UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie
Stresové testy vybraných anthelmintik v procesu přípravy stabilitní studie léčivého přípravku Diplomová práce
Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Petr Solich, Csc. Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Lucie Havlíková, Ph.D.
Hradec Králové 2012
Marcela Kameníčková
-1-
Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a byly řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.
Marcela Kameníčková
-2-
Chtěla bych poděkovat zejména PharmDr. Lucii Havlíkové Ph.D. za její odborné vedení, cenné rady a obětavou podporu při řešení této práce. Děkuji též pracovníkům katedry analytické chemie za ochotu a pomoc při řešení experimentální práce v laboratoři. .
-3-
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Marcela Kameníčková Školitel: PharmDr. Lucie Havlíková, Ph.D. Název diplomové práce: Stresové testy vybraných anthelmintik v procesu přípravy stabilitní studie léčivého přípravku Cílem diplomové práce byly stresové testy vybraných anthelmintik v procesu přípravy stabilitní studie léčivého přípravku Caniverm®. Caniverm® obsahuje tři účinné látky a v rámci této diplomové práce byly provedeny stresové testy prazikvantelu. Prazikvantel patří mezi anthelmintika. Během stresových testů byly vzorky prazikvantelu vystaveny vlivu extrémních podmínek, jejichž účelem bylo urychlení chemického rozkladu léčiva. Byl sledován obsah účinných látek a vznik rozkladných produktů. Cílem testu bylo stanovení základních vlastností substance nebo produktu v modelových zátěžových situacích simulujících extrémní podmínky výroby, skladování, transportu a působení vnějších vlivů, charakterizovat degradační produkty a ověřit vhodnost metod pro analýzu rozkladných produktů.
Vyvinutá metoda
byla částečně validována ověřením parametrů linearita a přesnost. Výsledkem experimentální části bylo zjištěno, že prazikvantel je stabilní v methanolu a ve vodě. Ke vzniku rozkladných produktů dochází v prostředí 2% roztoku kyseliny sírové za vzniku RP 1, který je charakterizován retenčním časem tR 4,5 min. Další rozkladný produkt RP 2 s retenčním časem tR 4,9 min vzniká v prostředí 3% peroxidu vodíku. Třetí rozkladný produkt označený RP 3 s retenčním časem tR 1,8 min vzniká v zásaditém prostředí roztoku hydroxidu sodného. Výsledky těchto testů mohou sloužit jako součást rozšířených stabilitních testů přípravku Caniverm® 700 mg tablety.
-4-
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Marcela Kameníčková Supervisor: PharmDr. Lucie Havlíková, Ph.D. Title of Diploma Thesis: Forced degradation studies of anthelmintics in the process of stability testing of pharmaceuticals The goals of this thesis were to perform stress tests of selected anthelmintic praziquantel in the preparation process of stability studies of Caniverm®. The samples were exposed to extreme conditions to accelerate the chemical decomposition of a drug substance. The content of active substances and the formation of degradation products were observed. The aims of the tests were to determine the basic properties of a substance or product in model stress situations, simulating the extreme conditions during production, storage, transport and effects of external influences, to characterize degradation products and to verify the suitability of methods for analysis of degradation products. The developed method was partially validated by parameters linearity and precision. Praziquantel is stable in methanol and water. Degradation product “RP 1” has been formed in the 2% sulfuric acid solution. RP 1 is characterized by retention time of tR 4.5 min. Degradation product “RP 2” with retention time of tR 4.9 min has been formed in a 3% hydrogen peroxide solution. Degradation product “RP3”, characterized by retention time of tR 1.8 min has been formed in an alkaline sodium hydroxide solution. The results of these tests can be used as part of the extended stability tests of Caniverm ® 700 mg tablets.
-5-
Obsah 1.
ÚVOD ........................................................................................................................................ 8
2.
CÍL A POPIS ZADÁNÍ PRÁCE........................................................................................................ 9
3.
TEORETICKÁ ČÁST.................................................................................................................... 10 3.1
STABILITNÍ TESTY VE FARMACII.......................................................................................................... 10
3.1.1
Úvod ................................................................................................................................ 10
3.1.2
Typy stabilitních testů ..................................................................................................... 11
3.1.3
Hodnocení stabilitních zkoušek ....................................................................................... 15
3.2
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) ..................................................................... 20
3.2.1
HPLC a její přednosti ....................................................................................................... 20
3.2.2
Schéma přístroje: ............................................................................................................ 20
3.2.3
Kvalitativní a kvantitativní analýza. Detektory ............................................................... 22
3.2.4
Nejdůležitější oblasti využití HPLC................................................................................... 23
3.3
LÉČIVÝ PŘÍPRAVEK CANIVERM® ........................................................................................................ 24
3.3.1
Složení a léková forma .................................................................................................... 24
3.3.2
Použití ............................................................................................................................. 24
3.3.3
Prazikvantel..................................................................................................................... 25
3.4
SOUHRN REŠERŠE .......................................................................................................................... 26
3.5
VALIDACE ANALYTICKÝCH METOD ...................................................................................................... 27 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................................................................... 32
4. 4.1
MATERIÁL .................................................................................................................................... 32
4.1.1
Vzorky léčivých přípravků................................................................................................ 32
4.1.2
Chemikálie....................................................................................................................... 32
4.1.3
Pomůcky a přístroje......................................................................................................... 32
4.2
PRACOVNÍ POSTUP......................................................................................................................... 33
4.2.1
HPLC sestava, podmínky separace .................................................................................. 33
4.2.2
Příprava mobilní fáze ...................................................................................................... 34
4.2.3
Příprava zásobního roztoku prazikvantelu (0,5 g/100 ml) .............................................. 34
4.2.4
Příprava standardního roztoku ....................................................................................... 34
4.2.5
Příprava vzorku tablet..................................................................................................... 34
4.2.6
Stanovení obsahu prazikvantelu v tabletách .................................................................. 35
4.3
STRESOVÉ TESTY ............................................................................................................................ 36 VÝSLEDKY A DISKUZE............................................................................................................... 37
5. 5.1
PRAZIKVANTEL .............................................................................................................................. 37
5.1.1
Stabilita roztoku prazikvantelu ....................................................................................... 37
5.1.2
Vliv zvýšené teploty (70°C) na prazikvantel..................................................................... 39
-6-
5.1.3
Vliv kyselého pH na prazikvantel..................................................................................... 42
5.1.4
Vliv oxidace na prazikvantel............................................................................................ 46
5.1.5
Vliv hydrolýzy na prazikvantel......................................................................................... 50
5.1.6
Vliv zásaditého pH na prazikvantel ................................................................................. 53
5.2
VALIDACE METODY ........................................................................................................................ 57
5.2.1
Test vhodnosti chromatografického systému ................................................................. 57
5.2.1.1
Počet pater N ............................................................................................................................ 57
5.2.1.2
Faktor symetrie As .................................................................................................................... 58
5.2.1.3
Rozlišení chromatografických píků Rs ....................................................................................... 58
5.2.1.4
Opakovatelnost analýzy ............................................................................................................ 59
5.2.2
Validace analytické metody ............................................................................................ 60
5.2.2.1
Přesnost .................................................................................................................................... 60
5.2.2.2
Linearita .................................................................................................................................... 60
6.
SHRNUTÍ ZÁVĚRŮ PRÁCE ......................................................................................................... 63
7.
SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................................... 64
8.
SEZNAM TABULEK ................................................................................................................... 65
9.
SEZNAM OBRÁZKŮ .................................................................................................................. 66
10.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY................................................................................................ 67
-7-
1. Úvod Stabilitní testy ve farmacii slouží ke stanovení podmínek skladování léčivých přípravků, k určení vhodného obalového materiálu a doby použitelnosti přípravku. Sledování stability je důležité k zajištění kvalitního, bezpečného a účinného přípravku po celou dobu použitelnosti. K těmto účelům se často používá vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). HPLC je v analýze léčiv využívaná široce. Je to především proto, že se jedná o metodu separační, umožňující kvalitativní i kvantitativní analýzu léčivého přípravku.
-8-
2. Cíl a popis zadání práce Cílem diplomové práce bylo pomocí stresových testů prazikvantelu ověřit jeho stabilitu v léčivém přípravku Caniverm®. V popisu zadání práce bylo vystavit vzorek prazikvantelu extrémním podmínkám, tj. kyselému a zásaditému pH, oxidaci, vodnému prostředí, zvýšené teplotě a sledovat jejich vliv na stabilitu. Byla sledována hladina účinné látky a vznik rozkladných produktů. U jednotlivých testů byl popsán postup přípravy vzorků a charakterizovány podmínky zkoušky. Výsledek testu byl znázorněn obrázky, tabulkami a slovně komentován. Ke zjištění experimentálních výsledků byla použita metoda HPLC. Teoretická část diplomové práce se zabývá teorií HPLC, popisem přípravku Caniverm®, stabilitními testy, stresovými testy a validací metody.
-9-
3. Teoretická část 3.1
Stabilitní testy ve farmacii
3.1.1 Úvod Léčivé přípravky nejsou neomezeně stálé soustavy. Probíhají v nich rozkladné procesy, mění se fyzikální a chemické vlastnosti, časem klesá biologická účinnost. Pacient musí dostat lék kvalitní, tedy vyhovující všem jakostním ukazatelům. Proto je nutné věnovat stabilitě léčivých látek a léčivých přípravků velkou pozornost, a to jak při výzkumu, vývoji, tak při výrobě či distribuci1. Stabilita léčivé látky a léčivého přípravku je vlastnost zachovat si ve stanovených mezích po určitou dobu a za stanovených podmínek uchování určené jakostní znaky. Mírou stability je doba použitelnosti léčivé látky nebo léčivého přípravku. Pro léčiva připravovaná v lékárně postačuje doba použitelnosti několik týdnů, ale pro hromadně (průmyslově) vyráběné léčivé přípravky (HVLP) se většinou deklaruje doba použitelnosti dva až pět let1. Stabilita léčivé látky nebo léčivého přípravku se hodnotí stabilitním testem, kdy jsou v určitých časových intervalech posuzovány změny jakosti, např. změna obsahu účinné látky. Jsou tedy sledovány rozkladné reakce a jejich kinetika. Při vývoji léčivého přípravku se sleduje také kompatibilita jednotlivých složek. Kompatibilita je termín vyjadřující vzájemnou snášenlivost jednotlivých složek léčivého přípravku. Sledování kompatibility je krátkodobá zkouška (řádově hodiny až týdny). Stabilitní zkoušky probíhají měsíce až roky1. Cílem stabilitních zkoušek je prokázat, jak se mění kvalita látky nebo přípravku s časem vlivem různých faktorů prostředí. Doporučit podmínky uchování a stanovit dobu reatestace pro léčivou látku (re-test period) a dobu použitelnosti pro konečný přípravek (shelf-life)2. Sledování stability je důležité k zajištění kvalitního, bezpečného a účinného přípravku po celou dobu použitelnosti. Důsledkem případné nestability léku může být snížení obsahu léčiva, zvýšení koncentrace léčiva, změna biologické dostupnosti, ztráta
-10-
mikrobiologické nezávadnosti, vznik rozkladných produktů nebo změna lékové formy3. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) se sešla v roce 1995 v Japonsku a zavedla směrnice týkající se testování stability nových léčivých látek a léčivých přípravků:
Stability Testing of New Drug Substances and Products Q1A(R2)4
Stability Testing: Photostability Testing of New Drug substances and Products Q1B5
Stability Testing for New Dosage Forms Q1C6
Státní ústav pro kontrolu léčiv (SÚKL) vypracoval pokyn7 týkající se zásad provedení stabilitní studie. Informace o stabilitě léčivé látky a konečného přípravku jsou součástí registrační dokumentace.
