikost jeho řetězců se pohybuje v rozmezí od 5-ti tisíc do 20-ti milionů daltonů. Průměrná molekulová hmotnost hyaluronanu obsaženého v synoviální tekutině je 3-4 MDa. Hmotnost HA, který je přítomen v pupeční šňůře, je 3,14 MDa (Nečas et al., 2008).

2.2. Struktura v roztoku Ve fyziologickém roztoku je páteř hyaluronanové molekuly vyztužena kombinacemi chemických

struktur

disacharidů,

vnitřními

vodíkovými

vazbami

a

interakcemi

s rozpouštědlem. Vodíkové atomy v axiálním postavení mají nepolární, relativně hydrofóbní povrch. Postranní ekvatoriální řetězce formují polární, hydrofilní povrch a tím vytvářejí stuhovité zakroucení struktury.

- 10 -

Hyaluronanový roztok je mimořádně vazký a velice hydrofilní. Polymerové řetězce zaujímají rozbalenou nahodilou spirálu. Tyto řetězce se pak mezi sebou zaplétají, což pak může působit neobvyklé reologické vlastnosti. Roztok o vyšší koncentraci je extrémně viskózní. 1 % roztok je jako rosol, ale pokud je na něj vyvinut tlak, pohybuje se velice snadno a může být vpravován tenkou jehlou. Díky tomu se nazývá „pseudo-plastický“ materiál. Mimořádné reologické vlastnosti roztoku hyaluronanu z něj dělají ideální lubrikant. Tyto extrémní lubrikační vlastnosti se využívají při postoperační péči u ortopedických a abdominálních zákroků. Již zmíněné spirálovité uspořádání polymeru může být přisuzováno vodíkovým vazbám mezi hydroxylovými skupinami podél řetězce.

2.3. Polymerová struktura Lineární polymer opakujících se disacharidových jednotek syntetizuje enzym hyaluronan syntáza tak, že střídavě přidává glukuronovou kyselinu a N-acetylglukosamin k rostoucímu řetězci. Přitom využívá jejich aktivované nukleotidové sacharidy – UDPglukuronovou kdyselinu a UDP-N-acetylglukosamin – jako substráty. Počet opakujících se jednotek v kompletní molekule HA může dosáhnout více než 10 000, což odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 4 miliony Da (každý disacharid dosahuje přibližně 400 Da). Průměrná délka disacharidu je 1 nm a šířka odpovídá přibližně průměru lidského erytrocytu (Cowman and Matsuoka, 2005).

2.4. Výskyt a význam HA organizmu Hyaluronan se v lidském těle vyskytuje především v extracelulární a perinukleární matrix. Největší objem HA se nachází v synoviální tekutině, pupeční šňůře a ve sklivci oka. Téměř polovina tělesného HA se vyskytuje v kůži, kde je umístěn v intracelulárním prostoru a jeho množství může dosáhnout až 2,5 g/l. Jeho důležitá role zde spočívá ve schopnosti imobilizovat vodu ve tkáních a tím měnit kožní objem a pružnost. Může také ovlivnit buněčnou proliferaci, diferenciaci a tkáňovou reparaci. Jeho důležitost v pokožce zdůrazňují změny pozorované se stárnutím, hojením ran a degenerativními chorobami. Kůže, která je největším tělesným orgánem, představuje primární ochranou bariéru mezi podkožními tkáněmi a nepříznivými vlivy okolního prostředí. HA zde funguje jako zhášeč volných radikálů, které jsou tvořeny ultrafialovými paprsky slunečního záření. Ultrafialové

- 11 -

světlo způsobuje oxidační stres působící na buňky. Ten může zapříčinit zničení genetického materiálu uloženého uvnitř buněk a tím vést k degenerativním změnám či buněčné smrti. Přestože chrupavky obsahují relativně malé množství HA, je zde důležitou strukturní jednotkou matrix. Tvoří sběrné centrum pro chondroitinové sulfatované proteoglykany, které udržují jeho vysokomolekulární uspořádání vůči specifickým HA-proteinovým interakcím. Tyto agregáty pak mají obrovskou molekulovou hmotnost přesahující 100 MDa a jsou začleněny do struktury kolagenu. V synoviální tekutině poskytuje vysokomolekulární HA nezbytné promazávání kloubů a slouží jako tlumič nárazů. Dále také redukuje tření pohybujících se kostí, a tím snižuje opotřebovávání kloubních spojů. Při zánětlivém procesu u artritických onemocnění, jakými jsou například osteoartritida či revmatoidní artritida, je vysokomolekulární HA degradován působením reaktivního kyslíku. Reaktivní kyslík snižuje jeho vazkost a narušuje promazávací a otřes tlumící vlastnosti, což vede ke zhoršování pohybu kloubů a bolesti. Nejprve se usuzovalo, že hlavní význam HA je sloužit jako inertní molekulární výplň pojivové tkáně. Pozdější výzkumy a studie HA-vázajících proteinů a specifických receptorů ukázaly, že hyaluronan zprostředkovává mnoho dalších funkčních činností. K dalším funkčním oblastem se řadí embryogeneze či přenos signálu a pohyb buňky. Je také spojován s invazivností karcinomu a metastáz (Kogan, 2006).

2.5. Biologická aktivita spojena s různou molekulovou hmotností HA Navzdory jeho uniformitě a jednoduché primární struktuře, molekuly hyaluronanu mají široké využití a často antagonistickou biologickou funkci v závislosti na velikosti molekuly. Velké matrixové polymery vyplňují volné prostory, působí antiangiogenicky a imunosupresivně. Středně velké polymery v rozmezí 25-50 disacharidových jednotek mají prozánětlivé účinky, jsou imunostimulační a vysoce angiogenní. Menší oligosacharidy se vyznačují antiapoptickými účinky a indukují proteiny tepelného šoku. Tyto nízkomolární oligosacharidy se zdají fungovat jako endogenní výstražné signály. Molekuly o hmotnosti 0,2 MDa zlepšují přežívání periferních eozinofilních krevních buněk. HA o velikosti 3 až 6 MDa již vykazuje jiné účinky. Mechanizmus zahrnuje zvýšenou expresi faktoru stimulujícího granulocyty a makrofágy (GM-CSF – Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor). Tato exprese je částečně inhibována protilátkami CD44. HA také zvyšuje produkci transformujícího růstového faktoru β1 u eozinofilů. Dle vědců může lokální produkce nízkomolekulárního HA přispívat k fibróze dýchacích cest, která je spojena s chronickým astmatem. - 12 -

Nízkomolekulární HA stimuluje produkci metaloelastázy v alveolárních makrofázích u myší a expresi oxidu dusnatého v endoteliálních a Kupfferových buňkách jater u potkanů. V některých případech se ukázalo, že stimulační efekty HA oligosacharidů jsou zprostředkovávány aktivací nukleárního faktoru κB (NFκB). Interleukin (IL) 10 a interferon γ naopak inhibují produkci cytokinů indukovaných nízkomolekulárními fragmenty makrofágů u myších buněk kostní dřeně. Výzkumy a práce vědců naznačují zásadní rozdíly biologické odpovědi na vysokomolekulární (MDa) a nízkomolekulární hyaluronan. V současné době není žádné rozumné vysvětlení pro tyto rozdíly. Oligomery mohou fungovat přes inhibici HAreceptorové interakce bez klastrovních receptorů. Ale je mnohem složitější zjistit, jak velké fragmenty stimulují genovou expresi, když velké molekuly toho schopny nejsou. Je nezbytné identifikovat receptory zahrnuté do této zajímavé biologické odpovědi proto, abychom mohli lépe porozumět jeho prozánětlivým a angiogenickým vlastnostem. Prvním krokem k tomuto porozumění je objasnění role receptoru CD44 a jeho odpovědi na přítomnost HA. Hyaluronan je dostupnou substancí od komerčních dodavatelů, kteří ho poskytují o různých průměrných molekulových hmotnostech. Tyto oligosacharidy mohou být připravovány různými metodikami, které jsou popsány v dalších kapitolách této diplomové práce (Camenisch and McDonald, 2000).

- 13 -

3. Příprava a izolace hyaluronanových oligosacharidů 3.1. Degradace hyaluronanu Hyaluronan může být odbouráván na menší fragmenty chemickými metodami za kyselých či zásaditých podmínek, fyzikálním působením, ultrazvukovými vibracemi, štěpením založeným na volných radikálech nebo enzymatickými metodami.

3.1.1. Štěpení HA volnými radikály Štěpení HA volnými radikály fyziologicky probíhá v pojivových tkáních při stárnutí a artritidě. Hydroxylový radikál se ukázal jako primární faktor v zahájení degradace HA působením nespecifického štěpení glykosidické vazby. Čím vyšší je koncentrace volných radikálů, tím více se snižuje molekulová hmotnost původní molekuly.

3.1.2. Štěpení HA za pomoci ultrazvukových vibrací Využití vysokoenergetického ultrazvuku nebo ultrazvukových vibrací je další metodou degradace hyaluronových řetězců. Předběžné studie ukázaly vztah mezi časem působení vibrace, intenzitou a zmenšováním délky řetězce. Po delší době účinku vibrací o stálé intenzitě se molekulová velikost depolymerizovaného HA nemění. Fragmenty produkované po této proceduře pak mají převážně N-acetylglukosamin na redukujícím konci a glukuronovou kyselinu na neredukujícím konci řetězce. Toto zjištění ukazuje na slabší vazby související s N-acetylglukosaminem, které jsou citlivé na ultrazvukové vibrace (Capila and Sasisekharan, 2004).

3.1.3. Štěpení HA hyaluronidázami Nejrozšířenější metodou tvorby HA oligosacharidů je využití hyaluronidázových enzymů. Těchto enzymů jsou nejméně 3 druhy a každý z nich rozkládá řetězec HA jiným mechanizmem. První skupina zahrnuje savčí typ hyaluronidáz – endo-β-N-acetyl-D-hexosaminidázy, které rozkládají vysokomolekulární substráty na tetrasacharidy a hexasacharidy jako hlavní konečné produkty. V mezinárodní enzymové nomenklatuře patří této skupině označení EC 3.2.1.35. Modelovým případem této skupiny je testikulární hyaluronidáza. Ukázalo se, že tento enzym také katalyzuje transglykosylační reakce, při kterých mohou hydrolýzou HA vznikat hexa-, di- a oktasacharidové fragmenty. Dalším zajímavým výsledkem studie bylo

- 14 -

zjištění, že 100 % esterifikovaný hyaluronan nemůže být degradován testikulární hyaluronidázou, zatímco neesterifikovaný nebo jen částečně esterifikovaný HA jí rozložen být může. Tato skutečnost vyjasnila, že celkové zablokování karboxylové skupiny ve struktuře HA může inhibovat aktivitu hyaluronidázy. Z toho vyplývá, že součástí aktivního centra hyaluronidázy je karboxylová skupina (COO-) (Zhong et al, 1993). Do druhé skupiny patří hyáza izolovaná ze slinné žlázy pijavice. Je to endo-β-Dglukuronidáza a je označena kódem EC 3.2.1.36. Působením tohoto enzymu vznikají především tetrasacharidové odštěpky. Enzymy tohoto typu mohou být nalezeny i u měchovců a dalších parazitů. Poslední skupinou jsou bakteriální hyázy (koncentrované hyaluronidázy) s označením EC 4.2.99.1. Nově je této skupině přiřazeno číslo EC 4.2.2.1. Tyto lyázy působí jako Nacetyl-D-hexosaminidázy, které odtrhnou β-eliminací disacharid obsahující glukuronosylové zbytky s dvojnou vazbou mezi uhlíky 4 a 5. Pro dva enzymy produkované streptokoky byla určena i genová sekvence. Tato sekvence je u těchto enzymů z 50 % identická. Byly prokázány i dvě další prokaryotické hyázy, jež nejsou příbuzné s enzymy ze streptokoka. Jedna pochází z Clostridium perfringens a další byla izolována z bakteriofága Streptococcus pyogenes (Kreil, 1999).

Obr. 2 – působení bakteriální hyaluronidázy na HA

Enzymatický rozklad HA se obvykle provádí v pufru z acetátu sodného upraveného kyselinou octovou na pH v rozmezí 4,8 – 6,0. Při těchto hodnotách vykazují enzymy nejvyšší aktivitu. U enzymů savčího druhu se teplota procesu pohybuje obvykle kolem 37° C. U bakteriálních enzymů se ukázalo, že jsou aktivní od 20 až do 60° C. Důležitou veličinu při štěpení enzymy hraje čas. Průměrná velikost výsledných oligosacharidů se s časem mění. Narůstající čas působení enzymů na molekuly vede k většímu podílu fragmentů o malé molekulové hmotnosti. Poté, co byl polymer HA zpracováván enzymem po požadovanou dobu, je další reakce zastavena uvedením natrávené směsi do varu na přibližně 5 minut. Konečná směs pak může být analyzována a fragmenty HA purifikovány za použití různých chromatografických technik (Capila and Sasisekharan, 2004).

- 15 -

3.2. Metody separace a purifikace hyaluronanových oligosacharidů Pro separaci fragmentů HA lze využít několik metod, jakými jsou například gelová permeační chromatografie, iontově-výměnná chromatografie či vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzních fázích.

3.2.1. Gelová permeační chromatografie Při gelové permeační chromatografii (GPC – Gel Permeation Chromatography) neboli vylučovací chromatografii (SEC – Size Exclusion Chromatography) dochází k separaci jednotlivých molekul podle jejich velikosti. Jednotlivé látky jsou rozdělovány mezi pohyblivou část mobilní fáze, která se nachází mezi jednotlivými zrny gelu a nepohyblivou část mobilní fáze, nacházející se uvnitř pórů gelu. Při průchodu kolonou jsou molekuly složek zadržovány v důsledku permeace do rozpouštědlem naplněných pórů. Malé molekuly pronikají hlouběji a mají proto vyšší hodnoty retenčních objemů než větší molekuly (Klouda, 2005). Velikost produktů vymývaných z kolony se liší podle druhu použitého štěpného enzymu. U bakteriálních hyaluronidáz se monitorují fragmenty při vlnové délce 232 nm. U savčích hyaluronidáz jsou fragmenty stanovovány při vlnové délce 206 – 210 nm. V případech, kde pufr obsahuje acetát nebo citrát, se používají vzorky uronové kyseliny a její modifikace, protože acetát i citrát mají v těchto vlnových délkách silné UV pozadí. Oligosacharidy menší velikosti (4 – 16 jednotek) jsou při této metodě dobře rozeznatelné a je tu i menší křížová kontaminace mezi jednotlivými píky. Větší oligosacharidy (nad 18 jednotek) se již projevují směsí fragmentů o velikosti 3 – 8 jednotek uvnitř jednoho píku. Proto je někdy potřeba další analýzy k určení jednotlivých komponent. Tato metoda je velice užitečná při získávání čistých nízkomolekulárních fragmentů HA, které jsou pak využívány v biochemických a krystalografických studiích (Capila and Sasisekharan, 2004).

3.2.2. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High-Performance Liquid Chromatography) využívá jako mobilní fázi kapalinu. O separaci složek vzorku rozhodují nejen interakce mezi vzorkem a stacionární fází, ale velice významně se zde podílí i použitá mobilní fáze. Jsou využitelné různé mechanizmy separace – normální fázové rozdělení, systém reverzních fází, iontová výměna či vymývání podle velikosti (Klouda, 2005).

- 16 -

Na detektory pro HPLC jsou kladeny mimořádné požadavky – musejí být vysoce citlivé, aby byly schopny zachytit látky v roztoku o koncentraci ng až μg na ml, musejí být univerzální, důležitá je i reprodukovatelnost a linearita odezvy. Mezi nejpoužívanější detektory patří pulzní amperometrický detektor (Karlíček a kol., 2005). Pro kvantifikaci HA v biologických tkáních a vzorcích se užívá HPLC na reverzních fázích. Tato metoda byla použita při separaci oligosacharidů vzniklých působením hyaluronidázy ze Streptomyces hyalurolyticus, která je specifická pro hyaluronan. Konečnými produkty jsou tetrasacharidy a hexasacharidy, které je možno rozdělit na obrácených fázích v přítomnosti tetrabutylamoniového iontu, který vytváří s těmito produkty iontový asociát. Produkty se detekují a kvantifikují hodnotami absorbance při vlnové délce 232 nm. Účinnost purifikace oligosacharidů touto metodou je 93 % (Capila and Sasisekharan, 2004).

3.2.3. Separace radioaktivně značených oligosacharidů polyakrylamidovou gelovou elektroforézou Glykosaminoglykanové oligosacharidy mohou vznikat působením chondroitin lyázy nebo testikulární hyaluronidázy na biosynteticky radioznačený dermatan sulfát a hyaluronovou kyselinu. Směs vzniklých fragmentů může být dále rozdělena na série jednotlivých proužků metodou polyakrylamidové gelové elektroforézy. Tyto proužky jsou poté fixovány ledovou kyselinou octovou obsahující 20 % 2,5-difenyloxazolu. Detekce se provádí fluorograficky. Jednotlivé proužky na obrázku č. 3 reprezentují glykany, které se liší ve velikosti jedné disacharidové jednotky. Typické glykosaminoglykany jsou negativně nabité polysacharidy obsahující sulfátové zbytky a jsou kovalentně připojeny k bílkovině. Výjimkou je hyaluronová kyselina, která není sulfatována a není připojena na protein. Tato metoda rozděluje oligosacharidy na základě molekulární velikosti. Rozsah elektroforetické pohyblivosti použitých vzorků koreluje s relativními molekulovými hmotnostmi. Velké fragmenty mají nižší pohyblivost a menší fragmenty naopak vyšší pohyblivost. Výsledkem studie bylo zjištění, že polyakrylamidová gelová elektroforéza může separovat nesulfatované

glykosaminoglykanové oligosacharidy, stejně jako sulfatované

deriváty (Hampson and Gallagher, 1984).

- 17 -

Obr. 3 – výsledek frakcionace oligosacharidů hyaluronové kyseliny gelovou polyakrylamidovou elektroforézou Ve sloupcích 1 – 7 jsou oligosacharidové fragmenty s různou molekulovou hmotností. V prvním sloupci je nejmenší fragment, v sedmém pak největší a tudíž i nejtěžší fragment, který má nízkou elektroforetickou pohyblivost. V posledním sloupci je naznačena elektroforetická separace nefrakcionovaného oligosacharidu hyaluronové kyseliny, ze kterého byly připraveny vzorky 1-7. Elektroforéza probíhala po dobu 3,5 hodiny v prostředí pufru Tris/glycin/EDTA o pH 8,9. Hodnota napětí byla 650 V a 35 mA. Vizualizace je provedena rentgenograficky (Hampson and Gallagher, 1984).

- 18 -

4. Metody analýzy a charakteristika oligosacharidů hyaluronanu 4.1. Kapilární elektroforéza (CE) Princip metody spočívá v migraci elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Elektrické pole se vytváří vkládáním konstantního stejnosměrného napětí mezi elektrody. Vzorek je dávkován do určitého místa tohoto systému. Kationty migrují k zápornému pólu, anionty ke kladnému pólu a neutrální molekuly se nepohybují. Vlivem odlišné rychlosti pohybu složek ve vzorku se v průběhu separace vytvářejí oddělené zóny jednotlivých molekul. Kapilára je naplněna základním elektrolytem, který vede proud. Konce kapiláry jsou ponořeny do zásobníku s elektrolytem, společně s elektrodami z inertního materiálu (například platina). Mezi elektrody se aplikuje vysoké napětí. Malý objem vzorku se dávkuje do konce kapiláry, přičemž kapilára prochází přes detektor. Pro HA se využívá refraktometrický nebo ultrafialový detektor. UV detektor sleduje absorbanci ultrafialového záření při vlnové délce 200 nm. Záznamem je pak elektroforegram, kde poloha píků určuje kvalitu, plocha nebo výška píků kvantitu.

Obr. 4 – schéma zařízení pro kapilární elektroforézu (http://klouda.webpark.cz/mam.htm – 23.2.2010)

Výhodou této analytické metody je rychlost analýzy, vysoké rozlišení separace, kvantitativní stanovení analytů a potřeba malého množství vzorku. Postupy pro stanovení a identifikaci fragmentů hyaluronanu jsou velmi dobře zavedeny. Kapilární elektroforéza v normálním režimu probíhá při neutrálním či bazickém pH a vzorek se aplikuje na anodu a detekuje se na katodě. Negativně nabité molekuly jsou před migrací ven z kapiláry zabezpečeny převládající sílou elektroosmotického toku. Jako - 19 -

elektrolyt se používá fosfát a borát o pH 9 v přítomnosti dodecylsulfátu sodného – SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Při CE v systému reverzních fází se používá jako prostředí kyselý pufr. Vzorek se dávkuje na katodu a detekuje se na anodě. Přístroje pro kapilární elektroforézu jsou vybaveny absorbančním či flourescenčním detektorem.

Při velmi nízkém pH (pH < 3) začínají

silanolové zbytky na stěně kapiláry ztrácet svůj negativní náboj, který má za následek redukci elektroosmotického toku. Převládající sílou separačního procesu se stává pohyblivost iontů. V nepřítomnosti elektroosmotického toku se mohou v kapiláře směrem k detektoru pohybovat pouze anionické molekuly. Tento proces dělá tuto metodu velmi užitečnou pro analýzu kyselých molekul uhlovodíků (Lindhart and Pervin, 1996).

4.2. Fluorofory podporovaná elektroforéza sacharidů Fluorofory podporovaná sacharidová elektroforéza (FACE – fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis) je přímá a citlivá metoda pro určení přítomnosti a relativního množství

jednotlivých

oligosacharidů

ve

směsi.

Terminální

aldehydové

skupiny

oligosacharidů se značí fluorescenčním barvivem a jsou separovány na základě velikosti elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Flourescenční značení není zkresleno délkou oligosacharidového řetězce. Avšak intenzita fluorescence je přímo úměrná relativnímu množství poloviny jednotlivého sacharidu v heterogenní směsi vzorku (Huang et al., 2007). Pro hyaluronanové fragmenty jsou dvě různé procedury, které můžeme pro analýzu využít. V prvním případě se HA oligomery derivatizují 2-aminoakridonem (AMAC) a pohyb v gelu probíhá v přítomnosti borátu. Tato metoda lze použít pro rozlišení hyaluronanových fragmentů o délce dvou až 50 podjednotek. Přestože pohyb oligomerů v gelu je převážně ovlivněn jejich velikostí, u disacharidů až hexasacharidů lze pozorovat odlišnou migraci. Tyto fragmenty vykazují inverzní pohyb. Disacharidy a tetrasacharidy se pohybují pomaleji než hexasacharidy. Pohyb hexasacharidů předstihuje oktasacharidy. Pro delší fragmenty již probíhá rozdělování podle velikosti. Od doby, kdy se k utváření komplexu se sacharidy využívá borát a tím ovlivňuje separaci, vědci předpokládají, že anomální pohyblivost je pravděpodobně výsledkem rozdílné interakce oligosacharidů s borátem v elektroforetickém pufru. Tato metoda se díky vysoké citlivosti využívá ke kvantifikaci a analýze hyaluronanu z chrupavky a také pro analýzu purifikovaných hyaluronanových oligosacharidů (Calabro et al., 2000).

- 20 -

Obr. 5 – FACE analýza hyaluronanu derivatizovaného 2-aminoakridonem V prvním sloupci je směs standardu složená ze tří purifikonaných oligomerů ( HA10, HA 14, HA 18) derivatizovaných 2-aminoakridonem použitých jako žebřík. V gelu jsou označeny relativní pozice nasycených HA oligomerů, které obsahují 1 (HA2), 2 (HA4), 3 (HA6), 4 (HA8), 5 (HA10), 10 (HA20), 15 (HA30), 20 (HA40) a 25 (HA50) disacharidy. (Calabro et al., 2000)

Další metodou, jež byla aplikována na určení HA oligomerů, je FACE zahrnující derivatizaci

nabitým

8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfátem

jako

indikátorem.

Jedná

se

o modifikovanou metodu podle Calabra. Separace využívá neborátový elektroforetický systém. V tomto systému je hlavním faktorem dodatečný negativní náboj každého značeného sacharidu ve spojitosti s hmotností, která ovlivňuje pohyb. Tento náboj umožňuje molekulám interagovat s póry vysoce zesítěného gelu a rozděluje molekuly na základě jejich hmotnosti. Na rozdíl od působení indikátoru AMAC se zde neprojevuje opačný pohyb u menších sacharidů, neboť borát není součástí elektroforetického pufru. Tato metoda se používá k charakterizaci čistoty a velikosti hyaluronanových sacharidů o velikosti 4 až 20 podjednotek (Tawada et al., 2002).

- 21 -

4.3. Analýza HA oligomerů hmotnostní spektrometrií ve spojení s ionizací elektrosprejem Hmotnostní spektrometrie (MS – Mass Spectrometry) je separační technika, která převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotnosti a náboje m/z. Hmotnostní spektrometry pracují v prostředí hlubokého vakua, které brání vzájemným kolizím částic v plynné fázi. Po nasátí vzorku do systému dochází k jeho odpaření, následně je ionizován a unášen do hmotnostního analyzátoru. V analyzátoru se ionty rozdělí na hmotnostním filtru a přecházejí do detektoru, kterým může být Faradayova klec či detektor s konverzní dynodou a fotonásobičem. Výstupem je hmotnostní spektrum (Klouda, 2005).