3.1.2 Typy stabilitních testů Stabilitní testy se dělí podle podmínek zátěže na stresové testy, zrychlené testy a dlouhodobé testy. Stresové testy se provádí před registrací jako předběžná stabilitní studie a to obvykle na jedné šarži substance nebo produktu. Během stresových testů se léčivo nebo přípravek podrobí extrémní fyzikální a chemické zátěži za účelem urychlení chemického rozkladu léčiva, případně antioxidantů nebo konzervačních látek nebo fyzikální změny produktu8. Cílem testu je stanovit základní vlastnosti substance nebo produktu v modelových zátěžových situacích simulujících extrémní podmínky výroby, skladování, transportu a působení vnějších vlivů. Stresové testy mají identifikovat a charakterizovat degradační produkty a dále ověřit vhodnost metod pro analýzu rozkladných produktů. Pokud je to možné, tak by se měly u rozkladných
produktů
určit
fyzikální
a
chemické
vlastnosti
a
jejich
farmakologická aktivita. Dále je žádoucí u těchto rozkladných produktů zjistit procesy izolace a čištění, vysvětlit jejich reakční kinetiku a vytvořit specifikaci -11-
pro testování na jejich přítomnost, zjistit pravděpodobné množství jejich výskytu v přípravku a dodat reference z dostupných zdrojů o jejich možném biologickém účinku8. Při stresových testech se zkoumá:
Vliv zvýšené teploty – test se provádí s léčivým přípravkem, s léčivem a jeho roztokem. Cílem je určit teplotu, při které je látka zřetelně nestabilní. Maximální testovací teplota je při 180 °C.
Účinek světla - tento test se provádí s přípravkem, s léčivem a jeho roztokem. Ozařuje se definovaným způsobem, např. xenonovou lampou po dobu až 48 hodin.
Účinek pH - zjišťuje se vliv pH (v rozsahu od 0,1% roztoku kyseliny chlorovodíkové až po 0,01% roztok hydroxidu sodného) na 1% roztok léčiva při 60 °C.
Vliv oxidace – zkouší se vliv 0,3% roztoku peroxidu vodíku na 1% roztok léčiva při teplotě 50°C a možnosti oxidace produktu atmosférickým kyslíkem při teplotě 25°C.
Kompatibilita účinné látky a obalu.
Kompatibilita účinné látky s pomocnými látkami.
Vliv vlhkosti, popřípadě další specifické zkoušky pro danou látku1, 9.
Neexistuje žádná směrnice nebo nařízení, které by blíže specifikovaly podmínky stresových testů. Je důležité si uvědomit, že není vhodné použít nejextrémnější vlivy za rychlého rozkladu 100 % látky během krátkého časového intervalu. Vhodnější je zvolit takové podmínky, aby k rozkladu látky docházelo pomaleji a bylo tedy možné lépe sledovat děje probíhající během rozkladu10. Obvykle se sledují hlavní rozkladné produkty, které se identifikují anebo se charakterizují pomocí vhodného parametru (v kapalinové chromatografii např.
-12-
retenčním časem nebo retenčním faktorem). Stresové testy se většinou ukončují při poklesu koncentrace sledované látky o 5 -20%11. Zrychlené testy se provádí při extrémních skladovacích podmínek za účelem urychlení chemického rozkladu nebo fyzikální změny léčiva či léčivého přípravku. Mezi zrychlené testy se řadí jak vlastní zrychlený test, při kterém se na léčivo nebo léčivý přípravek působí teplotou 40°C a 75% relativní vlhkosti po dobu šesti měsíců, tak i test v přechodných podmínkách (30°C a 65% relativní vlhkosti po dobu 1 roku). Obecně platí (u zrychlených a dlouhodobých testů), že by se testování stability mělo provádět v tříměsíčních intervalech během prvního roku skladování. V šestiměsíčních intervalech během druhého roku a dále pak jedenkrát ročně. Data ze zrychleného testu a testu v přechodných podmínkách se mohou použít k výběru vhodné technologie, konečného složení přípravku a pro stanovení skladovacích podmínek. Lze je také použít k ověření stability při krátkodobém skladování přípravku mimo navržené podmínky (např. při přepravě) 3, 12. Pokud generický přípravek vyhoví jakostním požadavkům během zrychleného testu s nejméně čtyřmi odběrovými body, je možno stanovit dobu použitelnosti na dva roky při normálních podmínkách skladování, přičemž se ale musí respektovat doba použitelnosti originálního přípravku9. Při stanovených podmínkách skladování by měla být zvolena dostatečná doba, aby délka studie a podmínky skladování pokryly skladování, distribuci a běžné užití. Studie se provádí na třech šaržích, avšak pokud jde o stabilní látku, tak se provádí na dvou šaržích, které mají vyhovující kvalitu a vyrábí se stejným postupem jako šarže výrobní9. Teplota se musí udržovat v rozmezí 2°C a relativní vlhkosti vzduchu v rozmezí 5%. Tyto limity platí u všech stabilitních studií. Pokud se během šestiměsíčních zrychlených testů objeví výrazná změna, mělo by se provést další testování za přechodných podmínek. Za výraznou změnu se považuje 5% ztráta účinnosti oproti původním hodnotám dané šarže, jakýkoliv rozkladný produkt, který překročí svůj specifický limit, zvýšení pH produktu nad
-13-
stanovenou hodnotu a také pokud nevyhoví specifikaci fyzikálních vlastností a vzhledu3, 4. Jsou povoleny jiné skladovací podmínky, pokud je to oprávněné. Např. u přípravků s termolabilními léčivy se při zrychlených stabilitních testech použije teplota o 15°C vyšší než je navrhovaná skladovací teplota4.
Tabulka 1: Podmínky uchování pro provedení stabilitních studií9 Typ studie
Zrychlená V přechodných podmínkách
Celková délka studie
Minimální délka studie při podání žádosti o registraci (měsíce)
Podmínky skladování
Intervaly hodnocení (měsíce)
40°C
0, (1, 2), 3, 6
6
6
0, (1, 2), 3, 6, 9, 12
12
6
0, (1, 2), 3, 6
6
6
75% rel. vlhkosti 30°C 65% rel. vlhkosti
25% Zrychlená s termolabilní látkou 60% rel. vlhkosti
Dlouhodobé testy se provádějí za doporučených podmínek skladování pro určení doby použitelnosti. Přípravky se testují v originálním uzavřeném obalu. Podmínky skladování závisí na typu klimatického pásma, ve kterém se daný stát nachází. Podle WHO (světové zdravotnické organizace) jsou jednotlivé země zařazeny do různých klimatických pásem podle průměrných teplot a vlhkostí vzduchu dosahovaných na těchto územích. Dlouhodobé stabilitní studie by se měly provádět podle takových podmínek, které odpovídají danému klimatickému pásmu. Česká republika patří do I. klimatického pásma. Testuje se tedy při 25°C a 60% relativní vlhkosti až po dobu pěti let, což je maximální doba použitelnosti léčivého přípravku. Ve všech místnostech v lékárně, kde se uchovávají léčivé přípravky, musí být také proto teplota do 25°C. Při testování přípravků s termolabilní účinnou látkou se přípravky skladují při 5°C (v případě uchování za chladu) nebo při - 20°C (v případě uchování za mrazu)9.
-14-
Tabulka 2: Podmínky dlouhodobých testů pro jednotlivá klimatická pásma9
Klimatické pásmo
I. a II. - mírné a subtropické III. - horké, suché
Teplota (°C)
Relativní vlhkost (%)
25
60
30
35
Interval analýzy (měsíce)
3, 6, 9, 12, 18, 24 (36, 48, 60) 3, 6, 9, 12, 18, 24 (36, 48, 60)
IV. - horké, vlhké
30
65
3, 6, 9, 12, 18, 24 (36, 48, 60)
3.1.3 Hodnocení stabilitních zkoušek Pro testování stability léčivých přípravků se využívá organoleptického hodnocení fyzikálních, chemických, biologických a mikrobiologických zkoušek13. K organoleptickému
hodnocení
při
testování
stability
léčivých
přípravků patří sledování vzhledu zápachu, chuti, barvy nebo čirosti (u roztoků). Hodnotí se například porovnáváním s barevnými standardy, rozpouštěním lékové formy a měřením zbarvení roztoku spektrofotometricky. Velkého významu nabývá organoleptické hodnocení u perorálních roztoků. Pro chuť se určuje druh a stupeň chuti, např. stupeň kyselosti, slanosti. Testuje se převážně po skladování za pokojové teploty ve stanovených časových intervalech 1, 3. Fyzikální zkoušky se liší u jednotlivých lékových forem. Například u parenterálních roztoků se zkouší čirost, ve které se hodnotí případná vířivá sraženina a zákal vznikající reakcí roztoku se skleněným obalem nebo uzávěrem nebo v důsledku jiných chemických změn v roztoku. U suspenzí se hodnotí rychlost sedimentace, objem sedimentu, disoluční profil léčiva a roztřepatelnost sedimentu po skladování za určených podmínek. U polotuhých suspenzních lékových forem se hodnotí konzistence, viskozita a polymorfismus. U transdermálních lékových forem se především sleduje vliv skladování na uvolnění léčivé látky z přípravku. U tablet se k fyzikálním zkouškám řadí zkouška na obsah vlhkosti, zkoušky mechanické odolnosti (pevnost, oděr) a zkouška rozpadu, případně disoluce 1. -15-
Pomocí chemických zkoušek se sleduje zejména vznik rozkladných produktů. Dále se stanovuje obsah účinné látky a vybraných pomocných, např. konzervačních látek. Ke stanovení se využívá chromatografických (zvláště HPLC) a spektrofotometrických metod. Rozkladné procesy zahrnují především oxidaci, hydrolýzu a rozklad vlivem světla1,3. Biologické a mikrobiologické zkoušky mají význam ve skupině hormonů, antibiotik a dalších látek, u nichž nevystačíme s hodnocením obsahu účinné látky chemickými metodami. Patří sem např. testování na nepřítomnost bakteriálních pyrogenů, zkouška na bakteriální endotoxiny, zkouška sterility a zkouška na biologickou účinnost. Jednotlivé lékové formy mají předepsanou mikrobiologickou čistotu, která se musí zachovat i na konci doby použitelnosti1. Extrapolace doby použitelnosti a kinetika rozkladných reakcí: Doba použitelnosti při dlouhodobých stabilitních zkouškách přímo vyplývá z hodnocení vzorků v termínovaných odběrech. Z parametrů rozkladné reakce je možné při kratším průběhu stabilitního testu za předepsaných podmínek předpovědět dobu použitelnosti přípravku. Rozkladné reakce probíhají nejčastěji podle kinetiky 1. řádu. Reakce prvního řádu jsou charakterizovány tím, že reakční rychlost je za dané teploty přímo úměrná koncentraci pouze jediné výchozí látky. Graficky můžeme průběh reakce 1. řádu znázornit například zakreslením okamžité koncentrace proti času. Křivka, kterou takto získáme, je klesající exponenciála2. Pro reakce prvního řádu platí rovnice2:
log = log
−
. 2,303
K
rychlostní konstanta
t
čas
c
koncentrace sledované látky
co
počáteční koncentrace sledované látky
-16-
3.3.1
Grafem závislosti log c = f (t) je přímka. Pro výpočet rychlostní konstanty se používá směrnice (tg α) této přímky:
K = - 2,303 tg α
3.3.2
Aktivační energie Ea vyjadřuje energii, kterou musí molekula získat, aby rozkladná reakce proběhla. Teplotní závislost rychlostní konstanty vyplývá z Arrheniovy rovnice (teplotní závislost rychlostní konstanty K).
log
= log
A
frekvenční faktor
R
plynová konstanta
T
absolutní teplota
Ea
aktivační energie
−
2,303.