Obr. 6 – Schéma hmotnostního spektrometru

Existuje mnoho způsobů ionizace. Ionizace elektrosprejem (ESI – Electrosprayionization) patří mezi takzvané měkké ionizační techniky. To znamená, že při ionizaci vznikají protonované molekuly (při záznamu kladných iontů) nebo deprotonované molekuly (při záznamu záporných iontů) a nedochází tak k rozsáhlé fragmentaci jako u tvrdých ionizačních technik. Tato metoda je výhodná pro analýzu oligomerů o menší molekulové hmotnosti. Pro analýzu HA oligomerů purifikovaných aniontově výměnnou chromatografií se užívá ESI-MS v negativním iontovém módu. Pro každý oligomer je charakteristický jiný poměr m/z. U studie hyaluronanových oligomerů je nezbytná kontrola rozsahu napětí pro správnou interpretaci získaných výsledků. Elektrické napětí hraje důležitou roli v akceleraci iontů do hmotnostního analyzátoru. Příliš nízká hodnota napětí vede k nedostatečnému

- 22 -

průtoku iontů do analyzátoru, což má za výsledek nepoužitelné hmotnostní spektrum. Naopak vysoké napětí poskytuje iontům více vnitřní energie během srážení, důsledkem čehož dochází k fragmentaci oligomerů. Náchylnost oligomerů podléhat fragmentaci v určitém rozmezí elektrického napětí je závislé na délce oligomerového řetězce. Pro větší fragmenty o délce 14 – 16 podjednotek je větší pravděpodobnost pro pozorování oligomerů o lichém počtu jednotek (15) v nižším rozsahu napětí. To je důležité mít v paměti, pokud byla zaznamenána přítomnost sacharidů o lichém počtu jednotek ve směsi hyaluronanu natrávené testikulární hyaluronidázou. Toto zjištění je v kontrastu se známou specifitou tohoto enzymu, který může vytvářet pouze sacharidy o sudém počtu jednotek. Přesto v těchto případech byla potvrzena přítomnost lichých oligomerů, která může být výsledkem kontaminace hydrolázové či glukuronidázové aktivity při přípravě enzymů (Mahoney et al, 2001). Přestože fragmentace vede ke složitějšímu hmotnostnímu spektru, může nám poskytnout i důležité informace o pořadí jednotek v sacharidovém řetězci. Proto ESI-MS představuje výhodnou techniku pro charakterizaci nepříliš velkých hyaluronanových oligomerů. Tato metoda poskytuje výhodnou kontrolu a volbu rozpětí elektrického napětí. Výsledky jsou podpořeny i ostatními analytickými metodami.

4.4. Analýza oligomerů HA hmotnostní spektrometrií ve spojení s MALDI MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) je další měkkou ionizační metodou, která na rozdíl od ostatních technik může generovat ionty u látek s vyšší molekulovou hmotností. K ionizaci vzorku laserem je třeba zajistit efektivní a kontrolovatelný přenos energie na vzorek a zároveň zamezit jeho tepelnému rozkladu. Jsou-li molekuly vzorku ionizovány laserem přímo, většinou se štěpí nežádoucím způsobem. Proto se začala používat matrice – látka, jejímž prostřednictvím se ionizační energie laseru přenáší na molekuly vzorku a tím brání jejich štěpení. Ionizace laserem přes matrici umožňuje měřit molekulové hmotnosti více látek v jednom vzorku. Analýza vyžaduje malé množství vzorku a problém nepředstavuje ani pozadí biologických vzorků, jakými jsou například soli či pufrační systémy. Navíc je tato analytická technika velice citlivá. Jako hmotnostní spektrometr se ve spojení s MALDI využívá především TOF (Time Of Flight). Jsou to nejjednodušší a nejrychlejší spektrometry, u kterých je celý vzorek iontů akcelerován najednou a tím se všem iontům dodává stejná energie. Ionty vstupují do evakuované letové trubice o délce 1 až 2 metry. Má-li ion s nižší hmotností stejnou kinetickou energii jako ion s vyšší hmotností, musí pak mít vyšší rychlost. Na konci letové trubice je detektor, na který dopadají ionty postupně od nejlehčích po nejtěžší (Havliš, 1999). - 23 -

MALDI-TOF MS byla využita i k analýze hyaluronanových oligomerů vznikajících z degradace HA hyaluronátovou lyázou. Protože je hyaluronan méně kyselý než ostatní glykosaminoglykany, můžeme najít pozitivní i negativní režim spektra z HA oligomerů. V pozitivním módu můžeme pozorovat píky pouze tetrasacharidových fragmentů. V negativním módu pak nalézáme píky hexa- a oktasacharidů. Negativní režim je pro stanovení HA oligomerů citlivější. Pro studie byl jako matrice použit roztok 2,5-dihydroxybenzoové kyseliny ve vodě obsahující trifluoroctovou kyselinu. Tato matrice však nevykazovala dobré signály a využívala se k charakterizaci oligomerů o počtu 8 – 34 jednotek. Velmi kvalitní spektra poskytla až ko-matrice složená z 2,4,6trihydroxyacetofenolu a citronanu triamonného. V pozitivním spektru se nacházejí převážně směsi kovových sloučenin, jakými jsou například sodné či draselné soli. V negativním módu převažují vodíkové sloučeniny [M–H]-. Následně byla negativní iontová spektra zaznamenána ve většině případů pro jejich jednodušší interpretaci. MALDI-TOF MS je vhodná metoda pro kvalitativní analýzu HA oligosacharidů o širokém rozmezí jejich velikosti. Tato technika nám ale nemůže poskytnout informace pro kvantitativní rozbor (Mahoney et al., 2001).

4.5. Spektroskopie nukleární magnetické rezonance Spektroskopie nukleární magnetické rezonance neboli NMR spektroskopie (Nucler Magnetic Resonance) je fyzikálně-chemická metoda, která využívá reakce atomových jader s magnetickým polem. Atomová jádra některých prvků mají magnetický moment a ve vnějším magnetickém poli se orientují do poloh, kterým odpovídají určité energetické hladiny. Absorpcí elektromagnetického záření v oblasti krátkých rádiových vln dochází k přechodu jádra na vyšší energetické hladiny. Mezi jádra s magnetickým momentem patří ty, která mají lichý počet protonů nebo nukleonů. Z praktického hlediska se jeví jako nejvýznamnější NMR jader o kvantovém čísle ½ (1H). Jádra s větším kvantovým číslem (2H, 17

O) dávají příliš složitá NMR spektra a jsou tedy méně vhodná pro praktickou aplikaci. Mezi

jádra bez magnetického momentu patří například

12

C a

16

O, což zjednodušuje spektra

organických látek. NMR spektroskopie dokázala určit čistotu izolovaných HA oligosacharidů. Nevýhodou této metody je potřeba velkého množství vzorku k získání spektra. Přesto však pomohla nahlédnout na možné konformace, které se u HA oligomerů vyskytují. Tato metoda pomohla také objasnit uspořádání intramolekulárních vodíkových vazeb okolo glykosidické vazby (Capila and Sasisekharan, 2004). - 24 -

Závěrem této kapitoly je důležitost separace, identifikace a analýzy HA fragmentů. Jako nejvhodnější metody pro analýzu se ukázaly kapilární a fluorofory podporovaná elektroforéza. Důležitou je i analýza HA oligomerů hmotnostní spektrometrií ve spojení s různými typy ionizace. V posledních letech narůstá počet fyziologických a biologických funkcí, které jsou hyaluronanu přisuzovány. Navíc hraje roli jako esenciální strukturní součást extracelulární matrix. Jeho biologické účinky se mění s jeho molekulovou hmotností. HA oligomery projevily aktivity, které nelze pozorovat u celých velkých molekul. Pokusy v chemoenzymatické syntéze HA oligosacharidů otevřely možnosti využití těchto fragmentů v léčbě. Dále se také zkoumá používání HA fragmentů ve farmaceutickém průmyslu. Předtím, než však budou moci být využívány v biologických systémech, je důležité potvrdit čistotu a strukturu jednotlivých oligomerů.

- 25 -

5. Biodegradace hyaluronanu a s ní spojené signální molekuly Biodegradace hyaluronanu je stupňovitý proces. V extracelulární matrix (ECM) se nachází

HA

o

vysoké

molekulární

hmotnosti.

Spolu

s dalšími

strukturálními

makromolekulami vytváří mechanickou síť. Z tohoto důvodu musí být nejdříve z této sítě uvolněn a tento uvolněný polymer pak částečně degradován. Následně mohou buňky navázat středně velké řetězce buď receptorově zprostředkovaným mechanizmem, nebo je pohltit endocytózou. Poté jsou řetězce HA shromažďovány v lysozómech, kde jsou hydrolyzovány intracelulární hyaluronidázou na malé oligosacharidové fragmenty. Tyto fragmenty pak mohou být případně rozloženy exoglukosidázou na monosacharidy. Pro hyaluronan bylo na povrchu různých typů buněk identifikováno několik specifických struktur, které můžeme označit jako receptory. Mezi nejlépe popsané a nejlépe charakterizované patří receptor CD44 a receptor RHAMM (Receptor for Hyaluronan Mediated Motility). Oba se zapojují do procesu migrace zánětlivých nádorových buněk, ovlivňují jejich invazivitu, adhezivitu a proliferaci. Dalšími známými receptory jsou LYVE-1 (Lymphatic Vessel Endotelial HA receptor) a HARE (HA Receptor for Endocytosis).

5.1. Příjem HA buňkami za účasti receptoru CD44 V pojivových tkáních nebyly prokázány žádné enzymy umožňující kompletní rozložení HA v extracelulárním prostoru za neutrálního pH. Proto se dlouho usuzovalo, že lokální

katabolizmus

hyaluronanu

probíhá

receptorově-zprostředkovanou

cestou

a intracelulární degradací. CD44, jednoprůchodový transmembránový glykoprotein, který je zodpovědný za kompetitivní navázání a příjem HA, se nachází na leukocytech, endotelu a parenchymálních a epiteliálních buňkách. Kromě funkce receptoru slouží také jako mediátor vyzrávání, adheze a přestupu aktivovaných T-lymfocytů z krevního řečiště do místa zánětu. Koordinuje také signály pro buněčné přežívání a smrt.

5.1.1. Struktura receptoru CD44 a jeho izoformy Molekula CD44 se skládá minimálně ze čtyř funkčních domén – viz. obr. 7. Distální extracelulární doména je složena přibližně ze 100 aminokyselin a je primárně zodpovědná za navázání molekuly HA. Skupina, která je považována za rozhodující při této vazbě, je tvořena argininem v pozicích 41 a 78 a tyrozinem v pozicích 42 a 79.

- 26 -

Extracelulární proximální doména je prvotní místo alternativních vazeb na rozdílných izoformách CD44. Je to také místo pro začleňování glykosaminoglykanových postranních řetězců. Transmembránová doména obsahuje 22 aminokyselin a je zcela typickým příkladem jednoprůchodového glykoproteinu. Výsledky studií naznačují, že přidružené lipidy či připojené membránové bílkoviny interagující s touto doménou mohou ovlivňovat funkční aktivitu CD44. Buněčná kontrola funkcí CD44 je také udržována spojením cytosolického proteinu s intracelulární doménou, jež je složena ze 70-ti aminokyselin.

Obr. 7 – schéma funkčních domén receptoru CD44 (Knudson et al., 2002)

Lidský gen pro CD44 je uložen na krátkém raménku 11. chromozomu. Tento gen sestává z 20-ti exonů. Nejběžnější formou je protein kódovaný exony 1 – 5, 16 – 18 a exonem 20. Tyto formy jsou často označovány jako CD44s. Rozšířené kombinace deseti variant exonů (exony 6 – 14) se účastní alternativního spojování uvnitř extracelulární domény a dávají vzniknout velkému množství variant CD44 receptorů. Bývají nazývány „variabilní“ exony – v1 – v10. Příkladem těchto izoforem může být CD44v10 známý jako gp116, který je exprimován endoteliálními buňkami. CD44v3-10 je prominentní izoformou u keratinocytů. Izoformy jako CD44v6 a CD44v9 jsou selektivně exprimovány maligními buňkami. Některé tyto izoformy zahrnují kombinace různých exonů jako například CD44E, které byly původně izolovány z epiteliálních buněk. Jsou to varianty, jež obsahují různé varianty exonů 8, 9 a 10. Funkce této izoformy není ale zatím zcela popsána. V modelových systémech, kde byla tato funkce testována, se neprojevila schopnost ovlivnění internalizace HA do buňky. - 27 -

Další možnosti alternativního sestřihu nabízí rozdílné využití exonů 19 a 20, které kódují intracelulární doménu. Nejběžnější izoformy CD44 exonu 20 (CD44H) mají za následek expresi typické cytoplazmatické ocasní domény. Je tvořena 70-ti aminokyselinami. Exprese exonu 19 obsahujícího CD44 mRNA vede k translaci CD44 proteinu, který zasahuje do cytosolu pouze třemi aminokyselinami. Je to esenciální izoforma bez funkčního chvostu ve struktuře CD44. Na obrázku číslo 6 je znázorněna jako „tailless CD44“.