3.3.3
Na základě znalosti hodnoty rychlostní konstanty a aktivační energie lze pomocí uvedených vzorců vypočítat dobu použitelnosti léčivého přípravku při dané sladovací teplotě. Dobu použitelnosti je také možno odečíst z grafu při extrapolaci hodnot koncentrace2. Mezi faktory, které mohou ovlivňovat stabilitu, patří čas, teplota, vlhkost, místo výroby, světlo, léková forma, dodavatelé, velikost a typ obalu, naplněný objem, šarže a síla přípravku2. Sleduje se stabilita fyzikální, chemická, biologická a mikrobiální. V tabulce 3 jsou uvedeny požadavky jakosti při stabilitní zkoušce.
-17-
Tabulka 3: Požadavky na znaky jakosti při stabilitní zkoušce2. Znaky jakosti
Požadavky na stabilitu
Fyzikální
Původní fyzikální vlastnosti včetně vzhledu zůstávají zachovány ve stanovených mezích
Chemické
Obsah léčivých látek, pomocných látek a rozkladných produktů je ve stanovených mezích (minimálně 90% účinné látky, 80% konzervačních přísad)
Biologické
Biologická účinnost se nemění nebo její míra zůstává ve stanovených mezích, nedochází ke zvýšení toxicity a jiných negativních biologických jevů
Mikrobiologické Zůstává zachována požadovaná mikrobiologická čistota
Fyzikální změny: Fyzikální nestabilita se u směsí tuhých látek projevuje nejčastěji změnou krystalické struktury, obsahu vody (vlhkosti), případně sublimací. Pokud jsou tuhé látky dispergované v kapalině nebo se jedná o dispergovanou směs omezeně mísitelných kapalin, projevuje se nestabilita změnou velikosti částic, oddělením fází a snížením obsahu těkavých látek. Je-li pevná látka rozpuštěna v kapalině, může dojít k jejímu vysrážení a vykrystalizovování1. Chemické změny: Léčivé látky a přípravky jsou náchylné na hydrolýzu a oxidativní změny. Dojít může však i k dekarboxylaci, fotolýze, racemizaci, redukci nebo polymerizaci. Hydrolýza – hydrolytickému rozkladu podléhají nejvíce látky typu esterů, amidy, anilidy, karbamáty, laktony, thioestery, thioamidy a další. Hlavní ochranou před hydrolýzou je příprava jiných lékových forem, nejsou vodné roztoky. Pokud se vodné roztoky připravují a skladují, je nejdůležitějším faktorem ovlivňujícím stabilitu volba optimálního pH. U pevných lékových forem může hydrolýzu vyvolat obsah vody přítomný v tabletách, tzv. vlhkost. Vhodnou úpravou
účinných
a
pomocných
látek
lze
však
hydrolýze 2
(např. vysušení látek, mikrokapsulace či potahování tablet) . -18-
předejít
Oxidace – na oxidaci jsou citlivé nejvíce sloučeniny obsahující ve své molekule násobné vazby (nenasycené mastné kyseliny, terpeny). Oxidaci taktéž podléhají aldehydy, ketony, fenoly, terciální aminy a další. Oxidace je spojena často s přijetím kyslíku nebo odebráním vodíku. Látka se oxiduje tím snadněji, čím má menší redoxní potenciál. Oxidace se při vyšším pH zrychluje, protože se redoxní potenciál zmenšuje zvýšením pH. U některých léčivých látek byly nalezeny vhodné hodnoty pH na potlačení oxidativního rozkladu. Oxidaci vzdušným kyslíkem ovlivňuje kromě pH i světlo a teplo. Na oxidaci působí katalyticky těžké kovy. Látky podléhající oxidativnímu rozkladu lze stabilizovat vyloučením faktorů, které oxidaci způsobují, iniciují a urychlují (např. použití inertních plynů u parenterálií ve vzduchotěsném obalu, snížení pH ve vodných roztocích) nebo použitím antioxidačních látek. Primární antioxidanty jsou látky, které mají nižší redoxní potenciál než léčivé látky, oxidují se tak proto rychleji a vychytávají kyslík, který ohrožuje léčivou látku. Sekundární antioxidanty bývají komplexotvorné látky2. Fotolýza – je fotochemický rozklad. Fotolýzu způsobuje ultrafialová a viditelná část spektra. K látkám, které jsou citlivé na světlo, patří furosemid, nitrazepam, tetracyklin a další. Světlo může mít vliv jak na účinné látky, tak i na pomocné látky. Nejlepší ochranou před fotolýzou je volba vhodného obalu2. Dekarboxylace - je závislá na pH, rozpouštědle a případném vlivu vícemocných iontů1,2. Biologická stabilita: Změny
biologické
aktivity
se
hodnotí
v hormonech
a
různých
enzymaticky aktivních peptidech. Zabránit nežádoucím změnám v biologické aktivitě u citlivých látek lze skladováním za snížené teploty, ochranou před vzdušným kyslíkem, přípravou vhodných lékových forem (např. lyofilizáty) a vhodným pH prostředí během výroby. Projevem biologické nestability může být i změna toxicity léčivé látky2. Mikrobiologická stabilita: Při výrobě a skladování jsou léčivé přípravky vystaveny nebezpečí kontaminace bakteriemi, kvasinkami a plísněmi2. -19-
3.2
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
3.2.1 HPLC a její přednosti Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - High Performance Liquid Chromatography - je separační metoda umožňující kvantitativní i kvalitativní hodnocení separovaných složek směsi. Jde o velice citlivou metodu nacházející uplatnění ve všech oblastech analýzy léčiv. Hlavní přednosti HPLC jsou:
Rychlost analýzy
Citlivost analýzy v závislosti na použitém detektoru
Pro analýzu postačuje minimální množství vzorku
Možnost automatizace - po nastavení příslušných parametrů lze provádět desítky analýz bez obsluhy
Prakticky ve všech výše uvedených ukazatelích je HPLC srovnatelná s plynovou chromatografií, avšak vzhledem k tomu, že většina léčiv není těkavá, je právě v analýze léčiv HPLC mnohem použitelnější technikou než GC14. 3.2.2 Schéma přístroje:
Obrázek 1: Schéma kapalinového chromatogramu15 HPLC chromatografické kolony pro analytické účely jsou nejčastěji dlouhé 10-25 cm a jsou zpravidla zhotoveny z nerezové oceli nebo ze skla. Kolony jsou -20-
naplněny vhodnými sorbenty. V HPLC se nejvíce používají tzv. chemicky vázané stacionární fáze. Na hydroxylové skupiny na povrchu silikagelových zrnek jsou vhodnou chemickou reakcí navázány různé radikály14:
Obrázek 2: Chemická modifikace silikagelu pomocí silylace16
Nejčastěji se jedná o uhlovodíkové řetězce obsahující zpravidla 18 (případně 8) uhlíkových atomů. Jde o nepolární chemicky vázané fáze (tzv. reverzní fáze)
Radikál obsahuje tříuhlíkatý řetězec zakončený skupinami -NH2, -CN. Jde o středně polární fáze.
Chemicky vázané stacionární fáze se vyrábějí v různých typech a jako nosič, na kterém jsou navázány radikály, se kromě silikagelu používají i jiné materiály. Jako HPLC sorbenty se rovněž používají silikagel a oxid hlinitý (polární sorbenty), avšak daleko méně než chemicky vázané stacionární fáze. HPLC analýzu lze provádět za konstantního složení mobilní fáze v průběhu celé analýzy. Jedná se pak o izokratickou eluci. Izokratická eluce se pro analytické účely provádí nejčastěji. Je vhodná k dělení látek s podobnými chemickými vlastnostmi. Pokud je v průběhu analýzy programově měněno složení mobilní fáze, pak jde o gradientovou eluci. Gradientová eluce je vhodná pokud vzorek obsahuje složky s velmi rozdílnou polaritou. Polární látky jsou eluovány rychle, nepolární látky mají dlouhé retenční časy14.
-21-
3.2.3 Kvalitativní a kvantitativní analýza. Detektory Předpokladem
úspěšné
HPLC
analýzy
je
optimalizace
chromatografických podmínek tak, aby jednotlivé složky směsi poskytovaly ostré a symetrické chromatografické píky, rozdělené pokud možno na základní linii. Základní kvalitativní charakteristikou je retenční čas tR. Retenční čas je doba od nástřiku vzorku na kolonu k maximu chromatografického píku. Důkazem totožnosti je shoda retenčních časů chromatografického píku léčiva v analyzovaném vzorku s retenčním časem píku standardu. Kvantitativní
charakteristikou
chromatografické
analýzy
je
plocha
(eventuálně výška) chromatografického píku. Citlivost a selektivita chromatografické analýzy závisí na použitém detektoru14. Typy detektorů: a) Spektrofotometrické detektory Spektrofotometrické detektory jsou v analýze léčiv používány nejčastěji, jelikož se vyznačují značnou citlivostí (10-9 až 10-10 g/ml). Proměřují absorbanci elektromagnetického záření určité vlnové délky složkami eluátu protékajícího celou detektoru. K detekci léčiv se využívá UV oblast spektra, mnohem méně viditelná či infračervená oblast spektra. Tyto detektory se mohou využít při gradientové eluci. b) Fluorimetrické detektory Tyto detektory jsou vhodné u léčiv, která vykazují fluorescenci. Látky, které ji nevykazují, lze často derivatizací s činidly převést na fluoreskující deriváty. Fluorimetrické detektory jsou selektivnější a citlivější (10-9 až 10-12 g/ml) než spektrofotometrické detektory. Jde je také použít u gradientové eluce.