5.1.2. Regulace pohlcování HA za účasti CD44 Nárůst exprese receptoru CD44 v důsledku transkripční aktivace je často pozorován po následné expresi prozánětlivých cytokinů. Těmito činiteli mohou být interleukiny – IL 1, tumor nekrotizující faktor alfa (TNFα), nebo růstové faktory – transformující růstový faktor beta (TGF-β), epidermální růstový faktor (EGF). Přestože mnoho buněčných mediátorů zvyšuje expresi receptoru CD44, nadbytek exogenních hyaluronanových oligosacharidů tuto expresi nezvyšuje, ba naopak ji i snižuje (Knudson, 2002).

5.2. Exprese receptoru RHAMM Hyaluronanový receptor pro motilitu je v mezinárodní klasifikaci (Cluster of Differentiation) veden pod označením CD168. Na rozdíl od hlavního HA receptoru CD44 není tak dobře prostudován. Byl popsán jako rozpustná bílkovina, která pozměňuje migrační reakce buněk a která souvisí s HA. Není transmembránovým proteinem, ale je lokalizován na povrchu a uvnitř buňky. Uvnitř buněk je přítomen v různých organelách, jako v jádru, cytosolu, mikrotubulech či centrozómech. Tento protein patří do skupiny hyaladherinů. Vedle buněčné migrace ovlivňuje buněčný cyklus a podporuje novotvorbu cév. Je zmiňován ve spojitosti s tumorgenezí, neboť RHAMM receptory jsou exprimovány lidskými nádorovými buňkami (http://en.wikipedia.org – 20.2.2010).

5.3. Obrat hyaluronanu v oběhu Molekuly hyaluronanu mohou být odbourány lymfatickými žlázami. Velké molekuly jsou nejdříve částečně rozloženy, než opustí matrix. Polymer poté prostupuje do lymfatického systému. Většina HA je využita nebo rozložena lymfatickými tkáněmi. Lymfatické uzliny mohou vychytat 50 až 90 % látky z periferní lymfy. Zbývající HA, který má menší velikost, prochází do krevního oběhu, odkud je rychle eliminován sinusoidálními endoteliálními

- 28 -

buňkami v játrech. Buněčná absorpce je ovlivněna speciálními receptory endoteliálních buněk.

5.3.1. Receptor pro endocytózu HA Sinusoidální endoteliální buňky v játrech a v lymfatických uzlinách vykazují rychlé odbourávání fragmentů HA v ECM. Tyto buňky mají na svém povrchu lokalizovaný receptor pro endocytózu (HARE – HA Receptor for Endocytosis). Pro tento receptor byly popsány dvě izoformy. Jedna má velikost 190 a druhá 315 kDa. Menší izoforma, která byla odvozena z většího prekurzoru proteolýzou, je glykosylována. Zprostředkovává endocytózu při nepřítomnosti větší izoformy. Celkový poměr mezi oběma variantami se mění u různých tkání. V játrech je přítomno více menší izoformy, naproti tomu ve slezině a lymfatických uzlinách se vyskytuje více izoformy větší. Větší receptor má vyšší afinitu pro vysokomolekulární HA, menší izoforma interaguje přednostně s nízkomolekulárním HA. Proto endoteliální buňky různých tkání (játra, slezina, lymfatické uzliny) preferují různě velké molekuly hyaluronanu. Po pohlcení molekuly buňkou prostřednictvím receptoru HARE je hyaluronan dopraven do lysozómu a degradován (Zhou, B. et al., 2000).

5.3.2. Endoteliální HA receptor v lymfatických cévách Primární funkcí lymfatických cév je sbírat prosáknutou plazmu a intersticiální tekutinu a navrátit ji zpět do krevního řečiště. Tento proces zahrnuje také absorpci a degradaci rozpuštěných makromolekul, mezi které patří i hyaluronan. HA prochází neustálou přeměnou, která začíná jeho uvolněním z matrix tkání do aferentních lymfatických žláz, pokračuje degradací během průchodu lymfatickými uzlinami a končí odstraněním přes eferentní lymfatické cévy, které ho dopraví ke konečné hydrolýze v jaterních sinusoidách. Endoteliální receptor HA v lymfatických cévách (LYVE-1 – the Lymphatic Vessel Endothelial HA Receptor) byl identifikován jako hlavní receptor pro HA přítomný na lymfatických buňkách. Je ze 43 % shodný s hlavním receptorem hyaluronanu – CD44. Mimo lymfatické buňky ho můžeme nalézt také na jednotlivých populacích aktivovaných tkáňových makrofágů, v endoteliálních sinusoidálních buňkách jater a v ledvinách.

- 29 -

Obr. 8 – porovnání struktury receptoru LYVE-1 a receptoru CD44 Receptory se skládají z části, která váže hyaluronan, dále z O-glykosylované juxtamembránové domény a cytoplazmatického chvostu (Jackson, 2003).

Receptor LYVE-1 zprostředkovává endocytózu HA ve fibroblastech. Je těžké představit si hlavní roli tohoto receptoru v transportu hyaluronanu, neboť rychlost pohlcování je nižší ve srovnání s absorpcí za účasti receptoru HARE. Je možné, že LYVE-1 funguje jako koreceptor spíše než jako primární receptor v pohlcování HA. V jaterních a sinusoidálních buňkách sleziny je exprimován společně s receptorem pro endocytózu. Proto se LYVE-1 účastní i metabolizmu hyaluronanu v těchto orgánech (Jackson, 2003).

5.4. Degradace hyaluronanu hyaluronidázami Hyaluronan

je

rozkládán

specifickými

glykosylovými

hydrolázami

–

hyaluronidázami. Jsou přítomné v prokaryotních i eukaryotních buňkách. Mají mnoho vlastností, které zahrnují rozdíly ve velikosti, katalytickém mechanizmu, substrátové specificitě, afinitě k inhibitorům a rozmezí pH optimálního působení. Jak již bylo zmíněno v kapitole 3, rozdělujeme hyaluronidázy do třech skupin na základě biochemických reakcí

- 30 -

těchto enzymů a jejich reakčních produktů – savčí typ hyaluronidázy, bakteriální hyaluronidázy a hyaluronidázy z pijavice, dalších parazitů a korýšů. Savčí hyaluronidázy sestávají z endo-β-N-acetyl-D-hexosaminidáz, které štěpí vnitřní β-1,4-glykosidickou vazbu mezi N-acetylglukosaminem a glukuronátem. Konečnými produkty jsou převážně hexasacharidy. Mnohé z těchto enzymů štěpí i 4-S a 6-S chondroitin sulfát a katalyzují transglykosylaci. Největší koncentrace hyaluronidáz u savců se nachází ve varlatech, lysozomech jater a v séru. Hyaluronidázy jsou v lidském genomu kódovány nejméně šesti různými geny. Podle těchto genů je pak můžeme rozdělit do skupin. Tři geny – HYAL1, HYAL2 a HYAL3 – jsou seskupeny na chromozomu 3p21.3. Další tři – HYAL4, pseudogen PHYAL1 a PH20/SPAM1 – jsou na chromozomu 7q31.3. Vyšetření ukázala, že u různých druhů nádorových onemocnění některé z těchto chromozomálních oblastí chybí.

5.4.1. Somatická hyaluronidáza navázaná na buněčném povrchu (HYAL2) HYAL2 je všudypřítomný enzym navázaný na povrchu buněk. Proto se předpokládá jeho hlavní role v katabolizmu hyaluronanu. Výjimkou je mozek dospělého jedince, přestože je bohatý na přítomnost hyaluronanu. Exprese genu je zde pouze v období embryonálního vývoje a krátce po narození. Aktivita lidského HYAL2 je optimální při pH 4. Štěpí vysokomolekulární HA na produkty o hmotnosti přibližně 20 kDa, což odpovídá asi 50-ti disacharidovým jednotkám. HYAL2 je v lysozomech právě tak jako na plazmatické membráně připojen prostřednictvím glykosylfosfatidylinositolové kotvy (GPI-AP – glycosylphosphatidyl-inositol anchored proteins) – viz. obr. 9. To dokazuje, že enzym může být transportován do lysozomů sekrecí a reabsorpcí přes plazmatickou membránu. HYAL2 je považován za příklad extracelulární hyaluronidázu, kterou potřebují somatické buňky, které jsou aktivně zapojeny v procesu hydrolýzy hyaluronanu. Ukazuje se také jeho funkce při remodelaci tkáně. Gen pro HYAL2 často chybí u plicních karcinomů. A naopak může i zabraňovat karcinogenezi u tkáňových štěpů.

- 31 -

Obr. 9 – Glykosylfosfatidylinositolová kotva Kotva se skládá z fosfatidylinositolu (In), glukózy (Gluc), třech molekul manózy (Man) a fosfoetanolaminu (Etn) (http://www.hmds.org.uk/images/gpi.gif - 15.3.2010)

5.4.2. Sérová a lysozomální hyaluronidáza (HYAL1) Aktivita degradující hyaluronan byla pozorována v okyselené lidské plazmě. Koncentrace faktoru je zde velice malá (60ng/ml). Navíc může být detekována i v moči. Při použití monoklonální protilátky proti lidské sérové hyaluronidáze odlišné od hyaluronidázy plazmatické, byly identifikovány dva HYAL1 izoenzymy. HYAL1 je rozsáhle exprimována buňkami na svém povrchu. Enzymová aktivita se projevuje pod hodnotou pH 5,5. Nejprve byla izolována ze séra jako rozpustný enzym. Přesto je to i lysozomální enzym, který štěpí hyaluronan na di- a tetrasacharidy. Další výzkumy ukázaly, že lysozomální onemocnění mukopolysacharidóza IX je způsobena mutantní formou HYAL1. Není jasné, proč je pravděpodobný lysozomální enzym nalézán v cirkulaci či jaká je zde jeho možná funkce. Přesto se enzymu HYAL1 přisuzuje štěpení pohlceného hyaluronanu, když doputuje do organely lysozomu.

5.4.3. HYAL3 O produktech tohoto genu je známo pouze málo informací. Je přítomen v mnoha různých tkáních. Především ho nacházíme ve varlatech, ale detailní biochemické studie nebyly provedeny. Exprese bude pravděpodobně zvýšena spolu s HYAL2 v dělících se chondrocytech. Oba geny jsou aktivovány cytokiny IL-1 a TNF-α (Lepperdinger and Kreil, 2004). - 32 -

5.4.4. Testikulární hyaluronidáza (PH-20) Tento enzym byl identifikován monoklonální protilátkou a ukázalo se, že na něm závisí úspěšnost oplození ve chvíli, kdy spermie prochází do vajíčka přes zona pellucida. Zona pellucida je glykoproteinový obal vajíčka, který je produkován samotným vajíčkem během oogeneze a jeho funkcí je selekce spermií. Její další funkcí je zabránění tzv. polyspermii – jevu kdy je vajíčko oplozeno více než jednou spermií. Výsledek prezentovaný tímto spojením ukazuje, že PH-20 vlastní hyaluronidázovou aktivitu. Protein PH-20 je lokalizován na zadní části povrchu spermie. Byl také popsán jako SPAM1 – Sperm Adhesion Molekule 1. PH-20 je původně syntetizován jako polypeptid s molekulovou hmotností 64 kDa a je vázán k membráně přes GPI-kotvu. Během maturace spermií je část PH-20 rozštěpena na dvě domény – jednu s amino- zakončením o velikosti 41 – 48 kDa a druhou s karboxy- koncem o 27 kDa. Obě domény jsou spojeny disulfidovým můstkem (Gmachl, 1993). Při pokusech, během kterých byl myším odstraněn gen pro PH-20, dochází stále k pronikání spermie do vajíčka. Proto je jasné, že spermie syntetizují další enzym s vlastnostmi srovnatelnými s PH-20. Tato skutečnost může být vysvětlena přítomností HYAL3, který se nalézá ve varlatech. To, jestli může HYAL3 funkčně nahradit PH-20 během interakce se zona pellucida a v intracelulární signalizaci, zatím zůstává předmětem bádání.