-22-
c) Elektrochemické detektory Elektrochemické detektory jsou též značně citlivé (10-9 - 10-12 g/ml). Využívají se u dějů, které souvisejí s elektrochemickou reakcí a probíhají na rozhraní elektroda-eluent. Proměřují elektrochemickou veličinu, jejíž hodnota je závislá na koncentraci analyzovaného léčiva. Většinu z těchto detektorů nelze použít při gradientové eluci. d) Refraktometrické detektory Refraktometrické detektory měří rozdílný index lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem vytékajícím z kolony. Nejsou příliš citlivé a nelze je využít při gradientové eluci. e) Hmotnostně spektrometrické (MS) detektory Spojení HPLC-MS je vysoce citlivé, selektivní, avšak finančně velice náročné14.
3.2.4 Nejdůležitější oblasti využití HPLC HPLC se využívá při lékopisné kontrole chemických léčiv. Kontroluje se totožnost, obsah a čistota léčiva. Dále se využívá při analýze složených lékových přípravků a při stabilitních studiích, kdy se zjišťuje, zda je léčivo vlivem extrémních podmínek stabilní nebo dochází-li ke vzniku rozkladných produktů. HPLC se velice často používá také při analýze přírodních léčiv v rostlinném materiálu nebo při monitorování léčiv a metabolitů v tělních tekutinách14. V této diplomové práci byla tato instrumentální metoda využita při sledování stability prazikvantelu.
.
-23-
3.3
Léčivý přípravek Caniverm® Léčivý přípravek Caniverm® je antiparazitikum proti oblým a plochým
červům.
3.3.1 Složení a léková forma Léčivé látky:
Febendazolum 150 mg Pyranteli embonas 144 mg Prazikvantelum 50 mg
Pomocné látky:
Mikrokrystalická celulóza Monohydrát laktózy Bramborový škrob Stearan hořečnatý Povidon K 90 Koloidní bezvodý oxid křemičitý
Léková forma:
Tablety
3.3.2 Použití Přípravek
se
používá
v následujících
indikacích:
Onemocnění
způsobená škrkavkami a tasemnicemi psů, koček, kočkovitých a psovitých šelem. (Toxocara canis, Toxocara cati, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Ancylostoma canium, Trichuris vulpis, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Dipylidium canium, Taenia spp., Multiceps multiceps, Mesocestoides spp.)17.
-24-
3.3.3
Prazikvantel CAS:
55268 55268-74-1
Definice:
Je
to
(11bRS)-2-(cyklohexankarbonyl) (cyklohexankarbonyl)-1,2,3,6,7,11b-
hexa-hydro-4H-pyrazino[2,1-a]isochinolin a]isochinolin-4-on. Obsah:
Obsahuje 97,5% 9 až 102,0 ,0 % sloučeniny C19H24N2O2, počítán na vysušenou látku. počítáno
Vzhled:
Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek.
Rozpustnost: Velmi těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v etanolu 96% a v dichlormethanu. MR:
312 312,41
Vzorec:
viz. obr. o 3
Prazikvantel má svoji monografii s názvem Praziquantelum v ČL 2009 18 (evropská část, 2. díl, str. 2981-2982) 2981 .
Obrázek 3: Chemická struktura prazikvantelu19
-25-
3.4
Souhrn rešerše Z dostupných literárních zdrojů byla vypracována rešerše se zaměřením
na nalezení informací o stabilitě prazikvantelu a HPLC metodách jeho stanovení. Prazikvantel vykazuje stabilitu za zvýšené teploty. Dále je prazikvantel fotolabilní. Pokud je po delší dobu vystaven slunečnímu záření, tak dochází ke ztrátě okolo 50 % původní koncentrace. Prazikvantel byl na světle a při zvýšené teplotě nestabilní, pokud byl sledován ve vodném prostředí. Rychlost rozkladu prazikvantelu se zvyšuje s rostoucím pH rozpouštědel a snižuje se zvýšením koncentrace léčiva. Rychlost rozkladu prazikvantelu při světelné reakci ve vodném prostředí je rychlejší než u tepelného rozkladu. Pro analýzu prazikvantelu a jeho hlavních rozkladných produktů byla použita metoda HPLC20. Prazikvantel je stabilní po dobu dlouhodobé i zrychlené stabilitní studie v rámci testování přípravku Profender, který obsahuje dvě účinné látkyprazikvantel a emodepsid21. Profender je přípravek pro kočky na parazitická onemocnění způsobená oblými a plochými červi. Hepatocyty izolované ze samce krysy byly využívány ke zjištění metabolického rozkladu prazikvantelu. Studie byly navrženy ke zkoumání odlišnosti v biotransformaci prazikvantelu a jeho enantiomerů. Bylo zjištěno, že hepatocyty převedly oba enantiomery prazikvantelu na hlavní metabolity cis a trans-4-hydroxyprazikvantel22. Pro stanovení prazikvantelu v plasmě a moči byla vyvinuta HPLC metoda. Tato analýza byla provedena na Ultrasphere ODS C18 koloně s mobilní fází acetonitril-voda při UV detekci 217 nm23. Pro stanovení prazikvantelu v lidské plasmě byla vyvinuta a validována HPLC metoda s využitím Spherisorb ODS 2 kolony. Jako mobilní fáze byla použita směs acetonitril-methanol a voda. UV detekce probíhá při vlnové délce 217nm. Jako vnitřní standard byl použit diazepam24.
-26-
3.5
Validace analytických metod Validace analytické metody je série experimentů, kterými se zjistí
nejdůležitější charakteristiky metody, potvrdí se, že dává reprodukovatelné a spolehlivé výsledky a je vhodná k zamyšlenému použití. Hlavním cílem validace je hodnocení analytických a výkonnostních znaků metod a průkaz, že bylo dosaženo požadované úrovně těchto znaků. Cílem je též vyšetřit praktické hranice, ve kterých je zkušební postup použitelný, a zajistit, aby při opakovaném použití v jedné nebo různých laboratořích dávala metoda stále stejné a spolehlivé výsledky. Součástí všech chromatografických metod (tj. HPLC, GC a densitometrie) musí být test způsobilosti chromatografického systému. Každá analytická metoda musí být validována a tato validace musí být v registrační dokumentaci doložena výsledky. Validace analytické metody je oddělený akt. Obecně je postup vývoje metod takový, že nejprve se definují požadavky na zkušební metodu (např. selektivní stanovení účinné látky v tabletě s přesností menší než 1% nebo stanovení rozkladného produktu s detekčním limitem menším než 0,1%). Vyvine se metoda, najdou se optimální podmínky a třetím bodem postupu je validace, tj. pomocí experimentálních dat se prokáže, že splňuje metoda na začátku definované požadavky. Současně se musí definovat podmínky, za kterých se bude metoda používat. Vytvořit tyto podmínky je dalším cílem validačního procesu. Při každém dalším použití nově vyvinuté validované metody se už validace neopakuje, ale testují se právě tato kritéria. Pokud metoda splňuje kritéria, lze výsledky považovat za spolehlivé. Tato kritéria se nazývají test způsobilosti analytického systému. U chromatografických metod je nezbytné užít takové podmínky, aby byla zajištěna účinnost a separační schopnost konkrétního chromatografického systému, i kdyby se tyto podmínky trochu lišily od podmínek popsaných v postupu. Aby bylo možné snadno, rychle a s jistotou nalézt vhodné podmínky, musí být součástí chromatografické metody test způsobilosti, který se provádí při každé změně chromatografického systému, před každou novou sérii měření nebo před použitím metody v jiné laboratoři. -27-
Dvěma
základními
údaji
testu
způsobilosti
jsou
požadavky
na
reprodukovatelnost chromatografického systému a na rozlišení dvou vybraných píků. Lze udávat i jiné parametry, které jsou specifické pro konkrétní metodu. Jde například o počet teoretický pater, faktor symetrie píku, minimální či maximální retenční čas, kapacitní poměr stanovované látky, nebo mez detekce25. Obecné analytické parametry používané při validaci jsou:
Přesnost (opakovatelnost, reprodukovatelnost)
Linearita, rozsah
Správnost
Detekční a kvantitativní limit
Selektivita
Robustnost
Přesnost je míra shody mezi jednotlivými výsledky metody opakovaně prováděné s homogenním vzorkem. Podle podmínek opakování metody se rozlišuje opakovatelnost a reprodukovatelnost. Při
stanovení
opakovatelnosti
se
metoda
provádí
na
jednom
zhomogenizovaném vzorku jedním analytikem, na tomtéž přístroji a se stejnými činidly. Při stanovení reprodukovatelnosti se metoda provádí na jednom zhomogenozovaném vzorku, ale s různými analytiky v různých laboratořích a s různými činidly i přístroji. Jde vlastně o přesnost při přenosu metody z jedné laboratoře do druhé. Přesnost se vyjadřuje jako relativní směrodatná odchylka a stanoví se minimálně ze šesti nezávislých analýz homogenizovaného vzorku provedených kompletním postupem, počínaje přípravou vzorku. Nestačí jen šestkrát nastříknout do chromatografu jeden roztok, ale je nezbytně nutné připravit kompletním postupem šest roztoků vzorku. Linearita je schopnost metody dávat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky ve vzorku. Linearita analytické metody se doloží graficky jako závislost výsledků na koncentraci stanovené látky, nebo matematicky pomocí výsledků lineární regresní analýzy. Korelační faktor je mírou linearity a směrnice -28-
citlivosti mírou vedlejších vlivů. SÚKL požaduje potvrzení linearity v rozmezí 50 - 150% deklarovaného obsahu a stanovení minimálně pěti různých koncentrací standardní látky. Správnost je odchylka výsledku metody od správné hodnoty. Správná hodnota se zjistí buď jinou, nezávislou metodou, jejíž správnost je ověřena, nebo analýzou modelového vzorku, tj. placeba s přidaným standardem nebo, není-li k dispozici placebo, analýzou vzorku s přídavkem standardní látky. Vyjadřuje se jako rozdíl hodnot nebo jako výtěžnost (recovery) : nalezená hodnota x 100 / skutečná hodnota Pokud se analyzuje modelový vzorek, přidává se standardní látka v množství menším i větším než je deklarovaný obsah. Některé postupy uvádějí 10%, jiné 50%. SÚKL požaduje jen jednu hladinu, tedy stanovení minimálně šesti
různých
modelových
vzorků
s přibližně
stoprocentním
obsahem
stanovované látky. Při přidání standardní látky ke vzorku se přidává méně než 100%, aby se výsledek nedostal mimo kalibrační křivku. Detekční a kvalitativní limit udává citlivost metody. Tyto parametry je nutné stanovit u metod pro stanovení nečistot. Detekční limit je pro limitní testy. Limitní testy jsou testy zjišťující, je-li látka nad nebo pod určitou hranicí. Je to nejnižší
detekovatelná
koncentrace
látky,
nestanovované
kvantitativně.
Kvantitativní limit je pro kvantitativní stanovení obsahu nečistot. Je to nejnižší koncentrace látky, stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Stanovení těchto limitů závisí na tom, zdali jde o metodu neinstrumentální nebo instrumentální. U neinstrumentálních metod se hledají tyto limity experimentálně. To znamená, že se zanalyzují vzorky o známé koncentraci stanovované látky a určí se minimální koncentrace, kdy je možné ještě látku detekovat, anebo ji lze ještě stanovit s přijatelnou přesností a správností. U
instrumentálních
metod
se
zjišťují
tyto
limity
na
základě
šumu.
Jednou z možností je, že se stanoví směrodatná odchylka odezvy slepého vzorku,
její
trojnásobek
odpovídá
detekčnímu
limitu
a
desetinásobek
kvalitativnímu limitu. Získaná hodnota se pak ověří analýzou příslušné koncentrace vzorku. -29-
Selektivita
je
schopnost
metody
změřit
správně
a
specificky
stanovovanou látku v přítomnosti jiných látek. Tyto jiné látky mohou být další účinné složky u kombinovaných přípravků, pomocné látky, nečistoty z výroby, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla nebo jiné dosud neznámé látky. Je též nezbytně nutné doložit, zda je metoda dostatečně selektivní pro dané použití. Metoda pro stanovení obsahu účinné látky nesmí být rušena výchozími látkami, vedlejšími produkty, pomocnými látkami nebo dalšími složkami přípravku, případně zbytkovými rozpouštědly. U stabilitu indikující metody musí být doloženo oddělení rozkladných produktů. Selektivita se vyjadřuje jako rozdíl mezi výsledky analýzy vzorku bez nečistot a vzorku s přidanými rozkladnými produkty, složkami placeba nebo různými nečistotami. Jsou-li nečistoty nebo rozkladné produkty neznámé nebo nedostupné, je možné selektivitu prokázat jako výtěžnost standardního přídavku čisté látky k materiálu, který obsahuje stálé množství jiných látek. Robustnost je míra reprodukovatelnosti výsledků získaných analýzou jednoho homogenního vzorku v různých laboratořích, různými analytiky, na různých přístrojích a s různými činidly. Je to vlastně reprodukovatelnost výsledků z parametru přesnost. Míra schopnosti metody dávat správné a přesné výsledky i při menších změnách pracovních podmínek, ke kterým nutně dochází při provádění metody v jiné laboratoři, i když popsaný postup zůstává zachován. Nelze obecně požadovat konkrétní hodnoty jednotlivých parametrů, záleží na použité metodě, jejím cíli i vzorku, jenž je analyzován. Přijatelnost získaných hodnot validačních parametrů v konkrétním případě musí posoudit příslušný analytik. Ke každému případu se musí přistupovat rozumně, aby byla zaručena potřebná kvalita a přitom se nedělala zbytečně. Obecně se lze při výběru validačních parametrů řídit následující tabulkou25.
-30-
Tabulka 4: Parametry požadované pro validaci metody25 METODA PRO STANOVENÍ
PŘESNOST SPRÁVNOST SELEKTIVITA LINEARITA DETEKČNÍ LIMIT KVANTITATIV. LIMIT ROBUSNOST
obsahu účinné nebo konzerv. látky
test kvantitativní
test limitní
ANO ANO ANO ANO NE
ANO ANO ANO ANO NE
NE PŘÍPADNĚ ANO NE ANO
ANO PŘÍPADNĚ PŘÍPADNĚ PŘÍPADNĚ NE
NE
ANO
NE
PŘÍPADNĚ
ANO
ANO
ANO
ANO
nečistot
-31-
zkouška lékové formy
4. Experimentální část 4.1
Materiál
4.1.1 Vzorky léčivých přípravků
Caniverm® tablety 700 mg, šarže: 195813, Bioveta a.s., Česká republika
4.1.2 Chemikálie
Acetonitril pro HPLC CHROMASOLV®, šarže: SZBB081SV, Sigma-Aldrich, Německo
Hydroxid sodný, šarže: 1502010210, PENTA, Česká republika
Kyselina sírová 95-97%, šarže: SZBA2840, Sigma-Aldrich, Německo
Methanol pro HPLC CHROMASOLV®, šarže: SZBA162, SigmaAldrich, Německo
N,N-dimethylformamid, šarže: 82250 Sigma-Aldrich, Německo
Peroxid vodíku 30%, šarže: BCBC3539, Sigma-Aldrich, Německo
Prazikvantel VETRANAL 99,6%, šarže: 2053X, Sigma-Aldrich, Německo
Ultračistá voda, čištěná systémem Milli-Q, Millipore, USA
4.1.3 Pomůcky a přístroje
Analytické váhy, Sartorius, Německo
Filtrační sada Millipore, USA
Filtrační zařízení pro přípravu ultra čisté vody Milli-Q, Millipore, USA
-32-
HPLC kolona Supelco Discovery® HS C18, 150 x 4,6 mm x 5 m, Sigma-Aldrich, Německo
HPLC sestava: LC – 2010C SHIMADZU, Shimadzu corp., Japonsko
Injekční stříkačky Luer 5ml, Chirana T. injecta, Slovensko
Mikropipeta Transferpette 5ml, Brand, Německo
Mikropipeta Transferpette1000 l Brand, Německo
Q-Max Syringe Filtres, průměr 25 mm, membrána nylon, velikost pórů 0,45 µm, Frisenette ApS, Dánsko
Ultrazvuková lázeň Sonorex Digitec, Bandelin, Německo
Vodní lázeň, Memmert, Německo
Laboratorní sklo: kádinky, pipety dělené a nedělené, odměrné válce, odměrné baňky, nálevky, atd.
Další pomůcky: pipetovací balónek, váženky, zátky, plastové zkumavky, kovová lžička, kovové svorky, špičky pro mikropipety Transferpette
4.2
Pracovní postup
4.2.1 HPLC sestava, podmínky separace HPLC sestava:
LC – 2010C SHIMADZU
Kolona:
Supelco Discovery® HS C18 (Sigma Aldrich), délka 15 cm, průměr 4,6 mm, velikost částic 5m
Zpracování dat:
Class VP 6.13
Mobilní fáze:
acetonitril:voda= 45:55 (v/v), před použitím přefiltrovaná přes skleněný filtr pomocí sady Millipore -33-
Průtok mobilní fáze:
Fm= 1,0 ml/min
Typ eluce:
izokratická eluce
Vlnová délka detekce:
= 220 nm
Objem nástřiku:
V= 10 l
Teplota:
laboratorní
Podmínky separace byly zvoleny tak, aby měl prazikvantel dostatečně vysoký retenční čas a aby případně vznikající rozkladné produkty byly dostatečně od sebe odděleny.
4.2.2 Příprava mobilní fáze Mobilní fáze byla připravena smísením 55 objemových dílů vody a 45 objemových dílů acetonitrilu pro HPLC. Voda byla filtrována pomocí filtračního zařízení na mobilní fáze Millipore za použití filtru ze skleněných vláken o velikosti pórů 0,45 m.
4.2.3 Příprava zásobního roztoku prazikvantelu (0,5 g/100 ml) Přibližně 500,0 mg prazikvantelu bylo rozpuštěno v methanolu v 100 ml odměrné baňce a doplněno methanolem po rysku.
4.2.4 Příprava standardního roztoku Standardní roztok byl připraven podle jednotlivých postupů dle kap. 5.1.1-5.1.6.
4.2.5 Příprava vzorku tablet Pro přípravu vzorku byla použita interní metoda: 35 mg rozdrcené tabletoviny se naváží do 25 ml odměrné baňky a doplní se směsí -34-
N, N-dimethylformamid-methanol v poměru 2:3 (v/v) po rysku. Směs se umístí po dobu 10 minut do ultrazvukové lázně (10-15°C). Po uplynutí této doby se vzorek přefiltruje přes membránový filtr o velikosti pórů 0,45 m.
4.2.6 Stanovení obsahu prazikvantelu v tabletách Vypočet obsahu prazikvantelu se provede podle vzorce:
=
∙
∙
∙ 25 ∙ ∙ 100
C
obsah stanovované složky v mg v jedné tabletě
AV
plocha píku vzorku
As
plocha píku standardu
mV
navážka vzorku v mg
ms
navážka standardu v mg
T
průměrná hmotnost tablety v mg T= 700 mg
-35-
4.2.1
4.3
Stresové testy Přípravek Caniverm® 700 mg, Bioveta a.s. obsahuje tyto účinné látky: Fenbendazolum 150 mg Pyranteli embonas 144 mg Prazikvantelum 50 mg V rámci diplomové práce byla věnována pozornost prazikvantelu. Tato účinná látka byla vystavena vlivu stresových testů. Stresové testy jsou zkoušky, při kterých je léčivo nebo přípravek vystaven vlivu extrémních podmínek. Cílem mé práce bylo vystavit vzorek prazikvantelu rozdílnému pH, oxidaci, vodnému prostředí a zvýšení teploty a sledovat vliv na jejich stabilitu. Byla sledována změna hladiny účinných látek a vznik rozkladných produktů. U jednotlivých testů byl popsán postup přípravy vzorků a charakterizovány podmínky zkoušky. Výsledek testu je znázorněn obrázky a tabulkami a slovně komentován. Délka trvání testu byla zvolena pro každou zkoušku samostatně s ohledem na stabilitu látky v daném prostředí. Síla použité kyseliny sírové, hydroxidu sodného a peroxidu vodíku, stejně jako podíl vody a použitá teplota byly optimalizovány tak, aby v průběhu testovacího časového intervalu (nejčastěji 4 hodiny nebo 48 hodin) byl pokles/nárůst koncentrace sledované látky maximálně 20%. pH* vzorku i standardů bylo před vlastní HPLC analýzou v případě potřeby upraveno kyselinou/zásadou na neutrální hodnotu. Látka je v rámci diplomové práce považována za stabilní, pokud v průběhu testu nedojde k poklesu/nárůstu její koncentrace o více než 5 %.
-36-
5. Výsledky a diskuze Roztok léčivé látky prazikvantelu byl vystaven vlivu kyselého prostředí (kyselina sírová), zásaditého prostředí (hydroxid sodný), oxidace (peroxid vodíku), vlivu vodného prostředí a použitého rozpouštědla za laboratorní (25°C) a zvýšené teploty (50°C nebo 70°C). Vliv zvýšené teploty byl proveden s léčivým přípravkem, roztokem přípravku a s léčivem. Byl hodnocen pokles/nárůst plochy píku prazikvantelu (vyjádřeno v % a vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod). Zároveň byl sledován vznik rozkladných produktů. Byl sledován nárůst plochy píku rozkladného produktu a vyjádřen v % plochy píku prazikvantelu, vztaženo na plochu v čase t = 0 hod.
5.1
Prazikvantel
5.1.1 Stabilita roztoku prazikvantelu Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5 g/100 ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml v methanolu a analyzován pomocí HPLC.