- 33 -

6. Oligosacharidy hyaluronanu a jejich funkce při nádorovém bujení Početné studie dokazují, že hyaluronan je nedílnou součástí procesu nádorové progrese. Jeho zvýšená syntéza u různých maligních nádorů vede k navýšení adheze a migrace nádorových buněk. Během progrese nádoru můžeme u pacientů nalézt oligosacharidy ve vzorcích moči, krve či nádorové tkáně. Oligosacharidy jsou zapojeny do procesu angiogeneze, buněčné migrace a proliferace. Tyto funkce jsou odlišné od těch, které vykazují velké polymery hyaluronanu. Oligosacharidy v určitém rozmezí velikosti indukují proteolytické štěpení receptoru CD44 u nádorových buněk a podporují buněčnou migraci prostřednictvím receptoru CD44. Oligosacharidy působí fyziologickou indukci štěpení CD44 in vivo a tím posilují úvahy o jejich možné roli v invazivnosti tumorové tkáně. Navíc množství HA v oběhu může být pomocným ukazatelem průběhu onemocnění. HA oligosacharidy jsou nalézány v těle ve spojitosti s různými fyziologickými i patologickými procesy. V roce 1985 byly zaznamenány a popsány angiogenické vlastnosti HA oligosacharidů o velikosti 8 až 50 jednotek. Byly nazvány „angiogenické oligosacharidy“ (angiogenic oligosaccharides). Oligosacharidy o velikosti 6 až 20 podjednotek podporují migraci a proliferaci endotelových buněk. Výzkumy posledních let ukazují, že molekuly hyaluronanu o různých velikostech mají také rozdílné funkce. Například HA o průměrné molekulární hmotnosti 200 kDa navozuje expresi chemokinů u makrofágů. HA velikosti 6,9 kDa aktivuje integriny nádorových buněk. Molekuly o velmi malé hmotnosti (o 4 – 6-ti jednotkách) indukují expresi cytokinů u dentritických buněk a podporují také jejich dospívání. Dále ovlivňují expresi IL-8 u endoteliálních buněk a zvyšují expresi metaloproteináz tkáňové matrix (MMP – matrix metalloproteinase) u nádorových buněk. Tetrasacharidy navozují expresi bílkovin tepelného šoku. Důležitá je role oligosacharidů u nádorových onemocnění. Například u invazivního onemocnění močového měchýře byla prokázána produkce oligosacharidů o velikosti 20 až 30 jednotek, které indukují a stimulují mitotickou odpověď v endotelových buňkách. Vysoká hladina angiogenických oligosacharidů je také detekována u karcinomů prostaty, Wilmsova tumoru (nefroblastomu) a mesotheliomu.

6.1. Funkce CD44 v průběhu vzniku nádoru CD44 je široce distribuovaná adhezní molekula, která funguje jako povrchový receptor pro komponenty extracelulární matrix. Početné zprávy uvádějí, že receptor CD44 je

- 34 -

zapojen do migrace a invaze nádorových buněk. Proteolytické štěpení CD44 na extracelulární doméně za účasti membránově-vázaných metaloproteináz hraje v tomto procesu důležitou roli. Zvýšené štěpení CD44 je zaznamenáváno u invazivních nádorů, jakými jsou například gliomy – nádory centrální nervové soustavy, nádory prsu, nemalobuněčného karcinomu plic, nádoru tlustého střeva a nádoru vaječníku. Pouze oligosacharidy v určitém rozmezí velikosti a rozsahu molekulové hmotnosti mohou indukovat štěpení CD44 v buňkách nádorů a přispívat tím k CD44-dependentnímu pohybu nádorových buněk. Například při vystavení buněk MIA PaCa-2 (linie lidského nádoru pankreatu) účinku směsi natrávených HA fragmentů o délce 4 – 16 jednotek vykazovaly kultury zvýšené štěpení CD44, které bylo prokázáno nárůstem štěpných produktů vázaných k membráně o velikosti 25 kDa. Tyto produkty byly detekovány polyklonální protilátkou metodou western blotting. Pro porovnání účinku oligosacharidů byla další populace buněk vystavena účinku nenatráveným HA o hmotnosti 250 kDa a velikosti 1000 jednotek a více. U této populace nebylo pozorováno zvýšené štěpení receptoru CD44. Tyto výsledky potvrzují, že degradované HA fragmenty indukují štěpení CD44, ale velké polymery tuto schopnost nemají. Přesný způsob účinku působení HA oligosacharidů na štěpení CD44 není zatím vyjasněn. Prozatím víme, že oligosacharidy o 6-ti a více jednotkách mohou být navázány přes receptor CD44. Tato vazba je pro štěpení receptoru nezbytná. Nicméně obsazení HAvázajícího místa u CD44 per se se nezdá být dostatečná k indukci štěpení, neboť velké polymery hyaluronanu navázané přes CD44 u buněk MIA PaCa-2 s mnohem větší afinitou než oligosacharidy HA v indukci štěpení selhávají. Navíc míra CD44 síťování, která je pravděpodobně důležitá v navození štěpení receptoru, nemusí být nezbytná, protože oligosacharidy v rozmezí 6-ti až 12-ti podjednotek pravděpodobně podstupují pouze monovalentní vazbu k receptoru a také indukují štěpení. Oligosacharidy hyaluronanu tedy sehrávají zásadní roli v tumorové progresi, přestože mechanizmus účinku zůstává neobjasněn. Fragmenty o určité velikosti navozují štěpení receptoru CD44 a podporují migraci nádorových buněk. Ale není jasné, jak jsou oligosacharidy vytvářeny a jak štěpení CD44 narušuje produkci oligosacharidů v nádorových buňkách. Není také jasné, jaký druh signálního mechanizmu zahrnuje štěpení receptoru CD44 navozené oligosacharidy. Úloha HA-indukovaného štěpení receptoru CD44 v nádorových buňkách bude třeba dále experimentálně ověřovat. K objasnění může pomoci nedávné zjištění, které ukazuje na interakci Toll-like receptoru 4 (TLR-4) s oligosacharidy při indukci dozrávání a produkci cytokinů - 35 -

z aktivovaných dentritických buněk. Toll-like receptory jsou skupinou bílkovinných receptrorů na povrchu cytoplazmatických membrán u buněk imunitního systému (monocyty, makrofágy, dentritické buňky), které jsou schopny rozeznávat cizí, a tedy potencionálně nebezpečné struktury. Spolupráce mezi TLR-4 s oligoacharidy HA naznačuje jejich možnou úlohu při aktivaci imunitního systému proti nádorům, ukazující dvojsečnou roli oligosacharidů v kancerogenzi. Studium biologických funkcí hyaluronanových oligosacharidů vyžadují další výzkumy, které mohou objasnit zásadní mechanizmus nádorové progrese a mohou nám poskytnout mocnou zbraň při boji s nádory (Sugahara et al., 2004).

6.2. Oligosacharidy HA a rakovina kostí Osteosarkom je nejběžnější druh primárního maligního kostního nádoru. Nejčastěji je diagnostikován ve věku 10 až 30 let s maximem v období růstové akcelerace. Jsou popisovány ale i osteosarkomy kojenců či lidí starších 90 let. Ve většině případů není možné jednoznačně určit specifické etiologické agens. Osteosarkom je nádor charakterizovaný přímou tvorbou kosti nebo osteoidní tkáně nádorovými buňkami. Je vysoce maligní, šíří se lokálně dřeňovou dutinou, dochází k invazi do okolních měkkých tkání a k časnému hematogennímu rozsevu především do plic a ostatních kostí. Primární osteosarkomy postihují nejčastěji metafýzy dlouhých kostí, stehenní, holenní a pažní kosti. U osového skeletu je velice špatná prognóza. Vzácně může osteogenní sarkom vznikat i v měkkých tkáních (www.mou.cz/file.html?id=424 – 30.3.2010). Termín osteosarkom se používá k popisu heterogenní skupiny poškození s různorodou morfologií a klinickými příznaky. Prognóza se o mnoho zlepšila se zavedením chemoterapie. Přesto není snadné zlepšit současnou rychlost reakce na léčbu s progresivním zvýšením dávky ozařování. Proto je potřeba vyvinout novější a alternativní prostředky pro léčbu pacientů postižených osteosarkomem. O spojení hyaluronanu s tvorbou kostních nádorů se prozatím neví mnoho. Selektivní inhibice HA-syntázy-2 (HAS-2) v mladých vývojových osteosarkomových buňkách protilátkou antisense fosforo-thiolátovými oligonukleotidy snižuje akumulaci HA a snižuje přidruženou tvorbu matrix produkované těmito buňkami. Tyto změny následovně způsobují podstatné snížení buněčné proliferace, motility a invazivnosti. Buňky MG-63 (buňky lidské osteoblastické osteosarkomové linie) mají na hyaluronan bohatou přidruženou matrix, což vede k hypotéze, že inhibice udržování této na HA bohaté matrix na povrchu buňky může mít také vliv na rakovinotvornost těchto buněk. Nicméně, použití HAS-2 antisense oligonukleotidů k inhibici syntézy HA má v klinické praxi jen omezenou účinnost. - 36 -

Výzkumníci nejprve použili malé oligosacharidy HA k odstranění této matrix bohaté na hyaluronan z buněk. Předpokládaným mechanizmem bylo, že tyto oligosacharidy soutěží s molekulami HA o velké hmotnosti o vazbu na receptoru CD44. Podle velikosti oligosacharidů, jejich čistoty a možné snadné průchodnosti do tkání může být jejich využití vhodné ke klinickým účelům. Ve studii, jejímž cílem bylo určit rozhodující velikost oligosacharidů nezbytnou k inhibici udržování HA na buněčném povrchu u buněk MG-63 a získat takto nástroj s protinádorovým účinkem, byl analyzován efekt aplikace různě velkých HA oligosacharidů u nádorů osteosarkomu. Pro výzkum rozhodující délky oligosacharidů vykazujících protinádorové účinky byly připraveny buněčné vzorky vystavené působení hyaluronanovým tetrasacharidům (HA4), hexasacharidům (HA6), oktasacharidům (HA8), dekasacharidům (HA10), dodekasacharidům (HA12) a také vysokomolekulárnímu HA (HMWHA – High Molecule Weight HA). Na základě těchto předběžných zkoušek byly pro následné experimenty použity HA4, HA8 a HMWHA. Předchozí studie na chondrocytech ukázaly, že efektivní koncentrace exogenních HA oligosacharidů je 250 μg/ml. Toto množství již ovlivní buněčné chování. Důležitým ukazatelem účinku oligosacharidů HA na zpomalení růstu buněk MG-63 byl počet apoptických buněk. Jak je graficky znázorněno na obr. 10, největší nárůst apoptózy u nádorových buněk vykazovalo působení oktasacharidů ve srovnání s kontrolním vzorkem. U tetrasacharidů a HMWHA nebyl pozorován významný nárůst apoptické aktivity.

Obr. 10 – účinek HA oligosacharidů na apoptickou aktivitu u osteosarkomových buněk (Hosono et al., 2007)

- 37 -

Hyaluronan na povrchu buněk slouží jako konstrukce pro hromadění buněčné přidružené matrix. U nádorových buněk může tato matrix podporovat jejich růst a přežívání díky inhibici apoptózy nebo jejich „skrytí“ před imunokompetentními buňkami. Na dalším obrázku je znázorněn účinek oligosacharidů na přidruženou matrix bohatou na HA přímo u buněk. Působení tetrasacharidů (A) či HMWHA (C) buňky výrazně neovlivnilo. U oktasacharidů (B) můžeme vidět snížení přidružené matrix o 64 % ve srovnání s kontrolním snímkem (D). Pouze HA8 ovlivnilo zadržování endogenního HMWHA u buněk MG-63.

Obr. 11 – účinek oligosacharidů na udržování HA buňkami MG-63 Buňky MG-63 byly léčeny 250 μg/ml HA4 (A), HA8 (B), vysokomolekulárním HA (C) a kontrolním médiem (D) po dobu 72 hodin. Na snímku D je u buňky vlevo vidět na hyaluronan bohatá přidružená matrix, v buňce vpravo můžeme pozorovat intracelulární granule obsahující HA (Hosono et al., 2007).

- 38 -

Výsledkem studie na osteoblastických buňkách lidského osteosarkomu, které mají na hyaluronan bohatou přidruženou matrix, bylo zjištění, že nejvýraznější protinádorové účinky mají oktasacharidy HA. Tyto účinky jsou významné u plicních metastáz. Možným vysvětlením pro podstatnou redukci plicní metastázy osteosarkomu může být inhibice pericelulárního HA působením lokálně vpraveného HA8. Sklon k potlačení lokálního nádorového růstu může být důsledkem narušení přidružené matrix, které vede k odhalení přítomnosti nádorových buněk. Na tyto buňky následně reaguje imunitní systém hostitele. Účinek je podpořen i přímým inhibičním efektem HA8 na buněčnou proliferaci. Přestože se přežívání u pacientů s lokálním osteosarkomem pohybuje okolo 70 %, prognóza není dobrá. Často se objevují recidivy z důvodu špatné operability tohoto nádoru. U případů, kde je obtížné dosáhnout celkového odstranění nádoru, je třeba další chemoterapie či radioterapie. Současné studie odhalují inhibiční účinky HA oligosacharidů na buněčnou proliferaci, motilitu a invazivnost zprostředkovanou supresí přidružené buněčné matrix (Hosono et al., 2007).

- 39 -

7. Hyaluronanové oligosacharidy a jejich účinky na chondrocyty Chondrocyty jsou hlavní buňky vyskytující se v chrupavce. Jejich název pochází z řeckých slov chondros – chrupavka a kytos – buňka. Chondrocyty produkují a zadržují mezibuněčnou hmotu, která se skládá především z kolagenu, elastinu, hyaluronanu a dalších proteoglykanů. Mají eliptický nebo kulovitý tvar a většinou se vyskytují ve skupině po osmi – viz. obrázek 12. Chrupavka není prokrvena, proto jsou její energetické možnosti velmi omezené. Energii získávají z anaerobního dýchání. Buňky vznikají z mezenchymálních kmenových buněk – chondroblastů, které jsou ještě schopné dalšího dělení. V závislosti na okolním médiu se chondroblasty mohou dělit na chondrocyty nebo na osteoblasty. Ve vaskularizovaných

oblastech

(např.

v kostech)

vznikají

osteoblasty,

zatímco

nevaskularizované části (např. v chrupavkách) dávají vzniknout chondrocytům. Chondrocyty podstupují konečnou diferenciaci, když se stávají hypertrofickými během endochondrální osifikace. Tento poslední stupeň je charakterizován hlavními fenotypickými změnami v buňce. Produkce chrupavkové tkáně je velice striktně řízena hormony. Růst chrupavky podporuje tyroxin, testosteron a nepřímo i somatotropin. Opačným způsobem na ně působí kortizon, hydrokortizon a estradiol. (http://cs.wikipedia.org )

Obr. 12 – shluky chondrocytů v chrupavce (http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/colorpage/cb/cbcc2.gif - 7.4.2010)

- 40 -

Hyaluronan projevuje různé biologické účinky na buňky, jako například změny v buněčné migraci, proliferaci a matrixovém metabolizmu. Signální dráhy spojené s působením HA na buňky ale prozatím nebyly jasně stanoveny. Pro bližší objasnění těchto pochodů bylo použito HA oligosacharidů jako molekulárního nástroje k prozkoumání účinku změn u interakce buňka – hyaluronan. HA oligosacharidy indukují ztrátu proteoglykanové a kolagenové extracelulární matrix z kultivačních řezů připravených z lidské dospělé kloubní chrupavky. Ztráta byla koincidenční s nárůstem exprese matrixové metaloproteinázy-13 (MMP-13). Tato exprese byla navozena v artikulárních chondrocytech HA hexasacharidy. Tetrasacharidy či HMWHA tento účinek však nemají. HA oligosacharidy aktivují v chondrocytech nukleární faktor κB (NFκB). Spojení mezi aktivací NFκB a indukcí MMP13 bylo později potvrzeno použitím inhibitoru NFκB – helenalinu. Inhibice mitogenemaktivované proteinkinázy (MAP – mitogen-activated protein kinase) demonstruje účast p38 MAP kinázy v indukci HA oligosacharidů MMP-13. Hyaluronanové CD44 interakce ovlivňují metabolizmus matrix prostřednictvím p38 MAP kinázy a NFκB. p38 MAP kinázy jsou skupinou mitogenem-aktivovaných kináz, které jsou zodpovědné za stresové podněty. Těmito podněty jsou například cytokiny, ultrafialové záření, tepelný šok a osmotický šok. Jsou zahrnuty v buněčné diferenciaci a apoptóze. p38 MAP kináza je savčí kináza, která se účastní v signální kaskádě odpovědi buňky na cytokiny a stres. Byly identifikovány čtyři izoformy, p38 MAP-α, -β, -γ, -δ. NFκB – nukleární faktor kappa – posilovač lehkých řetězců aktivovaných B buněk – je bílkovinný komplex, který reguluje transkripci DNA. NFκB můžeme najít téměř ve všech buněčných typech. Je zahrnut v buněčné odpovědi na cytokiny, volné radikály, UV záření, oxidovaný LDL (Low Density Lipoprotein), bakteriální a virové antigeny. NFκB hraje klíčovou roli v regulaci imunitní odpovědi na infekci. Jeho nesprávné řízení je spojováno s rakovinou, zánětem, autoimunitními nemocemi, septickým šokem, virovou infekcí a nesprávným imunitním rozvojem. Tento faktor je také zapojen do procesu synaptické plasticity a paměti. U savců patří do této skupiny 5 proteinů – NFκB1, NFκB2, RelA, RelB, cRel. Všechny typy jsou strukturně homologní s retrovirovým onkoproteinem v-Rel. Z toho vyplývá jejich klasifikace na NFκB a Rel proteiny. (http://en.wikipedia.org – 10.4.2010) V mnoha tkáních slouží součinnost buňka-matrix k regulaci buněčné homeostázy. Zásah do těchto spojení signalizuje buňkám zahájit opravu matrix, buněčnou proliferaci či migraci. Tyto interakce jsou důležité u tkání, jakou jsou kloubní chrupavky. V těchto tkáních je bohatá ECM, ale je sem omezen cévní přístup pro systematickou kontrolu homeostázy.

- 41 -

Proto jsou chondrocyty velice závislé na interakcích buňka-matrix, jako primárním prostředku rozpoznání změn v extracelulárním prostředí. HA oligosacharidy snadno prostupují kloubní chrupavkou a indukují podstané změny v metabolizmu matrix, které se nejvíce projevují ztrátou proteoglykanů z tkání. Tato ztráta může být následkem vlivu proteoglykanů na biosyntézu, degradaci či obojího. Další zajímavou skutečností bylo, jak HA oligosacharidy působily na změny kolagenu II uvnitř chrupavky. Při ošetření tkáně oligosacharidy kloubní chrupavky vykazovaly redukci kolagenu II v pericelulárních a meziprostorových oblastech dosahujících povrchových, středních a hlubokých zón tkání. Účinek oligosacharidů HA reprezentuje aktivaci katabolické kaskády rezidentními chondrocyty jako důkazu regulace genu MMP-13. Ukazují se tak signální dráhy zprostředkované HA, které mohou být narušeny použitím jeho oligosacharidů v prostředí neporušené tkáně. HA oligosacharidy aktivují MMP-13 genovou transkripci, která má za následek nárůst počtu kopií MMP-13 mRNA, tím se navýší MMP-13 protein a zvýší se enzymová aktivita spojená s MMP-13. Receptory, které zprostředkovávají tyto procesy však nejsou jednoznačně určené. Podle provedených studií není za aktivaci odpovědný receptor CD44, přestože u jiných výzkumů byla potvrzena účast tohoto receptoru. Buněčná signalizace prostřednictvím receptoru CD44 je pravděpodobně iniciovaná HA oligosacharidy. Tyto výsledky nechávají otevřenou možnost, že různé typy buněk využívají k iniciaci buněčné signalizace rozdílné typy receptorů, jakými jsou RHAMM, TLR-4, LYVE-1 nebo jejich kombinace. Proto je nezbytné určit receptor odpovědný za signalizaci v primárních kulturách chondrocytů nebo kloubních řezů. Přiblížením k odpovědi na tuto problematiku je použití malých interferujících RNA či antisense oligonukleotidů k selektivní inhibici exprese CD44 u dospělých diferencovaných buněk. Podle studií použití CD44 antisense oligonukleotidů na řezy chrupavkové tkáně vedlo k indukci katabolické kaskády a k dramatické ztrátě ECM, které je téměř totožné se ztrátou matrix vyvolanou HA oligosacharidy. Toto opět dokazuje, že CD44 je mediátorem HA a HA oligosacharidů v buněčné signalizaci. Při zkoumání účinků oligosacharidů na indukci MMP-13 byla použita směs HA8, HA6 a HA4. Pouze oktasacharidy a hexasacharidy byly schopné aktivace transkripce MMP13. HA4 vykazovaly pouze malý signalizační potenciál. Hexasacharid HA je příliš malý, aby interferoval s agregáty či proteinovými interakcemi spojenými s HA a již je dostatečně velký na to, aby byl schopen vazby s receptorem CD44. Ač nemůže HA4 interagovat s tímto receptorem, slouží jako kontrola pro potenciální reakce mezi HA oligosacharidy a lektiny, metabolických účinků cukerných oligosacharidů či může upravovat pH. Dalším rozdílem - 42 -

mezi HA4 a HA6 je, že tetrasacharid nemůže ovlivnit nahrazení HMWHA z povrchu chondrocytů, neboť tato vazba je zprostředkována přes receptor CD44. Toto zjištění je souhlasné s hypotézou, že buněčná signalizace je v chondrocytech iniciována nahrazením HMWHA, které vede k „deklastrování“ CD44 na buněčném povrchu a následné destabilizaci kortikálních cytoskeletálních konformací. Cytoskeletální přestavba je zapojena v indukci metaloproteináz a zahrnuje aktivaci proteinkinázy C a NFκB. HA oligosacharidy zvyšují stupeň aktivního NFκB přítomného v jaderných extraktech zkoumaných chondrocytů. Indukce MMP-13 HA oligosacharidy byla přednostně blokována inhibitorem NFκB – helaninem, který blokuje NFκB-DNA-vázající aktivitu selektivní alkylací podjednotky NFκB. Společně tyto výsledky ukazují na HA oligosacharidy jako na induktory exprese MMP-13 protřednictvím aktivace a jaderné translokace NFκB. Inhibitory p38 MAP také kompletně blokovali indukci MMP-13 zprostředkovanou HA oligosacharidy. Ukázalo se, že indukce MMP-13 fibronektinovými fragmenty a IL-1 zahrnuje aktivaci p38 MAP kinázy i NFκB. Výsledky studie provedené Ohnem a jeho kolektivem ukázaly, že HA oligosacharidy zvyšují expresi MMP-13 u chondrocytů signální cestou aktivace NFκB a p38 MAP kinázy. Signalizace zprostředkovaná receptorem CD44 podporuje tuto aktivaci a tento receptor je pravděpodobně rozhodující u určitých buněčných typů, jako například u chondrocytů. Tyto výsledky naznačují, že kloubní chondrocyty mají schopnost rozlišit změny v HA-buněčných interakcích, které vedou k odpovědi chondrocytů (Ohno et al., 2006).

- 43 -

8. Účinky hyaluronanových fragmentů na syntézu hladkého svalstva

Náprava tkáně, která je porušena mechanickým zraněním, chorobou či vrozeným defektem, je kromě dalších faktorů omezována nedostatkem vhodných buněk, jež by mohly regulovat a vést přirozeně nízkou syntézu elastinu u cévních buněk hladkého svalstva. Proces obnovy založený na hyaluronanu by mohl sloužit k vybuzení elastogenních buněk. Tyto procesy jsou pravděpodobně řízeny HA fragmenty o určité délce. Důležitým měřítkem je i množství podaných exogenních oligosacharidů. Hladká svalovina se skládá z vřetenovitých buněk. Její činnost je pomalá a řídí ji vegetativní soustava. Činnost hladkého svalstva je vykonávána bez vědomé činnosti jedince a nedokážeme ji ovládat vůlí. Vegetativní systém udržuje srdeční a dýchací frekvenci, vykonává proces trávení, pocení a močení, tvoří sliny, ovládá průměr zornice a má důležitou úlohu v pohlavním vzrušení. Hladká svalovina u člověka tvoří stěny většiny orgánů, ale také střední svalovou vrstvu cévní stěny (tunica media). Základní jednotkou tvořící hladkou svalovinu je svalová buňka – myocyt. Jejich délka se mění podle druhu orgánu. Například v děloze dosahuje délky až 500 μm. V ostatních orgánech je délka podstatně menší (přibližně 20 μm). Šířka myocytu je asi 5 μm. Buňky obsahují uprostřed buněčné jádro. Ostatní organely jsou lokalizovány spíše na obou pólech. V cytoplazmě myocytů se nachází mimo běžné organely především aktinomyozinový komplex, který umožňuje kontrakci buňky. V buňkách probíhá nejen pravidelná kontrakce, ale i poměrně intenzivní syntéza kolagenu, elastinu a proteoglykanů. Kolagen je extracelulární skleroprotein, který je nerozpustný ve vodě. Je základní stavební hmotou pojivových tkání. Tvoří 25 až 30 % všech bílkovin v těle savců. Ve formě kolagenních vláken je složkou mezibuněčné hmoty. Molekula kolagenu je tvořena hlavně aminokyselinami glycinem, prolinem, hydroxyprolinem a hydroxylysinem. Kolagen se skládá z řetězců alfa 1 a alfa 2, které se jen málo liší pořadím aminokyselin. Řetězce tvoří trojitou spirálu, která se označuje jako tropokolagen. Je to základní jednotka kolagenu, dlouhá přibližně 256 nm. Poslední údaje dokládají, že je známo nejméně 27 rozdílných typů kolagenů. Nejdůležitější typy jsou kolagen I, II, III, IV, a V. Typ I je nejrozšířenější. Představuje 90 % kolagenu v organizmech. Je přítomen v pokožce, šlachách, kostech a zubech. Tvoří typická 1-20 µm dlouhá kolagenní vlákna. Kolagen typu II je přítomen v chrupavkách. Jsou to 20 nm dlouhé fibrily, které neagregují ve vlákna. Typ III je kolagen embryonálního vývoje, později je nahrazen typem I. Dříve se nazýval retikulín. Typ IV je

- 44 -

přítomný v bazálních membránách epitelů. Jde o nepolymerizovaný tropokolagen. Kolagen typu V je charakteristický pro stěnu krevních cév (http://cs.wikipedia.org/ - 14.4.2010).