450
400
350
mAu
300
400
350
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 4: Standard prazikvantelu, čas t= 0 hod -37-
7,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel-hned003
Retention Time Name
6,37 prazikvantel
500
Laboratorní teplota - vzorek K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml methanolu. Po 1, 4, 24 a 48 hodinách (při teplotě 25oC) byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC. Výsledek: Výsledek působení methanolu na prazikvantel za laboratorní teploty je dokumentován v tabulce 5 a na obrázku 5. Prazikvantel je v prostředí methanolu stabilní. Na chromatogramu nejsou detekovány žádné rozkladné produkty. Tabulka 5: Vliv rozpouštědla na stabilitu prazikvantelu
počátek
Plocha
Průměr
Plocha %
2601473
2603404
100%
2679550
102,92%
2649559
101,77%
26820165
102,92%
2701206
103,76%
2605336 po 1 hod
2675155 2683946
po 4 hod
2643102 2656017
po 24 hod
2675674 2688359
po 48 hod
2693760 2708652
-38-
450
400
350
mAu
300
400
350
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+MeOH-po48hod001
Retention Time Name
6,34 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 5: Vliv rozpouštědla na stabilitu prazikvantelu po 48 hodinách
5.1.2 Vliv zvýšené teploty (70°C) na prazikvantel Sledování vlivu zvýšené teploty bylo provedeno s léčivým přípravkem, roztokem přípravku a s léčivem. Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5g /100ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml v methanolu a analyzován pomocí HPLC. Vzorek: a) K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml methanolu. Po 1, 2, 3 a 4 hodinách (při teplotě 70°C) působení methanolu byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC. b) Rozdrcená tableta Canivermu® 700 mg byla použita pro přípravu roztoku vzorku podle kapitoly 3.2.5. a byla hned po přípravě roztoku umístěna na vodní lázeň (70 °C). Po 1, 2, 3 a 4 hodinách byl vzorek analyzován pomocí HPLC.
-39-
c) Rozdrcená tableta Canivermu® 700 mg byla umístěna na vodní lázeň (70 °C). Po 1, 2, 3 a 4 hodinách byl připraven vzorek podle postupu uvedeného v kapitole 3.2.5. a vzorek byl analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek vlivu zvýšené teploty je dokumentován v tabulce 6, 7, 8 a na obrázku 6. Výpočet obsahu prazikvantelu ve vzorku tablet (tabulka 7) byl proveden podle vzorce 4.2.1 a byl převeden na procenta deklarovaného množství prazikvantelu, výpočet obsahu substance (vzorek a) byl přepočítán na plochu odpovídající přesné navážce 25,00 mg. Prazikvantel je za zvýšené teploty stabilní v roztoku methanolu, jako substance a i v testovaném léčivém přípravku. Na chromatogramu nejsou detekovány žádné rozkladné produkty. Tabulka 6: Vliv zvýšené teploty na substanci prazikvantelu – působení methanolu
počátek
Plocha
Průměr
Plocha%
2612038
2657452
100%
2623096
98,71%
2702238
101,69%
2750986
103,52%
2740968
103,14%
2702867 po 1 hod
2621840 2624353
po 2 hod
2707854 2696622
po 3 hod
2753585 2748388
po 4 hod
2740236 2741701
-40-
450
400
350
m Au
300
400
350
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
m Au
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+MeOH-vod019.laz-po4hod
Retention Time Name
6,38 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 6: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel - působení methanolu po 4 hodinách
Tabulka 7: Roztok léčivého přípravku Caniverm®
Počátek:
Plocha
Průměr
Plocha %
1190680
1190630
100,00
1228730
103,20%
1236669
104,60%
1238377
105,70%
1236898
104,10%
1190580 po 1hod:
1237342 1220119
po 2hod:
1246635 1226703
po 3hod:
1235853 1240901
po 4hod:
1217781 1256016
-41-
Tabulka 8: Tabletovina léčivého přípravku Caniverm®
Počátek:
Plocha
Průměr
Plocha %
1225692
1224141
100,00%
1273107
104,00%
1252026
102,70%
1280095
104,30%
1274053
104,80%
1222590 po 1hod:
1276430 1269784
po 2hod:
1252484 1251569
po 3hod:
1279787 1280404
po 4hod:
1278543 1269564
5.1.3 Vliv kyselého pH na prazikvantel Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5 g/100 ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml směsí methanol – 2% kyselina sírová 95-5 (v/v) a analyzován pomocí HPLC.
450
400
mAu
350
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Minutes
Obrázek 7: Standard prazikvantelu, čas t= 0 hod
-42-
5,5
6,0
6,5
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2SO4-vod007.laz-hned
Retention Time Name 6,36 prazikvantel
500
a) Laboratorní teplota -vzorek: K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml 2% kyseliny sírové. Po 1, 4, 24 a 48 hodinách (při teplotě 25oC) působení kyselého pH byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek působení kyselého pH za laboratorní teploty je dokumentován v tabulce 9 a na obrázku 8. Prazikvantel není v prostředí kyseliny sírové stabilní. Vzniká rozkladný produkt 1 (RP 1; tR 4,50 min). Rozkladný produkt je oddělen od píku prazikvantelu (rozlišení 9,08). Tabulka 9: Vliv kyselého pH na prazikvantel Prazikvantel
RP 1, tR 4,50 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
0 hod
2801473
2803404
100,00%
-
2822704
2826928
100,84%
2790733
2796594
99,76%
2699513
2705813
96,52%
2311736
0,01
290
294
0,01
5372
5500
0,20
6218
0,22
5628
2712113 48 hod
221
298
2802455 24 hod
217 225
2831152 4 hod
T2
-
2805336 1 hod
průměr
2308106
82,33%
6215 6222
2304477
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 1 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
-43-
450
400
350
350
300
250
250
200
200
150
150
100
100
4,45 RP 1
mAu
300
400
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2SO4po24hod033
Retention Time Name
6,36 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 8: Vliv kyselého pH na prazikvantel po 24 hodinách b) Zvýšená teplota - vzorek: K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml 2% kyseliny sírové. Po 1, 2, 3 a 4 hodinách (při teplotě 70oC) působení kyselého pH byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC. Výsledek: Výsledek působení kyselého pH za zvýšené teploty je dokumentován v tabulce 10 a na obrázku 9. Zvýšená teplota sama o sobě vliv na stabilitu roztoku prazikvantelu nemá, ale při vyšší teplotě dochází k urychlení rozkladu v kyselém prostředí. Prazikvantel není v prostředí kyseliny sírové za zvýšené teploty stabilní. Vzniká rozkladný produkt 1 (RP 1, tR 4,50 min).
-44-
Tabulka 10: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel-působení kyseliny sírové Prazikvantel
RP 1, tR 4,50 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
0 hod
2780289
2782524
100,00
-
2784760 1 hod
95,89
2668217
15197
2668123 86,49
2406735
31100
2404588
0,54
30801
1,11
46960
1,70
61616
2,21
30502
2427756
87,36
2430948
47902
2434141 4 hod
15148
15100
2408883
3 hod
T2
-
2668312
2 hod
průměr
46018
2395634
86,10
2395617
59729
2395600
63504
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 1 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2SO4-vod026.laz-po4hod
Retention Time Name
450
400
6,38 prazikvantel
400
350
300
250
250
200
200
150
150
100
100
4,50 RP 1
mAu
300
350
50
50
0 0,0
mAu
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 9: Vliv zvýšené teploty a kyselého prostředí na prazikvantel po 4 hodinách
-45-
5.1.4 Vliv oxidace na prazikvantel Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5 g /100 ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml směsí methanol – 3 % peroxid vodíku 95-5 (v/v) a analyzován pomocí HPLC.
450
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
4,92 RP 2
mAu
350
400
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O2hned
Retention Time Name 6,38 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 10: Standard prazikvantelu – methanol a peroxid
a) Laboratorní teplota - vzorek: K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml 3% peroxidu vodíku. Po 1, 4, 24 a 48 hodinách (při teplotě 25oC) působení 3% peroxidu vodíku byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek působení 3% peroxidu vodíku za laboratorní teploty je dokumentován v tabulce 11 a na obrázku 11. Prazikvantel v prostředí 3% roztoku peroxidu vodíku není stabilní. Už po 1 hodině dochází ke vzniku rozkladného produktu 2 (RP 2, tR 4,90 min). Rozkladný produkt je oddělen od píku prazikvantelu (rozlišení 6,51). -46-
Tabulka 11: Vliv oxidace na prazikvantel Prazikvantel
RP 2, tR 4,90 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
0 hod
2871638
2880626
100,00
-
2889615 1 hod
99,36
2862074
14658
2867674 94,73
2728848
56147
2731563
0,50
56259
1,95
160052
5,56
291196
10,11
56372
2379698
82,62
2380000
159582
2380302 48 hod
14555
14453
2726134
24 hod
T2
-
2856475
4 hod
průměr
160522
2475159
85,93
2475460
291062
2475762
291331
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 2 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O2-po48hod002
Retention Time Name
450
400
6,34 prazikvantel
400
350
250
300
250
1,48
200
200
150
150
4,88 RP 2
mAu
300
350
100
50
100
50
0 0,0
mAu
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 11: Vliv oxidace na prazikvantel a vznik RP 2 po 48 hodinách
-47-
b) Zvýšená teplota - vzorek: K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml 3% peroxidu vodíku. Po 1, 2, 3 a 4 hodinách (při teplotě 70oC) působení peroxidu vodíku byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek působení 3% peroxidu vodíku za zvýšené teploty je dokumentován v tabulce 12 a na obrázku 12.
Prazikvantel v prostředí 3% roztoku peroxidu vodíku není stabilní. Už po naředění dochází ke vzniku rozkladného produktu 2 (RP 2, tR=4,90 min). Rozkladný produkt je oddělen od píku prazikvantelu (rozlišení 6,51). Pokles obsahu prazikvantelu je pomalejší než při laboratorní teplotě, což je způsobeno vyprcháním obsahu peroxidu vodíku působením zvýšené teploty.
Tabulka 12: Vliv zvýšené teploty a peroxidu vodíku na prazikvantel Prazikvantel
RP 2, tR 4,90 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
průměr
T2
0 hod
2850059
2850528
100,00
1099
1028
0,04
6505
0,23
10838
0,39
14254
0,50
18150
0,64
2850997 1 hod
2796017
958 2785950
97,72
6604
2775884 2 hod
2805500
6406 2805633
98,43
10711
2805766 3 hod
2719337
10965 2722637
95,51
13969
2725938 4 hod
2669997
14540 2671427
93,71
18141
2672858
18160
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 2 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
-48-
450
400
350
300
300
250
250
1,48
mAu
350
400
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O2-vod024.laz-po4hod
Retention Time Name
6,38 prazikvantel
500
200
150
150
100
100
4,90 RP 2
200
50
50
0 0,0
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 12: Vliv zvýšené teploty a peroxidu vodíku na prazikvantel po 4 hodinách
-49-
5.1.5 Vliv hydrolýzy na prazikvantel Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5 g/100 ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml směsí methanol – voda 95-5 (v/v)a analyzován pomocí HPLC.