Obr. 13 – struktura a velikost kolagenu (www.sciencedaily.com/images/2006/11/061114190020.jpg - 14.4.2010)

Elastin je nerozpustný skleroprotein. Nejprve je syntetizován buňkami hladkého svalstva jako rozpustný monomer – tropoelastin. Desmosin a izodesmosin (lyzylové a hydroxylyzylové zbytky) pak zajišťují tvorbu příčných vazeb působením enzymu lyzyl oxidázy. Výsledkem je ve vodě nerozpustná zesítěná bílkovina. Svou stavbou se podobá kolagenu, který je hlavní složkou elastických vláken ve tkáních živočichů. Velké množství elastinu se vyskytuje v cévách poblíž srdce, dále ve vazech, kůži a šlachách. Elastin představuje vláknitý řetězec složený z mnoha (cca 820) za sebou seřazených aminokyselin. Jeho molekulární hmotnost je 64 až 66 kDa. Obsahuje vysoký podíl prolinu a alifatických aminokyselin (glycinu, alaninu, valinu, leucinu a izoleucinu). Glycin je neesenciální aminokyselina, která podporuje zvýšení energetického výdeje při svalové činnosti. Tím snižuje a oddaluje nástup vyčerpání a urychluje regeneraci organizmu po jakékoli fyzické zátěži. Je velice důležitý pro přenos vzruchů během mozkové činnosti (tzv. neurotransmiter) a tím i pro produkci růstového hormonu. Prolin je nezbytný pro tvorbu kolagenu, urychluje regeneraci chrupavek, vaziva a kostí. Elastin je zodpovědný za pružnost pokožky a dalších tělesných orgánů. V cévách je uspořádaný do svazků, které poskytují nezbytnou podmínku

- 45 -

k absorpci a přenosu hemodynamických sil. Také umožňují cévní retrakci do původních rozměrů po uvolnění přenášených substancí. Na buněčné úrovni také ovlivňuje buňky hladkého svalstva přes navázání na povrchový elastin – lamininový receptor a zásadně tím reguluje aktivitu těchto buněk během morfogeneze a onemocnění. Proto degradace cévního elastinu

v důsledku

mechanického

zranění

může

urovnat

cévní

homeostázu.

(www.celostnimedicina.cz - 14.4.2010)

Hyaluronan hraje nepřímou roli v elastogenezi prostřednictvím versikanu, který postupně interaguje s mikrofibrilárními a s elastin-příbuznými proteiny za vytvoření větší makromolekulární struktury. Versikan je velký chondroitin sulfátový proteoglykan, který se účastní buněčné adheze, migrace a proliferace. HA fragmenty mají mnohem větší biologickou aktivitu než HMWHA a vyvolávají elasticitu tkání. Naproti tomu HA s dlouhým řetězcem usnadňuje uložení matrix. Elastická odpověď buněk na přítomnost HA je zkoumána metodou exogenní suplementace. Tento model nám může poskytnout vodítko k porozumění, jak buňky hladkého svalstva reagují na přítomnost HA fragmentů. Tyto fragmenty působí na chondrocyty, endoteliální buňky a fibroblasty proliferativně a angiogenicky na rozdíl od HMWHA. Tyto poznatky odpovídají úkazu, kde je na gelech obsahujících HMWHA spolu s malými fragmenty pozorována zvýšená buněčná proliferace než na gelech, kde je samostatný HMWHA. Vysvětlením zvýšené proliferace u buněk podporovaných malými fragmenty může být, že HA fragmenty s krátkým řetězcem mohou způsobit fosforylaci povrchového buněčného receptroru CD44, který interaguje i s HA uvnitř buňky a tím s buněčným cytoskeletem. Následná aktivace cytoplazmatické kaskády může indukovat buněčnou proliferaci. Syntéza kolagenu může být ovlivněna jak délkou přidaného HA řetězce, tak jeho dávkou. Fragmenty o nízké molekulární hmotnosti i oligosacharidy mohou stimulovat výtěžek v závislosti na dávce. Největší produkce byla pozorována u dávky větší než 20 μg/ml. Pravděpodobné vysvětlení závislosti na dávce je narůstající stupeň interakcí mezi CD44 a HA, který signalizuje buňkám navýšení produkce kolagenu až k dosažení saturace. Srovnání množství nasyntetizovaného kolagenu mezi buňkami kultivovaných HMWHA a malými fragmenty ukazují, že vliv na interakci mezi CD44 a HA je aditivní, pokud se přidají HA monomery. Většina elastinu v buňkách u kontrolních vzorků bez přidaného HA byla uložena ve formě amorfních shluků. Mnoho shluků se zdálo být kruhových a měřilo přibližně 100 nm - 46 -

napříč. Toto podporuje hypotézu, že to jsou transverzální elastinová vlákna. Přítomnost fibrilinové mikrotubulární sítě okolo elastinových shluků, nezbytných prekurzorů pro uspořádání elastinových vláken, naznačuje, že organizace elastických vláken v přítomnosti HA probíhá přes normální fibrilinem-zprostředkovaný mechanizmus. Hustota elastinových vláken byla vyšší u buněčných kultur kultivovaných v prostředí HMWHA než u menších fragmentů. Buňky

hladkého

svalstva

reagují

rozdílně

na

přítomnost

HMWHA

a nízkomolekulárních fragmentů. Jako výhodná se ukázala i kultura kombinující molekuly HA o vysoké a nízké molekulární hmotnosti (Joddar and Ramamurthi, 2006).

- 47 -

9. Hyaluronanové oligosacharidy a jejich působení na angiogenezi Angiogeneze je proces novotvorby krevních kapilár – neokapilarizace. Jde o fyziologickou vlastnost všech vyšších organizmů, při které se remodeluje či nově vytváří síť krevních kapilár v poškozeném či změněném ložisku tkáně. Je to dynamický proces, který je regulován signály z okolní ECM. Tkáně a orgány přežívají díky rozvoji krevních cév, které poskytují kyslík a živiny a odstraňují vedlejší produkty metabolizmu. Angiogeneze je nezbytnou součástí při procesech hojení ran a veškeré traumatizované, či nekrózou postižené tkáně (např. srdeční infarkt), při zánětlivých procesech a také při vzniku a vývoji nádorů. Mezi stimulátory angiogeneze patří růstový faktor fibroblastů (FGF – fibroblastic growth factor), cévní endoteliální růstový faktor (VEGF – vascular endothelial growth factor) a růstový faktor krevních destiček (PDGF – platelet-derived growth factor). Poněvadž tyto faktory jsou bílkovinné povahy, mohou být natráveny během hojícího procesu, který vede ke ztrátě jejich biologické aktivity. Přestože jsou růstové faktory zásadní pro angiogenezi, o jejich úloze při hojení ran se ví pouze málo. S procesem obnovy tkáně je hyaluronan velmi úzce spojen. Je i klinicky využíván jako léčivý prostředek. Ale o účincích HA oligosacharidů a jejich roli v regulaci angiogeneze a léčení poraněné tkáně není dostatek informací. Vysokomolekulární HA je základní částí ECM, kde funguje primárně jako strukturní jednotka. Význam oligosacharidů se liší. Jejich důležitou biologickou funkcí může být podpora angiogeneze. Pro studium účinku HA oligosacharidů na obnovení zraněné tkáně byla použita směs oligosacharidů, kde se velikost molekul pohybovala od dvou do deseti disacharidových jednotek. Dalším cílem studie bylo určit signální dráhu, přes kterou tento proces probíhá. První důkazy o tom, že oligosacharidy o velikosti méně než 20 disacharidových jednotek stimulují angiogenezi, vzešly ze studie v roce 1985. Pro studii zkoumající signální dráhy uplatňující se v ovlivňování angiogeneze, byla testována aktivita směsi HA oligosacharidů u růstu a migrace endoteliálních buněk. Endoteliální buňky vytvářejí endotel, který vystýlá vnitřní povrch krevních a lymfatických cév. Tvoří hranici mezi cévní soustavou a tkáněmi (obr. 14). Hlavní funkcí těchto buněk je kontrolovaný a selektivní transport látek přes cévní stěnu. Výsledky naznačují, že HA oligomery mají pozitivní účinky na proliferaci a pohyb endoteliálních buněk. Endoteliální buňky hrají zásadní roli během procesu hojení, která spočívá v jejich spojení s formací kapilárních tubulů.

- 48 -

Obr. 14 – lokalizace cévního endotelu a endoteliální buňka obklopující erytrocyt (E) (http://en.wikipedia.org)

Proces hojení ran je komplexní děj, kterého se zúčastňují buňky, chemické signály a okolní prostředí buněk. Kombinace těchto činitelů vede ke konečné reparaci tkáně. Angiogeneze je úzce spojena s hojením ran. Tento aspekt neokapilarizace záleží na chemotaktických faktorech poskytovaných okolními buňkami a matrix. Po porušení tkáně se v místě hromadí nízkomolekulární fragmenty HA, které jsou výsledkem nadměrné aktivity hyaluronidázy. Vytváření HA fragmentů vlivem narušení tkáně signalizuje hostiteli, že je narušena normální homeostáza. Tyto fragmenty následně indukují angiogenezi. Největší angiogenickou aktivitu vykazují oligosacharidy o velikosti 4 – 25 disacharidových jednotek. Aplikovaná dávka 10 μg/ml se ukázala jako dostatečné množství pro navození angiogeneze. Při podání vyšší koncentrace buňky nevykazovaly rozdílnou proliferaci. Signální přenosy probíhaly převážně prostřednictvím hyaluronanového receptoru pro motilitu (RHAMM) nikoliv přes CD44. Tato skutečnost může být výsledkem použití rozdílných linií kultivačních buněk, různých reagencií či rozdílnými reakčními podmínkami v jednotlivých laboratořích. Oba receptory CD44 i RHAMM byly detekovány na cévním enditeliu in situ i na povrchu kultivovaných endoteliálních buňkách. Tyto kontroverzní výsledky vedou k závěru, že existuje heterogenita mezi primárními lidskými endoteliálními buňkami u různých cévních zdrojů. Receptory RHAMM a CD44 mohou vykonávat samostatné úlohy v regulaci buněčné odpovědi.

- 49 -

Mezi mediátory, které jsou schopné stimulovat angiogenezi během hojení zraněné tkáně, patří TGF-β, TNF, FGF či PDGF. Nejvýznamnější je však VEGF. Přesto je aplikace růstových faktorů v klinickém použití limitována. Růstové faktory jsou bílkoviny, které mohou být rozloženy proteázami, pokud budou aplikovány přímo na zraněnou tkáň. HA oligosacharidy jsou finální natrávené produkty, které neobsahují bílkovinnou složku (jsou neantigenní). Proto je jejich použití vhodnější než použití bílkovinných růstových faktorů (Gao et al., 2008).

- 50 -

10. Souhrn Tato práce je souhrnem informací o hyaluronanových oligosacharidech. Od objevu hyaluronové kyseliny roku 1934 našla tato substance mnohé uplatnění především v lékařství. Hyaluronová kyselina se v těle vyskytuje v ionizované formě nejčastěji v podobě sodné soli. Zatímco polymery hyaluronanu a jejich účinky jsou zkoumány v početných výzkumných studiích, o jeho oligosacharidech to neplatí. Fragmenty o malé délce přitom mají rozdílné vlastnosti a funkční oblasti, než velké molekuly HA. HA oligosacharidy lze připravit různými způsoby. Nejčastěji se využívají hyaluronidázy, které natráví vysokomolekulární hyaluronan na malé fragmenty. Pro separaci slouží chromatografické metody – gelová permeační chromatografie či vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Pro analýzu pak nachází uplatnění kapilární elektroforéza, flourofory podporovaná elektroforéza sacharidů a hmotnostní spektrometrie s detekcí v UV oblasti případně pomocí rozptylových metod – refraktometry. U MS lze využít různé způsoby ionizace. Pro HA se ukázaly nejvhodnější ionizace elektrosprejem a metoda MALDI. Oligosacharidy můžeme analyzovat i metodou spektroskopie nukleární magnetické rezonance, avšak nevýhodou této analýzy je potřeba velkého množství vzorku. Proto, aby mohly HA oligosacharidy ovlivňovat buněčné funkce, je třeba, aby interagovaly s příslušnými buňkami. Jako hlavním buněčným receptorem pro HA se ukázal CD44. Tento transmembránový glykoprotein může navázat nejen HMWHA, ale i oligosacharidy o velikosti 6 a více jednotek. Existuje mnoho izoforem tohoto receptoru. Rozdílné buněčné druhy exprimují různé izoformy CD44. Dalšími receptory jsou HA receptor pro motilitu, receptor pro endocytózu HA a endoteliální receptor HA v lymfatických cévách. Hyaluronidázy, které rozkládají HA, jsou specifické glykosylové hydrolázy. Existují 3 druhy těchto enzymů – savčí, bakteriální a hyaluronidázy z pijavic. Savčí typy jsou endo-β-Nacetyl-D-hexosaminidázy,

které

štěpí

vnitřní

β1,4-glykosidickou

vazbu

mezi

N-

acetylglukosaminem a glukuronátem. Největší koncentrace hyaluronidáz u savců je ve varlatech, lysozómech jater a v séru. Štěpnými produkty jsou nejčastěji tetra-, hexaa oktasacharidy. Zatím nedostatečně vyjasněná zůstává funkce oligosacharidů během kancerogeneze. Receptor CD44 je zapojen do migrace a invaze nádorových buněk. Štěpení toho receptoru mohou indukovat pouze oligosacharidy v určitém velikostním rozhraní. Velké polymery HA tuto schopnost nemají. Výzkum oligosacharidů na buňkách osteosarkomu odhalil i jejich

- 51 -

protinádorové účinky. Ukázalo se, že HMWHA u nádorových buněk slouží k hromadění přidružené matrix, která má za následek jejich „zakrytí“ před imunokompetentními buňkami a podporuje jejich růst a přežívání. Jako nejúčinnější se ukázaly oktasacharidy HA, které značně zredukovaly přidruženou matrix, a tím odhalily nádorové buňky buňkám imunitního systému. Ty mohly následně reagovat na přítomnost nádorových buněk a vyvolat jejich apoptózu. HA oligosacharidy jsou důležité i ve spojitosti s kloubními chrupavkami, kde indukují ztrátu proteoglykanové a kolagenové extracelulární matrice. Tato aktivita byla spojena s působením matrixové metaloproteinázy 13. MMP-13 je aktivována signální cestou zprostředkovanou nukleárním faktorem κB a p38 MAP kinázy. HA ovlivňuje hladké buňky svalstva. Ve studii byly srovnávány kultury buněk kultivovaných za přítomnosti HMWHA a nízkomolekulárních fragmentů HA. Byla zkoumána i důležitost podané dávky. Výsledkem provedené studie bylo zjištění, že na gelech obsahujících HMWHA spolu s malými fragmenty je pozorována zvýšená buněčná proliferace než na gelech, kde je samostatný HMWHA. Dávka, která je potřebná pro stimulaci produkce kolagenu je nejméně 20 μg/ml. Důležitá je role HA oligosacharidů během novotvorby krevních kapilár. Povrch cév je vystlán endotelem tvořeným endotelovými buňkami. HA oligomery mají pozitivní účinky na proliferaci a pohyb těchto buněk. Navíc při poranění se uvolní hylauronidáza z poškozených buněk. Ta poté začne štěpit polymery HA. Nárůst HA fragmentů signalizuje hostiteli, že je narušena homeostáza. Tyto fragmenty následně indukují angiogenezi. Angiogenezi stimulují i jiné růstové faktory, které jsou však bílkovinné povahy. Během hojícího procesu se aktivují i proteázy, které natráví bílkovinné faktory. To vede ke ztrátě jejich biologické aktivity. HA oligosacharidy nejsou bílkoviny, proto se mohou s výhodou aplikovat přímo na místo poranění.

- 52 -

Seznam zkratek AMAC....................... 2-aminoakridon CE.............................. kapilární elektroforéza DNA........................... deoxyribonukleová kyselina EC.............................. mezinárodní klasifikace enzymů ECM........................... extracelulární matrix EDTA......................... ethylendiamintetraoctová kyselina EGF............................ epidermální růstový faktor ESI............................. ionizace elektrosprejem FACE......................... fluorofory podporovaná elektroforéza sacharidů FGF............................ růstový faktor fibroblastů GM-CSF.................... faktor stimulující granulocyty a makrofágy GPC........................... gelová permeační chromatografie GPI-AP.......................glykosylfosfatidylinositolová kotva HA.............................. hyaluronan HARE.........................receptor hyaluronanu pro endocytózu HAS-2........................ HA-syntáza-2 HMWHA....................vysokomolekulární hyaluronan HPLC......................... vysokoúčinná kapalinová chromatografie HYAL........................ gen pro hyaluronidázu IL................................ interleukin LDL............................ lipoprotein s nízkou hustotou LYVE-1......................endoteliální receptor hyaluronanu v lymfatických cévách MALDI...................... ionizace laserem za účasti matrice MAP........................... mitogenem-aktivovaný protein MG-63........................ buňky lidské osteoblastické osteosarkomové linie MIA PaCa-2............... lidské nádorové buňky pankreatu MMP.......................... matrixová metaloproteináza mRNA........................ mediátorová ribonukleová kyselina MS.............................. hmotnostní spektrometrie NF.............................. nukleární faktor NMR.......................... nukleární magnetická rezonance

- 53 -

PGDF......................... růstový faktor krevních destiček PH-20......................... testikulární hyaluronidáza RHAMM.................... hyaluronanový receptor pro motilitu SDS............................ dodecyl sulfát sodný SEC............................ vylučovací chromatografie TGF-β.........................transformující růstový faktor beta TLR............................ Toll-like receptor TNFα.......................... tumor nekrotizující faktor alfa TOF............................ analyzátor doby letu UDP............................uridindifosfát UV..............................ultrafialové záření VEGF......................... cévní endoteliální růstový faktor

- 54 -

Použitá literatura Calabro A., Benavides M., Tammi M., Hascall V.C., Midura R.J.: Microanalysis of enzyme digests of hyaluronan and chondroitin/dermatan sulfate by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE). Glycobiology, Vol. 10, No. 3, 2000, str. 273-281

Camenisch T.D., McDonald J.A.: Hyaluronan. Is Bigger Better? American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol. 23, 2000, str. 431-433

Capila I., Sasisekharan R.: Methods for Analysis of Hyaluronan and Its Fragments. Chemistry and Biology of Hyaluronan, Chapter 2, editors Garg H.G., Hales C.A, Elsevier, 2004, str. 2140

Cowman M.K., Matsuoka S.: Experimental approaches to hyaluronan structure. Carbohydrate Research, Vol. 340, No. 5, 2005, str. 791-809

Gao F., Yang C.X., Mo W., Liu Y.W., He Y.Q.: Hyaluronan oligosaccharides are potential stimulators to angiogenesis via RHAMM mediated signal pathway in wound healing. Clinical and Investigative Medicine, Vol. 31, No. 3, 2008, str. 106-116

Gmachl M., Sagan S., Ketter S., Kreil G.: The human sperm protein PH-20 has hyaluronidase activity. Federation of European Biochemical Sociaties Letters, Vol. 336, No. 3, 1993, str. 545-548

Hampson

I.N.,

Gallagher

J.T.:

Separation

of

radiolabelled

glycosaminoglycan

oligosaccharides by polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochemical Journal, Vol. 221, 1984, str. 697-705

Havliš J.: Hmotnostní spektrometrie – MALDI-TOF. Vesmír, No. 78, 1999, str. 448

Hosono K., Nishida Y., Knudson W., Knudson C.B., Naruse T., Suzuki Y., Ishiguro N.: Hyaluronan Oligosaccharides Inhibit Tumorgenicity of Osteosarcoma Cell Line MG-63 and

- 55 -

LM-8 in Vitro and in Vivo via Perturbation of Hyaluronan Rich Pericellular Matrix of the Cells. The American Journal of Pathology, Vol. 171, No. 1, 2007, str. 274-286

Huang G.L., Yang H., Mei X.Y., Liu M.X., Ma Y.T.: Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis as Detection Method for Carbohydrate–Protein Interactions. Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 136, No. 1, 2007, str. 17-22

Jackson D.G.: New Perspectives from the Hyaluronan Receptor LYVE-1. Trends in cardiovaskular medicine, Vol. 13, No. 1, 2003, str. 1-7

Joddar B., Ramamurthi A.: Fragment size- and dose-specific effects of hyaluronan on matrix synthesis by vascular smooth muscle cells. Biomaterials, Vol. 27, 2006, str. 2994-3004

Karlíček R. a kolektiv: Analytická chemie pro farmaceuty. Nakladatelství Karolinum, Praha 2005

Klouda P.: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, 2005

Knudson W., Chow G., Knudson C.B.: CD44-mediated uptake and degradation of hyaluronan. Matrix Biology, Vol. 21, 2002, str. 15-23

Kogan G., Šoltés L., Stern R., Gemeiner P.: Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnology Letters, Vol. 29, No. 1, 2007, str. 17-25

Kreil G.: Hyalronidases – A group of neglected enzymes. Protein Science, No. 4, 1999, str. 1666-1669

Lepperdinger G., Kreil G.: Functional, Structural and Biological Properties of Hyaluronidases. Chemistry and Biology of Hyaluronan, Chapter 27, editors Garg H.G., Hales C.A, Elsevier, 2004, str. 585-597

Lindhart R.J., Pervin A.: Separation of negatively charged carbohydrates by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 720, 1996, str. 323-335 - 56 -

Mahoney D.J., Aplin R.T., Calabro A., Hascall V.C., Day A.J.: Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined lenght. Glycobiology, Vol. 11, No. 12, 2001, str. 1025-1033

Meyer K., Palmer J.W.: The polysaccharide of the vitreous humor. Journal of Biology and Chemistry, 107, 1934, str. 629-634

Nečas J., Bartošíková L., Brauner P., Kolář J.: Hyaluronic acid (hyaluronan): a review. Veterinární Medicína, 53, No. 8, 2008, str. 397-411

Ohno S., Im H.J., Knudson C.B., Knudson W.: Hyaluronan oligosaccharides induce matrix metalloproteinase 13 via transcriptional activation of NFkappaB and p38 MAP kinase in articular chondrocytes. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 281, No. 26, 2006, str. 17952-17960

Sugahara K.N., Hirata T., Murai T., Miyasaka M.: Hyaluronan Oligosaccharides and Tumor Progression. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol. 16, No. 89, 2004, str. 187197

Tawada A., Masa T., Oonuki Y., Watanabe A., Matsuzaki Y., Asari A.: Large-scale praparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, Vol. 12, No. 7, 2002, str. 421-426

Zhong S.P., Campoccia D., Doherty P.J., Benedetti L.,Willams D.F.: Biodegradation of hyaluronic acid derivatives by hyaluronidase. Biomaterials, Vol. 15, No. 5, 1994, str. 359-365

Zhou B., Weigel J.A., Fauss L., Weigel P.H.: Identificaion of the hyaluronan receptor for endocytosis (HARE). Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, 2000, str. 37733-37741

- 57 -

Internetové odkazy http://cs.wikipedia.org

http://en.wikipedia.org

http://klouda.webpark.cz/mam.htm - 23.2.2010

www.celostnimedicina.cz - 14.4.2010

www.cosmobio.co.jp/export_e/products/proteins_and_peptides/products_csr_20090914.asp?e ntry_id=5710 – 11.1.2010

www.hmds.org.uk/images/gpi.gif - 15.3.2010

www.sciencedaily.com/images/2006/11/061114190020.jpg - 14.4.2010

www.udel.edu/biology/Wags/histopage/colorpage/cb/cbcc2.gif – 7. 4.2010

www.mou.cz/file.html?id=424 – 30.3.2010

- 58 -