450
400
mAu
350
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O-vod003.laz-hned
Retention Time Name 6,37 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 13: Standard prazikvantelu – methanol a voda a) Laboratorní teplota - vzorek K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml destilované vody. Po 1, 4, 24 a 48 hodinách (při teplotě 25oC) působení vodného prostředí byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek působení hydrolýzy za laboratorní teploty je dokumentován v tabulce 13 a na obrázku 14.
Prazikvantel je v prostředí vody stabilní. Na chromatogramu nejsou detekovány žádné rozkladné produkty.
-50-
Tabulka 13: Vliv hydrolýzy na prazikvantel
počátek
Plocha
Průměr
Plocha %
2860796
2863860
100%
2947582
102,92%
2863631
99,99%
2743469
95,80%
2927656
102,23%
2866925 po 1 hod
2949520 2945645
po 4 hod
2863537 2863725
po 24 hod
2737870 2749068
po 48 hod
2925893 2929419
450
400
mAu
350
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O-po48hod004
Retention Time Name
6,34 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 14: Vliv hydrolýzy na prazikvantel po 48 hodinách
b) Zvýšená teplota - vzorek: K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml destilované vody. Po 1, 2, 3 a 4 hodinách (při teplotě 70oC) působení vodného prostředí byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
-51-
Výsledek: Výsledek působení hydrolýzy za zvýšené teploty je dokumentován v tabulce 14 a na obrázku 15.
Prazikvantel je v prostředí vody stabilní. Na chromatogramu nejsou detekovány žádné rozkladné produkty. Tabulka 14: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel-působení vody
počátek
Plocha
Průměr
Plocha%
2860796
2863860
100%
2828893
98,78%
2813904
98,26%
2825706
98,67%
2828389
98,76%
2866925 po 1 hod
2828596 2829191
po 2 hod
2818516 2809292
po 3 hod
2843195 2808218
po 4 hod
2824341 2832437
450
400
mAu
350
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+H2O-vod022.laz-po4hod
Retention Time Name
6,38 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 15: Vliv zvýšené teploty a vody na prazikvantel - po 4 hodinách
-52-
5.1.6 Vliv zásaditého pH na prazikvantel Roztok standardu: Byl připraven 0,5% roztok prazikvantelu (0,5 g/100 ml) v methanolu. Tento roztok byl naředěn na koncentraci 25 mg/100 ml směsí methanol – 2% hydroxid sodný 95-5 (v/v) a analyzován pomocí HPLC.
450
400
350
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
1,81 RP 3
mAu
350
400
50
50
0 0,0
mAu
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+NaOH-vod-laz-hned026
Retention Time Name 6,33 prazikvantel
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 16: Standard prazikvantel, t = 0 hod a) Laboratorní teplota - vzorek K 5 ml 0,5% roztoku prazikvantelu bylo přidáno 5 ml 2% roztoku hydroxidu sodného. Po 1, 4, 24 a 48 hodinách (při teplotě 25oC) působení zásaditého pH byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek
působení
zásaditého
pH
za
laboratorní
teploty
je
dokumentován v tabulce 15 a na obrázku 17.
Prazikvantel není v prostředí zásaditého pH stabilní. Již po 4 hodinách působení dochází k rozkladu prazikvantelu o více než 20%. Na chromatogramu -53-
je detekován rozkladný produkt 3 (RP 3; tR= 1,80 min). Rozkladný produkt je oddělen od píku prazikvantelu (rozlišení 19,80). Tabulka 15: Vliv zásaditého pH na prazikvantel Prazikvantel
RP 3, tR 1,80 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
0 hod
2601473
2606016
100,00
-
2610559 1 hod
100,55
2620431
214577
2621149 78,20
2038044
588056
2036190
8,26
587210
22,53
1632302
62,64
1811763
69,52
586365
392301
15,10
393433
1651072
394566 48 hod
215072
215568
2039899
24 hod
T2
-
2619714
4 hod
průměr
1613532
79830
3,09
80365
1802713
80901
1820814
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 3 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+NaOHpo48002
Retention Time Area Name
450
400
400
1,83 1802713 RP 3
350
mAu
300
250
350
300
250
200
6,34 79830 prazikvantel
200
150
100
50
150
100
50
0 0,0
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Minutes
Obrázek 17: Vliv zásaditého pH na prazikvantel po 48 hod
-54-
mAu
500
b) Zvýšená teplota – vzorek K 5 ml 0,5% roztoku standardu bylo přidáno 5 ml 0,4% roztoku hydroxidu sodného. Po 1, 2, 3 a 4 hodinách (při teplotě 50oC) působení zásaditého pH byl roztok prazikvantelu 20 x naředěn a analyzován pomocí HPLC.
Výsledek: Výsledek působení 0,4% roztoku hydroxidu sodného za zvýšené teploty je dokumentován v tabulce 16 a na obrázku 18.
Prazikvantel není v prostředí hydroxidu sodného za zvýšené teploty stabilní. Na chromatogramu je detekován rozkladný produkt 3 (RP 3; tR 1,80 min). Rozlišení RP 3 19,80. Tabulka 16: Vliv zvýšené teploty a hydroxidu sodného na prazikvantel Prazikvantel
RP 3, tR 1,80 min
čas
plocha
průměr
T1
plocha
0 hod
2750404
2757965
100,00
-
2755527 1 hod
2743301
2503400
2744141
99,50
122791
2538606
2538347
92,04
266266
2393761
4,46
264981
9,61
358808
14,12
441786
16,02
263697 2541496
92,15
359090
2544387 4 hod
123150
123510
2573295 3 hod
T2
-
2744981 2 hod
průměr
358527 2396988
86,91
438989
2400215
444574
T1 - plocha píku prazikvantelu v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t = 0 hod T2 - plocha píku RP 3 v %, vztaženo na plochu píku prazikvantelu v čase t=0 hod
-55-
450
500
Detector A - 1 (220nm) prazikvantel+NaOH(1)vodlaz-po4hod001
Retention Time Name
450
400
6,36 prazikvantel
400
350
300
250
250
200
200
150
150
1,83 RP 3
mAu
300
350
100
100
50
50
0 0,0
mAu
500
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Minutes
Obrázek 18: Vliv zvýšené teploty hydroxidu sodného na prazikvantel po 4 hodinách
-56-
5.2
Validace metody
5.2.1 Test vhodnosti chromatografického systému 5.2.1.1
Počet pater N
Byl měřen standardní roztok prazikvantelu připravený dle kap. 5.1.1. Počet pater N podle Ph. Eur., resp. ČL 20095:
= 5,545 ∙
5.2.1
Tabulka 17: Účinnost chromatografické kolony (počet pater) N Počet pater N měření
prazikvantel
1.
1519
2.
11292
3.
11477
4.
11265
5.
11368
6.
11396
Průměr
10118
Počet měření:
n=6
-57-
5.2.1.2
Faktor symetrie As
Byl měřen standardní roztok prazikvantelu, připravený dle kap. 5.1.1. Faktor asymetrie As podle Ph. Eur., resp. ČL 20095:
=
2
,
5.2.2
Tabulka 18: Faktor symetrie As Faktor symetrie As měření
prazikvantel
1.
0,99
2.
1,03
3.
1,03
4.
1,02
5.
1,01
6.
1,04
Průměr
1,02
Počet měření:
n=6
Požadavek:
As 0,8-1,5
Závěr:
Vyhovuje
5.2.1.3
Rozlišení chromatografických píků Rs
Byl měřen standardní roztok prazikvantelu připravený dle kap. 5.1.1. Rozlišení podle Ph. Eur., resp. ČL 2009 5:
= 1,18 ∙
− +
,
-58-
>
5.2.3
Tabulka 19: Rozlišení chromatografických píků Rs
měření
Rozlišení chromatografických píků Rs prazikvantel
1.
6,05
2.
6,01
3.
6,02
4.
5,95
5.
5,99
6.
5,95
Průměr
5,99
Počet měření:
n=6
Požadavek:
Rs> 1,5
Závěr:
Vyhovuje
5.2.1.4
Opakovatelnost analýzy
Opakovaně byl dávkován roztok prazikvantelu v methanolu o koncentraci 25 mg /100 ml. Tabulka 20: Opakovatelnost analýzy prazikvantelu Prazikvantel Číslo pokusu 1 2 3 4 5 6
Retenční čas (tR)
Plocha píku (A)
6,45
2878676
6,44
2881691
6,43
2875595
6,45
2872050
6,46
2878072
6,47
2885047
Počet měření n:
6
6
Aritmetický průměr x ̅:
6,45
2878521,833
SD:
0,012909944
4149,267301
RSD (%):
0,20%
0,14%
Požadavek:
RSD < 1%
Závěr:
Vyhovuje
-59-
5.2.2 Validace analytické metody 5.2.2.1
Přesnost
Byly analyzovány tablety Caniverm® 700 mg. Vzorky byly paralelně připraveny samostatným postupem dle kap. 4.2.5. Každý roztok byl dvakrát dávkován na kolonu. Poměry ploch byly přepočteny na navážku jedné tablety. Tabulka 21: Přesnost prazikvantelu Prazikvantel Číslo pokusu 1 2 3 4 5 6
5.2.2.2
Plocha píku (A) 1117873,5 1120985,5 1116810 1108048,5 1116172,5 1140352,5
Počet měření n:
6
Aritmetický průměr x ̅:
1120040,417
SD:
9894,206017
RSD (%):
0,88%
Požadavek:
RSD < 1%
Závěr:
Vyhovuje
Linearita
Pro hodnocení linearity bylo připraveno 6 kalibračních roztoků s různou koncentrací prazikvantelu. Každý roztok byl třikrát dávkován na kolonu a pro výpočet byly použity průměry ploch. Závislost plochy na koncentraci prazikvantelu v roztoku byla vyhodnocena metodou lineární regrese. Závislost je zobrazena na obr. 19.
-60-
Prazikvantel 4000000 3500000 3000000
plocha
2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0
5
10
15
20
25
30
35
koncentrace (mg/100ml)
Obrázek 19: Závislost plochy na koncentraci prazikvantelu v roztoku
Tabulka 22: Závislost plochy na koncentraci prazikvantelu v roztoku prazikvantel koncentrace c (mg/100ml)
plocha
plocha-průměr
629064 5
648117
633725,3333
623995 1194367 10
1183394
1191058,333
1195414 1738412 15
1744998
1744229,667
1749279 2292556 20
2304574
2300563,667
2304561 2872050 25
2878072
2878389,667
2885047 3457008 30
3410755 3415848
-61-
3427870,333
Regresivní funkce:
y = kx + q
Počet bodů:
n=6
Parametry regresní přímky: y = 2E+08x + 70401 Koeficient korelace R:
0,9999
-62-
6. Shrnutí závěrů práce Cílem
práce
bylo
provedení
stresových
zkoušek
anthelmintika
prazikvantelu. Prazikvantel byl podle zadání vystaven vlivu oxidace, vodného prostředí, kyselému a zásaditému pH a to vždy po danou dobu za laboratorní a zvýšené teploty. Bylo zjištěno, že prazikvantel je stabilní v prostředí methanolu za laboratorní i zvýšené teploty. Rozpouštědlo methanol nemá tedy vliv na stabilitu prazikvantelu ani po 48 hodinách. Ze zkoušek vyplývá, že je prazikvantel stabilní ve vodě. Nedochází k hydrolýze prazikvantelu za laboratorní ani za zvýšené teploty a to ani po 48 hodinách. Vlivem kyselého pH, které bylo nastaveno 2% kyselinou sírovou, dochází k rozkladu prazikvantelu a ke vzniku rozkladného produktu RP 1, který je charakterizován retenčním časem tR 4,50 min. Působením zvýšené teploty (70 °C) dochází k urychlení rozkladu. Působením 3% roztoku peroxidu vodíku na prazikvantel dochází k rozkladu prazikvantelu za vzniku rozkladného produktu RP 2, který je charakterizován retenčním časem tR 4,90 min. Pokles obsahu prazikvantelu je pomalejší při zvýšené teplotě než při laboratorní teplotě, což je způsobeno vyprcháním peroxidu vodíku působením zvýšené teploty. Vlivem zásaditého pH (roztok hydroxidu sodného) dochází ke snížení obsahu prazikvantelu a vzniká rozkladný produkt RP 3, který je charakterizován retenčním časem tR 1,80 min. Použité chromatografické podmínky byly zvoleny tak, aby prazikvantel a vzniklé rozkladné produkty byly dostatečně separovány. Rozkladné produkty nebyly identifikovány, ale byly charakterizovány retenčním časem a byl sledován jejich nárůst. Identifikace rozkladných produktů proběhne v rámci případných stabilitních studií. V rámci stabilitních studií bude sledován pokles obsahu prazikvantelu a výskyt výše uvedených rozkladných produktů RP 1 - RP 3.
-63-
7. Seznam zkratek ČL 2009
Český lékopis 2009
GC
Plynová chromatografie
ICH
International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
HPLC
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
MS
Hmotnostní spektrometrie
RP
Rozkladný produkt
SPC
Souhrn údajů o přípravku
SÚKL
Státní ústav pro kontrolu léčiv
UV
Ultrafialová oblast spektra
WHO
World
Health
Organization
organizace)
-64-
(Světová
zdravotnická
8. Seznam tabulek Tabulka 1: Podmínky uchování pro provedení stabilitních studií9 .................. 14 Tabulka 2: Podmínky dlouhodobých testů pro jednotlivá klimatická pásma9 . 15 Tabulka 3: Požadavky na znaky jakosti při stabilitní zkoušce2....................... 18 Tabulka 4: Parametry požadované pro validaci metody25 .............................. 31 Tabulka 5: Vliv rozpouštědla na stabilitu prazikvantelu .................................. 38 Tabulka 6: Vliv zvýšené teploty na substanci prazikvantelu – působení methanolu ...................................................................................................... 40 Tabulka 7: Roztok léčivého přípravku Caniverm® ......................................... 41 Tabulka 8: Tabletovina léčivého přípravku Caniverm®.................................. 42 Tabulka 9: Vliv kyselého pH na prazikvantel.................................................. 43 Tabulka 10: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel-působení kyseliny sírové... 45 Tabulka 11: Vliv oxidace na prazikvantel ....................................................... 47 Tabulka 12: Vliv zvýšené teploty a peroxidu vodíku na prazikvantel.............. 48 Tabulka 13: Vliv hydrolýzy na prazikvantel .................................................... 51 Tabulka 14: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel-působení vody .................. 52 Tabulka 15: Vliv zásaditého pH na prazikvantel............................................. 54 Tabulka 16: Vliv zvýšené teploty a hydroxidu sodného na prazikvantel......... 55 Tabulka 17: Účinnost chromatografické kolony (počet pater) N..................... 57 Tabulka 18: Faktor symetrie As ..................................................................... 58 Tabulka 19: Rozlišení chromatografických píků Rs ....................................... 59 Tabulka 20: Opakovatelnost analýzy prazikvantelu ....................................... 59 Tabulka 21: Přesnost prazikvantelu ............................................................... 60 Tabulka 22: Závislost plochy na koncentraci prazikvantelu v roztoku ............ 61
-65-
9. Seznam obrázků Obrázek 1: Schéma kapalinového chromatogramu15..................................... 20 Obrázek 2: Chemická modifikace silikagelu pomocí silylace16 ....................... 21 Obrázek 3: Chemická struktura prazikvantelu19 ............................................. 25 Obrázek 4: Standard prazikvantelu, čas t= 0 hod .......................................... 37 Obrázek 5: Vliv rozpouštědla na stabilitu prazikvantelu po 48 hodinách........ 39 Obrázek 6: Vliv zvýšené teploty na prazikvantel - působení methanolu po 4 hodinách ........................................................................................................ 41 Obrázek 7: Standard prazikvantelu, čas t= 0 hod .......................................... 42 Obrázek 8: Vliv kyselého pH na prazikvantel po 24 hodinách........................ 44 Obrázek 9: Vliv zvýšené teploty a kyselého prostředí na prazikvantel po 4 hodinách ........................................................................................................ 45 Obrázek 10: Standard prazikvantelu – methanol a peroxid............................ 46 Obrázek 11: Vliv oxidace na prazikvantel a vznik RP 2 po 48 hodinách ........ 47 Obrázek 12: Vliv zvýšené teploty a peroxidu vodíku na prazikvantel po 4 hodinách ........................................................................................................ 49 Obrázek 13: Standard prazikvantelu – methanol a voda................................ 50 Obrázek 14: Vliv hydrolýzy na prazikvantel po 48 hodinách .......................... 51 Obrázek 15: Vliv zvýšené teploty a vody na prazikvantel - po 4 hodinách ..... 52 Obrázek 16: Standard prazikvantel, t = 0 hod ................................................ 53 Obrázek 17: Vliv zásaditého pH na prazikvantel po 48 hod ........................... 54 Obrázek 18: Vliv zvýšené teploty hydroxidu sodného na prazikvantel po 4 hodinách ........................................................................................................ 56 Obrázek 19: Závislost plochy na koncentraci prazikvantelu v roztoku ........... 61
-66-
10. Seznam použité literatury [1] CHALABALA, M., et al.: Technologie léků. 2.vydání. Praha: Galén, 2001. s. 333-343 [2] HAVLÍKOVÁ, L., Studium problematiky stability léčivých přípravků metodou HPLC. Disertační práce. Hradec Králové, 2006. Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. [3] CARSTENSEN T. J., RHODES C. T., et al.: Drug stability. Marcel Dekker Inc., New York 2000. [4] International Conference on Harmonization (ICH): Q1A(R2): Stability Testing of New Drug Substances and Products, US FDA Federal Register, č. 68, February 2003. [5] International Conference on Harmonization (ICH): Q1B: Photostability Testing of New Drug Substnces and Products, US FDA Federal Register, č. 62, May 1997. [6] International Conference on Harmonization (ICH): Q1C: Stability Testing for New Dosage Forms, US FDA Federal Register, č. 62, May 1997. [7] Věstník SÚKL 1/1996, Státní Ústav pro Kontrolu Léčiv, REG-21- Část II. Chemická, farmaceutická a biologická dokumentace, 1996. [8] VETCHÝ, D. Stabilitní testy ve farmacii. Praktické lékárenství. 2006, č. 6, s. 276-277. ISSN 1801-2434. [9] VETCHÝ, D., FRÝBORTOVÁ K., RABIŠKOVÁ M., HÄRING. TESTOVÁNÍ STABILITY LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ. Chemické listy. 2006, č. 1, s. 24-29. ISSN 1213-710. [10] REYNOLDS W., KEVIN L., FACCHINE, et al. Motto, Available Guidance and Best Practices for Conducting Forced Degradation Studies, Pharmaceutical Technology. 2002, č. 2, s. 48-56. [11] KAREN M., MARTIN L., STEVEN W. A Stress Testing Benchmarking Study, Pharmaceutical Technology. 2003, č. 2, s. 60-72.
-67-
[12] SAVICKAS A., RAMANAUSKIENE K., SAVICKIENE N., CHALUPOVA Z.: Če. Slov. Farm. 2004, č.53, s. 35-36. [13] Ministerstvo zdravotnictví České republiky: Český lékopis 2002. Praha: Grada Publishing a.s., 2002. [14] KLIMEŠ, J., et al. KONTROLA LÉČIV I. 1. vydání. Praha: Karolinum, 2006. s. 29-36 . ISBN 80-246-0419-1. [15] COUFAL, P. HPLC. [online]. © 28. 7. 2004 [cit. 2012-04-03]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/hplc/HPLC/ohplc.html. [16] DOUŠA, M. HPLC - teorie - Adsorbenty - Kolony. |HPLC| High Performance Liquid Chromatography| [online]. (C) 1999 - 2011 Michal Douša, Last
modified:
3.
června
110
[cit.
2012-04-03].
Dostupné
z:
http://www.hplc.cz/Teorie/adsorbent.html. [17] SPC Caniverm tbl., revize textu 21. 4. 2010. Mikro-verze AISLP 2011. 4. Praha. [18] Český lékopis 2009. 1 vydání. Praha: Grada Publishing, a.s., 2009. s. 29812982. ISBN 978-80-247-2994-7. [19] Praziquantel. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikipedia Foundation, 2001-, This page was last modified on 30 March 2012 at 18:41 [cit. 2012-04-03]. Dostupné z: http://en.wikipedia.org/wiki/Praziquantel. [20] SULEIMAN M. I. et al., Saudi Pharmaceutical Journal. 2004, 12(4), s. 157158. [21] EUROPEAN MEDICINES AGENCY. Profender : EPAR - Scientific Discussion.
2008.
[cit.
2012-04-30].
Dostupné
z:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR__Scientific_Discussion/veterinary/000097/WC500063849.pdf [22] MEIER, H., BLASCHKE G. Investigation of Praziquantel metabolism in isolatedrat hepatocytes. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2001, č. 26, s. 409-415.
-68-
[23] GONZÁLES-ESQUIVEL F., MORANO OKUNO, SÁNCHEZ RODRIGUEZ, SOTELO M. J. a JUNG C. Sensitive high performance liquid chromatographic assai for praziquantel in plasma, urine and liver homogenates. Journal of Chromatography. 1993, č. 613, s. 174-178. [24] RIDTITID W., WONGAWA M., MAHATTHANATRAKUL W., Jarurat PUNYO a Methi SUNBHANICH. LC determination of praziquantel in human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2002, č. 28, s. 181-186. [25] ŠABARTOVÁ J., Věstník SÚKL 1/1994, Státní ústav pro kontrolu léčiv (1993), Validace analytických metod v kontrole léčiv, s. 6-8.
-69-
